Функционирование гидрогеназного электрода в биореакторе с водородвыделяющими микроорганизмами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Шастик, Евгений Сергеевич

• Шастик, Евгений Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шастик, Евгений Сергеевич

Содержание

СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Интегральные системы получения водорода биологическим путем

1.1. Получение водорода биологическим путем

1.2. Совмещение брожения и фотоферментации

1.3. Совмещение топливных элементов и выделения водорода различными микроорганизмами для получения электричества

1.4. Другие интегрированные системы

2. Микробные топливные элементы

2.1. Механизм электронного транспорта

2.2. Дизайн МТЭ

2.3. Материалы электродов

2.4. Микроорганизмы в МТЭ

2.5. Субстраты, используемые в МТЭ

3. Гидрогеназы

3.1. Строение [Ni-Fe] гидрогеназ

3.2. Классификация [Ni-Fe] гидрогеназ

4. Гидрогеназные электроды

5.Материалы и методы

5.1 .Экспериментальная установка для изучения температурной и операционной стабильностей ГЭ

5.2. Электрохимическая ячейка

5.3. Исследование электрохимической активности ГЭ

5.4. Исследование стабильности ГЭ во времени

5.5. Исследование зависимости значений тока ГЭ от температуры

5.6. Интеграция ГЭ и крахмалразлагающего консорциума в биореакторе

5.7. Выбор мешальника

5.7. Изучение работы ГЭ в биореакторе с микробным консорциумом

5.8. Питательная среда и консорциум микроорганизмов

5.9. Методы биохимического анализа

5.10. Препараты гидрогеназ

5.11. Изготовление ГЭ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

6. Исследование особенностей работы ГЭ

6.1. Вольтамперные характеристики ГЭ

6.2. Исследование стабильности ГЭ во времени

6.3. Выявление основной лимитирующей стадии в процессе электрокатализа

7. Совмещение ГЭ и водородвыделяющих микроорганизмов

7.1. Выявление возможности работы ГЭ в биореакторе с крахмалразлагающим микробным консорциумом

7.2. Влияние повышенного поглощения водорода ГЭ на метаболизм микробного консорциума

7.3. Работа ГЭ в биореакторе при проточном культивировании

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ:

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СОКРАЩЕНИЯ

МТЭ - микробный топливный элемент; МЭЯ - микробная электролизная ячейка; ТЭ - топливный элемент; НК - нейтральный красный; ГЭ — гидрогеназный электрод; ПСМ — протонселективная мембрана; КЭ - кулоновская эффективность; ЛЖК - летучие жирные кислоты; н. г. - начальная глюкоза.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функционирование гидрогеназного электрода в биореакторе с водородвыделяющими микроорганизмами»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. К наиболее важным проблемам, стоящим перед современной цивилизацией, можно отнести дефицит энергоносителей и утилизацию техногенных отходов, загрязняющих окружающую среду. Эти проблемы являются взаимосвязанными, так как большая часть современной энергетики использует полезные ископаемые: нефть, газ, каменный уголь. При использовании ископаемого топлива выделяется углекислый газ, который загрязняет атмосферу. Очистка органических отходов, в свою очередь, требует больших затрат электроэнергии, хотя окисление этих же отходов могло бы давать энергию. Таким образом, использование отходов как вторичных ресурсов для получения энергии - перспективный путь решения проблем энергосбережения и утилизации мусора. Особенно интересен с этих позиций молекулярный водород, синтезируемый биологическим путем из сточных вод. Несмотря на интенсивные исследования в течение нескольких десятилетий, проводимые как на фундаментальном, так и прикладном уровнях с участием молекулярных биологов, микробиологов, биотехнологов, уровень наших знаний еще недостаточен для использования на практике биологического преобразования органических отходов в молекулярный водород.

Преобразование биоводорода в электричество является важной практической задачей. При этом использование Нг в топливных элементах (ТЭ) в децентрализованных энергосистемах, где Н2 образуется из органических отходов на месте их получения, может решить проблемы его хранения и транспортировки без изменения инфраструктуры энергосетей. В литературе описаны работы по сопряжению топливных элементов на основе платины с биореакторами, образующими водород (глава 1.5). Однако для использования биоводорода в ТЭ на основе платины требуется его предварительная очистка от каталитических ядов, таких как сероводород, необратимо инактивирующих металлический катализатор, что приведет к дополнительным затратам энергии. С другой стороны совмещение в одном пространстве ТЭ и биореактора, генерирующего водород, может дать дополнительные преимущества. Снижение парциального давления водорода в биореакторе, за счет его поглощения ТЭ, может увеличить скорость выделения водорода, а также и изменить спектр получаемых продуктов брожения. Как альтернативу катализу благородными металлами предлагается использовать биологические катализаторы — ферменты (глава 4). В качестве биологического катализатора окисления водорода в ТЭ может использоваться гидрогеназа -

белок, участвующий в превращениях водорода в живых организмах. Вместе с тем, уровень разработанности водородных электродов на основе гидрогеназ пока не позволяет их применять в промышленных ТЭ.

Степень разработанности проблемы. К 2008 году (начало исследований) в литературе не имелось публикаций, касающихся интеграции выделения водорода и гидрогеназного электрода (ГЭ), хотя принципиальная возможность работы гидрогеназного электрода в качестве сенсора водорода в среде, где развиваются клостридии, была показана в кратковременных экспериментах [1]. Возможность длительной работы гидрогеназного электрода в среде, где могут появляться протеазы, разрушающие фермент на электроде, не показана. Неизвестно было также, как присутствие и функционирование гидрогеназного электрода может повлиять на метаболизм водородвыделяющих микроорганизмов.

Целью работы было проверить возможность длительного использования гидрогеназного ферментного электрода для преобразования биоводорода, выделяемого микробным консорциумом, в электричество.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• Разработка и изготовление биореактора и системы управления для одновременного выделения водорода микроорганизмами и его электрохимического окисления на ГЭ.

• Изучение операционной стабильности ГЭ как в буферных растворах, так и в биореакторе с крахмалразлагающим микробным консорциумом.

• Исследование электрохимической активности ГЭ при разных температурах.

• Исследование работы ГЭ в режиме сенсора водорода и в режиме генерации электрокаталитического тока в биореакторе с водородвыделяющим микробным консорциумом.

• Выявление особенностей периодического и непрерывного процессов сбраживания крахмала в присутствии и отсутствие ГЭ.

Научная новизна. Впервые изучена операционная стабильность ГЭ на основе гидрогеназ из Thiocapsa roseopersicina BBS и Desulfomicrobium baculatum и показано, что ГЭ с гидрогеназой из Т. roseopersicina обладает высокой стабильностью. Впервые изучена зависимость энергии активации электрохимического окисления водорода на ГЭ от

приложенного перенапряжения. Показана возможность работы ГЭ в режиме сенсора и в режиме генерации тока в биореакторе с водородвыделяющим микробным консорциумом. Обнаружено, что при длительном непрерывном культивировании микробного крахмалразлагающего консорциума в присутствии ГЭ наблюдаются изменения в составе продуктов брожения.

Практическая значимость. Сконструирован и апробирован биореактор для получения электричества из крахмалсодержащих сточных вод и разработана система управления этим процессом, что может служить прообразом для промышленных образцов. Полученные данные могут служить основой для дальнейшей оптимизации процесса преобразования органических отходов в электричество. Обнаружено, что обрастание ГЭ является одной из важных причин снижения его каталитической активности.

Апробация результатов исследования. Результаты работы были апробированы на следующих конференциях:

• 13th International Symposium on Phototrophic Procaryotes (2009, Montreal, Canada)

• Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (2009, Москва. Россия);

• 14- Международная Пущинская школа - конференция молодых ученных. Биология наука XXI века (2010, Пущино, Россия.);

• The 9-th International Hydrogenase Conference (2010, Uppsala, Sweden);

• III Международный форум по нанотехнологиям Rusnanotech (2010, Москва, Россия);

• 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (2012, Пущино, Россия)

• Школа конференция молодых ученных биосистема: от теории к практике (2010, Пущино, Россия)

Работа была поддержана программой РАН «Химические аспекты энергетики».

Публикации по теме работы. В рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, опубликованы 2 статьи по материалам диссертации, также опубликовано 7 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Интегральные системы получения водорода биологическим путем

1.1. Получение водорода биологическим путем

Водород является одним из перспективных энергоносителей для альтернативной

энергетики вследствие своей высокой энергоемкости и экологичное™ (продуктом сгорания Нг или его электрокаталитического окисления в ТЭ является НгО). Способностью выделять водород при помощи различных метаболических путей и ферментов обладают многие

N

микроорганизмы.

Светозависимые процессы. Наибольшими скоростями получения водорода в светозависимом синтезе Нг обладают пурпурные несерные бактерии при фотоферментации, выделяющие Нг как побочный продукт реакции фиксации азота нитрогеназой [2]. Цианобактерии также способны к азотфиксации за счет аэробного фотосинтеза [3] (а значит к выделению Нг). Однако кислород, образующийся в результате оксигенного фотосинтеза, губителен для нитрогеназы. Гетероцистные филаментные цианобактерии решили эту проблему пространственным разделением этих процессов [4], а одноклеточные - временным, осуществляя фотосинтез и азотфиксацию в разное время клеточного цикла [5, 6]. К кратковременному выделению водородас высокими скоростями способны микроводоросли при темновой адаптации в ответ на освещение [7, 8]. Также микроводоросли могут устойчиво, хотя и с низкими скоростями, синтезировать Нг, используя ацетат при недостатке серы [8, 9] , азота [10], фосфора [11]. В определенных условиях микроводоросли и цианобактерии могут синтезировать Нг, сбраживая полисахариды, образованные при фотосинтезе [12, 13]. Synechocystis sp. [14] и Thiocapsa roseopersicina BBS [15, 16] способны к выделению Нг в условиях избытка восстановителя на свету за счет обратимой гидрогеназы, но данный процесс мало изучен.

При фотовыделении Нг можно переводить энергию солнца в энергию химической связи водорода (биофотолиз цианобактерий или зеленых микроводорослей) или совмещать очистку сточных вод, содержащих летучие жирные кислоты (ЛЖК), с фотогетеротрофным синтезом биоводорода (пурпурные несерные бактерии), причем конверсия субстрата может достигать 90 % от теоретического (12 моль Нг на моль гексозы). Однако, существуют ряд проблем,

ограничивающих практическое применение «фотоводорода»: низкие скорости выделения при долговременном культивировании (цианобактерии и микроводоросли), ограниченный спектр используемых субстратов (фотоферментация), а также трудности в разработке дешевых фотобиореакторов [17, 18]. Темновое же выделение водорода, как правило, идет с более высокими скоростями (15 л/л реактора [19], что уже близко к практически важным значениям [20, 21]), может использовать широкий спектр субстратов (в том числе сточные воды и твердые отходы [18, 22]).

Некоторые бактерии в анаэробных условиях способны к брожению с выделением водорода, двуокиси углерода и ЛЖК как продуктов (рисунок 1). Первоначально происходит деградация полимеров, если субстратом являются полисахариды, до мономеров: пентоз и гексоз. Затем С5, С6 углеводы разлагаются по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (гликолиз, 1). Продуктами гликолиза являются АТФ, пируват и НАДН. АТФ в дальнейшем используется для метаболических нужд [23, 24]. Пируват же может конвертироваться в ацетил-СоА, СО2 и восстановленный ферредоксин пируват:ферредоксин оксидоредуктазой (5), либо диссимилироваться пируват:формиат лиазой (6) в ацетил-СоА и формиат, который разлагается до СО2 и Нг при помощи формиатгидрогенлиазной системы (7). Ацетил-СоА в свою очередь может дать большой спектр продуктов от ЛЖК (ацетата, бутирата), до спиртов (этанола, бутанола) или ацетона в зависимости от вида бактерий и условий культивирования. Таким образом, в результате брожения внутри микроорганизмов накапливаются восстановленные эквиваленты, которые смещают редокс-потенциал бактериальной клетки. В роли «ликвидатора» НАДН и восстановленного ферредоксина выступает гидрогеназа [25, 26]. Но при исчерпании углеводородного субстрата восстановленные эквиваленты могут участвовать в синтезе спиртов из ЛЖК, что может снизить общий выход Н2 [24, 27].

полисахариды

гексозы,

Рисунок 1. Схема процесса брожения. 1- гликолиз; 2, 3 - гидрогеназа; 4 - НАДН:ферридоксин оксидоредуктаза; 5 - пируват:ферредоксин оксидоредуктаза; 6 - пируват:формиат лиаза; 7 -формиатгидрогенлиазная система; Ф - восстановленная форма ферредоксина. Использована

схема из работы [28] с дополнениями.

На выделение водорода в темновых условиях могут влиять различные факторы: • Инокулят. Для выделения водорода в темновых условиях используют чистые штаммы микроорганизмов, либо консорциумы. В качестве чистых культур наиболее часто выбирают представителей рода Clostridia или семества Entherobacteriaceae [29]. Причем эти две группы характеризуются различными метаболическими путями синтеза Нг. Выделение водорода у клостридий происходит за счет гидрогеназ, которые могут

акцептировать электроны напрямую от НАДН или через ферредоксин, восстановленный от НАДН. Теоретический максимум при таком типе брожения составляет 4 моля Н2 из моля глюкозы. Энтеробактерии, такие как Escherchia coli, могут достигнуть теоретического максимума только в 2 моля Нг на моль глюкозы вследствие конверсии формиата до Н2 и СОг за счет формиатгидрогенлиазной системы [30, 31]. Поэтому при использовании микробных консорциумов выгодней производить селекцию для клостридиальных видов. Однако клостридии имеют некоторые недостатки: чувствительны к кислороду, нуждаются в специфических питательных компонентах, требуют особенные условия для прорастания спор [27]. Хотя многие исследования проводят с чистыми культурами, на практике более применимы смешанные культуры в связи с меньшими энергозатратами, необходимыми для поддержания стерильных условий. Более того микробные консорциумы способны разлагать большой спектр субстратов: отходы пищевой и аграрной промышленностей, биомассу водорослей и др. [29]. Инокулят для консорциума обычно берут из активного ила, компоста или почвы. Однако инокулят нуждается в переподготовке для удаления водородпоглощающих микроорганизмов (глава 1.2.).

• Продукты. В качестве субстрата в лабораторных исследованиях чаще всего используют глюкозу, другие сахара либо полисахариды (глава 1.2). Причем теоретически, наиболее выгодно брожение клостридиального типа при котором синтезируется только ацетат как продукт:

С6Н120б=2СНзС00Н + 2С02 + 4Н2 (1)

Однако на практике наряду с ацетатом синтезируется и бутират:

С6Н12Об=СНзСН2СН2СООН + 2С02 + 2Н2 (2)

Полученные значения выделения водорода ниже теоретически рассчитанных и колеблются в диапазоне от 0 до 3,3 моль Нг на моль глюкозы. Причем показано что концентрация как субстрата (сахарозы), так и продуктов (ацетата и бутирата) [32, 33] может не только снижать, но также подавлять выделение водорода. Концентрация водорода также влияет на процесс его синтеза. Вследствие его накопления в культуральной жидкости возможно переключение метаболизма микроорганизмов с

утилизации восстановленных эквивалентов НАДН гидрогеназами на синтез лактата, этанола, ацетона, бутанола (рисунок 1) [24]. Снижение же парциального давления Н2 увеличит его синтез. Так барботирование азотом культуральной жидкости может дать 68% увеличения выхода Н2 [34].

Питательная среда. Особое внимание при выращивании водородвыделяющих микроорганизмов необходимо уделить минеральному составу питательной среды. Важную роль играют фосфаты, которые выполняют функцию не только питательного компонента среды, но и буфера, предотвращающего избыточное закисление культуральной жидкости [35, 36]. Однако при высоких концентрациях фосфаты приводят не только к изменению метаболизма микроорганизмов, но и к ингибированию выделения Нг. Так как ионы двухвалентного железа входят в состав гидрогеназ [37], их низкие концентрации могут приводить к превалированию в продуктах брожения этанола и бутанола и, как следствие, снижению выделения водорода [38]. Не менее важен источник фиксированного азота, как правило, используют аммоний [37], пептон либо отдельные аминокислоты [39].

Иммобилизация. Интенсифицировать процесс выделения Н2 можно при помощи увеличения биомассы микроорганизмов в биореакторе иммобилизацией. Используют различные способы иммобилизации: гранулы [33, 40], биофильмы, полимеризацию в гель [32, 41]. В работах [33, 40] показано, что биореактор с гранулированным консорциумом микроорганизмов может выделять до 9,3 л/л реактора в час, при эффективности преобразования 4 моля на моль сахарозы.

Температура. В исследованиях используют либо мезофильные (37°С), либо термофильные (55°С) условия культивирования [32]. Так при увеличении температуры с 20 до 35°С показано значительное увеличение концентрации ацетата и уменьшение концентрации этанола, кроме того при возрастании температуры с 20 до 55°С уменьшается концентрация пропионата и бутирата, что увеличивает синтез Н2 [37]. Таким образом, при термофильных условиях образование водорода выше, чем при мезофильных [24] и приближается к 4 моль на моль гексоз [42].

рН. Вследствие синтеза ЛЖК рН культуральной жидкости значительно снижается и без поддержания может упасть ниже 5, что приводит к ингибированию выделения Н2. Более того величина рН влияет на продукты брожения: при низких значениях превалируют этанол (ацетат) и бутират (рН=5), при более высоких формиат и лактат (6 и более) [43]. Так как на практике использование консорциумов микроорганизмов более

выгодно, причем стерилизация питательной среды сильно удорожит данный метод получения энергии, то важной проблемой является устранение возможности развития метаногенных бактерий (поглощающих водород). Поддержание кислых значений рН позволит ингибировать развитие метаногенов и поддерживать постоянное выделение Н2 [39].

Стоит также упомянуть и возможность выделения Н2 некоторыми пурпурными бактериями [3] и археями [44] при росте в темноте, без доступа кислорода, с присутствием СО как единственного источника углерода, при помощи гидрогеназы, а также выделение водорода в микробных электролизных ячейках (МЭЯ) при разложении органических веществ на аноде микроорганизмами [45, 46, 47].

Таким образом, синтез водорода в темновых условиях помимо высоких скоростей выделения Н2, использования широкого спектра субстратов, наличия разработанных биореакторов для культивирования имеет и отрицательные стороны: низкий практический и теоретический выход Н2, неполное использование энергии субстратов (продуктами брожения являются ЛЖК). Поэтому интегрированием процессов (светового и темнового) в одной системе можно преодолеть негативные стороны разных способов выделения Н2 и приблизить использование таких систем в промышленных масштабах.

1.2. Совмещение брожения и фотоферментации

Данная схема совмещения позволяет объединить в одной системе два процесса с наибольшими скоростями выделения Н2, что увеличивает спектр используемых субстратов вплоть до сточных вод и твердых отходов, повышая теоретический выход водорода до 12 моль с 1 моля гексоз [48, 49]. Причем на первой стадии ферметации (темновое брожение) возможны различные продукты: лактат, ацетат, этанол, бутират [50, 49]. Синтез того или иного соединения и их соотношения зависит не только от состава микроорганизмов, но и от условий культивирования (рН, парциальное давление Н2) [51].

В лабораторных исследованиях используют либо модельные субстраты: глюкоза [50, 52], сахароза [53-55], гидролизат целлюлозы [56], крахмал [30, 57], либо реальные органические отходы [58, 59]. Применение большинства субстратов приводит к синтезу Н2 на обеих стадиях, но возможно ингибирование выделения водорода на второй стадии избыточным содержанием в ферментационной жидкости (сток темнового реактора) либо азота [60, 61], либо органических

кислот [62]. Избыток органических кислот устраняют разведением стока темнового реактора. В результате может происходить лимитирование светозависимой стадии недостатком минеральных компонентов (сульфатов, магния, железа) [63], вносимых дополнительно.

В данной схеме совмещения на темновой стадии используют чистые культуры, их искусственные сообщества или консорциумы, взятые из природных источников. При использовании чистых культур применяют чаще всего штаммы семейств Clostridiaceae или Enterobacteriaceae, бактерии рода Cellulomonas, Klebsiella, термофильные бактерии Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Thermotoga neapolitana, молочнокислые бактерии. Хотя чистые культуры и удобны для лабораторных исследований, на практике их использование невозможно вследствие дороговизны поддержания стерильности биореактора и узкого спектра используемых субстратов [64]. Поэтому более перспективно применение консорциумов микроорганизмов. Наличие в консорциуме нескольких водородобразующих видов расширяет спектр используемых субстратов и повышает устойчивость системы к действию неблагоприятных факторов. Природные консорциумы, применяемые в исследованиях, подвергаются дополнительным физическим и химическим обработкам (прогревание, аэрация, использование химических ингибиторов [65, 66], низкие значения рН [67]) для удаления водородпоглощающих микроорганизмов (сульфатредукторов, гомоацетатных и метаногенных бактерий). Также природные консорциумы иногда искусственно дополняют штаммами микроорганизмов для решения биотехнологических задач [68, 69], однако сложно предугадать стабильность полученного сообщества. Эффективность выделения Н2 на стадии темновой ферментации колеблется в основном от 1,3 до 3,3 моль Н2 на моль глюкозы [53].

На световой стадии теоретически возможно использование серных, несерных пурпурных бактерий и зеленых серных бактерий, но вследствие пластичности метаболизма, высокой скорости роста за счет дыхания и очень высокой нитрогеназной активности в анаэробных условиях большинство исследователей используют пурпурные несерные бактерии: Rb. sphaeroides [50, 53, 70 - 73], Rb. capsulatus [52, 62, 63, 74], Rps. palustris [55, 57, 75], Rps. faecalis [76, 77], R. marinum и некоторые неидентифицированные штаммы [30, 58, 78].Также стоит упомянуть об увеличении выделения фототрофными бактериями Н2 при помощи генетических модификаций: изменение коровой и периферической антенны [79], удаление водородпоглощающей активности [77, 80, 81], гетеро или гомологичная экспрессия водородвыделяющих гидрогеназ [82].

Для совмещения темнового брожения и фотоферментации необходимо учитывать ряд особенностей обоих процессов:

• оптимальное значение рН для выделения Н2 при темновом сбраживании колеблется от 4,5 до 6,0 [81], в то время как границы оптимума для пурпурных несерных бактерий 6,5 - 9,0 [83];

• температурный оптимум роста у энтеробактерий и большинства представителей рода Clostridia 35 - 40°С, а для пурпурных бактерий оптимум роста составляет 28 -30°С;

в содержание взвешенных частиц (клетки, споры, недеградированные твердые отходы) в стоке темнового реактора снижают прозрачность среды и, как следствие, выход Нг на световой стадии;

• токсические вещества, синтезированные на темновой стадии, могут подавлять рост пурпурных несерных бактерий [61];

• необходимость высокого содержания связанного азота в питательной среде для наработки биомассы темнового консорциума и его ингибирующее действие на нитрогеназную систему пурпурных бактерий [55];

• вариабельность процесса синтеза органических кислот при изменении подаваемого субстрата у темнового консорциума (от 50 [52, 76] до 100 мМ и более [74, 84]) и ингибирующее действие легких жирных кислот при концентрации выше 50 мМ на выделение водорода при фотоферментации [85, 86]. Этот факт часто вынуждает разбавлять ферментационные жидкости перед подачей в фотобиореактор [48, 63];

• избирательное потребление органических кислот пурпурными бактериями из смеси; кислоты, обладающие более короткой углеродной цепью, потребляются первыми [52, 86, 87].

Совмещение темнового брожения и фотоферментации можно производить несколькими способами:

1. Совместное культивирование [50, 58, 70, 77, 78, 88-90]. Данный метод является довольно привлекательным со стороны практического применения в связи со своей экономичностью и простотой. Но описанные лабораторные эксперименты не соблюдали оптимальные условия для выделения Н2 и роста смешанными культурами. Это приводило к уменьшению эффективности процесса или скорости выделения Н2 [91]. Однако использование иммобилизованных культур приводило к увеличению выхода водорода, что может быть связанно с микроусловиями в разных частях матрицы [50, 70, 73, 77, 90].

2. Последовательное объединение процессов [30, 55, 57, 58, 60, 62, 63, 74 - 76]. Один из наиболее используемых методов включающий в себя сбраживание субстрата в темновом реакторе, обработку и использование полученной жидкости в фотобиореакторе. Обработка включает в себя: стерилизацию, центрифугирование, разведение (при высоких концентрациях органических кислот), фильтрование, аэрацию (удаление избыточного содержания фиксированного азота), добавление минеральных компонентов при необходимости (при разведении ферментационной жидкости). Эффективность такого процесса варьируется от 1,6 до 7,1 моль Н2 на моль глюкозы. Но использование данного подхода на практике является нецелесообразным.

3. Совмещение двух процессов проходящих в разных биореакторах. Этот метод подразумевает использование двух параллельно работающих биореакторов (темнового и светового). Причем биореакторы соединены при помощи фильтрующей системы, необходимой для удаления взвешенных частиц из стока темнового реактора. Однако выделение Нг в таких системах еще достаточно низкое [59, 92].

В качестве субстрата для двухстадийной системы, описанной выше, также можно использовать биомассу микроводорослей, выращенную в автотрофных условиях [93-96]. В такой системе единственным источником энергии является солнечная. СОг образующийся при брожении и фотоферментации можно использовать для роста водорослей, что позволит снизить выброс углекислого газа в атмосферу до нуля. В настоящее время уже разработаны эффективные методы выращивания биомассы микроводорослей как в открытых водоемах, так и в реакторах [97]. Более того микроводоросли могут удалять из водоемов избыток азота и фосфора [98, 93] и способны к росту на морской воде, что может снизить себестоимость системы. Главными проблемами этой интегрированной системы является перенос биомассы микроводорослей в темновой реактор и разрушение растительных клеток. В современных исследованиях используют замораживание-оттаивание [95] или высушивание биомассы [94, 96].

1.3. Совмещение топливных элементов и выделения водорода различными микроорганизмами для получения электричества

Особый интерес вызывает совмещение выделения водорода микроорганизмами и ТЭ. Такие интегральные системы могут помочь решить проблему хранения и транспортировки

водорода от места его получения к местам потребления. В настоящее время имеются разные схемы совмещения процесса выделения Нг и его преобразования в электричество: последовательное соединение биореактора и ТЭ с предварительной очисткой биоводорода от загрязняющих газов [99-101], размещение ТЭ непосредственно в культуральной жидкости [102106]. Причем в таких интегральных системах используют как фотосинтезирующие микроорганизмы: пурпурные несерные бактерии [100-102, 105], микроводоросли [103, 106]; так и анаэробные бродилыцики [99, 104]. Расположение ТЭ в культуре микроорганизмов является более перспективным вследствие окисления водорода непосредственно в культуральной жидкости, что приводит к увеличению его синтеза [103]. Однако рабочие электроды (аноды) с платиновым катализатором приходится покрывать дополнительными слоями полимеров, защищающими электрод от каталитических ядов. Это может приводить к диффузионным ограничениям, а также не предохраняет полностью от отравления катализатора протонами или диффундирующими газами (Нг8). Решением этой проблемы может стать использование ферментных электродов на основе гидрогеназы [107]. Авторами статьи продемонстрировано, что ГЭ может работать в культуре целюлозолитического водородвыделяющего консорциума и генерировать примерно в 5 раз больше мощность, чем МТЭ (глава 2). Но, к сожалению, продемонстрирована только 72 часовая операционная стабильность ферментного электрода при перенапряжении в 200 мВ.

Таким образом, остается не изучена стабильность ферментного электрода в условиях генерации электроэнергии в культуре микроорганизмов при длительной работе. Также не существует данных о влиянии ТЭ на метаболизм водородвыделяющих микоорганизмов.

1.4. Другие интегрированные системы

Совмещение темнового выделения водорода фотоавтотрофными микроорганизмами с фотоферментацией. Если фотосинтезирующие микроорганизмы (микроводоросли и цианобактерии) после синтеза запасных веществ на свету поместить в темновые анаэробные условия, то они будут сбраживать накопленный крахмал (СЫатуйотопа$ [13]) или гликоген {МуспсузШ aerogenosa [108], С1оеосар$а а1р1со\а [109]) с образованием водорода и органических кислот. Эти продукты брожения могут быть использованы пурпурными бактериями для синтеза Н2. При совмещении микроводорослей и пурпурных бактерий [110] удалось достигнуть эффективности 10,5 моль Н2 на моль глюкозы, однако при

масштабировании системы в биореакторе эффективность этой интегрированной системы снижалась и составляла 5,8 моль Нг на моль глюкозы [108, 111]. Совмещение процессов выделения водорода цианобактериями на первой стадии и пурпурными бактериями на второй в настоящее время не реализовано.

Совмещение микробных электролизных элементов с брожением. Органические вещества, образующиеся в результате темнового брожения, могут быть переработаны не только в водород (фотоферментация), но и напрямую в электричество посредством микробного топливного элемента (МТЭ) (более подробно МТЭ рассмотрен в следующей главе). МТЭ может быть преобразован в МЭЯ (не снятием, а приложением потенциала более -200 мВ) [47]. При таком режиме работы в анаэробной катодной камере на поверхности платинового катода образуется Нг, не загрязнённый примесями других газов. В данной интегрированной системе количество восстановленных электронов до Нг может достигать 99% при напряжении 0,8 В [112]. Показано, что двухстадийные системы такого типа могут быть использованы для очистки сточных вод свиных ферм [113, 114], однако удельные скорости выделения Нг пока далеки от практически значимых.

2. Микробные топливные элементы

Хотя микробные топливные элементы (МТЭ) и появились сравнительно недавно, они являются одной из многообещающих технологий [115]. Микроорганизмы в МТЭ, взаимодействуя с электродом, передают ему электроны из субстратов [116]. Благодаря способности непосредственно переводить химическую энергию жирных летучих кислот в электричество МТЭ могут использовать сточные воды (пищевой промышленности) для одновременного получения электроэнергии и очистки сточных вод, что может снизить стоимость утилизации отходов [117, 118]. Способности к генерации электрического тока микроорганизмами была показана Potter еще в 1911 г [119], однако, реальный интерес научного мира к этой проблеме начал возрастать в 2008 гик 2012 г количество публикаций уже насчитывает свыше 400 статей. Для понимания механизмов протекающих в МТЭ необходимо рассмотреть его строение (рисунок 2).

органические вещества

со2

анод

катод

мембрана барботация воздухом

Рисунок 2. Схема строения МТЭ [122].

МТЭ состоит из анода, катода, протонпроводящей мембраны и электрической цепи. На поверхности анода автоиммобилизуются микроорганизмы, использующие органические вещества как доноры электронов [120}. При помощи катаболических циклов у всех бактерий, растущих без использования электронпереносящих поверхностей, электроны передаются на НАДН и в электронтранспортной цепи достигают конечных акцепторов, таких как нитраты, сульфаты и кислород или же сбрасываются при брожении на продукты [121]. В МТЭ микроорганизмы используют в качестве акцептора электронов анод, подсоединенный при помощи электрической цепи к катоду, на поверхности которого электроны достигают конечного акцептора: кислорода [123 - 125], ферроцианида [126 - 128] или МпОг [129]. Протоны, образующиеся в результате окисления органических веществ на аноде, через протонпроводящую мембрану диффундируют к катоду и участвуют в процессе восстановления. Таким образом, мембрана необходима не только для разделения процесса окисления и восстановления в пространстве, но и для предотвращения попадания конечных акцепторов к микроорганизмам в виду их токсичности процессу генерации электричества [130, 131].

2.1. Механизм электронного транспорта

В МТЭ бактерии транспортируют электроны из субстратов к аноду в основном двумя путями: прямым транспортом или при помощи медиаторов [132]:

• Прямой электронный транспорт. Некоторые микроорганизмы (Бкем/апеИа ри&е/аЫет, СеоЬас1ег $и1/еггес1исет, С. те(аШгес1исеп5 и ЛИос1о/егах /егпгес1исепз) при помощи внеклеточных цитохромов с-типа могут донировать внешним акцепторам электроны посредством образования биопленок или пилей (нанопроволок) обладающих высокой проводимостью [133, 134]. Благодаря этим морфологическим и биохимическим особенностям микроорганизмы имеют высокие значения кулоновской эффективности [126, 135].

• Электронный транспорт при помощи собственных и внесенных медиаторов. При данном типе переноса электронов от клеток микроорганизмов к электроду используются внешние медиаторы. Медиаторы могут быть, как синтезированы самими микроорганизмами (5ЪемнтеИа опе1с1ет18, Сео1кг1х /егтеМапя), так и добавляться дополнительно. Восстановленные формы медиаторов легко проникают в клетку, где получают электроны из ЭТЦ, и переносят их на поверхность

электрода [136}. В качестве редокс активных веществ в таких процессах используют нейтральный красный, тионин, метиленовый синий, антрахинон - 2, 6 - дисульфонат, феназины и хелаты железа [115]. Внесение искусственных медиаторов используют в МТЭ с Escherichia coli, Streptococcus lactis и Pseudomonas [137-139], причем внесенные переносчики электронов не были токсичны для микроорганизмов, и МТЭ работали стабильно в течение продолжительного времени [115, 140-142].

2.2. Дизайн МТЭ

Существует много различных типов реакторов для МТЭ [115], но все они используют схожие принципы работы. Основными направлениями в разработке реакторов является увеличение выходящей мощности и уменьшение стоимости:

• Двухкамерный МТЭ. Наиболее часто используется в дизайне реакторов. Реактор

данного типа состоит из двух камер с анодом и катодом, которые разделены между собой ионселективной мембраной. Двухкамерные МТЭ часто используют для решения фундоментальных вопросов взаимодействия микроорганизмов и электрода, но показано, что вследствие высокого внутреннего сопротивления и потерь на электродах выходящая мощность обычно низкая [115, 121, 143].

• Однокамерные МТЭ. Данный дизайн состоит только из одной камеры, в которой

располагаются оба электрода. Анод либо удален от катода пространственно, либо отделен протонпроводящей мембраной. Liang и соавторы [144] показали, что при использовании одной камеры с двумя электродами, разделенными мембраной, удается снизить омическое сопротивление реактора вследствие редукции второй камеры и свободного доступа кислорода к поверхности катода, что увеличило плотность мощности. Если сравнивать двухкамерный МТЭ с однокамерным, то второй тип реактора более дешевый в исполнении и генерирует большую плотность мощности [115]. Однако возникают проблемы с микробной контаминацией и диффузией кислорода сквозь катод внутрь реактора [135].

• Составные МТЭ [145]. В конструкции этого типа реактора используются несколько

однокамерных МТЭ, соединенных параллельно или последовательно, что позволяет достигать высокой силы тока или напряжения £1151. Благодаря высокой скорости электрохимической реакции при параллельном соединении генерируется больше энергии, чем при серии последовательных соединений [118, 128]. Таким образом,

данный тип реактора является попыткой масштабировать процесс получения энергии с сохранением высоких значений плотностей тока.

• Потоковый МТЭ. Данный тип реактора имеет форму цилиндра, днище которого представляет собой анод, а верхняя часть катод. Электроды между собой разделены слоями стекловаты и стеклянных шариков. Питательная среда поступает через низ реактора и, проходя через анод и два сепарирующих слоя, попадает на катод. Диффузионный барьер между электродами обеспечивается градиентом, возникающим при работе МТЭ [118, 135]. Данный тип МТЭ не имеет физического барьера между электродами и связанных с этим проблем диффузии протонов, что может послужить применению в очистке сточных вод [135], но могут возникать проблемы при длительной эксплуатации реакторов (забивание сепарирующих слоев биомассой и сточными водами).

2.3. Материалы электродов

Необходимо чтобы материалы электродов способствовали выполнению их функции, увеличивая мощность МТЭ, но одновременно они должны быть легкодоступными и иметь низкую стоимость. Чтобы обеспечить эффективный транспорт электронов между анодом и микроорганизмами, материал электрода должен обладать стабильностью, высокой электрической проводимостью и иметь большую площадь поверхности, поэтому часто используют углеродную ткань, углеродный войлок, графитовый войлок, углеродную сетку и графитовую кисть [146]. В свою очередь для катодов используют платину (Р1:), платиновую чернь, активированный углерод (АУ) [148, 149], графит и биокатоды [147, 150, 151]. Хотя электроды, покрытые платиной, и имеют максимальную эффективность и высокую мощность благодаря большей каталитической активности, чем другие электроды, они имеют высокую стоимость [146, 152]. Альтернативой применению платиновых катализаторов является использование ферроцианид иона, оксида марганца и смесей на основе железа, кобальта. МТЭ, в которых использовали ферроцианид (Кз(Ре(С1ч[)б) в качестве конечного акцептора, показали высокую мощность при низких перенапряжениях, но, к сожалению, применение цианидов в промышленных масштабах (особенно при очистке сточных вод) является недопустимым [121, 153-156].

Мощность МТЭ помимо материалов электродов также зависит от протонного транспорта между анодом и катодом. Медленный транспорт увеличивает внутреннее сопротивление и, как следствие, уменьшает мощность МТЭ [141, 157]. Большинство исследователей используют солевой мостик или протон селективную мембрану (ПСМ), отделяющие анод от катода. ПСМ обычно состоят из полимеров сходных с nafion и ultrax [118]. Иногда отказываются от применения ПСМ в однокамерных МТЭ, что значительно увеличивает мощность МТЭ, но вследствие проникновения через катод кислорода снижается кулоновская эффективность и биокаталитическая активность микроорганизмов.

2.4. Микроорганизмы в МТЭ

В МТЭ используется большое разнообразие микроорганизмов, способных окислять органические компоненты и передавать электроны аноду. Электрохимически активные бактерии являются либо строгими анаэробами [158], либо факультативными анаэробами, растущими при мезофильных или термофильных условиях [130]. К электрохимически активным бактериям относятся не только железо редуцирующие бактерии (Shewanella [159161] и Geobacter [162-165]), но также и другие группы микроорганизмов (Klebsiella pneumonia, Rhodopseudomonas palustris, Dessulfobulbus propionicus), которые были получены из сточных вод и показали большой потенциал для использования в МТЭ [166]. Причем помимо чистых культур используют и консорциумы микроорганизмов [167-169]. Rabaey и соавторы [120] показали, что консорциумы микроорганизмов имеют большую устойчивость к стрессовым факторам, чем монокультуры, а также могут потреблять комплексные субстраты. Более того консорциум микроорганизмов может генерировать электричество при содержании кислорода в жидкости более 10%, что позволяет использовать сообщества в однокамерных МТЭ [170]. Сообщества микроорганизмов, использующихся в МТЭ, не только получают из естественных источников, но и искусственно вводя дополнительные кокультуры для увеличения эффективности МТЭ (синтрофные бактерии) [171].

2.5. Субстраты, используемые в МТЭ

Субстраты не только снабжают микроорганизмы энергией и расходуются в результате их роста, но также влияют на экономическую эффективность, генерацию мощности и кулоновскую эффективность (КЭ) МТЭ. Также важную роль играет структура, концентрация

субстрата или смеси субстратов [172-174]. В качестве органических субстратов в МТЭ используют: глюкозу [172, 127, 175, 176], белки [177], ЛЖК [175, 178], лигноцеллюлозу и целлюлозу [179-182], хитин [183], сточные воды [184-189]. В качестве доноров электронов в МТЭ иногда используются неорганические вещества (сульфат, тиосульфат) [190, 191] и продукты химического синтеза (фенол [192], 1,2 дихлорэтан [193], различные красители [194]). Но чаще всего используют ацетат в качестве источника энергии, так как он легко усваивается экзоэлектрогенными микроорганизмами, и МТЭ при использовании ацетата имеют высокую КЭ [174], максимальную генерацию мощности [174, 195]. Исследования КЭ и генерируемой мощности на различных субстратах широко представлены в литературе [173, 175, 195], в то время как данные об экономической эффективности субстратов отсутствует.

3. Гидрогеназы

Гидрогеназа - фермент, участвующий в метаболизме водорода у бактерий, архей и у некоторых одноклеточных эукариотах [196, 197]. Микроорганизмы используют гидрогеназы либо для сброса избытка восстановительных эквивалентов [196-199], либо для поглощения Н2, как источника электронов [197, 200]. Также существуют сенсорные гидрогеназы, которые запускают транскрипцию водородпоглощающих гидрогеназ [196, 197]. В настоящее время гидрогеназы подразделяются на три группы в зависимости от наличия металлов в активном центре: Fe гидрогеназы, Fe-Fe и Ni-Fe [197, 201].

[Fe] гидрогеназы. Ферменты этого класса в настоящее время являются наименее изученными. Они были открыты в 1992 году при выращивании метаногенных архей в атмосфере СО2 и Н2 [202]. Данный тип гидрогеназ не имеет [Fe-S] кластеров, состоит из двух идентичных субъедениц (40 кДа), которые связаны с железосодержащим кофактором, выполняющим роль активного центра [203]. Fe гидрогеназы участвуют в реакции дегидрирования метилен-тетрагидрометаноптерина до метенил-тетрагидрометаноптерина [201].

[Fe-Fe] гидрогеназы. Данный класс гидрогеназ обнаружен как у анаэробных прокариотов: Clostridium, Thermotoga, Shewanella Desulfovibri [201], так и у эукариотов: у микроводорослей (Chlamydomonas, Chlorella, Scenedesmus), в гидрогеносомах простейших (Trichomonas, Giardia, Entamoeba, Nyctotherus) и у хитридиомицетовых грибов (Neocallimastrix, Pyromyces) [204, 205]. [Fe-Fe] гидрогеназы в своем активном центре имеют два атома железа, которые связаны с СО, CN" лигандами и остатками цистеина. Описаны моно-, ди-, три- и тетрамерные белки этого класса. Дополнительные субъединицы взаимодействуют с редокс-партнерами: флаводоксином, цитохромом с-3, пластохиноном, ферредоксином [197]. Выделяют три подгруппы Fe-Fe гидрогеназ: мономерные растворимые цитоплазматические ферменты (Clostridium pasteurianum), гетеродимерные периплазматические ферменты и мономерные растворимые ферменты (хлоропласты микроводорослей). Отличительной особенностью этого класса гидрогеназ является необратимая инактивация кислородом, что затрудняет их изучение.

[Ni-Fe] гидрогеназы. Это одн из наиболее изученных классов гидрогеназ. Активный центр схож с [Fe-Fe] гидрогеназами и содержит атомы железа и никеля, связанные с группами

СО, CN" и остатками цистеина. Отличительной особенностью является отсутствие ковалентного связывания с кислородом, что значительно упрощает методику их получения [206]. Ферменты как 2 так и 3 класса содержат до трех железо-серных кластеров, которые участвуют в переносе электронов [207]. Несмотря на меньшую активность [Ni-Fe] гидрогеназ (0,05-1,5 ммоль/мин мг), низкая Км позволяет им работать с такой же эффективностью, как и Fe-Fe гидрогеназам при физиологических концентрациях водорода. Хотя оба класса гидрогеназ проявляют сходства в строении активного центра, филогенетически они не связаны, что говорит об их конвергентной эволюции [208].

3.1. Строение [Ni-Fe] гидрогеназ

Данный класс гидрогеназ представляет собой металоферменты с á(3 гетеродимерной структурой. Большая субъединица (46-72 кДа), несущая активный центр, с малой (23-38 кДа), содержащей Fe-S кластеры, прочно связана нековалентными связями. Железо и никель в активном центре большой субъединицы координированы между собой посредством двух цистеиновых мостиков [209]. Никель координирован еще двумя остатками цистеинов, причем у некоторых бактерий (Desulfomicrobium baculatum) один из цистеинов может быть заменен на селеноцистеин [209]. Атом железа связан с 2 группами CN" и одной СО [210-221]. В окисленном неактивном состоянии между атомами металлов в активном центре имеется дополнительный лиганд, предположительно кислород или гидрокси-группа [222, 223]. Активный центр погружен на 30 Á внутрь большой субъединицы [221]. К нему ведет образованный гидрофобными аминокислотами [224] газовый канал, через который проникают молекулы газов к свободному координационному сайту железа. Предположительно концевые аминокислоты газового канала (изолейцин и фенилаланин) играют роль «бутылочного горлышка», защищая активный центр от крупных молекул [225, 226]. Малая субъединица [Ni-Fe] гидрогеназ содержит от двух до 3 железосерных кластеров. Проксимальный кластер [4Fe-4S] участвует в активации молекулы водорода, а дистальный [4Fe-4S] донирует (акцептирует) электроны от (на) физиологических партнеров. Промежуточный кластер (при наличии) может иметь структуру как [4Fe-4S] [209], так [3Fe-4S] [201], в редких случаях [2Fe-2S] (С. pasteurianum). Дистальный железосерный кластер расположен близко к поверхности фермента, что обеспечивает обмен электронами гидрогеназы и цитохрома. [Ni-Fe] гидрогеназный

гетеродимер может входить в состав более сложного фермента с 4-6 субъединицами [208, 206, 227].

Благодаря лигандам активный центр [Ni-Fe] гидрогеназ может образовывать несколько стабильных структур (рисунок 3). При выделении в аэробных условиях фермент проявляет ЭПР активность характерную для Ni (III), что говорит о наличии дополнительной связи в активном центре [228]. Причем выделяют две стабильные формы окисленного фермента Ni-A и Ni-B [206]. Ni-A структура характерна медленным переходом в активное состояние Ni-C в течение нескольких часов при анаэробных условиях (с окисленным метилвиологеном в растворе и под атмосферой водорода), в то время как Ni-B переходит к активной структуре за несколько минут [206]. Обе неактивные формы в присутствии сильных восстановителей (дитионита) переходят в состояние Ni-C за несколько минут. Также для активации гидрогеназы может быть использован электрод, как донор электронов [228, 229]. В настоящее время нет единого мнения о структурных различиях между Ni-A и Ni-B. Доказано, что между железом и никелем в окисленной форме фермента существует кислородсодержащий мостиковый лиганд (О2" или ОН" или НгО), в редких случаях лигандом является сера [230, 231].

*Ni-B

каф анаэробная ' ннактийация Ка»7ЧкЛ»люяк

•Ni-Л

tmreatfy

f. И*

Г <- -230 mV

Ni-Sl, чр

iNi-CO4

Ni-Sl„ * «\Н+

Е - -380 mV

Ni-Slj

CBCl

Ni-R,,

*!4'i-C

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Шастик, Евгений Сергеевич

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны и апробированы биореактор и система контроля процесса для одновременного выделения водорода микроорганизмами и электрохимического окисления Нг на ГЭ.

2. Показано, что ГЭ на основе гидрогеназы Т. гозеореЫста обладали более высокой операционной стабильностью по сравнению с ГЭ на основе гидрогеназы И. ЬасиШит.

3. Впервые установлено, что энергия активации электрокатализа ГЭ на основе гидрогеназы из Т. гояеорепчсчпа в диапазоне температур 17,5-50°С зависит от прикладываемого перенапряжения, значительно снижаясь при его увеличении.

4. Показано, что ГЭ на основе гидрогеназы из Т. гозеорегэтпа способен работать как в режиме сенсора водорода, так и в режиме генерации тока в биореакторе с консорциумом водородвыделяющих микроорганизмов, разлагающих крахмал.

5. В условиях периодического культивирования присутствие ГЭ не влияло на метаболизм консорциума независимо от количества потребленного водорода на ГЭ, причем ГЭ сохранял свою активность.

6. Обнаружено, что при проточном культивировании изменялся спектр продуктов брожения, образуемых микробным консорциумом из крахмала: в отсутствии ГЭ, происходит увеличение концентрации лактата, а в его присутствии преобладали ацетат, бутират и изобутират.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный и апробированный нами биореактор для одновременного проведения ферментации и электрокатализа оказался достаточно простым в изготовлении и удобным в эксплуатации. Кроме того, за счет трехэлектродной схемы подключения ГЭ нам удалось изучать процессы, происходящие в микробном консорциуме в присутствии работающего ГЭ, за счет исключения второго электрода топливного элемента. Диффузионные ограничения, неизбежно возникающие на мембране между двумя электродами [141, 157], в используемой нами схеме подключения электродов также были исключены. Причем разработанная конструкция биореактора сходна с двухкамерными МТЭ [121], что позволяет в дальнейшем использовать опыт, накопленный по работе МТЭ. Так как биореактор с ГЭ вместо катодной камеры имел вспомогательную (с углеродным вспомогательным электродом), нам удалось устранить контакт рабочей камеры (микробного консорциума и ГЭ) с Ог, токсичным как для выделения Н2 [19], так и для ГЭ [228, 233]. Это позволило проводить анализ продуктов брожения, причем, как следует из наших данных, баланс углерода потребленного крахмала и углерода, находящегося в продуктах брожения, практически всегда совпадал.

Изучение операционной стабильности ГЭ, изготовленных с использованием разных углеродных матриц и промотеров, показало, что более стабильная к токсическому действию кислорода гидрогеназа Т. го$еорег$1ста оказалась более практична в ГЭ, чем гидрогеназа из И. ЪасиШит. Работоспособность ГЭ проверена в течение более 750 часов в режиме генерации тока.

При изучении активности ГЭ в диапазоне температур нами показано, что энергия активации электрокатализа существенно зависела от перенапряжения на электроде, снижаясь при повышении перенапряжения. При этом энергия активации электрокатализа численно совпадала с энергией активации гидрогеназы лишь при 50 мВ, становясь больше при пониженных и значительно меньше при повышенных перенапряжениях. Этот факт свидетельствует в пользу того, что лимитирующая стадия биоэлектрокатализа неодинакова при разных перенапряжениях, причем ферментативная активность гидрогеназы и ее количество не являлись лимитирующими факторами. Более подробный анализ с целью выявления лимитирущих факторов при повышенных и пониженных перенапряжениях выходит за рамки данной работы.

Нами обнаружено, что ГЭ способен функционировать в одном пространстве с микробным консорциумом как в режиме сенсора, так и в режиме генерации каталитического тока. Этот факт позволяет рассматривать и в дальнейшем разрабатывать системы биоконверсии энергии органических соединений в отходах в электричество. Причем по литературным данным [94] мощность ГЭ в условиях ТЭ в биореакторе с водородвыделяющим целюлозолитическим консорциумом примерно в 5 раз больше чем МТЭ [121]. Так как конверсия отходов в электричество при помощи ГЭ делает только первые шаги [17, 107] и не разработаны еще биореакторы с эффективным и полным преобразованием выделяемого Н2, можно предположить, что мощность ТЭ такого типа в будущем существенно возрастет.

Нам не удалось добиться полного поглощения выделившегося водорода на ГЭ. Однако это связано с особенностями конструкции нашего биореактора. В нашу задачу входило учесть весь выделившийся водород, и для этого его отбирали в мерную емкость. Именно поэтому он становился недоступным для каталитического поглощения электродом. Для полного преобразования выделяющегося водорода в каталитический ток достаточно оставлять водород в биореакторе. Однако в этих условиях важно будет уравнивать скорость выделения водорода и его поглощения ГЭ для того, чтобы парциальное давление водорода в биореакторе было невысоким и не ингибировало синтез Н2.

Нами показано, что для увеличения доли поглощенного водород непосредственно в биореакторе эффективность перемешивания не менее важна, чем площадь ГЭ. Более того, увеличение площади ГЭ в 4 раза не приводило к четырехкратному увеличению каталитического тока именно вследствие диффузионных ограничений, что коррелирует с литературными данными об отсутствии пропорционального возрастания мощности при увеличении площади поверхности анода в МТЭ [146]. По-видимому, при технологическом совершенствовании предложенной нами системы удастся добиться больших плотностей тока за счет большей доступности водорода ГЭ.

В условиях периодического культивирования наличие ГЭ не влияло на тип брожения, осуществляемый микробным консорциумом независимо от количества потребленного Н2 при электрокатализе. Возможно, это связано с тем, что для изменения спектра продуктов брожения необходимо изменение состава микробного консорциума, что маловероятно при периодическом культивировании. При этом операционная стабильность ГЭ в биореакторе практически не отличалась от таковой в модельном буфере: после примерно 200 часов работы сохранялось больше 80% активности ГЭ как в биореакторе, так и в модельном буферном растворе. Это свидетельствует о высокой стабильности фермента.

В отличие от периодического культивирования, при длительном непрерывном культивировании обнаружено изменение выхода продуктов брожения. В биореакторе без ГЭ наблюдалось увеличение образования лактата, прекращение выделения водорода и снижение концентрации ацетата и бутирата. Это свидетельствует об изменении состава консорциума и преобладании молочнокислого брожения. Более стабильными, очевидно, являются иммобилизованные культуры. Во всяком случае, в литературе, встречаются примеры длительного (3 года) стабильного выделения водорода из глюкозы при использовании гранул [306].

В биореакторе, оснащенном ГЭ, также наблюдалось изменение спектра продуктов. Однако смещение происходило в сторону образования ацетата, бутирата и изобутирата, без существенного изменения выделения Н2. Имеющиеся данные не позволяют сделать однозначный вывод о причинах такого смещения. Возможно, это связано с пониженным содержанием водорода вследствие его поглощения ГЭ. Не исключено, что в приэлектродном пространстве развивались синтрофные бактерии, способные к образованию ацетата и водорода из органических кислот с содержанием углерода больше 2. Хотя концентрация ацетата к концу эксперимента возрастала, не было обнаружено значительного увеличения выделяемого Н2, поэтому необходимы дальнейшие специальные исследования для выяснения этого вопроса.

Подводя итог, следует отметить, что совмещение ГЭ и микробного консорциума оказалось возможным. Дальнейшее развитие таких исследований могут привести к созданию технологий биологического получения водорода и электричества с одновременной очисткой органических жидких отходов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шастик, Евгений Сергеевич, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[1] Karyakin, A. A. Hydrogenase electrodes for fuel cells / A. A. Karyakin, S. V. Morozov, E. E. Karyakina, N. A. Zorin, V. V. Perelygin, S. Cosnier // Biochem. Soc. Trans. -2008. -V. 33. -P. 73-75.

[2] Bolton, J. R. Solar photoproduction of hydrogen: a review / J. R. Bolton // Sol. Energy. -1996. -V. 57. -P. 37-50.

[3] Turker, L. Biohydrogen production: molecular aspects / L. Turker, S. Gumus, A. Tapan // J. Sci. Ind. Res. -2007. -V. 67/ -P. 994-1016.

[4] Liu, J.G. Light energy conversion into H2 by Anabaena variabilis mutant PK84 dense cultures exposed to nitrogen limitations / J. G. Liu, V. E. Bukatin, A. A. Tsygankov // Int. J. Hydrogen Energy. -2006.-V. 31.-P. 1591-1596.

[5] Suda, S. Change in the H2 photoproduction capability in a synchronously grown aerobic nitrogen-fixing cyanobacterium, Synechococcus sp miami bg 043511 / S. Suda, S. Kumazawa, A. Mitsui // Arch. Microbiol. -1992. -V. 158 (1). -P. 1-4.

[6] Borodin, V. B. Manifestation of behavioural and physiological functions of Synechococcus sp. Miami BG 043511 in a photobioreactor / V.B. Borodin, К. K. Rao, D. O. Hall // Marine Biology. -2002.-V. 140.-P. 455-463.

[7] Gaffron, H. Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae / H. Gaffron, J. J. Rubin // Gen. Physiol. -1942. -V. 26. -P. 219-240.

[8] Бойченко, В. А. Эффективность фотообразования водорода водорослями и цианобактериями / В. А. Бойченко, Л.Я. Сатина, Ф. Ф. Литвин // Физиология растений. -1989. -Т. 3. -С. 239-247.

[9] Melis, A. Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green alga Chlamydomonas reinhardtii / A. Melis, L. P. Zhang, M. Forestier, M. L. Ghirardi, M. Seibert // Plant. Physiol. -2000. -V. 122(1). -P. 127-135.

[10] Meilin, H. The enhancement of hydrogen photoproduction in Chlorella protothecoides exposed to nitrogen limitation and sulfur deprivation / H. Meilin, L. Ling, Z. Litao, L. Jianguo // Int. J. Hydrogen Energy. -2012. -V. 37 (22). -P. 16903-16915.

[11] Batyrova, K. A. Sustained hydrogen photoproduction by phosphorus-deprived Chlamydomonas reinhardtii cultures / K. A. Batyrova, A. A. Tsygankov, S. N. Kosourov // Int. J. Hydrogen Energy. -2012.-V. 37.-P. 8834-8839.

[12] Asada, Y. Hydrogenase mediated hydrogen metabolism in some cyanobacteria / Y. Asada, M. Miyake, N. Tomizuka // Photosynthesis Research. -1992. -V. 34 (1). -P. 128.

[13] Miura, Y. Isolation and characterizationof a unicellular green alga exhibiting high activity in dark hydrogen production / Y. Miura, S. Ohta, M. Mano, K. Miyamoto // Agric. Biol. Chem. -1986. -V. 50 (11).-P. 2837-2844.

[14] Cournac, L. Sustained photoevolution of molecular hydrogen in a mutant of Synechocystis sp. strain PCC6803 deficient in the type I NADH-dehydrogenase complex / L. Cournac, G. Guedeney, G. Peltier, P. Vignais // J. Bacteriol. -2004. -V. 186 (6). -P. 1737-1746.

[15] ] Rakhely, G. Cyanobacterial-type, heteropentameric, NAD(+)-reducing NiFe hydrogenase in the purple sulfur photosynthetic bacterium Thiocapsa roseopersicina / G. Rakhely, A. T. Kovacs, G. Maroti, B. D. Fodor, G. Csanadi, D. Latinovics, K. L. Kovacs // Appl. Env. Microbiol. -2004. -V. 70 (2). -P. 722-728.

[16] Rakhely, G. The role of Hox hydrogenase in the H2 metabolism of Thiocapsa roseopersicina / G. Rakhely, T. V. Laurinavichene, A. A. Tsygankov, K. L Kovacs // BBA-Bioenergetics. -2007. -V. 1767 (6).-P. 671-676

[17] Hawkes, F. R. Continuous dark fermentative hydrogen production by mesophilic microflora: principles and progress / F. R. Hawkes, I. Hussy, G. Kyazze, D. Richard, L. H. Dennis // Int. J. Hydrogen Energy. -2007. -V. 32. -P. 172-184.

[18] Hallenbeck, P. C. Microbial paths to renewable hydrogen / P. C. Hallenbeck // Biofuels. -2011. -V. 2(3). -P. 285-302.

[19] Wu, S. Y. Fermentative hydrogen production and bacterial community structure in high-rate anaerobic bioreactors containing silicone-immobilized and selfflocculated sludge / S. Y. Wu, C. H. Hung, C. N. Lin, H. W. Chen, A. S. Lee, J. S. Chang // Biotechnol. Bioeng. -2006. -V. 93 (5). -P. 934-946.

[20] Levin, D. B. Re: Biohydrogen production: prospects and limitations to practical application -erratum / D. B. Levin // Int. J. Hydrogen Energy. -2004. -V. 29(13). -P. 1425-1426.

[21] Levin, D. B. Biohydrogen production: prospects and limitations to practical application / D. B. Levin, L. Pitt, M. Love // Int. J. Hydrogen Energy. -2004. -V. 29 (2). -P. 173-185.

[22] Li, C. L. Fermentative hydrogen production from wastewater and solid wastes by mixed cultures / C. L. Li, H. H. P. Fang // Crit. Rev. Environ Sci. Technol. -2007. -V. 37. -P. 1-39.

[23] Hallenbeck, P. C. Fundamentals of dark hydrogen fermentations: multiple pathways and enzymes / P. C. Hallenbeck, In: Azbar, N., Levin, DB (eds) State of the Art and Progress in Production of Biohydrogen. Bentham Science Publishing, in press. 2011.

[24] Hallenbeck, P. C. Fundamentals of the fermentative production of hydrogen / P. C. Hallenbeck // Water Sci. Technol. -2005. -V. 52(1-2). -P. 21-29

[25] Adams, M. W. W. Biological hydrogen production: not so elementary / M. W. W. Adams, E. I. // Stiefel Science. -1998. -V. 282. -P. 1842-1843.

[26] Hallenbeck, P. C. Biological hydrogen production; fundamentals and limiting processes / P. C. Hallenbeck, J. R. Benemann // Int. J. Hydrogen Energy. -2002. -V. 27. -P. 1185-1193.

[27] Hawkes, F. R. Sustainable fermentative hydrogen production: challenges for process optimization / F. R. Hawkes, R. Dinsdale, D. L. Hawkes, I. Hussy // Int. J. Hydrogen Energy. -2002. -V. 27. -P. 1339-1347.

[28] Abo-Hashesh, M. Fermentative Hydrogen Production / M. Abo-Hashesh, P. C. Hallenbeck // In: Microbial Technologies in Advanced Biofuels Production edd: P. C. Hallenbeck. -2011. -P. 272.

[29] Hallenbeck, P. C. Fermentative hydrogen production: principles, progress, and prognosis / P. C. Hallenbeck // Int. J. Hydrogen Energy. -2009. -V. 34. -P. 7379-7389.

[30] Yokoi, H. H-2 production from starch bya a mixed culture of Clostridium butyricum and Rhodobacter sp. M-19 / H. Yokoi, S. Mori, J. Hirose, S. Hayashi, Y. Takasaki // Biotechnology letters. -1998. -V. 20 (9). -P. 895-899.

[31] Sauter, M. Mutational analysis of the operon (hyc) determining hydrogenase 3 formation in Escherichia coli / M. Sauter, R. Bohm, A. Bock // Mol. Microbiol. -1992. -V. 6 (11). -P. 1523-1532.

[32] Li, C. L. Inhibition of heavy metals on fermentative hydrogen production by granular sludge / C. L. Li, H. H. P. Fang // Chemosphere. -2007. -V. 67. -P. 668-673

[33] Lee K. S. Improving biohydrogen production in a carrier-induced granular sludge bed by altering physical configuration and agitation pattern of the bioreactor / K. S. Lee, Y. C. Lo, P. J. Lin, J. S. Chang // Int. J. Hydrogen Energy. -2006. -V. 31-P. 1648 - 1657.

[34] Mizuno, O. Enhancement of hydrogen production from glucose by nitrogen gas sparging / O. Mizuno, R. Dinsdale, F. R. Hawkes, D. L. Hawkes, T. Noike // Bioresour Technol. -2000. -V. 73. -P. 59-65

[35] Lay, J. J. Factors affecting hydrogen production from food wastes by Clostridium-rich composts / J. J. Lay, K. S. Fan, J. I. Hwang, J. I. Chang, P. C. Hsu. J Environ Eng -2005. -V. 131. -P. 595-602.

[36] Bisaillon, A. The effect of nutrient limitation on hydrogen production by batch cultures of Escherichia coli / A. Bisaillon, J. Turcot, P. C. Hallenbeck // Int. J. Hydrogen Energy. -2006. -V. 31. -P. 1504-1508

[37]Wang, J. L. Comparison of different pretreatment methods for enriching hydrogen-producing cultures from digested sludge. Int J Hydrogen Energy / J. L. Wang, W. Wan. -V. 33. -P. 2934-2941.

[38] Lee, Y. J. Effect of iron concentration on hydrogen fermentation / Y. J. Lee, T. Miyahara, T. Noike // Bioresour. Technol. -2001. -V. 80. -P. 227-231.

[39] Belokopytov, B. F. Towards the integration of dark- and photo-fermentative waste treatment. 2. Optimization of starch-dependent fermentative hydrogen production / B. F. Belokopytov, K. S. Laurinavichius, T. V. Laurinavichene, M. L. Ghirardi, M. Seibert, A. A. Tsygankov // Int. J. Hydrogen Energy. -2009. -V. 34(8). -P. 3324-3332.

[40] Lee, K. S. Anaerobic hydrogen production with an efficient carrier-induced granular sludge bed bioreactor / K. S. Lee, J. F. Wu, Y. S. Lo, Y. C. Lo, P. J. Lin, J. S. Chang // -2004. -V. 87(5). -P. 648657

[41] Wu, S. Y. Fermentative hydrogen production and bacterial community structure in high-rate anaerobic bioreactors containing silicone-immobilized and self-flocculated sludge / S. Y. Wu, C. H. Hung, C. N. Lin, H. W. Chen, A. S. Lee, J. S. Chang // Biotechnol. Bioeng. -2006. -V. 93(5). -P.934-946.

[42] Zeidan, A. A. A quantitative analysis of hydrogen production efficiency of the extreme thermophile Caldicellulosiruptor owensensis OLT / A. A. Zeidan, E. W. J. van Niel // Int. J. Hydrogen Energy. -2010. -V. 35. -P. 1128-1137

[43] Masset, J. Effect of pH on glucose and starch fermentation in batch and sequenced-batch mode with a recently isolated strain of hydrogen-producing Clostridium butyricum CWBI1009 / J. Masset, S. Hiligsmann, C. Hamilton, L. Beckers, F. Franck, P. Thonart // Int. J. Hydrogen Energy. -2010. -V. 35(8).-P. 3371-3378.

[44] Bott, M. Proton translocation coupled to the oxidation of carbon monoxide to C02 and H2 in Methanosarcina barkeri / M. Bott, R. K. Thauer// Eur. J. Biochem. -1989. -V. 179 (2). -P. 469-472.

[45] Call, D. F. Hydrogen production by Geobacterspecies and a mixed consortium in a microbial electrolysis cell / D. F. Call, R. Wagner, B. E. Logan // Appl. Environ. Microbiol. . -2009. -V. 75 (24). -P. 7579-7587.

[46] Geelhoed, J. S. Electricity-assisted biological hydrogen production from acetate by Geobacter sulfurreducens / J. S. Geelhoed, A. J. M. Stams // Environ Sci. Technol. -2011. -V. 45. -P. 815-820.

[47] Liu H. Electrochemically assisted microbial production of hydrogen from acetate / H. Liu, S. Grot, B. E. Logan // Environ Sci. Technol. -2005. -V. 30. -P. 785-793.

[48] Redwood, M. D. Integrating dark and light bio-hydrogen production strategies: towards the hydrogen economy / M. D. Redwood, M. Paterson-Beedle, L. E. Macaskie // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. -2009.-V. 8 (2).-P. 140-185.

[49] Ren, N.Q. Bioconversion of lignocellulosic biomass to hydrogen: Potential and challenges /N.Q. Ren, A. J. Wang, G. L. Cao, J. F. Xu, L. F. Gao // Biotechnol. Adv. -2009. -V. 27 (6). -P. 1051-1060.

[50] Miyake, J. Hydrogen photoproduction from glucose by a co-culture of a photosynthetic bacteria and Clostridium butyricum / J. Miyake, X-Y. Mao, S. Kawamura // J. Ferment. Technol. -1984. -V. 62 (6).-P. 531-535.

[51] Guo, X. M. Hydrogen production from agricultural waste by dark fermentation: A review / X. M. Guo, E. Trably, E. Latrille, H. Carrere, J. P. Steyer // Int. J. Hydrogen Energy. -2010. -V. 35. -P. 10660-10673.

[52] Nath, K. Hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides strain OUOOl using spent media of Enterobacter cloacae strain DM11 // K. Nath, A. Kumar, D. Das, Applied Microbiology and Biotechnology. -200. -V. 568(4). -P.533-541.

[53] Nath, K. Kinetics of two-stage fermentation process for the production of hydrogen / K. Nath, M. Muthukumar, A. Kumar, D. Das // Int. J. Hydrogen Energy. -2008. -V. 33 (4). -P. 1195-1203.

[54] Chen, C.Y. Biohydrogen production using sequential two-stage dark and photo fermentation processes / C. Y. Chen, M. H. Yang, K. L. Yeh, C. H. Liu, J. S. Chang / Int. J. Hydrogen Energy // -2008. -V. 33. -P. 4755^4762.

[55] Chen, C-Y. Engineering strategies for the enhanced photo-H2 production using effluents of dark fermentation processes as substrate / C-Y. Chen, K-L Yeh, Y-C. Lo, H-M. Wang, J-S. Chang // Int. J. Hydrogen Energy. -2010. -V. 35. -P. 13356-13364.

[56] Odom, J. M. Photoproduction of H2 from cellulose by an anaerobic bacterial culture / J. M. Odom, J. Wall // Appl. Env. Microbiol. -1983. -V. 45 (4). -P. 1300-1305.

[57] Lo, Y. C. Monitoring dark H2 fermentation performance of indigenous Clostridium butyricum by hydrogenase gene expression using RT-PCR and Qpcr / Y. C. Lo, S. D. Chen, C. Y. Chen, T. I. Huang, C. Y. Lin, J. S. Chang // Int. J. Hydrogen Energ. -2008. -V. 33 (19). -P. 5224-5233.

[58] Yokoi, H. Microbial hydrogen production from sweet potato starch residue / H. Yokoi, A. Saits, H. Uchida, J. Hirose, S. Hayashi, Y. Takasaki // J. Biosci. Bioeng. -2001. -V. 91 (1). -P. 58-63.

[59] Jeong, T. Y. Hydrogen production from waste activated sludge by using separation membrane acid fermentation reactor and photosynthetic reactor / T. Y. Jeong, G. C. Cha, I. K. Yoo, D. J. Kim // Int. J. Hydrogen Energy. -2007. -V. 32 (5). -P. 525-530.

[60] Redwood, M. D. A two-stage, two-organism process for biohydrogen from glucose / M. D. Redwood, L. E. Macaskie // Int. J. Hydrogen Energy. -2006. -V. 31(11). -P. 1514-1521.

[61] Lee, C-M. Photohydrogen production using purple nonsulfur bacteria with hydrogen fermentation reactor effluent / C-M. Lee, P-C Chen, C-C Wang, Y-C Tung // Int. J. Hydrogen Energy. -2002.-V. 27.-P. 1309-1313.

[62] Uyar, B. Photoproduction of hydrogen by Rhodobacter capsulatus from thermophilic fermentation effluent / B. Uyar, M. Schumacher, J. Gebicki, M. Modigell // Bioprocess Biosystems Eng. -2009. -V. 32 (5). -P. 603-606.

[63] Laurinavichene, T. V. Towards the integration of dark- and photo-fermentative waste treatment. 3. Potato as substrate for sequential dark fermentation and light-driven H2 production / T. V. Laurinavichene, B. F. Belokopytov, K. S. Laurinavichius, D. N. Tekucheva, M. Seibert, A. A. Tsygankov // Int. J. Hydrogen Energy. -2010. -V. 35 (16). -P. 8536-8543.

[64] Brenner, K. Engineering microbial consortia: a new frontier in synthetic biology / K. Brenner, L. C. You, F. H. Arnold // Trends Biotechnol. -2008. -V. 26 (9). -P. 483-489.

[65] Ren, N. Q. Effects of different pretreatment methods on fermentation types and dominant bacteria for hydrogen production / N. Q. Ren, W. Q. Guo, X. J. Wang, W. S. Xiang, B. F. Liu, X. Z. Wang, J. Ding, Z. B. Chen / Int. J. Hydrogen Energy. -2008. -V. 33. -P. 4318-^1324.

[66] Li, C. L. Fermentative hydrogen production from wastewater and solid wastes by mixed cultures / C. L. Li, H. H. P. Fang // Crit. Rev. Env. Sci. Technol. -2007. -V. 37 (1). -P. 1-39.

[67] Luo, G. Long-term effect of inoculum pretreatment on fermentative hydrogen production by repeated batch cultivations: homoacetogenesis and methanogenesis as competitors to hydrogen production / G. Luo, D. Karakashev, L. Xie, Q. Zhou, I. Angelidaki // Biotechnol. Bioeng. -2011. -V. 108 (8).-P. 1816-27.

[68] Collet, C. Acetate production from lactose by Clostridium thermolacticum and hydrogen-scavenging microorganisms in continuous culture-Effect of hydrogen partial pressure / C. Collet, O. Gaudard, P. Peringer, J-P. Schwitzguebel // J. Biotechnol. -2005. -V. 118. -P. 328-338.

[69] Qian, M. Ethanol production from diluted-acid softwood hydrolysate by co-culture / M. Qian, S. Tian, X. Li, J. Zhang, Y. Pan, X. Yang / Appl. Biochem. Biotechnol. -2006. -V. 134. -P. 273-283.

[70] Asada, Y. Hydrogen production by co-cultures of Lactobacillus and a photosynthetic bacterium, Rhodobacter sphaeroides RV / Y. Asada, M. Tokumoto, Y. Aihara, M. Oku, K. Ishimi, T. Wakayama, J. Miyake, M. Tomiyama, H. Kohno / Int. J. Hydrogen Energy. -2006. 31 (11). -P. 1509-1513.

[71] Alalayah, W. M. Hydrogen Production using a Two-Stage Fermentation Process Pak // W. M. Alalayah, M. S. Kalil, A. A. H. Kadhum, J. M. Jahim, S. Z. S. Jaapar, N. M. Alauj // J. Biol. Sci. -2009. -V. 12 (22). -P. 1462-1467.

[72] Tsygankov, A. A. Integration of biological H2 producing process. In: State of the art and progress in production of Biohydrogen: book / A. A. Tsygankov, D. N. Tekucheva: ed. by D. Levin, U. Azbar, (eds.) // Bentham Science Publishers. -2012. -P. 258.

[73] Zhu, H. Hydrogen production by four cultures with participation by anoxygenic photosynthetic bacterium and anaerobic bacterium in the presence of NH4 / H. Zhu, T. Wakayama, Y. Asada, J. Miyake // Int. J. Hydrogen Energy. -2001. 26 (11). -P. 1149-1154.

[74] Ozgur, E. Potential use of thermophilic dark fermentation effluents in photofermentative hydrogen production by Rhodobacter capsulatus / E. Ozgur, N. Afsar, T. Vrije, M. Yucel, U. Gunduz, P. A. M. Claassen, I. Eroglu // Journal of Cleaner Production. -2010. -V. 18. -P. 23-28.

[75] Su, H. B. Combination of dark- and photo-fermentation to enhance hydrogen production and energy conversion efficiency / H. B. Su, J. Cheng, J. H. Zhou, W. Song, K. Cen // Int. J. Hydrogen Energy. -2009. -V. 34(21). -P. 8846-8853.

[76] Liu, B-F. Hydrogen production by immobilized R. faecalis RLD-53 using soluble metabolites from ethanol fermentation bacteria E. harbinense B49 / B-F. Liu, N-Q. Ren, D-F Xing, J. Ding, G-X. Zheng, W-Q. Guo, J-F. Xu, G-J. Xie // Bioresource Technol. -2009. -V. 100. -P. 2719-2723.

[77] Ding, J. Hydrogen production from glucose by co-culture of Clostridium Butyricum and immobilized Rhodopseudomonas faecalis RLD-5334 / J. Ding, B. F. Liu, N. Q. Ren, D. F. Xing, Guo, J. F. Xu, G. J. Xie // Int. J. Hydrogen Energy, -2009. -V. 34. -P. 3647-3652.

[78] Argun, H. Effects of the substrate and cell concentration on bio-hydrogen production from ground wheat by combined dark and photo-fermentation / H. Argun, F. Kargi, I. K. Kaplan // Int. J. Hydrogen Energy. -2009. -V. 34 (15). -P. 6181-6189.

[79] Vasilyeva, L. Enhanced hydrogen production by a mutant of Rhodobacter sphaeroides having an altered light-harvesting system / L. Vasilyeva, M. Miyake, E. Khatipov, T. Wakayama, M. Sekine, M. Hara, E. Nakada, Y. Asada, J. Miyake // J. Biosci. Bioeng. -1999. -V. 87 (2). -P. 619-624.

[80] Ruiyan, Z. Hydrogen production by draTGB hupL double mutant of Rhodospirillum rubrum under different light conditions / Z. Ruiyan, W. Di, Z. Yaoping, L. Jilun // Chin. Sci. Bull. -2006. -V. 51.-P. 2611-8.

[81] Gokhan, K. Improved hydrogen production by uptake hydrogenase deficient mutant strain of Rhodobacter sphaeroides O.U.OOl / K. Gokhan, G. Ufuk, R. Gabor, Y. Meral, E. Inci, L. K. Kornel // Int. J. Hydrogen Energy. -2008. -V. 33. -P. 3056-60.

[82] Kim, E. J. Molecular hydrogen production by nitrogenase of Rhodobacter sphaeroides and by Fe-only hydrogenase of Rhodospirillum rubrum / E. J. Kim, M. K. Lee, M. S. Kim, J. K. Lee // Int. J. Hydrogen Energy. -2008. -V. 33. -P. 1516-1521.

[83] Rocha J, Barbosa HR, Wijffels RH. Hydrogen production by photosynthetic bacteria: culture media, yields and efficiencies. In: Miyake J, Matsunaga T, San Pietro A, editors. Biohydrogen 2. An approach to environmentally acceptable technology. Amsterdam: Pergamon, 2001 ; p. 3-32.

[84] Tao, Y. High hydrogen yield from a two-step process of dark- and photo-fermentation of sucrose / Y. Tao, Y. Chen, Y. Wu, Y. He, Z. Zhou // Int. J. Hydrogen Energy. -2007. -V. 32 (2). -P. 200-206.

[85] Lo, Y.C. Photofermentative hydrogen production using dominant components (acetate, lactate, and butyrate) in dark fermentation effluents / Y. C. Lo, S. Y. Chen, C. M. Lee, J. S. Chang // Int. J. Hydrogen Energ. -2011. -V. 36 (21). -P. 14059-14068.

[86] Laurinavichene, T. V. Towards the integration of dark and photo fermentative waste treatment. 1. Hydrogen photoproduction by purple bacterium Rhodobacter capsulatus using potential products of starch fermentation / T. V. Laurinavichene, D. N. Tekucheva, K. S. Laurinavichius, M. L. Ghirardi, M. Seibert, A. A. Tsygankov // Int. J. Hydrogen Energy. -2008. -V. 33 (23). -P. 7020-7026.

[87] Uyar, B. Photofermentative hydrogen production from volatile fatty acids present in dark fermentation effluent / B. Uyar, I. Eroglu, M. Yucel, U. Gunduz // Int. J. Hydrogen Energy. -2009. -V. 34.-P. 4517-4523.

[88] Ozmihci, S. Comparison of different mixed cultures for bio-hydrogen production from ground wheat starch by combined dark and light fermentation Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology / S. Ozmihci, F. Kargi. -2010. -V. 37 (4). -P. 341-347.

[89] Odom, J. M. Hydrogenase, electron-transfer proteins, and energy coupling in the sulfate-reducing bacteria Desulfovibrio / J. M. Odom, H. D. J. Peck, J. Annu // Rev. Microbiol. -1984. -V. 38 (7). -P. 551-592.

[90] Xie, G. J. Control strategies for hydrogen production through co-culture of Ethanoligenens harbinense B49 and immobilized Rhodopseudomonas faecalis RLD-5 / G. J. Xie, L. B. Feng, N. Q. Ren, J. Ding, C. Liu, D. F. Xing, G. W. Qian, H. Y. Ren // Int. J. Hydrogen Energy. -2010. -V. 35 (5). -P. 1929-1935.

[91] Fang, H. H. P. Phototrophic hydrogen production from glucose by pure- and co-cultures of Clostridium butyricum and Rhodobacter sphaeroides / H. H. P. Fang, H. G. Zhu, T. Zhang // Int. J. Hydrogen Energy. -2006. -V. 31 (5). -P. 2223-2230.

[92] Argun, H. Bio-hydrogen production from ground wheat starch by continuous combined fermentation using annular-hybrid bioreactor, / H. Argun, F. Kargi // Int. J. Hydrogen Energy. -2010. -V. 35 (12).-P. 6170-6178.

[93] Mallick, N. Biotechnological potential of immobilized algae for wastewater N, P and metal removal: a review/N. Mallick// Biometals. -2002. -V. 15. -P. 377-390.

[94] Kim, M. S. Hydrogen production from Chlamydomonas reinhardtii biomass using a two-step conversion process: Anaerobic conversion and photosynthetic fermentation / M. S. Kim, J. S. Baek, Y. S. Yun, S. J. Sim, S. Park, S. C. Kim // Int. J. Hydrogen Energy. -2006. -V. 31 (6). -P. 812-816.

[95] Kawaguchi, H. H2 production from algal biomass by mixed culture of Rhodobium marinum A-501 and Lactobacillus amylovorus / H. Kawaguchi, K. Hashimoto, K. Hirata, K. Miyamoto // J. Biosci. Bioeng. -2001. -V. 91. -P. 277-282.

[96] Mussgnug, J. H. Microalgae as substrates for fermentative biogas production in a combined biorefinery concept / J. H. Mussgnug, V. Klassen, A. Schluter, O. Kruse // J. Biotechnol. -2010. -V. 150(1). -P. 51-56.

[97] Chaumont, D. Biotechnology of algal biomass production: a review of systems for outdoor mass culture / D. Chaumont // J. Appl. Phycol. -1993. -V. 78 (5). -P. 593-604.

[98] Hernandez, J-P. Starvation enhances phosphorus removal from wastewater by the microalgae Chlorellaspp.co-immobilized with Azospirillum brasilense // J-P. Hernandez, L. E. de-Bashan, Y. Bashan // Enzyme and Microbial Technology. -2006. -V. 38. -P. 190-198.

[99] Garcia-Pena, E.I. Semi-continuous biohydrogen production as an approach to generate electricity / E. I. Garcia-Pena, C. Guerrero-Barajas, D. Ramirez, L. G. Arriaga-Hurtado // Bioresour. Technol. -2009. -V. 100. -P. 6369-6377.

[100] He, D. Willison Hydrogen photosynthesis by Rhodobacter capsulatus and its coupling to a PEM fuel cell / D. He, Y. Bultel, J-P. Magnin , C. Roux, John C // Journal of Power Sources. -2005. -V. 114.-P. 19-23.

[101] Jeon, B. S. Performance analysis of a proton exchange membrane fuel cell (PEMFC) integrated with a trickling bed bioreactor for biological high-rate hydrogen production / B. S. Jeon, Y. S. Um, S. M. Lee, S. Y. Lee, H. J. Kim, Y. H. Kim, M. B. Gu. B. I. Sang // Energy and Fuels. -2008. -V. 22. -P. 83-86.

[102] Cho, Y.K. Development of a solar-powered microbial fuel cell / Y, K. Cho, T. J. Donohue, Tejedor, M. A. Anderson, K. D. McMahon, D. R. Noguera // Journal of Applied Microbiology. -2008. -V. 104.-P.640-650.

[103] Rosenbaum, M. Utilizing the green alga Chlamydomonas reinhardtii for microbial electricity generation: a living solar cell / M. Rosenbaum, U. Schroder, F. Scholz // Appl. Microbiol. Technol. -2005. -V. 68. -P. 753-756.

[104] Niessen, J. Gaining electricity from in situ oxidation of hydrogen / J. Niessen, U. Schroder, F. Harnisch, F. Scholz // Letters in Applied Microbiology. -2005. -V. 41. -P. 286-290.

[105] Rosenbaum, M. In Situ Electrooxidation of Photobiological Hydrogen in a Photobioelectrochemical Fuel Cell Based on Rhodobacter sphaeroides / M. Rosenbaum, U. Schroder, F. Scholz // Environ Sci. Technol. -2005. -V. 39 (16). -P. 6328-33.

[106] Chader, S. Biohydrogen production using green microalgae as an approach to operate a small proton exchange membrane fuel cell / S. Chader , B. Mahmah, K. Chetehouna, F. Amrouche , K. Abdeladim // Int. J. Hydrogen Energy. -2011. -V. 36. -P. 4089-4093.

[107] Voronin, O. G. Bioconversion of the cellulose containing waste into electricity through the intermediate hydrogen production / O. G. Voronin , A. I. Shestakov, E. R. Sadraddinova, S. M. Abramov , A. I. Netrusov, N. A. Zorin, A. A. Karyakin // Int. J. Hydrogen Energy. -2012. -V. 37. -P. 10585-10589.

[108] Asada, Y. Hydrogenase from the unicellular cyanobacterium, Microcystis aeruginosa / Y. Asada, S. Kawamura, K. K. Ho // Phytochemistry. -1987. -V. 26 (3). -P. 637-640.

[109] Serebryakova, L. T. Two-stage system for hydrogen production by immobilized cyanobacterium Gloeocapsa alpicola CALU 743 // L. T. Serebryakova, A. A. Tsygankov // Biotechnol. Prog. -2007. -V. 23 (5). -P. 1106-1110.

[110] Miura, Y. Stably sustained hydrogen production with high molar yield through a combination of a marine green alga and a photosynthetic bacterium / Y. Miura, C. Saitoh, S. Matsuoka, K. Miyamoto // Biosci. Biotech. Biochem. -1992. -V. 56 (5). -P. 751-754.

[111] Miura, Y. Stably sustained hydrogen production by biophotolysis in natural day/night cycle / Y. Miura, T. Akano, K. Fukatsu, H. Miyasaka, T. Mizoguchi, K. Yagi, I. Maeda, Y. Ikuta, H. Matsumoto // Energy Conv Man. -1997. -V. 38. -P. 533-S537.

[112] Cheng, S. A. Sustainable and efficient biohydrogen production via electrohydrogenesis / S. A. Cheng, B. E. Logan // PNAS. -2007. -V. 104. -P. 18871-18873.

[113] Wagner, R. C. Hydrogen and methane production from swine wastewater using microbial electrolysis cells / R. C. Wagner, J. M. Regan, S. E. Oh, Y. Zuo, B. E. Logan // Water Research. -2009. -V. 43 (5).-P. 1480-1488.

[114] Lalaurette, E. Hydrogen production from cellulose in a two-stage process combining fermentation and electrohydrogenesis / E. Lalaurette, S. Thammannagowda, A. Mohagheghi, P. C. Maness, B. E. Logan // Int. J. Hydrogen Energy. -2009. -V. 34 (15). -P. 6201-6210.

[115] Du, Z. A state of the art review on microbial fuel cells: a promising technology for wastewater treatment and bioenergy / Z. Du, H. Li, T. Gu // Biotech. Adv. -2007. -V. 25. -P. 464-482.

[116] Rabaey, K. Microbial ecology meets electrochemistry: electricity- driven and driving communities / K. Rabaey, J. Rodriguez, L. L. Blackall, J. Keller, P. Gross, D. Batstone , W. Verstraete, K. H. Nealson // ISME J. -2007. -V. 1. -P. 9-18.

[117] Lu, N. Electrsicity generation from starch processing wastewater using microbial fuel cell technology / N. Lu, S-G. Zhou, L. Zhuang, J-T. Zhnag, J-R. Ni / Biochem. Eng. J. -2009. -V. 43. -P. 246-251.

[118] Schwartz, K. Microbial fuel cells: Design elements and application of a novel renewable energy sources / K. Schwartz // Basic, biotech. ells. Enzyme and Microbial Technology. -2007. -V. 47. -P. 179-188.

[119] Potter, M. C. Electrical effects accompanying the decomposition of organic compounds / M. C. Potter / Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. -1911. -V. 84. -P. 160-276.

[120] Rabaey, K. Microbial fuel cells: novel biotechnology for energy generation / K. Rabaey, W. Verstraete // Trends in Biotechnology. -2005. -V. 23. -P. 291-298.

[121] Logan, B. E. Feature Article: Microbial Fuel Cells-Challenges and Applications / B. E. Logan, J. M. Regan // Environ. Sci. Technol. -2006. -V. 40(17). -P. 5172-5180.

[122] Padma, S. Microbial Fuel Cells / S. Padma, B. Dirk // In: Hays Working Document of the NPC Future Transportation Fuels Study Made Available. -2012. -P. 18.

[123] Li, Z. Electricity production by an overflow-type wetted microbial fuel cell / Z. Li, X. Zhang, Y. Zeng, L. Lei // Biores. Technol. -2009. -V. 100. -P. 2551-2555.

[124] Liu, H. Electricity generation using an air-cathode single chamber microbial fuel cell in the presence and absence of a proton exchange membrane / ] Liu, H.; Logan, B. E. // Environ. Sci. Technol. -2004. -V. 38. -P. 4040-4046.

[125] Min, B. Electricity generation using membrane and salt bridge microbial fuel cells / B. Min, S. Cheng, B. E. Logan // Water Res. -2005. -V. 39. -P. 1675-1686.

[126] Chaudhuri, S. K. Electricity generation by direct oxidation of glucose in mediatorless microbial fuel cells / S. K. Chaudhuri, D. R. Lovley //Nat. Biotechnol. -2003. -V. 21. -P. 1229-1232.

[127] Rabaey, K. A microbial fuel cell capable of converting glucose to electricity at high rate and efficiency / K. Rabaey, G. Lissens, S. D. Siciliano, W. A. Verstraete // Biotechnol. Lett. -2003. -V. 25. -P.1531-1535.

[128] Aelterman, P. Continuous electricity generation at high voltages and currents using stacked microbial fuel cells / P. Aelterman, K. Rabaey, T. H. Pham, N. Boon, W. Verstraete // Environ. Sci. Technol. -2006. -V. 40. -P. 3388-3394.

[129] Rhoads, A. Microbial fuel cell using anaerobic respiration as an anodic reaction and biom ineralized manganese as cathodic reactant / A. Rhoads, H. Beyenal, Z. Lewandowski // Environ. Sci. Technol. -2005. -V. 39. -P. 4666-4671.

[130] Logan, B.E. Microbial fuel cells: book / B. E. Logan. New York. -2008. 200 p.

[131] Rahimnejad, M. Low voltage power generation in a biofuel cell using anaerobic culture / M. Rahimnejad, N. Mokhtarian, G. D. Najafpour, W. R. Wan Daud, A. A. Ghoreyshi // World Applied Sciences. -2009. -V. 6(11). -P. 1585-1588.

[132] Yan-ping, X. M. Preliminary Study on E. coli Microbial Fuel Cell and On-electrode Taming of the Biocatalyst / X. M. Yan-ping // Chinese Journal of Process Engineering. -2008. -V. 8. -P. 11791184.

[133] Derek, R. L. The microbe electric: conversion of organic matter to electricity / R. L. Derek // Current Opinion in Biotechnology. -2008. -V. 19. -P. 564-571.

[134] El-Naggara, M. Y. Electrical transport along bacterial nanowires from Shewanella oneidensis MR-1 / M. Y. El-Naggara, G. Wangerb, K. M. Leungc, T. D. Yuzvinskya, G. Southame, J. Yangc, W. M. Laud, K. H. Nealsonb, Y. A. Gorbyb //PNAS. -2010. -V. 107(42). -P. 18127-18131.

[135] Kim , K. J. C. Microbial fuel cells : recent advances, bacterial communities and application beyond electricity generation / K. J. C Kim, M. J. Choi // Environmental Engineering Research. -2008.-V. 13.-P.

[136] Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms / D. R. Lovley // Nat. Rev. Micro. -2006. -V. 4. -P. 497-508.

[137] Du, Z. A state of the art review on microbial fuel cells: A promising technology for wastewater treatment and bioenergy / Z. Du, H. Li, T. Gu // Biotechnology Advances. -2007. -V. 25. -P. 464482.

[138] Rabaey, K. Microbial phenazine production enhances electron transfer in biofuel cells / K. Rabaey, N. Boon, M. Hofte, W. Verstraete // Environ. Sci. Technol. -2005. -V. 39. -P. 3401-3408.

[139] Rabaey, K. Biofuel cells select for microbial consortia that self-mediate electron transfer / K. Rabaey, N. Boon, S. D. Siciliano, M. Verhaege, W. Verstraete // Appl. Environ. Microbiol. -2004. -V. 70.-P. 5373- 5382.

[140] Ieropoulos, I. A. Comparative study of three types of microbial fuel cell / I. A. Ieropoulos, J. Greenman, C. Melhuish, J. Hart // Enzyme and Microbial Technology. -2005. -V. 37. -P. 238-245.

[141] Osman, M. H. Recent progress and continuing challenges in bio-fuel cells. Part II / M. H. Osman, A. A. Shah, F. C. Walsh // Microbial. Biosensors and Bioelectronics. -2010. -V. 26. -P. 953963.

[142] Zhang, T. Novel mediatorless microbial fuel cell based on direct biocatalysis of Escherichia coli / T. Zhang, C. Cui, S. Chen, X. Ai, H. Yang, P. Shen, Z. A. Peng // -2006. -V. 4(21). -P. 2257-2259.

[143] Nwogu, N.G. Microbial fuel cells and parameters affecting performance when generating electricity /N. G. Nwogu // Basic Biotech. -2007. -V. -P. 73-79.

[144] Liang, P. Composition and distribution of internal resistance in three types of microbial fuel cells / P. Liang, X. Huang, M. Z. Fan, X. X. Cao, C. Wang // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2007. -V. 77. -P.551-558.

[145] Ieropoulos, I. Microbial fuel cells based on carbon veil electrodes: Stack configuration and scalability / I. Ieropoulos, J. Greenman, C. Melhuish // Int. J. Energy. Res. -2008. -V. 32. -P. 12281240.

[146] Logan, B. E. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems / B. E. Logan. Applied Microbiology and Biotechnology. -2010. -V. 85. -P. 1665-1671.

[147] He, Z. Application of bacterial biocathodes in microbial fuel cells. Electroanalysis / Z. He, L. T. Angenent. -2006. -V. 18(19-20). -P. 2009-2015.

[148] Freguia, S. Non-catalyzed cathodic oxygen reduction at graphite granules in microbial fuel cells / S. Freguia, K. Rabaey, Z. Yuan, J. Keller. Electrochimica Acta. -2007. -V. 53. -P. 598-603.

[149] Aelterman, P. Microbial fuel cells operated with iron-chelated air cathodes / P. Aelterman, M. Versichele, E. Genettello, K. Verbeken, W. Verstraete // Electrochimica Acta. -2009. -V. 54. -P. 5754-5760.

[150] Chen, G. W. Application of biocathode in microbial fuel cells: cell performance and microbial community / G. W. Chen, S. J. Choi, T. H. Lee, G. Y. Lee, J. H. Cha, C. W. Kim // Applied Microbiology and Biotechnology. -2008. -V. 79. -P. 379-388.

[151] Huang, L. Electron transfer mechanisms, new applications, and performance of biocathode microbial fuel cells / L. Huang, J. M. Regan, X. Quan // Bioresource Technology. -2011. -V. 102. -P. 316-323.

[152] Oh, S. Cathode Performance as a Factor in Electricity / S. Oh, B. Min, B. E. Logan // Generation in Microbial Fuel Cells. Environmental Science & Technology. -2004. -V. 38. -P. 4900-4904.

[153] Rabaey, K. Tubular microbial fuel cells for efficient electricity generation / K. Rabaey, P. Clauwaert, P. Aelterman, W. Verstraete // Environ. Sci. Technol. -2005. -V. 39. -P. 8077-8082.

[154] He, Z. The upflow microbial fuel cell with an interior cathode: assessment of the internal resistance by impedance spectroscopy / Z. He, N. Wagner, S. D. Minteer, L. T. Angenent // Environ. Sci. Technol. -2006. -V. 40. -P. 5212-5217.

[155] Pham, T. H. Microbial fuel cells in relation to conventional anaerobic digestion technology / T, H. Pham, K. Rabaey, P. Aelterman, P. Clauwaert, L. D. Schamphelaire, N. Boon, W. Verstraete // Eng. Life. Sci. -2006. -V. 20. -P. 121.

[156] Zuo, Y. Tubularmembrane cathodes for scalable power generation in microbial fuel cells / Y. Zuo, S. Cheng, D. Call, B. E. Logan // Environ. Sci. Technol. -2007. -V. 41. -P. 3347-3353.

[157] Kazuya, W. Recent Developments in Microbial Fuel Cell Technologies for Sustainable Bioenergy / W. Kazuya // Journal of Bioscience and Bioengineering. -2008. -V. 106. -P. 528-536.

[158] Caccavo, F. Geobacter sulfurreducens sp. nov., a hydrogen-oxidizing and acetate-oxidizing dissimilatory metal-reducing microorganism / F. J. Caccavo, D. J. Lonergan, D. R. Lovley, M. Davis, J. F. Stolz, M. Mcinerney // J. Appl. Environ. Microbiol. -1994. -V. 60. -P. 3752-3759.

[159] Ringeisen, B. R. High power density froma miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 / B. R. Ringeisen, E. Henderson, P. K. Wu, J. Pietron, R. Ray, B. Little, J. C. Biffinger, J. M. Jones-Meehan // Environ Sci. Technol. -2006. -V. 40. -P. 2629-2634.

[160] Manohar, A. K. The Use of Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) in the Evaluation of the Electrochemical Properties of a Microbial Fuel Cell. Bioelectrochemistry / A. K. Manohar, O. Bretschger, K. H. Nealson, F. Mansfeld. -2008. -V. 72. -P. 149 - 159.

[161] Logan, B. E. Electricity generation from cysteine in a microbial fuel cell / B. E. Logan, C. Murano, K. Scott, N. D. Gray, I. M. Head // Water Research. -2005. -V. 39. -P. 5. 942-952.

[162] Dumas, C. Electrochemical activity of Geobacter sulfurreducens biofilms on stainless steel anodes / C. Dumas, R. Basseguy, A. Bergel // Electrochimica Acta. -2008. -V. 53. -P. 5235-5241.

[163] Mehta, T. Outer membrane c-type cytochromes required for Fe(III) and Mn(IV) oxide reduction in Geobacter sulfurreducens / T. Mehta, M. V. Coppi, S. E. Childers, D. R. Lovley // Appl. Environ. Microbiol. -2005. -V. 71. -P. 8634-8641.

[164] Bond, D. R. Electricity production by Geobacter sulfurreducens attached to electrodes / D. R. Bond, D. R. Lovley // Appl. Environ. Microbiol. -2003. -V. 69. -P. 1548-1555.

[165] Bon, D. R. Electrode-reducing microorganisms harvesting energy from marine sediments. Science / D. R. Bond, D. R. Lovley. -2002. -V. 295. -P. 483-485.

[166] Sharma, V. Biocatalysts in microbial fuel cells / V. Sharma, P. P. Kundu // Enzyme and Microbial Technology. -2010. -V. -P. 179-188.

[167] Kleerebezem, R. Mixed culture biotechnology for bioenergy production / R. Kleerebezem, M. C. M. Loosdrecht // Curr. Opin. Biotechnol. -2007. -V. 18. -P. 207-212.

[168] Cheng, S. Power Densities Using Different Cathode Catalysts (Pt and CoTMPP) and Polymer Binders (Nafion and PTFE) in Single Chamber Microbial Fuel Cells / S. Cheng, H. Liu, B. E. Logan // Environmental Science & Technology. -2005. -V. 40. -P. 364-369.

[169] Schroder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency / U. Schroder // Phys. Chem. Chem. Phys. -2007. -V. 9 -P. 2619-2629.

[170] Nevin K. P. Power output and columbic efficiencies from biofilms of Geobacter sulfurreducens comparable to mixed community microbial fuel cells / K. P. Nevin, H. Richter, S. F. Covalla, J. P.

Johnson, T. L. Woodard, A. L. Orloff, H. Jia, M. Zhang D. R. Lovle, // Environ. Microbiol. -2008. -V. 10.-P.2505-2514.

[171] Qu, Y. Use of a Coculture To Enable Current Production by Geobacter sulfurreducens / Y. Qu, Y. Feng, X. Wang, B. E. Logan // Applied and Environmental Microbiology. -2012. -P. 3484 -3487.

[172] Chae, K. J. Effect of different substrates on the performance, bacterial diversity, and bacterial viability in microbial fuel cells / K. J. Chae, M. J. Choi, J. W. Lee, K. Y. Kim, I. S. Kim // Biores. Technol. -2009. -V. 100. -P. 3518-3525.

[173] Pant, D. A review of the substrates used in microbial fuel cells (MFCs) for sustainable energy production / P. Deepak, G. V. Bogaert, L. Diels, K. Vanbroekhoven // Bioresource Technology. -2010. -V. 101.-P. 1533-1543.

[174] Cheng, S. Increasing power generation for scaling up single-chamber air cathode microbial fuel cells / S. Cheng, B. E.Logan // Bioresource Technology. -2011. -V. 102. -P. 4468-4473.

[175] Lee, H. S. Evaluation of energy-conversion efficiencies in microbial fuel cells (MFCs) utilizing fermentable and non-fermentable substrates / H. S. Lee, P. Parameswaran, A. Kato-Marcus, C. I. Torres, B. E. Rittmann // Water Research. -2008. -V. 42. -P. 1501-1510.

[176] Hu, Z. Electricity generation by a baffle-chamber membraneless microbial fuel cell / H. S. Lee, P. Parameswaran, A. Kato-Marcus, C. I. Torres, B. E. Rittmann // J. Power Sources -2008. -V. 179. -P. 27-33.

[177] Liu, Z. Study of operational performance and electrical response on mediator-less microbial fuel cells fed with carbon- and protein-rich substrates / Z. Liu, J. Liu, S. Zhang, Z. Su // Biochem. Eng. J. -2009.-V. 45.-P. 185-191.

[178] Liu, H. Production of electricity from acetate or butyrate using a single-chamber microbial fuel cell / H. Liu, S. A. Cheng, B. E. Logan // Environ. Sci. Technol. -2005. -V. 39. -P. 658-662.

[179] Huang, L. Electricity production from xylose using a mediator-less microbial fuel cell / L. Huang, R. J. Zeng, I. Angelidaki // Biores. Technol. -2008. -V. 99. -P. 4178^1184.

[180] Ren, Z. Electricity production from cellulose in a microbial fuel cell using a defined binary culture / Z. Ren, T. E. Ward, J. M. Regan // Environ. Sci. Technol. -2007. -V. 41. -P. 4781^1786.

[181] Catal, T. Electricity production from twelve monosaccharides using microbial fuel cells / T. Catal, K. Li, H. Bermek, H. Liu // J. Power Sources. -2008. -V. 175. -P. 196-200.

[182] Rismani-Yazdi, H. Electricity generation from cellulose by rumen microorganisms in microbial fuel cells / H. Rismani-Yazdi, A. D. Christy, B. A. Dehority, M. Morrison, Z. Yu, O. H. Tuovinen // Biotechnol. Bioeng. -2007. -V. 97(6). -P. 1398-1407.

[183] Rezaei, F. Analysis of chitin particle size on maximum power generation, power longevity, and Coulombic efficiency in solid-substrate microbial fuel cells / F. Rezaei, T. L. Richard, B. E. Logan // J. Power Sources. -2009. -V. 192. -P. 304-309.

[184] Venkata Mohan, S. Bioelectricity production from wastewater treatment in dual chambered microbial fuel cell (MFC) using selectively enriched mixed microflora: effect of catholyte / S. Venkata Mohan, R. Saravanan, S. Veer Raghavulu, G. Mohanakrishna, P. N. Sarma // Biores. Technol. -2008. -V. 99. -P.596-603.

[185] Aldrovandi, A. Sustainable power production in a membrane-less and mediator-less synthetic wastewater microbial fuel cell / A. Aldrovandi, E. Marsili, P. Paganin, S. Tabacchioni, A. Giordano // Biores. Technol. -2009. -V. 100. -P. 3252-3260.

[186] Min, B. Continuous electricity generation from domestic wastewater and organic substrates in a flat plate microbial fuel cell / B. Min, B. E. Logan // Environ Sci. Technol. -2004. -V. 38. -P. 58095814.

[187] Cheng, S. Increased Power Generation in a Continuous Fow MFC with Advective Flow through the Porous Anode and Reduced Electrode Spacing / S. Cheng, H. Liu, B. E. Logan // Environ. Sci. Technol. -2006. -V. 40(7). -P. 2426-2432.

[188] Liu, H. Scale-up of membrane-free single-chamber microbial fuel cells / H. Liu, S. Cheng, L. Huang, B. E. Logan // J. Power Sources. -2008. -V. 179. -P. 274-279.

[189] He, Z. Electricity generation from artificial wastewater using an upflow microbial fuel cell / Z. He, S. D. Minteer, L. T. Angenent // Environmental Science and Technology. -2005. -V. 39(14). -P. 5262-5267.

[190] Rabaey, K. Microbial fuel cells for sulfide removal / K. Rabaey, K. Sompel, L. Maignien, N. Boon, P. Aelterman, P. Clauwaert, L. Schamphelaire, H. T. Pham, J. Vermeulen, M. Verhaege, P. Lens, W. Verstraete // Environ. Sci. Technol. -2006. -V. 40. -P. 5218-5224.

[191] Zhao, F. Factors affecting the performance of microbial fuel cells for sulfur pollutants removal / F. Zhao, N. Rahunen, J. R. Varcoe, A. J. Roberts, C. Avignone-Rossa, A. E. Thumser, R. C. T. Slade // Biosens. Bioelectron. -2009. -V. 24. -P. 1931-1936.

[192] Luo, H. Phenol degradation in microbial fuel cells / H. Luo, G. Liu, S. Jin // Chem. Eng. J. -2009. -V. 147. -P. 259-264.

[193] Pham, H. Enhanced removal of 1,2- dichloroethane by anodophilic microbial consortia / H. Pham, N. Boon, M. Marzorati, W. Verstraete // Water Res. -2009. -V. 43. -P. 2936-2946.

[194] Sun, J. Simultaneous decolorization of azo dye and bioelectricity generation using a microfiltration membrane air-cathode single- chamber microbial fuel cell / J. Sun, Y. Y. Hu, Z. Bi, Y. Q. Cao // Biores. Technol. -2009. -V. 100. -P. 3185-3192.

[195] Zuo, Y. Electricity Production from Steam-Exploded Corn Stover Biomass / Y. Zuo, P. C. Maness, B. E. Logan // Energy and Fuels. -2006. -V. 20. -P. 1716-1721.

[196] Adams, M. W. Hydrogenase / M. W. Adams, L. E. Mortenson, J. S. Chen // Biochim. Biophys. Acta. -1981. -V. 594. -P. 105-176.

[197] Vignais, P. M. Classification and phylogeny of hydrogenases / P. M. Vignais, B. Billoud, J. Meyer // FEMS Microbiol. Rev. -2001. -V. 25. -P. 455-501.

[198] Bagramyan, K. Participation of hyf-encoded hydrogenase 4 in molecular hydrogen release coupled with proton-potassium exchange in Escherichia coli / K. Bagramyan, A. Vassilian, N. Mnatsakanyan, A. Trchounian // Membr. Cell Biol. -2001. -V. 14. -P. 749-763.

[199] Sawers, R. G. Differential expression of hydrogenase isoenzymes in Escherichia coli K-12: evidence for a third isoenzyme / R. G. Sawers, S. P. Ballantine, D. H. Boxer // J. Bacteriol. -1985. -V. 164.-P.1324-1331.

[200] Colbeau, A. Cloning of DNA fragments carrying hydrogenase genes of Rhodopseudomonas capsulate / A. Colbeau, A. Godfroy, P. M. Vignais // Biochimie. -1986. -V. 68. -P. 147-155.

[201] Vignais, P. M. Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview / P. M. Vignais, B. Billoud // Chem. Rev. -2007. -V. 107. -P. 4206-4272.

[202] Zirngibl, C. H2-forming methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase, a novel type of hydrogenase without iron-sulfur clusters in methanogenic archaea / C. Zirngibl, W. Van Dongen, B. Schworer, R. Von Bunau, M. Richter, A. Klein, R. K. Thauer // Eur. J. Biochem. -1992. -V. 208. -P. 511-520.

[203] Korbas, M. The Iron-Sulfur Cluster-free Hydrogenase (Hmd) Is a Metalloenzyme with a Novel Iron Binding Motif / M. Korbas, S. Vogt, W. Meyer-Klaucke, E. Bill, E. J. Lyon, R. K. Thauer, S. Shima // J. Biol. Chem. -2006.-V. 281.-P. 30804-30813.

[204] Happe, T. Hydrogenases in green algae: do they save the algae's life and solve our energy problems? / T. Happe, A. Hemschemeier, M. Winkler, A. Kaminski // Trends Plant. Sci. -2002. -V. 7. -P. 246-250.

[205] Hackstein, J .H. P. Hydrogenosomes: eukaryotic adaptations to anaerobic environments / J. H. P. Hackstein, A. S. Akhmanova, B. Boxma, H. R. Harhangi, F. Voncken // Trends Microbiol. -1999. -V. 7. _P. 441^147.

[206] Albracht, S. P. J. Nickel hydrogenases: in search of the active site / S. P. J. Albracht // Biochim. Biophys. Acta. -1994. -V. 1188. -P. 167-204.

[207] Ogata, H. [NiFe] hydrogenases: structural and spectroscopic studies of the reaction mechanism / H. Ogata, W. Lubitz Y. Higuchi // Dalton Trans. -2009. -V. 37 -P. 7561-7828.

[208] Vignais, P. M. Molecular biology of microbial hydrogenases / P. M. Vignais, A. Colbeau // Cur. Issues. Mol. Biol. -2004. -V. 6. -P. 159-188.

[209] Garcin, E. The crystal structure of a reduced [NiFeSe] hydrogenase provides an image of the activated catalytic center / E. Garcin, X. Vernede, E. C. Hatchikian, A. Volbeda, M. Frey, J. C. Fontecilla-Camps // Structure Fold. Des. -1999. -V. 7. -P. 557-566.

[210] Volbeda, A. High-resolution crystallographic analysis of Desulfovibrio fructosovorans [NiFe] hydrogenase / A. Volbeda, Y. Montet, X. Vernede, E. C. Hatchikian, J. C. Fontecilla-Camps // Int. J. Hydrogen Energy. -2002. -V. 27(11-12). -P. 1449-1461.

[211] Volbeda, A. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas / A. Volbeda, M. H. Charon, C. Piras, E. C. Hatchikian, M. Frey, J. C. Fontecilla-Camps //Nature. -1995. -V.373.-P.580-7.

[212] Frey, M. Ni,Fe-hydrogenases / M. Frey, J. C. Fontecilla-Camps, A. Volbeda. In: Messerschmidt A, Huber R, Poulos T, Wieghardt K, editors. Handbook of metalloproteins. -2001. -P. 880-96.

[213] Volbeda, A. Structure of the [NiFe] hydrogenase active site: evidence for biologically uncommon Fe ligands / A. Volbeda, E. Garcin, C. Piras, A. L. De Lacey, V. M. Fernandez, E. C. Hatchikian, M. Frey, J. C. J. Fontecilla-Camps // Am. Chem. Soc. -1996. -V. 118. -P. 12989-12996.

[214] Bruunger, A. T. Crystallography & NMR system: a new software suite for macromolecular structure determination / A. T. Bruunger, P. D. Adams, G. M. Clore, W. L. DeLano, P. Gros, R. W. Grosse-Kunstleve, J.-S. Jiang, J. Kuszewski, M. Nilges, N. S. Pannu, R. J. Read, L. M. Rice, T. Simonson, G. L. Warren // Acta. Crystallogr. -1998. -V. 54. -P. 905-921.

[215] Engh, R. A. Accurate bond and angle parameters for X-ray protein structure refinement / R. A. Engh, R. Huber // Acta. Crystallogr. -1991. -V. 47. -P. 392^100.

[216] Amara,P. Ahybrid density functional theory/molecular mechanics study of nickel-iron hydrogenase: investigation of the active site redox states / P. Amara , A. Volbeda , J. C. Fontecilla-Camps , and M^J. Field // J. Am. Chem. Soc. -1999. -V. 121. -P. 4468^1477.

[217] Stein, M. DFT calculations of the electronic structure of the paramagnetic states Ni-A, Ni-B and Ni-C of [NiFe] hydrogenase / M. Stein, W. Lubitz // Phys. Chem. Chem. Phys. -2001. -V. 3. -P. 2668-2675.

[218] Li, S. Modeling the active sites of metalloenzymes. 4. Predictions of the unready states of [NiFe] Desulfovibrio gigas hydrogenase from density functional theory / S. Li, M. B.Hall // Inorg. Chem. -2000.-V. 40.-P. 18-24.

[219] Darensbourg, D. J. Analysis of an organometalliciron site model for the heterodimetallicunit of [NiFe] hydrogenase / D. J. Darensbourg, J. H. Reibenspies, C.-H. Lai, W.-Z. Lee, M. Y. Darensbourg // J. Am. Chem. Soc. -1997. -V. 119. -P. 7903-7904.

[220] Volbeda, A. Novel metal sites in protein structures / A. Volbeda, J. C. Fontecilla-Camps, M. Frey // Curr. Opin. Struct. Biol. -1996. -V. 6. -P. 804-812.

[221] Volbeda, A. Structure-function relationships of nickel-iron sites in hydrogenase and a comparison with the active sites of other nickel-iron enzymes / A. Volbeda, J. C. Fontecilla-Camps // Coordination Chemistry Reviews. -2005. -V. 249. -P. 1609.

[222] Brecht, M. Direct detection of a hydrogen ligand in the [NiFe] center ofthe regulatory H2-sensing hydrogenase from Ralstonia eutropha in its reduced state by HYSCORE and ENDOR spectroscopy / M. Brecht, M. van Gastel, T. Buhrke, B. Friedrich, W. Lubitz // J. Am. Chem. Soc. -2003.-V. 125.-P. 13075-13083.

[223] Foerster, S. Single crystal EPR studies of the reduced active site of [NiFe] hydrogenase from Desulfiovibrio vulgaris Miyazaki / S. Foerster, M. Stein, M. Brecht, H. Ogata, I. Y. Higuch, W. Lubitz // F. J. Am. Chem. Soc. -2003. -V. 125. -P. 83-93.

[224] Vignais, P. M. H/D exchange reactions and mechanistic aspects of the hydrogenases / P. M. Vignais // Coordination Chemistry Reviews. -2005. -V. 249. -P. 1677-1690.

[225] Buhrke, T. Oxygen Tolerance of the H2-sensing [NiFe] Hydrogenase from Ralstonia eutropha HI6 Is Based on Limited Access of Oxygen to the Active Site / T. Buhrke, O. Lenz, N. Krauss, B. Friedric // J. Biol. Chem. -2005. -V. 280. -P. 23791-23796.

[226] Duche, O. Colbeau. Enlarging the gas access channel to the active site renders the regulatory hydrogenase HupUV of Rhodobacter capsulatus 02 sensitive without affecting its transductory activity / O. Duche, S. Elsen, L. Cournac, A. Colbea // FEBS J. -2005. -V. 272. -P. 3899-3908.

[227] Burgdorf, T. The soluble NAD(+)-reducing [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha HI6 consists of six subunits and can be specifically activated by NADPH / T. Burgdorf, E. Linden, M. Bernhard, Q. Y. Yin, J. W. Back, A. F. Hartog, A. O. Muijsers, C. G. Koster, S. P. J. Albracht, B. Friedrich, J. Bacteriol. -2005.-V. 187(9). -P. 3122-3132.

[228] De Lacey, A. L. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies / A, L. Lacey, V. M. Fernandez, M. Rousset, R. Cammack // Chem. Rev. -2007. -V. 107. -P. 4304-4330.

[229] Морозов, С. В. Водородный топливный электрод на основе ферментов: дисс. канд. хим. наук 02.00.15. 03.00.23 / С. В. Морозов. -Москва. МГУ. 2003. 159 с.

[230] Higuchi. Y. Unusual ligand structure in Ni-Fe active center and an additional Mg site in hydrogenase revealed by high resolution X-ray structure analysis / Y. Higuchi, T. Yagi, N. Yasuok // Structure. -1997. -V. 5. -P. 1671-1680.

[231] Matias, P. M. [NiFe] hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774: gene sequencing, three-dimensional structure determination and refinement at 1.8 A and modelling studies of its interaction with the tetrahaem cytochrome сЗ / P. M. Matias, С. M. Soares, L. M. Saraiva, R. Coelho, J. Morais, J. Le Gall, M. A. Carrondo // J. Biol. Inorg. Chem. -2001. -V. 6. -P. 63.

[232] Воронин, О. Г. Высокоэффективный электрокатализ гидрогеназами для конверсии органических отходов в электричество: дисс. канд. хим. наук. 02.00.15. 03.01.06 / О. Г. Воронин. - Москва. МГУ. 2010. 135 с.

[233] Carepo, М. 170 ENDOR Detection of a Solvent-Derived Ni-(OHx)-Fe Bridge That Is Lost upon Activation of the Hydrogenase from Desulfovibrio gigas / M. Carepo, D, L. Tierney, C. D. Brondino, Т. C. Yang, A. Pamplona, J. Telser, I. Moura, J. J. G. Moura, В. M. Hoffman // J. Am. Chem. Soc. -2002. -V. 124-P. 281-286.

[234] Fernandez, V. M. Properties and reactivation of two different deactivated forms of Desulfovibrio gigas hydrogenase / V. M. Fernandez, E. C. Hatchikian, R. Cammack // Biochim. Biophys. Acta. -1985.-V. 832.-P. 69.

[235] Mege, R. M. Nickel controls the reversible anaerobic activation/inactivation of the Desulfovibrio gigas hydrogenase by the redox potential / R. M. Mege , C. Bourdillon // J. Biol. Chem. -1985. -V. 260.-P. 14701-14706.

[236] Jones, A. K. Enzyme electrokinetics: Electrochemical studies of the anaerobic interconversions between active and inactive states of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase / A. K. Jones, S. E. Lamle, H. R. Pershad, K. A. Vincent, S. P. J. Albracht, F. A. Armstrong // J. Am. Chem. Soc. -2003.-V. 125(28).-P. 8505-8514.

[237] Lacey, A. L. FTIR spectroelectrochemical study of the activation and inactivation processes of [Ni-Fe] hydrogenases: effects of solvent isotope replacement and site-directed mutagenesis / A. L. Lacey, A. Pardo, V. M. Fernandez, S. Dementin, G. Adryanczyk-Perrier, E. Claude Hatchikian, M. Rousse, // J. Biol. Inorg. Chem. -2004. -V. 9. -P. 636-642.

[238] Hyman, M. R. Kinetic analysis of the interaction of nitric oxide with the membrane-associated, nickel and iron-sulfur-containing hydrogenase from Azotobacter vinelandii / M. R. Hyman , D. Arp // J. Biochim. Biophys. Acta.-1991.-V. 1076.-P. 165-172.

[239] Dross, F. The quinone-reactive Ni/Fe-hydrogenase of Wolinella succinogenes / F. Dross, V. Geisler, R. Lenger, F. Theis, T. Krafft, F. Fahrenholz, E. Kojro, A. Duchene, D. Tripier, K. Juvenal / Eur. J. Biochem. -1992. -V. 206. -P. 93-102.

[240] Dross, F. The quinone-reactive Ni/Fe- hydrogenase of Wolinella succinogenes / E. Dross, V. Geisler, R. Lenger, F. Theis, T. Krafft, F. Fahrenholz, E. Kojro, A. Duchene, D. Tripier, K. Juvenal // Eur. J. Biochem. -1993. -V. 214. -P. 949-50.

[241] Rodrigue, A. Co-translocation of a periplasmic enzyme complex by a hitchhiker mechanism through the bacterial tat pathway / A. Rodrigue, A. Chanal, K. Beck, M. Muller, L. F. Wu // J. Biol. Chem. -1999. -V. 274. -P. 13223-13228.

[242] Sargent, F. Overlapping functions of components of a bacterial Sec-independent protein export pathway / F. Sargent, E. G. Bogsch, N. R. Stanley, M. Wexler, C. Robinson, B. C. Berks, T. Palmer // EMBO J.-1998.-V. 17.-P. 3640-3650.

[243] Wu, L. F. Membrane targeting and translocation of bacterial hydrogenases / L. F. Wu, A. Chanal, A. Rodrigue // Arch. Microbiol. -2000. -V. 173. -P. 319-324.

[244] Black, L. K. Sequences and characterization of hupU and hupV genes of Bradyrhizobium japonicum encoding a possible nickel-sensing complex involved in hydrogenase expression / L. K. Black, C. Fu, R. J. Maier. // J. Bacteriol. -1994. -V. 176. -P. 7102-7106.

[245] Elsen, S. The hupTUV operon is involved in negative control of hydrogenase synthesis in Rhodobacter capsulatus / S. Elsen, A. Colbeau, J. Chabert, P. M. Vignais // J. Bacteriol. -1996. -V. 178.-P. 5174-5181.

[246] Lenz, O. A hydrogen-sensing system in transcriptional regulation of hydrogenase gene expression in Alcaligenes species / O. Lenz, A. Strack, A. Tran-Betcke, B. Friedrich // J. Bacteriol. -1997.-V. 179.-P. 1655-1663.

[247] Rey, F. E. Regulation of uptake hydrogenase and effects of hydrogen utilization on gene expression in Rhodopseudomonas palustris / F. E. Rey, Y. Oda, C. S. Harwood // J. Bacteriol. - 2006. -V. 188.-P. 6143-6152.

[248] Tamagnini, P. Hydrogenases and hydrogen metabolism of cyanobacteria / P. Tamagnini, R. Axelsson, P. Lindberg, F. Oxelfelt, R. Wunschiers, P. Lindblad // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2002. -V. 66.-P. 1-20.

[249] Ma, K. Hydrogenase of the hyperthermophile Pyrococcus furiosus is an elemental sulfur reductase or sulfhydrogenase: evidence for a sulfur-reducing hydrogenase ancestor / K. Ma, R. N. Schicho, R. M. Kelly, M. W. W. Adams // Proc. Natl. Acad. Sci. -1993. -V. 90. -P. 5341-5344.

[250] Ma, K. Characterization of hydrogenase II from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus and assessment of its role in sulfur reduction / K. Ma, R. Weiss, M.W.W Adams. // J Bacteriol. -2000.-V. 182.-P. 1864-1871.

[251] Burgdorf, T. Structural and oxidation-state changes at its nonstandard Ni-Fe site during activation of the NAD-reducing hydrogenase from Ralstonia eutropha detected by X-ray absorption, EPR, and FTIR spectroscopy / T. Burgdorf, S. Loscher, P. Liebisch, E. V. Linden, M. Galander, F. Lendzian, W. Meyer-Klaucke, S. P. J. Albracht, B. Friedrich, H. Dau, M. Haumann // J. Am. Chem. Soc. -2005. -V. 127. -P. 576-592.

[252] Grzeszik, C. Location, catalytic activity, and subunit composition of NAD-reducing hydrogenases of some Alcaligenes strains and Rhodococcus opacus MR22 / C. Grzeszik, K. Ross, K. Schneider, M. Reh, H. G. Schlegel // Arch. Microbiol. -1997. -V. 167. -P. 172-176.

[253] Schneider, K. Purification and properties of soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H 16 / K. Schneider, H. G. Schlegel // Biochim. Biophys. Acta. -1976. -V. 452. -P. 66-80.

[254] Appel, J. The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis / J. Appel, S. Phunpruch, K. Steinmuller, R. Schulz // Arch. Microbiol. -2000.-V. 173.-P. 333-338.

[255] Stojanowic, A. Physiological role of the F 420-non-reducing hydrogenase (Mvh) from Methanothermobacter marburgensis / A. Stojanowic, G. J. Mander, E. C. Duin, R. Hedderich // Arch. Microbiol. -2003.-V. 180.-P. 194-203.

[256] Steuber, J. Membrane-Bound NAD(P)+-Reducing Hydrogenase Provides Reduced Pyridine Nucleotides during Citrate Fermentation by Klebsiella pneumonia / J. Steuber, W. Krebs, M. Bott, P. Dimrot// J. Bacteriol. -1999. -V. 181.-P. 241-245.

[257] Bohm, R. Nucleotide sequence and expression of an operon in Escherichia coli coding for formate hydrogenlyase components / R. Bohm, M. Sauter, A. Bock // Mol. Microbiol. -1990. -V. 4. -P.231-243.

[258] Tersteegen, A. Methanobacterium thermoautotrophicum encodes two multisubunit membrane-bound [NiFe] hydrogenases. Transcription of the operons and sequence analysis of the deduced proteins / A. Tersteegen, R. Hedderich // Eur. J. Biochem. -1999. -V. 264. -P. 930-943.

[259] Bryant, F. О. Characterization of hydrogenases from the hyperthermophilic Archaebacterium, Pyrococcus furiosus / F. O. Bryant, M. W. W. Adams // J. Biol. Chem. -1989. -V. 264. -P. 5070-5079.

[260] Takacs, M. Formate hydrogenlyase in the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus litoralis / M. Takacs, A. Toth, B. Bogos, A. Varga, G. Rakhely, K. L. Kovacs // BMC Microbiol. -V. -2008. -V. 8.-P. 88-100.

[261] Тернера, Э. Биосенсоры / под ред. Э. Тернера, И. Краубе, Д. Уилсона -М.: Мир. -1992. -615 с.

[262] Bullen, R. A. Walsh. Biofuel cells and their development / R. A. Bullen, Т. C. Arnot, J. B. Lakemanc, F. C. Biosen // Bioel. -2006. -V. 21. -P. 2015-2045.

[263] Хуснутдинова, A. H. Генетические подходы к изучению гидрогеназы HydSL пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina: дис. к. б. наук: 03.01.04 / Хуснутдинова, А. Н. -Пущино. -2012. - 102 с.

[264] Armstrong, F. A. Direct electrochemistry of redox proteins / F. A. Armstrong, H. A. O. Hill, N. J. Walton // Acc. Chem. Res. -1988. -V. 21. -P. 407.

[265] Barton, S. Enzymatic Biofuel Cells for Implantable and Microscale Devices / S. Barton, J. Gallaway, P. Atanassov // Chem. Rev. -2004. -V. 104. -P. 4867-4886.

[266] Marcus, R. A. Electron transfers in chemistry and biology / R. A. Marcus , N. Sutin // Biochim. Biophys. Acta. -1985.-V. 811.-P. 265-322.

[267] Pizzariello, A. A glucose/hydrogen peroxide biofuel cell that uses oxidase and peroxidase as catalysts by composite bulk-modified bioelectrodes based on a solid binding matrix / A. Pizzariello, M. Stredansky, S. Miertu // Bioelectrochemistry. -2002. -V. 56(1-2). -P. 99-105.

[268] Bartlett, P. N. Theoretical treatment of diffusion and kinetics in amperometric immobilized enzyme electrodes Part I: Redox mediator entrapped within the film / P. N. Bartlett, K. F. E. Pratt // J. Electroanal. Chem. -1995. -V. 397(1-2). -P. 61-78.

[269] Palmore, G. T. R. A methanol/dioxygen biofuel cell that uses NAD+-dependent dehydrogenases as catalysts: application of an electro-enzymatic method to regenerate nicotinamide adenine dinucleotide at low overpotentials / G, T. R. Palmore, H. Bertschy, S. H. Bergens, G. Whitesides // J. Electroanal. Chem. -1998.-V. 443(1).-P. 155-161.

[270] Tsujimura, S. Bioelectrocatalysis-based dihydrogen/dioxygen fuel cell operating at physiological pH / S. Tsujimura, M. Fujita, H. Tatsumi, К. Капо, T. Iked // Phys. Chem. -2001. -V. 3(7). -P. 13311335.

[271] Кондратьева, Е. Н. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов / Е. Н. Кондратьева, И. Н. Гоготов. 1981, М.: Наука. С. 342.

[272] Yagi, Т. New Assay Method For Hydrogenase Based On an Enzymic Electrode-Reaction -Enzymic Electric Cell Method / T. Yagi, M. Goto, K. Nakano, K. Kimura, H. Inokuch, // J. Biochem. -1975. -V. 78(3). -P. 443-454.

[273] Ikeda, T. Electrochemical control of hydrogenase action of Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) / T. Ikeda, K. Takagi, H. Tatsumi, K. Kano // Chem. Lett. -1997. -V. 3. -P. 5-6.

[274] Cooney, M. J. Enzyme catalysed biofuel cells / M. J. Cooney, V. Svoboda, C. Lau, G. Martina, S. D. Minteer// Energy Environ. Sci. -2008. -V. 1. -P. 320-337.

[275] Cosnier, S. Biosensors based on immobilization of biomolecules by electrogenerated polymer films - New perspectives / S. Cosnie // Appl. Biochem. Biotech. -2000. -V. 89(2-3). -P. 127-138.

[276] Mousty, C. Electrogeneration of a hydrophilic cross-linked polypyrrole film for enzyme electrode fabrication. Application to the amperometric detection of glucose / C. Mousty, B. Galland, S. Cosnier //Electroanalysis. -2001.-V. 13(3).-P. 186-190.

[277] Martinek, K. Micellar enzymology - catalytic activity of peroxidase in colloid solution of water in an organic - solved / K. Martinek, N.L. Klyachko, A.V. Levashov, I.V. Berezin // Dokl. Akad. Nauk. -1983. -V. 263. -P. 491.

[278] Пшежецкий, А. В. Моделирование мембранного окружения ферментов: суперактивность лакказы, включенной в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях / А. В. Пшежецкий, Ш. Меркер, Н. J1. Клячко, Г. С. Пепанян, К. Мартинек, А. В. Левашов//Биохимия. -1988.-Т. 53.-С. 1013-1016.

[279] Moore, С. М. Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides / С. M. Moore, N. L. Akers, A. D. Hill, Z. C. Johnson, S. D. Minteer // Biomacromolecules. -2004. -V. 5. -P. 1241-1247.

[280] Frew, J. E. Direct and indirect electron transfer between electrodes and redox proteins / J. E. Frew, H. A. O. Hill // European J. Biochem. -1988. -V. 172. -P. 261-269.

[281] Allen, P. M. Surface modifiers for the promotion of direct electrochemistry of cytochrome с / P. M. Allen, H. A. O. Hill, N. J. Walton // J. Electroanal. Chem. -1984. -V. 178. -P. 69-86.

[282] Guo, L. H. Direct electrochemistry of proteins and enzymes / L. H. Guo, H. A. O. Hill // Adv. Inorg. Chem. -1991.-V. 36.-P. 341-375.

[283] Draoui, K. Electrochemical Investigation of Intermolecular Electron-Transfer Between Two Physiological Partners - Cytochrome-C3 and Immobilized Hydrogenase From Desulfovibrio-

Desulfuricans Norway / K. Draoui, P. Bianco, J. Haladjian, F. Guerlesquin, M. Brusch, // J. Electroanal. Chem. -1991. -V. 313. -P. 1-2. -P. 201-214.

[284] Butt, J. N. Direct electrochemistry of Megasphaera elsdenii iron hydrogenase - Definition of the enzyme's catalytic operating potential and quantitation of the catalytic behaviour over a continuous potential range / J. N. Butt, M. Filipiak, W. R. Hagen // European J. Biochem. -1997. -V. 245. -P. 116-122.

[285] Bianco, P. Electrocatalytic Hydrogen-Evolution At the Pyrolytic-Graphite Electrode in the Presence of Hydrogenase / P. Bianco, J. Haladjian // J. Electrochem. Soc. -1992. -V. 139(9). -P. 2428-2432.

[286] Volbeda, A. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas / A. Volbeda, M. H. Charon, C. Piras, E. C. Hatchikian, M. Frey, J. C. Fontecilla-Camps //Nature. -1995. -V. 373.-P. 580-587.

[287] Volbeda, A. Structure of the [NiFe] hydrogenase active site: Evidence for biologically uncommon Fe ligands / A. Volbeda, E. Garcia, C. Piras, A, L. deLacey, V. M. Fernandez, E. C. Hatchikian, M. Frey, J. C. Fontecilla-Camps // J. Am. Chem. Soc. -1996. -V. 118 (51). -P. 1298912996.

[288] Moreno, C. Voltammetric Studies of the Catalytic Electron-Transfer Process Between the Desulfovibrio-Gigas Hydrogenase and Small Proteins Isolated From the Same Genus / C. Moreno, R. Franco, I. Moura, J. Legall, J. J. G. Moura // European J. Biochem. -1993. -V. 217(3). -P. 981-989.

[289] Leger, C. Enzyme electrokinetics: Hydrogen evolution and oxidation by Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase / C. Leger, A. K. Jones, W. Roseboom, S. P. J. Albracht, F. A. Armstrong//Biochem. -2002.-V. 41(52).-P. 15736-15746.

[290] Armstrong, F. A. Dynamic Electrochemistry of Iron-Sulfur Proteins / F. A. Armstrong // Adv. Inorg. Chem. -1992.-V. 38.-P. 117-163.

[291] Willner, I. Electrical Wiring of Glucose Oxidase by Reconstitution of FAD-Modified Monolayers Assembled onto Au-Electrodes / I. Willner, V. Heleg-Shabtai, R. Blonder, E. Katz, G. Tao, A. F. Buckmann, A. Heller// J. Am. Chem. Soc. -1996. -V. 118. -P. 10321-10322.

[292] Gerard, M. Application of conducting polymers to biosensors / M. Gerard, A. Chaubey, B. D. Malhotra // Biosens. Bioelectron. -2002. -V. 17. -P. 345-359.

[293] Heller, A. Electrical wiring of redox enzymes / A. Helle // Acc. Chem. Res. -1990. -V. 23. -P. 128-134.

[294] Asatiani, V. Enzymatic methods of analysis / V. Asatian // M. Nauka, 1969. -P. 739.

[295] Hanson, R. Chemical composition of bacterial cell: in Gerhardt P, editor, anual of methods for general bacteriology // Hanson R., Phillips G. M.: Mir; -1984. -150 p.

[296] Гоготов, И. H. Метаболизм водорода и способность к азотфиксации у Thiocapsa roseopersicina / И. H. Гоготов, H. А. Зорин, JI. В. Богоров // Микробиологияю. -1974. -Т. 43(1). -С. 5-10.

[297] Шерман, М. Б. Структура микрокристаллов гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina / M. Б. Шерман, Е. В. Орлова, Е. А. Смирнова, Н. А. Зорин, И. В. Тагунова, И. П. Куранова, И. Н. Гоготов // Биофизика. -1987. -Т. 295(2). -С. 509-512.

[298] Гоготов, И. Н. Очистка и свойства гидрогеназы из фототрофной бактерии Thiocapsa roseopersicina / И. H. Гоготов, H. А. Зорин, Е. Н. Кондратьева // Биохимия. -1976. -Т. 41(5). -С. 836-842.

[299] Задворный, О. А. Окислительно - восстановительные взаимодействия гидрогеназ фототрофных бактерий с металлами: дисс. к. б. наук: 02.00.15. 03.00.23 / Задворный, О. А. -Пущино. -2004. -105 с.

[300] Patil, D. Nickel-iron-selenium hydrogenase Meth / D. Patil // Enzymol. -1994. -V. 243. -P. 6894.

[301] Цыганков, А. А. Об измерении pH- зависимости активности гидрогеназ / А. А. Цыганков, Е. А. Минаков, Н. А. Зорин, К. С. Гостева, О. Г. Воронин, А. А. Карякин // Биохимия. -2007. -Т. 72(9).-С. 1189 - 1195.

[302] Alonso-Lomillo, M. A. Hydrogenase-Coated Carbon Nanotubes for Efficient H2 Oxidation / M. A. Alonso-Lomillo, О. Rudiger, A. Maroto-Valiente, M. Velez, I. Rodriguez-Ramos, F. J. Muñoz, V. M. Fernandez, A. L. Lacey //Nano Lett. -2007. -V. 7(6). -P. 1603-1608.

[303] Карякин, А. А. Каталитические свойства гидрогеназ / А. А. Карякин, С. Д. Варфоломеев // Усп. хим.-1986.-В. 55(9).-С. 1524-1549.

[304] Ярополов, А. И. Биоэлектрокатализ. Механизм окисления молекулярного водорода на электроде с иммобилизованной гидрогеназой / А. И. Ярополов, А. А. Карякин, И. Н. Гоготов, Н. А. Зорин, С. Д. Варфоломеев, И. В. Березин // Физ. хим. -1984. -В. 274(6). -С. 1434-1437.

[305] Wang, С. Н. Continuous biohydrogen production from starch with granulated mixed bacterial microflora / C. H. Wang, J. S. Chang // Energy and Fuels. -2008. -V. 22. -P. 93-97.

[306] Yu, H. Q. Biological production in a UASB reactor with granules. II: Reactor performance in 3-year operation / H. Q. Yu, Y. Mu // Biotechnol. Bioeng. -2006. -V. 94 -P. 998-995.