Деструкция аминоароматических веществ анаэробными микробными сообществами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Линькова, Юлия Валерьевна

• Линькова, Юлия Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Линькова, Юлия Валерьевна

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9 3.1. Метаболизм ароматических соединений

3.1.1. Аэробная деградация

3.1.2. Анаэробная деградация

3.1.3. Альтернативный (гибридный) путь деградации

3.2 Микроорганизмы, анаэробно расщепляющие аминоароматические 13 субстраты

3.2.1. Чистые культуры

3.2.2. Микробные сообщества

3.2.2.1. Синтрофные взаимодействия

3.2.2.2. Сложность и устойчивость микробных сообществ

3.2.2.3. Консорциумы микроорганизмов, разрушающие 22 ароматические вещества, и их трофическая структура

3.3. Влияние различных факторов на структуру сообщества

3.3.1. Природа субстрата и состав среды

3.3.2. Температура

3.3.3. Изменение состава сообщества во времени

3.4 Пространственная структура анаэробных сообществ, разлагающих 31 вещества-загрязнители

3.4.1. Образование анаэробных агрегатов и их влияние на процессы 31 деградации

3.4.2. Каналы как важная структура микробных агрегатов 34 3.5. Современные методы анализа состава микробных сообществ 35 3.6 Заключение

4. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 43 5.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

5.1.1. Источники биологического материала

5.1.2. Использованные реактивы

5.1.3. Условия культивирования

5.1.4. Выделение чистых культур из анаэробных сообществ

5.1.5. Молекулярно-биологические методы

5.1.5.1. Выделение ДНК

5.1.5.2. ПЦР-амплификация

5.1.5.3. Разделение ПЦР-продуктов методом ДГГЭ

5.1.5.4. Секвенирование ДНК-фрагментов

5.1.6. Аналитические методы

5.1.6.1. Определение концентраций субстратов и продуктов их 51 деградации

5.1.6.2. Определение токсичности ароматических субстратов в 53 анаэробных условиях

5.1.6.3. Определение содержания белка

5.1.6.4. Определение аммоний-ионов

5.1.6.5. Определение содержания лактата

5.1.6.6. АР1-тесты

5.1.7. Микроскопические методы

5.1.7.1. Световая микроскопия

5.1.7.2. Электронная сканирующая микроскопия 55 5.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5.2.1. Получение накопительных культур, использующих в своём 56 метаболизме аминоароматические вещества

5.2.1.1. Схемы получения накопительных культур

5.2.1.2. Накопительные культуры, выделенные из илов 60 очистных сооружений

Накопительная культура

Накопительная культура Р

Накопительная культура ЕР

5.2.1.3. Накопительные культуры, выделенные из естественных 64 мест обитания

Накопительные культуры из донных отложений 64 реки Джамна (Индия)

Накопительные культуры, полученные из донных 66 отложений озера Цайдам (Бурятия) 5.2.2. Свойства выделенных активных и стабильных накопительных культур

5.2.2.1. Культуральные признаки, морфология агрегатов и микроскопическая картина активных накопительных культур в сравнении с неактивными 5.2.2.2. Определение роли небиологических факторов (физико- 71 химических параметров) в процессе деградации ксенобиотиков. Токсичность использованных аминоароматических субстратов

Адсорбция

Гидродинамические условия (перемешивание) 73 Температура, освещенность, рН, аминоароматический субстрат

Токсичность использованных аминоароматических субстратов

5.2.3. Общая характеристика процесса биодеструкции 88 аминоароматических субстратов

5.2.4. Стимуляция процесса деградации при добавлении 90 дополнительных источников углерода и энергии

5.2.5. Интермедиаты процесса биодеструкции аминоароматических 92 кислот и возможности использования сообществами других ароматических субстратов

5.2.5.1. Идентификация интермедиатов процесса- и 92 трансформация других ароматических веществ

5.2.5.2. Токсичность интермедиатов процесса биодеградации 98 аминобензойных кислот

5.2.5.3. Влияние пирувата на процесс деструкции 100 интермедиатов анаэробной биоконверсии аминобензойных кислот

5.2.5.4. Определение биохимического пути деструкции 106 аминоароматики

5.2.6. Пространственная организация и компонентный состав активных 109 сообществ

5.2.6.1. Морфотипы клеток, изменение микроскопической 109 картины на разных стадиях процесса, смена доминирующих видов

5.2.6.2. Агрегирование микробного сообщества

5.2.6.3. Функциональные группы микроорганизмов в 117 выделенных накопительных культурах

5.2.6.4. Бесспоровые микроорганизмы-члены сообщества и их 120 возможные функции в процессе

5.2.6.5. Гетеротрофные микроорганизмы в сообществе

5.2.6.6. Филогенетический анализ состава сообществ

5.2.7. Выделение чистых культур микроорганизмов, входящих в 129 микробные сообщества, разрушающие аминоароматику

5.2.7.1. Особенности выделения чистых культур с учётом их 129 функционирования в составе синтрофных анаэробных микробных сообществ

5.2.7.2. Систематическое положение и свойства выделенных 131 чистых культур

Штамм Tsaydam-5 - AS А

Штамм ЕР-ABA

Штамм ЕР-АВА

Штамм L

Штамм L-43.

5.2.7.3. Определение роли выделенных культур в едином 141 процессе деструкции аминоароматики

Определение роли выделенных лактобацилл в 141 процессе биоразложения ароматических аминов и пищевых азокрасителей

Определение роли штамма ЕР-ABA в процессе 146 биоразложения ароматических аминов

Определение роли штамма ЕР-АВА2 в процессе 148 биоразложения ароматических аминов

Определение роли штамма Tsaydam-5-ASA в 149 процессе биоразложения ароматических аминов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Деструкция аминоароматических веществ анаэробными микробными сообществами»

С развитием химической промышленности в биосферу стало поступать более тысячи различных ксенобиотиков, которые в значительной степени её загрязняют. Известно, что соединения, вносимые человеком в окружающую среду в последнее время (инсектициды, гербициды, детергенты и другие ксенобиотики), помимо того, что очень токсичны, ещё и весьма устойчивы, что представляет опасность для человека и животных (Carmona et al., 2009). В 'настоящее время нагрузка на естественные процессы самоочищения биосферы является избыточной, поэтому параллельно с незначительной деструкцией загрязнений идёт их постепенное накопление в окружающей среде. Деградация ксенобиотиков микроорганизмами является одним из важных направлений защиты биосферы.

Многие ксенобиотики по своей химической природе являются ароматическими веществами. Так, например, некоторые пестициды представляют собой феноксиалкановые кислоты (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота—-2,4-D), встречаются и хлорорганические соединения (пентахлорфенол, дихлордифенилтрихлорэтан — DDT), карбаматы (пестициды на основе анилина), триазины (Скрябин, Головлёва, 1974). Ежегодно в крупных масштабах мировой химической промышленностью производятся и алкилбензолсульфонаты, которые служат основой для производства широкого спектра моющих средств (Щербакова, 2000). Помимо этого, ароматические соединения используются в производстве фармацевтических препаратов, лакокрасочных материалов, красителей, взрывчатых веществ (Березин, Березин, 2001; Razo-Flores et al., 2007а). Ароматические соединения являются одними из наиболее токсичных и устойчивых загрязняющих веществ (Carmona et al., 2009). Термодинамическая стабильность бензольного кольца обусловливает устойчивость к химическому разложению соединений ароматического ряда в окружающей среде и, следовательно, их большую опасность для биосферы (Хоменков и др., 2008; McLeod, Eltis, 2008). Значительная роль в деградации этих соединений принадлежит микроорганизмам (Остроумов, 1986; Щербакова, 2000; Diaz, 2004). Благодаря огромному генетическому разнообразию, метаболической пластичности, высокой скорости размножения наряду со способностью к горизонтальному переносу генов микроорганизмы способны вовлекать в свой метаболизм вещества неприродного происхождения, развиваться и адаптироваться к быстро изменяющимся условиям внешней среды даже в экстремальных условиях, в которых не способны выжить другие живые организмы (Хоменков и др., 2008).

В настоящее время результаты исследований по биодеградации загрязнений учитываются при разработке различных очистных сооружений. Биологические методы очистки сточных вод имеют ряд преимуществ: относительно небольшие эксплуатационные расходы; надёжность очистки, обусловленная практически полным разрушением растворённых в воде органических веществ; получение безвредных для окружающей среды отходов (Гвоздяк и др., 1985). Анаэробная очистка в ряде случаев предпочтительнее аэробной с экономической точки зрения: 1) не требует принудительного подвода кислорода и дополнительных питательных веществ-источников азота и фосфора; 2) даёт значительно меньшее накопление биомассы микроорганизмов и ведёт к образованию полезного продукта — биогаза; 3) характеризуется высокой скоростью отмирания патогенной микробиоты; 4) образующийся и быстро уплотняющийся осадок может быть использован в сельском хозяйстве как органическое удобрение; 5) процесс возможно проводить в концентрированных стоках (Заварзин, 1985; Trosch, Chmiel, 1985; Ditchfield, 1986). Кроме того, аэробная минерализация ароматических соединений имеет и ряд других ограничений: 1) ароматические соединения способны реагировать с молекулярным кислородом, что может вызвать последующую полимеризацию веществ (особенно для фенолов и др.); 2) ароматические соединения понижают поверхностное натяжение водных растворов и, следовательно, могут являться причиной неконтролируемого пенообразования в аэрируемых резервуарах; 3) разложение некоторых ароматических соединений в аэробных условиях происходит менее эффективно, чем в анаэробных (например, нитро- и азопроизводных); 4) некоторые ароматические соединения летучи и токсичны, а значит, могут вызывать проблемы с загрязнением воздуха (Савельева и др., 2003).

Для очистки почв, атмосферы, сточных вод используются биореакторы различных технологических типов: аэробный, анаэробный и гибридный, включающий анаэробную и аэробную стадии (Deriell et al., 1999). Как правило, в реакторах используются естественно сложившиеся консорциумы микроорганизмов. В консорциумах микроорганизмов наблюдается комбинация катаболических возможностей, благодаря чему происходит полное разрушение вещества, недоступное чистым культурам микроорганизмов из-за термодинамических ограничений. В состав консорциумов, участвующих в анаэробной очистке сточных вод с высоким содержанием вредных органических веществ, входят гидролитические, ацидогенные и метаногенные микроорганизмы (Satoh et al., 2007):

Деградацию веществ, загрязняющих окружающую среду, изучают уже несколько десятилетий, в результате чего очень подробно исследованы биохимические и молекулярно-биологические аспекты метаболизма (Head, 1998; Harwood et al., 1999; 8

Schink et al., 2000; Boll, 2005; Heider, 2007; Fuchs, 2008; Хоменков и др., 2008; Carmona et al., 2009). Несмотря на то, что сложившиеся естественным путём сообщества микроорганизмов активно используют при очистке промышленных сточных вод, при их изучении практически не уделяют внимания структуре (т.е. пространственной организации, трофическим связям, видовому составу) этих сообществ. Литературные данные, касающиеся этого аспекта проблемы, очень разрозненные и отрывочные. На данный момент времени мало известно о структуре микробных консорциумов, разрушающих токсичные органические вещества, в частности, ароматические соединения: не выявлены таксономическое положение и функции отдельных компонентов, их связи между собой и пространственное расположение микроорганизмов-партнеров.

Приведенный ниже обзор обобщает и анализирует немногочисленные литературные данные относительно различных аспектов структуры сообществ микроорганизмов, разлагающих ароматические вещества.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Метаболизм ароматических соединений

Разложение ароматических субстратов может происходить несколькими различными путями. 3.1.1. Аэробная деградация

Деароматизация в аэробных условиях является хорошо изученным и давно описанным процессом (Dagley, 1971; Dagley, 1986; Harayama et al., 1992; Harwood, Parales, 1996), который протекает при участии ферментов—моно- и диоксигеназ, катализирующих включение кислорода в молекулу субстрата (рис.1).

Монооксигеназы

О,

2[hj Н20

Жг«0

Диоксигеназь, Q —► ^—► —► ^CD0H j4G«0

Рис.1. Реакции с участием моно- и диоксигеназ в аэробном метаболизме ароматических веществ (модифицировано по Fuchs, 2008).

Бензольное кольцо образовавшихся центральных интермедиатов содержит либо две гидроксильные группы, расположенные рядом, либо гидроксильную группу рядом с карбоксильной, как, например, в катехоле (1,2-дигидроксибензоле), протокатехоате (3,4-дигидроксибензоате) и гентизате, или 2,5-дигидроксибензоате (Fuchs, 2008). Затем эти гидроксилированные субстраты подвергается либо орто- (между двумя гидроксильными группами), либо мета- (рядом с одной из гидроксильных групп) расщеплению, приводящему к раскрытию бензольного кольца (рис.2).

СОО"

С^Хон

Катехол орто^/ \мета

С соо' соо" о н СОО"

LA„

Протокатехоат орто / \ Мета

7 X н оос

СОО' СОО" оос V

Y соо

СОО'

ОН

НО о СОО" X соо

KJ

Рис.2. Пути расщепления бензольного кольца при аэробной деструкции (модифицировано по Cao et al., 2009).

Продуктами служат СОг, пируват и ацетат, которые далее метаболизируются до СО2 и Н2О (Хоменков и др., 2008).

3.1.2. Анаэробная деградация

В анаэробных условиях происходят более сложные процессы, протекающие в несколько этапов: активирование бензольного кольца, его разрыв, образование Ci- и С2-соединений. В литературе описаны три различных пути конверсии ароматических соединений в анаэробных условиях, отличающиеся основными ароматическими интермедиатами. Этими интермедиатами являются бензоат, резорцин и флороглюцин (рис. 3, 4). т

БенхнлоЕын опфт сося т»

Фенол у 6и

ССОИ

П*Р«°Л Аннлнк 1 Б ею альдегид " / 4-атннобеюоат соон

Фшдрохснбекюат

50-saA

CO-SCei Щ он

Бензоат 1

C0-SC4A

Беюокл-КоА Л

Толуол i^cacH О

Беммлсукцнмат

Рис.3. Периферические пути анаэробной деградации ароматических соединений, ведущие к образованию центрального интермедиата - бензоил-КоА (модифицировано по Heider, Fuchs, 1997). он

Гздлок^я кислоте

Он ф" т сода

ОН Гамма-реюраднноваяккслота. О

I Пирогаллол Гцфиашцфояшок i 1

Eeia-peivpimiDiH кксло-ra

Рис.4. Периферические пути анаэробной конверсии некоторых ароматических веществ, ведущие к образованию резорцина и флороглюцинола (модифицировано по Heider, Fuchs, 1997).

В настоящее время наиболее распространенным в мире микробов считают бензоил-КоА-путь разложения ароматических соединений, центральным интермедиатом которого является бензоил-КоА (рис.3, 5), а конечным продуктом—ацетил-КоА (Heider, Fuchs, 1997; Fuchs, 2008; Carmona et al., 2009).

Раскрытию бензольного кольца может предшествовать отщепление различных заместителей, таких как метоксил (Bache, Pfennig, 1981; Krumbolz, Bryant, 1985), гидроксил (Szewzyk et al., 1985; Young, Rivera, 1985), метил (Bossert, Young, 1986), карбоксил (Scheline, 1966; Tschech, Schink, 1986) или атом галогена (Sulfita et al., 1982).

Рис.5. Бензош-КоА-путъ анаэробной деградации ароматических веществ (модифицировано по Fuchs, 2008).

3.1.3. Альтернативный (гибридный) путь деградации

У факультативных аэробов был также описан альтернативный, т.н. гибридный путь конверсии ароматических субстратов (Fuchs, 2008), совмещающий в себе признаки обоих путей (рис. 6). Гидроксильные группы вводятся в кольцо при участии молекулярного кислорода, как в случае классического аэробного пути, в то же время происходит и восстановление бензольного кольца, и интермедиаты существуют в форме КоА-эфиров, как в случае анаэробного бензоил-КоА пути. Расщепление кольца также не требует участия кислорода.

Реакции Ферменты Гены 5

At*

-(»A JW

V * icac Ô

М11ГИtr ШН1 \ /*.

O, г crac«*; a

COSCtA tc&tm

-óC

СКОЛ ne^Jt № V/ h

COOH рп W

Сукщшил- Ко A r» ntcw Y xoo- Ацетил-Ko A

Рис.6.Гибридный аэробный путь метаболизма бензоата, реализуемый некоторыми денитрифицирующими бактериями (модифицировано по Fuchs, 2008).

Денитрифицирующие микроорганизмы, а также, возможно, и другие (Fuchs, 2008) сначала преобразуют фенилацетат (Luengo et al., 2001; Mohamed et al., 2002), бензоат (Zaar et al., 2001) или 2-аминобензоат (Langkau et al., 1990; Schuhlc et al., 2001) в соответствующие КоА-эфиры. Бензоил-КоА и фенилацетил-КоА затем трансформируются при участии диоксигеназ (оксидоредуктаз) в соответствующие неароматические цис-дигидродиолы. Обь л но такие интермедиаты повторно восстанавливают свою ароматическую структуру, образуя дигидроксилированные ароматические продукты, В данном случае этерификация карбоксильной группы способствует последующему расщеплению ароматического кольца без участия кислорода. В случае антраниловой кислоты 2-аминобензоил-КоА превращается в моногидроксилированный неароматический интермеди ат. Последующая реакция расщепления кольца пока не изучена (Fuchs, 2008). Альтернативный путь может быть выгодным при колебании содержания кислорода во внешней среде. Реализация этого пути способствует гибкой и быстрой адаптации микроорганизмов к изменяющимся концентрациям кислорода (Fuchs, 2008).

3.2.Микроорганизмы, анаэробно расщепляющие аминоаромагичсские субстраты 3.2.1. Чистые культуры

Аминоароматические вещества могут использоваться микроорганизмами в качестве источников углерода и/или энергии. Микроорганизмы, разрушающие аминоароматику в анаэробных условиях, принадлежат к различным таксономическим группам бактерий; среди архей деструкторы аминоароматических соединений пока не обнаружены (Савельева и др., 2003).

Большая часть изученных деструкторов аминоароматики принадлежит к денитрифицирующим бактериям (табл. 1).

Таблица 1.

Чистые культуры микроорганизмов, расщепляющие различные изомеры аминоароматических соединений.

Микроорган изм Аминоароматический субстрат Морфологические особенности Ссылка

Исполъзуется/условия использования Не используется

Thauera aromatica К 172 2-АБК/денигрифиц., 2-АБК, 4-АБК/аэроб. 3-АБК подвижные грамотрицатель-ные палочки Heider et al., 1998

Azoarcus evansii 2-АБК/денитриф., 2-АБК, 4-АБК/аэроб. анилин подвижные грамотрицатель-ные палочки Heider et al., 1998

Thauera chlorobenzoica 3-CB-l,3-BBl, 4-FB1, 4-FB2 3 - АБК/денитриф. нет данных подвижные грамотрицатель-ные палочки Song et al., 2001

Magnetospirillum sp. CC-26 2-АБК, 3-АБК/ денитриф. 4-АБК спирально закрученные, грамотрицатель-ные клетки с биполярными ~ жгутиками Shinoda et al., 2000

Delftia sp. HY99 Анилин/денитриф., аэроб. нет данных подвижные, грамотрицатель- ные, палочковидные клетки. Kahng et al., 2000

Pseudomonas aeruginosa ASA2 2-, 3-, 4-АБК, 4-АСК, 5-АСК/денитриф., 2-АБК/аэроб. нет данных подвижные грамотрицатель-ные прямые палочки Савельева и др., 2003

Desulfobacterium sp. mABl 3-АБК, 4-АБК/ сульфатредуц. 2-АБК неподвижные грамотрицатель-ные короткие палочки Schnell and S chink, 1991

Desulfobacterium 2-АБК, 4-АБК, 3-АБК неподвижные Schnei et anilini анилин/сульфатредуц. короткие палочки al., 1989

Citrobacter freundii WA1 3-АБК, 5-АСК/ метаногенн. 2-АБК, 4-АБК, 4-АСК подвижные грамотрицательные прямые или слегка изогнутые палочки Савелье ва и др., 2003

Rhodopseudomo-nas palustris 4-АБК, 4-аминофенол/ фототроф., анаэроб. нет данных подвижные грамотрицательные прямые палочки Khanna et al., 1992

Ранее исследованные штаммы денитрификаторов на основании физиологических и морфологических характеристик классифицировали как представителей рода Pseudomonas, штаммы К172 (Tschech, Fuchs, 1987) и КВ740 (Braun, Gibson, 1984). Затем они были описаны как Thauera aromatica и Azoarcus evansii, соответственно (Anders et al., 1995). Данные микроорганизмы представляют собой подвижные грамотрицательные палочки, являются мезофилами и нейтрофилами. Содержание ГЦ-пар в ДНК у Thauera aromatica и Azoarcus evansii составляет 67,0 и 67,5 мол.%, соответственно. Оба микроорганизма способны к росту как в аэробных, так и в нитратредуцирующих условиях. Денитрификация протекает в основном с образованием N2O (Anders et al., 1995). Azoarcus evansii в присутствии нитрата способен к разложению 2-аминобензоата, бензоата, пара-крезола, толуола, 3- и 4-гидроксибензоата, 2-фторбензоата, фталата, бензальдегида, бензилового спирта. В аэробных условиях данный микроорганизм расщепляет 2- и 4-аминобензоат (Tschech, Fuchs, 1987; Anders et al., 1995). Thauera aromatica в нитратредуцирующих условиях способен к расщеплению 2-аминобензоата, толуола, фенола, бензальдегида, бензилового спирта, иара-крезола, фенилацетата, бензоата, 3,5-дигидроксибензоата, 3-й 4-гидроксибензоата. В качестве единственного источника углерода и энергии Thauera aromatica может использовать 2-аминобензойную кислоту (Braun, Gibson, 1984; Anders et al., 1995).

Из накопительной культуры, расщепляющей хлорбензоат, был выделен штамм

ЗСВ-1, описанный как Thauera aromatica, геномовар chlorobenzoica, способный к росту на

3-аминобензоате в денитрифицирующих условиях (Song et al., 2000а). Данный штамм представляет собой подвижные грамотрицательные палочки с оптимальными для роста температурой 30°С и pH 7,5-8. Содержание ГЦ-пар в ДНК составляет 68,6 %. Штамм

ЗСВ-1 может использовать в качестве источников углерода и энергии 3-хлорбензоат, 3бромбензоат, 2- и 4-фторбензоаты, бензоат, бензиловый спирт, 3-й 4-гидроксибензоаты,

15 пирокатехат, мета- и пара-крезолы. Наряду с другими штаммами (ЗВВ1, 4FB1, 4FB2), способными расти на 3-аминобензоате в денитрифицирующих условиях (Song et al., 2000b), штамм ЗСВ-1 выделен в новый вид Thauera chlorobenzoica (Song et al., 2001).

Также была обнаружена денитрифицирующая спирилла, штамм СС-26, расщепляющая целый ряд ароматических субстратов (Shinoda et al., 2000). Этот штамм относится к альфа-протеобактериям и близок к роду Magnetospirillum как по морфологии, так и по результатам сиквенса 16S- рРНК. Клетки штамма СС-26 спирально закручены, грамотрицательны и имеют биполярные жгутики. В денитрифицирующих условиях данный штамм в качестве источника углерода способен использовать 2- и 3-аминобензоаты, разлагать бензальдегид, бензоат, бензиловый спирт, яаря-крезол, 3- и 4-гидроксибензоаты, фенол и фенилацетат. В аэробных условиях штамм СС-26 не может расти на изомерах аминобензойной кислоты.

Выделен штамм HY99, способный расщеплять анилин как в денитрифицирующих, так и в аэробных условиях (Kahng et al., 2000). Штамм HY99 представляет собой подвижные, грамотрицательные, палочковидные клетки. По результатам филогенетического анализа данный- микроорганизм наиболее близок к виду Delftia acidovorans.

Из метаногенного сообщества, выделенного из мезофильного флокулярного ила очистных сооружений, обрабатывающего стоки свиноферм и разрушающего как 5-АСК, так и 2-АБК, был выделен мезофильный штамм ASA-2, идентифицированный как Pseudomonas aeruginosa (Савельева и др., 2003). Клетки штамма представляют собой: грамотрицательные прямые подвижные палочки. Содержание ГЦ-пар в ДНК данного штамма составляет 67,0 мол.%. Выделенный штамм одновременно с гетеротрофным ростом в денитрифицирующих условиях на среде, содержащей пируват или некоторые аминокислоты (гистидин, алапин, аспартат), осуществлял трансформацию изомеров аминобензойной кислоты (орто-, мета- и пара-), 4- и 5-аминосалициловой кислот. Данный штамм был- способен к аэробной конверсии 2-аминобензойной кислоты.

В группе сульфатредуцируюших микроорганизмов также присутствуют деструкторы аминоароматики. Desulfobacterium sp. mABl способна расщеплять 3- и 4-аминобензоат до ацетата и СО2 (Schnell, Schink, 1991). Это неподвижная грамотрицательная короткая палочка, мезофил с оптимальным для роста рН среды 7,0-7,5.

Другой сульфатредуктор, Desulfobacterium anilini, разлагает анилин в анаэробных условиях с образованием 4-аминобензоата в качестве промежуточного продукта (Schnell et al., 1989). Клетки данного организма представляют собой короткие неподвижные палочки, с оптимальным рН для роста 6,9-7,5 и температурой культивирования 35°С.

Содержание ГЦ-пар в ДНК равно 59,1 мол.%. Этот микроорганизм расщепляет в сульфатредуцирующих условиях 2-аминобензоат, фенол, бензоат, «ара-крезол, 2-, 3- и 4-гидроксибензоат.

Была показана возможность трансформации лдра-метиланилина в присутствии толуола как источника углерода и энергии сульфатредуцирующей бактерией Desulfobacula toluolica То12 (Raber et al., 1998) с образованием фенилацетата в качестве конечного продукта трансформации.

Описана деструкция аминоароматических соединений фототрофным микроорганизмом (Khanna et al., 1992). Три штамма Rhodopseudomonas palustris использовали 4-аминобензоат и 4-аминофенол как единственные источники углерода и азота в анаэробных условиях на свету (Khanna et al., 1992; Crosby et al., 2010). При росте на аминоароматических субстратах эти штаммы не нуждались в СОг

Описан штамм WA1, выделенный из анаэробного консорциума, разлагающего 5-АСК (Савельева и др., 2003). Данный штамм являлся факультативно анаэробной бактерией с бродильным типом метаболизма. Оптимальные для роста температура и рН -30°С и 7,8. Штамм WA1, идентифицированный как представитель видат Citrobacter" freundii, осуществлял в присутствии косубстрата (пирувата, глюкозы или серина) конверсию 5-АСК и 3-АБК до соответствующих спиртов.

Деградация изомеров аминосалициловой кислоты в анаэробных условиях менее изучена, чем трансформация аминобензойных кислот. Показана возможность трансформации 5-АСК несколькими видами Klebsiella (К. pneumoniae, K.^mobilis, К., oxytoca) в анаэробных условиях с образованием СОг и ларя-аминофенола в присутствии глюкозы (Сиволодский и др., 1994). Была изучена конверсия 5-АСК штаммом Citrobacter freundii WA1 (Савельева и др., 2003) и трансформация 4-АСК и 5-АСК штаммом Р. aeruginosa ASA2 (Савельева, 2003). 3.2.2. Микробные сообщества 3.2.2.1. Синтрофные взаимодействия

В настоящее время микробное сообщество рассматривается как целостная функциональная совокупность взаимодействующих видов, форм, ассоциаций.

Между микроорганизмами возможны различные типы взаимоотношений. Чаще всего взаимодействие микроорганизмов в сообществе основано на трофических связях. Синтрофия является особым случаем симбиотической кооперации между метаболически разными микроорганизмами, которые зависят друг от друга при разрушении субстратов.

Синтрофные взаимодействия в сообществах могут быть как факультативными, так и облигатными (Stams, 1994; Nealson et al., 2005; Stams, Plugge, 2009). В случае факультативных синтрофных отношений один вид микроорганизмов способен самостоятельно (по отдельности) трансформировать субстрат, но на рост этих микроорганизмов и на метаболические продукты, которые они образуют, влияет водород-потребляющий метаноген. В случае облигатной синтрофии ни бактерия, ни архей по одиночке не способны к разрушению органических веществ, для деградации субстратов и роста необходимы и важны оба микроорганизма. Расстояние между клетками влияет на активность биодеградации и скорость роста организмов (Conrad et al., 1985; Schink, Thauer, 1988; Ishii et al., 2005), что приводит к формированию бактериями и археями компактных агрегатов. Эти сообщества существуют в условиях, близких к термодинамическому равновесию (Jackson, Mclnerney, 2002). Была даже высказана гипотеза о том, что эти особенности облигатных синтрофных сообществ могли привести к образованию эукариотических клеток (Martin, Muller, 1998).

Классическим примером синтрофии является кокультура "Methanobacillus omelianskii", которая, как было показано позже, состоит из двух культур организмов-партнёров - штамма S и штамма М.о.Н. Два штамма совместно превращали этанол в ацетат и метан, при этом происходил межвидовой перенос водорода:

Штамм S: 2С2Н5ОН + 2Н20 = 2СН3СОО""+ 2Н+ + 4Н2 (AG0 = +19 кДж/2 моль ЕЮН) Штамм М.о.Н. : 4Н2 + С02 = СН4 + 2Н20 (AG° = -131 кДж/1 моль СН4)

Кокультура:2С2Н5ОН + С02= 2СН3СОО""+ 2Н++ СН4 (AG° = -112 кДж/1 моль СН4)

В данном примере штамм S не растёт на этаноле в отсутствие Н2-потребляющего организма, т.к. реакция окисления этанола при стандартных условиях эндотермическая. Первая реакция может идти лишь в том случае, если штаммом М.о.Н. (метаногеном) будет снижено парциальное давление водорода. Таким образом, деградация этилового спирта целиком зависит от кооперации двух штаммов (Schink, 1997). В настоящее время определены микроорганизмы- участники < таких ассоциаций: первую реакцию способны осуществлять бактерии из рода Pelobacter, вторую — гидрогенотрофные метаногены родов Methanospirillum, Methanococcus, Methanobacterium, Methanobrevibacter (Нетрусов, Котова, 2006).

В анаэробных условиях кооперация микроорганизмов является одним из важных условий, т.к. зачастую отдельные члены ассоциаций из-за энергетических барьеров не могут использовать химически стабильные вещества. В таких условиях именно сообщество микроорганизмов способно разлагать сложные органические соединения, в том числе ксенобиотики, до простых веществ, иногда с получением полезного продукта (например, биогаза в метаногенном сообществе).

Синтрофная ассоциация "Ме^апоЪасШиз отеИатки", упомянутая выше, является классическим примером межвидового переноса водорода. Аналогичные взаимодействия были описаны для других природных метаногенных сообществ. В общем виде процесс разложения биополимеров выглядит следующим образом (рис.7):

Полимеры

1 а у

Мон< эмер О

Жирные кислоты, спирты

0 ©

Рис. 7. Схема потока углерода в трофических группах микроорганизмов в метаногенном сообществе, разрушающем сложные органические вещества в анаэробных условиях (модифицировано по БсЫпк, 1997): а - первичные анаэробы (осуществляют гидролиз полимера и сбраживание образующихся мономеров); б - водородпотребляющие метаногены; в - ацетокластические метаногены; г - вторичные (синтрофные) анаэробы (сбраживают продукты первичных анаэробов до ацетата, Н?, С О 2); д - гомоацетогены.

1 - стадия расщепления полимеров до олигомеров и мономеров внеклеточными ферментами первичных бродилыциков-гидролитиков и сбраживание их разными группами бродилыциков.

2 - стадия расщепления жирных кислот и спиртов синтрофными организмами, облигатными восстановителями Н+, с образованием ацетата и Н2.

3 - стадия образования биогаза.

При использовании аминоароматического ксенобиотика в качестве субстрата в таком сообществе классическая схема разложения должна видоизменяться на начальных стадиях (рис.8).

1- стадия трансформации аминоароматического субстрата до центрального амфиболита.

2 - стадия «раскрытия» кольца (деароматизации).

3 - стадия сбраживания линейных продуктов.

4 - стадия потребления жирных кислот и спиртов синтрофными микроорганизмами, облигатными восстановителями Н+, с образованием ацетата и Н2.

5 - стадия образования биогаза.

Рис.8. Предполагаемая схема разложения аминоароматического ксенобиотика метаногепиым сообществом (Котова и др., 2010).

Межвидовой перенос интермедиатов имеет важное значение в трофической цепи. В роли ключевого регуляторного интермедиата в анаэробном сообществе выступает водород, отмечена (но не универсальна) также роль других веществ, формиата и ацетата (Заварзин, Колотилова, 2001; Wolfe, 2005; Stams, Plügge, 2009).

Аминоароматический ксенобиотик Т

Центральный ароматический амфиболит

1 г

Линейные продукты 1 г \ Жирные кислоты, спирты \

-соединения, Н2, СОг Ацетат

1 I 3 и

I 5 сн4, со,

3.2.2.2.Сложность и устойчивость микробных сообществ

Вопрос о структуре биологических сообществ, о соотношении сложности биологических систем и их устойчивости является одним из основных в популяционной микробиологии и экологии вообще (Адамович, Дегерменджи, 1985). Так, в некоторых экспериментальных работах было установлено, что сила взаимодействия между видами падает при увеличении числа видов в сообществе (McNaughton, 1978). Реально существующие стабильные сообщества микроорганизмов, развивающиеся в проточных лабораторных системах, служат очень удобным объектом исследования (Fredrikson, 1977; Печуркин, 1981). В математической модели (Адамович, Дегерменджи, 1985), описывающей динамику факторов, влияющих на плотность популяции, в роли подобных факторов могут выступать, например, ингибиторы (Неронова и др., 1967), стимуляторы (Slyter, Weaver, 1977), лимитирующие компоненты, а также понижение рН или изменение температуры. Как показывают многочисленные эксперименты со смешанными культурами микроорганизмов, устойчивость в таких сообществах обеспечивается в основном через факторы химической природы (Фуряева, 1981).

В таблице 2 приведено распределение типов внутри- и межвидовых взаимодействий в устойчивых сообществах. Таблица 2.

Распределение положительных и отрицательных взаимодействий в устойчивых сообществах (Адамович, Дегерменджи, 1985).

Число видов в Тип Положительные Отрицательные сообществе взаимодействий взаимодействия, взаимодействия,

2 Внутривидовые 15 85

Межвидовые 65 35

3 Внутривидовые 30 70

Межвидовые 55 45

4 Внутривидовые 30 70

Межвидовые 60 40

Как следует из таблицы 2, устойчивость сообщества характеризуется преобладанием отрицательных внутривидовых связей и положительных взаимодействий между видами.

3.2.2.3. Консорциумы микроорганизмов, разрушающие ароматические вещества, и их трофическая структура

В научной литературе описан ряд синтрофных консорциумов, разрушающих ароматические вещества. Например, полная минерализация бензоата (в метаногенных условиях) проходит в два этапа (Heider, Fuchs, 1997):

1) С7Нб02 = ЗСНзСООН + С02 + ЗН2

2а) ЗН2 + 0,75С02 = 0,75СН4 + 1,5Н20

26) ЗСНзСООН = ЗСН4+ ЗС02

Первый (1) этап осуществляет микроорганизм с бродильным типом метаболизма, второй (2) —метаноген(ы). Данный метаболический симбиоз впервые был открыт для метаногенных консорциумов, которые на данный момент времени довольно хорошо изучены. Поскольку субстратами метаногенеза являются лишь Cr и С2-соединения, то очевидно, что спектр ароматических субстратов, которые разлагаются анаэробным сообществом, определяется субстратной специфичностью бродилыцика. Синтрофные1, бактерии, окисляющие бензоат, относятся к виду Syntrophus buswellii, который принадлежит к классу Deltaproteobacteria. Эти бактерии обнаруживаются во множестве независимо полученных стабильных сообществ (Warikoo et al., 1996; Heider, Fuchs, 1997). Штаммы S. buswellii при росте на бензоате облигатно нуждаются в микроорганизме-партнёре, потребляющем водород, но могут расти в монокультуре на более окисленном * субстрате — кротонате. S. buswellii также может разлагать бензоат в присутствии кротоната (Auburger, Winter, 1995). Кроме того, описана синтрофная бактерия S.gentianae, разлагающая следующие ароматические субстраты: бензоат, гентизат, гидрохинон (Wallrabenstein et al.,1995).

Сравнительно недавно был выделен и описан первый культивируемый синтрофный анаэробный микроорганизм Syntrophorhabdus aromaticivorans, gen. nov., sp. nov., способный к деградации фенола до ацетата в облигатных синтрофных ассоциациях с гидрогенотрофным микроорганизмом (Qui et al., 2008). Этот организм был выделен из накопительной культуры, полученной при адаптации метаногенного ила очистных сооружений, обрабатывающих сточные воды производств терефталевой и изофталевой кислот (Qiu et al., 2004). Бактерия относится к классу Deltaproteobacteria, является строгим анаэробом, в синтрофной ассоциации с Methanospirillum hungatei способна к утилизации изофталата, бензоата, фенола, /7-крезола и 4-гидроксибензоата с образованием ацетата и метана в качестве конечных продуктов.

Благодаря синтрофной ассоциации, повышающей продуктивность метаногенных процессов, эти сообщества разлагают даже такие устойчивые ароматические соединения, как бензол или высокохлорированную ароматику. Как видно из рисунка 9, бензоат, образованный в результате восстановительного дехлорирования 3-хлорбензойной кислоты Desulfomonile tiedjei, сбраживается штаммом S. buswellii (Heider, Fuchs, 1997). Образованные продукты брожения (СОг и Н2) используются как субстраты метаногенеза Methanospirillum sp. При этом образующийся при брожении ацетат может использоваться как источник углерода и для D. tiedjei, и для Methanospirillum sp., а Нг служит источником энергии для восстановительного дехлорирования (Heider, Fuchs, 1997).

Рис.9. Состав и трофические связи 3-хлоробепзоат-разрушающего консорциума. [С]-углерод, ассимилированный клеточной массой (модифицировано по Heider, Fuchs, 1997).

Из метаногенного сообщества, активно разлагающего аминоароматические соединения, были выделены микроорганизмы, стоящие на разных этапах трофической цепи использования аминоароматических веществ (Савельева, 2003). Штамм WSF (строго анаэробный организм), сбраживающий глюкозу с образованием кислот и газа, вероятно, относится к роду Clostridium или родственному ему. Штамм WAC (культура длинных

З-хпорбензоат тонких спорообразующих палочек) при росте на метаноле образует в качестве продуктов ацетат и пропионат, а при росте на Н2/СО2 — ацетат и бутират. Этот штамм (строго анаэробный микроорганизм), скорее всего, принадлежит либо к роду Clostridium, либо к роду Sporomusa. Клетки штамма WSR растут на пирувате, лактате или ЛЖК (летучих жирных кислотах) в условиях сульфатредукции. При изучении микробиологических и физиолого-биохимических свойств штамм WSR был отнесён к роду Desulfovibrio. В сообществе, разлагающем 5-АСК, присутствовали также Methanosarcina-подобные клетки и мелкие кокки. В чистую культуру мелкие кокки авторам выделить не удалось, поэтому нельзя сказать ничего о функциональном значении этой культуры в процессе деградации аминоароматики. Предполагают, что этот штамм либо нуждается в специальных факторах роста, либо является синтрофом.

Из стабильных метаногенных ассоциаций были выделены в чистую культуру две бактерии, участвующие в первых стадиях разложения аминоароматики метаногенным сообществом: штамм WA1, отнесённый к виду Citrobacter freundii, и штамм Pseudomonas aeruginosa ASA2 (Савельева, 2003). Таким образом, показано, что в состав данного сообщества входят следующие микроорганизмы: бактерии, осуществляющие, первичную трансформацию бензольного кольца (Citrobacter freundii и Pseudomonas aeruginosa ASA2), микроорганизм с бродильным типом метаболизма (штамм WSF), гомоацетоген (штамм WAC) и метаноген (Савельева, 2003).

В общем случае, синтрофные консорциумы, разрушающие ароматические вещества, должны включать микроорганизмы, активирующие и раскрывающие ароматическое кольцо; микроорганизмы, сбраживающие линейные продукты и образующие водород и ацетат; а также микроорганизмы, потребляющие водород (метаногены, гомоацетогены или сульфатредукторы).

Поскольку метаболические взаимодействия в сообществе зависят от переноса метаболитов между партнёрами, то поступление субстрата путём молекулярной диффузии от источника его образования до потребителя пропорционален квадрату расстояния между ними (Заварзин, Колотилова, 2001). Поэтому кооперация микроорганизмов-партнёров при синтрофных взаимодействиях оптимальна, если диффузионные расстояния предельно малы (Conrad et al., 1985; Schink and Thauer, 1988; Ishii et al., 2005; Stams, Plugge, 2009). Это достигается в случае тесного контакта партнёров путём образования различных агрегатов, т.е. пространственного объединения трофически связанных типов микроорганизмов (рис. 10).

Рис.10. Обмен Н2 в анаэробных агрегатах (Schink,1997), содержащих: a) гомогенно перемешанную в одной структурной единице популяцию водородобразующих и водородпотребляющих микроорганизмов; b) обособленные популяции этих микроорганизмов, образующие отдельные скопления.

Действительно, в большинстве случаев ассоциации микроорганизмов структурно оформлены в виде гранул, биоплёнок, хлопьев, что способствует облегчению межвидового переноса интермедиатов (Stams, Plügge, 2009).

3.3. Влияние различных факторов на структуру сообщества 3.3.1. Природа субстрата и состав среды

Свойства субстрата, как показано многими авторами, могут, оказывать значительное влияние на активность сообщества и его структуру (Grotenhuis et al., 1991; Dalton et al.,1994; James et al., 1995; Massol-Deya et al., 1995; Moller et al., 1997). Так, при изучении сообщества из аэробно-анаэробного реактора, потребляющего ацетат в качестве основного источника углерода, было показано, что на видовую структуру сообщества влияет соотношение содержания фосфора и углерода в среде. При изменении соотношения фосфора и углерода (Р/С) с 1:10 до 1:50 процентное содержание ß-протеобактерий снизилось с 77 до 38%. Это снижение связано с уменьшением количества Rhodocyclus-подобпых клеток. При снижении уровня Р/С одновременно происходило увеличение содержания а-протеобактерий и в меньшей степени у-протеобактерий. В то же время наблюдалось изменение морфологии (а- и у-протеобактерий) в сторону преобладания тетрадообразующих кокков (Kong et al., 2002).

В случае метаногенных сообществ наблюдается чёткая зависимость видового состава метаногенов от концентрации субстрата метаногенеза: при высокой концентрации ацетата доминирует Methanosarcina, при низкой—Methanosaeta (Заварзин, 1986; Hori et al., 2006).

Для анаэробного термофильного реактора, использующего в качестве субстрата глюкозу, было исследовано изменение численности микроорганизмов при внесении ацетата и пропионата. SSCP-анализ (анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК) показал, что состав архейного компонента сообщества тесно коррелировал с концентрацией летучих жирных кислот (ацетата и пропионата), тогда как на бактериальную популяцию сильное влияние оказывал pH среды (Hori et al., 2006).

Археи в сообществе были представлены двумя водородпотребляющими (Methanoculleus sp. - и Methanothermobacter sp.) и одним ацетокластическим {Methanosarcina sp.) метаногенами. Было обнаружено, что в обычных условиях, без добавления ЛЖК, в сообществе преобладает Methanoculleus sp. Увеличение концентрации JDKK вызывало резкое увеличение численности Methanothermobacter sp. Повышение концентрации внесённого ацетата сопровождалось размножением ацетокластического метаногена Methanosarcina sp. Таким образом, метаногенная популяция отвечает колебаниями численности' на изменение условий, вызванных внесением пропионата №. ацетата (Hori et al., 2006).

Для анаэробных микробных сообществ, полученных из метаногенного ила муниципальной станции по очистке сточных вод и разрушающих 3-хлорбензоат, было показано, что внесение в сообщество дополнительных легкоусваиваемых субстратов приводит к сокращению лаг-периода и увеличению активности сообщества (Becker et al., 2006).

Изучено влияние дополнительных источников углерода на разложение аминоароматических веществ в устойчивых метаногенных сообществах (Савельева, 2003). Метаногенное сообщество, состоящее из 6 морфотипов (короткие неспорообразующие палочки, Methanosarcina-uo добяыс клетки, вибриоподобные клетки, мелкие кокки, длинные тонкие спорообразующие палочки, толстые спорообразующие палочки), разлагало 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) в присутствии пирувата с большей скоростью, нежели при росте на 5-АСК как единственном источнике углерода и энергии. Подавление метаногенеза с помощью бромэтансульфоновой кислоты (BESA) не оказало влияния на скорость деградации 5-АСК в присутствии дополнительного углеродного субстрата — пирувата, однако при этом изменилась микроскопическая картина сообщества: исчезли Methanosarcina-подобные и вибриоподобные клетки, а также длинные тонкие спорообразующие палочки. В то же время, внесение BESA в активное сообщество без дополнительного источника углерода приводило к остановке деградации аминоароматического субстрата (Савельева, 2003).

В сообществах, полученных из мезофильного ила очистных сооружений, обрабатывающих стоки свиноферм и в течение долгого времени адаптированных к деградации аминоароматических соединений, авторы не отметили нитрат- или сульфат-зависимого разложения аминоароматических субстратов. При внесении в неадаптированный ил, полученный из очистных сооружений, обрабатывающих бытовые сточные воды, экзогенных акцепторов электронов было показано, что в зависимости от электрон-акцепторных условий деструкция может идти с разной активностью (Савельева, 2003).

3.3.2. Температура

Температура является одним из факторов, оказывающих воздействие на структуру сообщества. Изменение температуры влияет на соотношение концентраций субстратов и продуктов реакций, а также на изменение свободной энергии Гиббса этих реакций (AG°=AH°—TAS0), где АН0—стандартная энтальпия реакции; AS0—изменение стандартной энтропии; Т—температура в градусах Кельвина. При ^понижении-, температуры образование водорода синтрофными микроорганизмами становится термодинамически менее выгодным, тогда как метаногенез с потреблением водорода— более выгодным (Stams, 1994). С понижением температуры изменяется состав анаэробного сообщества—в нём начинают преобладать ацетатпотребляющие метаногены (Chin et al., 1999; Fey, Conrad, 2000). Вероятно, это связано с тем, что в среде происходите увеличение содержания ацетата, поскольку при низких температурах гомоацетогенные бактерии и водородпотребляющие метаногены конкурируют за водород (Conrad et al., 1989; Коцюрбенко и др., 1992; Nozhevnikova et al., 1997; Vavilin et al., 2000).

При изучении анаэробных сообществ, полученных из UASB-реакторов, потребляющих углеводы, ацетат и пропионат, было показано, что температура влияет на такой аспект структуры сообщества, как видовое разнообразие. При культивировании сообществ в условиях средних температур (35°С) преобладающей группой микроорганизмов являлись представители дельта-протеобактерий (27%) и археи из филума Euryarchaeota (19%), также в сообществе присутствовали зеленые несерные бактерии (14%). В термофильном (55°С) сообществе преобладали представители филума Euryarchaeota (22%), группы Thermodesulfovibrio (19%), зелёные несерные бактерии (18%) и подгруппа грамположительных бактерий с низким содержанием Г+Ц (18%). Протеобактерии обнаружены не были, в то время как в мезофильном сообществе они преобладали. Помимо этого, внутри групп микроорганизмов в мезофильном реакторе

27 наблюдали большее разнообразие, чем внутри групп из термофильного реактора. Авторами было обнаружено, что мезофильное сообщество имело большее видовое разнообразие по сравнению с термофильным, вследствие чего мезофильное сообщество обладало большей пластичностью, а термофильное было более чувствительно к внешним факторам (Sekiguchi et al., 1998).

Из анаэробного мезофильного ила были получены накопительные культуры, разлагающие 2-аминобензойную (2-АБК) и 5-аминосалициловую (5-АСК) ■ кислоты (Savelieva et al., 2002). Авторы проверили возможность функционирования полученных высокоактивных накопительных культур в условиях повышенной (55°С) и пониженной (20°С) температур. Показано, что активность процесса при 20°С даже несколько увеличивалась, в то время как переход на термофильный режим приводил к полной потере активности. Возвращение к мезофильному режиму восстанавливало способность к деградации субстрата после короткого лаг-периода, (около 20 суток). Таким образом, кроме возможности ведения процесса при пониженной температуре показано, что кратковременные перепады температур не приводят к необратимой потере накопительными культурами своих деградабельных свойств (Savelieva et al.; 2002). Это1'.-свидетельствует о том, что активные структурированные сообщества обладают более высокой устойчивостью к изменению температуры.

3.3.3. Изменение состава сообщества во времени

Для всех сообществ характерен определённый адаптационный период (лаг-фаза), в:. течение которого происходит пространственная организация« сообщества, изменение его трофических связей и активизация ферментных систем. В процессе развития во время лагфазы структура микробного сообщества может претерпевать изменения. На длительность лаг-фазы может влиять температура культивирования. При изучении анаэробной деградации ацетата было показано, что илы, культивируемые при 55°С, имеют более короткий лаг-период, чем илы, культивируемые при 70°С (Rintala et al., 1993). Проведены исследования сообщества из лабораторного реактора, разрушающего смесь ароматических компонентов Solvesso-100. Исходный инокулум был получен из очистных сооружений сточных вод фабрики по производству автомобильных красок и содержал большое количество а- и ß-протеобактерий. Стартовую культуру для реактора выращивали в ферментёре, содержащим Solvesso - 100 в качестве источника'углерода. К концу культивирования в ферментёре преобладали у-протеобактерии, близкие к

Pseudomonas pulida. После возвращения смешанной культуры в реактор структура сообщества вернулась к прежней с доминированием а- и ß-протеобактерий, тогда как

28 содержание у-протеобактерий резко снизилось (Stoffels et al., 1998). К сожалению, авторы не приводят никакого объяснения полученным результатам, а лишь констатируют факты.

При изучении разложения толуолсульфоната и бензолсульфоната гранулированным консорциумом из полупромышленного UASB-реактора (анаэробного реактора с восходящим потоком через слой анаэробного ила) показано, что в процессе деградации участвует сообщество из 9-10 микроорганизмов (Щербакова, 2000). При исследовании развития микробной популяции во времени наблюдали следующую картину. В первые сутки роста основную часть популяции составлял спорообразующий организм штамм 14 (68,5%). На вторые сутки его численность уменьшилась, и в сообществе стали преобладать клостридиальные штаммы (80,5%). В дальнейшем наблюдалось увеличение численности штамма SS (другой спорообразующий организм). С третьих суток началось активное спорообразование у клостридиальных штаммов, одновременно росла численность метанобразующих микроорганизмов. К концу первой недели их суммарная численность составляла около 60% клеток в популяции. Скачок в потреблении толуолсульфоната можно соотнести с ростом численности штамма SS в популяции микроорганизмов на третьи сутки. В процессе развития сообщества наряду cv образованием метана происходило накопление летучих жирных кислот. В первые 3-4 суток увеличивалось количество ацетата, в дальнейшем его содержание снижалось (Щербакова, 2000).

Для изучения влияния длительного хранения на микробное сообщество свиного навоза был исследован микробный состав жидких стоков свинофермы на протяжении 6~ месяцев. Анализ показал, что наиболее резкие изменения происходили в течение первых двух недель анаэробного хранения, а затем сообщество становилось относительно устойчивым. Несколько бактериальных популяций, идентифицированные как близкие к некультивируемым клостридиям, p. Porphyromonas, p. Lactobacillus и p. Streptococcus, которые обычно выделяются из экскрементов свиньи, постоянно присутствовали и доминировали в сообществе на протяжении всего времени. С другой стороны, архейный компонент сообщества адаптировался медленно; его разнообразие увеличивалось при хранении, а популяция Methanobrevibacter ruminantium, доминировавшая в начале, заместилась к концу срока на Methanobrevibacter smithii (Peu et al., 2006).

Изучена накопительная культура, выделенная из анаэробного мезофильного ила, адаптированного к 2-аминобензойной кислоте (Савельева, 2003). Потребление субстрата, отмеченное лишь на 87-е сутки культивирования, сопровождалось изменениями внешнего вида культур и микроскопической картины. Черные, угловатые гранулы, представляющие из себя конгломераты тонких палочек разной длины, мелких палочек с плектридиальными

29 спорами и кокков, лежащих в аморфном матриксе, превратились в грязно-белые пленки, содержащие цепочки или скопления мелких палочек и множество кокков. Только в течение первых 5-ти суток потребления субстрата улавливались небольшие количества молекулярного водорода и возрастало количество углекислоты. После длительного периода медленного использования 2-АБК и возрастания концентрации ионов аммония в среде на 112-е сутки был зарегистрирован первый, промежуточный продукт — бензойная кислота. На этом этапе культуры претерпевали дальнейшие видоизменения — культуральная жидкость становилась мутной, на дне находились темно-бурые пленки, а в толще жидкости — снежно-белые ватообразные агрегаты. Под микроскопом наблюдали очень длинные нити, состоящие из цепочек палочек разной длины, заключенных в полупрозрачные чехлы, встречались также мелкие бесспоровые палочки, одиночные и в скоплениях. Затем содержание бензоата в среде понизилось, и регистрировали появление ацетата. Следующим этапом было образование метана, в результате которого произошло потребление ацетата и быстрая окончательная деградация 2-АБК. После того, как в среду культивирования была вновь внесена 2-АБК, наблюдали увеличение содержания бензоата, аммония и метана, однако уровень ацетата оставался постоянно низким. Стабильная«, накопительная культура, с высокой активностью потребляющая 2-АБК, представляла собой темные хлопья в мутной культуральной жидкости с желтовато-бурым осадком на дне. Под микроскопом наблюдали палочки разной длины, часто фрагментированные, некоторые со спорами, и отдельно лежащие кокки (Савельева, 2003).

Итак, основными факторами, воздействующими на структуру микробного сообщества, являются состав среды, свойства субстрата и температура культивирования. Развитие сообщества, как правило, характеризуется длительными лаг-фазами (ИеегеЬегеш е1 а1.,1999; Савельева, 2003), в течение которых происходит формирование пространственной структуры сообщества и его трофических связей, вследствие чего видовой состав сообщества может изменяться во времени. Преобразования в уже сложившемся консорциуме обычно связаны с накоплением (или потреблением) тех или иных промежуточных и конечных метаболитов (Щербакова, 2000). Следует также отметить, что активное, оформившееся структурно сообщество, как правило, обладает значительной устойчивостью к факторам внешней- среды, в частности, к изменению температуры (Савельева, 2003).

3.4. Пространственная структура анаэробных сообществ, разлагающих вещества-загрязнители

На современном этапе для очистки промышленных сточных вод, а также почв, водоёмов и атмосферы от сложных органических соединений используются биореакторы (Deriell et al., 1999). Как правило, в реакторах применяют уже естественно сложившиеся консорциумы • (пространственно организованные ассоциации). Для очистки производственных стоков часто применяется UASB-реактор (Upflow-Anaerobic- Sludge Blanket reactor, Lettinga et al., 1980), характеризующийся подачей свежей среды, снизу, через слой анаэробного ила, что приводит к образованию "кипящего" слоя микробных, агрегатов и повышению эффективности массо- и газообмена.

3.4.1. Образование анаэробных агрегатов и их влияние на процессы деградации

Анаэробный гранулярный ил является ключевым компонентом UASB-реактора. Гранулы ила представляют собой плотные, многовидовые микробные сообщества, в. которых ни один из видов по отдельности в экосистеме гранулы не способен к деструкции -сложных органических веществ, содержащихся в сточных водах. Обычно для/развития гранулярного- ила требуется, от 2 до 8 месяцев. Существуют несколько моделей,, описывающих образование гранул (Liu et al., 2003).

Микробная адгезия, или самоиммобилизация, является начальной точкой процесса анаэробной грануляции, и может быть определена как взаимодействие одной бактериальной клетки с другой либо взаимодействие клетки с твёрдой частицей.

Модель инертного ядра была предложена голландскими учёными, разработавшими UASB-реактор (Lettinga et al., 1980). В присутствии инертных микрочастиц в UASB-реакторе анаэробные бактерии могут прикрепляться к поверхности частиц, формируя т.н. зародышевые гранулы. Далее путём размножения прикрепившихся бактерий из зародышевых развиваются зрелые гранулы.

Было показано, что ускорению грануляции способствуют такие факторы, как высокое гидравлическое давление (HulsHoff et al., 1988; Noyola, Merengo, 1994; Alphenaar et al., 1993; O'Flaherty et al., 1997), добавление поливалентных, положительных ионов, например, кальция, железа, алюминия или магния, в исходный ил, приводящее к снижению электростатического отталкивания между негативно заряженными клетками (Scmidt, Ahring, 1993; Yu et al., 2001a; Yu et al., 2001b), внесение в ил как синтетических, так и природного происхождения полимеров, цепи которых могут формировать своеобразные "мостики" между клетками, облегчающие формирование начальных микробных "ядер", являющихся первой стадией грануляции (El-Mamouni et al., 1998; Kalogo et al., 2001).

Анаэробная грануляция представляет собой сложный процесс, в который, помимо физико-химических сил, вовлечены также биологические и микробиологические факторы. За последние 25 лет произошёл значительный прогресс в понимании микробиологических характеристик гранул UASB-реакторов и взаимодействия между различными видами в гранулах. На основании многочисленных данных было разработано несколько структурных моделей грануляции: модель Кейптауна (Pains et al., 1987; Sam-Soon et al., 1988), модель спагетти (Sanchez et al., 1994, Wu et al., 1996), кластерная (Hirsh, 1984) и слоистая (MacLeod et al., 1990; Guiot et al., 1992) модели, согласно которым основная роль в формировании пространственной структуры гранул принадлежит метаногенным микроорганизмам.

Агрегирование метаногенной биомассы (образование структурированных агрегатов) обладает не только рядом технологических преимуществ по сравнению с диспергированной биомассой, но имеет и важное биологическое значение для формирования микробного консорциума под влиянием гидродинамических факторов (Ножевникова, .1994). Компактная организация микробного сообщества в пространстве очень выгодна для эффективного переноса, промежуточных продуктов (прежде всего водорода). Было показано, что при агрегировании метаногенной биомассы поток водорода между двумя видами микроорганизмов увеличивается на 2 порядка по сравнению с дисперсной биомассой (Duborguier et al., 1988). Метаногенная активность гранул - уменьшалась при нарушении их структуры. Механическая смесь тех же микроорганизмов имела гораздо меньшую активность, чем агрегированная- биомасса. Таким образом, гранулообразование в UASB-реакторах представляет собой удивительное явление самоорганизации микробного сообщества в искусственных очистных сооружениях под действием физических и гидродинамических факторов (Ножевникова, 1994). Сформированный гранулированный ил используется в качестве посевного материала при запуске новых реакторов.

Примером образования анаэробного агрегата может служить формирование гранул микроорганизмами, разрушающими жирные кислоты (Wu et al., 1996). В образовании гранулы участвовало 5 компонентов (рис.11):

1) Methanosarcina mazeii T18;

2) Methanobacterium formicicum TIN;

3) Кокультура Methanobacterium formicicum и бутират-потребляющего штамма BH;

4) Трикультура Methanosaeta sp. шт.М7, Methanobacterium formicicum TIN и пропионат-потребляющего штамма РТ;

5) Агрегаты и отдельные клетки Methanosaeta sp. шт.М7. 2 з 4 5 7

Л//.

Рис.11. Модель образования анаэробных гранул (JVu et al., 1996).

Клетки М. formicicum TIN (компонент 2) сначала адсорбировались на поверхности агрегатов, состоящих из М. Mazeii Т18 (компонент 1), с образованием компонента 6, тогда как компоненты 2, 3, 4 и 5 формировали синтрофные пропионат-бутират-потребляющие консорциумы (компонент 7). Далее некоторые фрагменты компонентов 6 и 7 комбинировались благодаря адгезивным свойствам штамма TIN, образуя гранулу (компонент 8). Авторы считают, что ключевую роль в образовании гранулы играли Methanosaeta sp. и М. formicicum, а в дальнейшем поддержании структуры гранулы-, главное место занимала Methanosarcina sp.

В UASB-реакторах микроорганизмы могут образовывать также крупные рыхлые ассоциации (хлопья, флоки) или небольшие плотные гранулы. В процессе образования гранул многие авторы отмечают основную структурную роль метаногенов (Dolfing et al., 1985; Wiegant, Man, 1986; Dubourguier et al., 1988; Hulshoff et al., 1988; Wu et al., 1992). Так, например, Methanosarcina за счёт внешних слоев оболочки образует псевдопаренхиму — специальную "ткань", в межклетниках которой располагаются другие бактерии. Methanosaeta и Methanospirillum формируют клубок, внутри которого также могут находиться другие бактерии.

Некоторые авторы описывают микроорганизмы из группы Chloroflexi, которые благодаря формируемым филаментам также вносят свой вклад в формирование плотной и ригидной структуры анаэробных гранул путём своеобразного "обёртывания" других микроорганизмов (Satoh et al., 2007).

Для аэробных сообществ показано, что роль структурообразующего организма могут играть микроорганизмы рода Acinetobacter (Malik et al., 2003). Также описаны аэробные гранулы ила, в которых роль "скелета" выполняют простейшие (например, Epistylus spp.), а также (в отдельных случаях) гифы грибов (Weber et al., 2007). Образование агрегата происходит в 3 стадии. Сначала стебельковое простейшее оседает на частице (флоке) ила, формируя древовидные колонии, и его поверхность последовательно колонизируется бактериями. Затем бактерии покрывают поверхность простейшего целиком, и этот организм погибает. Таким образом, клеточный каркас простейшего служит своеобразным "скелетом". На третьем этапе формируются гладкие, компактные гранулы. Сердцевина этих зрелых гранул состоит из бактериальных клеток и экзополисахаридов, вокруг которых располагаются как простейшие, так и грибы, покрытые клетками бактерий (Weber et al., 2007).

3.4.2. Каналы как важная структура микробных агрегатов

Одной из важнейших особенностей структурированных образований являются внутренние пустоты или каналы. Они являются "жизненно важной" коммуникацией!:' системы, поскольку обеспечивают циркуляцию как питательных веществ, так и продуктов метаболизма с током жидкости (Davey, O'Toole, 2000). Помимо этого, такая "канализированная" структура, увеличивающая площадь биологической поверхности на единицу объёма, облегчает транспорт субстратов, питательных веществ и газов набольшие расстояния, нежели это возможно путём обычной диффузии (Massol-Deya et al.,,-1995; Wu et al., 2001). Для многих процессов в анаэробных реакторах с фиксированными микроорганизмами выявлена интегративная сеть каналоподобных структур в микробных гранулах (MacLeod et al., 1990; Wu et al., 1991; Wu et al., 2001).

Итак, образование гранул является весьма выгодным для микробного сообщества. Из анализа литературных данных ясно, что основная роль в формировании структуры гранул принадлежит метаногенам (Dolfing et al., 1985; Wiegant, Man, 1986; Dubourguier et al., 1988; Hulshoff et al., 1988; Wu et al., 1992; Grotenhuis et al., 1992). Methanospirillum и Methanosaeta образуют как бы "каркас" микробных агрегатов за счёт своих длинных клеток или нитей, a Methanosarcina "скрепляет" такие агрегаты и поддерживает их пространственное единство путём образования псевдопаренхимы (Wu et al., 1996). Формирование структурно оформленного сообщества, при котором происходит уменьшение расстояния между микроорганизмами и, как следствие, увеличение активности синтрофной деградации, возможно, происходит в течение часто наблюдаемых длинных лаг-фаз при выращивании синтрофных культур из суспензий.

Как правило, метаногенная активность наблюдается преимущественно в сердцевине агрегатов, вокруг располагаются области бродилыциков или сульфатредукторов (Fang, 2000; Gonzalez-Gil et al., 2001; Satoh et al., 2007).

Структура самой гранулы существенно зависит от пути деградации ксенобиотика и его концентрации. Как правило, неслоистая (гомогенная) структура возникает при наличии постоянного тока субстрата и отсутствии какого-либо лимитирования со стороны интермедиатов (Fang et al., 1995; Rocheleau et al., 1999). Слоистая организация формируется в случае высокого содержания загрязнителя в сточных водах, а кластерная преобладает в разбавленных системах (Gonzalez-Gil et al., 2001).

3.5. Современные методы анализа состава микробных сообществ

За последние десятилетия было разработано довольно много молекулярно-биологических методов для характеристики микробного разнообразия в природных местообитаниях, основанных на экстрагировании и исследовании тотальной ДНК микробного сообщества, в результате чего появилась возможность осуществлять выявление и идентификацию известных микроорганизмов в образцах без выделения их в 'i чистые культуры, а также выявлять в образце новые, неидентифицированые ранее, организмы (Нетрусов и др., 2005; Zengler, 2009).

Для исследования микробного разнообразия и для определения видового состава наиболее подходящим является клонирование ПЦР-амплификатов 16S рДНК. Однако ввиду того, что этот метод довольно трудоёмок и требует больших затрат времени, он не подходит для изучения сукцессионных изменений популяций в микробном сообществе, которое, по сути, является одной из основных задач микробной экологии (Marshall, 1993). Для данных целей намного лучше подходят методы генетического фингерпринтинга. Они позволяют сравнивать одновременно как генетическое разнообразие микробных сообществ из различных мест обитания, так и изучать изменения во времени, происходящие в микробных сообществах. К этим методам относятся денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ, DGGE в английской транскрипции), температурный градиентный гель-электрофорез (ТГГЭ, TGGE в английской транскрипции), анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (метод, основанный на регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул, SSCP), анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (ПДРФ-анализ) и некоторые другие (Muyzer, 1999). Для сравнительного анализа микробных сообществ используют метод T-RFLP, основанный на анализе полиморфизма длин концевых рестрикционных фрагментов генов 16S рРНК, помеченных флуоресцентной меткой. Так, данный метод применяли для анализа изменения состава популяции метаногенов в накопительных культурах при высокой и низкой концентрации водорода (Лейбо и др., 2006). Было установлено, что концентрации водорода определяют структуру сообщества метаногенов. Высокая концентрация водорода, очевидно, даёт преимущества развитию водород- и ацетатиспользующих метаногенов семейства Methanosarcinaceae, тогда как низкая концентрация водорода поддерживает развитие более разнообразного сообщества метаногенов (Лейбо и др., 2006).

При исследовании сообществ, полученных из биореакторов, разрушающих бензол в условиях сульфатредукции, методом T-RFLP после внесения бензола в реакторы было выявлено резкое увеличение количества микроорганизмов, относящихся к филотипам Cryptanaerobacter/Pelotomacnlum, доминирование которых наблюдали в сообществе во время потребления ароматического субстрата. Очевидно, данные группы микроорганизмов играют ключевую роль в деградации бензола (Kleinsteuber et al., 2008).

Метод T-RFLP применяли также для изучения сообщества, выделенного из донных осадков длительное время загрязняемого водоёма и разрушающего такой продукт-), окисления топлива, как метил-третбутиловый эфир (Youngster et al., 2010). Анализ полученных профилей показал значительные различия в структуре сообществ донных осадков после того, как они подверглись загрязнению. Так, филогенетический анализ исходного сообщества выявил микроорганизмы, относящиеся к филогенетическим группам Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Chloroßexi и Thermotoga. Воздействие токсиканта привело к преобладанию трёх филотипов, наиболее близких к группам Deltaproteobacteria, Firmicutes и Chloroßexi (Youngster et al., 2010).

Такие молекулярно-биологические методы, как клонирование и секвенирование выделенной ДНК и РНК микробного сообщества, помогают определить, какие микроорганизмы присутствуют в сообществе и какие из них наиболее активны (Sekiguchi et al., 2001; Ito et al., 2002; Ferrera et al., 2004; Roest et al., 2005; Yamada et al., 2005). Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) и метод гибридизации флуоресцирующих олигомерных нуклеотидных последовательностей с нуклеиновыми кислотами, целых клеток (fluorescence in situ hybridization - FISH) очень хорошо отображают изменения в микробном сообществе во времени, а также служат для сравнения микробного состава сообществ, отличающихся по происхождению (например, из различных биореакторов). Метод DGGE - широко используют для анализа биоразнообразия гранулярного ила (Chan et al., 2001; Roest et al., 2005; Zhang et al., 2005), для анализа сукцессии активного ила мезофильных и термофильных биореакторов при запуске реактора и по прошествии времени (LaPara et al., 2000; Liu et al., 2002), для исследования изменений микробной популяции в реакторах с перемешиванием (Ueno et al., 2001; Rincon et al., 2006), для определения разнообразия популяции сульфатредуцирующих организмов (Santegoeds et al., 1998) и для анализа динамических характеристик микробных сообществ из реакторов, обрабатывающих сточные воды, содержащие трихлорэтан и продукты выщелачивания (Calli et al., 2003; Tresse et al., 2005). При помощи метода FISH анализируют структуру гранул (Sekiguchi et al., 1999; Gonzalez-Gil et al., 2001), распределение сульфатредуцирующих микроорганизмов и метаногенов (Rocheleau et al., 1999; Santegoeds et al., 1999; Sekiguchi et al., 1999; Tagawa et al., 2000; Gonzalez-Gil et al., 2001), a также топографию и биоразнообразие гранул (Rocheleau et al., 1999; Saiki et ai., 2002; Diaz et al., 2003; Calli et al., 2006). Зачастую эти методы сочетают для создания более полной характеристики исследуемых сообществ (Diaz et al., 2006).

Так, комбинация из вышеперечисленных методов была использована для исследования гранулы из UASB-реактора, обрабатывающего стоки пивоваренного завода (Diaz et al., 2006). Помимо цвета, гранулы различались по скорости седиментации и размеру: чёрные гранулы (самые "молодые") - наиболее мелкие и компактные, серые -наиболее обильные, коричневые гранулы (самые "старые" и самые крупные) являлись наименее компактными и пористыми.

Рис, 12.Структура различных типов метаногенных гранул, проанализированная с помощью сканирующей электронной микроскопии (верхняя половина) и метода FISH (,нижняя половина) (A-чёрная гранула, B-серая, С-коричнееая).

Зелёная окраска отражает распределение микроорганизмов, принадлежащих к домену Bacteria, красная- к Archaea (Diaz et al., 2006).

Распределение микроорганизмов в гранулах изучали с помощью метода FISH (рис.12). В чёрных гранулах бактерии располагались в наружном слое, тогда как археи формировали плотные кластеры внутри гранулы. В сердцевине серых гранул находились археи с низкой метаногенной активностью, в противоположность им в коричневых гранулах содержалось много активных архей.

Для исследования соотношения различных групп микроорганизмов был использован метод группоспецифичных олигонуклеотидных проб. В чёрных и серых гранулах преобладали грамположительные бактерии, тогда как в коричневых они практически отсутствовали я были представлены протеобактериями. Среди архей во всех трёх типах гранул преобладали представители рода Methanosaeta (от 75 до 95% от общего содержания архей).

Сравнение профилей DGGE показало сходное разнообразие представителей домена Bacteria во всех трёх типах гранул, хотя количественные соотношения различались (рис.13).

Рис. 13.DGGE-npo

Так, например, полоса А2 в серой грануле, имевшая меньшую интенсивность, чем в остальных гранулах, была идентифицирована как Methanosarcina и не выявлялась методом FISH.

ДНК-фрагменты экстрагировали из наиболее выраженных полос, амплифицировали и секвенировали. Секвенированные последовательности сравнивали с последовательностями различных представителей таксонов, доступных в базе данных GenBank с помощью программы BLAST (данные приведены в таблице 3).

Стоит отметить, что единственным представителем протеобактерий являлись дельта-протеобактерии. Среди грамположительных клостридий доминировали Clostridium butyricum (полоса В2, рис.13, табл.3) и Clostridium difficile (полоса ВЗ, там же). Нужно отметить, что эти полосы были' очень слабо выражены в коричневых гранулах, что подтверждается данными FISH, не выявившими грамположительных микроорганизмов в составе коричневых гранул.

Таблица 3.

Филогенетическое разнообразие микроорганизмов на основе анализа DGGE-профилей

Diaz et al., 2006).

Клон Филум, класс или порядок Ближайший вид или таксон % сходства

Al Methanosarcinales Methanosaeta concilii{M59146) 97

А2 Methanosarcinales Methanosarcina mazei (AF028691) 93

A3 Methanomicrobiales Methanospirillum hungatei (M60880) 94

В1 Nitrospirae Uncultured bacterium (L22045) 97

В2 Firmicutes Clostridium butyricum (M59085) 97

ВЗ Firmicutes Clostridium difficile (X73450) 96

В4 Proteobacteria Syntrophobacter wolinii (X70905) 93

В5 Proteobacteria Syntrophobacter wolinii (X70905) 93

Вб Deferribacteres Uncultured bacterium (AF280863) 95 ä

В7 Deferribacteres Uncultured bacterium (U81735) 97

Состав метаногенов, определённый с помощью анализа профилей DGGE {Methanosaeta, Methanosarcina и Methanospirillum), не отличался от выявленного с помощью FISH и сканирующей электронной микроскопии.

Результаты оценки филогенетического разнообразия с помощью клонирования ДНК-фрагментов (16S рДНК), полученных обратной транскрипцией 16S рРНК, приведены в таблице 4.

Всего были проанализированы 96 клонов, полученных для домена Bacteria. Интересно, что 85% всех полученных бактериальных клонов принадлежали к малоизвестным филумам Nitrospirae и Deferribacteres, среди метаногенных архей преобладал Methanosaeta concilii (70% всех клонов).

Таблица 4.

Филогенетическое разнообразие микроорганизмов, оцененное с помощью KnoHupoeaHunl6SрДНК-фрагментов (Diaz et al., 2006).

Клон % от общего количес тва Филум, класс или порядок Ближайший вид или таксон % сходства

G35 5 Methanomicrobiales Uncultured archaeon (AF229775) Methanospirillum hungatei (M60880) 96 90

G46 70 Methanosarcinales Methanosaeta concilii (X51423) 99

G74 25 Methanosarcinales Methanosarcina mazei (AF028691) 98

G33 5 Alphaproteobacteria Sphingopyxis witflariensis (AJ416410) 99

G9 2,5 Firmicutes Uncultured bacterium (AY134903) "93

G19 5 Firmicutes Acetobacterium paludosum (X96958) 91

G3 2,5 Chlorojlexi Uncultured bacterium (AY08260) 92

G6, 49, G59 и G98 51 Nitrospirae Uncultured bacterium (AF351225) Magnetobacterium bavaricum (X71838) 97 93

G30, G36 и G39 18 Deferribacteres Uncultured bacterium (AF280863) Synergistes jonesii (L08066) 98 93

G50 8 Deferribacteres Uncultured bacterium (AF229792) 96

G96 8 Deferribacteres Uncultured bacterium (AF229792) 98

Таким образом, наиболее полная характеристика микробного сообщества возможна лишь при сочетании классических микробиологических методов с современными молекулярно-биологическими методами исследования.

3.6. Заключение

Микроорганизмы являются важным звеном в круговороте веществ в биосфере, выполняя в основном роль редуцентов. Анаэробные микроорганизмы, обладающие способностью трансформировать большое количество органических и неорганических субстратов, принимают активное участие во всех биологических циклах (круговороте углерода, азота, серы и других элементов). В естественных условиях анаэробные микроорганизмы, входящие в состав микробных консорциумов, осуществляют функции деструкции сложных органических веществ, обеспечивая самоочищение экосистем.

Из анализа имеющихся литературных данных очевидно, что компонентный состав и пространственная организация анаэробных сообществ имеют большое значение для проявления ими деградирующей активности в отношении сложных органических ксенобиотиков. Исследования, направленные на выяснение микробного состава, межпопуляционных взаимодействий и расположения микроорганизмов-партнёров относительно друг друга, позволят в дальнейшем эффективно воздействовать на процессы очищения окружающей среды как в природе, так и в искусственных сооружениях. Практическое воплощение полученных знаний может выразиться в стимуляции активности уже имеющихся микробных ассоциаций, либо в грамотной интродукции структурно оформленных анаэробных микробных сообществ, заведомо обладающих необходимой-активностью в отношении определённой группы ксенобиотиков, в загрязнённые места. При этом микробные ассоциации могут быть как получены из естественных мест обитания (анаэробные осадки) и адаптированы к соответствующим веществам, так и "сконструированы" из микроорганизмов, имеющих аналогичные функции и "собранных" в искусственные консорциумы.

4. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью данной работы было изучение процесса деструкции аминоароматических веществ микробными сообществами в анаэробных условиях. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Получение метаногенных микробных сообществ, способных расщеплять аминоароматические субстраты до СН4 и СО2;

2. Определение функциональных возможностей выделенных сообществ и влияния ряда факторов на процесс биодеградации.

3. Определение биохимического пути деструкции аминоароматических веществ и идентификация интермедиатов процесса.

4. Изучение микробного состава выделенных сообществ, разлагающих аминоароматику в анаэробных условиях;

5. Выделение чистых культур микроорганизмов, осуществляющих различные этапы деструкции аминоароматических веществ в изучаемых сообществах.

5 .ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

5.1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 5.1.1. Источники биологического материала

В работе для выделения накопительных и чистых культур использовали анаэробные илы различных очистных сооружений и донные отложения естественных водоёмов (табл. 5).

Таблица 5.

Свойства исследуемых анаэробных образцов.

Анаэробный образец (обозначение) Происхождение биологического материала Физико-химические условия на момент отбора пробы

Мезофильный флокулярный ил (КСА) Очистные сооружения Курьяновской станции аэрации (Москва) t°=15-25°C, pH = 7,0

Мезофильный гранулярный ил (ЕР) Очистные сооружения (ЕОБВ-реактор с расширенным и взвешенным слоем гранул) стоков пивоваренного завода «ЕГеэ Рйзепег» (Москва) t°= 25-30°С, pH = 6,5-6,9 Л , t*

Донные отложения (Ц) Озеро Цайдам (Россия, Бурятия) t°= 15-20°C, pH = 9,2

Донные отложения (Дж) Река Джамна (Индия) t°= 16-18°C, pH = 7,0

5.1.2.Использованные реактивы

Для работы были взяты 2-АБК, бензальдегид, бензиловый спирт, 2-гидроксибензиловый спирт, 2-аминобензиловый спирт (Sigma-Aldrich, Германия), 4-АБК, БК, CK, ацетонитрил, серная кислота (Merck, Германия), 5-АСК (Janssen Chimical, Бельгия), резазурин (Fluka, Германия), дрожжевой экстракт (BDH Chemicals, В еликобритания).

Остальные соли и реактивы, используемые в работе, были производства различных отечественных и зарубежных фирм максимально доступной степени чистоты (не ниже ч.д.а.).

5.1.3.Условия культивирования

Получение накопительных культур проводили на минеральной среде №1 (Kalyuzhnyi, Sklyar, 2000), следующего состава (г/л): NH4CI - 0,280; СаС12 - 0,010; К2НР04-0,250; MgS047H20 - 0,100; ЭДТА - 0,001; NaHC03 - 5,000; резазурин - 0,001; дрожжевой экстракт - 0,100; раствор микроэлементов - 1,0 мл концентрированного раствора на 1 л среды.

Конечная концентрация микроэлементов в среде №1 составляла (мг/л): Н3ВО3 -0,05; FeCl24H20 - 2,00; ZnCl2 - 0,05; MnCl24H20 - 0,05; CuCl22H20 - 0,03; (NH4)2Se03-5H20 -0,05; A1C13'6H20 - 2,00; NiCl26H20 - 0,05; Na2Se03"5H20 - 0,05.

Для выделения, очистки и роста чистых культур микроорганизмов использовали среду №2 следующего состава (г/л): КН2Р04-0,38; Na2HP04-0,53 ;NH4C1 - 0,30; NaCl -0,30; СаС122Н20 - 0,11; MgCl2'6H20 - 0,10; резазурин - 0,001; раствор микроэлементов -1,0 мл/л; раствор витаминов - 0,5 мл/л.

Конечная концентрация микроэлементов в среде №2 составляла (мг/л): FeCl2'4H20 - 0,944; Н3ВО3 - 0,062; ZnCl2 - 0,068; CuCl2 - 0,013; MnCl24H20 - 0,061; СоС126Н20 - 0,066; NiCl2 - 0,013; Na2Se03 - 0,017; Na2W04 - 0,029; Na2Mo04 - 0,021.

Конечная концентрация витаминов в среде №2 составляла (мг/л): биотин -0,01; фолиевая кислота - 0,01; никотинамид - 0,10; р-аминобензойная кислота - 0,05; тиамин (В1) - 0,10; пантотеновая кислота - 0,05; пиридоксамин - 0,25; цианкобаламин (В12) - 0,05; рибофлавин (В2) - 0,05.

Минеральную среду кипятили (не более 20 секунд) для избавления от кислорода, затем под током азота (для предотвращения диффузии кислорода в среду) охлаждали до комнатной температуры и разливали во флаконы. Их закрывали резиновыми пробками и зажимали алюминиевыми колпачками. Затем газовую фазу во флаконах заменяли на требуемую - N2, Н2, N2/C02 (80/20), Н2/С02 (80/20). Конечное давление во флаконах I составляло 160 кПа. Среды стерилизовали автоклавированием (1 ати), а раствор витаминов - фильтрованием (бактериальный фильтр, d=0,2 мкм). После стерилизации в среды добавляли раствор Na2S'9H20 до конечной концентрации 0,278* г/л. Все пересевы анаэробных сообществ и чистых культур микроорганизмов осуществляли с помощью стерильных шприцев, не нарушая условий анаэробиоза.

Для накопительных культур рН среды устанавливали после стерилизации до 7,07,5. Инкубацию накопительных и чистых культур проводили, в основном, при 30°С. (Амино)ароматические субстраты вносили в среды культивирования из их стерильных концентрированных анаэробных растворов (1 М) до конечных концентраций от 0,5 до 5 мМ.

Для выделения чистых культур лактобацилл использовали жидкую или агаризованную среду MRS следующего состава (г/л): гидролизат казеина — 10,0; мясной экстракт - 10,0; дрожжевой экстракт — 5,0; глюкоза — 20,0; ацетат натрия -5,0; цитрат аммония (двузамещенный) - 2,0; твин 80 - 1,0; К2НР04 - 2,0; MgS04 • 7Н20 - 0,2; MnS04" 4Н20 - 0,05; вода дистиллированная. рН среды устанавливали ~ 6,5 по реакции с бромтимолблау. Жидкую среду предварительно кипятили для освобождения от кислорода, разливали в пенициллиновые пузырьки с резиновыми пробками и укупоривали алюминиевыми колпачками. Для приготовления агаризованной среды в жидкую MRS добавляли 1,5-2,0% агара. Сосуды со средой стерилизовали в автоклаве при 0,5 ати 20-30 мин.

Для получения накопительных культур сульфатредукторов использовали среду Постгейта В следующего состава (г/л): лактат натрия - 3,5 мл; дрожжевой экстракт - 1,0; NH4C1 - 1,0; CaS04" Н20 - 1,0; КН2Р04 - 0,5; MgS04 7Н20 - 2,0; FeS04 7Н20 - 0,5; раствор микроэлементов по Пфеннигу - 1 мл; 1% раствор Na2S в 1%-м растворе ЫаНСОз - 5-8 мл; вода дистиллированная. рН среды доводили до 7,0-7,5. 1% раствор Na2S в 1%-м растворе КаНСОз стерилизовали отдельно и добавляли в стерильную среду перед посевом. FeS04" 7Н20 растворяли в 1%-й НС1, стерилизовали отдельно и добавляли в стерильную среду перед посевом.

Получение накопительных культур микроорганизмов-гидролитиков,'. использующих целлюлозу, проводили на среде Имшенецкого для анаэробных бактерий следующего состава (г/л): фильтровальная бумага - 15,0; NaNH4HP04- 1,5; КН2Р04 - 0,5; К2НР04 - 0,5; MgS04 7Н20 - 0,4; NaCl - 0,1; пептон - 5,0; MnS04 4Н20 - следы; FeS04 7Н20 - следы; СаСОз — 2,0;вода дистиллированная. рН устанавливали 7,0-7,4. Среду стерилизовали при 0,5 ати 20-30 мин.

Для выделения чистых культур анаэробных азотфиксаторов из рода Clostridium использовали среду Виноградского следующего состава (г/л): глюкоза — 20,0; К2НР04 — 1,0; MgS04" 7Н20 - 0,5; СаСОэ - 20,0; NaCl - 0,5; MnS04, FeS04 - следы; дрожжевой экстракт — 10 мг; раствор микроэлементов по Фёдорову - 1 мл; вода дистиллированная.

Для выделения из сообществ бактерий группы кишечной палочки была использована среда Эндо, приготовленная нижеописанным способом. 100 мл стерильного МПА (рН 7,4) расплавляли на водяной бане и охлаждали до 70°С, прибавляли 1 г лактозы, предварительно растворённой в небольшом количестве воды и прокипячённой. В отдельных пробирках готовили 2-3 мл спиртового насыщенного раствора фуксина и 10 мл 10% водного раствора Na2SC>3. В стерильную пробирку вносили 1 мл фуксина и прибавляли раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет). Приготовленную смесь вливали в расплавленный МПА с лактозой, хорошо перемешивали и разливали по стерильным чашкам. Среду использовали сразу, без стерилизации.

5.1.4. Выделение чистых кулыур из анаэробных сообществ

Для выделения чистых культур образец анаэробной накопительной культуры, разлагающей аминоароматические соединения, высевали глубинным способом в агаризованную (1,9% агара) анаэробную среду в чашки Петри. Чашки инкубировали в анаэробном боксе с газогенераторными пакетами (ОепЬох, Вютепеих) для создания анаэробной атмосферы. Полученные отдельные колонии снимали петлей с агара и переносили в стерильную среду в пробирках Эппендорф. После тщательного перемешивания суспензию шприцем переносили в пенициллиновые пузырьки с анаэробными стерильными жидкими средами. После инкубации до появления видимой мутности чистоту выделенной культуры проверяли микроскопированием и высевом как на агаризованную анаэробную минеральную среду, содержащую (амино)аромэтический субстрат, так и на богатые питательные среды (рис.14).

Рис.14. Обобщённая схема выделения чистых культур из анаэробных сообществ.

Выделение чистых культур лактобацилл проводили на среде MRS из предварительно полученной накопительной культуры (рис.15). Накопительную культуру, посеянную с помощью шприца в стерильный пенициллиновый флакон с жидкой средой MRS, инкубировали в течение 1-3 сут при температуре 37°С до появления признаков роста (помутнения, появления запаха, изменения цвета среды, газообразования и т.д.). Затем из накопительной культуры отбирали стерильным шприцем каплю культуральной жидкости и растирали посевной материал по поверхности стерильной агаризованной среды MRS в чашке Петри стерильным стеклянным шпателем круговыми движениями. Засеянные чашки помещали в анаэростат и выдерживали 2-3 сут. Из отобранных колоний проводили посев клеток в пенициллиновые флаконы со стерильной средой MRS. Пузырьки с посевами инкубировали в термостате при 37°С в течение 1-3 сут до появления признаков роста. Чистоту выделенной культуры проверяли микроскопированием культуральной жидкости и поверхностным рассевом на твердой среде MRS в чашках Петри.

Получение накопительной культуры

Посев на чашки

Петри с агаризованной средой MRS

Получение отдельных колоний

Проверка на чистоту (микроскопия, однородность колоний на твердой среде)

Посев отдельной колонии на среду MRS

Описание куль ту рал ьных признаков

Чистая культура ш

Рис. 15. Выделение чистых культур лактобацилл из накопительных культур.

5.1.5. Молекулярно-биологические методы

5.1.5.1. Выделение ДНК

Выделение ДНК из чистых культур и первичную очистку проводили модифицированным фенол-хлороформным методом (Маниатис и др., 1984; Нетрусов и др., 2005).

К 200 мг сырой биомассы в пробирке Эппендорф на 1,5 мл добавляли 400 мкл экстракционного буфера (TNE буфер, содержащий 100 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 100 мМ ЭДТА (рН 8,0), 1,5 мМ NaCl) и 200 мг стеклянных бус (диаметр 0,1 мм). Смесь встряхивали с помощью прибора "Mini beadbeater-8" (Biospec Products, Bartlesville, США) 2 мин в режиме гомогенизации. Добавляли 40 мкл 20% раствора додецилсульфата натрия (SDS), встряхивали с помощью прибора "Mini beadbeater-8" 5 сек и инкубировали 1 ч при 65°С в термостате "СН-100" (BioSan, Рига, Латвия). Пробирки со смесью центрифугировали 5 мин при 6000 g на центрифуге "Centrifuge 5415 R"(Eppendorf AG, Hamburg, ФРГ) и переносили супернатант в новую пробирку Эппендорф на 1,5 мл. Осадок ресуспендировали в 400 мкл экстракционного буфера, инкубировали 5 мин при 65°С, центрифугировали 10 мин при 6000 g и вновь отбирали супернатант. К объединенному-; супернатанту (~ 400мкл) добавляли 0,5 объема (200мкл) раствора полиэтиленгликоля (30%)/NaCl (1,6М) и инкубировали 2 ч при комнатной температуре (~ 22°С). Смесь центрифугировали 10 мин при 10000 g, сливали надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 300 мкл ТЕ буфера (ЮмМ Трис-HCl, 1 мМ Na-ЭДТА). Добавляли ацетат, к алия (3 М) до конечной концентрации 0,5 M (60 мкл) и выдерживали - на льду 5 мин, затем центрифугировали 10 мин при 13000 g и 4°С. Экстрагировали водную фазу последовательно 300 мкл смеси фенол/хлороформ (1:1) и 300 мкл хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). К отобранной водной фазе (~ 500мкл) добавляли 0,6 объема (300 мкл) 80% изопропанола и выдерживали 60 мин при комнатной температуре. Центрифугировали 10 мин при 10000 g, промывали осадок 70% этанолом, высушивали осадок и ресуспендировали в 50 мкл ТЕ буфере.

Полученные образцы ДНК дополнительно подвергали очистке с помощью миниколонок "Wizard DNA clean-up system" (Promega Corporation, Madison, США) по методике, приведенной в руководстве.

5.1.5.2. ПЦР-амплификация

Для амплификации полноразмерной копии гена 16S рибосомальной РНК использовали пару праймеров 8-27F (5AGAGTTTGATCMTGGСТСAG-3') и 1492R

5* -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'). Объем амплификадионной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1х буфер ДНК-полимеразы BioTaq (17 мМ (NFL^SO^ 67 мМ трис-HCl, pH 8,8, 2 мМ MgCl2); по 12,5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия).

Полимеразную цепную реакцию проводили в приборе "MyCycler" ("Bio-Rad", США) с использованием следующего режима (с понижением температуры на полградуса за каждый цикл):

94°С (начальная денатурация и плавление ДНК) — 9 мин

65-55°С (отжиг) — 1 мин первый цикл

72° С (удлинение цепи)— 2 мин

94°С — 1 мин -.

55°С — 1 мин ~~ последующие 30 циклов 72°С — 2 мин

72°С (финальное удлинение) — 7 мин 4°С — оо

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.

Продукты ПЦР очищали от посторонних примесей при помощи электрофореза в 0,8% агарозе и на миниколонках "Wizard PCRPreps" («Promega», США) по методике;, приведенной в руководстве с поставляемым набором.

ПЦР-продукты, полученные при амплификации с праймерами 8-27F и 1492R (для чистых культур), очищали и секвенировали. ПЦР-продукты, полученные при амплификации с праймерами 338F (GC) (5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG GGGGCACGGGGGG-3') и 518F(GC) (5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGC CCCCGCCCGGTGBCAGCMGCCGCGGTAA-З'Хдля сообществ), очищали и разделяли методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Линькова, Юлия Валерьевна

7.ВЫВОДЫ

1. Вьщелены и изучены анаэробные микробные сообщества, стабильно и с высокой активностью расщепляющие изомеры аминобензойной кислоты и 5-аминосалициловую кислоту до СН4 иС02.

2. Показано влияние на процесс биодеструкции ряда физико-химических факторов: адсорбции, перемешивания, температуры и рН культивирования, освещённости, природы и токсичности аминоароматического субстрата, присутствия легкоусваиваемых источников углерода и энергии.

3. Идентифицированы продукты первичной трансформации: для 2-АБК и салициловой кислоты - бензиловый спирт, для 5-АСК - 2-гидроксибензиловый спирт.

4. Определены основные интермедиаты процесса разложения и установлено их соответствие бензоил-КоА-пути деструкции аминоароматических соединений в выделенных метаногенных сообществах.

5. Из метаногенных сообществ различного происхождения выделено и идентифицировано до вида 5 чистых культур микроорганизмов, участвующих в процессе деструкции аминоароматики: Pseudomonas aeruginosa Tsaydam-5-ASA, Lactobacillus rhamnosus L-43.1, L. paracasei subsp. paracasei L-34, Bacillus subtilis ЕР-ABA, Moraxella osloensis EP-ABA2.

6. Установлено селективное воздействие аминоароматических субстратов на микробное сообщество, выражающееся в снижении биоразнообразия и последовательной смене доминирующих морфотипов.

6.ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биодеградацию различных веществ, загрязняющих окружающую среду, изучают уже несколько десятилетий, однако литературные данные по деструкции аминоароматических соединений довольно немногочисленны и отрывочны. При очистке промышленных сточных вод активно используются сложившиеся естественным путём сообщества микроорганизмов, однако изучению их структуры уделяется очень мало внимания.

Нами были выделены активные анаэробные сообщества, минерализующие аминоароматические ксенобиотики до биогаза. Выделенные микробные консорциумы различались по происхождению источника биологического материала. Так, в работе были использованы анаэробные илы различных очистных сооружений и анаэробные донные отложения естественных водоёмов. Возможность разрушения ароматических веществ донными осадками природных водоёмов, не загрязнённых соответствующими веществами, ранее была уже продемонстрирована различными авторами (Ye et al., 1992; Haggblom et al., 1993; Edwards, Grbic-Galic, 1994; Becker et al., 2001). Однако биодеградация именно аминоароматических веществ сообществами, выделенными из подобных мест обитания, впервые была показана в нашей лаборатории.

На процесс биоконверсии аминоароматических ксенобиотиков влияет целый ряд физико-химических факторов. В литературных источниках имеются данные о связи начальной стадии потребления субстрата с действием небиологических факторов, заключающихся в адсорбции вещества на частицах ила (Wu et al., 1993; Fu, Viraragharan, 2001), однако для аминоароматических соединений такие сведения отсутствовали. Согласно литературным данным, вещества, отличающиеся по химическому строению, по-разному адсорбируются на поверхности клеток (Fu, Viraragharan, 2001). Однако нами было показано, что в случае 2- и 4-АБК химическая природа субстрата не влияла на степень его адсорбции.

С помощью световой и сканирующей электронной микроскопии были продемонстрированы различия в микроскопической картине активных сообществ, инкубируемых при перемешивании и в статичных условиях. Было установлено, что изменение гидродинамических условий влияет на морфолого-функциональные характеристики сообщества. В литературе имеются данные об изменении микроскопической картины сообщества в зависимости от стадии потребления субстрата (Щербакова, 2000; Савельева, 2003). Однако для анаэробных сообществ, культивируемых при перемешивании (в том числе и для потребляющих аминоароматические субстраты), ранее это не было показано.

Нами было также отмечено влияние начальной плотности посевного материала (количества биомассы) на активность процесса деструкции аминоароматики. В больших разведениях не происходило окончательной утилизации субстрата и не наблюдалось образования крупных структурированных агрегатов. В литературе есть данные о различной активности разведений (lOMO"4 и после 10"4) аэробных илов из очистных сооружений (Franklin et al., 2001), связанной с различиями в видовом составе полученных сообществ. Для разведений анаэробных илов, потребляющих аминоароматические ксенобиотики, такая связь показана впервые.

Начальные стадии преобразования субстрата в метаногенном сообществе являются менее изученными, и потому их исследование представлялось нам наиболее важным, вследствие чего на них было акцентировано особое внимание. Определённый интерес представляла идентификация интермедиатов деструкции, поскольку, согласно литературным данным, деградация одного и того же ароматического соединения в анаэробных условиях может идти разными путями. Нами было, показано сходство процессов деструкции 5-АСК метаногенными сообществами, выделенными как из природных мест обитания, так и из искусственных очистных сооружений.

Как известно, существуют различные пути анаэробной конверсии ароматических веществ (Heider, Fuchs, 1997), где в качестве центрального интермедиата могут выступать не только бензоат, но и резорцинол или флороглюцинол. Нами была проведена проверка возможности реализации альтернативных путей деградации использованных в работе аминоароматических веществ, результаты которой свидетельствовали о реализации бензоил-КоА-пути деструкции в изучаемых микробных консорциумах.

Микробные сообщества представляют собой естественно сложившиеся системы, в состав которых входят представители различных таксономических групп, и при анализе состава микробного сообщества мы пытались понять, какие микроорганизмы отвечают за конкретные стадии процесса. По причине синтрофных взаимодействий, особенно выраженных в анаэробных условиях и значительно затрудняющих изоляцию микроорганизмов-членов сообщества, широко применяются молекулярно-биологические методы анализа микробных сообществ без выделения в чистые культуры. Проведённый нами анализ сообществ выявил преобладание некультивируемых микроорганизмов в изучаемых консорциумах, тем не менее, нами были выделены в чистые культуры и идентифицированы до вида несколько микроорганизмов.

Из микробного сообщества Ц-5-АСК, разлагающего 5-АСК до биогаза, была выделена чистая культура Р.aeruginosa. Данный штамм хотя и не принимает непосредственного участия в процессе деструкции аминоароматических соединений, однако при определённых условиях может принимать участие в трансформации аминоароматики по схеме, предложенной ранее (Савельева, 2003). Помимо этого, псевдомонады в составе сообщества могут как опосредованно стимулировать процесс деструкции аминобензойных кислот, так и выполнять функции защиты других членов микробного сообщества от стрессорных воздействий (Николаев, 2011).Остальные выделенные штаммы - две лактобациллы L.rhamnosus и L. paracasei subsp. paracasein Bacillus subtilis, Moraxella osloensis, выделенные из сообществ ЕР/2-АБК и Цайдам/5-ACK, участвуют в процессе биоразрушения аминоароматических субстратов, входя в «бродильный» блок анаэробных микробных сообществ и осуществляя сбраживание линейных интермедиатов - продуктов деструкции аминобензойных кислот. Одной из функций В. subtilis в сообществе может бьггь защита других микроорганизмов-членов сообщества от воздействия неблагоприятных факторов, обусловленная синтезом адаптогенов (Николаев, 2011) и поддержание его стабильного функционирования: Одной из функций, выполняемых всеми выделенными штаммами - факультативными анаэробами, может являться также поддержание условий анаэробиоза в метаногенном I сообществе, что способствует стабилизации процесса метаногенной биодеградации субстратов.

Таким образом, полученные в нашей работе данные позволяют лучше понять механизмы биоконверсии аминоароматических веществ до безвредных минеральных соединений, существенно расширяют знания о структурно-функциональной организации микробных сообществ, как из естественных мест обитания, так и из искусственно созданных человеком очистных сооружений. В нашей работе были продемонстрированы потенциальные возможности микробных сообществ при очистке сточных вод вредных производств. Результаты исследований по микробной деградации загрязнений представляют собой научную основу для биотехнологического процесса обработки стоков, их необходимо учитывать при прогнозировании судьбы поллютантов в окружающей среде и разработке различных очистных сооружений.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Линькова, Юлия Валерьевна, 2011 год

1. Адамович В. В., Дегермеиджи А. Г., 1985. Статистические закономерности организации маловидовых стационарных сообществ микроорганизмов. Журнал общей биологии, 46(4), 527-532.

2. Березин Б.Д., Березин Д.Б., 2001. Курс современной органической химии. Учебное пособие для вузов. М., Высш. шк., 768 с.

3. Воробьёв A.B., Руднева O.A., Марченко С.А., Ермоленко З.М., Боровик Р.В., 2007. Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-8811, используемый для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от тринитротолуола in situ. Патент РФ 2292391 от 27.01.2007.

4. Гвоздяк П.И., Дмитриенко Г.Н., Куликов В.И., 1985. Очистка промышленных сточных вод прикреплёнными микроорганизмами. Химия и технология воды, 7(1), 64-68.

5. Емашова H.A., 2006. Кинетические закономерности конверсии азокрасителей и продуктов их распада анаэробным и аэробным консорциумами микроорганизмов. Дис. канд. хим. наук. М., МГУ, 127 с.

6. Емашова H.A., Котова И.Б., Нетрусов А.И., Калюжный C.B., 2009. Особенности разложения азокрасителей анаэробными микробными сообществами. Прикладная биохимия и микробиология, 45(2), 195-201.

7. Есакова A.A., 2002. Разрушение аминоароматических соединений анаэробными микробными сообществами из естественных мест обитания. Дипломная работа, кафедра микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, 90 с.

8. Заварзин Г.А., 1985. Перспективы использования в промышленности анаэробных микроорганизмов. Биотехнология, 2, 122-127.

9. Заварзин Г. А., 1986. Трофические связи в метаногенном сообществе. Изв. АН СССР, сер.биол., 3, 341-360.

10. Заварзин Г. А., Колотилова H. Н., 2001. Введение в природоведческую микробиологию.Учебное пособие. М., Книжный дом "Университет", 256 с. -.

11. Заварзин Г.А., 2003. Лекции по природоведческой микробиологии. М., Наука, 348 с.

12. Калюжный C.B., Данилович Д.А., Ножевникова А.Н., 1991. Анаэробная биологическая очистка сточных вод. "Итоги науки и техники". Серия «Биотехнология». Т.29. М., 1991.С.156.

13. Кожевин П.А., 2000. Популяционная экология почвенных микрорганизмов. Дисс. на соиск. уч. степени докт. биол. наук в форме науч. докл. М., МГУ, 2000, 55с.

14. Котова И.Б., Савельева О.В., Дьяконова А.Т., Скляр В.И., Калюжный C.B., Стамс А., Нетрусов А.И., 2005. Анаэробные микробные сообщества, разлагающие аминоароматические кислоты. Прикладная биохимия и микробиология, 41 (4), 422428.

15. Коцюрбенко О. Р., Ножевникова A. H., Заварзин Г. А., 1992. Анаэробное разложение органического вещества психрофильными микроорганизмами. Журнал общей биологии, 53(2), 159-175.

16. Лейбо А.И., Нетрусов А.И., Конрад Р., 2006. Исследование влияния концентрации водорода на структуру сообщества гидрогенотрофных метаногенов методом T-RFLP-анализа ампликонов генов 16S рРНК. Микробиология, 75(6), 786-791.

17. Лурье Ю.Ю., 1984. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия. С.170.

18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: пер. с англ. М.: "Мир", 480 с.

19. Милько Е.С., Максимович М.О., Лопатина Л.И., Породенко Е.В., 2010. Особенности роста диссоциантов углеводородокисляющих родококков и псевдомонад в моно- и смешанных культурах. Прикладная биохимия и микробиология, 46(5), 538-542;

20. Неронова.Н. М., Ибрагимова С. И., Иерусалимский Н. Д., 1967. Влияние концентрации пропионата на удельную скорость роста Propionibacterium shermanii. Микробиология, 36(3), 404-409.

21. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М., Колотилова H.H. Котова И.Б. и др., 2005. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. М.: "Академия", 608 с.

22. Нетрусов А.И.,. Котова И.Б., 2006. Микробиология: учебник для студ. высш. учеб. заведений. М.: "Академия", 352 с.

23. Николаев Ю.А., 2011. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов Автореф. докт. дисс. Москва, 2011, 48 с.

24. Ножевникова А.Н., 1994. Метаногенные микробные сообщества в охране окружающей среды. Дис. докт.биол. наук. Москва, 1994.

25. Остроумов С.А., 1986. Введение в биохимическую экологию. М.: Изд-во Московского университета, 176 с. .,

26. Печуркин Н. С., 1981. Смешанные проточные культуры микроорганизмов—новый этап в развитии теоретической и прикладной микробиологии. В кн.: Смешанные проточные культуры микроорганизмов. Новосибирск, Наука, 3-25. .

27. Савельева О. В., 2003. Разложение аминоароматических соединений метаногенными сообществами. Дис. канд. биол. наук. Москва, МГУ, 2003, 120 с.

28. Самсонова А., Макаревич А., 2009. Микробиологические методы повышения вторичной добычи нефти. Нефтехимический комплекс, №1, 56-64.

29. Сиволодский Е.П., Ровнов Н.В., Петров Л.Н., 1994. Механизм специфической хромогенной реакции Klebsiella spp. на питательной среде с 5-аминосалициловой кислотой. Микробиология, 63(3), 489-494.

30. Скрябин Г. К., Головлёва Л.А., 1974. Микробиологическая трансформация' и деградация пестицидов. Изв. АН СССР, сер. биол., 6, 805-817.

31. Фуряева А. В., 1981. Экспериментальные исследования динамики смешанных дрожжевых культур в проточных системах. В кн.: Смешанные культуры микроорганизмов. Новосибирск, Наука, 116-144.

32. Щербакова В.А., 2000. Анаэробная биодеградация алкилбензолсульфонатов. Автореф. канд. дисс. Пущино, 2000, 24 с.

33. Aftring R.P., Taylor B.F., 1981. Aerobic and anaerobic catabolism of phthalic acid by a nitrate-respiring bacterium. Arch. Microbiol., 130, 101-104.

34. Asano Y., Sekigawa Т., Inukai H., Nakazawa A., 1988. Purification and properties of formate dehydrogenase from Moraxella sp. strain C-l. Journal of Bacteriology, 170(7), 3189-3193.

35. Auburger G., Winter J., 1995. Isolation and physiological characterization of Syntrophus buswelli strain GA from a syntrophic benzoate-degrading, strictly anaerobic coculture. Appl. Microbiol. Biotechnol., 44(3), 241-248.

36. Bache R., Pfennig N., 1981. Selective isolation of Acetobacterium woodi on methoxylated aromatic acids and determination of growth yields. Arch. Microbiol., 130(3), 255-261.

37. Balba M.T., Senior E., Nedwell D.B., 1981.Anaerobic metabolism of aromatic compounds by microbial association-isolated from saltmarsh sediment. Biochem. Soc. Trans;,«9(1), 230231.

38. Becker J.G., Berardesco G., Rittmann B.E., Stahl D.A., 2006. Effects of endogenous substrates on adaptation of anaerobic microbial communities to 3-chlorobenzoate. Appl. Env. Microbiol., 72(1), 449 456.

39. Berry D.F., Francis A.J., Bollag J.M., 1987. Microbial metabolism of homocyclic and heterocyclic aromatic compounds under anaerobic conditions. Microbiological Reviews, 51(1), 43-59.

40. Bitton G. "Wastewater microbiology". Third edition."John Wiley and Sons, Inc.", Hoboken, New Jersey, 2005. P.274.

41. Boll M., 2005. Dearomatizing benzene ring reductases. J.Mol. Microbiol. Biotechnol., 10, 132-142.

42. Bossert I. D., Young L. Y., 1986. Anaerobic oxidation of p-cresol by a denitrifying bacterium. Appl. Env. Microbiol., 52(5), 1117-1122.

43. Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248254.

44. Braun K., Gibson D., 1984. Anaerobic degradation of 2-aminobenzoate (anthranilic acid) by denitrifying bacteria. Appl. Env. Microbiol., 48(1), 102-107.

45. Calli B., Mertoglu B., Tas N., Inane B., Yenigun O., Oztyrk I., 2003. Investigation of variations in microbial diversity in anaerobic reactors treating landfill leachate. Water Sci. Technol., 48(4), 105-112.

46. Calli B., Mertoglu B., Roest K., Inane B., 2006. Comparison of longterm performances and final microbial compositions of anaerobic reactors treating landfill leachate. Bioresour. Technol., 97(4), 641-647.

47. Cao B., Nagarajan K., Loh K.-C., 2009. Biodégradation of aromatic compounds: current status and opportunities for biomolecular approaches. Appl. Microbiol. Biotechnol., 85(2), 207-228.

48. Carmona M., Zamarro M.T., Blazquez B., Durante-Rodriguez, Juarez J.F., Valderrama J.A., Barragan M.J.L. Garcia J.L., Diaz E., 2009. Anaerobic catabolism of aromatic compounds: a genetic and genomic view. Microbiol. Mol. Biol. Reviews, 73(1), 71-133.

49. Chan O. C., Liu W. T., Fang H. H. P., 2001. Study of microbial community of brewery-treating granular sludge by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rRNA gene. Water Sci. Technol., 43(1), 77-82.

50. Chin K. J., Lukow T., Conrad R., 1999. Effect of temperature on structure ahd function of methanogenic archael community in an anoxic rice field soil. Appl. Env. Microbiol., 65(6), 2341-2349.

51. Chiu P. C., Lee M., 2001. 2-Bromoethanesulfonate affects bacteria in a trichloroethene-dechlorinating culture. Appl. Env. Microbiol., 67(5), 2371-2374.

52. Conrad R., Phelps T. J., Zeikus J. G., 1985. Gas metabolism evidence in support of the juxtaposition of hydrogen-producing and methanogenic bacteria in sewage sludge and lake sediments. Appl. Environ.Microbiol., 50(3), 595-601.

53. Conrad R., Bak F., Mayer H. P., Schutz H., 1989. Hydrogen turnover by psychrotrophic homoacetogenic and mesophilic bacteria in anoxic paddy soil and lake sediment. FEMS Letters. Microb. Ecology, 62,285-294.

54. Dagley S., 1986. Biochemistry of aromatic hydrocarbon degradation in pseudomonads. In: The Bacteria. Vol. 10. J.R. Sokatch L.N. Ornston, eds.: p.527-555. New York : Academic Press.

55. Dalton H. M., Poulsen L. K., Halasz P., Angles M. L., Goodman A. E., Marshall K. C., 1994. Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure. J. Bacteriol., 176(22), 6900-6906.

56. Davey M.E., O'Toole G. A., 2000. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64(4), 847-867.

57. Deriell E., Comeau J., Villemur R., 1999.Two-luquid-phase bioreactors for enchanced degradation ofhydrophobic/toxic compounds. Biodegradation, 10(3), 219-233.

58. Diaz E., Amils R., Sanz J. L., 2003. Molecular ecology of anaerobic granular sludge grown at different conditions. Water Sci. Technol. 48(6), 57-64.

59. Diaz E., 2004. Bacterial degradation of aromatic pollutants: a paradigm of metabolic versatility. Int. Microbiology, 7(3), 173-180.

60. Diaz E.E., Stams A. J. M., Amils R., Sanz J. L., 2006. Phenotypic properties and microbial diversity of methanogenic granules from a full-scale Upflow Anaerobic Sludge Bed Reactor treating brewery wastevvater.Appl. Env. Microbiol., 72(7), 4942-4949.

61. Ditchfield P., 1986. Industrial waste water treatment: the anaerobic alternative. Trends Biotechnol., 4(12), 309-313.

62. Dolfing J., Criffoen A., Neerwen A. R. W., 1985. Chemical and bacteriological composition of granular methanogenic sludge. Can. J. Microbiol., 31(8), 744-750.

63. Donlon B.A., Razo-Flores E., Field J.A., Lettinga G., 1995. Toxicity of N-substituted aromatics to acetoclastic methanogenic ativity in granular sludge. Appl. Env. Microbiol., 61(11), 3889-3893.

64. Edwards E.A., Grbic-Galic D., 1994. Anaerobic degradation of toluene and o-xylene by a methanogenic consortium. Appl. Env. Microbiol., 60(1), 313-322.

65. Fang H. H. P., Chui H. K., Li Y.Y., 1994. Microbial structure and activity of UASB granules treating different wastewaters. Water Sci. Technol., 30(12), 87-96.

66. Fang H. H. P., Chui H. K., Li Y.Y., 1995. Effect of degradation kinetics on the microstructure of anaerobic biogranules. Water Sci. Technol., 32(8), 165-172. /

67. Fang H. H. P., 2000. Microbial distribution in UASB granules and its resulting effects. Water Sci.Technol., 42(12), 201-208.

68. Ferrera I., Massana R., Casamayor E. O., Balague V., Sanchez O., Pedros-Alio C., Mas J., 2004. High-diversity biofilm for the oxidation of sulfide-containing effluents Appl. Microbiol. Biotechnol., 64(5),726-734.

69. Fey A., Conrad R., 2000. Effect of temperature on carbon and electron flow and on the archael community in methanogenic rice field soil. Appl. Env. Microbiol., 66(11), 47904797.

70. Francese A., Cordoba P., Duran J., Sineriz F., 1998. High velocity and organic loading rate improve granulation in UASB reactors. World J. of Microbiology and Biotechnol., 14(3), 337-341.

71. Franklin R.B., Garland J.Y., Bolster C.H., Mills A.L., 2001. Impact of dilution on microbial community structure and functional potential: comparison of numerical simulations and batch culture experiments. Appl. Env. Microbiol., 67(2), 702-712.

72. Fredrickson A. G., 1977. Behavior of mixed culture of microorganisms. Ann. Rev. Microbiol., 31, 63-87.

73. Fu Y., Viraragharan T., 2001. Fungal decolorization of dye wastewaters: a review. Bioresourse Tecnol., 79(3), 251-262.

74. Fuchedzhieva N., Karakashev D., Angelidaki I., 2008. Anaerobic biodégradation of fluoranthene under methanogenic conditions in presence of surface-active compounds. Journal of Hazardous Materials, 153(1-2), 123-127.

75. Fuchs G., 2008. Anaerobic metabolism of aromatic compounds. Ann. N. Y. Acad: Sci., 1125(1), 82-99.

76. Gonzalez-Gil G., Lens P. N. L., van Alest A., Versprille A. I., Lettinga G., 2001. Cluster structure of anaerobic aggregates of an expanded granular sludge bed reactor. Appl. Env. Microbiol., 67(8), 3683-3692.

77. Grotenhuis J. T. C., Smit M., Plugge C. M., Zehnder A. J. B., 1992. Hydrophobities and electrophoretic mobilities of anaerobic bacterial isolates from methanogenic granular sludge. Appl: Env.-Microbiol., 58(3), 1054-1056.

78. Guiot S.R., Pauss A., Costerton J.W., 1992. A structured model of the anaerobic granules consortium. Water Sci. Technol., 25(7), 1-10.

79. Hagglbom M.M., Rivera M.D., Young L.Y., 1993. Influence of alternative electron acceptors on the anaerobic biodegradability of chlorinated1 phenols and benzoic acids. Appl. Env.

80. Microbiol., 59(4), 1162-1167.

81. Harayama S., Kok M., Neidle E.L., 1992. Functional and evolutionary relationships among diverse oxygenases. Annu. Rev. Microbiol., 446; 565-601.

82. Harwood C. S., Burchhardt G., Herrmann H., Fuchs G., 1999. Anaerobic metabolism of aromatic compounds via the benzoyl-CoA pathway. FEMS Microbiol. Rev., 22(5), 439—458.

83. Harwood C. S., Parales R.E., 1996. The P-ketoadipate pathway and the biology of self identity. Annu. Rev. Microbiol., 50, 553-590.

84. Head I.M., 1998. Bioremediation: towards a credible technology. Microbiology, 144(3), 599608. ÎÎ.

85. Heider J., Fuchs G., 1997. Microbial anaerobic aromatic metabolism. Anaerobe, 3(1), 1-22.

86. Heider J., 2007. Adding handles to unhandy substrates: anaerobic hydrocarbon activation mechanisms. Curr. Opin. Chem. Biol., 11(5), 188-194.

87. HirshR., 1984. Microcolony formation and consortia. In: Marshall KC, ed. Microbial adhesion and aggregation. Berlin: Springer, p. 373—93.

88. Hopkins B: T., Mclnerney M. J., Warikoo V., 1995. Evidense for anaerobic syntrophic benzoate degradation threshold and isolation of the syntrophic benzoate degrader.Appl. Env. Microbiol., 61(2), 526-530.

89. Hori T., > Haruta S., Ueno Y., Ishii M., Igarashi Y., 2006. Dynamic transition of a methanogenic population in response to the concentration of volatile fatty acids in a thermophilic anaerobic digester. Appl. Env. Microbiol., 72(2), 1623 — 1630.

90. Ishii S., Kosaka T., Hori K., Hotta Y., Watanabe K., 2005.Coaggregation facilitates interspecies hydrogen transfer between Pelotomaculum thermopropionicum and

91. Methanothermobacter thermaiitotrophicus. Appl.Environ. Microbiol., 71(12), 78387845.

92. Ito T., Okabe S., Satoh H., Watanabe Y., 2002. Successional development of sulfate-reducing bacterial populations and their activities in a wastewater biofilm growing under microaerophilic conditions. Appl. Environ. Microbiol., 68(3), 1392-1402.

93. Jackson B. E., Mclnerney M. J., 2002. Anaerobic microbial metabolism can proceed close to thermodynamic limits. Nature, 415, 454-456.

94. James G. A., Korber D. R., Costerton J. W., 1995. Digital image analysis of growth and starvation responces of a surface-colonizing Acinetobacter sp. J. Bacteriol., 177(4), 907915.

95. Kahng H.-Y., Kukor J.J., Oh K.-H., 2000. Characterization of strain HY99, a novel microorganism capable of aerobic and anaerobic degradation of aniline. FEMS Microbiol. Lett., 190(2), 215-221.

96. Kalyuzhnyi S.V., Sclyar V.I., Mosolova T.P., Kucherenko I.A., Russkova I.A., Degtyarova N.N., 2000. Methanogenic biodégradation of aromatic amines.Water Sci. Technol., 42(5-6), 363-370.

97. Khanna P.,. Rajkumar В., Jothikumar N., 1992. Anoxygenic degradation of aromatic substances by Rhodopseudomonaspalustris. Curr. Microbiol., 25(1), 63-67.

98. Kleerebezem R, Hulshoff Pol L.W., Lettinga G., 1999. Anaerobic biodegradability of phthalic acid isomers and related compounds. Biodégradation, 10(1), 63-73.

99. Kleinsteuber S., Schleinitz K.M., Breitfeld J., Harms H., Richnow H.H., Vogt C., 2008. Molecular characterization of bacterial communities mineralizing benzene under sulfate-reducing conditions. FEMS Microbiol.Ecol., 66(1) 143-157.

100. Kong Y. H., Beer M., Rees G. N., Seviour R. J., 2002. Functional analysis of microbial communities in aerobic-anaerobic sequencing batch reactors fed with different phosphorus/carbon (Р/С) ratios. Microbiology, 148(8), 2299-2307.

101. Kotova I. В., Savel'eva О. V., D'yakonova A. T., Sklyar V. I., Kalyuzhnyi S. V., Stams A.J.M., Netrusov A. I., 2005. Anaerobic microbial associations degrading aminoaromatic acids. Apppl. Biochem. Microbiol., 41(4), 372-376.

102. Krumbolz L. R, Bryant M. P., 1985. Clostridium pfennigi sp. nov. uses methoxyl groups of mono-benzenoids and produces butyrate. Int. J. System. Bact., 35(4), 454-456.

103. Langkau В., Ghisla S., Buder R., Fuchs G., 1990. 2-Aminobenzoyl-CoA monooxygenase/reductase, a novel type of flavoenzyme. Identification of the reaction products. Eur. J. Biochem., 191(2), 365—371.

104. La Para T. M., Nakatsu C. H., Pantea L., Alleman J. E., 2000. Phylogenetic analysis of bacterial communities in mesophilic and thermophilic bioreactors treating pharmaceutical wastewater. Appl. Environ. Microbiol., 66(9), 3951—3959.

105. Lens P. N., de Beer D., Houwen F. P., 1993. Heterogeneous distribution of microbial activity in methanogenic aggregates: pH and glucose microprofiles. Appl. Env. Microbiol., 59(11), 3803-3815.

106. Liu W. T., Chan O. C., Fang H. H. P., 2002. Microbial community dynamics during startup of acidogenic anaerobic reactors. Water Res., 36(13), 3203-3210.

107. Luengo J.M., Garcia J.L., Olivera E.R., 2001. The phenylacetyl-CoA catabolon: a complex catabolic unit with broad biotechnological applications. Mol. Microbiol., 39(6), 1434— 1442.

108. MacLeod F. A., Guiot S. R., Costerton J. W., 1990. Layered structure of bacterial aggregates produced in UASB- and filter reactor. Appl. Env. Microbiol., 56(6), 1598-1607.

109. Malic A., Sakamoto M., Hanazaki S., Osawa M., Suzuki T., Tochigi M., Kakii K., 2003. Coaggregation among nonflocculating bacteria isolated from activated sludge. Appl. Env. Microbiol., 69(10), 6056-6063.

110. Marshall K.C., 1993. Microbial ecology: whither goes thou. In: Guerrerro R, Pedros-Alio C (eds.). Trends in microbial ecology. Spanish Society for Microbiology, Barcelona, p. 5-8.

111. Martin W., Muller M., 1998. The hydrogen hypothesis for the first eukaryote. Nature, 392, 37-41.

112. Massol-Deya A. A., Whallon J., Hickey R. F., Tiedje J. M., 1995. Channel structures in aerobic biofilms of fixed-films reactors treating contaminated groundwater. Appl. Env. Microbiol., 61(2), 769-777.

113. McLeod M.P., Eltis L.D., 2008. Genomic insights into the aerobic pathways for degradation of organic pollutants, p. 1-23. In E.Diaz (ed.), Microbial degradation: genomics and molecular biology. Caister Academic Press, Norfolk, United Kingdom.

114. McNaughton S. J., 1978. Stability and diversity of ecological communities. Nature, 274, 251-253.

115. Mohamed M.E., Ismail W.,Heider J., Fuchs G., 2002. Aerobic metabolism of phenylacetic acids in Azoarcus evansii. Arch. Microbiol., 178,180-192.

116. Moller S., Korber D. R., Wolfaard G. M., Molin S., Caldwell D. E., 1997. Impact of nutrient composition on a degradative biofilm community. Appl. Env. Microbiol., 63(6), 2432-2438.

117. Morales A., Garland J. L., Lim D. V., 1996. Survival of potentially pathogenic human-associated bacteria in the rhizosphere of hydroponically grown wheat. FEMS Microbiol. Ecol., 20(3), 155-162.

118. Mountfort D. O., Brulla W. J., Krumholz L. R., Bryant M. P., 1984. Syntrophus buswelli gen. nov., sp. nov.: a benzoate catabolizer from methanogenic ecosystems. Int. J. Syst. Bacteriol., 34(2), 216-217.

119. Nakano M.M., Dailly Y.P., Zuber P., Clark D.P., 1997. Characterization of anaerobic fermentative growth of Bacillus subtilis: identification of fermentation end products and genes required for growth. Journal of Bacteriology, 179(21), 6749-6755.

120. Nealson K. H., Inagaki F., Takai K., 2005. Hydrogen-driven subsurface lithoautotrophic microbial ecosystems (SLiMEs): do they exist and why should we care? Trends Microbiol., 13(9), 405—410.

121. Nozhevnikova A. N., Holliger C., Ammann A., Zehnder A. J. B., 1997. Methanogenesis in sediments from deep lakes at different temperatures (2-70°C). Water Sci. Technol., 36(6-7), 57-64.

122. O'Neill C., Lopes A., Esteves S., Haw Kes F.R., Hawkes D.L., Willox S., 2000. Azo-dye degradation in an anaerobic-aerobic treatment system operating on simulated textile effluent. Appl. Microbial. Biotechnol., 53(2), 249-254.

123. Pains S.S., Loewenthal R.E., Dold P.L., Marais G.R., 1987. Hypothesis for pelletisation in upflow anaerobic sludge blanket reactor. Water SA, 13(2), 69-80.

124. Perez-Diaz I.M., McFeeters R.F., 2009. Modification of azo dyes by lactic acid bacteria. J. Appl. Microbiol., 107(2), 584-9.

125. Peu P., Brugère H., Pourcher A.-M., Kérourédan M., Godon J-J., Delgenès J.-P., Dabert, P., 2006. Dynamics of a pig slurry microbial community during anaerobic storage and management.Appl. Envir. Microbiol., 72(5), 3578 3585.

126. Picioreanu C., van Loosdrecht M. C. M., Heijnen J. J., 1998. Mathematical modeling of biofilm structure with a hybrid differential-discrete cellular automaton approach. Biotechnol. Bioeng., 58(1), 101-116.

127. Picioreanu C., van Loosdrecht M. C. M., Heijnen J. J., 1999. Discrete- differential modeling of biofilm structure. Water Sci. Technol., 39(7), 115-122.

128. Raber T., Gorontzy T., Kleinschmidt M., Steinbach K., Blotevogel K.H., 1998:;Anaerobic degradation and transformation of p-toluidine by the sulfate-reducing bacterium Desulfobacula toluolica. Curr. Microbiol., 37(3),172-176.

129. Razo-Flores E., Donlon B., Lettinga G., Field J.A., 1997a. Biotransformation and biodégradation of N-substituted aromatics in methanogenic granular sludge FEMS Microbiol Rev., 20(3-4), 525-38.

130. Razo-Flores E., Luijten M., Donlon B.A., Lettinga G., Field J., 1997b. Biodégradation of selected azo-dyes under methanogenic conditions. Wat. Sci. Technol., 36(6-7), 65-72.

131. Rintala J., Lepisto S., Ahring B., 1993. Acetate degradation at 70 deg C in Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactors and temperature response of granules grown at 70 deg C.Appl. Env. Microbiol., 59(6), 1742-1746.

132. Robinson T., McMullan G., Marchan R., Nigam R., 2001. Remediation of dyes in textile-effluent: a critical review on current treatment technologies with proposed alternative. Bioresourse Technol., 77(3), 247-255.

133. Roest K., Heilig H. G., Smidt H., de Vos W. M., Stams A. J. M., Akkermans A. D. L., 2005. Community analysis of a full-scale anaerobic bioreactor treating paper mill wastewater. Syst. Appl. Microbiol., 28(2),175-185.

134. Saiki Y., Iwabuchi C., Katami A., Kitagawa Y., 2002. Microbial analyses by fluorescence in situ hybridisation of well-settled granular sludge in brewery wastewater treatment plants. J. Biosci. Bioeng., 93(6), 601-606.

135. Sam-Soon P.A., Looewenthal R.E., Dold P.L., Marais D.V.R., 1988. Pelletization in upflow anaerobic sludge bed reactors. In: (Hall ER, Hobson PN, eds.)Anaerobic digestion. Oxford, UK: Pergamon Press.p. 55-60.

136. Sanchez J.M., Arijo S., Munoz M.A., Morinigo M.A., Borrego J.J., 1994. Microbial colonization of different support materials used to enhance the methanogenic process. Appl. Microbiol. Biotechnol., 41(4), 480^86.

137. Santegoeds C. M., Ferdelman T. G., Muyzer G., de Beer D., 1998. Structural and functional dynamics of sulfate-reducing populations in bacterial biofilms. Appl. Environ. Microbiol., 64(10), 3731-3739.

138. Satoh H., Miura Y., Tsushima I., Okabe S., 2007. Layered structure of bacterial and i archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl. Env. Microbiol., 73(22), 7300-7307.

139. Scheline R. R., 1966. Decarboxylation and demethylation of some phenolic benzoic acid derivatives by rat caecal contents. J. Pharm. Pharmac., 18, 664-669.

140. Schink B., Stams A.J.M., 2002. Syntrophism among prokaryotes. In M. Dworkin, K. H. Schleifer, and E. Stackebrandt (ed.)./The prokaryotes, 3rd ed. Springer Verlag, New York, N.Y.

141. Schink B., Thauer R. K., 1988. in Granular Anaerobic Sludge: Microbiology and Technology (eds Lettinga G., Zehnder A. J. B., Grotenhuis J. T. C., Hulshoff L. W.), p.5-17 (Pudoc, Wageningen, The Netherlands, 1988).

142. Schink B., 1997. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation. Microbiol. Molecular Biol. Rev., 61(2), 262-280.

143. Schink B., Phillips B., Muller J., 2000. Anaerobic degradation of phenolic compounds. Naturwissenschaften, 87(1), 12—23.

144. Schmidt J. E., Ahring B. K., 1993. Effects of hydrogen and formate on the degradation of propionate and butyrate in thermophilic granules from an UASB-reactor. Appl. Env. Microbiol., 59(8), 2546-2551.

145. Schnell S., Bak F., Pfennig N., 1989. Anaerobic degradation of aniline and dihydroxybenzenes by newly isolated sulfate-reducing bacteria and description of Desulfobacterium anilini. Arch. Microbiol., 152(6), 556-563.

146. Schnell S., Schink B., 1991.Anaerobic aniline degradation via reductive deamination of 4-aminobenzoyl-CoA m Desulfobacterium anilini. Arch. Microbiol., 155(2), 183-190.

147. Schnell S., Schink B., 1992. Anaerobic degradation of 3-aminobenzoate by a newly isolated sulfate reducer and methanogenic enrichment culture. Arch. Microbiol., 158(4), 328-334.

148. Schuhle C., Jahn M., Ghisla S., Fuchs G., 2001. Two similar gene clusters coding for the enzymes of a new type of aerobic 2-aminobenzoate (anthranilate) metabolism in the bacterium Azoarcus evansii. J. Bacteriol., 183(18), 5268—5278.

149. Sekiguchi Y., Kamagata Y., Syutsubo K., Ohashi A., Harada H., Nakamura K., 1998. Phylogenetic diversity of mesophilic and thermophilic granular sludges determined by 16S rRNA gene analysis. Microbiology, 144(9), 2655-2665.

150. Shinoda Y., Sakai Y., Ue M., Hiraishi A., Kato N., 2000. Isolation and characterization of a new denitrifying spirillum capable of anaerobic degradation of phenol. Appl. Envir. Microbiol., 66(4), 1286 1291.

151. Slyter L. L., Weaver J. M., 1977. Tetrahydrofolate and other growth requirements of certain strains of Ruminococcus flavifaciens. Appl. Env. Microbiol., 33(2), 363-369.

152. Song B., Palleroni N.J., Haggblom M.M., 2000a. Description of strain 3CB-1, a genomovar of Thauera aromatica, capable of degrading 3-chlorobenzoate coupled to nitrate reduction. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 50(2),551-558.

153. Song B., Palleroni N.J., Haggblom M. M., 2000b. Isolation and characterization of diverse halobenzoate-degrading denitrifying bacteria from soils and sediments. Appl. Env. Microbiol., 66(8), 3446 3453.

154. Spain J.C., Gibson D.T., 1991. Pathway for biodégradation of p-nitrophenol in a Moraxella sp. Appl. Env. Microbiol., 57(3), 812-819.

155. Sponza D. T., 2001. Rapid granulation and sludge retention for tetrachloroethylene removal in an UASB reactor. Biotechnology Letters, 23(15), 1209-1216.

156. Stackebrandt E., Goebel B.M., 1994. Taxonomic note: A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol., 44(4), 846-849.

157. Stams A. J. M., 1994. Methabolic interactions between anaerobic bacteria in methanogenic environments. Antonie van Leewenhoek, 66(3), 271-294.

158. Stams A.J.M., Plugge C.M., 2009. Electron transfer in syntrophic communities of anaerobic bacteria and archaea. Nature Reviews Microbiol, 7(8), 568-577.

159. Stoffels M., Amann R., Ludwig W., Hekmat D., Schleifer K. H., 1998. Bacterial community dynamics during start-up of a trickle-bed bioreactor degrading aromatic compounds. Appl. Env. Microbiol., 64(3), 930-939.

160. Sulfita J. M., Horowitz A., Shelton D. R., Tiedje J. M., 1982. Dehalogenation: a novel pathway for the anaerobic biodégradation of haloaromatic compounds. Science, 218(4577), 1115-1117.

161. Szewzyk U., Szewzyk R., Schink B., 1985. Methanogenic degradation of hydroquinone and catechol via reductive dehydroxilation to phenol. FEMS Microbiol. Ecol., 31(2), 7987.

162. Tagawa T., Syutsubo K., Sekiguchi Y., Ohashi A., Harada H., 2000.Quantification of methanogen cell density in anaerobic granular sludge consortia by fluorescence in-situ hybridization. Water Sci. Technol., 42(3-4), 77-82.

163. Thaveesri J., Daffonchio D., Liessens B., Yandermeren P., Yerstraete* W., 1995. Granulation and sludge bed stability in upflow anaerobic sludge bed reactors in relation to surface thermodynamics. Appl. Env. Microbiol., 61(10), 3681-3686.

164. Tresse O., Mounien F., Levesque M. J., Guiot S., 2005. Comparison of the microbial population dynamics and phylogenetic characterization of a CANOXIS reactor and^a UASB reactor degrading trichloroethane. J. Appl. Microbiol., 98, 440-449.

165. Trosch W., Chmiel H., 1985. Stand der tecnik und Entwicklungstrends bei der anaeroben Abwasserreinigung. Chem. Ind., 108(8), 543-546. }.

166. Tschech A., Schink B., 1986. Fermentative degradation of monohydroxybenzoates by defined syntrophic cocultures. Arch. Microbiol., 145(1), 52-59.

167. Tschech A., Fuchs G., 1987. Anaerobic degradation of phenol by pure cultures of newly isolated denitrifying pseudomonads. Arch. Microbiol., 148(3), 213-217.

168. Van de Peer Y., De Wachter R., 1994. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Applic. Biosci., 10, 569-570.

169. Yavilin Y. A., Lokshina L. Y., Rytov S. Y., Kotsyurbenko O. R., Nozhevnikova A. N., 2000. Description of two-step kinetics in methane formation during psychrophilic H2/CO2 and mesophilic glucose conversions. Bioresource Technology, 71(3), 195-209.

170. Yaz-Moreira I., Silva M.E., Manaia C.M., Nunes O.C., 2008. Diversity of bacterial isolates from commercial and homemade composts. Microb. Ecol., 55 (4), 714-722.

171. Wagner M., Loy A., 2002. Bacterial community composition and function in sewage treatment systems. Current Opinion in Biotechnology, 13(3), 218-227.

172. Wallrabenstein C., Gorny N., Springer N., Ludwig W., Schink B., 1995. Pure cultures of Syntrophas buswelli, definition of its philogenetic status, and description of Syntrophus gentianae sp. nov. Syst. Appl. Microbiol., 18(1), 62-66.

173. Warikoo V., Mclnerney M. J., Robinson J. A., Sulfita J. M., 1996. Interspecies acetate transfer influences the extent of anaerobic benzoate degradation by syntrophic consortia. Appl. Env. Microbiol., 62(1), 26-32.

174. Weber S. D., Ludwig W., Schleifer K.-H., Fried J., 2007. Microbial composition and. structure of aerobic granular sewage biofilms. Appl. Env. Microbiol., 73(19), 6233-6240.

175. Wittich R.M., Rast H.G., Knackmuss H.J., 1988. Degradation of naphthalene-2,6- and naphthalene-1,6-disulfonic acid by a Moraxella sp. Appl.Env. Microbiol., 54(7), 18421847.

176. Wolfe A.J., 2005. The Acetate Switch. Microbiol. Mol.Biology Rew., 69(1), 12-50.

177. Whitman W. B., Bowen T. L., Boone D. R., 1992. The methanogenic bacteria. In: The Procaryotes ,vol. 1. Edited by A. Balows, H.G. Truper, K.H. Schleifer. New York, Springer, 719-767.

178. Wiegant W. M., de Man A. W., 1986. Granulation of biomass in thermophilic UASB reactors treating acidified wastewaters. Biotechnol. Bioeng., 28(5), 718-727.

179. Wu W. M., Hickey R. F., Zeicus J. G., 1991. Characterization of metabolic performance of methanogenic granules treating brewery waste-water: role of sulfate-reducing bacteria. Appl. Env. Microbiol., 57(12), 3438-3449.

180. Wu W. M., Jain M. K., Zeicus J. G., 1992. Microbial composition and characterization of prevalent methanogens and acetogens isolated from syntrophic methanogenic granules. Appl. Microbiol. Biotechnol., 38(2), 282-290.

181. Wu W.M., Bhatnagar L., Zeicus J. G., 1993. Performance of anaerobic granules for degradation of pentachlorophenol. Appl. Env. Microbiol., 59(2), 389-397.

182. Young L. Y., Rivera M. D., 1985. Methanogenic degradation of four phenolic compounds. Water Res., 19(10), 1325-1332.

183. Youngster L.K.G., Kerkhof L.J., Haggblom M.M., 2010. Community characterization of anaerobic methyl tert-butyl ether (MTBE)-degrading enrichment cultures. FEMS Microbiol. Ecol., 72(2), 279-288.

184. Zaar A., Eisenreich W., Bacher A., Fuchs G., 2001.A novel pathway of aerobic benzoate catabolism in the bacteria Azoarcus evansii and Bacillus stearothermophilus. J. Biol. Chem., 276(27), 24997-25004.

185. Zengler K., 2009. Central role of the cell in microbial ecology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73(4), 712-729.

186. Zhang Y., Aiyuk S., Xu H., Chen G., Verstraete W., 2005. Study of microbial community structures in UASB sludge treating municipal wastewaters by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rRNA. Sei. China Life Sei., 48,128-135.

187. Диссертационная работа выполнялась на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

188. Спасибо моей семье и всем моим дузьям за постоянную поддержку и оптимизм.