Генетические подходы к изучению гидрогеназы HydSL пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Хуснутдинова, Анна Наилевна

• Хуснутдинова, Анна Наилевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хуснутдинова, Анна Наилевна

СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. МЕТАБОЛИЗМ ВОДОРОДА ПРОКАРИОТ

ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИДРОГЕНАЗ

2.1. Распространение гидрогеназ, их физиологическая роль и локализация

2.2. Классификация гидрогеназ

2.2.1. Fe гидрогеназы

2.2.2. Fe-F гидрогеназы

2.2.3. Ni-Fe гидрогеназы

2.2.3.1. Структура

2.2.3.2. Классификация Ni-Fe гидрогеназ

2.2.3.2.1. Группа 1. Водородпоглощающие Ni-Fe гидрогеназы

2.2.3.2.2. Группа 2. Цитоплазматические сенсорные гидрогеназы и водородпоглощающие Ni-Fe гидрогеназы цианобактериалъного типа

2.2.3.2.3. Группа 3. Обратимые гетеромультимерные цитоплазматические

Ni-Fe гидрогеназы

2.2.3.2.4. Группа 4. Hi - выделяющие, энергосберегающие мембрансвязанные

Ni-Fe гидрогеназы

2.2.3.3. Регуляция биосинтеза Ni-Fe гидрогеназ

2.2.3.4. Биосинтез Ni-Fe гидрогеназ

2.2.3.4.1. Биосинтез активного центра Ni-Fe гидрогеназ

2.2.3.4.2. Биосинтез Fe-S кластеров

2.3. Ni-Fe гидрогеназы Т. roseopersicina BBS

2.3.1. Общая характеристика Т. roseopersicina BBS

2.3.2. Гидрогеназы Т. roseopersicina BBS

2.3.2.1. HupSL-гидрогеназа

2.3.2.2. Сенсорная гидрогеназа HupUV

2.3.2.3. Обратимая НохYH-гидрогеназа

2.3.2.4. HydSL-гидрогеназа 32 2.3.3 Сборка гидрогеназ в Т. roseopersicina

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГИДРОГЕНАЗ

3.1. Генетические подходы для практического применения гидрогеназ

3.2. Гетерологичная экспрессия гидрогеназ

3.3. Использование генетических методов для изучения структуры Ni-Fe гидрогеназ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. Молекулярно-биохимические методы

4.1.1. Культивирование пурпурных бактерий

4.1.2. Культивирование Escherichia coli

4.1.3. Выращивание штаммов Е. coli — продуцентов структурных генов гидрогеназ для исследования продуктов гетерологичной экспрессии

4.1.4. Выращвание штаммов Е. coli — продуцентов структурных генов гидрогеназ для исследования активности продуктов гетерологичной экспрессии

4.1.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК из клеток Е. coli методом щелочного лизиса

4.1.6. Выделение геномной ДНК пурпурных бактерий

4.1.7. Выделение ДНК из геля

4.1.8. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции

4.1.9. Лигирование векторов и фрагментов ДНК

4.1.10. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле

4.1.11. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК

4.1.11.1. Электропорация

4.1.11.2. Конъюгативный перенос плазмид в Т. roseopersicina

4.1.12. Получение электрокомпетентных клеток

4.1.13. ПЦР амплификация

4.1.14. Разработка олигонуклеотидных праймеров 49 4.1 15. Стабилизация гена hydS

4.1.16. Вертикальный электрофорез в ПААГ

4.1.17. Определение концентрации белка

4.1.18. Определение бактериохлорофилла а

4.1.19. Приготовление коллоидной серы

4.1.20. Определение концентрации сульфида 51 4.1.21 .Определение гидрогеназной активности

4.1.21.1. Спектрофотометрический метод

4.1.21.2. Газохроматографический метод

4.1.21.3. Определение HydSL-гидрогеназной активности по восстановлению серы до сульфида

4.2. Выделение и очистка гидрогеназы

4.2.1. Получение хроматофор

4.2.2. Получение экстракта клеток и очистка гидрогеназы

4.3. Методы исследования телец включения

4.3.1. Электронно-микроскопические методы

4.3.2. Выделение телец включения

4.3.3. Определение металлов 55 РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА 5. СОЗДАНИЕ СИСТЕМЫ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ HYDSL-ГИДРОГЕИАЗЫ Т. ROSEOPERSICINA В Е. COLI

5.1. Амплификация генов hydS, hydL и hynD с геномной ДНК

Т. roseopersicina BBS

5.2. Создание генетических конструкций для экспрессии структурных генов гидрогеназы HydSL в клетках Е. coli

5.3. Изучение гетерологичной экспрессии структурных генов HydSL-гидрогеназы Т. roseopersicina в клетках Е. coli

5.3.1. Экспрессия структурных генов гидрогеназы HydSL в клетках Е. coli

5.3.2. Исследование гидрогеназной активности штаммов Е. coli — продуцентов гидрогеназы HydSL

5.3.3. Электронная микроскопия штаммов Е. coli — продуцентов гидрогеназы HydSL

5.3.4. Наличие Ni в тельцах включения гидрогеназы HydSL

ГЛАВА 6. СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МОДИФИКАЦИИ HYDSL-ГИДРОГЕНАЗЫ Т. ROSEOPERSICINA В ГЕНОМЕ МАТЕРИНСКОГО ШТАММА

6.1. Создание конструкций для генетической модификации Т. roseopersicina

6.2. Постановка конъюгации Т. roseopersicina со штаммами Е. coli, несущими конструкции для двойной рекомбинации

6.3. Скрининг трансконъюгантов Т. roseopersicina

6.4. Исследование модифицированной гидрогеназы HydSL-6His

6.4.1. Определение локализации HydSL-6His-zudpo2eua3bi

6.4.2. Исследование физиологической функции HydSL-6His на целых клетках

6.4.3. Разработка системы очистки HydSL-6His-гидрогеназы

6.4.4. Исследование активности и термостабшъности НуйЗЬ-бШв-гидрогеназы

ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БОЛЬШОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ НУБЬ ГИДРОГЕНАЗЫ НУБЗЬ Т. КОБЕОРЕШСША НА ПЛАЗМИДЕ В ШТАММЕ Т. ЮБЕОРЕШСША СВ

7.1. Создание штамма Т. го8еорег$шпа, экспрессирующего ген ку(1Ь гидрогеназы Ну(18Ь, модифицированный путем вставки 6£Ш, выделение и проверка активности большой субъединицы

7.1.1. Модификация штамма Т. гозеорегз1с 'та СВ11 плазмидой, экспрессирующей ген кус1Ь с 6Н1$-меткой

7.1.2. Выделение большой субъединицы Нус18Ь-гидрогеназы, модифицированной бНгз-меткой, и исследование ее активности

ГЛАВА 8. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ВЫРОЖДЕННЫХ ПРАЙМЕРОВ

ДЛЯ ПОИСКА СТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ НУОБЬ-, НОХУН- И Нир8Ь-ГИДРОГЕНАЗ В НЕИЗУЧЕННЫХ ПУПУРНЫХ БАКТЕРИЯХ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетические подходы к изучению гидрогеназы HydSL пурпурной серной бактерии Thiocapsa roseopersicina»

Актуальность проблемы. Молекулярный водород занимает важное место в метаболизме бактерий и некоторых эукариотических микроорганизмов. Н2 может использоваться как источник энергии при дыхании, как донор электронов при фотосинтезе и в процессе метаногенеза. При брожении Н2 часто является конечным продуктом. Кроме того, выделение Н2 может регулировать уровень восстановленности пула пиридиннуклеотидов при разных типах питания. Выделение водорода в процессе азотфиксации катализируется нитрогеназами, в остальных случаях поглощение и выделение водорода катализируется гидрогеназами. Несмотря на то, что Н2 является простейшей молекулой, оказалось, что для каждого типа метаболизма бактерии синтезируют отдельную гидрогеназу, имеющую свои структурные гены и механизмы регуляции (Vignais et al., 2007). Поэтому бактерии, способные к росту за счет разных типов питания с участием Н2, как правило, синтезируют несколько гидрогеназ.

Пурпурная серная бактерия Thiocapsa roseopersicina BBS способна расти в фотоавтотрофных и хемолитоавтотрофных условиях с использованием Н2, фиксировать молекулярный азот и осуществлять брожение с выделением водорода (Кондратьева и др., 1981). Поэтому неудивительно, что Т. roseopersicina синтезирует, по крайней мере, 4 различных гидрогеназы, выполняющих разные функции (Rakhely et al., 2004, 2007; Maroti et al., 2010).

Одной из первых гидрогеназ, выделенных из пурпурных бактерий, была HydSL-гидрогеназа Т. roseopesicina (Гоготов и др., 1976). Оказалось, что это удивительно стабильный фермент, имеющий температурный оптимум около 80°С, способный к активации молекулы Н2 в присутствии 02 (Morozov et al., 2006), который может найти своё применение в гибридных системах преобразования Н2 в электричество (Shastik et al., 2011). По сравнению с платиной этот фермент более устойчив к воздействию таких каталитических ядов, как H2S и СО (Зорин и др., 1982; 1986). Единственной обнаруженной к настоящему времени функцией этого фермента является участие в восстановлении серы, описываемом уравнением: Н2 + S° = H2S (Laurinavichene et al., 2007).

В то же время мало известно не только о причинах термостабильности и устойчивости к кислороду HydSL-гидрогеназы, но также о структуре и механизме её действия. Поскольку этот фермент является гетеродимерным Ni-Fe металлоферментом с несколькими кластерами, его сборка и созревание представляют сложный и неизученный процесс и, судя по всему, не все вспомогательные белки к настоящему моменту известны (Weyman et al., 2011).

Показано, что HydSL-гидрогеназа является перспективным ферментом для создания водородных электродов как в качестве сенсора, так и для использования в топливных элементах без благородных металлов (Karyakin et al., 2007; Morozov et al., 2002).

Таким образом, разработка подходов к изучению и целенаправленной модификации свойств указанной гидрогеназы представляется необходимой как в научном, так и в практическом отношении.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка генетических подходов для изучения HydSL-гидрогеназы пурпурной серной бактерии Т. roseopersicina.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: разработка генетической системы для модификации HydSL-гидрогеназы Т. roseopersicina BBS как в геноме, так и на плазмиде, автономно реплицирующейся в данной бактерии;

- создание генетической основы для изучения синтеза HydSL-гидрогеназы при гетерологичной экспрессии структурных генов на плазмиде в клетках Е. coli и роли вспомогательных генов в этом процессе;

- создание штамма Т. roseopersicina, несущего в геноме модифицированную вставкой бШэ-метки субъединицу HydS гидрогеназы HydSL, и изучение свойств полученного двухсубъединичного фермента;

- модификация штамма Т. roseopersicina GBl 1, не несущего структурных генов HydSL-гидрогеназы, плазмидой с геном субъединицы HydL, модифицированным вставкой 6His-метки;

- конструирование и тестирование вырожденных праймеров для поиска структурных генов HydSL-, HoxYH и HupSL-гидрогеназ в неизученных пурпурных бактериях.

Научная новизна. Создана генетическая система модификации генов HydSL-гидрогеназы Т. roseopersicina BBS, локализованных как в геноме, так и на поддерживающейся в клетках бактерий плазмиде. С использованием этой системы впервые получен трансгенный штамм Т. roseopersicina, продуцирующий модифицированную HydSL-гидрогеназу с шестью остатками гистидина, расположенными на С-конце малой субъединицы. Показано, что модифицированный фермент обладает близкими к исходному ферменту гидрогеназной активностью и термостабильностью, сохраняя ту же локализацию и функция в клетках. Путем введения в трансгенный штамм Т. roseopersicina GB11 поддерживающейся плазмиды, несущей hydL, впервые получен штамм Т. roseopersicina, экспрессирующий только большую субъединицу HydSL-гидрогеназы, модифицированную полигистидиновой меткой с N-конца. Показана важная роль малой субъединицы в сборке активного центра и функционировании фермента.

Практическая значимость. Впервые сконструированы и апробированы вырожденные праймеры для поиска структурных генов HupSL, HoxYH и HydSL-гидрогеназ в неизученных пурпурных бактериях. Использование этих праймеров позволяет проводить скрининг и отбирать перспективные штаммы.

Получены штаммы Е. coli, синтезирующие HydS и HydL субъединицы гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina BBS как раздельно, так и совместно в одной клетке. Разработанная система является удобной основой для дальнейшего изучения роли вспомогательных белков в синтезе гидрогеназы, поскольку гетерологично экспрессированные структурные гены практически не обладают гидрогеназной активностью.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 8-й международной конференции «Гидрогеназы и выделение водорода» (Брекенридж, США, 2007), Молодёжной школе-конференции с международным участием «Возобновляемые источники энергии» (Москва, 2008), 13-м международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (Монреаль, Канада, 2009), Симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), 14-й международной школе-конференции молодых учёных «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2010).

Работа была поддержана грантами РФФИ (06-04-49658, 08-08-12196, 11-04-01383) и частично финансировалась подпрограммой «Нанобиотехнология» программы РАН «Фундаментальные основы технологий наноструктур и наноматериалов».

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит 8 глав и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Хуснутдинова, Анна Наилевна

выводы

1. Создана генетическая система модификации HydSL-гидрогеназы Т. roseopersicina BBS, локализованная как в геноме, так и на поддерживающейся плазмиде.

2. Получен трансгенный штамм Т. roseopersicina, продуцирующий модифицированную HydSL-гидрогеназу с шестью остатками гистидина на С-конце малой субъединицы, и отработана методика ее выделения. Показано, что модифицированный фермент сходен с нативным по активности, термостабильности, температурному оптимуму и энергии активации, локализован в мембранах и участвует в поглощении водорода в присутствии серы.

3. Получены штаммы Е. coli BL21, синтезирующие HydS и HydL субъединицы гидрогеназы HydSL Т. roseopersicina BBS как раздельно, так и совместно в одной клетке. Полученная система является удобной основой для дальнейшего изучения роли вспомогательных белков в синтезе гидрогеназы.

4. Трансгенный штамм Т. roseopersicina GB11 модифицирован поддерживающейся плазмидой для экспрессии гена hydL большой субъединицы HydSL-гидрогеназы с полигистидиновой меткой на N-конце. Полученные гидрогеназные фракции не обладали активностью. Эти данные, наряду с пониженным количеством металлов в ТВ большой субъединицы без экспрессии малой в гетерологичной системе, указывают на возможное участие малой субъединицы гидрогеназы в сборке активного центра и функционировании фермента.

5. Впервые сконструированы и апробированы вырожденные прайм еры для поиска структурных генов HupSL-, HoxYH- и HydSL-гидрогеназ в неизученных пурпурных бактериях.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хуснутдинова, Анна Наилевна, 2012 год

1. Богоров Л.А. О свойствах Thiocapsa roseopersicina штамм BBS, выделенного из эстуария белого моря. // Микробиология, 1974;43:326-333.

2. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных бактерий//Микробиология 2002, 71, 4, 500-508.

3. Гоготов И.Н., Зорин Н.А., Кондратьева Е.Н. Очистка и свойства гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina. //Биохимия, 1976;41:836-842.

4. Зорин Н. А., Гоготов И.Н. Стабильность гидрогеназы из пурпурной серобактерии Thiocapsa roseopersicina. //Биохимия, 1982;47:827-833.

5. Зорин Н.А. Ингибирование гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina различными соединениями. //Биохимия, 1986;51:770-774.

6. Кондратьева Е.Н., Гоготов И.Н. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов. М.: Наука, 1981. С. 344.

7. Кондратьева Е. Н. Фототрофные прокариоты. М.: Изд-во МГУ, 1996, С. 312.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479 с.

9. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Т.1. Генная и белковая инженерия. М.: Наука, 2004. 526 с.

10. Сузина Н.Е., Ставская С.С., Фихте Б.А. Изменения в ультраструктурной организации клеток Pseudomonas aeruginosa под действием додецилсульфата натрия. //Микробиология, 1988;57:255-257.

11. Adams M.W., Mortenson L.E., Chen J.S. Hydrogenase. // Biochim Biophys Acta, 1981;594:105-176.

12. Adams, M.W. The structure and mechanism of iron-hydrogenases. // Biochim Biophys Acta, 1990;1020:115-145.

13. Agapakis C., Ducat D., Boyle P., Wintermute E., Way J., Silver P. Insulation of a synthetic hydrogen metabolism circuit in bacteria. // J Biol Eng, 2010;4:1-15.

14. Aggag M., Schlegel H.G. Studies on a gram-positive hydrogen bacterium, H. opaca16.