Плазмидные гены, определяющие синтез микроцина С51, и регуляция их экспрессии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Фоменко, Дмитрий Эдуардович

• Фоменко, Дмитрий Эдуардович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фоменко, Дмитрий Эдуардович

Содержание

Стр.

Введение

Обзор литературы

1. Общая характеристика микроцинов

2. Микроцины типа В

2.1. Микроцин В17

2.1.1. Структура и биосинтез микроцина В17

2.1.2. Механизм антибиотического действия микроцина В17

2.1.3. Генетический контроль синтеза микроцина

В17 и иммунитета к нему

2.2. Другие микроцины типа В

3. Микроцины типа С

3.1. Структура и действие

3.2. Генетический контроль синтеза микроцинов С типа

4. Микроцины типа Б

5. Микроцин типа Е

6. Микроцин типа Н

7. Микроцин 125

8. Микроцины типа А

9. Колицины V как микроцины

Материалы и методы

Результаты и обсуяедение

1. Анализ продуктов экспрессии генов рекомбинантных плазмид, определяющих синтез микроцина С51

2. Определение нуклеотидной последовательности

микроцинового оперона

3. Изучение функций отдельных генов микроцинового оперона

4. Изучение регуляции экспрессии генов микроцинового оперона

5. Влияние продукции микроцина С51 на свойства вакцинного

штамма Shigella flexneri

Заключение

Выводы

Литература

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Плазмидные гены, определяющие синтез микроцина С51, и регуляция их экспрессии»

Введение

Актуальность темы.

Проблема антагонистических взаимоотношений микроорганизмов в природных экологических системах вызывает пристальное внимание исследователей - специалистов различных областей биологии и медицины. Одним из существенных аспектов этой проблемы является изучение способности микроорганизмов продуцировать антибиотические вещества. Работы, связанные с поиском и исследованием новых и уже известных антибиотиков, проводятся в большом количестве лабораторий во всех развитых странах мира; эти исследования имеют огромное значение для современной медицины.

В 1976 г. в результате поиска антибиотических веществ при выращивании бактерий семейства Enterobacteriaceae на бедных питательных средах была обнаружена новая группа антибиотиков, названных микроцинами. Микро-цины - это низкомолекулярные антибиотики пептидной природы с широким спектром действия; они активны, главным образом, в отношении грамотрица-тельных бактерий. При исследовании микроцинов были выявлены новые, необычные химические структуры. В биосинтезе наиболее исследованного мик-роцина В17 были обнаружены новые типы посттрансляционных модификаций. Микроцины вызывают сейчас большой интерес. Свидетельством этого может быть цитата из статьи д-ра J. Liu (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, 91:4618): "Среди недавно открытых антибиотиков микроцины являются ярчайшим примером богатства химии и биологии... и изобретательности природы в создании широкого разнообразия необычных структур антибиотиков, которые химики-синтетики могли бы вообразить лишь в самых горячих мечтах".

Синтез микроцинов и иммунитет к собственному микроцину клетки-продуцента в большинстве изученных случаев определяются плазмидами. Исследование новой группы специфических плазмидных генов, участвующих в синтезе микроцинов, продуктов этих генов, регуляции их экспрессии представляет несомненный интерес. Изучение генетического контроля синтеза

микроцинов является частью более широкой проблемы регуляции синтеза вторичных метаболитов бактерий. Система плазмидных генов, определяющих продукцию микроцинов - удобная модель для изучения экспрессии генов при замедлении и прекращении роста бактерий, т.е. в условиях, в которых синтезируются многие полезные для человека метаболиты бактерий. Выяснение особенностей и механизмов регуляции экспрессии генов в период отсутствия активного роста может открыть новые перспективы увеличения продукции этих веществ.

Несомненно, важен и экологический аспект изучения микроцинов и генетических детерминантов, определяющих их синтез. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что синтез микроцинов обеспечивает селективные преимущества клеткам-продуцентам. В практическом отношении гены, определяющие синтез микроцинов, могут быть использованы для создания штаммов бактерий-антагонистов с целью получения бактериальных препаратов для борьбы с заболеваниями человека и животных.

В диссертационной работе исследовался генетический контроль синтеза микроцина С51, обнаруженного в Лаборатории внехромосомной наследственности микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН. Микроцин С51 - низкомолекулярный нуклеотидпептидный антибиотик с наиболее широким из известных микроцинов спектром действия и необычной структурой.

Цель работы.

Целью настоящей работы было изучение организации и функциональной роли плазмидных генов, ответственных за синтез микроцина С51, а также исследование особенностей генетического контроля синтеза микроцина на транскрипционном уровне. Прикладным аспектом работы было выяснение возможностей использования генов, определяющих продукцию микроцинов, для улучшения штаммов аттенуированных вакцин (на модельной системе).

Конкретными задачами работы были: -определение и анализ нуклеотидной последовательности генов оперона микроцина С51;

-идентификация продуктов экспрессии генов микроцинового оперона; -изучение функций отдельных генов микроцинового оперона и оценка-возможной роли продуктов этих генов в процессе биосинтеза микроцина С51 и обеспечении иммунитета к нему клетки-продуцента;

-исследование особенностей регуляции транскрипции микроцинового оперона;

-оценка возможности использования генов микроцина С51 для улучшения защитных свойств штамма аттенуированной вакцины.

Научная новизна В настоящей работе была уточнена локализация плазмидных генов, детерминирующих синтез микроцина С51 и иммунитет к нему. Клонированы отдельные гены и их комбинации. Определена нуклеотидная последовательность генов микроцинового оперона. Идентифицированы продукты экспрессии соответствующих генов. Показано, что по крайней мере три гена тссА, тссВ, тссИ принимают участие в биосинтезе микроцина С51; два гена, тссС и тссЕ, участвуют в экспрессии иммунитета к микроцину. На основании сведений, полученных путем анализа аминокислотных последовательностей отдельных белков показана их возможная роль в процессе биосинтеза микроцина С51.

Показано, что маленький структурный ген тссА (21 п.н.) кодирует гепта-пептид, входящий в состав молекулы микроцина С51; синтез его происходит на рибосомах. Выявлены два предшественника микроцина С51 с антибиотической активностью, изучение структуры которых позволит установить роль отдельных генов в модификации предшествеников антибиотика.

Обнаружены короткие прямые повторы, фланкирующие микроциновый оперон; наличие этих повторов позволяет предположить возможность передачи микроциновых генов путем рекомбинации.

Клонирован и секвенирован участок плазмиды, содержащий промотор-ную область микроцинового оперона. В экспериментах, проведенных с использованием однокопийной конструкции, содержащей клонированную про-моторную область, слитую с лактозным опероном, было показано, что при переходе клеток в стационарную фазу происходит активация транскрипции с этого промотора. Показано, что транскрипция микроцинового оперона зависит от продуктов генов глобальных регуляторов транскрипции rpoS (os-субъединица РНК-полимеразы)4 сгр и суа. Белок OmpR и гистоноподобные белки Е. coli IHF и Fis не оказывают существенного влияния на транскрипцию с исследованного промотора.

На модельной системе показано, что гены, определяющие продукцию микроцина С51, могут быть использованы для улучшения защитных свойств вакцинного штамма Shigella ßexneri.

Практическая значимость

Несколько аспектов определяют практическую ценность работы.

1. Полученные в работе микроциновые гены могут быть использованы для создания новых препаратов-пробиотиков и вакцинных штаммов для борьбы с заболеваниями человека и животных.

2. Микроцины интересны как новые антибиотики с необычной структурой, активные против грамотрицательных бактерий. Гены, участвующие в процессе биосинтеза микроцина С51, кодируют продукты, осуществляющие посттрансляционную модификацию пептида. Они могут быть использованы в белковой инженерии и инженерии пептидов, для конструирования штаммов бактерий, продуцирующих новые антибиотики и другие биологически активные вещества.

3. Промоторная область оперона микроцина С51, определяющая активацию транскрипции при переходе клеток в стационарную фазу роста, может быть использована для создания векторов, обеспечивающих индукцию синтеза продуктов метаболизма в отсутствие активного роста клеток. Изучение подобных регуляторных областей может дать ценную информацию для создания новых и улучшения существующих искуственных регулируемых промоторов, применяемых в биотехнологии.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию основания МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (26-28 марта 1996 г., Москва), Втором съезде биохимического общества РАН (19-23 мая 1997 г., Москва), Конференции, посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология" (17-19 декабря 1997 г., Москва), Конференции "Новые направления биотехнологии" (апрель 1998, Москва), Первом мировом конгрессе по вакцинам и иммунизации (апрель 1998, Стамбул).

Обзор литературы

1.0бщая характеристика микроцинов

С начала XX века объектом пристального внимания исследователей было взаимодействие микроорганизмов в природных экологических системах. Одним из существенных аспектов этого взаимодействия является синтез антибиотических веществ.

Антибиотические вещества, продуцируемые энтеробактериями, были обнаружены еще в 1925 году (Gratia, 1925). В настоящее время известно, что многие грам-положительные и грам-отрицательные бактерии синтезируют антибиотические вещества белковой природы, названные бактериоцинами. Бактериоцины обладают узким спектром действия и активны в основном против близкородственных штаммов. Наиболее изученными бактериоцинами являются колицины, продуцируемые Е. coli. В настоящее время известно более 25 колицинов. Большинство колицинов являются крупными белками с молекулярной массой до 90 кДа. Известны ферментативные свойства некоторых колицинов: например, колицин Е2 расщепляет ДНК, ЕЗ -РНК, другие взаимодействуют с клеточными мембранами, нарушая их электрический потенциал и изменяя проницаемость (Konisky, 1982; Рекеш и др., 1987).

На протяжении длительного времени колицины считались единственной группой антибиотиков, продуцируемых кишечными бактериями семейства Enterobacteriaceae. В 1976 году испанскими исследователями была обнаружена новая группа антибиотических веществ, продуцируемых энтеробактериями (в основном Е. coli) и обладающих более широким, по сравнению с бактериоцинами, спектром действия. Благодаря небольшому молекулярному весу эти антибиотики были названы микроцинами (Asensio et al., 1976).

Микроцины были обнаружены в результате поиска антибиотических веществ при выращивании бактерий на бедных питательных средах. По мнению исследователей, обнааруживших их, эти условия роста, с ограниченным доступом питательных веществ, соответствуют условиям обитания кишечных

бактерий в организме человека и животных (Baquero and Moreno, 1984). По данным испанских исследователей 10-15% изолятов энтеробактерий из кишечника здоровых людей продуцируют микроцины (Asensio et al., 1976).

В настоящее время выделены и изучаются семь типов микроцинов: А, В, С, D, Е, Н и J (Baquero and Moreno, 1984; Lavina et al., 1990; Salomon and Farias, 1992). Синтез большинства микроцинов определяется плазмидами, которые определяют также иммунитет клетки продуцента к собственному мик-роцину (Baquero et al., 1978; Baquero and Moreno, 1984),

Микроцины классифицируют, прежде всего, по критерию перекрестного иммунитета, т.е. устойчивости штаммов-продуцентов к действию микроцинов того же типа и чувствительности к микроцинам другого типа. Кроме того, микроцины различаются по свойствам и структуре антибиотиков, механизмам действия и спектрам антибиотической активности.

Большинство микроцинов термостабильны; многие микроцины устойчивы к экстремальным значениям рН (от 1,0 до 12,0) (Asensio et al., 1976; Baquero and Moreno, 1984).

В настоящий момент лучше всего исследованы микроцины В17, С7 и С51, как с точки зрения их структуры, так и в отношении генетических детерминантов, определяющих их продукцию. При изучении этих микроцинов и генетического контроля их синтеза выявлены особенности, представляющие общебиологический интерес.

2,Микроцины типа В.

2.1. Микроцин В17.

2.1.1. Структура и биосинтез микроцина В 17

Микроцин В17 является наиболее изученным представителем микроцинов типа В и микроцинов вообще. Его химическая структура была утановлена первой из микроцинов. По химическому строению В17 представляет собой модифицированный гидрофобный пептид с молекулярной массой 3255 Да, чувствительный к термолизину, проназе и протеиназе К, при этом он устойчив

к действию трипсина и химотрипсина (Baquero and Moreno, 1984; Davagnino et al., 1986). Активная молекула антибиотика состоит из 43 аминокислотных остатков, из которых 26 являются остатками глицина. Электронно-микроскопическое исследование выявило наличие у В17 высоко организованной четвертичной структуры (Davagnino et al., 1986).

Микроцин В17 принадлежит к классу рибосомально синтезируемых антибиотиков. В просессе биосинтеза антибиотика можно выделить три основных этапа. На первом этапе происходит транскрипция структурного гена (тсЪА) и рибосомальный синтез микроцинового предшественника, состоящего из 69 аминокислот и названного премикроцином (рис. 1).

На втором этапе происходит посттрансляционная модификация 14 аминокислотных остатков основной цепи премикроцина. При этом из двух Gly-Cys аминокислотных остатков образуются два тиазольных кольца, из двух Gly-Ser остатков - два оксазольных кольца, и из двух трипептидных остатков Gly-Cys-Ser и Gly-Ser-Cys образуются тиазол-оксазольные кольца. Это происходит путем конденсации соответствующих Ser и Cys остатков с карбонильными группами предшествующих аминокислотных остатков и последующего а, ß-дегидрирования.

Модификации в молекуле микроцина В17 - это принципиально новый тип посттрансляционной модификации полипептидов. В случае микроцина В17 были впервые обнаружены тиазольные и оксазольные кольца в молекулах полипептидов, синтезируемых на рибосомах. При этом посттрансляционной модификации подвергается основная цепь аминокислотных остатков в полипептиде (Bayer A. et al., 1993,. Yorgey Р et al., 1994, Kolter R. et al., 1992).

Третий этап биосинтеза микроцина В17 - превращение промикроцина в зрелый микроцин - происходит при удалении лидерной последовательности -26 N-терминальных аминокислотных остатков, которое осуществляется про-теазой хромосомного происхождения, кодируемой, по-видимому, геном ртЬА (Yorgey et al., 1993, Rodrigues-Sainz et al., 1990, Li et al., 1996). Лидерная последовательность предшественника микроцина В17 не является типичной сиг-

1 27

MEIiCASEFGVVl^VDALKI^RQSPLGVGIGGGGGœSCGGQGGGCGGCSNGCSGGNGGSGGSGSm

Рге-МсВ17

Премикроцин В17 Поспрансляционная модификация

8 HjO, 8 Hj

О 0 0 О О О

H Si H Si H Si o-^

0 0 о

H Ol H p-^ О О

ю

Промикроцин В17 Отщепление лидерного пептида

vohgg«*^^

О 0 0 О О о

МикроцинВ17

Рис. 1. Химическая структура микроцина В17

нальной последовательностью, присутствующей в молекулах многих секрети-руемых белков. Была показана необходимость лидерной последовательности для превращения премикроцина в зрелый микроцин (Уо^еу & а1., 1993).

2.1.2. Механизм антибиотического действия микроцина В17.

Микроцин В17 необратимо ингибирует репликацию в клетках чувствительных штаммов и вызывает деградацию ДНК. При обработке клеток E.coli микроцином В17 происходит остановка элонгации ДНК и индукция клеточных SOS-функций, что выражается в повышении уровня экспрессии генов recA, sfiA, итиС, дерепрессии синтеза колицина Ег и индукции профага X. Действие микроцина В17 приводит к ингибированию клеточного деления и образованию филаментов. Мутации генов гесА, гесВ и гесС генов увеличивают чувствительность клеток E.coli к микроцину В17 (Herrero and Moreno, 1986).

Было показано, что микроцин В17 ингибирует ДНК-гиразу - топоизоме-разу П, вводящую отрицательную суперспирализацию в ДНК. Предположительно антибиотик взаимодействует с С-концевой областью В-субъединицы ДНК-гиразы. Это было показано путем картирования мутаций, приводящих к к устойчивости к микроцину В17. Предполагают, что микроцин инактивирует ДНК-гиразу после внесения ферментом двунитевого разрыва в ДНК; место разрыва становится мишенью для клеточных нуклеаз, разрушающих ДНК (Vizanetal., 1991).

В настоящее время микроцин В17 является единственным пептидным антибиотиком, ингибирующим ДНК-гиразу. Он отличается по структуре от двух других ингибиторов ДНК-гиразы - кумаринов и хинолонов (Yorgey et al., 1994). Известно, что ДНК-гираза бактерий гомологична топоизомеразе II животных, являющейся мишенью для ряда противоопухолевых препаратов. Изучается возможность создания нового поколения ингибиторов эукариотических топоизомераз на основе производных микроцина В17 (Liu, 1994). Способность микроцина В17 вызывать деградацию ДНК была использована для получения максиклеток (Mayo et al., 1988).

2.1.3. Генетический контроль синтеза микроцина В17 и иммунитета к нему.

Синтез микроцина В17 и иммунитет клетки-хозяина к микроцину связаны с конъюгативной малокопийной плазмидой рМссВ17 (70 т.п.н.), относящейся к группе несовместимости FII (Baquero et al., 1978; San Millan et al., 1985). Плазмидные гены, детерминирующие синтез микроцина В17, были клонированы и картированы. Было установлено, что за синтез микроцина отвечает фрагмент ДНК размером 3,8 т.п.н., а за иммунитет к нему - соседний фрагмент 1 т.п.н. По данным комплементационного анализа и секвенирования ДНК, четыре гена (mcbA, mcbB, mcbC, mcbD) связаны с продукцией микроцина, три гена (тсЪЕ, mcbF, mcbG) участвуют в экспрессии иммунитета клетки к микроцину (рис. 2) (Genniloud et al., 1989, Garrido et al., 1988).

j* S,™ fe fe ^ift'.frf fe fe Ej92

pMM102 (B17)

Pv H2

А В С D E F G

p

1 mcb

P2

--Рз

Рис. 2. Физическая карта фрагмента плазмидырМСС В\7, определяющего синтез микроцина В17 и иммунитет к нему. А, В, С, Б - гены, детерминирующие синтез микроцина, Е, Б, в - гены иммунитета к микроцину В17. Рь Р2, Ршсь - промоторы микроциновых генов. Стрелками указано направление транскрипции. Сайты узнавания рестриктаз: В - ВатШ, В§ - BgШ, Н - НтсИИ, К -Крп1, Е - ЕсоШ, 8 - БаЮ!, 8ш - Бта!, Ру-Р\и11.

Ген тсЪА кодирует полипептид, состоящий из 69 аминокислотных остатков - предшественник активного микроцина В17 (Оауа§дто еХ а1., 1986; СеппПоиё et а1.,1989). Продукты генов тЬсВ, тсЬС и тпсЬИ идентифицированы

- это белки с молекулярными массами 33, 31 и 45 кДа соответственно (Genniloud et al., 1989, Li et. al., 1996). Гены mcbB, mcbC и mcbD принимают участие в посттрансляционной модификации предшественника микроцина. Недавно был выделен энзиматический комплекс, названный синтазоймикро-цина В17, содержащий белки McbB, McbC и McbD (Li , 1996), который превращает in vitro 14 аминокислотных остатков в молекуле предшественника В17 в тиаольные и оксазольные кольца.

Транскрипция микроциновых генов происходит с трех промоторов (рис. 2). Транскрипция генов mcbA, mcbB, тсЪС и 90% транскрипции гена mcbD инициируется с главного промотора Pmcb. С промотора Р2 транскрибируется ген mcbD. С третьего промотора, расположенного внутри гена mcbD, идет синтез нетранслируемой антисмысловой РНК в направлении, противоположном направлению транскрипции генов mcbABCD. В настоящий момент непонятно, играет ли антисмысловая РНК регуляторную роль в экспрессии генов синтеза микроцина В17 (Genniloud et al., 1989).

Иммунитет клетки, продуцирующей микроцин, обеспечивается экспрессией плазмидных генов mcbE, mcbF и mcbG. Исходя из данных секвенирова-ния ДНК, молекулярная масса продуктов этих генов составляет соответственно 27.9; 28.8 и 22 кДа. Изучение мутантных клеток с нарушенным синтезом продуктов генов mcbEFG показало, что иммунитет к микроцину В17 определяется посредством двух различных механизмов (Garrido et al., 1988). Первый механизм иммунитета связан с функционированием продуктов генов mcbE и mcbF. Предположительно, комплекс белков McbE-McbF, расположенный во внутренней цитоплазматической мембране и выполняет роль насоса, экспортируя молекулы микроцина в периплазматическое пространство, откуда они выводятся за пределы клетки. Второй механизм иммунитета к микроцину В17 связан с продуктом гена mcbG, функция которого пока неясна.

Подобно другим вторичным метаболитам, синтез микроцина В17 происходит, в основном, при переходе клеток в стационарную фазу роста. При этом количество синтезируемого микроцина увеличивается в 100 раз по сравнению

с экспоненциальной фазой роста (Connel et al., 1987). С использованием метода слияния генов было показано, что функционирование промотора зависит от скорости роста и состава питательной среды (Moreno et. al., 1992). Эти результаты показывают, что в регуляции функционирования промотора Ртсь задействованы тонкие физиологические механизмы.

Показано, что несколько хромосомных генов участвуют в регуляции синтеза микроцина В17. Мутации в гене ompR резко уменьшают продукцию мик-роцина (Genniloud et al., 1989, Moreno et. al., 1992, Hernandez-Chico et al., 1982, Hernandez-Chico et al., 1986). Известтно, что белок OmpR осуществляет позитивный контроль транскрипции генов двух главных белков-поринов клеточной мембраны - OmpF и ОтрС, а также некоторых других генов Е. coli (Gralla et al., 1996). Регуляция экспрессии генов, ответственных за синтез микроцина В17, с участием продукта гена ompR происходит на уровне транскрипции. Связываясь с областью ДНК, расположенной перед промотором Ртсь, белок OmpR регулирует транскрипцию генов микроцина (Hernandez-Chico et al., 1986). Было показано, что область ДНК, необходимая для связывания с белком OmpR, локализована между -166 и -54 положениями по отношению к стартовой точке транскрипции (Bohannon et al., 1991). Промотор Р2 тоже является OmpR зависимым.

Транскрипцию с промотора Ртсъ активирует белок IHF , продукт генов himA и himD, которые кодируют А и В субъединицы этого белка (Moreno et. al., 1992, Friedman, 1988). IHF связывается со специфическими сайтами в Д НК,

вызывая ее изгибание; он участвует в регуляции экспрессии многих генов.

i

При нулевой мутации в гене himA ß-галактозидазная активность клеток, несущих транскрипционно слитые гены mcbA-lac (перед геном тсЪА - промотор Ртсь) уменьшалась в 10 раз в стационарной фазе роста. Мутации в генах himA или himD приводили к отсутствию синтеза самого микроцина В17 (Moreno et al., 1992).

Продукты двух хромосомных генов, тргА и bglY, также участвуют в регуляции экспрессии генов синтеза микроцина В17. Ген тргА кодирует поли-

пептид из 176 аминокислотных остатков; функция его в настоящее время неизвестна (del Castillo, et al., 1990, del Castillo et al., 1991). Синтез микроцина и транскрипция с промотора Ртсь резко повышаются в клетках с нулевыми мутациями в этом гене (Moreno et. al., 1992, del Castillo et al., 1991). Продукт гена bglY (или osmZ), гистоноподобный белок HNS, регулирует экспрессию генов, продукты которых участвуют в различных функциях бактерий (терморегуляция, осморегуляция, вирулентность и др.) (Higgins et al., 1991). Экспрессия микроциновых генов резко повышалась в bglYwTnlO мутанте (Moreno et. al., 1992). Таким образом, продукты двух названных выше генов участвуют в негативной регуляции транскрипции генов микроцина В17.

Как было отмечено ранее, в образовании зрелого микроцина В17 и его экспорте из клетки участвует протеаза, кодируемая хромосомным геном ртЬА. Продукт хромосомного гена sbmA, расположенный в клеточной мембране, может играть роль рецептора микроцина ( Lavina et al., 1986). Известно также, что мутация в гене hisT снижает продукцию микроцина, возможно, вследствие того, что отсутствие продукта этого гена вызывает уменьшение скорости элонгации трансляции (Moreno et. al., 1992, Rodriguez-Sainz et al., 1991).

2.2. Другие микроцины типа В.

Описаны еще несколько микроцинов, принадлежащих к типу В, исходя из критерия перекрестного иммунитета. Отмечено сходство фрагментов ДНК, определяющих их синтез. К ним относятся микроцин, ранее считавшийся ко-лицином X (San Millan et al., 1987), а также микроцины В2 и В27, выделенные в нашей лаборатории (Басюк и др., 1994). Фрагменты ДНК, определяющие продукцию микроцинов В2 и В27, были клонированы и картированы.

Изучение фенотипа штаммов продуцентов и физическое картирование показали, что для продукции микроцина В2 необходим фрагмент ДНК размером 4.2 т.п.н., а иммунитет обеспечивается фрагментом ДНК 1.4 т.п.н. Для синтеза микроцина В27 и экспрессии иммунитета к нему необходим фрагмент ДНК размером 5 т.п.н. Обнаружена гомология этих фрагментов между собой и

с ДНК плазмиды, определяющей синтез микроцина В17 (рис. 3). Установлено, что синтез микроцина В27 регулируется продуктом гена ompR, а синтез микроцина В2 не зависит от продукта этого гена. Мутации в генах гесА и lexA увеличивают чуствительность клеток Е. coli к действию микроцинов В2 и В27 (Басюк и др., 1994). Сходство физических карт и отдельных участков ДНК плазмид, определяющих продукцию микроцинов В17, В2 и В27, позволяет сделать предположение о родственности соответствующих генов и их консервативности. Вследствие недостаточной изученности этих микроцинов в настоящее время невозможно сказать, являются ли они идентичными или близко родственными микроцину В17.

gAM102 f ^ у, ^ м ^

Pv Н2

pBV27 (В27)

f, ^ ^m ^ ^ ^glj>2 fry ^ f>3 ^ tj»4

Pv Н2 Kg

рВЕ108 (В2)

Sm Н1 К, ВдР

Pv Н,

К

Рис. 3. Физические карты фрагментов ДНК, определяющих синтез микроцинов В2, В17, В27. Обозначения сайтов рестрикции как на рис. 2

3. Микроцины типа С.

3.1. Структура и действие.

В настоящее время известны два микроцина типа С - С7 и С51; продуценты этих микроцинов были выделены в Испании (Garsia-Bustos et al., 1984) и в России соответственно (Курепина и др. 1990, Khmel et al., 1993). Микроцины типа С были активны, в основном, ' против грамотрицательных бактерий. Микроцин С7 подавлял рост Escherichia coli, Salmonella, Shigella, одного штамма Klebsiella pneumoniae (из двух использованных), одного штамма Proteus mirabilis (из 4 исследованных) (Garsia-Bustos et al., 1985). Микроцин С51 проявлял активность против Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Providencia rettgeri, а также в отношении некоторых грамположительных бактерий - например, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, но его действие на эти бактерии было более слабым (Khmel et al., 1993). Микроцины С7 и С51 оказывали бактериостатическое действие на клетки бактерий.

Микроцин С51 является нуклеотидпептидом с молекулярной массой 1.18 кДа (Metlitskaya et al., 1995). Молекула антибиотика содержит гептапептид с формилметионином на N-конце (f-Met-Arg-Thr-Gly-Asn-Ala-Asn), соединенный с модифицированным аденозинмонофосфатом на С-конце (рис. 4). Все аминокислоты в молекуле микроцина являются 1-аминокислотами, что крайне редко встречается среди антибиотиков бактерий. Другой интересной особенностью является наличие фосфорамидной связи. Фосфатный остаток соединен с пропаноламином.

Сравнение структуры микроцина С51 с опубликованной позже структурой микроцина С7 (Guijarro et al., 1995) показало сходство этих двух антибиотиков. Оба микроцина содержали одинаковый гептапептид, соединенный с модифицированным аденозинмонофосфатом.

Было показано, что микроцин С7 резко подавлял включение меченого лейцина в белок и не действовал на включение меченых предшественников в

РНК, ДНК и клеточную стенку (Garsia-Bustos et al., 1985). В системе in vitro (сопряженная система транскрипции-трансляции) наблюдалось частичное ин-гибирование синтеза белка микроцином С7 и химически синтезированными гептапептидами, содержащими метионин с формильной группой и без нее (Guijarro et al., 1995). Микроцин С51 in vivo резко подавлял синтез белка, в меньшей степени синтез РНК и очень мало влиял на синтез ДНК. Вопрос о сходстве и различии этих двух антибиотиков остается открытым.

О

о о

N

f-Met-Arg-Thr-Gly-Asn-Ala-C-NH-CH-C-NH-P-OH2C 0

сн2

СОО

N

ОН ОН

Рис. 4 Химическая структура микроцина С51

3.2. Генетический контроль синтеза микроцинов С типа.

Гены синтеза микроцина С7 и иммунитета к нему локализованы в составе малокопийной конъюгативной плазмиды рМссС7 размером 43 т.п.н. Показано, по данным генетического картирования и секвенирования клонированного фрагмента ДНК, определяющего синтез микроцина, что за продукцию микроцина С7 и обеспечение иммунитета к нему отвечают 6 плазмидных генов (mccABCDEF) (рис. 5) (Gonzalez-Pastor et al., 1995). Синтез микроцина С51 также связан с конъюгативной плазмидой (38 т.п.н.). По данным, полученным

в нашей лаборатории, 5 плазмидных генов отвечают за продукцию микроцина и обеспечение иммунитета (рис. 8) (Kurepina et al., 1993).

Гены синтеза обоих микроцинов организованы в оперон. Первый ген в опероне микроцина С7 кодирует гептапептид, входящий в состав молекулы микроцина. Это самый маленький из известных в настоящее время генов - он содержит всего 21 п.н. (7 кодонов), что меньше, чем другие описанные маленькие гены прокариот (Gonzalez-Pastor el. al., 1994,1995).

За иммунитет к микроцину С7 отвечают три гена - тссС, Е и F. Гены тссС и тссЕ считываются с общего промотора микроцинового оперона, а ген mccF транскрибируется в противоположном направлении с собственного промотора (рис. 5).

1 т.п.н.

1_I

вд

тссА тссВ

9i

н,

SiH2

тссС

mccD

Р4

тссЕ

mccF

Í

mlc

Рис. 5. Физическая карта фрагмента плазмиды рМссС7, содержащего гены синтеза и иммунитета к микроцину С7. Стрелками указано направление транскрипции. Сайты рестрикции: Е^ - Н - Нтс11П; К - КрпГ, Р - 8 -БасГ, Е - ЕсоШ, С-С/а/.

Синтез микроцина С7, как и микроцина В17, активируется при переходе культуры в стационарную фазу роста. С помощью инсерций Mudr.lacZ в гены микроцинового оперона было показано, что в регуляции транскрипции генов, связанных с синтезом микроцина С7, участвуют глобальный регулятор транскрипции - продукт гена rpoS (или appR) и белок Crp (Moreno et al., 1992, Diaz-Guerra et al., 1989). В негативной регуляции генов, отвечающих за продукцию микроцина С7, принимает участие ген тргА (когда он присутствует в клетке в

большом числе копий) и ген bglY, кодирующий гистоно-подобный белок HNS (Moreno et al., 1992).

4. Микроцины типа D.

Известно несколько представителей типа D- это микроцины D93, D140, D15 и D136 (Baquero et al., 1978; Aguilar et al., 1983). Микроцины D-типа представляют собой гидрофильные основные пептиды с молекулярным весом не более 1000 Да (Aguilar et al., 1983; Martinez and Perez-Diaz, 1986). Наиболее подробно изученный микроцин D93 устойчив к высоким значениям pH, относительно термоустойчив , не чувствителен к ряду протеолитических ферментов (Martinez and Perez-Diaz, 1986).

Микроцин D93 активен против штаммов бактерий, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, и некоторых видов Pseudomonas. Штаммы с мутациями гесА более чувствительны к действию микроцина. Первичным эффектом действия антибиотика на бактериальную клетку считается ингибирование биосинтеза ДНК (Martinez and Perez-Diaz, 1986). Подробнее механизм его действия не изучался.

л

Микроцин D140 влияет на энергетический баланс чувствительных клеток. Было показано, что в результате действия антибиотика резко снижается количество АТФ в клетке и активируется АТФ-аза. Микроцин также ингибирует транспорт пролина и фенилаланина, который связан с протонным градиентом бактериальной мембраны.

Изучение микроцинов D93 и D140 показало, что микроцины одного типа могут существенно отличаться по механизму действия - следовательно, это различные микроцины.

Синтез микроцинов типа D и иммунитет к ним связан с плазмидами, различающимися по молекулярной массе (Baquero et al., 1978). Лучше всего изучены генетические детерминанты синтеза микроцина D93 и иммунитета к нему. Продукция микроцина связана с мультикопийной плазмидой pMccD93 длиной 5,5 т.п.н., относящейся к ColEI-типу репликации (Scott, 1984), а также

плазмидами pCPlOl рСРЮб. Гибридизация фрагментов ДНК этих плазмид, связанных с синтезом микроцинов, показала высокую степень их гомологии (Martinez and Perez-Diaz, 1990). Высказывалась гипотеза о том, что гены микроцинов D-типа были расположены на транспозонах (Perez-Diaz and Clowes, 1980; Martinez and Perez-Diaz, 1990), но в настоящее время нет экспериментальных данных, подтверждающих правильность этой гипотезы.

Согласно результатам, полученным испанскими авторами, до 50% мик-роциногенных штаммов продуцируют микроцины D-типа (Martinez and Perez-Diaz, 1990).

5. Микроцины типа Е.

В настоящее время известен единственный представитель микроцинов типа Е - Е492, продуцируемый клетками штамма Klebsiella pneumoniae. Мик-роцин Е492 представляет собой гидрофобный основной пептид с молекулярной массой 5-7 кДа. Антибиотик устойчив к действию трипсина, но чувствителен к проназе, химотрипсину и высоким значениям pH среды (de Lorenzo, 1984).

Микроцин Е492 оказывает бактерицидный эффект на чувствительные клетки. Антибиотик нарушает энергетический балланс клетки путем наруше- / ния трансмембранного потенциала. В отличие от других микроцинов микроцин Е492 действует не только на минимальных средах, но и на богатых (de Lorenzo, 1984).

Микроцин Е492 обладает узким по сравнению с другими микроцинами спектром действия. Антибиотик активен против штаммов грамотрицательных бактерий родственных штамму-продуценту: Е. coli, Klebsiella, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, но не действует на клетки Shigella, Proteus, Serratia и Pseudomonas (de Lorenzo, 1984).

Продукты хромосомных генов tonB, exbB и semA влияют на чувствительность клеток E.coli к микроцину Е492 (Elkins and Earhart, 1989; Gonzalo et al., 1988; Martinez et al., 1990). Продукт гена exbB участвует в транспорте энтеро-

хелина, связывающего железо. ТопВ - белок клеточной стенки, участвующий в

W

/ траспорте витамина В12 и хелатных ионных комплексов. Он также вовлечен в транспорт некоторых колицинов (Pugsley, 1984; Davies and Reeves, 1975). tonB и ехЪВ мутанты были нечувствительны к микроцину Е492, что свидетельствует о взаимодействии систем транспорта ионов и микроцина (Pugsley et al., 1986). Продукт хромосомного гена semA может являться клеточным рецептором для микроцина Е492

Установлено, что структурный ген микроцина Е492 кодирует предшественник, от которого отщепляется пептид длиной 15 либо 19 аминокислот. Разрезание проходит по двум глициновым остаткам, расположенным рядом. Определен и клонирован ген иммунитета к микроцину Е492. Он кодирует гидрофобный полипептид длиной 95 аминокислотных остатков. Предполагают, что этот белок связан с мембраной клетки (Lagos et al., 1999).

6. Микроцин типа Н.

Единственным микроцином, для которого точно установлена хромосомная локализация генов синтеза и иммунитета, является микроцин Н47 (Lavina et al., 1990). Он подавлял рост грамотрицательных бактерий Е. coli, Salmonella, Enterobacter, Shigella, Klebsiella, Proteus, но не действовал на грамположи-тельные Streptococcus, Staphylococcus и Bacillus (Lavina et al., 1990).

Гены синтеза микроцина Н47 были клонированы и было показано, что за синтез антибиотика и обеспечение иммунитета к нему отвечает фрагмент ДНК длиной прядка 10 т.п.н. (Lavina et al., 1990). Анализ субклонированных фрагментов и транспозонных мутаций показал, что для синтеза микроцина и обеспечения иммунитета к нему необходимы две области ДНК длиной 1.1 т.п.н. и 6.3. т.п.н. Эти области разделены активно экспрессирующейся, но не имеющей отношения к синтезу микроцина областью длиной 3 т.п.н.

Комплементационный анализ выявил 6 генов, которые необходимы для продукции антибиотика. Четыре гена вовлечены в биосинтез микроцина (mchA, В, С, D), продукты двух из них (mchE, F), по-видимому, участвуют в

экспорте микроцина из клетки в среду. Система имеет сложную транскрипционную организацию и включает, по крайней мере, четыре разнонаправленных транскршгга (рис. 6) (Gaggero а1., 1993).

1 т.п.н.

I_I

P2S Ц9, М2Р3 Р5 М3

S1 I В с D Е

Рис. 6. Цистроны генетической системы микроцина Н47: В - BgUI, Н -Hindlll, Р - Pstl, S - SalGI. Стрелками показано направление транскрипции.

7. Микроцин J25.

Микроцин 25 продуцируется клетками Е. coli на минимальных средах при переходе культуры к стационарной фазе роста. Молекулярная масса антибиотика составляет, по предварительным данным, 2100 Da. В состав молекулы микроцина 25 входит двадцатичленный пептид, замещенный с N-конца. В молекуле микроцина преобладают незаряженные гидрофобные аминокислоты, 25% из которых составляет глицин. (Salomon and Farias, 1992).

Микроцин J25 подавлял рост Е. coli, Salmonella, Shigella причем штаммы Е. coli были более чувствительны к антибиотику при росте на богатой среде, что отличает микроцин J25 от всех известных микроцинов..

Синтез микроцина J25 и иммунитет к нему связаны с природной плазми-дой размером около 60 т.п.н. В продукции микроцина участвуют, по крайней мере, три гена, которые локализованы во фрагменте ДНК размером около 2,2 т.п.н. Иммунитет к микроцину обеспечивается геном, соседним с районом, определяющим продукцию микроцина (Solbiati et al., 1996).

Предполагают, что микроцин J25 нарушает клеточное деление. Было показано, что чувствительные клетки в присутствии микроцина продолжают

расти, но теряют способность делиться и образуют филаменты. Действие мик-роцина не вызывает ингибирования репликации ДНК и SOS-индукции. Об этом свидетельствует одинаковая чувствительность гесА мутантов и изоген-ных штаммов Е. coli дикого типа к микроцину и способность клеток гесА мутантов образовывать филаменты в присутствии микроцина. Высказано предположение, что микроцин J25 может нарушать функции одного из белков, участвующих в формировании перегородки при клеточном делении (Salomon and Farias, 1992). Было показано, что рецептором для микроцина J25 является белок FhuA (Salomon and Farias, 1993).

8. Микроцины типа А.

К типу А относятся микроцины, антибиотическая активность которых подавляется 1-метионином. По данным Aguilar et al. (1982), штаммы, продуцирующие микроцин типа А, составляют 35% от общего количества изолятов, образующих микроцины.

В настоящее время подробно изучен только микроцин А15. Этот антибиотик имеет молекулярную массу 240 Да и устойчив к действию протеаз. Микроцин А15 подавляет рост штаммов Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, но не действует на Pseudomonas и грам-положительные микроорганизмы.

Микроцин А15 оказывает бактериостатическое действие на чувствительные клетки. Он ингибирует синтез белка и на 50% снижает синтез РНК.

Показано, что микроцин А15 ингибирует гомосерин-О-транссукцинилазу (HST) - первый фермент биосинтеза метионина. Микроцин А15 является производным L-метионина и действует как конкурентный аналог путем аллосте-рического ингибирования HST (Aguilar et al., 1982). Микроцин ингибирует также метионил-тРНК-синтетазу, хотя этот эффект наблюдается только при высоких концентрациях микроцина и может быть неспецифическим.

Было установлено, что при 42 °С чувствительность клеток к микроцину А15 значительно повышается. Это можно оъяснить повышением сродства ан-

тибиотика к ферменту вследствие конформационных изменений (Aguilar et al., 1982).

Микроцин А15 начинает синтезироваться в ранней логарифмической фазе роста клеток. В анаэробных условиях культивирования продукция микро-цина А15 на клетку больше, чем при аэробных условиях.

Высказана гипотеза, согласно которой микроцин А15 может быть синтезирован как "ошибочный продукт" биосинтеза метионина. Основываясь на этой гипотезе, можно предположить, что гены синтеза микроцина А15 кодируют белки, вызывающие изменения в процессе биосинтеза метионина и приводящие к появлению вещества с антибиотической активностью.

Согласно одним из первых работ испанских исследователей , синтез мик-роцинов типа А был связан с плазмидами pCPlOl и рСРЮб (Perez-Diaz and Clowes, 1980). Однако, впоследствии было установлено, что эти плазмиды определяют синтез микроцинов типа D и в настоящее время вопрос о плазмид-ной локализации генов синтеза микроцина А15 остается открытым. (Martinez and Perez-Diaz, 1990).

В нашей лаборатории был проведен скрининг большого числа изолятов из фекалий людей, телят и ягнят; нами не было обнаружено штаммов, продуцирующих микроцины типа А. Мы предполагаем, что авторы более ранних работ ошибочно принимали за микроцин А15 валин, ингибирующий рост Е. coli К12 (Khmel et al., 1987; Glover, 1962). Это утверждение нельзя считать окончательным, поскольку вопрос, безусловно, нуждается в дальнейшем изучении.

9. Колицины V как микроцины.

Колицин V был первым описанным колицином (Gratia, 1925). Однако, небольшой размер молекул колицинов V (Frick et al., 1981), конститутивный синтез (Herschman and Helinski, 1967) и отсутствие гена лизиса, ответственного за выход синтезированного колицина из клетки (Pugsley, 1984), позволяют рассматривать колицины V как один из типов микроцинов.

Колицины V продуцируются штаммами E.coli и другими бактериями семейства Enterobacteriaceae. и подавляют рост бактерий этого же семейства. Известно, что мишенью для колицинов V является цитоплазматическая мембрана чувствительных клеток. Предполагают, что колицины V встраиваются во внутреннюю мембрану и нарушают трансмембранный потенциал (Yang and Konisky, 1984). Рецептором для колицина V в наружной мембране является белок Cir (Nikaido and Rosenderg, 1990).

Синтез колицинов V определяется большими малокопийными плазмида-ми группы несовместимости IncFI (Hardy, 1975). Показана гомология фрагментов ДНК, содержащих гены синтеза колицинов V, из различных колицино-генных плазмид (pColV-КЗО, pColV-B188, pColV-H247, pColV-P72) (Waters et al., 1989). Были клонированы гены синтеза колицина ColV-КЗО и иммунитета к нему (Gilson et al., 1987). Анализ делеционных и мутантных плазмид показал, что синтез колицина ColV-КЗО связан с фрагментом ДНК длиной 4,2 т.п.н., в котором имеется по крайней мере три гена (cvaA, cvaB и cvaC). Эти гены образуют кластер и транскрибируются как часть оперона. Ген иммунитета cvi расположен во фрагменте протяженностью 700 т.п.н., примыкающем к гену cvaC. Возможно перекрывание генов cvaC и cvi. Анализ продуктов экспрессии генов колицина в миниклеточной системе показал, что структурным геном колицина V является ген cvaC. Этот ген кодирует белок с молекулярной массой 6 кДа. Продукты генов cvaA и cvaB участвуют в экспорте колицина (Gilson et al., 1987). Было показано, что для экспорта колицина V из клетки необходима последовательность N-концевой части белка CvaC (Gilson et al., 1990).

Из представленных в литературном обзоре сведений видно, что микроци-ны как антибиотики изучены в настоящее время недостаточно. Наиболее исследованными как в отношении химической структуры, так и в отношении генетических детерминантов синтеза являются микроцины В17, С51 и С7. Процесс биосинтеза двух последних микроцинов, относящихся к С-типу, практически не изучен, нет сведений о роли продуктов конкретных генов в биосинте-

зе. Отсутствуют достаточно подробные данные о механизме действия этих микроцинов, механизмах иммунитета к микроцину..Очень мало известно о генетическом контроле синтеза других микроцинов, их действии и биосинтезе.

В настоящей работы было проведено подробное исследование плазмид-ных генов, участвующих в синтезе микроцина С51, и регуляции экспрессии этих генов.

Материалы и методы

Штаммы бактерий и бактериофаги, использованные в работе, приведены в таблице 1 Все штаммы E.coli, кроме Е. coli В, являются производными Е. coli К12.

Таблица 1. Штаммы E.coli и бактериофаги, использованные в работе.

Штамм Характеристика Источник

Штаммы Е. coli

TG1 supE, thi, hsd5, (lac-proAB) F'(traD36 proAB+ laclq lacZ Ml 5) Коллекция ИМГ РАН

XLIblue RecAl, lac, endAl, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relAl, {F'pro AB, laclq, lacZAM15, TnlO} Коллекция ИМГ РАН

Х925 leu, thr, thi, st/, minA, minB hsd Коллекция ИМГ РАН

SBS1936 HfrC, relA, pitlO, tonA22(rpoS+) Boquet Р.

SBS1931 HfrC, relA, pit 10, tonA22, srl::TnlO(rpoS+) Boquet P.

SBS1935 HfrC, relA, pit 10, tonA22, rpoS190 Boquet P.

SBS1930 HfrC, relA, pit 10, tonA22, srl::Tnl0,rpoS190 Boquet P.

SBS2680 HfrC, relA,pit 10, tonA22, rpoSr.TnlO Boquet P.

SBS2151 HfrC, relA, pit 10, tonA22(rpoS+), AlacZ Boquet P.

SBS2150 HfrC, relA, pitlO, tonA22, rpoS190, AlacZ, Boquet P.

SBS2152 HfrC, relA, pitlO, tonA22, rpoS13::TnlO, AlacZ. Boquet P.

SBS2151crp HfrC, relA, pitlO, tonA22(rpoS+), AlacZ, crpr.TnlO Эта работа

SBS2151cya HfrC, relA, pitlO, tonA22(rpoS+), AlacZ, vat, cya Эта работа

MC4100 F A(argF-lac), U169, F165307, thiA, rpsll50, araD139, relA, ptsF-25, deoCl Коллекция ИМГ РАН

TK821 F A(argF-lac), U169, F165307, thiA, rpsllSO, araD139, relA, ptsF-25, deoCl, ompR331::TnlO Frost S.

DL844 F A(argF-lac), U169, F165307, thiA, Low D.A.

rpsllSO, araD139, relA, ptsF-25, deoCl, mbß20::TnlO

DL 1784 F A(argF-lac), U169, F165307, thiA, rpsll50, araD139, relA, ptsF-25, deoCl, mbß20::Tnl0, Mrp LowD.A.

DL 1800 F A(argF-lac), U169, F165307, thiA, rpsll50, araD139, relA, ptsF-25, deoCl, Ahns Low D.A.

Rlgl378 AlacX74, araD139 A(ara-leu)7647, galU, galK, strA Миронов A.C.

Rlgl379 AlacX74, araD139 A(ara-leu)7647, galU, galK, strA,fis::Tn5 Миронов A.C.

AB1157 F, ihr, leu, pro, his, Bj, lac, gal, ara, xyl, mtl, strA Миронов A.C.

PP1954 F, thr, leu, pro, his, Bh lac, gal, ara, xyl, mtl, strA, himAr.TnlO Миронов A.C.

Mgl655 crp+, cya+ Миронов A.C.

AM3006 КакMgl655, ноcrpr.TnlO Миронов A.C.

AM365 Как Mgl655, но cyaValr Миронов A.C.

Е.соИ В Прототроф Коллекция ИМГРАН

Бактериофаги

Р1 Г ±ЩГ Коллекция ИМГРАН

Ш45 В1а -Ьас2зс, шт21, тсГ 8тют ЯЖ

Питательные среды. Минимальная среда (г/л дистиллированной воды): Ка2НР04-7.5; КН2РО4 -1.5; (№14)2804 -2; М§Б04 -0.2; глюкоза - 2.0. Минимальная среда (Адамса) (г/л дистиллированной воды): Ыа2НР04 - 3.5; КН2РО4 -1.5; ЯНЦа - 2; М§804-0.1;

Минимальная среда М63 (г/л дистиллированной воды): КН2Р04-13.6; (ЫН4)2804-2.0; Ре804*7Н20-0,0005; 1м MgS04*7H20-l мл;

Среда Адамса, обогащенная дрожжевым экстрактом (О1&о, конечная концентрация 0,3 %), агаризованная среда того же состава (1,5 % агар-агар), ЬВ-бульон и 1,5 % ЬВ-агар.

Антибиотики отечественного производства использовали в следующих концентрациях: ампициллин - 100 мкг/мл, канамицин - 100 мкг/мл, тетрациклин -10 мкг/мл, хлорамфеникол - 20 мкг/мл.

Определение продукции микроцинов проводили, как описано ранее (Khmel et al., 1987). На колонии штаммов, выращенных уколом в течение 1-2 суток и убитых парами хлороформа, накладывали целлофановую мембрану и сверху засевали индикаторный штамм в 3 мл 0,7% агара (1 - 2x10 клеток из культуры в экспоненциальной фазе роста). О продукции микроцина судили по появлению зон задержки роста на газоне индикаторного штамма после 5-24 часов роста культуры при 37 °С.

Для выделения плазмидной ДНК использовали метод Birnboim and Doly, 1979.

Электрофорез нативной и рестрицированной плазмидной ДНК проводали в 0,5 - 0,8% агарозном геле при 100-150 В 1,5-3 часа.

Гидролиз и лигирование ДНК ферментами НПО "Фермент" (Вильнюс) проводили согласно рекомендации изготовителя.

Для трансформации клеток Е. coli плазмидной ДНК использовали метод, описанный ранее (Sambrook et al., 1989).

Для определения иммунитета клеток к микроцину использовали следующий метод: клетки микроцинпродуцирующего штамма Е. coli высевали уколом на минимальную агаризованную среду с дрожжевым экстраком, инкубировали 16-20 часов при 37 °С, убивали парами хлороформа. На поверхность среды выливали 3 мл 0,7% агаризованной среды того же состава, засеянной клетками испытуемого штамма в количестве 1-2x107 клеток, выращенных в минимальной жидкой среде с дрожжевым экстрактом. Появление зон задержки роста вокруг уколов наблюдали через 5-16 часов инкубации при 37 °С. Иммунитет к микроцину проявлялся в отсутствии зон задержки роста вокруг уколов. При частичном иммунитете клеток зоны задержки роста были меньше, чем в случае полностью чувствительных к микроцину клеток.

Определение активности микроцина в клетках и культуральной среде проводили следующим способом. Клетки штамма Е. coli засевали в 10 мл минимальной среды с глюкозой и дрожжевым экстрактом, инкубировали с аэрацией 16 часов при 37 °С. Затем центрифугировали при 5000g 10 минут. Полученный супернатант был сконцентрирован в 20 раз при лиофильном высушивании. Осадок клеток суспендировали в 1 мл раствора 0,1М СН3СООН, ImM ЭДТА, кипятили 10 минут, после чего центрифугировали при 10000g 10 минут. Полученный клеточный экстракт был сконцентрирован в 20 раз. На поверхность газона штамма E.coli В наносили сконцентрированный супернатант и клеточный экстракт в различных разведениях. Появление зон задержки роста E.coli В наблюдали через 5-20 часов.

Определение нуклеотидной последовательности (работа проводилась совместно с А.А.Володиным). Для определения нуклеотидной последовательности фрагменты ДНК были клонированы в фагмиды pTZ18U и pTZ19U, которые переводились в однонитевую форму с использованием фага-помощника М13К07. Выделение однонитевой ДНК и получение делеций с использованием экзонуклеазы Ш и нуклеазы SI проводили по Sambrook et al., 1989.

Нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера (Sambrook et al., 1989) с набором праймеров, флуоресцентно меченых соответствующими красителями (Applied Biosystems). Секвенирующую реакцию проводили используя линейную ПЦР (Murray, 1989; Adams and Blakeslly, 1991). Продукты реакции анализировали при помощи автоматического секвенатора Applied Biosystems 370А.

Каждая из четырех дидезокси-секвенирующих реакционных смесей объемом 10 мкл содержала 0,01-0,1 пмоль однонитевой ДНК, 1 пмоль флурес-центно меченого праймера, 0,5 ед. Taq-ДНК-полимеразы, 300 мМ трис-НС1 (pH 9,0); 5 мМ MgCl2; 10 мкМ каждого из дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ и один из четырех дидезоксинуклеотидов: 300 мкМ дцАТФ либо 200 мкМ дцЦТФ, 100 мкМ ддГТФ, 400 мкМ ддТТФ. Сверху наслаивали 10 мкл вазелинового масла. Инкубировали в амплификаторе Ericomp. Реакция включала 20 циклов

(30 с при 95 °С, 30 с при 55 °С, 60 с при 70 °С) с последующими 10 циклами (30 с при 55 °С и 60 с при 70 °С). Реакцию останавливали добавлением 5 мкл 80% раствора формамида и прогреванием при 95 °С в течение 5 мин. 1-4 мкл из водной фазы наносили на секвенирующий гель для электрофореза. Использовали 6% полиакриламидный гель с добавлением 7 М мочевины.

Анализ нуклеотидных последовательностей проводился при помощи программных пакетов DNASUN и PC\Gene.

Для электропорации использовали следующий метод: клетки E.coli растили в 50 мл среды LB до оптической плотности 0,3 по спектрофотометру (600 н.м.), центрифугировали 10 мин. при 4000 об/мин и три раза промывали 50 мл. дистиллированной воды. Клетки суспендировали в 0.1 мл 10% глицерина. Для электропорации брали 0.5 мкг ДНК и 40 мкл клеток. Электропорацию проводили при напряжении 1.2 В в течение 5 мс. Далее клетки подращивали в течение часа в среде LB и высевали на селективную среду.

Для получения миниклеток использовали метод, описанный Stoker et al, 1974. Суспензию миниклеток инкубировали в среде LB при 37°С без аэрации в течение 45 мин. Добавляли 50 мкЮ 358-метионина и инкубировали при 37°С с аэрацией 1 час 15 мин. Меченые клетки отмывали минимальной средой (см. выше) от избытка метки, центрифугировали 5 мин при 16000 об/мин, и суспендировали в 100 мкл буфера ТЕ. Суспензию клеток прогревали 2 мин. на водяной бане. Полученный препарат анализировали методом электрофореза в ПААГ.

Электрофорез белков проводили в 15% ПААГ при напряжении 50 В в течение 10 часов по методике (Stoker et al, 1974).

Для определения активности (3-галактозидазы клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе. Активность Р-галактоозидазы измеряли по методу Миллера.(1978).

Трансдукцию с использованием фага PlVir проводили по методу (Миллер, 1978).

Результаты и обсуждение

Эта работа была продолжением начатой ранее в Лаборатории внехромо-сомной наследственности микроорганизмов ИМГ РАН работы по изучению генетических систем, определяющих синтез низкомолекулярных антибиотиков энтеробактерий - микроцинов. В лаборатории были выделены продуценты микроцинов типов С и В. Были клонированы и картированы гены, определяющие синтез микроцинов и иммунитет к ним клеток продуцентов. В данной работе предполагалось подробно изучить организацию генов микроцина С51, определить функции отдельных генов в процессе биосинтеза антибиотика, а также исследовать особенности генетического контроля биосинтеза микроцина. Кроме того, мы предполагали оценить возможность практического применения микроциновых генов для усиления защитных свойств вакцинного штамма.

1. Анализ продуктов экспрессии генов рекомбинантных плаз-мид, определяющих синтез микроцина С51.

В рамках проводимой нами работы по изучению генетических детерминантов, отвечающих за синтез микроцина С51 и обеспечение иммунитета к нему, представляло большой интерес идентифицировать белки, участвующие в этом процессе.

С этой целью исходные рекомбинантные плазмиды, определяющие синтез микроцина, их делеционные производные и векторные плазмиды, использованные при конструировании (рис. 7), были введены с помощью трансформации в клетки штамма Е. coli %925, образующего миниклетки. Выделенные миниклетки были проинкубированы с S-метионином; меченые полипептиды были разделены путем электрофореза в ПААГ. Авторадиограммы гелей представлены на рисунке 8.

Было установлено, что фрагмент плазмиды pUHAB, определяющий синтез микроцина и иммунитет к нему (рис. 7), кодирует 6 полипептидов с молекулярными массами 85, 63, 35, 19, 16 и 14 кДа (рис. 8). Более короткий Mic+ фрагмент ДНК плазмиды pAST определял синтез 5 полипептидов с молекулярными массами 63,33,35,16и14 кДа. Из этих данных следует, что белки с массами 19 и 85 кДа кодируются фрагментом плазмиды pUHAB, отсутствующим в pAST, т.е. локализованным вне фрагмента ДНК, детерминирующего синтез микроцина. Полипептид 33 кДа, определяемый плазмидой pAST, также не имеет отношения к продукции микроцина и иммунитету, т.к. отсутствует среди полипептидов, определяемых Mic+ фрагментом pUHAB. Следовательно, с синтезом микроцина С51 и иммунитетом к нему могут быть связаны полипептиды с молекулярными массами 63, 35, 16 и 14 кДа, гены которых расположены во фрагменте длиной 5 т.п.н. (рис. 7).

Анализ полипептидов, кодируемых делеционными производными плаз-мид, показал следующее. Плазмида pUKH, определяющая частичный иммунитет к микроцину, кодировала 3 полипептида - 63, 35 и 14 кДа. Плазмиды pUHBn иpUHBr содержали HindIII -фрагмент ДНК 2,6 т.п.н. в различных ори-ентациях. Когда этот фрагмент был клонирован в pUC19 в той же ориентации, что и в pUHAB, он не определял иммунитета к микроцину. При клонировании HindIII фрагмента в противоположной ориентации (pUHBr) он определял частичный иммунитет к микроцину, как и плазмида pUKH. Из этих данных следовало, что 2,6 т.п.н. //ш£////-фрагмент не содержал собственного промотора гена тссЕ и его транскрипция происходила с промотора, локализованного в pUC19, скорее всего, с lac промотора, причем в том же направлении, что и в плазмиде pUHAB (Kurepina et al. 1993). Плазмида pUHBr определяла синтез полипептида 63 кДа в миниклетках, в то время как pUHBn не кодировала этого полипептида. Эти данные показывают, что полипептид 63 кДа, по-видимому, связан с обеспечением частичного иммунитета к микроцину клетки-продуцента.

1

63 кДа 35 кДа СР. ш ее Н2Р2

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Фоменко, Дмитрий Эдуардович

Выводы

1. Определена и проанализирована нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего оперон микроцина С51 - нового нуклеотидпеп-тидного антибиотика, продуцируемого Escherichia coli. Обнаружены пять открытых рамок трансляции, соответствующие плазмидным генам, ответственным за синтез микроцина и иммунитет к нему. В системе миниклеток идентифицированы продукты экспрессии генов микроцинового оперона.

2. Установлено, что по крайней мере три гена, тсс А, тссВ и mccD, принимают участие в биосинтезе микроцина. Маленький структурный ген тссА (21 п.н.) кодирует гептапептид, входящий в состав молекулы микроцина. Гены тссВ и mccD участвуют в посттрансляционной модификации пептидной части микроцина.

3. Выявлены два активных предшественника микроцина С51, синтез которых отрицательно влияет на жизнедеятельность клеток Е. coli.

4. Показано, что два гена, тссС и тссЕ, участвуют в экспрессии иммунитета к микроцину.

5. С использованием однокопийной конструкции, содержащей клонированную промоторную область микроцинового оперона, слитую с репортерным /ас-опероном, показано, что при замедлении роста и переходе клеток в стационарную фазу происходит активация транскрипции с этого промотора -уровень транскрипции увеличивается в 50-100 раз.

6. Транскрипция, инициируемая с промотора микроцинового оперона, зависит от продуктов генов глобальных регуляторов транскрипции rpoS (cts-субъединица РНК-полимеразы), сгр и су а. Белок OmpR и гистоноподобные белки Е. coli IHF и Fis не оказывают существенного влияния на транскрипцию с этого промотора.

7. Показано, что введение в вакцинный штамм Shigella flexneri реком-бинантной плазмиды, определяющей синтез микроцина С51, повышает антагонистическую активность штамма и, в результате, способствует увеличению пребывания клеток штамма в кишечнике перорально вакцинированных кроликов и усилению иммунного ответа. Эти данные свидетельствуют об улучшении вакцинных свойств штамма.

Заключение

Микроцины - новая интересная группа низкомолекулярных антибиотиков широкого спектра действия, продуцируемых энтеробактериями. Наиболее изученными из них являются микроцины типов В и С. При исследовании этих антибиотиков были выявлены новые интересные химические структуры и новые типы посттрансляционных модификаций. Можно с уверенностью сказать, что исследование структуры и генов синтеза микроцинов имеет большое значение как с фундаментальной, так и с практической точки зрения.

В данной работе исследовался генетический контроль синтеза микроцина С51. Этот микроцин является первым описанным нуклеотидпептидным антибиотиком. Было показано, что пептид, входящий в состав молекулы микроцина, синтезируется на рибосомах с матрицы тРНК структурного гена тсс А. В настоящее время это самый короткий пептид, синтезирующийся на рибосомах. Анализ определенной в работе первичной структуры ДНК и белков, связанных с продукцией микроцина С51, позволил высказать предположения относительно роли конкретных генов и их продуктов в биосинтезе микроцина и обеспечении иммунитета к микроцину клетки-продуцента. Исходя из полученных данных, можно привести следующую предположительную схему процесса биосинтеза микроцина С51:

1. синтез предшественника микроцина (I), гептапептида, продукта гена тссА;

2. аденилирование гептапептида с участием продукта гена тссВ - в результате образуется предшественник микроцина П, обладающий антибиотической активностью;

3. модификация предшественника П с участием продукта гена тссЭ. В результате образуется предшественник Ш, обладающий антибиотической активностью; возможно, на этой стадии происходит присоединение пропанола-миновой группировки;

4. образование зрелого микроцина С51 при участии продукта гена тссЕ.

Было показано, что биологически активные предшественники микроцина, синтезирующиеся на стадиях II и III в отсутствие гена mccD, токсичны для клетки; система иммунитета к микроцину не может защитить клетку от этих соединений.

Подробное исследование структуры предшественников и продуктов плазмидных генов, участвующих в посттрансляционной модификации гепта-пептида ( тссВ, mccD и, возможно, тссЕ), может выявить новые ферменты и типы посттрансляционной модификации пептидов. Подобные модификации пептидов и полипептидов, увеличивающие разнообразие их структур, представляют большой интерес для биотехнологии; их использование имеет серьезные перспективы для создания новых биологически активных веществ, в том числе, антибиотиков.

Согласно полученным данным, иммунитет клеток-продуцентов обусловлен двумя генами, тссС и тссЕ. Первый из них, по-видимому, участвует в экспорте зрелого микроцина из клетки, второй, возможно, модифицирует мишень действия микроцина. Выяснение механизма иммунитета клетки к собственному микроцину представляет большой интерес и требует проведения дальнейших экспериментов.

При секвенировании фрагментов ДНК, соседних с микроциновым оперо-ном, были обнаружены короткие прямые повторы, фланкирующие оперон, что свидетельствует о возможности передачи микроциновых генов путем рекомбинации. В пользу этого говорит также и отличие GC-содержания фрагмента ДНК микроцинового оперона от GC-содержания, характерного для Е. coli. Исследования в этом направлении представляют интерес с точки зрения эволюции бактериальных геномов.

Синтез микроцина С51 - сложный процесс, в котором задействованы ряд плазмидных и хромосомных генов. Микроцин С51 принадлежит к вторичным метаболитам клетки, синтез которых активируется, в основном, при переходе культуры к стационарной фазе роста. Мы показали, что активация экспрессии генов микроцинового оперона происходит на уровне транскрипции. В регуляции работы микроцинового промотора принимают участие глобальные регуляторы транскрипции - от® субъединица РНК-полимеразы и белок Сгр. Изучение регуляции экспрессии микроциновых генов выходит за рамки исследования генетического контроля синтеза микроцинов как таковых и является частью обширной области регуляции транскрипции у бактерий, причем промо-торная область микроцинового оперона является чрезвычайно удобной модельной системой.

Промотор микроцинового оперона, как и другие промоторы, активирующиеся при замедлении роста культуры, представляет большой интерес для биотехнологии. Он может быть использован для создания векторов нового типа, содержащих промотор, обеспечивающий индукцию синтеза необходимых продуктов в отсутствие активного роста клеток. Использование подобных промоторов кажется перспективным для активации синтеза токсичных соединений при переходе культуры - продуцента в стационарную фазу роста, когда чувствительность клеток к этим соединениям существенно снижается.

Несомненный интерес представляет экологический аспект изучения микроцинов. Судя по всему, микроцины обеспечивают селективные преимущества продуцирующим их бактериям. Микроциновые гены могут быть использованы для получения бактериальных препаратов пробиотиков, применяемых для профилактики и лечения заболеваний человека и животных. В данной работе на модельной системе была показана целесообразность использования генов микроцина С51 для улучшения вакцинных штаммов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фоменко, Дмитрий Эдуардович, 1999 год

Литература

1. Басюк Е.И., Безруков В.М., JIunacoea В.А., Хмель И.А. Клонирование и анализ генетических детерминантов, определяющих продукцию микроцинов В2 и В27 Генетика. 1994. Т.ЗО. С. 731-739.

2. Басюк Е.И. Анализ генетических детерминантов, определяющих синтез микроцинов. Кандидатская диссертация. Москва 1994.

3. Курепина Н.Е. Изучение генетического контроля синтеза микроцина микроцина R51 - антибиотика широкого спектра действия. Кандидатская диссертация. Москва. 1992.

4. Курепина Н.Е., Хмель H.A. Микроцины: природа и генетическое детерминирование. Молек. генетика, микробиол. и вирусол. 1986. № 4, С. 3-9.

5. Курепина Н.Е., Хмель И.А., Липасдва В.А., Зайцев ДА. Микроцин R51 и плазмида, определяющая его синтез. Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1990. № 5, С. 12-17.

6. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. Москва. Мир. 1976.

7. Рекеш А.Н., Колот М.Н., Малхосьян С.Р. Колицины: организация генов, функциональная структура молекул и механизм действия. Успехи современной биологии, 1987. Т. 104, С. 184-200.

8. Фоменко Д.Э., Басюк Е.И., Безруков В.М., Володин A.A., Метлщкая А.З., Хмель И.А. Идентификация и экспрессия плазмидных генов, участвующих в синтезе микроцина С51. Генетика. 1996. Т. 32. С. 1326-1332.

9. Фоменко Д.Э., Дзюменко Е.В., Хмель И.А. Участие гена rpoS в регуляции экспрессии плазмидных генов, определяющих синтез микроцина С51. Генетика. 1997. Т. 33. С. 284-286.

10. Хмель И. А. Плазмиды и эволюция микроорганизмов. Успехи совр. биол. 1985. Т. 99, С. 323-337.

11. Хмель И.А., Манохина И.М., Басюк Е.И., Метлицкая А.З., JIunacoea В.А., Романова Ю.М., Бондаренко В.М. Характеристика энтеробактерий, продуцирующих антибиотики широкого спектра действия микроцины. Генетика. 1993. Т. 29, С. 768-776.

12. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. Наука, 1984.

13. Abraham DJ, Leo А/Extension of the fragment method to calculate amino acid zwitterion and side chain partition coefficients. Proteins 1987;2(2): 130-52

14. Adams S.M., Blakeslly R.. Linear amplification DNA sequencing. Focus, 1991. V. 13, N2, P. 56-58.

15. Aguilar A., Perez-Diaz J.C., Baquero F., Asensio C. Microcin 15m from Escherichia coir, mechanism of antibiotic action. Antimicr. Agents and Chemoterapy. 1982, V. 21, No 3, P. 381-386.

16. Aguilar A., Perez-Diaz J.C., Asensio C. Mechanisms involved in the increased sensitivity of Escherichia coli to microcin 15m at 42 °C. Current Microbioligy. 1982, V. 7, No 2, P. 83-86.

17. Aguilar A., Baquero F., Martinez J. L., Asensio C. Microcin 15n: a second antibiotic from Escherichia coli LP15. The Journal of Antibiotics. 1983, Y. XXXVI, No 3, P. 325-7.

18. Asensio C., Perez-Diaz J.C., Martinez M.C., Baquero F. A new family of low molecular weight antibiotics from enterobacteria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 69, P. 7-14.

19. Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

20. Atlung T., Sund S, Olesen K., Brondsted L. The histone-like protein HNS acts as a transcriptional repressor for expression of the anaerobic and growth phase activator AppY of E. coli. J. of Bacteriol. June 1996, p. 3418-3425.

21. Baquero F., Bounchaud D., Martinez-Perez M.C., Fernandez C. Microcin plasmids: a group of extrachromosomal elements coding for low-molecular-weigh antibiotics in Escherechia coli. J. Bacteriol. 1978, V. 135, P. 342-347.

22. Baquero F. and Moreno F. The microcins. FEMS Microbiol. Letters. 1984, V. 23, P. 117-124.

23. Bayer A., Freund S., Nicholson G., Yung G. Posttranslational backbone modifications in the ribosomal biosynthesis of the glycine-rich antibiotic microcin B17. Angew. Chem. Int. Ed. 1993. V. 32. P. 1336-1339.

24. Ben-Gurion R., Flashner Y. New antibiotic substance produced by Salmonella typhimurium LT2. J. Bacteriol. 1982, V. 152, P. 542-4.

25. Bimboim K., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids Res. 1979. V. 7, P. 1513-1523.

26. Blanco M.T., Hurdato C., Peinado J.M. Effect of growth rate and aeration on the production of microcin by Escherichia coli growing in continuous culture. Microbios. 1986, V. 46, P.59-64.

27. Bohannon D.E., Connell N.. Keener J., TormoA., Espinosa-Urgel M., et al. Stationary-phase-inducible "gearbox" promoters: differential effects of KatF mutations and the role of s70. J. Bacteriol. 1991. V. 173, P. 4482-92.

28. Borthakur D., M. Basche, W. J. Buikema, P.B. Borthakur, R. Haselkorn. Expression, nucleotide sequense and mutational analisis of two open reading frames in the nif gene region of Anabaena sp. strain PCC7120. 1990, Mol. Gen. Genet. 221:227-234.

29. Brosius J. Plasmid vectors for the selection of promoters. Gene. 1984. V. 27. P. 151-160.

30. Castillo del I., Gomez J.M., Moreno F. mprA, an Escherichia coli gene that reduce growth-phase-dependent synthesis of microcin B17 and C7 and blocks

osmoinduction of proJJ when cloned on high-copy-number plasmid. J. Bacteriol. 1990, V. 172, P. 437-45.

31. Connel N., Han Z, Moreno F., Kolter R. An E.coli promoter induced by the cessation of growth. Molec. Microbiol. 1987, V. 1, P. 195-201.

32. Coplin D.L. Plasmids in plant pathogenic bacteria. Phytopathogenic Procaryotes. New York. 1982. V. 2. P. 255-280.

33. Davagnino J., Herrero M, Furlong D., Moreno F., Kolter R. The DNA replication inhibitor microcin B17 is a forty-three-amino-acid protein containing sixty percent glycine. Proteins: Structure, Function and Genetics. 1986, V. 1, P. 230238.

34. Davies J. K. and Reeves P. Genetics of resistance to colicin in Escherichia coli K-12: cross-resistance among colicins of group B. J. Bacteriol. 1975, V. 123, P. 96-101.

35. del Castillo I., Gonzalez-Pastor J.E., San Millan J.L., Moreno F. Nucleotide sequence of the Escherichia coli regulatory gene rapr.4-deficient mutants. J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 3942-3929.

36. Diaz-Guerra L., Moreno F., San Millan J.L. appR gene product activates transcription of microcin C7 plasmid genes. J. Bacteriol. 1989, V. 171, P. 2906-8.

37. Duro A. F., Serrano R. and Asensio C. Effect of the antibiotic microcin 140 on the ATP level and amino acid transport of Escherechia coli. BBRC. 1979, V. 88. P. 297-304.

38. Elaine B. Newman, Richard D'Ari, Rong Tuan Lin. The leucine-Zr/? regu-lon in E. coli: a global response in search of a raison d'etre. Cell, vol. 68, 617-619, Feb. 21,1992.

39. Elkins M.F., Earhart C.F. Nucleotide sequence and regulation of the E.coli gene for ferrienterobactin transport protein Fep B. J.Bacteriol. 1989. V.171, P. 5429-35.

40. Erratum, Russian J. of Genetics. 1997. V. 33. P. 116.

41. Frick K.K., Quakebush R.L. and Konisky J. Cloning of immunity and structure genes for colicin V. J. Bacteriol. 1981, V. 148, P. 498-507.

42. Friedman D. I. Integration host factor: a protein for all reasons. Cell. 1988. V. 51. P. 545-554.

43. Fonzi W.A., Sypherd P.S. ; "The gene and the primary structure of ornithine decarboxylase from Saccharomyces cerevisiaeJ. Biol. Chem. 262:10127-10133(1987).

44. Garsia-Bustos J.F., Pezzi N., Asensio C. Microcin 7: purification and properties. BBRC. 1984, V. 119, P. 779-785.

45. Gralla J.D., Collado-Vides J. Organization and function of transcription regulatory elements Escherichia coli and Salmonella typhimurium. 1996. Neidhardt F. C., Curtiss

46. Garsia-Bustos J.F., Pezzi N., Mendez E. Structure and mode of action of microcin 7, an antibacterial peptide produced by Escherichia coli. Antimicr. Agents and Chemoterapy. 1985. V.27, P. 791-7.

47. Gaggero C, Moreno F., Lavina M. Genetic analysis of microcin H47 antibiotic system. J. Bacteriol. 1993. V. 175, P. 5420-7.

48. Garrido del M., Herrero M., Kolter R., Moreno F. The export of the DNA inhibitor microcin B17 provides immunity for the host cell. EMBO J. 1988. V. 6, P. 1853-1862.

49. Guijarro J.I., Gonzalez-Pastor J.E., Baleux F., San Millan J.L., Castilla MA., Rico M, Moreno F., Delepierre M. Chemical structure and translation inhibition studies of the antibiotic microcin C7. J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 23520-23532.

50. Genilloud O., Moreno F., Kolter R. DNA sequence, products, and transcriptional pattern of the genes involved in production of the DNA replication inhibitor microcin B17. J. Bacteriol. 1989, V. 171, P. 1126-1135.

51. Gilson L., Mahatny H.K., Kolter R. Four plasmid genes are required for colicin V synthesis, export and immunity. J. Bacteriol. 1987. V. 169, P. 2466-2470.

52. Gilson L., Mahanty H. K, Kolter R. Genetic analysis of an MDR-like export system: the secretion of colicin V. EMBO J., 1990. V. 9, N. 12, P. 4197-207.

53. Glover S. W. Valine-resistant mutants of Escherichia coli K12. Genet. Res. 1962. V.3,P. 448-60.

54. Gonzalez-Pastor J.E., San Millan J.L., Moreno F. The smallest known gene. Nature. 1994. V. 369, N. 26, P. 281.

55. Gonzalez-Pastor J.E., San-Millan J.L., Costilla M.A., Moreno F. Structure and organization of plasmid genes required to produce the translation inhibitor microcin C7. J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 7131-7140.

56.Gonzalez-Gil G, Kahmann R, Muskhelishivili G, Regulation of crp transcription by oscillation between distinct nucleoprotein complexes. EMBO J 1998 May 15;17(10):2877-85

57. Gratia A. Sur un remarquable exemple d'antagisme entre deux souches de collibacille. 1925. C.R. Soc. Biol., V. 93, P. 1041-2.

58. Gralla J.D., Collado-Vides J. Organization and function of transcription regulatory elements. Escherichia coli and Salmonella typhimurium. 1996. Neidhardt F.C., Curtiss R. Ill, Ingraham J.L., Lin E.C.C., Low KB., Magasanik B., Reznikoff N.S., Riley M., Schaechter M., Umbarger H.L., eds. ISM Press Washington D.C. P. 1232-1245.

59. Haas H., I.A. Rose. The machnism of ubiquitin activating enzyme. 1982, J. Biol. Chem. 2557:10329-10337.

60. Hacker J., Blum-Oehler G., Muhldorfer I., Tschape H., Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. Mol. Microbiol. 1997 Mar, 23(6): 1089-1097

61. Hall M.N. and Silhavy T.J. Genetic analysis of the major outer membrane proteins of Escherichia coli. 1981. An. Rev. Genet., V. 15, P. 91-142.

62. Hall M.N. and Silhavy T.J. The ompB locus and regulation of the major outer membrane porin proteins of Escherichia coli K-12.1981. J. Mol. Biol. V. 146, P. 23-43.

63. Hanamura A, Aiba H A new aspect of transcriptional control of the Escherichia coli crp gene: positive autoregulation. Mol Microbiol 1992 Sep;6(17):2489-97

64. Hardy K. Colicinogeny and related phenomena. Bacteriol. Rev. 1975. V. 39, P. 464-515.

65. Hemandez-Chico C., Herrero M., Rejas M, San Millan J.L., Moreno F. Gene ompR and regulation of microcin 17 and colicin E2 syntheses. J. Bacteriol. 1982. V. 152, P. 897-900.

66. Hernandez-Chico C., San Millan J.L., Kolter R., Moreno F. Growth phase and OmpR regulation of transcription of microcin B17 genes. J. Bacteriol. 1986. V. 167, P. 1058-1065.

67. Herrero M. and Moreno F. Microcin B17 blocks DNA replication and induces the SOS-system in Escherichia colL Gen. Microbiol. 1986, 132, P. 393-402.

68. Herrero M., Kolter R., Moreno F. Effects of microcin B17 on microcin B17-immune cells. Gen. Microbiol. 1986, V. 132, P. 403-410.

69. Hershman H.R., Helinski D.R. Comparative study of the events associated with colicin induction. J. Bacteriol. 1967. V. 94, P. 691-699.

70. Higgins CF., Hinton J.C.D., Hulton C.S.F., Owen-Hughes T., Pavitt G.D., Seirafi A. Protein HI: a role for chromatine structure in the regulation of bacterial gene expression and virulence? Mol. Microbiol. 1990. V. 4. P. 2007-2012.

71. Hopwood D.A. Extrachromosomally determined antibiotic production. Ann. Rev. Microbiol. 1978. V. 32, P. 373-92.

72. Imai N., S. Kaneda, Y.Nagai, T. Seno, D. Ayusawa, F. Hanaoka, F. Yamao. Cloning and sequence of afunctionally active cDNa encoding the mouse ubiquitin-activating enzyme El .1992, Gene 118:279-282.

73 Jimin XU, Reid C. Jonson. Fis activités the iipo^-dependent stationary-Phase Expression ofproP in E.coli. J. of Bacteriol. Sept. 1995. P. 5222-5231.

74. Johnson M.E., K. V.Rajgopalan. Involvement of chlA,E,M,N loci in E. coli molybdopterin biosythesis. 1987, J. Bacteriol., 169:117-125.

75. Jung G. Lantibiotics - ribosomally synthesized biologically active polipeptides containing sulfide briges and a,p-didehidroamino acids. Angew Chem. Int. Edn 1991. V. 30, P. 1051 - 68.

76. Kato N, Tsuzuki M, Aiba H, Mizuno T. Gene activation by the E. coli positive regulator OmpR: a mutational study of the DNA-binding domain of OmpR. Mol Gen Genet (1995) 248:399-409

77. Khmel I.A., Lipasova V.A., Kurepina N.E., Rekesh A.N. Kolot M.N. The nature of typhimuricin, the antibiotic substance produced by Salmonella typhimurium LT2. Microbios Letters. 1987. V. 36, P. 33-38.

78. Khmel I.A., Bondarenko V.M., Manokhina I.M., Basyuk E.I., Metliskaya A.Z., Lipasova V.A., Romanova Y.M.. Isolation and characterization of Escherichia coli strains producing microcins of B and C types. FEMS Microbiology Letters. 1993. V. Ill, p. 269-274.

79. Kleinkauf H., von Dohrem H. Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics. Eur. J. Biochem. 1990. V. 192, P. 1-15.

80. Klein P., M. Kanehisa, C. DeLisi. The detection and classification of membrane-spanning proteins. 1985, Biochim. Biophys. Acta 815:468-476.

81 .Kolb A., Kotlarz D., Kusano S., Ishihama A.. Selectivity of the E. coli RNA polymerase Ect for overlapping promoters and ability to support CRP activatian. Nucleic Acids Research, 1995, vol. 23, No. 5.

82. Kolter R. and Moreno F. Genetics of ribosomally synthesized peptide antibiotics. Annu. Rev. Microbiol. 1992. V. 46, P. 141-63.

83. Kolter R., Siegele D.A., Torno A. The stationary phase of the bacterial life cycle Annu. Rev. Microbiol. 1993. V. 47. P. 855-874. 885-874.

84. Konisky J. The bacteriocins. In: Ornston L.N., Sokatch J.R. (eds.) The bacteria, V. 6, Academic Press, New York, 1978, P. 71-136.

85. Konisky J. Colicins and other bacteriocins with established modes of action. Ann. Rev. Microbiol. 1982. V. 36, P. 125-44.

86. Kurepina N.E., Basyuk E.I., Metliskaya A.Z., Zaitsev D.A., Khmel I.A. Cloning and Mapping of the Genetic Determinants for Microcin C51 Production and Immunity. MGG, 1993, V. 241, P. 700-706.

87. Lagos R, Villanueva JE, Monasterio O, Identification and properties of the genes encoding microcin E492 and its immunity protein, J Bacteriol 1999 Jan;181(l):212-7

88. Lange R., Hengge-Aronis R. Growth phase-regulated expression of bolA and morphology of stationary phase Escherichia coli cells is controlled by the novel sigma factor crs(rpoS). J. Bacteriol. 1991. V. 173, P. 4474-81.

89. Lange R., Fischer D., Hengge-Aronis R. Identification of transcriptional start sites and the role of ppGpp in the expression of rpoS, the structural gene for the a subunit of RNA polimerase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1995, V. 177, P. 4676-4680.

90. Lavina M., Pugsley A., Moreno F. Identification, mapping, cloning and characterization of a gene (sbmA) required for microcin B17 action on Escherichia coli K12. Gen. Microbiol. 1986. V. 132. P. 1685-1693.

91. Lavina M., Gaggero C., Moreno F. Microcin H47, a chromosome-encoded microcin antibiotic of Escherichia coli. J. Bacteriol. 1990. V. 172, P. 6585-88.

92. Leslie A. Pratt, Weihong Hsing, Katherine E. Gibson, Thomas J. Silhavy. From acids to osmZ: multiple factors influence synthesis of the OmpF and OmpC porins in E. coli. Mol. Microbiol. (1996) 20(5), 911-917.

93. Li Y-M., Milne J.C., Madison L.L., Kolter R., Walsh C. From peptide precursors to oxazole and thiazolecontaining peptide antibiotics: microcin B17 synthase. Science. 1996. V. 274. P. 1188-1193.

94. Liu J. Microcin B17: posttranslational modifications and their biological implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91, P. 4618-4620.

95. Loewen P.C., Hengge-Aronis R. The role of the sigma factor as (KatF) in bacterial global regulation. Annu. Rev. Microbiol. 1994. V. 48. P. 53-80.

96. Lorenzo de V. Isolation and characterization of microcin E492 from Klebsiella pneumoniae. Arch. Microbiol. 1984, V. 139, P. 72-75.

97. Lorenzo de V. Microcin-mediated interactions between Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli strains. Gen. Microbiol. 1984, V. 130.P. 391-400.

98. Lorenzo de V. and Pugsley A. Microcin E492, a low-molecular-weight peptide antibiotic which causes depolarization of the Escherichia coli cytoplasmic membrane. Antimicr. Agents and Chemoter. 1985. V. 27, P. 666-669.

99. Martin J.F. and Demain A.L. Control of antibiotic synthesis. Microbiol. Rev. 1980. V. 44, P. 230-251.

100. Martin J.F., Liras P. Organization and expression of genes involved in the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites. 1989. An. Rev. Microbiol. V. 43, P. 173-209.

101. Martinez J.L., Delgaro-Iribarren A., Baquero F. Mechanisms of iron acquision and bacterial virulence. FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75, P. 45-56.

102 Martinez J.L. and Perez-Diaz J.C. Isolation, characterization and mode of action on Escherichia coli strains of microcin D93. Antimicr. Agents and Chemoter. 1986, V. 29, P. 456-460.

103. Molly B. Schmid. More then jast "histone-like" proteins. Cell, vol. 63, 451-453, Nov. 2, 1990

104. Moreno F., San Millan J.L., del Castillo I., Gomez J.M., Rodriguez-Sainz M.C., Gonzalez-Pastor J.E., Diaz-Guerra L. Escherichia coli genes regulating the production of microcins MccB17 and MccC7. Bacteriocins, Microcins and Lantibiotics. James R., Lazdunski C., Pattus F., Eds. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 1992. P. 3-12.

105. Martinez J.L. and Perez-Diaz J.C. Cloning of the determinants for microcin D93 production and analysis of three different D-type microcin plasmids. Plasmid. 1990, V. 23, P. 216-225.

106. Mason T.G. and Richardson G. Escherichia coli and the human gut: some ecological considerations. J. Appl. Bacteriol. 1981, V. 1, P. 1-16.

107. Mayo O., Hernandez-Chico C., Moreno F. Microcin B17, a novel tool for preparation of maxicells: identification of polypeptides encoded by the IncII minireplicon pMccB17. J. Bacteriol. 1988, V.170, P. 2414-17.

108. McGrath J.P., Jentsch S., Varshavsky A. UBA!: an essential yeast gene encoding ubiquitin activating enzyme. EMBO J. 10:227-236(1991).

109. Metlitskaya A.Z., Katrukha G.S., Shashkov A.S., Zaitsev D.A., Egorov Ts.A., Khmel I.A. Structure of microcin C51, a new antibiotic with a broad spectrum of activity. FEBS Letters. 1995. V. 357. P. 235-238.

110. Mills D.A., Flickinger M.C.; Cloning and sequence analysis of the meso-diaminopimelate decarboxylase gene from Bacillus methanolicus MGA3 and comparison to other decarboxylase genes."; Appl. Environ. Microbiol. 59:2927-2937(1993).

111. Mizuno T., Chou M.Y., and Inoyuye M. A unique mechanism regulating gene expression: translation inhibition by a complementary RNA transcript (micRNA). Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984. V. 81, P. 1966-1970.

112. Mizuno T. and Mizushima S. Characterization by deletion and localized utagenesis in vitro of the promoter region of Escherichia coli ompC gene and importance of the upstream DNA domain in positive regulation by the OmpR protein. J. Bacteriol. 1986. V. 168, P. 86-95.

113. Moore R.C., Boyle S.M.; Nucleotide sequence and analysis of the speA gene encoding biosynthetic arginine decarboxylase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 172:4631-4640(1990).

114. Mulvey M.R., Loewen P.C. Nucleotide sequence of katF of Escherichia coli suggests KatF protein is a novel transcription factor. Nucleic. Acids Res. 1989. V. 17, P. 9979-91.

115. Murray V. Improved double-stranded DNA sequencing using the linear polymerase chain reaction. NAR, 1989. V. 17, N 21, P. 8889.

116. M.W. avn der Woude, L.S. Kaltenbatch and D.A. Low. Leucine-responsive regulatory protein plays dual roles as both an activator and a repressor of the E. coli pap fimbrial operon. Mol. Microbiol. (1995) 17(2), 303-312

117. Nara F., Matsuyama S., Mizuno J., Mizushima Molecular analysis of mutant ompR genes exhibiting different phenotypes as to osmoregulation at the ompF and ompC genes of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 1986, V. 202, P. 194 -199.

118. Norioka S., Ramakrishnan G., Ikenaka K. and Inouye M. Interaction of a transcriptional activator, OmpR, with reciprocally osmoregulated genes, ompF and ompC, of Escherichia coll J. Biol. Chem. 1986. V. 261, P. 17113-17119.

119. Novoa M., Diaz-Guerra L., San Millan J.I., Moreno F. Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C7 production and immunity. J. Bacteriol. 1986, V. 168, P. 1384-1391.

120. Nohno T., Y Kasai, T. Satio. Cloning an dsequencing of the E. coli chlEN operon involved in molibdopterin biosinthesis. 1988, J. Bacteriol. 170:4097-4102.

121. Panopoulos N.J. and Peet R.C. The molecular genetics of plant pathogenic bacteria and their plasmid. Ann. Rev. Phytopathol. 1985. V. 23, P.381-419.

122. Perez-Diaz J.C. and Clowes R.C. Physical characterization of plasmids determining synthesis of a microcin which inhibits methionine synthesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1980, V. 141, P. 1015-23.

123. Pugsley A.P. The ins and outs colicins. Part I: production, Mid translocation across membranes. 1984. Microbiol. Sciences. V. 1, N 7, P. 168-175.

124. Pugsley A.P. The ins and outs colicins. Part II: Lethal action, immunity and ecological implications. 1984. Microbiol. Sciences. V. 1, N 8, P. 203-5.

125. Pugsley A.P. Escherichia coli K12 strains for use in the identification and characterization of colicins. 1985. J. Jen. Microbiol. V.131, P. 369-76.

126. Pugsley A.P., Moreno F., Lorenzo de V. Microcin E492 insensitive mutants of Escherichia coli K12. J. Jen. Microbiol. 1986. V. 132, P. 3253-59.

127. Pugsley A.P., Schwartz, M. Export and secretion of proteins by bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 1985. V. 32, P. 3-38.

128. Quigley N.B., Lane D., Bergquist P.L. Genes for phaseolotoxin synthesis are located on the chromosome of P. syringae pv. phaseolicola. Current Microbiol. 1985. V. 12, P. 295-300.

129. Rampersaud A., Harlocker S.L., Inouye M. The OmpR protein of Escherichia coli binds to sites in the ompF promoter region in a hierarchical manner

determined by its degree of phosphorylation. J. Biol. Chem. 1994, V. 269, N. 17, P. 12559-12566.

130. Rajagopalan K.V., and J.L. Jonson. The pterin molybdenum cofactor. 1992, J. Biol. Chem. 267:10199-10202.

131. Rodrigues-Sainz M.C., Hernandez-Chico C., Moreno F. Molecular characterization of pmbA, an Escherichia coli chromosomal gene required for the production of the antibiotic peptide MccB17. Mol. Microbiol. 1990, V. 4, P. 19211932.

132. Rodriguez-Sainz M.C., Hernandez-Chico C., Moreno F. A his::Tn5 mutation affects production of microcin B17, C7 and H47 and colicin V. J. Bacteriol. 1991, V. 173, P. 7018-20.

133. Rodriguez E, Lavina M., Genetic analysis of microcin H47 immunity, Can J Microbiol 1998 Jul;44(7):692-7

134. Rosher J.L., Chai T.-J., and Foulds J. Regulation of OmpF porin expression by salicilate in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1991, V. 173, P. 56315638.

135. Ruhr E., Sahl H.G. Mode of action of the peptide antibiotic nisin and influence on the membrane potential of whole cells and on cytoplasmic and artificial membrane vesicles. Antimicrob. Agents Chemoter. 1985. V.27, P. 841-45.

136. R. in, Ingraham J.L., Lin E. C. C., Low K.B., Magasanik B., Reznikoff N.S., Riley M., Schaechter M., Umbarger H.L., eds. ISM Press Washington D.C. P. 12321245.

137. Salazar L., Dorta B. and Lemoine V.R. Growth rate and production of microcin by Salmonella typhimurium LT2 (strain M799-0) in continuous culture. Microbios. 1990, V. 61, P. 17-22.

138. Salomon R.A. and Farias R.N. Microcin 25, a novel antimicrobial peptide produced by Escherichia coli. J. Bacteriol. 1992, V. 174, P. 7428-35.

139. Salomon R.A. and Farias R.N. The FhuA protein is involved in microcin 25 uptake. J. Bacteriol. 1993, V. 175, P. 7741-2.

140. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular clonong, a laboratory

manual. Second ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.

141. Samir P. Bhagwat, Manda R. Rice, Rowena G. Matthews, Robert M. Blumenthal. Use of an inducible regulatory protein to identify members of a regulon: application to the regulon controlled by the leucine-responsive regulatory protein in E. coli. J. of Bacteriol. Okt. 1997, p.6254-6263.

142. San Millan J.L., Hernandez-Chico C., Pereda P. and Moreno F. Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin B17 production and immunity. J. Bacteriol. 1985a, V. 163, P. 275-281.

143. San Millan J.L., Kolter R, Moreno F. Plasmid genes required for microcin B17 production. J. Bacteriol. 1985b, V. 163, P. 1016-1020.

144. San Millan J.L., Kolter R., Moreno F. Evidence that colicin X is microcin B17. J. Bacteriol. 1987, V. 169, P. 2899-2901.

145. Sanchez F., Jimenez G., Aguilar A., Baquero F., Rubio V. Plasmid pVA517c from Escherichia coli V517 is required for the expression of an antibiotic microcin. J. of antibiotics. 1986. V. XXXIX, P. 1028-30.

146. Schnell N.. Entian K-D., Götz F., Horner T., Kellner R„ Jung G. Structural gene isolation and prepeptide sequence of gallidermin, a new lanthionine containing antibiotic. FEMS Microbiol. Lett. 1989, V. 58, P. 263-68.

147. Shine J., Delgarno L. The 3-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1974. V. 71. P. 1342-1346.

148. Siegele D.A. and Kolter R. Life after log. J. Bacteriol. 1992. V. 174, P. 345-348.

149. Silver S., Johns eine P., Whitney E. and Clark D. Manganese-resistant mutants of Escherichia coli: physiological and genetic studies. J. Bacteriol. 1972. V. 110, P. 186-195.

150. Smith H.W. and Higgins M.B. Further observation on the association of the colicin V plasmid of Escherichia coli with survival in the alimentary tract. J. Gen. Microbiol. 1976, V. 92, P. 335-350.

151. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 1975. V. 98, P. 503.

152. Solbiati J.O., Ciaccio M, Farias R.N., Salomon R.A. Genetic analysis of plasmid determinants for microcin J25 production and immunity. J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 3661-3663.

153. Stragier P., Danos O., Patte J.-C.; "Regulation of diaminopimelate decarboxylase synthesis in Escherichia coli. II. Nucleotide sequence of the lysA gene and its regulatory region.";. Mol. Biol. 168:321-331(1983).

154. Stoker N.G., Piatt J.M., Holland I.B. In vivo expression system in prokargotes. Oxsford: IRL Press, 1974.-p 164-171.

155. TaggJ.R., Dajani A.S., Wannamaker L.W. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol. Rev. 1976, V. 40,P. 722-756.

156. Tanaka S., Y. Matsushita, A. Yshikawa, K. Isono. Cloning and molecular characterization of the gene rimL wich encodes an enzyme acetylating ribosomal protein L12 of E. coli K12. 1989, Mol. Gen. Genet. 217:289-293.

157. Tanaka K., Takayanagi Y., Fujita N., Ishihama A., Takahashi H. Heterogeneity or the principal 6 factor in Escherichia coli'. the rpoS gene product,

38 *

<y , is a second principal factor of RNA polymerase in stationare-phase E. coli. Biochem. 1993. V.90,P. 3511-3515.

158. Talukder A., Yanai S, Nitta T., Kato A., Yamada M. -KpoS-dependent regulation of genes expressed at late stationary phase in E. coli. FEBS Letters 386 (1996) 177-180

159. Timothy S. Pratt, Thomas Steiner, Lean S. Feldman, Kimberly A. Walker, Robert Osuna. Deletion Analisis of the fis promoter region in E. coli: antagonistic effects of integration host factor and fis. J. of Bacteriol., Oct. 1997, p. 6367-6377

160. Touati E., Dassa E. and Boquet P.L. Pleotropic mutations in appR reduce pH 2,5 acid phosphatase expression and restore succinate utilization in CRP-deficient strains of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 1986. V. 202. P, 257-64.

161. Ueguchi Ch., Mizuno T. The E. coli nucleoid HNS function directly as a transcriptional repressor. EMBO Journal, vol. 12 no. 3 pp. 1039-1046,1993

162. Vander horn, P.B., A.D. Backstrom, V. Stewart, T.P. Begley. Structural gene for thiamine biosynthetic enzimes (thiCEFGH) in E. coli K-12.1993, J. Bacte-riol. 175:982-992.

163. Vidaver A.R. Bacteriocins: the lure and reality. Plant Dis. 1983. V. 67, P. 471-475.

164. Vizan J.L., Hernandez-Chico C., Castillo del I., Moreno F. The peptide antibiotic microcin B17 induces double-strand cleavage of DNA mediated by E. coli DNA gyrase. The EMBO J. 1991, V. 19, P. 467-476.

165. Waters V.L. and Crosa J.H. Colicin V virulence plasmids. Microbiological Reviews. 1991. V. 55, P.437-450.

166. Wierenga R.K. and W.G.J. Hoi. 1983. Predicted nucleotide-binding properties of p21 protein and its canser-associated variant. Nature, 302:842-844.

167. Waters V.L., Perez-Casals J.F., Crosa J.H. Col V plasmids pColV-B188 and pColV-K30: genetic maps accoding to restriction enzyme sites and landmark phenotypic characteristics. Plasmid, 1989, V. 22, P. 244-8.

168. Yang C.C., Konisky J. Colicin V-treated Escherichia coli does not generate membrane potettial. 1984. J. Bacteriol., V. 158, P. 757-759.

169. Yorgey P., Davagnino J., Kolter R. The maturation pathway of microcin B17, a peptide inhibitor of DNA gyrase. Mol. Microbiol. 1993,

170. Yorgey P., Jonathan L., Kordel J., Vivas E., Warner P., Jebaratnam P., Kolter R. Posttranslational modifications in microcin B17 define and additional class of DNA gyrase inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. V. 91, P. 45194523.

171. Yoshikawa A., Isono S., Sheback A., Isono K.; "Cloning and nucleotide sequencing of the genes riml and rimJ which encode enzymes acetylating ribosomal proteins S18 and S5 of Escherichia coli K12."; MOL. GEN. GENET. 209:481-488(1987).

172. Yamamoto J., Shimizu M., Yamane k.\ Nucleotide sequence of the diami-nopimelate-decarboxylase gene from Bacillus subtilisNucleic Acids Res. 17:10105-10105(1989).

173. Yoshida K.I., Seki S., Fujita Y.; Nucleotide sequence and features of the Bacillus licheniformis grit operon."; DNA Res. 1:157-162(1994).

Хочу выразить благодарность Инессе Александровне Хмель и всему коллективу Лаборатории внехромосомной наследственности микроорганизмов ИМГ РАН за огромную помощь в работе и написании диссертации.