Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор биологических наук Викторов, Дмитрий Викторович

• Викторов, Дмитрий Викторович
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Викторов, Дмитрий Викторович

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ТАКСОНОМИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ В URKHOLDERIA PSEUDOMALLEIИ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

1.1 Краткий таксономический очерк рода Burkholderia

1.2. Особенности генетической организации патогенных Burkholderia

1.2.1 Структурные элементы геномов буркхольдерий

1.2.2 Сравнительная геномика буркхольдерий группы «pseudomallei»

ГЛАВА 2. АНАЛИЗ ОСОБЕННОСТЕЙ ФОРМИРОВАНИЯ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ У BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

2.1 Модельная система для изучения механизмов формирования резистентности буркхольдерий к антибактериальным агентам

2.2 Получение мутантов Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei и Burkholderia thailandensis с фенотипом множественной антибиотикорезистентности

2.2.1 Характеристика фенотипов резистентности исходных штаммов В. pseudomallei,

В. mallei и В. thailandensis

2.2.2 Селекция вариантов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis, устойчивых к цефтазидиму, пефлоксацину, офлоксацину и имипенему

2.2.3 Анализ перекрестной резистентности мутантов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis

2.2.4 Вирулентные свойства полирезистентных мутантов В. pseudomallei и В. mallei

ГЛАВА 3. ИЗМЕНЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ И ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ПРИ РАЗВИТИИ МНОЖЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ BURKHOLDERIA

3.1 Лекарственная резистентность бактерий, обусловленная изменением экспрессии поринов •

3.2 Белковый состав наружных мембран клеток В. pseudomallei и родственных буркхольдерий

3.3 Экспрессия мембранных белков у мутантов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis с различными фенотипами резистентности

3.4 Получение и характеристика мутантов Burkholderia, дефектных по продукции мембранных белков

3.4.1 Инсерционный мутагенез и отбор Вор" клонов

3.4.2 Характеристика инсерционных мутантов, дефектных по продукции белков наружных мембран

3.5 Проницаемость клеточных мембран и эффлюкс антимикробных соединений у полирезистентных вариантов Burkholderia

3.5.1 Устойчивость к неспецифическим ингибиторам

3.5.2 Накопление и выброс бромистого этидия

3.5.3 Резистентность при воздействии блокаторов мембранных каналов

3.6 Изменения экспрессии поверхностных полисахаридов и систем секреции экзоферментов

3.6.1 Модификации ЛПС

3.6.2 Продукция экзополисахарида

3.6.3 Спектры внеклеточных ферментов 11 g

ГЛАВА 4. МНОЖЕСТВЕННАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ BURKHOLDERIA: ЭФФЛЮКС-СИСТЕМЫ

4.1 Резистентность бактерий, обусловленная системами активного выброса антимикробных соединении

4.2 Системы лекарственного эффлюкса патогенных Burkholderia

4.2.1 Алгоритм сравнительного анализа

4.2.2 Гены лекарственных транспортеров MFS- суперсемейства

4.2.3 Гены лекарственных транспортеров SMR-семейства '

4.2.4 Гены лекарственных транспортеров RND- суперемейства

4.3 Дифференциальная экспрессия эффлюкс-детерминант при формировании множественной резистентности Burkholderia

4.3.1 Последовательности-мишени и праймеры

4.3.2 Технологические этапы дифференциального дисплея мРНК генов лекарственного эффлюкса

4.3.3 Обратная транскрипция мРНК эффлюкс-транспортеров исходных штаммов и полирезистентных мутантов В. pseiidomaüei

4.3.4 Экспрессия эффлюкс-последовательностей у полирезистентных мутантов В. pseudomallei, В mallei и В. thailandensis

4.4 Экспрессия эффлюкс-последовательностей В. pseudomallei в гетерологичных системах

4.4.1 Клонирование последовательностей хромосомы В. pseudomallei 56770 SMCP в Escherichia coli и характеристка рекомбинантных клонов

4.4.2 Рестрикционный и гибридизацнонный анализ рекомбинантных плазмид

4.4.3 Анализ продуктов экспрессии рекомбинантных плазмид

4.4.4 Детекция клонированных эффлюкс-последовательностей В pseudomallei в рекомбинантных штаммах Е. coli

ГЛАВА 5. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ДЕТЕРМИНАНТ УСТОЙЧИВОСТИ К ОТДЕЛЬНЫМ ГРУППАМ АНТИМИКРОБНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ГЕНОМНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПОЛИРЕЗИСТЕНТНЫХ МУТАНТОВ BURKHOLDERIA

5.1 Мутационные изменения ДНК-гиразы А у мутантов Burkholderia с высоким уровнем устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы

5.1.1 QRDR-регион gyrA В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis

5.1.2 Техника анализа мутаций в последовательностях QRDR gyrA 179 5.1.3, Анализ нуклеотидных замен в QRDR ДНК-гиразы А мутантных штаммов

5.2 Интегроноподобные структуры геномов Burkholderia

5.2.1 Детекция интегроноподобных последовательностей в штаммах i?, pseudomallei,

В. mallei и В. thailandensis

5.2.2 Нуклеотидные последовательности интегроноподобных элементов буркхоль-дерий

5.3 Геномная вариабельность полирезистентных вариантов Burkholderia

5.3.1 Методические аспекты анализа

5.3.2 Генетическая гетерогенность штаммов В. pseudomallei и родственных видов с различной чувствительностью к антимикробным соединениям 195 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 200 ВЫВОДЫ 227 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНКаза - дезоксирибонуклеаза дНТФ (dNTP) - дезоксинуклеозидтрифосфаты

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛПС (LPS) - липополисахарид м.к. - микробные клетки

МПК - минимальная подавляющая концентрация

МФА - метод флуоресцирующих антител

НГ - N-метил ISr-нитро N-нитрозогуанидин

ООИ - особо опасные инфекции п.н. (т.п.н.) - пар нуклеотидов (тысяч пар нуклеотидов)

ГТААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РИД - радиальная иммунодиффузия в геле

РГОФ - ракетный иммуноэлектрофорез

ТИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

Трис - трис(гидрооксиметил)аминометан

УФ - ультрафиолетовое облучение

ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

Вор - белки наружной мембраны клеток буркхольдерий bp, kbp, Mbp - пар оснований, тысяч пар оснований, миллионов пар оснований

CDS - кодирующая последовательность

Eps - экзополисахарид

EtBr - этидиум бромид

IgG - иммуноглобулин G kDa - килодальтон

LD50 - доза микроорганизма, летальная для 50% зараженных животных

MD - мегадальтон

ML ST - мультилокусное сиквенс-типирование

Mr - относительная молекулярная масса белка

NA - Nutrient agar (питательный агар)

NB - Nutrient broth (питательный бульон)

ORF - открытая рамка считываяния

PFGE - электрофорез в пульсирующем электрическом поле

RAPD - амплификация с произвольными праймерами

RFLP - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

RT-PCR - обратная транскрипция и амплификация

SDS - додецилсульфат натрия

SDS-PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле сдодецилсульфатом натрия

SNP - полиморфизм единичных нуклеотидов

SSC - стандартный цитратно-солевой буфер

SSCP - полиморфизм однонитевых фрагментов ДНК

SSR - простые короткие повторы

VNTR - вариабельность количества тандемных повторов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов»

В настоящее время род Burkholderia, согласно «Taxonomic Outline of the Bacteria and Archaea, Release 7.7» (Garrity et al., 2007), включает в себя более 50 видов микроорганизмов, как сапрофитов, так и факультативных и об-лигатных паразитов, способных вызывать различную инфекционную патологию у многочисленных видов растений и животных. Из них к патогенным буркхольдериям относят два вида - В. pseudomallei и В. mallei, возбудителей особо опасных инфекций - мелиоидоза и сала.

В. pseudomallei и В. mallei, в отличие от многих бактериальных патогенов, имеют ограниченное распространение в мире, тем не менее, интерес к их изучению поддерживается сведениями о высокой опасности микроорганизмов для человека и различных видов животных (Илюхин, 1985; Беляков и др., 1990; Dance, 2002; White, 2003; Cheng et al., 2003; Leelarasamee, 2004; Douglas et al., 2004; Keluangkhot et al., 2005; Cheng, Currie, 2005; Peacock, 2006; Inglis et al., 2006a). В последние годы отношение к мелиоидозу стало более пристальным не только в эндемичных по данной инфекции регионах Юго-Восточной Азии и Северной Австралии, где улучшение диагностики привело к значительному росту числа подтвержденных случаев заболевания (Lowe et al., 2006; Liu et al., 2006; Francis et al., 2006; Cheng et al., 2006a; Cheng et al., 2006b; Cheng et al., 2006c; Wattiau et al., 2007), но и в ряде стран Старого Света и Северной Америки, где были описаны многочисленные случаи мелиоидоза среди лиц, посетивших эндемичные зоны (Heyse et al., 2003; Maccanti et al., 2004; Nieminen, Vaara, 2005; Ngauy et al., 2005; Svensson et al., 2006; Borgherini et al., 2006). Кроме того, недавние сообщения о случаях мелиоидоза у людей и животных, а также выделении культур возбудителя из объектов внешней среды в ряде тропических и субтропических регионов свидетельствовуют о существенно более широком ареале микроорганизма, чем это считалось ранее (Yang 2000; Dance, 2000; Currie et al., 2000; Kanungo et al., 2002; Sprague, Neubauer, 2004; Rolim et al., 2005; Lee et al., 2005; Issack et al., 2005; Braga, Almeida, 2005; Aardema et al., 2005; Wuthiekanun et al., 2006; Virginio et al., 2006; Peacock, 2006; Inglis et al., 2006b).

Что касается сапа, то, хотя заболеваемость им людей отмечается редко, в некоторых странах, в том числе, сопредельных с Россией (Турция, Иран, Монголия, Италия, Саудовская Аравия) продолжают регистрироваться вспышки заболевания у животных (Arun et al., 1999; Pospisil, 2001; Neubauer et al., 2005; Wittig et al., 2006). Таким образом, приведенные факты не исключают возможности завоза того и другого возбудителей на территорию нашей страны.

Необходимо также помнить, что возбудители мелиоидоза и сапа по-прежнему рассматриваются как возможные агенты биологического оружия и средства осуществления биотеррористических актов (Lehavi et al., 2002; Charrel et al., 2004; Bossi et al., 2004; Guilhot et al., 2005; Christensen et al., 2005; Wittig et al., 2006).

В последнее десятилетие, благодаря заметно усилившемуся интересу к проблеме заболеваемости мелиоидозом в мире, были обнаружены и детально охарактеризованы так называемые pseiidomallei-likQ штаммы, генетически и иммунологически близкие В. pseudomallei, но при этом не патогенные для человека и животных и биохимически более активные по отношению к олигасахаридам группы пентоз (Brett et al., 1997; Brett et al., 1998; Илюхин и др., 2002). Стабильность признаков Vir" Ага+, в сочетании с различиями в нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК послужили основанием для выделения данных микроорганизмов в самостоятельный вид В. thailan-densis (Brett et al., 1998).

Характерным и важным биологическим свойством патогенных бурк-хольдерий и близких им микроорганизмов является высокая природная резистентность к широкому спектру антимикробных соединений. Наличие этого свойства создает значительные трудности для успешного лечения вызываемых ими заболеваний. Необходимо отметить, что биологические основы полирезистентности у большинства видов Burkholderia на сегодняшний день являются мало исследованными.

К настоящему времени накоплен довольно обширный материал об индивидуальной устойчивости различных видов буркхольдерий к антибактериальным агентам (Антонов и др., 1991; Desai et al., 1998; Kenny et al., 1999; Vo-rachit et al., 2000; Moore et al., 2001; Jenney et al., 2001; Nzula et al., 2002). Показано, что с одной стороны, препараты тетрациклинового, фторхинолоново-го, цефалоспоринового, карбапенемового рядов и некоторые другие соединения в опытах in vitro проявляют выраженное ингибирующее действие на клетки патогенных и условно-патогенных видов данной группы микроорганизмов, культивируемых на искусственных питательных средах, с другой -применение этих антибактериальных агентов в условиях персистенции бактерий в организме-хозяине нередко оказывается малоэффективным (Haussier et al., 1999; Inglis et al., 2004; Azizi et al., 2005). Кроме того, известно, что буркхольдерии как при культивировании на питательных средах в селективных условиях, так и в процессе лечения быстро приобретают резистентность к различным антибактериальным препаратам, и нередко резистентность носит множественный характер (Rajyaguru, Muszynski, 1997; Но et al., 2002). Сложность генетической организации (Cheng, Lessie, 1994; Rodley et al., 1995; Songsivilai, Dharakul, 2000; Nierman et al., 2004; Holden et al., 2004) позволяет говорить о высокой адаптивной «емкости» их геномов и предполагать наличие различных молекулярно-генетических механизмов, посредством которых реализуется множественная лекарственная резистентность. Последнее является основанием к тому, чтобы обозначает в качестве одного из приоритетных направлений в исследовании микроорганизмов рода Burkholderia изучение фундаментальных основ их устойчивости к антибактериальным агентам, в первую очередь, касающихся молекулярио-генетических механизмов формирования резистентности.

Развитие исследований в этом направлении будет способствовать пониманию основных генетических особенностей буркхольдерий, предопределяющих их повышенную метаболическую пластичность, приспособляемость к воздействию специфических и неспецифических ингибиторов и защитных факторов макроорганизма. Следует отметить, что знание молекулярных механизмов развития резистентности к антимикробным соединениям имеет не только фундаментальное значение. Речь идет также о возможности получения важных с точки зрения современной теоретической и практической медицины фактов, которые могут быть положены в основу новых подходов к антибиотикотерапии инфекций, вызываемых микроорганизмами рода Burkholderia.

На сегодняшний день довольно детально изучены некоторые из моле-кулярно-генетических механизмов множественной лекарственной резистентности бактерий: аккумуляция и стабильное наследование отдельных R-детерминант генных кассет в составе интегронов (Ильина, 2003; Fluit, Schmitz, 2004), активный энергозависимый выброс антимикробных соединений из бактериальных клеток (multidrug efflux) (Putman et al., 2000; Poole 2001; Paulsen, Lewis 2001), снижение общей проницаемости клеточной оболочки за счет изменения экспрессии поринов наружной мембраны (Poole, 2002). Как правило, множественная лекарственная устойчивость обусловлена функционированием в микробной клетке нескольких молекулярных- механизмов (Nikaido, 1998; Poole, 2001). В рассматриваемом аспекте патогенные и филогенетически близкие им Burkholderia представляют собой весьма интересные объекты исследований, позволяющие анализировать особенности молекулярных механизмов, определяющих тот или иной тип устойчивости к ингибиторам, у близкородственных видов, эволюционирующих в различных экологических нишах.

Возможности современного изучения лекарственной резистентности определяются наличием молекулярно-биологических методов и модельных систем, позволяющих идентифицировать и осуществлять анализ последовательностей генома, детерминирующих резистентность. Необходимыми элементами здесь являются специальные штаммы, несущие генетические детерминанты измененной чувствительности, а также методы молекулярного анализа R-детерминант — элементов транспортных систем клеток, ферментов инактивации/модификации, генов внутриклеточных мишеней действия антибиотиков и других. Клонирование генетических последовательностей бурк-хольдерий, определяющих различные спектры лекарственной резистентности, анализ их экспрессии в гетерологичных видах, а также разработка подходов, направленных на идентификацию дифференциально экспрессирую-щихся последовательностей генома в различных физиологических состояниях микроорганизма (Rivera-Marrero et al., 1998; Fleming et al., 1998; Benson et al., 2000), также входят в спектр необходимых методологических приемов при изучении генетических механизмов множественной лекарственной резистентности патогенных буркхольдерий и идентификации последовательностей геномов, маркирующих тот или иной спектр лекарственной резистентности.

Представленная диссертация содержит обобщенные результаты выполненных в лаборатории функциональной геномики Волгоградского научно-исследовательского противочумного института исследований в рамках государственных НИР и исследовательских проектов, поддержанных грантами РФФИ 07-04-01568 и 07-04-08660. Вошедшие в диссертацию материалы получены как лично соискателем, так и в соавторстве с сотрудниками лаборатории, работавшими под его руководством, а также с сотрудниками лабораторий генетики и молекулярной биологии ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ.

Цель настоящей работы заключалась в комплексном изучении основных закономерностей формирования множественной устойчивости к антибактериальным препаратам у буркхольдерий группы «pseudomallei» (В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis), идентификации и анализе ведущих молекулярных механизмов, ответственных за развитие полирезистентности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создать коллекцию изогенных штаммов В. pseuäomallei, В. mallei и В. thailandensis, отличающихся по спектру устойчивости и инсерционных мутантов со сниженным уровнем резистентности для использования в качестве моделей для изучения множественной лекарственной резистентности.

2. Изучить динамику формирования и стабильность наследования различных типов антибиотикорезистентности у В. pseuäomallei и близкородственных видов. Исследовать у мутантных штаммов спектры перекрестной устойчивости к антимикробным препаратам различных классов.

3. Выявить закономерности развития множественной резистентности Burkholderia к антибиотикам на уровне транспортных мембранных систем, идентифицировать и охарактеризовать мембранные протеины, участвующие в формировании тех или иных типов устойчивости.

4. Разработать методические основы изучения транскрипционных профилей буркхольдерий и провести сравнительный анализ дифференциально экс-прессирующихся последовательностей эффлюкс-детерминант различных типов при развитии множественной антибиотикоустойчивости у В. pseuäomallei, В. mallei и В. thailandensis.

5. Клонировать в Е. coli последовательности генома В. pseuäomallei, кодирующие компоненты мембранных транспортных систем активного энергозависимого выброса антимикробных соединений из клеток и провести анализ их экспрессии в гетерологичной системе.

6. Исследовать геномный полиморфизм и вариации в структуре детерминант мишеней действия лекарственных препаратов при формировании резистентности к антибиотикам множественного характера, провести первичный структурный анализ элементов генома, способных к включению в свой состав генов антибиоткорезистентности, оценить перспективы молекулярного маркирования различных фенотипов антибиотикорезистентно-сти у бактерий группы «psвudomallе/».

Научная новизна

В настоящей работе на основе полученной коллекции мутантных полирезистентных штаммов с различными спектрами лекарственной устойчивости и мутантов со сниженным уровнем резистентности впервые проведено изучение особенностей формирования устойчивости множественного типа к антибиотикам у В. pseudomallei и родственных ей видов В. mallei и В. thailandensis.

Впервые изучены закономерности формирования и наследования резистентности к антибиотикам классов цефалоспоринов и фторхинолонов у В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis с последующим развитием у них множественной устойчивости к препаратам ряда аминогликозидов, Р-лактамов и хлорамфеникола. Показано, что устойчивость к антимикробным препаратам различных классов у В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis обусловлена как возрастанием экспрессии аппарата активного выброса антибиотиков (multidrug efflux), так и снижением проницаемости клеточной оболочки за счет утраты либо пониженной экспрессии отдельных поринов.

Изучены основные механизмы формирования резистентности Burkholderia к антибиотикам, реализующиеся на уровне транспортных мембранных систем; впервые продемонстрирована роль в развитии множественной резистентности транспортного типа мембранных белков 110, 71, 48, 39, 27 и 21 kDa. Разработана технология выделения и очистки порообразующих мембранных белков В. pseudomallei и получен патент на изобретение № 2208445 «Способ выделения белка 39 кДа наружной мембраны возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ

20.07.2003).

Исследовано соотношение изменения проницаемости клеточных мембран и активного энергозависимого транспорта лекарственных препаратов при развитии множественной резистентности у возбудителя мелиоидоза. У полирезистентных мутантов В. рБеис1ота1Ш выявлено существенное снижение мембранной проницаемости для ряда соединений различной химической природы и физико-химических свойств - жирных кислот, солей желчных кислот, анионных и неионных детергентов, красителей. В экспериментах по оценке влияния соединения, блокирующего мембранные транспортеры, показана важная роль процессов энергозависимого выброса антимикробных соединений при формировании у В. ряеис1ота11е1 резистентности множественного характера.

Охарактеризованы изменения биохимической активности, вирулентности и продукции поверхностных и внеклеточных биополимеров, имеющих значение факторов патогенности, в связи с развитием у В рБеи^тЫШ полирезистентности. Показано, что приобретение фенотипа множественной резистентности к антибиотикам сопровождается существенной функциональной модификацией секреторных систем клеток возбудителя, выражающейся в структурных модификациях ЛПС, изменениях способности микроорганизма к секреции экзополисахарида и комплекса внеклеточных ферментов. Приоритетность исследований поверхностных и секреторных биополимеров В. р$еи(1ота11е1, имеющих значение факторов патогенности, подтверждена патентами № 96111507 «Способ получения протективного гликопротеина возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован Российским агентством по патентам и товарным знакам 27.04.1998), № 2231364 «Способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.06.2004), № 2255762 «Способ получения капсульного антигена возбудителя мелиоидоза, обладающего антифагоцитарной активностью» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 10.07.2005).

Впервые на основе известных последовательностей геномов буркхоль-дерий проведен сравнительный анализ in silico нуклеотидных последовательностей идентифицированных и предполагаемых генов лекарственного зф-флюкса В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis\ обозначены группы детерминант множественной антибиотикорезистентности и подобраны олиго-нуклеотидные праймеры для амплификации консервативных фрагментов генов лекарственных транспортеров MFS (QacA/EmrB), SMR (QacE) и RND (AcrB/AcrD/AcrF) типов.

Осуществлена разработка методических подходов к изучению транскрипционных профилей исследуемых видов Burkholderia методом дифференциального дисплея мРНК с использованием генспецифических праймеров и проведено сравнительное исследование дифференциально экспрессирую-щихся генов эффлюкс-протеинов различных функциональных семейств у исходных штаммов и полирезистентных мутантов буркхольдерий, культивируемых в неселектвных условиях и при воздействии антибиотиков групп фторхинолонов и цефалоспоринов. Впервые показано сочетанное участие AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE детерминант в формировании антибиотикорезистентности множественного типа у видов группы «pseudomallei» и выявлен повышенный конститутивный уровень экспрессии QacA/EmrE и AcrB/AcrD/AcrF эффлюкс-транспортеров у части полирезистентных мутантов.

Впервые в Escherichia coli клонированы последовательности хромосомной ДНК полирезистентного мутанта В. pseudomallei 56110 SMCP, несущие детерминанты AcrB/AcrD/AcrF и QacE эффлюкс-транспортеров и показано, что их экспрессия приводит к развитию резистентности рекомбинант-ных клонов к препаратам фторхинолоновой и аминогликозидной групп. Ре-комбинантный штамм Е. coli ZV1 (КМ 167), несущий клонированные последовательности эффлюкс-систем В. pseudomallei, защищен патентом на изобретение № 2280688 «Рекомбинантный штамм Escherichia coli ZV1 - носитель клонированной последовательности ДНК Burkholderia pseudomallei, детерминирующей синтез белка 32 kDa и резистентность к пефлоксацину и стрептомицину» (зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.07.2006).

Впервые исследованы генетические вариации структуры (аллельного полиморфизма) гена ДНК-гиразы А у мутантных штаммов буркхольдерий с различными спектрами устойчивости к антибиотикам. Показано, что полире-зис! ентныс мутанты В. pseudomallei и В. mallei с высоким уровнем устойчивости к антибиотикам фторхинолонового ряда несут точечные мутации в регионе гена ДНК-гиразы А, детерминирующем резистентность к фторхиноло-новым соединениям (QRDR), приводящие к нескольким типам аминокислотных замен в последовательности белка (Thr83-»Ile, Gly81—>Cys и Asp87—»Туг). Секвенированные нуклеотидные последовательности QRDR диких и мутантных штаммов В. pseudomallei и В. mallei депонированы в Genbank NCBI (access. EU541544, EU541545, EU541546, EU541547, EU541548, EU541549, published 29.03.2008).

С использованием ПЦР-анализа и секвенирования установлено, что геномы исследуемых штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis несут последовательности, структурно сходные с интегронами - генетическими элементами, способными включать в свой состав индивидуальные генные кассеты по механизму сайт-специфической рекомбинации. Анализ геномных регионов буркхольдерий, имеющих максимальные показатели сходства с секвениро-ванными ампликонами, продемонстрировал наличие структур, включающих ген транспозазы/интегразы и кодирующие последовательности, аннотированные как детерминанты лекарственной устойчивости - гены эффлюкс-транспортеров MFS и RND типов. Секвенированные нуклеотидные последовательности фрагментов обнаруженных структур депонированы в Genbank NCBI (access. AY772715, published 7.11.2004).

Впервые апробированы техники молекулярного типирования, основанные на амплификации полиморфных ДНК и фрагментов генома, содержащих гены интегразы, для анализа геномного полиморфизма штаммов В. pseudo-mallei дикого типа, селекционированных вариантов, высокорезистентных к цефтазидиму, пефлоксацину и офлоксацину, и транспозонных мутантов, характеризующихся сниженной устойчивостью к отдельным классам антимикробных соединений. Полученные результаты указывают на заметные геномные перестройки при развитии различных типов резистентности у В. pseudo-mallei и близкородственных бактерий, и демонстрируют возможность определения дополнительных молекулярных маркеров, ассоциированных с различными типами лекарственной резистентности у патогенных буркхольде-рий.

При выполнении исследования разработана электронная библиографическая компьютерная база данных per. № 2006620082 «Потенциальные агенты биотерроризма: возбудители особо опасных инфекций и биологические токсины», зарегистрированная в Государственном реестре баз данных Российской Федерации в 2006 г.

Предложенные методологические подходы легли в основу исследовательских проектов 07-04-01568 и 07-04-08660,получивших финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований.

Практическая ценность

Создана коллекция, представленная 14 мутантными штаммами В. pseu-domallei, В. mallei и В. thailandensis с, различными спектрами множественной лекарственной устойчивости и 10 инсерционными мутантами, недостаточными по продукции отдельных мембранных белков и имеющими сниженный уровень резистентности к препаратам классов фторхинолонов и цефалоспоринов. Полученный набор штаммов предназначен для изучения молекулярных механизмов формирования лекарственной резистентности и структурно-функционального анализа поверхностных биополимеров патогенных бурк-хольдерий. Отдельные полирезистентные варианты и инсерционные мутанты со сниженным уровнем устойчивости депонированы в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий РосНИПЧИ «Микроб» (ГКПБ «М»),

Получены рекомбинантные штаммы Е. coli, несущие клонированные последовательности хромосомной ДНК В. pseudomallei - детерминанты резистентности транспортного типа к соединениям фторхинолоновой и аминог-ликозидной групп, предназначенные для структурно-функционального анализа эффлюкс-систем возбудителя мелиоидоза. Рекомбинантный штамм Е. coli ZV1 (КМ 167) депонирован в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий (ГКПБ «М») РосНИПЧИ «Микроб».

В ходе анализа адаптивных модификаций поверхностных и секреторных систем клеток возбудителя мелиоидоза разработаны технологические приемы очистки, идентификации и детекции поверхностных и секреторных биополимеров В. pseudomallei, имеющих значение основных факторов пато-генности микроба. По результатам исследований составлены методические рекомендации «Оценка иммунотропных и иммуногенных свойств поверхностных антигенов Burkholderia pseudomallei» (утверждены директором Волг-НИПЧИ 29.12.1998), методические рекомендации «Выделение, очистка и изучение некоторых иммунобиологических свойств белков клеточных мембран возбудителя мелиоидоза» (утверждены директором ВолгНИПЧИ 28.02.2001).

Предложен набор из 11 олигонуклеотидных праймеров, специфичных последовательностям сайтов связывания с рибосомой мРНК и консервативным фрагментам генов лекарственного эффлюкса буркхольдерий и осуществлена разработка способов анализа транскрипционных профилей патогенных Burkholderia в RT-PCR для выявления дифференциально экспрессирующихся последовательностей геномов при формировании различных фенотипов лекарственной устойчивости у В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis.

Подобраны праймеры для амплификации участка гена ДНК-гиразы А буркхольдерий, включающего регион, детерминирующий устойчивость к хи-нолонам. Осуществлена разработка техники анализа аллельного полиморфизма gyrA, включающая этапы амплификации QRDR, анализа конформапи-онного полиморфизма однонитевых цепей ампликонов (SSCP) и отбора вариантов с атипичными SSCP-профилями, секвекирования «кандидатных» мутантных последовательностей и определения характера и типа мутаций.

Результаты исследований, проведенных в рамках настоящей работы, вошли в материалы руководств «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004), «Опасные инфекционные заболевания. Учебное пособие» (Волгоград, 2006), «Методическое пособие для проведения практических занятий по лабораторной диагностике мелиоидоза с использованием гитамма-имитатора Burkholderia thailandensis КМ-161» (утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Оншценко 16.07.2008).

Материалы диссертации используются при проведении лекционных и практических занятий в ВолгоградНИПЧИ в рамках учебных программ по первичной специализации и усовершенствованию специалистов: «Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму» (утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Оншценко 01.02.2001), «Программы курсов повышения квалификации врачей-бактериологов общей медицинской сети, центров Госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения» (утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Оншценко 28.09.1999), а также при чтении лекций и проведении практических занятий учебных курсов «Молекулярная биология» и «Современные аспекты генодиагностики и биотехнологии» кафедры молекулярной биологии и генетики медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Штаммы В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis обладают выраженной способностью к формировнию резистентности высокого уровня к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп при культивировании на питательных средах с повышающимися концентрациями антиба-териальных агентов.

2. Устойчивые к фторхинолоновым и цефалоспориновым соединениям мутанты буркхольдерий отличаются стабильным сохранением приобретенного фенотипа резистентности и развитием перекрестной устойчивости к отдельным Р-лактамам, аминогликозидам, макролидам, хлорамфениколу и ряду неспецифических ингибиторов.

3. Формирование резистентности множественного типа у микроорганизмов группы «pseudomallei» сопровождается изменениями белкового состава клеточных мембран, являющимися показателем модификации транспортных функций и проницаемости поверхностных структур клеток. Гиперпродукция мажорных мембранных белков Мг 27, 39, 48, 71 и 110 kDa и значительное снижением синтеза протеинов Мг 45 и 49 kDa у мутантов В. pseudomallei и В. thailandensis ассоциирована с высоким уровнем устойчивости к фторхинолоновым и цефалоспориновым антибиотикам.

4. Развитие резистентности множественного типа обусловливает комплексные адаптивные перестройки процессов мембранного транспорта и синтеза поверхностных структур клеток буркхольдерий, выражающиеся в структурных модификациях ЛПС, изменении продукции экзополисахарида и способности секретировать комплекс экстраделлюлярных ферментов.

5. Включение Тп9 и Тп5 в хромосомные локусы детерминант мембранных протеинов 21, 27, 48, 71, 110 kDa В. pseudomallei приводит к снижению устойчивости инсерционных мутантов к препаратам цефалоспоринового и фторхинолонового ряда. Инсерционный мутагенез полирезистентного варианта В. pseudomallei демонстрирует связь утраты устойчивости к цефта-з ид им у с дефектами продукции мажорных мембранных протеинов 27 и 71 kDa.

6. Ведущая роль в формировании множественной антибиотикорезистентно-сти В. pseudomallei принадлежит механизмам эффлюкса, что демонстрирует анализ динамики накопления и выброса стуктурных аналогов антимикробных соединений клетками штамма дикого типа и полирезистентных мутантов, а также снижением устойчивости исходных и мутантных штаммов В. pseudomallei к антибиотикам различных классов в присутствии соединений - блокаторов мембранного транспорта.

7. Сравнительный анализ in silico известных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis является эффективным инструментом выбора последовательностей-мишеней и подбора олигонуклеотидных праймеров для оценки уровня экпрессии генов лекарственных транспортеров MFS, SMR и RND типов.

8. Участие AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE эффлюкс-детерминант в формировании антибиотикорезистентности множественного типа у видов группы «pseudomallei» подтверждается индукцией и возрастанием экспрессии данных лекарственных транспортеров у исходных штаммов и полирезистентных мутантов, культивируемых в присутствии антибиотиков фторхинолонового и цефалоспоринового рядов. Экспрессия клонированных последовательностей AcrB/AcrD/AcrF и QacE эффлюкс-транспортеров возбудителя мелиоидоза в Escherichia coli приводит к появлению резистентности рекомбинантных клонов к препаратам фторхи-нолоновой и аминогликозидной групп.

9. Мутационные изменения ДНК-гиразы А, наряду со снижением проницаемости оболочки и активацией эффлюкс-систем, определяют развитие высокого уровня резистентности к соединениям фторхинолоновой группы у В. pseudomallei и В. mallei. Нуклеот идные замены в QRDR gyrA у мутант-ных штаммов приводят к нескольким типам аминокислотных замен в последовательности белка (Thr83—»lie, Gly81—»Cys и Asp87—>Tyr).

10. Геномы штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis несут участки, структурно сходные с интегронами и представленные генами транспо-заз/интеграз и кодирующими последовательностями детерминант лекарственной устойчивости - эффлюкс-транспортеров MFS и RND семейств. Наличие интегроноподобных структур свидетельствует о потенциальной возможности формирования множественной устойчивости у данных микроорганизмов за счет аккумуляции и горизонтального переноса R-детерминант различных типов.

Апробация работы

Диссертация выполнена на основе 14 государственных плановых тем НИР, в 3 из которых соискатель являлся ответственным исполнителем, и в 3 - научным руководителем. Основные результаты исследований изложены в 79 опубликованных работах, в том числе в четырех патентах на изобретение и трех учебных пособиях.

Результаты исследований по теме диссертационной работы были представлены на международном конгрессе «Vaccine & Immunization» (Manchester, 1999), международной конференции «Problems of biological and ecological safety» (Оболенск, 2000), международных конференциях «Natural infectious diseases» (Ulaan Baator, 2001, 2002, 2003), IV и V межгосударственных науч-но-гграктической конференций «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003; Саратов, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), VI Всероссийской научно-практическая конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней — 2007» (Москва, 2007), II, IV и VI всемирных конгрессах по мелиоидозу (The 2nd World Melioidosis Congress, Bangkok, Thailand, 1998; The 4th World Melioidosis Congress, Perth, Australia, 2001; The 6th World Melioidosis Congress, Khon Kaen, Thailand, 2007), IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государ ств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008).

Объем и структура работы

Диссертация изложена в форме монографии на 266 листах компьютерного текста, состоит из введения, 5 глав, содержащих необходимые литературные справки, теоретические и экспериментальные разделы и иллюстрации в виде 28 таблиц и 83 рисунков, заключения и выводов. Указатель литературы включает 515 источников.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Викторов, Дмитрий Викторович

ВЫВОДЫ

1. На основе модельной системы, включающей штаммы с измененной чувствительностью к антибиотикам, а также технологии молекулярно-генетического анализа факторов резистентности проведено комплексное исследование механизмов множественной устойчивости патогенных буркхольдерий. Показано сочетанное участие в формировании резистентности множественного типа у В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis процессов снижения проницаемости клеточных мембран, экспрессии систем активного выведения ингибиторов из клеток и мутационных изменений генов внутриклеточных мишеней антимикробных соединений.

2. Развитие у штаммов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis высокого уровня устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспори-новой групп сопровождается приобретением резистентности к антимикробным соединениям других классов (р-лактамам, аминогликозидам, макролидам, хлорамфениколу), ряду неспецифических ингибиторов (жирным кислотам, солям желчных кислот, детергентам, красителям), а также заметным снижением вирулентности полирезистентных вариантов для экспериментальных животных.

3. Установлено, что развитие лекарственной резистентности множественного типа у исследуемых видов буркхольдерий сопровождается существенными изменениями белкового состава мембран, являющимися показателем модификации их транспортных функций и проницаемости. В сравнении с исходными штаммами, у полирезистентных производных В. pseudomallei и В. thailandensis наблюдалась гиперпродукция мажорных мембранных белков 27, 39, 48, 71 и 110 kDa и значительное снижение синтеза протеинов 45 и 49 kDa. Резистентные мутанты В. mallei характеризовались снижением продукции группы мембранных белков 21, 42, 45 и 70 -100 kDa.

4. Показано, что инсерционные мутанты В. pseudomallei Вор" с дефектами в продукции мембранных протеинов 21, 27, 48, 71, 110 kDa, индуцированными включением в хромосому транспозонов Тп9 и Тп5, отличаются снижением устойчивости к препаратам цефалоспоринового и фторхинолоно-вого ряда. Инсерционный мутант с фенотипом Cazs PfxR OfxR, чувствительный к цефтазидиму, полученный на основе полирезистентного варианта В. pseudomallei 57576 SMCP CazR PfxR OfxR, демонстрирует связь утраты устойчивости к антибиотику с изменением в продукции мажорных мембранных протеинов 27 и 71 kDa.

5. Структурные модификации ЛПС, выражающиеся в вариации высокомолекулярных ( > 150 kDa) и редукции низкомолекулярных (25 kDa и менее) фрагментов биополимера, снижение уровня продукции экзополисахарида и секреции экстрацеллюлярных ферментов с липазной, лецитиназной и протеолитической активностью указывают на комплексные адаптивные перестройки проницаемости клеточной оболочки и систем мембранного транспорта при развитии у буркхольдерий высокого уровня устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп.

6. Выявлены существенные различия в скорости накопления и количестве аккумулированного клетками штамма дикого типа и полирезистентных мутантов В. pseudomallei бромистого этидия (стуктурного аналога фтор-хинолоновых соединений). Установлено, что мутантные штаммы с преобладающей устойчивостью к препаратам фторхинолоновой группы обладают отчетливо меньшей проницаемостью мембран для ингибитора и максимальной скоростью его эффлюкса. Интенсивность выведения ингибитора из клеток возбудителя возрастает при повышении температуры инкубации и наличии в среде соединения - источника углерода, что свидетельствует об энергозависимом характере изученных процессов.

7. Установлено, что в присутствии верапамила - блокатора мембранного транспорта наблюдается снижение устойчивости исходных и мутантных штаммов В. pseudomallei к антимикробным соединениям фторхинолоно-вой группы, отдельным р-лактамам, аминогликозидам, макролидам и хло-рамфениколу, что подтверждает значимость механизмов эффлюкса в формировании множественной антибиотикорезистентности у возбудителя мелиоидоза.

8. При проведении сравнительного анализа in silico нуклеотидных последовательностей известных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis, выполненного с использованием биоинформационного программного обеспечения на основе опубликованных в Genbank последовательностей геномов буркхольдерий, были обозначены группы детерминант множественной резистентности и подобраны олигонуклеотидные праймеры для амплификации консервативных фрагментов генов лекарственных транспортеров MFS (QacA/EmrB), SMR (QacE) и RND (AcrB/AcrD/AcrF) групп.

9. На основе анализа дифференциально экспрессирующихся последовательностей эффлюкс-транспортеров у исходных штаммов и полирезистентных мутантов, культивируемых в неселектвных условиях и на средах с субъ-ингибирующими концентрациями антибиотиков фторхинолонового и це-фалоспоринового рядов, установлено участие AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE детерминант в формировании антибиотикорезистентности множественного типа у видов группы «pseudomallei». Повышенный конститутивный уровень экспрессии QacA/EmrE и AcrB/AcrD/AcrF эффлюкс-транспортеров у части полирезистентных мутантов позволяет предполагать наличие генетически закрепленных нарушениий в механизмах регуляции данных последовательностей.

10.Проведенное клонирование в Е. coli на векторе pUC19 AcrB/AcrD/AcrF и QacE эффлюкс-транспортеров возбудителя мелиоидоза и анализ их экспрессии в рекомбинантных клонах выявили участие этих детерминант в развитии резистентности у В. pseudomallei к препаратам фторхинолоновой и аминогликозидной групп.

11.Установлено, что полирезистентные мутанты В. pseudomallei и В. mallei с высоким уровнем устойчивости к антибиотикам фторхинолонового ряда несут точечные мутации в QRDR ДНК-гиразы А, приводящие к нескольким типам аминокислотных замен в последовательности белка. Показано, что замена Thr83—»lie является общей для всех исследованных мутантных штаммов, тогда как замены Gly81—»Cys и Asp87—>Туг обнаружены только у PfxRCazR и OfxRCazR мутантов В. pseudomallei. Нуклеотидная замена С—»T в позиции 250 gyrA, выявленная у одного из мутантов В. mallei, не приводит к аминокислотной замене в последовательности белка и может быть классифицирована как silence-мутация.

12.В результате ПЦР-анализа с использованием специфических праймеров, последующего секвенирования ампликонов и исследования гомологичных фрагментов хромосом буркхольдерий in silico установлено, что геномы штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis несут участки, структурно сходные с интегронами и представленные генами транспозаз/интеграз и кодирующими последовательностями детерминант лекарственной устойчивости - эффлюкс-транспортеров MFS и RND семейств. Наличие интег-роноподобных структур свидетельствует о потенциальной возможности формирования множественной устойчивости у данных микроорганизмов за счет аккумуляции и горизонтального переноса R-детерминант различных типов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важным биологическим свойством патогенных буркхольдерий и близких им микроорганизмов является их высокая природная резистентность к воздействию широкого спектра антимикробных соединений, а также защитных факторов иммунной системы макроорганизма (Антонов и др., 1991; Батманов и др., 1995; Brett, Woods, 2000; Vorachit et al., 2000). Наличие этого свойства определяет способность отдельных видов буркхольдерий к длительному персистированию в инфицированном макроорганизме, и создает значительные трудности для успешного лечения вызываемых ими заболеваний.

К настоящему времени накоплен довольно обширный материал об индивидуальной устойчивости патогенных буркхольдерий к антибактериальным агентам (Desai et al., 1998; Kenny et al., 1999; Vorachit et al., 2000; Jenney et al., 2001; Nzula et al., 2002). С одной стороны, препараты тетрациклиново-го, фторхинолонового, цефапоспоринового, карбапенемового рядов и некоторые другие соединения в опытах in vitro оказывают выраженное ингиби-рующее действие на клетки патогенных и условно-патогенных видов данной группы микроорганизмов, с другой - применение этих антибактериальных агентов в условиях персистенции бактерий в организме-хозяине может оказаться малоэффективным (Haussier et al., 1999; Inglis et al., 2004; Azizi et al., 2005). Кроме того, хорошо, известно, что микроорганизмы рода в ходе культивирования в селективных условиях быстро приобретают резистентность к различным антибактериальным агентам, и нередко резистентность носит множественный характер (Rajyaguru, Muszynski; 1997; Но et al., 2002).

Генетика лекарственной резистентности микроорганизмов рода Вигк-holderia является одной из динамично развивающихся областей исследований, учитывая то обстоятельство, что ряд представителей рода способны вызывать тяжелые инфекционные заболевания человека и животных. Молекулярные основы устойчивости видов группы <<pseudomallei» (В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis), на сегодняшний день изучены недостаточно. Более охарактеризованным в этом отношении из перечисленных видов является возбудитель мелиоидоза.

Недавнее завершение международных проектов по секвенированию и первичной аннотации геномов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis (Holden et al., -2004; Nierman et al., 2004; Kim et al., 2005) дает возможность более детально исследовать генетический аппарат микроорганизмов, детерминирующий устойчивость к различным классам антибиотиков, и изучать молекулярные основы формирования у них тех или иных типов лекарственной резистентности. Структурно-функциональный анализ, а также сравнительная оценка вклада различных молекулярных механизмов в формирование множественной резистентности и их взаимодействия представляют собой актуальное направление исследований в области функциональной геномики видов Burkholderia.

Представления о процессах, приводящих к формированию устойчивости бактерий к антибактериальным агентам, являются неотъемлемой частью наших знаний об их адаптационных возможностях. Механизмы, лежащие в основе развития лекарственной резистентности у бактерий весьма разнообразны - это инактивация/модификация антимикробного соединения специализированными ферментами, изменение клеточных мишеней действия антибиотиков, снижение проницаемости клеточных оболочек, активный энергозависимый выброс (эффлюкс) из клеток антибактериальных препаратов. В различных сочетаниях эти молекулярные механизмы могут приводить к развитию множественной резистентности, то есть устойчивости микроорганизма к антимикробным препаратам различной структуры и механизмов действия.

Приступая к выполнению данной работы, мы должны были, в первую очередь, сформировать определенный набор штаммов исследуемых видов микроорганизмов, несущих генетические детерминанты измененной чувствительности к тем или иным группам антибактериальных препаратов. При этом необходимо было учитывать то обстоятельство, что большинство микроорганизмов рода (в том числе, виды, относящиеся к группе «pseudomallei») характеризуются высокой природной устойчивостью к антибиотикам различным групп, являясь, по сути дела, природно полирезистентными. Таким образом, основными задачами начального этапа исследований мы считали подбор фенотипических маркеров устойчивости, анализ появления и наследования которых не был бы затруднителен в силу исходно высокого уровня резистентности штаммов микроорганизмов к соответствующему антибактериальному препарату, и селекцию клонов со стабильно сохраняющимися фенотипами резистентности. Исследования по получению коллекции полирезистентных вариантов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis включали в себя этапы оценки уровней устойчивости исходных штаммов микроорганизмов к антибиотикам различных групп, выбора подходящих селективных маркеров и схем получения резистентных вариантов, анализа динамики формирования и стабильности наследования новых фенотипов устойчивости, а также изучения перекрестной резистентности полученных вариантов к антимикробным соединениям других классов.

В качестве селективных агентов при анализе особенностей формирования различных профилей лекарственной резистентности у В. pseudomallei, В. thailandensis и В. mallei нами были избраны препараты групп цефалоспори-нов Ш поколения (цефтазидим) и фторхинолонов (пефлоксацин, офлокса-цин), отличающиеся высокой активностью в отношении всех имеющихся в нашем распоряжении штаммов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis. Препараты этих классов антимикробных соединений стандартно используются в существующих схемах экстренной и пролонгированной терапии ме-лиоидоза (Inglis et al., 2006; Wuthiekanun, Peacock, 2006), наряду с этим, неоднократно были описаны случаи развития резистентности возбудителя к ним в ходе лечения (White et al., 1989; Dance et al., 1989; Dance et al., 1991; Chaowagul et al., 1997). Кроме того, установлено, что развитие устойчивости к отдельным группам антибиотиков довольно часто сопровождается формированием множественной резистентности. Это, в частности, отмечено для антибиотиков фторхинолонового ряда (Deguchi et al., 1997; Jalal, Wretlind, 1998; Zhang et al., 2001; Jellen-Ritter, Kern, 2001; Join-Lambert et al., 2001; Baucheron et al., 2002; Dewi et al., 2004; Wolter et al., 2004).

Первоначальные попытки получения резистентных к фторхинолонам и цефтазидиму мутантов исследуемых видов буркхольдерий на плотных и жидких питательных средах с двукратным приращением концентрации антибиотиков начиная с ингибирующей не увенчались успехом, что в конечном счете привело нас к выбору схемы селекции, предусматривающей постепенное плавное повышение концентраций антибактериальных агентов, начиная с субъингибирующих. Клоны В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis, стабильно сохраняющие фенотип устойчивости к фторхинолонам или цефтазидиму, были использованы для селекции вариантов с множественной устойчивостью, при этом, для сохранения первичного фенотипического маркера резистентности применялась поочередная смена селектирующих агентов. В результате были отобраны PfxR CazR, CazRPfxR, CazR OfxR и OfxR CazR мутанты штаммов В. pseudomallei, PfxR CazR варианты В. thailandensis, тогда как селекционировать мутанты В. mallei, резистентные одновременно к антимикробным соединениям обеих групп (фторхинолоны и цефалоспорины) не удалось.

Анализ сохранения фенотипов резистентности мутантов при культивировании либо длительном хранении (6 и более месяцев) в неселективных условиях продемонстрировал, что наибольшей стабильностью отличается устойчивость к препаратам фторхинолонового ряда, тогда как устойчивость к цефтазидиму имела тенденцию к снижению при культивировании резистентных вариантов вне селективного давления. Исследования спектров перекрестной устойчивости полученных мутантов показали, что у В. pseudomallei и В. thailandensis резистентность, первично индуцированная препаратами фторхинолонового ряда, а затем цефтазидимом, сопровождается возрастанием устойчивости к другим фторхинолонам, гентамицину, эритромицину, ампициллину и хлорамфениколу, тогда как индукция устойчивости в направлении «цефтазидим-фторхинолоны» приводила к более выраженному возрастанию резистентности к препаратам Р-лактамной и аминогликозидной групп. Интересно, что в работе Rajyaguru J.M. и Muszynski М. J. был получен во многом аналогичный результат на модели В. cepacia - резистентные мутанты, селекционированные хлорамфениколом, имели значительно возросший уровень устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой группы и цефтази-диму (Rajyaguru, Muszynski, 1997).

Несмотря на то, что не удалось выделить мутанты В. mallei с высоким уровнем устойчивости к обеим группам антимикробных соединений, тем не менее, отдельные резистентные к пефлоксацину варианты В. mallei имели отчетливо возросшую устойчивость к другим фторхинолоновым антибиотикам и незначительно увеличенную резистентность к отдельным аминогликозидам и хлорамфениколу.

Определенные характеристики полученных мутантных штаммов, а именно их перекрестная устойчивость к антимикробным соединениям, которые не использовались при селекции, позволили нам сделать предположение о возможной роли процессов снижения проникновения антибиотиков, либо их активного выброса в формировании наблюдаемых фенотипов резистентности и исследовать характер изменений систем мембранного транспорта у полученных полирезистентных вариантов буркхольдерий. Анализ изменений белкового состава клеточных мембран был начальным этапом исследований в данном направлении.

Сравнительное исследование в SDS-PAGE белков наружных мембран штаммов В. pseudomallei дикого типа и их резистентных к отдельным антибактериальным препаратам мутантов показало, что мутантные штаммы, в целом, характеризовались снижением уровня продукции мажорных мембранных протеинов и прекращением продукции отдельных белков с молекулярными весами в диапазонах 39 - 70 kDa и 27 - 30 kDa. Совершенно иной, по сравнению с «монорезистентными» вариантами, характер изменений экспрессии белков наружных мембран был обнаружен у мутантов В. pseudomallei со стабильно сохранямыми PfxR CazR, CazR PfxR, CazR OfxR и OfxR CazR фенотипами резистентности. У всех полирезистентных вариантов наблюдалась гиперпродукция мажорных белков 27, 39, 48, 71 и 110 kDa и, вместе с тем, прекращение синтеза протеина 45 kDa, а также некоторое снижение продукции белка 49 kDa. Характер изменений в продукции мембранных протеинов, сходный с выявленным у полирезистентных мутантов В. pseudomallei, наблюдался также у полирезистентных производных В. thailandensis и, в меньшей степени, у В. mallei, чьи мутанты, резистентные к фтор-хинолоновым антибиотикам, характеризовались прежде всего снижением количества мажорных мембранных белков 21, 42, 45 kDa и группы минорных протеинов 70 - 100 kDa. Проведенные исследования, таким образом, обозначили определенную закономерность в изменении экспрессии протеинов наружных мембран у видов Burkholderia при формировании полирезистентных фенотипов, выражающуюся, наряду с дефектами по отдельным белкам, в возрастании экспрессии группы мембранных протеинов - 110, 71, 48, 39, 27 и 21 kDa.

Известно, что снижение экспрессии или утрата поринов мембран является одной из общих, закономерных черт адаптивного ответа бактерий на воздействие антимикробных соединений (Livermore, 1984; Nikaido, 1989), имеющей, вместе с тем, свои отличительные особенности, как в зависимости от таксономической принадлежности микроорганизма, так и от физико-химических свойств и механизмов действия антибиотика (Guymon et al., 1978; Irvin et al., 1981; Angus et al., 1982; Parr et al., 1987; Bakken et al., 1987;

Aronoff, 1988). Вместе с тем, анализ механизмов устойчивости к антибиотикам различных классов, в том числе хинолонам и их фторированным производным, у различных грамнегативных бактерий показывает, что ограничение поступления антибиотиков вследствие изменения экспрессии поринов наружной мембраны является первичным этапом процесса формирования резистентности, опосредованно приводящим к увеличению частоты мутаций по различным геномным локусам в целом, и дальнейшей селекции клонов с модифицированными мишенями действия препаратов (Cohen et al., 1989; Cham-berland et al., 1989b), либо активированными системами выведения антибиотиков из клеток (Sabath, 1984; Ishii et al., 1991).

Суммируя полученные результаты и известные данные литературы, можно было предположить, что формирование устойчивости к антимикробным препаратам различных классов у В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis обусловлено как возрастанием экспрессии аппарата активного выброса антибиотиков (multidrug efflux), так и снижением проницаемости клеточной оболочки за счет утраты, либо пониженной экспрессии отдельных поринов.

Для подтверждения выдвинутого предположения и более детальной оценки роли мембранных протеинов в реализации резистентности к антимикробным соединениям мы поставили перед собой задачу, используя техники мутагенеза, разработанные ранее для возбудителей мелиоидоза и сапа (Меринова и др., 1997; Меринова, 1998), получить мутанты исследуемых видов буркхольдерий, дефектные по продукции отдельных мембранных белков и провести анализ влияния утраты, либо снижения продукции мембранных протеинов на резистентность к отдельным группам антибиотиков. Кроме того, представлялось интересным получить мутанты со сниженной устойчивостью к тем или иным антибиотикам, используя в качестве исходных штаммов селекционированные полирезистентные мутанты, и исследовать возможные реаранжировки белковых спектров наружных мембран при утрате какого-либо фенотипического маркера резистентности

Мутанты патогенных буркхольдерий, недостаточные по продукции мембранных протеинов (Вор"), были индуцированы включением в хромосому транспозонов Тп9 и Тп5. Полученные мутанты В. pseudomallei и В. mallei отличались дефектами, либо сниженной продукцией ряда мембранных белков и уменьшением устойчивости к цефалоспориновым и фторхинолоновым антибиотикам. Естественно, приведенные данные не являются достаточными для оценки, как таковой, функциональной роли отдельных мембранных протеинов, тем не менее, они обозначают ряд белков (21, 27, 48, 71, 110 kDa), изменения в продукции которых оказывают влияние на уровень резистентности бактерий к антибиотикам различных групп. Для подтверждения связи экспрессии отдельных мембранных протеинов и резистентности исследуемых микроорганизмов к антибактериальным препаратам мы предприняли попытку получения мутантов со сниженной устойчивостью к антибиотикам на основе полирезистентных мутантных штаммов.

Плазмида RPl::Tn9 Rep ts была передана в клетки мутанта В. pseudo-mallei 57576 SMCP CazR PfxR OfxR. Трансконъюганты от скрещивания тестировали на средах с цефтазидимом и пефлоксацином, отбирая клоны со сниженной резистентностью. Удалось выделить клон (В. pseudomallei 57576

S R

SMRT21), утративший резистентность только к цефтазидиму (Caz Pfx OfxR); МПК антибиотика для него составила 12 мкг/мл, что соответствовало уровню штамма дикого типа. Анализ в SDS-PAGE белков наружных мембран В. pseudomallei 57576 SMRT21 демонстрировал, что утрата устойчивости к цефтазидиму сопровождается дефектами продукции мажорных мембранных протеинов 27 и 71 kDa.

Таким образом, результаты серии экспериментов по получению и первичной характеристике инсерционных Вор" мутантов показали, что отдельные протеины наружной мембраны (110, 71, 48, 27 и 21 kDa) могут непосредственно участвовать в процессах формирования у патогенных видов Burkholderia резистентности высокого уровня к антибиотикам фторхинолоновой и цефалоспориновой групп.

В целом, полученные результаты свидетельствовали в пользу того, что мембранные протеины, уровень продукции которых был ассоциирован с измененной чувствительностью к антибиотикам, являются компонентами транспортных систем, участвующих в активном выбросе антибатериальных препаратов из клеток во внешнюю среду либо обеспечивающих селективное проникновение антибиотиков в клетку извне.

Для дальнейшей оценки роли систем мембранного транспорта в развитии множественной антибиотикорезистентности мы провели сравнительные исследования проницаемости клеточных оболочек, процессов энергозависимого эффлюкса антимикробных соединений и их аналогов, и изменений в продукции и транспорте отдельных внеклеточных и поверхностных биополимеров у штаммов буркхольдерий, отличающихся чувствительностью к антибиотикам.

Известно, что наружные мембраны клеток грамотрицательных бактерий служат эффективным барьером, ограничивающим поступление из внешней среды различных соединений, ограничивающих жизнеспособность микроорганизмов (Nikaido, Vaara,1985; Vaara, 1992). Исходно низкая проницаемость поверхностных структур клетки для ряда антимикробных соединений является одной из составляющих внутренней, природной лекарственной резистентности (intrinsic resistance) у ряда видов бактерий. Активация эф-флюкс-систем клетки также вносит свой вклад в реализацию резистентности к токсичным для микроба соединениям. Имея в своем распоряжении ряд штаммов с измененной чувствительностью к антибиотикам мы попытались оценить соотношение снижения проницаемости мембран и процессов эффлюкса в феномене развития множественной лекарственной устойчивости у возбудителя мелиоидоза.

Изучение уровня устойчивости исходных и мутантных штаммов к ряду неспецифических ингибиторов, способных к эффективному проникновению через мембраны бактериальных клеток (жирные кислоты, соли желчных кислот, детергенты и красители) показали существенное снижение мембранной проницаемости полирезистентных мутантов В. pseudomallei для целого ряда соединений различной химической природы и физико-химических свойств. Для оценки составляющей активного эффлюкса в реализации резистентности к антибиотикам и неспецифическим ингибиторам мы исследовали влияние блокаторов мембранного транспорта на уровень устойчивости мутантов и штамма дикого типа к отдельным антибиотикам, а также процессы аккумуляции и выведения из клеток микроорганизмов бромистого этидия (EtBr), часто используемого в анализе транспортных мембранных систем в качестве структурного аналога антимикробных соединений фторхинолонового ряда (Kumar, Worobec, 2002; Godreuil et al., 2003; Brenwald et al., 2003; Xu et al., 2003; Rouquette-Loughlin et al., 2003; Li et al., 2004; Rafii et al., 2005; Martins et al., 2006).

Полученные результаты выявили существенную разницу в скорости накопления и количестве аккумулированного красителя в клетках штамма дикого типа и мутантов с высоким уровнем устойчивости к фторхинолоно-вым и цефалоспориновым антибиотикам, при этом мутантные штаммы с преобладающей устойчивостью к фторхинолоновым соединениям характеризовались отчетливо меньшей проницаемостью мембран для данного соединения. Анализ процессов эффлюкса EtBr показал, что максимальная скорость выброса ингибитора была у клеток полирезистентных мутантов. Энергозависимый характер процесса выброса бромистого этидия клетками мутантного штамма В. pseudomallei был продемонстрирован в серии дальнейших экспериментов при исследовании влияния температуры и наличия источника энергии в среде на кинетику эффлюкса EtBr. Взятые вместе, результаты проведенных исследований подтверждали значимую роль эффлюкса антимикробных соединений при формировании резистентности множественного характера, в связи с чем нами был проведен ряд дополнительных экспериментов по оценке влияния верапамила - соединения, блокирующего мембранные транспортеры (Ng et al., 1994; Banerjee et al., 1996; Choudhuri et al., 2002; Lee et al., 2003), на уровень резистентности исходного и мутантных штаммов В. pseudomallei к антибиотикам различных групп.

Как показал проведенный анализ, присутствие верапамила в целом приводило к снижению устойчивости исходных и мутантных штаммов к антимикробным соединениям, однако характер снижения отличался в каждом конкретном случае. Так, исследование динамики выживания клеток штамма дикого типа и мутантов под воздействием гентамицина продемонстрировала тенденцию к снижению числа жизнеспособных клеток в присутствии фиксированных концентраций верапамила, при этом у мутантных штаммов снижение выживаемости инокулума наблюдали лишь в определенных диапазонах концентраций антибиотика. Оценка влияния верапамила на выживаемость бактериального инокулума в присутствии фиксированных концентраций (субМПК по отношению к штамму дикого типа) антибактериальных препаратов различных групп в большинстве случаев также показала снижение количества жизнеспособных клеток, при этом угнетающее воздействие верапамила на рост культур полирезистентных мутантов хорошо прослеживалось на средах, содержащих препараты фторхинолоновой группы, тетрациклины и аминогликозиды. Отметим, однако, что набор антибиотиков, устойчивость к которым подавлялась верапамилом, для мутантных штаммов оказался существенно уже, чем для штамма дикого типа. Кроме того, у отдельных мутантов уровень устойчивости к таким антибиотикам, как тетрациклин и пиперацил-лин, в присутствии верапамила, напротив, возрастал. Мы не можем пока дать всесторонее объяснение наблюдаемому факту; возможно, речь идет об активации у использованных штаммов отличных от активного эффлюкса механизмов устойчивости к отдельным (3-лактамам и тетрациклинам, индуцируемых верапамилом.

Анализируя роль систем мембранного транспорта и изменения проницаемости клеточных оболочек в формировании антибиотикорезистентности у возбудителя мелиоидоза и близких ему видов Burkholderia, мы ставили перед собой в качестве одной из задач как можно более многоплановую оценку полирезистентных фенотипов у данной группы бактерий, в связи с чем нами были проведены исследования изменчивости некоторых поверхностных и внеклеточных биополимеров у полирезистентных мутантов В. pseudomallei, а именно изменений в структуре ЛПС, способности продуцировать экзополи-сахарид и внеклеточные ферменты «агрессии», то есть анализ модификации клеточных компонентов, причисляемых к факторам патогенности микроорганизма (Алексеев и др., 1984; Алексеев и др., 1994; Пивень, Илюхин, 2000; Brett, Woods, 2000).

Роль ЛПС, как внешнего барьера для различных антимикробных соединений, обусловлена его определенными физико-химическими характеристиками - анионными свойствами, числом межмолекулярных связей в коро-вом регионе и плотностью упаковки жирнокислотных цепей липида А (Snyder et al., 1999; Wiese et al., 1999). Барьерная функция ЛПС многократно подтверждена многочисленными исследованиями свойств мутантов различных видов бактерий, дефектных по продукции отдельных структурных компонентов ЛПС (Sukupolvi, Vaara, 1989; Plesiat, Nikaido, 1992; Vuorio, Vaara 1992a; Vuorio, Vaara 1992b; Helander et al., 1994; Helander et al., 1995; Plesiat et al., 1997; Plesiat, Vaara 1999; Nesper et al., 2001). Выявление возможных модификаций ЛПС при селективном воздействии антимикробных соединений, по нашему мнению, давало возможность более широко обозначить вероятные механизмы, лежащие в основе феноменологии множественной антибиотикорезистентности возбудителя мелиоидоза.

По данным SDS-PAGE, ЛПС-профили мутантов В. pseudomallei PfxR OfxR фенотипов отличались от исходного штамма числом и количественной выраженностью отдельных ЛПС-паттернов практически во всех диапазонах фракционирования - наблюдались вариации в подвижности высокомолекулярных ( > 150 kDa) и существенная редукция числа низкомолекулярных (25 kDa и менее) фрагментов, что мы рассматриваем как свидетельство наличия структурных модификаций биополимера, сопряженных с возрастанием устойчивости к антибиотикам фторхинолоновой группы. Логично предполагать, что изменения структуры ЛПС вносят свой вклад в изменение проницаемости клеточных оболочек мутантов В. pseudomallei и формирование устойчивости к отдельным антимикробным соединениям. Как было отмечено выше, структурные модификации ЛПС встречаются у мутантов различных видов бактерий с фенотипом множественной антибиотикорезистентности, часто, однако, изменения структуры ЛПС не являются ведущим фактором формирования резистентности, а скорее следствием комплексных адаптивных реакций клеток, тем не менее, дающим микроорганизмам дополнительные селективные преимущества (Chamberland et al., 1989а; Rajyagura, Mus-zynski, 1997; Ishikawa et al., 2002; Poole, 2002b).

Экзополисахарид (капсульный полисахарид), продуцируемый многими видами грамотрицательных и грамположительных бактерий, является одним из важнейших факторов вирулентности (Pier et al., 1987; Cabrai et al., 1987; May et al., 1991; Yu et al., 1995; Pier et al., 2001; Yu, Head 2002; Vuong et al., 2004), вместе с тем, неоднократно была показана роль экзополисахарида как экранирующего барьера в защите клеток бактерий от воздействия антибиотиков и антисептических соединений (Nickel et al., 1985; Morris et al., 1996; Vandenbroucke-Grauls, 1996; Desai et al, 1998; Ali et al., 2000; Hentzer et al., 2001; Campanac et al., 2002; Drenkard, Ausubel, 2002; Cunha et al., 2004; Arci-ola et al., 2005; Cerca et al., 2005). Подчеркнем также, что утрата способности продуцировать экзополисахарид также в отдельных случаях сопровождается повышением устойчивости микробов к некоторым группам антимикробных соединений, в частности, подобные особенности формирования резистентности к полипептидным антибиотикам были описаны у X. campestris, Sphingo-monas spp. и E. coli (Pollock et al., 1994).

Исследования изменений продукции экзополисахарида у полирезистентных мутантов различных видов Burkholderia мы проводили с использованием двух методических подходов. Качественно способность продуцировать экзополисахарид оценивали методом, основанным на избирательном окрашивании экзополисахарид-негативных колоний микроорганизмов липо-фильным красителем судан черным В (Liu et al., 1998); для количественного соотнесения экзополисахарид-продуцирующей активности мутантных штаммов буркхольдерий за основу был взят метод окрашивания биопленок, формируемых бактериями на твердых субстратах (Ngwai et al., 2006).

При анализе данных, полученных в этой серии экспериментов, можно видеть, что дефекты в продукции экзополисахарида отмечались, прежде всего, у мутантных штаммов В. pseudomallei и В. mallei, имеющих высокий уровень устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы, тогда как у мутантов, при получении которых в качестве селективных факторов первыми были использованы препараты группы цефалоспоринов, вообще не было выявлено вариантов со сниженной продукцией экзополисахарида, напротив, все штаммы этой группы обладали даже несколько более высокими показателями формирования биопленок.

Характер варьирования продукции экзополисахарида у мутантов буркхольдерий, принадлежащих к различным фенотипическим классам резистентности, по-видимому, является отражением изменений в экспрессии различных секреторных систем бактерий, в том числе, задействованных в транспорте компонентов данной поверхностной структуры. В пользу этого свидетельствуют также результаты изучения спектров внеклеточных ферментов полирезистентных мутантов.

Приобретение фенотипа множественной антибиотикорезистентности в ряде случаев может сопровождаться функциональной модификацией секреторных систем клеток I, II и IV типа (Poole, 2001а; Poole, 2002а; Poole 2002с; Poole, 2004а; Poole, 2005; Marquez, 2005), что, как правило, приводит к значительным изменениям отдельных фенотипических свойств микроорганизмов. Как отмечалось ранее, некоторые из таких полирезистентных вариантов обладают повышенным уровнем продукции экзополисахарида и большей био-фильм-формирующей способностью. Модификации спектров секретируемых белков, вызванные изменениями экспрессии секреторных аппаратов I, II (gsp, general secretory pathway) и IV типов, также является характерной особенностью изолятов с множественной антибиотикорезистентностью (Poole et al., 1993; Schlor et al., 1997; Hayashi et al., 2000; Peng et al., 2005; Linares et al., 2005; Gil et al., 2006; Zhu et al., 2006; Posadas et al., 2007).

Для оценки возможных модификаций секреторной активности полирезистентных мутантов В. pseiidomallei мы исследовали спектры их экстрацел-люлярных протеинов и вариабельности ферментативной активности культу-ральных супернатантов бактерий. Полученные результаты обозначили определенную закономерность в изменении специфической экстрацеллюлярной энзимной активности у штаммов В. pseudomallei с различными фенотипами резистентности. Мутанты, имеющие фенотип множественной резистентности, в целом, характеризовались снижением энзимной активности культу-ральных фильтратов, по сравнению с исходными штаммами и «монорезистентными» производными. Отметим, что полирезистентные варианты с высоким уровнем устойчивости к препаратам фторхинолонового ряда не продуцировали внеклеточных липаз и лецитиназ, кроме того, PfxR CazR фенотип практически полностью утрачивал экстрацеллюлярную протеолитическую активность.

В последнее время у грамотрицательных и грамположительных бактерий интенсивно изучается один из механизмов множественной лекарственной устойчивости, представленный системами активного энергозависимого транспорта и выброса антимикробных соединений из клеток во внешнюю среду (multidrug efflux) (Ma et al., 1994; Nikaido, 1994; Nikaido et al., 1998; Kohler et al., 1999; Van et al., 2000; Borges-Walmsley, Walmsley, 2001; Mark-ham, Neyfakh, 2001; Poole, 2001b; Poole, 2004b; Saidijam et al., 2006). Большинство из выявленных транспортных систем резистентности специфичны для довольно узкого ряда структурно сходных субстратов, однако идентифицированы и мультиэкспортеры (multidrug efflux pumps), «оперирующие» с широким набором даже структурно различных антибиотических соединений (Nikaido, 1998; Zgurskaya, Nikaido, 2000). Известные на сегодня бактериальные лекарственные мультитранспортеры принадлежат к 6 различным функциональным семействам транспортных протеинов: ABC (ATP binding cassette), MFS (Major Facilitator Superfamily), RND (Resistance / Nodulation / Division), SMR (Small Multidrug Resistance), MATE (Multidrug and Toxic Compound Extrusion), MET (Multidrug Endosomal Transporter) (Paulsen et al., 2001).

Множественная резистентность к антибактериальным соединениям, обусловленная эффлюкс-системами, широко распространена у микроорганизмов, в том числе патогенных. Значимость механизмов лекарственного эффлюкса в развитии резистентности к антибиотикам различных классов у видов группы «pseudomallei» на сегодняшний день не вполне ясна; имеются отдельные сообщения о роли эффлюкс-транспортеров RND суперсемейства в реализации устойчивости к аминогликозидным и макролидным соединениям у В. pseudomallei (Moore et al., 1999a; Chan et al., 2004b; Chan, Chua, 2005), тогда как транспортные механизмы формирования множественной устойчивости к антибиотикам у В. mallei и В. thailandensis вообще не изучены.

Мы использовали технику дифференциального дисплея мРНК для исследования экспрессии последовательностей геномов, гомологичных некоторым известным на сегодняшний день efflux-детерминантам MFS, SMR и

RND семейств транспортных протеинов, у исходных и мутантных штаммов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis в процессе селективного воздействия антимикробными препаратами фторхинолоновой и цефалоспориновой групп. Первичным этапом этого раздела исследований был сравнительный анализ in silico нуклеотидных последовательностей известных и предполагаемых генов лекарственного эффлюкса В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis, выполненный с использованием биоинформационного программного обеспечения на основе опубликованных в Genbank последовательностей геномов буркхольдерий группы <<pseudomallei».

Исследование представленных в Genbank геномных сиквенсов штаммов В. pseudomallei К96243, В. pseudomallei 1710b, В. mallei АТСС23344 и В. thailandensis Е264 показали наличие большого числа кодирующих последовательностей, гомологичных детерминантам лекарственных транспортеров MFS типа. Группирование кодируемых обозначенными генами протеинов по числу точных соответствий в участках их аминокислотных последовательностей с использованием алгоритма Clustal W (Thompson et al., 1994) и оценка их гомологии известным MFS-протеинам показала, что около половины MFS эффлюкс-транспортеров В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis принадлежит к DHA2 (Drug/Hydrogen Antiport) семейству вторичных транспортеров, при этом большая часть из них высокогомологична лекарственным муль-титранспортерам QacA/EmrB субсемейства, а небольшую группу составляют гомологи Bcr/CflA субсемейства. Принадлежащие к данным группам транспортные белки различных бактериальных видов, как сообщалось, осуществляют энергозависимый выброс структурно разнородных антимикробных соединений из клеток, во внешнюю среду (Putman et al., 2000; Saidijam et al., 2006).

Несомненный интерес представляет также характер локализации детерминант MFS-транспортеров в геномах В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis. Кодирующие последовательности MFS-протеинов расположены в области генных кластеров тРНК, транскрипционных регуляторов систем транспорта компонентов полисахарида, флагеллярных генов, генов консервативного метаболизма, генных кластеров секреторных систем II и III типов. Отметим также наличие последовательностей IS-элементов и генов транспо-заз в непосредственной близости от локусов многих MFS-транспортеров, что позволяет предполагать важную роль транспозиционных событий в формировании этих фрагментов геномов.

Последовательности геномов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailanden-sis, гомологичные SMR транспортерам EmrE/QacE группы, как показал проведенный анализ, расположены на хромосоме 1 у всех трех видов буркхоль-дерий и локализованы в области генных кластеров, кодирующих компоненты консервативных метаболических путей и АТФ-зависимых секреторных систем. Сравнение аминокислотных последовательностей EmrE микроорганизмов группы «pseudomallei», других буркхольдерий и видов отдаленой гете-рологии продемонстрировало полную идентичность этих протеинов у В. pseudomallei и В. mallei и отличия от них по 9 аминокислотам у соответствующего белка В. thailandensis. Оказалось также, что белок EmrE В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis структурно более сходен с SMR-транспортерами В. phymatum, В. phytofirmans, В. xenovorans, видов Ralstonia, Serracia и Klebsiella, чем с EmrE В. cenocepacia и некоторых других видов буркхольдерий.

В отношении эффлюкс-детерминант, кодирующих транспортеры RND суперсемейства, анализ геномных сиквенсов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis показал, что большинство из трехкомпонентных RND эффлюкс-систем у данных видов буркхольдерий локализовано на хромосоме 1 в областях генных кластеров транспортных систем аминокислот и азотистых оснований, генов синтеза и транспорта фимбриальных структур, систем секреции сидерофоров и гемолизинов (гомологов HlyB-HlyD), генов пуринового и ли-пидного обмена, генов контроля клеточного цикла.- В большинстве случаев, последовательности RND эффлюкс-систем представлены оперонами, состоящими из дивергентно транскрибируемого гена транскрипционного регулятора, гена вспомогательного белка MFP семейства, гена транспортера и гена порина наружной мембраны.

Проведенный анализ гомологии аминокислотных последовательностей обозначенных RND транспортеров буркхольдерий и протеинов - представителей различных групп RND суперсемейства показал прнадлежность большинства предполагаемых эффлюкс-белков данной категории к НАЕ1 (Ну-drophobe/amphiphile efflux-1) семейству транспортеров и максимальную степень сходства с лекарственными мультиэкспортерами AcrB/AcrD/AcrF и Ye-gO/YegN типов (Tseng et al., 1999).

In silico исследование предполагаемых детерминант антибиотикорези-стентности транспортного типа В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis с использованием биоинформационных технологий продемонстрировало разнообразие генетических механизмов, посредством которых у них может реа-лизовываться множественная устойчивость к антимикробным соединениям, а обозначенные по результатам анализа группы детерминант множественной резистентности были использованы при подборе олигонуклеотидных прай-меров для детекции генов лекарственного эффлюкса в ПЦР и изучении их экспрессии в неселективных условиях и при воздействии антибиотиков. Набор праймеров для амплификации последовательностей эффлюкс-детерминант включал олигонуклеотиды, специфичные консервативным фрагментам CDS транспортеров MFS (QacA/EmrB группа гомологии), SMR (QacE) и RND (AcrB/AcrD/AcrF группа) типов. В последнем случае были использованы три пары праймеров для детекции участков кодирующих последовательностей, гомологичных идентифицированным ранее генам эффтокс-транспортеров В. pseudomallei AmrB (Moore et al., 1999b) и BpeB (Chan et al., 2004a), а также предполагаемых RND эффлюкс-транспортеров

BPSS1119/BMAA1045), структурно сходных с MexF P. aeruginosa (Kohler et al., 1997).

Участие эффлюкс-транспортеров AcrB/AcrD/AcrF, QacA/EmrB и QacE групп в формировании антибиотикорезистентности множественного типа оценивали по результатам RT-PCR анализа мРНК транспортеров у исходных штаммов и полирезистентных мутантов, культивируемых в неселектвных условиях и на средах с субъингибирующими концентрациями антибиотиков фторхинолонового и цефалоспоринового рядов.

В неселективных условиях исходные штаммы и большинство резистентных мутантов имели невысокий уровень конститутивной экспрессии AcrB/AcrD/AcrF транспортеров AmrB и ВреВ, за исключением двух мутантов В. pseudomallei OfxR CazR и CazR PfxR фенотипов, у которых уровень экспрессии AmrB был существенно выше. Экспрессия BPSS1119/BMAA1045 в неселективных условиях была отмечена только у CazR PficR мутанта В. pseudomallei. Рост в присутствии антибиотиков вызывал заметное возрастания количества мРНК ВреВ, AmrB и BPSS1119/BMAA1045 и у диких, и у мутантных штаммов, при этом все же более выраженное возрастание экспрессии RND эффлюкс-детерминант наблюдалось у полирезистентных производных.

Уровень экспрессии эффлюкс-транспортеров QacA/EmrB был приблизительно одинаковым у исходных и мутантных штаммов при росте на средах, не содержащих антимикробных соединений; заметное увеличение мРНК данных эффлюкс-генов мы наблюдали у мутантных штаммов буркхольдерий с высоким уровнем устойчивости к препаратам фторхинолоновой группы при культивировании на средах с пефлоксацином. Уровень мРНК QacE также оказался приблизительно одинаковым у большинства штаммов буркхольдерий, выращенных на неселективных средах. В селективных условиях мы отмечали увеличение экспрессии QacE, более выраженное у мутантных штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis.

Полученные результаты, таким образом, указывают на участие эф-флюкс-систем различных типов в реализации множественной устойчивости буркхольдерий группы «pseudomallei» к антибиотикам фторхинолонового ряда, цефалоспоринам и другим антимикробным соединениям. Отметим, что факты сочетанного действия эффлюкс-систем различных типов при развитии множественной устойчивости известны для ряда бактериальных видов, в том числе природнорезистентных (Germ et al., 1999; Lee et al., 2000). Повышенный уровень экспрессии гомологов QacA/EmrE и AcrB/AcrD/AcrF в отсутствии селективного воздействия, наблюдаемый нами у части мутантов, возможно, свидетельствует о генетически закрепленных нарушениях механизмов регуляции последовательностей, что, например, было показано в отношении гиперэкспрессии эффлюкс-оперона mexAB-oprM P. aeruginosa (Adewoye et al., 2002).

Еще одно подтверждение участия QacE и AcrB/AcrD/AcrF эффлюкс-систем В. pseudomallei в формировании устойчивости к антимикробным соединениям различных групп было получено в экспериментах по shotgun-клонированию ДНК CazR PfxR мутанта В. pseudomallei, в результате которого удалось выделить рекомбинантные клоны Е. coli, экспрессирующие эф-флюкс-транспортеры AcrB/AcrD/AcrF и QacE типов возбудителя мелиоидоза. Анализ спектров резистентности полученных рекомбинантных штаммов к антимикробным соединениям различных классов и исследование уровня резистентности рекомбинантных клонов в присутствии соединений - блокато-ров мембранных каналов показали участие эффлюкс-последовательностей в формировании устойчивости к препаратам фторхинолоновой и аминоглико-зидной групп.

Исследования механизмов резистентности к хинолоновым антибиотикам и их фторированным производным у различных бактериальных видов демонстрируют значимую роль точечных мутаций в особом участке генов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, определяющем высокую резистентность к фторхинолонам - регионе QRDR (quinolone resistance determining region) (Baramval et al., 2002; Ruiz, 2003). Мы провели анализ возможных мутационных изменений в QRDR ДНК-гиразы для оценки их значения в формировании резистентности исследуемых видов Burkholderia к препаратам фторхи-нолонового ряда.

Регион последовательности ДНК-гиразы А, мутационные изменения в котором определяют соответствующие аминокслотные замены во взаимодействующих с антибиотиком участках молекулы белка (QRDR), был предварительно определен нами путем поиска участка gyrA буркхольдерий, гомологичного известным QRDR ДНК-гираз, представленных в Genbank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). По результатам alignment-анализа аннотированных последовательностей gyrA В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis и известных последовательностей QRDR gyrA нами были подобраны праймеры для амплификации фрагмента гена, включающего предполагаемый QRDR.

Поиск возможных мутационных изменений в предполагаемом QRDR ДНК-гиразы А буркхольдерий включал в себя несколько технологических этапов: амплификацию исследуемого фрагмента гена в ПЦР, анализ конфор-мационного полимо|рфизма однонитевых цепей ампликонов (SSCP, single strand conformation polymorphism) и отбор вариантов с атипичными SSCP-профилями, секвенирование и сопоставление нуклеотидных последовательностей QRDR исходных штаммов и «кандидатных» мутантных последовательностей.

Изменения в SSCP-профиле QRDR gyrA были обнаружены у мутантных штаммов PfxR CazR и OfxR CazR мутантов В. pseudomallei и резистентных к фторхинолонам мутантов В. mallei. Секвенирование QRDR ампликонов из этих штаммов показало наличие единичных и двойных нуклеотидных замен в регионе gyrA 240 - 260 п.н., а трансляция in silico мутантных последовательностей gyrA позволила определить несколько типов аминокислотных замен в QRDR-области фермента.

Аминокислотная замена Thr83—»Ile была общей для всех исследованных мутантных штаммов. Замены Gly81—»Cys и Asp87—>Туг были обнаружены только у Pfx Caz и Ofx Caz мутантов В. pseudomall ei, соответственно. Кроме того, у одного из мутантов В. mallei была выявлена нуклеотидная замена С—»T в 250 нуклеотидной позиции гена, не приводящая к аминокислотной замене, и классифицированная нами как silence-мутация. Интересно, что описанные в работе Maeda Y. et al., аминокислотные замены QRDR GyrA у резистентных к хинолонам природных изолятов В. glumae также затрагивают позицию 83 последовательности белка (Maeda et al., 2004).

Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что мутационные изменения мишеней действия антимикробных соединений (в данном случае, ДНК гиразы А), наряду с активацией систем лекарственного эффлюкса, также вносят свой вклад в формирование наблюдаемых фенотипов множественной антибиотикоустойчивости у В. pseudomallei и В. mallei. Отметим, что сочетание мутаций gyrA и механизмов активного выведения фторхинолонов из клеток неоднократно показано у различных бактериальных патогенов (Chen, Lo, 2003; Dewi et al., 2004; Ricci et al., 2004; Payot et al., 2004).

Исследования систем генетического обмена возбудителей мелиоидоза и сапа (Меринова и др., 1990; Меринова и др., 1997; Меринова и др., 1998; Меринова и др., 2000) доказали возможность горизонтального переноса и приобретения данными микроорганизмами R-детерминант в составе мобильных генетических элементов. В настоящей работе определенное внимание было уделено поиску и первичной характеристике интегронов - генетических элементов, способных включать в свой состав индивидуальные генные кассеты (в том числе детерминанты антибиотикорезистентности) по механизму сайт-специфической рекомбинации (Hall, Collis, 1995; Rowe-Magnus, Mazel, 2001; Fluit, Schmitz, 2004; Nogrady et al, 2005).

Для скрининга сходных с интегронами последовательностей В. pseu-domallei, В. mallei и В. thailandensis был использован ПЦР-анализ с прайме-рами, специфичными фрагментам гена интегразы Intll и фланкирующим последовательностям области вставки генных кассет (Bass et al., 1999). Последующий электрофоретический анализ продуктов реакции показал наличие ампликонов размерами от 100 п.н. до 1200 п.н. у отдельных штаммов В. pseu-domallei и В. thailandensis. Продукты ПЦР из штаммов В. thailandensis Е299 и В. pseudomallei 140 были секвенированы и проанализированы на предмет гомологии с последовательностями ДНК, доступными в Genbank.

Установлено, что продукты амплификации ДНК В. thailandensis Е299 представляют собой фрагменты кодирующей последовательности, имеющей высокую степень сходства с генами транспозаз/интеграз буркхольдерий, вместе с тем, результаты полученные в части, касающейся определения нуклео-тидной последовательности ампликона 340 п.н. В. pseudomallei 140, оказались несколько неожиданными. Сравнение нуклеотидной последовательности данного ДНК-фрагмента с аннотированными последовательностями геномов семейства Burkholderiaceae указывает на принадлежность секвениро-ванного ампликона к кодирующим последовательностям транспортных мембранных протеинов ABC (ATP Binding Cassette) семейства, предположительно являющихся компонентами систем транспорта аминокислот (branched chain amino acids transporters). Анализ данных последовательностей геномов буркхольдерий и видов других родов семейства показал наличие в их структуре многочисленных участков гомологии рекомбинационным сайтам интег-ронов, с учетом консенсус-последовательностей которых и были сконструированы использованные нами для скрининга праймеры (Bass et al., 1999).

Следует ли однозначно относить секвенированные нами последовательности к фрагментам структурных компонентов интегронов? Этот вопрос, по нашему мнению, требует дальнейшего изучения. По крайней мере, анализ геномных регионов буркхольдерий, включающих последовательности, имеющие максимальные показатели сходства с секвенированными амплико-нами В. thailandensis Е299, демонстрирует наличие интегроноподобных структур, включающих ген транспозазы/интегразы и гены различной функциональной направленности, в том числе CDS, аннотированные как детерминанты лекарственной устойчивости (гены эффлюкс-транспортеров MFS и RND типов).

Заключительная часть нашего исследования была посвящена анализу перспектив молекулярного типирования штаммов буркхольдерий с различными спектрами антибиотикорезистентности. Мы апробировали техники типирования, основанные на амплификации полиморфных ДНК с произвольным праймером (RAPD) и ПЦР-анализе с праймером, специфичным консервативному региону интеграз intll, для дифференциации штаммов В, pseudo-mallei дикого типа, селекционированных полирезистентных вариантов и транспозонных мутантов со сниженной устойчивостью к отдельным классам антибиотиков.

Типирование с использованием произвольного праймера показало заметную межвидовую вариабельность RAPD-паттернов и их более консервативный характер у производных того или иного штамма. Транспозонные мутанты В. pseudomallei со сниженной резистентностью к фторхинолонам и цефтазидиму были распределены в три достаточно обособленные друг от друга группы сходства RAPD-профилей, что может свидетельствовать о сходном характере генетических перестроек, вызванных инсерциями Тп5, внутри каждой из групп сходства. Интересно также, что две отдельные группы сходства RAPD-паттернов были образованы штаммами В. pseudomallei с преобладающей резистентностью к PFX, OFX или CAZ. Также удалось обнаружить заметные различия в фингерпринтах содержащих интегразу фрагментов ДНК. Два из трех проанализированных мутантов В. pseudomallei, высокорезистентных к CAZ, PFX и OFX, оказались фактически идентичны по спектру ампликонов, тогда как один мутантный штамм оказался более сходен с исходным. Как и в случае RAPD-анализа, различные виды буркхольде-рий формировали достаточно обособленные группы сходства ДНК-профилей. Полученные результаты, по нашему мнению, говорят о заметных геномных перестройках при развитии различных типов резистентности у В. pseudomallei и близкородственных бактерий, и, что может быть важно для дальнейшей разработки молекулярной эпидемиологии данных бактерий, свидетельствуют о возможности определения дополнительных молекулярных маркеров, ассоциированных с различными типами лекарственной резистентности.

Таким образом, настоящие исследования по интересующей нас проблеме позволили идентифицировать основные группы молекулярных механизмов, ответственных за реализацию множественной устойчивости бактерий группы «pseudomallei» к антимикробным соединениям и разработать комплекс методических подходов для их дальнейшего более детального анализа. На основе модельной системы, включающей штаммы с измененной чувствительностью к антибиотикам, а также технологии молекулярно-генетического анализа факторов резистентности проведено комплексное исследование механизмов множественной устойчивости патогенных буркхоль-дерий и показаны принципиальное участие в формировании резистентности множественного типа у В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis процессов снижения проницаемости клеточных мембран, экспрессии, систем активного выведения ингибиторов из клеток и мутационных изменений генов внутриклеточных мишеней антимикробных соединений, а также особенности развития полирезистентности, заключающиеся в сочетанном проявлении перечисленных механизмов.

Все это дает возможность наметить ближайшие перспективы работ в области функциональной и сравнительной геномики лекарственной резистентности патогенных буркхольдерий - изучение механизмов индукции и регуляции экспрессии отдельных эффлюкс-транспортеров, получение коллекций мутантов буркхольдерий с инакгивированными генами лекарственного эффлюкса, сравнительный анализ экспрессии белков клеточных мембран штаммов с измененной чувствительностью к антибиотикам с использованием техники протеомных исследований, разработка систем анализа экспрессии детерминант антибиотикорезистентности на основе технологии cDNA-чипов.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Викторов, Дмитрий Викторович, 2009 год

1. Алексеев В.В., Калей Г.М., ,Локтионов A.M. Идентификация клеточных антигенов возбудителя мелиоидоза методом двумерного иммуноэлектрофореза. // // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1984. — № 1. - С.62-65.

2. Антонов В. А. Первичная характеристика плазмид возбудителя мелиоидоза: Авто-реф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1995. - 21 е.

3. Антонов В.А., Илюхин В.И. Молекулярно-генетические подходы к диагностике и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиодоза // Мол. генет. микробиол. вирусол. 2005. - № 2. - С.3-9.

4. Антонов Ю.В., Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Батманов В.П. Чувствительность псевдомонад к используемым антибактериальным препаратам // Антибиот. химиотер. 1991а.1.- С. 14-16.

5. Антонов Ю. В., Поповцева Л. Д., Ярулин Р. Г., Илюхин В. И. Проблемы резистентности возбудителя мелиоидоза к антибиотикам // Антибиот. химиотер. 1991b. - № 10. -С.26-28.

6. Батманов В.П., Илюхин В.И., Антонов Ю.В. Лабораторный контроль эффективности химиотерапии мелиоидоза// Антибиот. химиотер. 1995. -т.40. - С.41-45.

7. Беляков В. Д., Ряпис Л. А., Илюхин В. И. Псевдомонады и псевдомонозы. Москва: Медицина. 1990. - 224 с.

8. Гришкина Т. А., Меринова Л. К. Изучение спонтанной фагопродукцни Pseudomonas pseudomallei и круга "хозяев" мелиоидозных фагов среди представителей рода Pseudomonas II Микробиол.журн. 1993. - № 4. - С.43-47.

9. Замараев В. С., Антонов В. А., Илюхин В. И., Захарова И. Б. Выделение и первичная характеристика плазмид Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei I/ Мол. генет. микробиол. вирусол. 1998. - № 4. - С.28-33.

10. Захарова И. Б., Викторов Д. В., Замараев В. С. Клонирование и экспрессия 7.55 т.п.н. Kpnl фрагмента плазмиды pPMl Burkholderia pseudomallei в Escherichia coli II Мол. генет. микробиол. вирусол. 2002. - № 2. - С. 19-22.

11. Ильина Т.С. Механизмы горизонтального переноса генов: роль бактериофагов и ин-тегронов в эволюции патогенных бактерий // Мол.генет.микробиол.вирусол. 2003. - № 4. - С. 3-10.

12. Илюхин В.И. Псевдомонадные инфекции в патологии человека // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1985. -№2. - С. 110-114.

13. Илюхин В. И., Плеханова Н. Г., Седина Т. В., Антонов В. А. Burkholderia thailanden-sis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция // Мол. генет. микробиол. вирусол. — 2002. № 1. — С.7-11.15