Биотехнология пищевых продуктов и биологически активных веществ (технические науки)

Муста Оглы Наргуль

Биотехнология пищевых продуктов и биологически активных веществ (технические науки) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат наук Муста Оглы Наргуль

Муста Оглы Наргуль
кандидат наук
2020

Специальность ВАК РФ05.18.07

Количество страниц 296

Муста Оглы Наргуль. Биотехнология пищевых продуктов и биологически активных веществ (технические науки): дис. кандидат наук: 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов (по отраслям). ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский университет ИТМО». 2020. 296 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Муста Оглы Наргуль

РЕФЕРАТ

SYNOPSIS

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР НАУЧНОЙ ИНФОРМАЦИИ

1.1 Фитиновая кислота

1.1.1 Химическая структура фитиновой кислоты

1.1.2 Распределение и содержание фитиновой кислоты в

растительной клетке

1.1.3 Антинутритивное действие фитиновой кислоты

1.2 Фитазы

1.2.1 Общие сведения. Ферментативные свойства

1.2.2 Номенклатура и классификация фитаз

1.3 Способы ферментации среды для биосинтеза фитазы

1.3.1 Глубинный способ культивирования микробных продуцентов ферментов

1.3.2 Синтез ферментов при поверхностном культивировании продуцентов

1.4 Оптимизация процесса ферментации для продуцирования микробной фитазы

1.5 Влияние различных параметров процесса культивирования продуцентов на биосинтез фитазы

1.5.1 Физические параметры

1.5.2 Влияние качественного состава компонентов питательной среды на биосинтез фитазы

1.5.3 Влияние поверхностно-активных веществ, возраста, количества вносимого инокулята на биосинтез фитазы

1.6 Промышленное применение фитаз

1.7 Микромицет Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. 1 Объекты исследований

2.2 Методы исследований

2.2.1 Условия ферментации среды при глубинном способе культивирования штамма Aspergillus niger Л-4

2.2.2 Условия ферментации среды при поверхностном способе культивирования микромицета Aspergillus niger Л-4

2.3 Методы определения

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1 Апробация различных методик для определения фитазной активности в мицелиальной массе и нативном растворе

3.2 Исследование влияния возраста и температуры выращивания посевного материала на биосинтез фитазы

3.3 Исследование биосинтеза фитазы штаммом Aspergillus niger Л-4 при ферментации сахарозоминеральной среды в условиях шейкера-инкубатора Multitron

3.4 Исследование биосинтеза фитазы штаммом Aspergillus niger Л-4 при ферментации гидролизатов кукурузного крахмала в условиях шейкера-инкубатора Multitron и ферментатора Biostat®Cplus - C20-3MO

3.5 Исследование биосинтеза фитазы штаммом Aspergillus niger Л-4 при ферментации зерновых культур в условиях шейкера-инкубатора Multitron и лабораторного термостата серии LIB

3.6 Влияние концентрации источника фосфора на биосинтез фитазы

3.7 Разработка способа получения ферментного препарата, содержащего

фитазу

3.7.1 Исследование физико-химических и биохимических свойств

ферментного препарата, содержащего фитазу

3.8. Исследование влияния физико-химических и биохимических свойств ферментного препарата, содержащего фитазу, на показатели качества теста и готового хлеба

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

LIST OF PUBLICATIONS ON THE THESIS

ТЕКСТЫ ПУБЛИКАЦИЙ

РЕФЕРАТ

Актуальность темы. В последние годы фитазы, способные гидролизовать фитаты - соли В-мио-инозитол-1,2,3,4,5,6-гексакисдигидрофосфорной кислоты, стали играть немаловажную роль в питании человека и рационе моногастричных животных. В пищевом сырье растительного происхождения за счет образования хелатных комплексов с фитиновой кислотой снижается содержание свободного фосфора, железа, кальция, магния, меди, натрия, аминокислот.

Хлеб и хлебобулочные изделия являются одним из основных товаров в потребительской корзине. Выраженной тенденцией в настоящее время является рост интереса населения к здоровому питанию и, соответственно, новым сортам хлебной продукции с добавленной пищевой ценностью (исследования IndexBox Russia). Возрастающий интерес к применению ферментных препаратов с фитазной активностью (ФПФА) обусловлен потреблением пищевых продуктов с высоким содержанием пищевых волокон (крупок, отрубей, плющеных цельных зерен и т. п.) и необходимостью повышения минеральной ценности основных продуктов питания.

На протяжении последних нескольких лет в России наблюдается подъем производства комбикормов (в августе 2019 года: 24,9 млн. т, что на 4,2% больше, чем в августе 2018 года), обоснованный повышением уровня выращиваемых сельскохозяйственных животных. Эффективное промышленное животноводство невозможно без применения кормовых энзимов, в том числе фитазы. Фитат в кормах приводит к неэффективному использованию кормов и снижению продуктивности животных, образуя нерастворимые комплексы с минеральными веществами, растительными белками и синтетическими аминокислотами, затрудняя их переваривание ферментами ЖКТ животных.

Введение фитаз в корма способствует снижению уровня выделенного неусвоенного фосфора в почве, что позволяет снизить уровень загрязнения почв и появление нерастворимых фосфатов в подземных водах и водоемах.

Синтезировать фитазу способны растения, бактерии и грибы. Так как большинство растительных фитаз не устойчивы к различным факторам, то перспективными для использования в пищевой и комбикормовой отраслях промышленности стали бактериальные и грибные фитазы.

Для пищевой и комбикормовой отраслей наиболее востребованы кислотоустойчивые и термостабильные ферменты. К ним относятся фитазы, синтезируемые представителями рода Aspergillus, которые являются промышленными продуцентами многочисленного ряда пищевых микроингредиентов.

Степень разработанности темы. Вопросы использования различных штаммов грибов и бактерий как продуцентов фитазы при различных условиях культивирования рассмотрены в работах Sabu A., Pandey A., Shivanna G.B., Chadha B., Singh N., Badamchi M., Sasirekha B., Tahir А., Cho E.-A., Jorquera M., Dae-Hee L., Anita R., Bekalu Z.E., Chu K. K., Eijsink V.G., Awad G.E.A., Kim Y.O., Chantasartrasamee K., Da Silva L.G., Ebune A., Eida M.F., Kalsi H.K., Kaur R., Konietzny U., Krishna C., Kuang R

Влияние внесения фитазы на биологическую ценность и усвояемость кормов сельскохозяйственными животными, птицей и рыбой рассмотрены в работах Adeola O., Ahmad T. и соавторов (Ahmad T., Rasool S., Sarwar M., Haq A. and Zia-ul H.), Ai Q. и соавторы (Ai Q., Mai K., Zhang W., Xu W., Tan B., Zhang C., Li H.), Ahmadi A. и соавторов (Ahmadi A., Tabatabaei M.M., Aliarabi H., Saki A.A., Hosseini Siyar S.A.) и т.д

В работах Greiner R., Gomes da Silva L., Couri S., Gargova S., Sariyska M., Sandhya A., Sridevi A., Narasimha G., Bekalu Z.E., Madsen C.K., Dionisio G., Brinch-Pedersen H., Nahas E. и т.д. рассмотрены вопросы биосинтеза фитазы микроскопическими грибами рода Aspergillus niger. Необходимо отметить, что имеется сравнительно мало данных по изучению влияния фитаз на показатели полуфабрикатов и готового хлеба при приготовлении хлебобулочных изделий.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является научное обоснование условий продуктивного биосинтеза фитазы штаммом Aspergillus

niger Л-4 при глубинном и поверхностном способах культивирования для разработки биотехнологии ферментного препарата. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• подбор сырья (зерно, крахмал, сахар кристаллический), источников фосфора и азота;

• определение наиболее значимых параметров процесса культивирования для достижения высокого уровня синтезируемой фитазы;

• исследование фитазной активности штамма Aspergillus niger при глубинном способе ферментации пищевого сырья;

• исследование биосинтеза фитазы штаммом Aspergillus niger при поверхностном способе ферментации различных зерновых культур;

• изучение свойств фитазы при выделении из культуральной жидкости и очистке;

• исследование влияния ферментного препарата, содержащего фитазу, на органолептические и физико-химические показатели теста и готового хлеба;

• разработка биотехнологии грибной кислотостабильной фитазы. Научная новизна. Показано, что промышленный штамм Aspergillus

niger Л-4 - продуцент лимонной кислоты способен синтезировать фитазу при культивировании на различных углеводсодержащих средах. Установлены условия и режимы для продуцирования фитазы грибом A. niger Л-4 при изменении параметров ферментации, на основании которых обоснована возможность направленного получения фитатгидролизующего фермента в качестве дополнительного целевого метаболита и создания «совмещённой» технологии пищевых микроингредиентов. Установлено, что при глубинном способе ферментации для накопления биомассы в приоритете штамм использует сахарозу, а для биосинтеза фитазы - гидролизат крахмала; при поверхностном способе ферментации для достижения повышенного уровня биосинтеза фитазы эффективнее использовать зерно пшеницы. Показано, что, несмотря на насыщенный минеральный состав зерна пшеницы, в питательную

среду необходимо вносить неорганические соли азота, магния и фосфора, что

является физиологической потребностью данного штамма. Теоретическая и практическая значимость работы.

• Разработаны технологии ферментного препарата, обладающего фитатгидролизующей способностью, при глубинном и поверхностном способах ферментации среды.

• Практически доказана эффективность использования полученного препарата фитазы А. niger в технологии хлеба для получения продукции, обогащенной фосфором и минеральными веществами. Разработана рецептура хлеба формового с отрубями на закваске, обогащенного минеральными веществами, из смеси муки ржаной хлебопекарной обдирной, муки пшеничной хлебопекарной 1-го сорта и полученного ферментного препарата, обладающего фитазной активностью.

• Получены экспериментальные данные, позволившие установить условия и режимы для продуктивного синтеза фитазы микромицетом А. niger, продуцирующим карбоновые кислоты, при ферментации углеводсодержащего сырья глубинным и поверхностным способами.

• Показано, что при изменении способа ферментации зернового сырья изменяется направленность биосинтетических процессов с увеличением уровня продуцирования фитазы. Экспериментально подтверждено, что, несмотря на насыщенный минеральный состав зерна пшеницы, необходимо внесение дополнительного количества солей неорганических кислот (источников азота, магния и фосфора), что является физиологической потребностью данного штамма.

• Проведена технико-экономическая оценка использования полученного препарата в технологии хлебопечения. Расход ферментного препарата, содержащего фитазу с активностью 60 ± 2 ед/г и стоимостью 500 руб/кг, для производства 1 т хлеба с отрубями составил 4 кг. Стоимость стандартной буханки хлеба с отрубями составит 42 руб.

• Установлена безопасность ферментного препарата, содержащего фитазу, синтезируемую грибом A. niger Л-4, по содержанию афлатоксина (в частности Bi) и отсутствию клеток продуцента. Показана перспективность применения ферментного препарата, содержащего фитазу, в технологии хлеба с отрубями; включение препарата в рецептуру хлеба увеличивает содержание минеральных веществ. Применение ферментного препарата, содержащего фитазу, в хлебопечении апробировано в опытно-промышленных условиях НИИ хлебопекарной промышленности (ФГАНУ НИИХП) г. Санкт-Петербург. Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследований биосинтеза фитазы при глубинном способе ферментации углеводсодержащих сред;

- результаты исследований биосинтеза фитазы при поверхностном способе ферментации зерна;

- разработка способа получения ферментного препарата, содержащего фитазу;

- оценка показателей безопасности полученного ферментного препарата;

- результаты изучения влияния ферментного препарата, содержащего фитазу, на показатели качества теста и выпеченного хлеба.

- технология ферментного препарата.

Степень достоверности результатов и апробация работы. Степень достоверности результатов работы подтверждается 3-кратной повторяемостью, воспроизводимостью полученных данных, использованием стандартных и современных биохимических, микробиологических методов исследований, а также математической обработкой результатов экспериментальных исследований с применением специального пакета приложений Microsoft Office. Основные положения диссертационной работы представлены на международных научных, научно-практических конференциях, всероссийских конгрессах и форумах:

VI Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-петербург, 2017); VII Международная Научно-техническая конференция «КАЗАХСТАН - ХОЛОД 2017» (Казахстан Алматы, 2017); V Международная студенческая Интернет-конференция «Приоритеты и научное обеспечение реализации государственной политики здорового питания в России» (Орел, 2017); VII Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 2018); XLVII научной и учебно-методической конференция (Санкт-Петербург, 2018); Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «ГОРИЗОНТЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» (Орел, 2018); VIII Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-петербург, 2019); 84-я Всероссийская научно конференция студентов и молодых ученых с международным участием "Вопросы теоретической и практической медицины" (Уфа, 2019); 9-й Международный научно-практический симпозиум «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2019); Международная научно-практическая конференция «Пищевые ингредиенты России 2019» (Санкт-Петербург, 2019).

Публикации. По теме работы опубликованы 17 печатных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых изданиях, из них 2 статьи - в журнале Web of Science.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, списка литературы и приложений. Работа изложена на 228 страницах, содержит 15 иллюстраций, 17 таблиц и 8 приложений. Список литературных источников включает 194 источника, из них 164 на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранного направления исследования, отмечена научная новизна, теоретическая и практическая значимость, представлены основные положения, выносимые на защиту.

В аналитической части приведены данные по антипитательному влиянию фитата на организм человека и животных, обусловленное образованием хелатных комплексов с минеральными веществами, рассмотрены классы фитаз, рынок фитаз и их применение в различных областях промышленности; представлены микроорганизмы, продуцирующие фитазу; рассмотрены различные факторы, влияющие на синтез фитазы (физические факторы, качественный состав питательных сред и возраст инокулята) и промышленные способы культивироания микроорганизмов для синтеза фермента.

Экспериментальная часть. В качестве объектов исследования были выбраны мицелиальная масса и нативные растворы, полученные в результате культивировании штамма Aspergillus niger Л-4 глубинным и поверхностным способами на различном сырье. Источники углерода: сахар белый (ГОСТ 33222-2015), кукурузный крахмал (ГОСТ 32159-2013) - для глубинного способа ферментации и ячмень (Hordeum vulgare, ГОСТ 28672-9), пшеница (Triticum aesüvum, ГОСТ Р 52554-2006), кукуруза (Zea mays, ГОСТ 13634-90) и овес (Avena sativa, ГОСТ 28673-90) - для поверхностного способа.

При организации и проведении исследований применялись общепринятые и современные физико-химические, биохимические методы исследования показателей процесса ферментации. Ферментацию проводили в шейкере-инкубаторе Multitron (INFORS, Швейцария), в инкубаторе (термостате) серии LIB, Россия, в качалочных колбах и в ферментаторе Biostat®Cplus - C20-3M0 (Sartorius, Германия). Количество синтезированной кислоты определяли титриметрическим методом; концентрацию общего белка - по методу Лоури. Фитазную активность (ФА) оценивали по ГОСТ 314872012, инвертазную активность - по методу, изложенному в «Методы определения активности гидролитических ферментов» авторов А. П. Рухлядева, Г. В. Полыгалина. Содержание фитиновой кислоты в растительном сырье определяли модифицированным методом Вейда. Обнаружение клеток продуцента осуществляли методом высева на жидкие агаризированные среды

по ГОСТ 10444.12-88. При исследовании влияния концентрата на показатели качества готового хлеба объектами исследований являлись хлебобулочные изделия из муки ржаной хлебопекарной обдирной и пшеничной хлебопекарной муки первого сорта на жидкой закваске без заварки с добавлением отрубей пшеничных и полученного препарата, содержащего фитазу. Качество хлебобулочных изделий оценивали общепринятыми методами (ГОСТ 21094-75 Хлеб и хлебобулочные изделия. Метод определения влажности, ГОСТ 5670-96. Хлебобулочные изделия. Методы определения кислотности, ГОСТ 5669-96. Хлебобулочные изделия. Метод определения пористости, ГОСТ 5667-65. Хлеб и хлебобулочные изделия. Правила приемки, методы отбора образцов, методы определения органолептических показателей и массы изделий). Содержание минеральных веществ определяли в испытательном центре ФГБУ «Ленинградская МВЛ», согласно: Fe - (ГОСТ 27998-88 - Корма растительные. Методы определения железа); Са - (ГОСТ 26570-95 - Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения кальция); М^ - (ГОСТ 32343 -2013 - Корма, комбикорма. Определение содержания кальция, железа, меди, магния, марганца, калия, натрия и цинка методом атомно-абсорбционной спектрометрии); Р - (ГОСТ 26657 - 97 - Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения содержания фосфора); - (ГОСТ 306922000 - Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Атомно - абсорбционный метод определения меди, свинца, цинка и кадмия). Содержание афлатоксиов исследовали по ГОСТ 30711-2001 Продукты пищевые. Методы выявления и определения содержания афлатоксинов В(1) и М(1). Отсутствие клеток продуцента в ферментном препарате также определяли в испытательном центре ФГБУ «Ленинградская МВЛ», согласно «Методическим указаниям по выделению и количественному учету микроскопических грибов в кормах, кормовых добавках и сырье для производства кормов» (МУ Минсельхоза России от 14.07.2003 № 13-5-02/0827). Содержание количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) контролировали согласно ГОСТ

Степень достоверности результатов работы подтверждается 3-кратной повторяемостью, воспроизводимостью полученных данных, использованием стандартных и современных биохимических, микробиологических методов исследований, а также математической обработкой результатов экспериментальных исследований с применением специального пакета приложений Microsoft Office. Экспериментальные исследования проводили в лаборатории ВНИИПД - филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им.В.М.Горбатова» РАН, Санкт - Петербург. Исследования влияния ферментного препарата, содержащего фитазу, на показатели качества теста и готового хлеба проводили на базе НИИХП, г. Пушкин.

Для определения основных показателей процесса, влияющих на продуцирование фитазы, в работе исследовали влияние возраста и температуры выращивания посевного материал. На рисунках 1а,б,в представлены зависимости внутриклеточной фитазной активности от возраста и температуры выращивания посевного материала.

Исследование влияния возраста и температуры выращивания посевного материала на биосинтез фитазы

3

_y = 0.0083x3 - 0.275x2 + 1.7167x - 0.18 -R2 =

y = -0.025X3 + 0.1107x2 + 0.2357x +

R2 =

y = -0.0083X3 + 0.0036x2 + 0.3119x + 0.28 R2 =

24

48

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнология пищевых продуктов и биологически активных веществ (технические науки)»

Длительность ферментации, ч

а

<D

л" H О

о

и «

s

Ё р л

m

1.4 1.2

л -е

0.8 0.6 0.4 0.2

29 °C

32 °C

36 °C

= -Q.0744x2 + 0.5628x + 0.1068

R2 = 0.9489

y= -0.0757x2 + 0.5683x - 0.098 --S; R2 = 0.949

y = -0.06x2 + 0.456x - 0.112 - R2 = 0.912

24 48 72 96 120

Длительность ферментации, ч

1

0

б

£

m

т

и ф

1.2

0.8

Ж6

'0.4 0.2

29 °C

32 °C

24 48 72 96

Длительность ферментации, ч

36 °C

y = -0.0757x2 + 0.5683x - 0.098 R2 = 0.949

y = -0.0671x2 + 0.4889x - 0.142 R2 = 0.9143

y = -0.0657x2 + 0.4823x - 0.236 R2 = 0.914

120

1

0

в

Рисунок 1а,б,в - Зависимость внутриклеточной фитазной активности от возраста и температуры выращивания посевного материала при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на

сахарозоминеральной среде. Возраст посевного материала, ч: а - 24; б - 36; в - 48.

На рисунках 2 а,б,в представлены зависимости внеклеточной фитазной от возраста и температуры выращивания посевного материала.

фе

е н

m

3.5

2.5

1.5

0.5

29 °C

32 °C —ö-

36 °C

-ry==0.1429x2 + 1.

R2 = 0.9

2371x + 0.38 = 0.9895

^-=-0ß929x2 + 0.8671x + 0.3

R2 = 0.9942

y = -0.1214x2 + 1.0386x - 0.06

R2 = 0.9664

24 48 72 96 120

Длительность ферментации, ч

3

2

1

0

а

б

¡5 гп

Л 2

IS

(D

И

m

1.2

0.8 0.6 0.4 0.2

29 °C

24

48

32 °C

72

96

36 °C

= -0.0371x2 + 0.3169x + 0.32

! = 0.9962

У=-^03429х2 + 0.3571x + 0.08 -R2 = 0.9821

y = -0.0214X2 + 0.1786x + 0.14 R2 = 0.9821

120

Длительность ферментации, ч

1

0

в

Рисунок 2 а,б,в - Зависимость внеклеточной фитазной активности от возраста и температуры выращивания посевного материала при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде. Возраст посевного материала, ч: а - 24; б - 36; в -

48.

Согласно данным рисунков 1-2 более высокие уровни фитазной активности (внутри- и внеклеточной) определены при температуре выращивания посевного материала 36 0С независимо от возраста посевного материала. Рост активности фермента внутри клетки (внутриклеточная ФА) активно продолжался в течение первых 3-х суток (72ч), далее наблюдался спад. Уровень внеклеточной ФА возрастал на протяжении всего процесса ферментации для посевного материала всех трех возрастов, однако, наиболее высокие уровни ФА определены при внесении в среду 24-часового посевного материала. Учитывая представленное на рисунках, в работе для ферментации

различных сред использовался 24-часовой посевной материал, который выращивали при температуре (36 ± 1) оС.

Исследование биосинтеза фитазы штаммом АspergШus niger Л-4 при ферментации сахарозоминеральной среды в условиях шейкера-

инкубатора М^^топ

Сахарозоминеральная среда содержит доступный для продуцента источник углерода - сахарозу и минеральный источник фосфора КН2РО4. Так как исследуемый штамм (Aspergillus niger Л-4) при ферментации среды, содержащей сахарозу и КН2РО4, синтезирует основной целевой метаболит -лимонную кислоту с высокой конверсией сахарозы, интерес представляло изучить влияние сахарозы как источника углерода на биосинтез фитазы.

На рисунке 3 иллюстрировано влияние среды, содержащей дисахарид -сахарозу как источник углерода, на биосинтез фитазы при глубинном способе ферментации.

Время, ч

Рисунок 3 - Зависимость активности фитазы от времени культивирования штамма Aspergillus niger Л-4 на сахарозоминеральной среде при глубинном

способе

При ферментации сахарозоминеральной среды внутриклеточная фитазная активность растет до конца третьих суток (72ч), далее начинается незначительное снижение активности фермента, что может быть связано с экскрецией фермента из клетки. Данное объяснение подкрепляется увеличением внеклеточной активности фитазы в течение всего процесса ферментации. Уровень

внутриклеточной фитазной активности к концу процесса равен 1,2 ± 0,1 ед/г мицелия. Внеклеточная фитазная активность в конце процесса ферментации (4 и 5 сут или 96 ч и 120 ч) либо растет с незначительным увеличением, либо прекращает повышаться. Однако в конце процесса ферментации внеклеточная фитазная активность достигает максимального уровня.

В таблице 1 представлены результаты ферментации сахарозоминеральной среды.

Таблица 1 - Результаты ферментации сахарозоминеральной среды (основная ферментация, конец процесса 120 ч)

Источ- Коли- Показатели процесса ферментации

ник чество Содержание общего Фитазная активность

углеро- лимонно белка

да й нативный мицелиальная натив- удель- мицелиаль удельная,

кислоты, раствор, масса, ный ная, -ная масса, ед/мг

г мг/см3 мг/г мицелия раствор, ед/мг ед/г белка

ед/см3 белка мицелия

Сахар 6,5 2,7 ± 0,2 1,9 ± 0,1 2,1 ± 0,2 0,8 ± 1,2 ± 0,1 0,6 ± 0,1

белый 0,1

Исследование биосинтеза фитазы штаммом Aspergillus niger Л-4 при ферментации гидролизатов кукурузного крахмала в условиях шейкера-инкубатора Multitron и ферментатора Biostat®Cplus - C20-3MO

Представленные выше результаты сахарозоминеральной среды свидетельствуют о том, что значительное накопление фитазы экскретируется из клетки на первых стадиях развития гриба Aspergillus niger Л-4 при культивировании на различных углеводсодержащих средах.

На рисунках 4 а, б представлены экспериментальные данные, полученные в результате исследования внутри- и внеклеточной фитазной активности при культивировании штамма Aspergillus niger Л-4 на гидролизатах крахмала с ДЕ = 21 ± 2 % и ДЕ = 32 ± 2 % в шейкере-инкубаторе.

Декстрозный эквивалент (ДЕ) - это отношение суммарного содерания глюкозы и мальтозы в гидролизате, отнесенное к содержанию сухих веществ (СВ), выраженное в %.

2.5

и f о н

¡а

m

1.5

н J-.

-а

н о ° 1

И 1 «

g I 0.5

ДЕ=21 ±2 %

ДЕ = 32 ±2 % y = -0.15x2 + 1.15x - 0.12

R2 = 0.9711

y = -0.1071x2 + 0.7929x - 7E-15 -R2 = 0.9643

24 48 72 96 120 Длительность ферментации, ч

2

0

а

н3

со 5

S ä

ф е ь,

т с о н

«

и

Ё ё * m

н ч о т е

ДЕ=21 ±2 %

ДЕ = 32 ±2 %

y^"-0f643x2 + 1.4157x + 0.62 " R2 = 0.9888 y = -0.1714x2 + 1.4886x - 0.26

R2 = 0.9842

24 48 72 96 120 Длительность ферментации, ч

4

3

2

1

0

б

Рисунок 4 а, б - Зависимость внутри- и внеклеточной активности фитазы от времени культивирования штамма Aspergillus niger Л-4 на гидролизатах крахмала с ДЕ = 21 ± 2 % и ДЕ = 32 ± 2 % в шейкере Multitron (INFORS,

Швейцария)

Характер изменения активности внутри- и внеклеточной фитазы различается. Внутри клетки активность фермента при ферментации двух гидролизатов увеличивалась в течение 3 сут процесса (72ч). Но ближе к концу процесса (на четвертые и пятые сутки) ФА снижается. На первые сутки (24 ч) внутриклеточная ФА для гидролизата крахмала с ДЕ = 21 ± 2 % была равна 0,7 ± 0,1 ед/г, к середине биотехнологического процесса (к 72 ч) ФА была равна 1,5 ± 0,1 ед/г, на четвертые сутки - 1,4 ± 0,1 ед/г, а к концу процесса (к 120 ч) ферментации снизилась до 1,3 ± 0,1 ед/г. По-видимому, синтезированная фитаза к окончанию процесса экскретируется из клетки, чем и объясняется более высокая внеклеточная ФА.

Повышенная продуктивность биосинтеза фитазы внутри и ее накопление вне клетки выявлены при ферментации гидролизата крахмала с ДЕ = 32 ± 2 %. Это обусловлено, возможно, более глубокой степенью гидролиза, а следовательно, и более высоким содержанием простых сахаров (таблица 2).

Таблица 2 - Содержание углеводов в гидролизатах крахмала

Степень гидролиза крахмала Доля углеводов в сумме сахаров в гидролизатах, %

Глюкоза мальтоза Декстрины

ДЕ = 21 ± 2 % 3,1 ± 0,2 19,8 ± 1,6 77,1 ± 7,1

ДЕ = 32 ± 2 % 4,4 ± 0,4 27,4 ± 2,1 68,2 ± 6,1

Штамм Aspergillus niger Л-4 является промышленным продуцентом лимонной кислоты и поэтому важно отметить, что с третьих по пятые сутки (с 72 ч по 120 ч) наблюдается активный синтез органических кислот. В начале ферментации (24-48 ч) рН составил 2,66 и снижался до 1,72 к концу процесса ферментации. Приостановление роста фитазной активности на 4 и 5 сут (96 ч и 120 ч) может быть следствием ингибирующего действия основного метаболита - лимонной кислоты.

Приостановление роста ФА также может быть вызвано действием ингибитора фитазы белкового типа, содержащегося в злаковых культурах (в данной работе это не исследовалось), исследованная автором Z.E. Bekalu и коллегами в работе « Aspergillus ficuum phytase activity is inhibited by cereal gram components».

Концентрация общего белка в исследуемых биомассах при ферментации гидролизата крахмала с ДЕ = 21 ± 2% была на уровне (4,1 ± 0,3) мг/г на первые сутки (24ч) и снижалась до (1,2 ± 0,1) мг/г к концу процесса ферментации. При ферментации гидролизата крахмала с ДЕ = 32 ± 2 % динамика накопления внутриклеточного общего белка имеет аналогичный характер. Причиной снижения уровня внеклеточного белка, начиная с четвертых суток, предположительно, могут быть протеиназы. Удельная ФА при культивировании штамма-микромицета на гидролизатах с ДЕ = 21 ± 2 % и ДЕ = 32 ± 2 % повышалась.

Содержание белка в биомассе на протяжении всего процесса ферментации исследуемых гидролизатов крахмала повышается.

На рисунках 5 а,б представлена динамика изменения ФА при ферментации гидролизатов с ДЕ = 21 ± 2 % и ДЕ = 32 ± 2 % в ферментаторе.

ДЕ=21 ±2 % ДЕ = 32 ±2 %

Длительность ферментации, ч

а

К

§ Ё

В в и

ДЕ=21 ±2 %

3

ДЕ = 32 ±2 %

y = -0.1714x2 + 1.4886x + 1.34 R2 = 0.9842

y = -0.1786x2 + 1.5614x + 0.36 R2 = 0.9792

24 48 72 96 120 Длительность ферментации, ч

5

4

2

1

0

б

Рисунок 5 а,б - Зависимость внутри- и внеклеточной активности фитазы от времени при культивировании продуцента лимонной кислоты - штамма Aspergillus niger Л-4 на гидролизатах крахмала с ДЕ = 21 ± 2 % и ДЕ = 32 ± 2 %

в ферментаторе Biostat®Cplus - C20-3MQ

Сравнительные данные по содержанию белка и других показателей процесса ферментации в шейкере-инкубаторе и в ферментаторе Вю81а1®Ср1ш -С20-3МО указаны в таблице 3.

Таблица 3 - Показатели процесса ферментации гидролизатов крахмала (конец

процесса, 120 ч)

Условия культивир ования ДЕ гидролизата крахмала, % Показатели процесса ферментации

Количес тво лимонн ой кислоты , г содержание общего белка активность фитазы

Внутриклет очное, мг/г мицелия Внеклет очное, мг/см3 Внутриклеточная Внеклеточная

ед/г мицелия удельная, ед/мг общего белка ед/см3 нативного раствора удельная, гд/мг общего белка

Шейкер- инкубатор Ми1Шгоп 21 ± 2 6,1 1,2 ± 0,1 2,5 ± 0,2 1,3 ± 0,1 1,1 ± 0,1 2,9 ± 0,2 1,1 ± 0,1

32 ± 2 6,3 1,1 ± 0,1 2,9 ± 0,2 1,9 ± 0,1 1,5 ± 0,1 3,6 ± 0,3 1,3 ± 0,1

Ферментат °р В^Ш®Ср 1ш - С20-3МО 21 ± 2 6,5 2,4 ± 0,2 3,1 ± 0,3 1,9 ± 0,1 0,8 ± 0,1 3,7 ± 0,3 1,2 ± 0,1

32 ± 2 7,0 2,9 ± 0,2 3,4 ± 0,3 2,5 ± 0,2 0,8 ± 0,1 4,5 ± 0,4 1,4 ± 0,1

Характер изменения ФА, определенной в биомассе, полученной при культивировании штамма аспергилла на гидролизате крахмала с ДЕ = 21 ± 2 % в ферментаторе, аналогичен характеру изменения фитазной активности, определенной в биомассе при ферментации того же гидролизата в шейкере-инкубаторе. В биотехнологическом процессе в условиях ферментатора активный рост ФА также наблюдался на протяжении 3 сут (72 ч). Уровень фитазы в мицелии и нативном растворе при проведении процесса в ферментаторе превосходил уровень активности фермента при культивировании штамма аспергилла в шейкере-инкубаторе в 1,1 - 2,6 раза. Значительная разница определена для первых и последних суток биотехнологического процесса. Однако в отличие от уровня внутриклеточной фитазной активности, определенной в условиях шейкера-инкубатора, уровень активности фитазы, выявленной в условиях ферментатора, снижается незначительно. Возможно, это связано с различными условиями аэрации.

Отличие в количестве синтезируемого фермента, оцениваемое по его биокаталитической активности, при различных условиях культивирования (шейкер-инкубатор, ферментатор), скорее всего, объясняется уровнем воздухоснабжения в процессе культивирования штамма.

Исследование биосинтеза фитазы штаммом Aspergillus niger Л-4 при ферментации зерновых культур в условиях шейкера-инкубатора Multitron и

лабораторного термостата серии LIB

В работе была исследована способность штамма продуцировать фитазу при поверхностном способе ферментации. В качестве питательной среды использовали различные зерновые культуры - ячмень (Hordeum vulgare, ГОСТ 28672-9), пшеница (Tríticum aestívum, ГОСТ Р 52554-2006), кукуруза (Zea mays, ГОСТ 13634-90) и овес (Avena sativa, ГОСТ 28673-90) и смесь этих 4-х культур в соотношении 1:1.

Условия культивирования: - в шейкере-инкубаторе Multitron: скорость перемешивания 30 об/мин, температура - (36 ± 10С), длительность процесса -120 ч. Гидромодуль зерно:вода -1:3 и 1:4.

- в лабораторном термостате серии LIB: без перемешивания, температура -(36 ± 10С), длительность процесса -120 ч. Гидромодуль зерно:вода - 1:4.

Результаты ферментации представлены на рисунке 3.6.

50

* 45 = 40

£ 35

« 30

S3

h ю

<u И

И eö

m

¡5 25 £ 20 К

15 10 5 0

II

Варианты

1:3 шейкер-инкубатор Multitron; 30 об/мин

1:4 шейкер-инкубатор Multitron; 30 об/мин

1:4 термостат серии LIB; без перемешивания

Рисунок 6 - Зависимость внеклеточной активности фитазы от условий культивирования штамма Aspergillus niger Л-4 на зерне ячменя (Hordeum vulgare) I вариант: споры микромицета Aspergillus niger Л-4 выдерживали в сахарозоминеральной среде А-4 в течение 6 ч при постоянном перемешивании. Состав среды А-4, г/дм3: сахар белый - 50,0; аммоний азотнокислый - 2,50;

I

магний сернокислый семиводный - 0,25; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,16 [18]. Полученный посевной материал в количестве 1 см3 помещали в качалочную колбу с подготовленным сырьем (ячмень:вода в соотношении 1:3; 1:4; 1:5) согласно [143] в модификации. Модификация обусловлена изменением гидромодуля зерно:вода и изменением скорости перемешивания.

II вариант: споры выращивали в течение 24 ч в среде следующего состава, г/дм3: сахар белый - 50,0, меласса свекловичная - 17,0; аммоний азотнокислый -2,50; магний сернокислый семиводный - 0,25; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,16 [18]. Полученный посевной материал в количестве 1 см3 помещали в качалочную колбу с подготовленным сырьем (ячмень:вода в соотношении 1:3 и 1:4) согласно [143] в модификации.

III вариант: получение посевного материала осуществляли аналогично варианту II. Полученный посевной материал в количестве 1 см3 помещали в качалочную колбу с подготовленным сырьем (ячмень:вода в соотношении 1:3; 1:4; 1:5) и питательными солями, г/дм3: аммоний азотнокислый - 2,50; магний сернокислый семиводный - 0,25; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,16 [16].

Повышенная экскреция фермента (41,2±4,1 ед/см3) в культуральную жидкость отмечена в III варианте (при внесении неорганических солей азота, магния, фосфора) при гидромодуле ячмень:вода = 1:3 в опытах в шейкере-инкубаторе при скорости вращения 30 об/мин. Также активно процесс экскреции фермента в культуральную жидкость протекал в III варианте в инкубаторе (термостате) серии LIB без перемешивания. Более высокий уровень фитазной активности обусловлен присутствием минеральных солей, являвшихся дополнительным источником азота, магния, фосфора.

При поверхностном способе содержание общего белка увеличилось в I варианте в условиях шейкера-инкубатора при соотношении ячмень:вода = 1:4 (6,4

± 0,6 мг/см3) и во II варианте при соотношении ячмень:вода =1:3 в условиях шейкера (6,1 ± 0,6 мг/см3).

При поверхностном способе ферментации по сравнению с глубинным количество синтезированной кислоты было в 5 - 6 раз ниже (20 - 25 г/дм3).

Повышенный уровень удельной активности фермента при культивировании штамма Л-4 на зерне ячменя (Hordeum vulgare) выявлен в III варианте при соотношении ячмень:вода = 1:3 в условиях шейкера-инкубатора (7,6 ± 0,5 ед/мг общего белка). Вышеописанные показатели приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты ферментации зерна ячменя (Hordeum vulgare) при поверхностном способе культивировании

штамма - кислотообразователя Aspergillus niger Л-4 (нативный раствор, конец процесса 120 ч)

Показатели процесса ферментации I вариант II вариант III вариант

Шейкер Термостат серии LIB Шейкер Термостат серии LIB Шейкер Термостат серии LIB

Гидромодуль Гидромодуль Гидромодуль

1:3 1:4 1:4 1:3 1:4 1:4 1:3 1:4 1:4

Содержание общего белка, мг/см3 5,4±0,4 6,4± 0,4 5,4±0,5 6,1±0,6 5,5±0,5 5,2±0,4 5,7 ± 0,2 5,4 ± 0,2 4,9 ± 0,4

Фитазная активность Ед/см3 25,7±2,5 22,5±2,1 28,7±2,7 27,5±2,6 22,5±2,2 23,7±2,3 41,2 ± 4,1 34,4 ± 3,4 28,7±2,6

ед/мг общего белка 5,1 ± 0,5 3,8 ± 0,3 5,1 ± 0,4 4,3 ± 0,4 4,1 ± 0,4 4,6 ± 0,4 7,6 ± 0,5 6,6 ± 0,4 6,8 ± 0,4

Так как наиболее продуктивный биосинтез фитазы и общего белка выявлен при проведении эксперимента по варианту III (ячмень:вода 1:3 + минеральные соли), то далее исследовали в качестве сырья зерно злаковых культур (ячмень,кукуруза, пшеница и овес) и смесь из них (1:1) по этому варианту.

Исследование способности штамма - микромицета синтезировать фитазу при культивировании на зерне кукурузы, ячменя, пшеницы, овса и его смеси.

В опытах гидромодуль был изменен на 1:5, поскольку при гидромодулях 1:3 и 1:4 к концу процесса ферментации наблюдалось интенсивное испарение воды и рост культуры был замедлен, наблюдалось активное спорообразование. На рисунке 7 представлена зависимость влияния вида зерновой культуры на внеклеточную фитазную активность при поверхностном способе ферментации.

КУКУРУЗА ЯЧМЕНЬ ПШЕНИЦА ОВЕС Сырье (зерно)

СМЕСЬ ИЗ 4-Х КУЛЬТУР

Рисунок 7 - Зависимость внеклеточной активности фитазы штамма Aspergillus

niger Л-4 от вида зерновой культуры Содержание фитиновой кислоты в исследуемых культурах представлено в таблице 5.

Таблица 5 - Содержание фитиновой кислоты в исследуемых культурах

Содержание фитиновой кислоты, мг/г Зерновая культура

Кукуруза Ячмень Пшеница Овес

0,4 ± 0,1 0,8 ± 0,1 0,9 ± 0,1 0,2 ± 0,1

В таблице 6 представлены основные показатели процесса ( ерментации.

Таблица 6 - Результаты ферментации зерновых культур при поверхностном способе культивирования штамма - кислотообразователя Aspergillus niger Л-4 (нативный раствор, конец процесса 120 ч)

Показатели процесса ферментации Сырье (зерно)

Кукуруза Ячмень Пшеница Овес Смесь из 4-х культур

Содержание общего белка, мг/см3 3,1 ± 0,2 5,1 ± 0,3 6,1 ± 0,5 4,9 ± 0,4 7,1 ± 0,5

Фитазная активность Ед/см3 17,3 ± 1,7 39,2 ± 3,5 39,2 ± 3,5 10,4 ± 1,1 30,9 ± 3,1

Ед/мг общего белка 5,6 ± 0,4 7,7 ± 0,6 6,4 ± 0,4 2,1 ± 0,2 4,4 ± 0,4

рН культуральной среды 4,3 ± 0,4 3,2 ± 0,2 3,3 ± 0,2 3,8 ± 0,3 3,4 ± 0,2

Количество лимонной кислоты, г от 0 до 0,3

В результате ферментации зерновых культур уровень фитазной активности отличался незначительно, а при ферментации зерна ячменя и пшеницы находился на одном уровне. В следующем эксперименте проводили сравнительное изучение фитазной активности при ферментации зерна ячменя и зерна пшеницы.

Результаты по определению фитазной активности и общего белка в нативном растворе при поверхностном способе ферментации зерна ячменя и пшеницы представлены на рисунках 8 и 9.

Рисунок 8 - Результаты внеклеточной ФА при ферментации зерна ячменя и

пшеницы поверхностным способом

о и и

щ

ю о

о

§ 2 к

се 3

о 4 Л |Ц

й- ю §

о

4 2 0

Й

Ячмень Пшеница Сырье (зерно)

8

6

Рисунок 9 - Результаты по определению содержания внеклеточного общего белка в нативном растворе при ферментации зерна ячменя и пшеницы

поверхностным способом В таблице 7 представлены результаты исследований активности, содержание лимонной кислоты и рН среды.

Таблица 7 —Показатели процесса ферментации

Показатели процесса ферментации Сырье (зерно)

Ячмень Пшеница

Удельная активность, ед/мг общего белка 7,1 ± 0,4 6,5 ± 0,4

рН культуральной среды 2,9 ± 0,2 2,6 ± 0,1

Содержание лимонной кислоты, г 0,4 ± 0,1 1,1 ± 0,1

Таким образом, наиболее высокие показатели ФА, количество синтезируемой кислоты выявлены при ферментации зерна пшеницы, что объясняется высоким содержанием крахмала в зерне пшеницы, гидролизуемого синтезируемой амилазой до глюкозы, которая в результате биоконверсии превращается в лимонную кислоту.

Влияние концентрации источника фосфора на биосинтез фитазы

Известно, что включение источника фосфата в питательную среду влияет на рост микроорганизмов, а также на синтез метаболитов. В данной работе также было изучено влияние различных источников и вносимых дозировок неорганического фосфата в питательную среду на синтез фитазы при глубинном и поверхностном способах культивирования штамма миромицета. В качестве источников солей фосфора были выбраны две неорганические соли: КН2РО4 и №ШРО4, КН2РО4 является неорганическим источником фосфора в ранее разработанной биотехнологии лимонной кислоты с применением штамма

Aspergillus niger Л-4 [18]. Выбор второй соли (NaH2PÜ4) вытекает из того, что в научной литературе встречается очень мало исследований по изучению влияния данной соли на биосинтез грибной фитазы штамма Aspergillus niger. Выбор количества вносимой соли в питательную среду также основывался на технологии лимонной кислоты [18]. Влияние более низких дозировок вносимых солей в данной работе не исследовалось по той же причине. Внесение дозировок солей фосфора выше 0,5 г/дм3 в данной работе также не исследовалось по следующей причине. В работе [186] биосинтез фитазы Candida krusei контролировался концентрацией фосфата в среде. Максимальная фитазная активность наблюдалась в среде, содержащей 0,5 г фосфора на 1000 см3. Увеличение концентрации до более, чем 0,5 г на 1000 см3 вызывало ингибирование синтеза фитазы. Однако, в отличие от большинства сообщений, некоторые исследователи обнаружили, что выраженная фитазная активность бактерий в рубце не была ни ингибирована, ни стимулирована фосфатными добавками. Кроме того, подавление синтеза фитазы неорганическим фосфором было менее значительным в среде с более высокой сложностью композиции. Это было результатом либо неспособности неорганического фосфора подавлять биосинтез фермента, либо тем, что компонент среды стимулировал синтез фитазы. Причины эффекта фосфора на биосинтез фитазы стали областью растущего интереса. В результате изучения влияния на синтез фитазы различных источников и вносимых дозировок неорганичесих солей фосфора в питательную среду установлено, что соль NH2PO4 менее эффективна как источник фосфора (таблицы 8, 9).

Таблица 8 - Влияние концентрации КН2РО4 и №ШР04 на биосинтез фитазы при культивировании штамма

глубинным способом (процесс ферментации сахарозоминеральной среды, конец процесса - 120 ч)

Источник фосфора Концентрация источника фосфора, г/дм3 Содержание общего белка Фитазная активность Количество лимоннои кислоты, г

внутриклеточное внеклеточное Внутриклеточная Внеклеточная

мг/г Е, мг мг/см3 Е, мг ед/г ед/мг общего белка Е, ед ед/см3 ед/мг общего белка Е, ед

КН2РО4 0,16 1,9±0,2 19 3,4±0,3 113 1,7±0,2 0,9±0,2 15 2,9±0,3 1,1±0,2 115 232

0,32 1,6±0,1 14 2,4±0,2 89 1,1±0,1 0,6±0,1 13 1,9±0,2 0,8±0,1 86 207

0,48 1,1±0,1 11 1,8±0,1 67 0,5±0,1 0,4±0,1 11 1,3±0,1 0,7±0,1 54 175

№ШР04 0,16 0,9±0,1 11 1,1±0,1 41 0,6±0,1 0,6±0,1 8 1,1±0,1 0,9±0,1 35 137

0,32 0,8±0,1 9 1,1±0,1 38 0,3±0,1 0,3±0,1 5 0,5±0,1 0,4±0,1 22 122

0,48 0,8±0,1 9 0,9±0,1 34 0,1±0,1 0,1±0,1 2 0,3±0,1 0,3±0,1 14 109

Таблица 9 - Влияние концентрации КН2РО4 на биосинтез внеклеточной фитазы при культивировании штамма поверхностным способом(процесс ферментации ячменя и пшеницы, конец процесса - 120 ч)

Сырье (зерно) Концентрация КН2РО4, г/дм3 Внеклеточное содержание общего белка Внеклеточная фитазная активность Количество лимонной

кислоты Е,г

мг/ см3 Е, мг ед/ см3 ед/мг общего белка Е, ед

Ячмень 0,16 5,1 ± 0,4 128,3 36,2 ± 2,1 7,1 ± 0,7 657,5 22

0,32 4,6 ± 0,4 114,5 25,3 ± 1,5 5,5 ± 0,5 444,8 21

0,48 3,2 ± 0,3 101,1 9,8 ± 0,9 3,1 ± 0,3 276,3 21

Пшеница 0,16 6,4 ± 0,5 184,6 39,2 ± 2,8 6,1 ± 0,6 963,2 37

0,32 5,7 ± 0,4 148,1 20,8 ± 2,1 3,6 ± 0,3 604,1 32

0,48 4,8 ± 0,4 149,4 12,1 ± 1,2 2,5 ± 0,2 375,4 31

Повышение концентрации обоих источников фосфора также приводит к снижению активности фитазы. По работам многих исследователей также известно, что при увеличении вносимой дозировки фосфора подавляется синтез кислых фосфатаз и фитаз, тогда как снижение концентраций фосфатов приводит к их экспрессии [29, 86,125].

На основании полученных результатов сделан вывод, что более перспективным видом сырья для биосинтеза фитазы при поверхностном способе ферментации среды является зерно пшеницы. При ферментации питательной среды, содержащей зерно пшеницы и минеральные соли, штамм способен синтезировать фитазу с высоким уровнем активности и повышенное количество общего белка без снижения уровня биосинтеза основного метаболита - лимонной кислоты.

В результате проведенных исследований для продуцирования фитазы штаммом Aspergillus niger Л-4 выбраны следующие составы питательных сред и режимы ферментации:

• при глубинном способе:

- состав питательной среды для получения посевного материала, г/дм3: сахароза - 50, меласса - 17; нитрат аммония - 2,5; сульфат магния семиводный -0,25; фосфат калия однозамещенный - 0,16; рН - 6,5.

- состав ферментационной среды, г/дм3: углеводный источник (гидролизат кукурузного крахмала с ДЕ = 32 ± 2 %) - 150; нитрат аммония - 2,5; сульфат магния семиводный - 0,25; фосфат калия однозамещенный - 0,16; рН 6,5.

Режимы ферментации:

- в шейкере-инкубаторе: температура на стадии получения посевного материала - (36 ± 1)°C; на стадии ферментации - (32 ± 1)°C. Возраст посевного материала - 24 ч. Длительность процесса ферментации среды - 120 ч. Скорость перемешивания - 230 об/мин.

- в ферментаторе: температура на стадии получения посевного материала -(36 ± 1) оС; на стадии ферментации - (32 ± 1) оС; длительность процесса 120 ч. Возраст посевного материала - 24 ч. Число оборотов мешалки в минуту 120 на

первые сутки процесса, 150-200 - на 2 сут, 250-300 - 3-4 сут, 300-350 - 5-6 сут; условия аэрации в первые 6 ч - 8 л/мин, с 6 ч до 12 ч - 16 л/мин, с 12 ч до 24 ч - 32 дм3/мин [14-15].

• при поверхностном способе: - состав среды для получения посевного материала, г/дм3: сахароза - 50,0, меласса - 17,0; нитрат аммония - 2,50; сульфат магния семиводный - 0,25; фосфат калия однозамещенный - 0,16. Состав питательной среды для ферментации, г/дм3: сырье (зерно пшеницы) и вода в соотношении 1:5, нитрат аммония - 2,50; сульфат магния семиводный - 0,25; фосфат калия однозамещенный - 0,16.

Температура на стадии получения посевного материала - (36 ± 1) оС в шейкере-инкубаторе; на стадии ферментации в шейкере-инкубаторе при скорости вращения 30 об/мин - (36 ± 1) оС. Длительность процесса 120 ч.

Так как при глубинном способе ферментации среды наиболее высокие уровни активности синтезируемого фермента, количество общего белка и основного метаболита - лимонной кислоты определены при ферментации гидролизата кукурузного крахмала с ДЕ=32 ± 2%, то для получения ферметного препарата (концентрата) использовался гидролизат кукурузного крахмала с ДЕ=32 ± 2 %.

Разработка способа получения ферментного препарата, содержащего

фитазу

Исследование физико-химических и биохимичесаких свойств ферментного препарата, содержащего фитазу

Полученный в результате ферментации гидролизата крахмала с ДЕ=32 ± 2 %) нативный раствор, представлял собой окрашенную жидкость и содержал клетки продуцента, редуцирующие сахара (от 0,25 % до 0,55 %) и белок (3,2 ± 0,2). В таблице 10 представлен состав культуральной жидкости, полученной при ферментации сред глубинным и поверхностным способами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Муста Оглы Наргуль, 2020 год

Литература

1. йюсоб получения лимонной кислоты и комплекса книотостабнльных амилолишческих ферментов: пат. 22^4371 Рос. Федерация: МПК С 12 Р 7/43 В 01 И 61/14/ Шарова Н.Ю.; заявитель и патентообладатель Санкт-Петербург Государственное учреждение Всероссийский научно - исследовательский институт пишевых ароматизаторов, кислот и красителей РАСХН; мявл.11.05.01; опубл. 10.08.04.

2. Шарова Н.Ю.. Сафронова В.И. Генетическая паспортизация штамма АлрегрИш mger Л-4 - промышленного продуцента лимонной кислоты с помощью геномного АПР-фингерпринтинга // Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т. 51. - № 2. - С. 204212.

3. Способ получения лимонной кислоты, альф а-амилазы и глюкоамилазы: пат. 2366712 Рос. Федерация: МПК С 12 Р 7/48 С 12 N 9/34/ Шарова Н.Ю, Позднякова Т.А., Выборнова Т.В., Кулев Д.Х.; заявитель и патентообладатель Санкт-Петербург Государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пишевых ароматизаторов., кислот и красителей РАСХН; заявл.06.07.07; опубл. 10.09.09.

4. Муста Отлы Н.М.. Шарова Н.Ю. Фнтаза микромыцета АьрегаПи.! щеег - потенциальный пишевой микроингредиент // Сборник докладов УП международной конференпии «КАЗАХСТАН ХОЛОД^М 1 б»_ 2016_ С_ 5159.

i p g Альманах научных работ молодых ученых

ХЬУП научной и учебно-методической конференции Университета ETTMQ. Том 4

Абднкамалова Нурзат Бахтбековна

Гол рождения: 1995

Университет ИТМО, факультет пшпевых биотехнологий и инженерии, кафедра технологии производства пшпевых микроингредиентов, студент группы № Т4113

Направление подготовки: 19.04.01 - Биотехнология e-mail: abdikaBaalova.n'idJniail.n]

Пуста Оглы Нар гуль

Год рождения: 1992

Университет ИТМО, факультет шппевой биотехнологии и инженерии, кафедра технологии производства пищевых микроингредиентов, аспирант

Направление подготовки: 19.06.01-Промышленнаяэкология и биотехнологии е-niail: naroul ш -м шаН .гп

Шарова Наталья Юрьевна

Год рождения: 1967

Университет 1ТГМО, факультет шппевой биотехнологии и инженерии, кафедра технологии производства пищевых микроингредиентов, л.т.н., профессор e-mail: natalva shaiovaliiiiinail.ru

УДК 577.152.54:661.746.?

ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ФИТАЗЫ, СИНТЕЗИРУЕМОЙ ШТАММОМ ASPERGILLUS NIGER В^З Абликама.товя Н.Б., Муста Оглы Н Научный руководитель - д.т.н., профессор Шарова НЮ.

Результаты лажной работы шкэзэлж, тго фнтвзиля пт. I и ktt-thttti поеышалэсъ в теченн& трех суток, н составляла на конец третьих суток (б.83±0,33) ед'-ем3, -затем активность фермента снижалась. Содержание Белка было высоким на первые и вторые сутки, затем количество белка шпдд Количество кислоты наогёрот jusшша б соответствие с ув елнченнея возраста

ШСЕЛНОГС vrm - TTIТ дд пггмттдц и т прОЦКИ тгу пт. i и цяр^тп инд

Ключе вые слова: фермент. фнтаза, Aspergillus шгет. биосинтез, фитиновая ннслота. фитат.

Фитиновая кислота (мио-иноштол 1, 2, 3, А, 5, б-гассакисфосфорная кислота) - это первичная форма нахождения фосфат-иснов в растениях и причина для беспокойства о здоровье человека. Обычно фитат представлен в виде солей таких катионов как К". Са3" и Mg* и распространен в растениях {семенах и орехах), микроорганизмах и в организме некоторых животных. Хотя фитат и является главной формой охранениям фосфата, он не может быть использован в организме человека, домашней птицы и животных: поскольку в этих организмах отсутствует фитат -деградирующий фермент [1]. Фермент фитаза (мио-инозитол 1. 2, 3, 4, 5, б-гексакисфосфатфосфогадролаза) относится к подклассу семейства гистиднн-кислотных фосфатаз {ГКФ). Он катализирует последовательное высвобождение фосфата из фигата. В 90-х годах XX века голландская фирма BASF предложила на рынке препарат «Натуфос», а финская AI со Ltd. Biotechnology - препарат «Финазм для кормов

Альманах научных работ молодых ученых ХЬЛШ иаучнай и учебно-методической кот

ИТМО. Том 4

животным. Продуцентами в обоих случаях являются грибы рода Aspergillus. В России фитаза не производите л. поэтому исследования в данном направлении актуальны [2].

Наиболее богаты фитатамн злака орехи и бобы: Следовые количества инонитопгевсафосфата присутствует в картофеле1, моркови: капусте. В ЧЕрной одоролине и клубнике фишновая кислота выявлена в следовых количествах. Таны: образом, фитиновая кислота, пап ала ет в пишу человека и в Борй1а жшзпнк с различными пншёеьош продуктами [3].

Основная проблема заключается в том, что шесть реакпионноспособных фосфатных групп в молекуле фитата являются сильным хелатирующим фактором для Са3 , Mg* , Fe1*, Zii В условиях рН пищеварительного тракта образуется нерастворимые ыетаплфигатные комплексы. в результате металлы недоступны для всасывания в шип тракте человека и животных [4].

Целью данной работы являлось исследование ферментативной активности фитазы. синтезируемой штаммом Aspergillus niger на сахарозоыинеральной среде.

Результаты. Результат исследований представлены в таблице.

Таблица. Результат™ ферментацим с ахарозоми моральной ьреды (усредненные данные)

Условия куль тнн про в алия Основные показатели в нашвном растворе

Время ферыенташш. сутки Содержание белка, мг.'сы3 Количество общей кислоты, г/ колба Фитазная активность

ел/см3 ед'мг белка

1 4,435 0,12 3,125 0,704

5,063 0,09 3,500 0,692

4,906 0,11 3,700 0,754

2 4,043 1,05 5,300 1,311

3,964 1,03 5,800 1,463

З.В07 1,09 6,300 1,655

3 2,551 2,71 6,500 2,54В

2,630 2,55 6,900 2,623

2,865 2,79 7,100 2,478

4 2,316 4,54 6,200 2,677

2,160 4,79 5,900 2,731

2,237 4,60 5,700 2,548

4,5 2,195 4,98 4,500 2,050

2,100 5,12 4,300 2,047

1,965 5,18 4,400 2,239

5 2,002 6,27 3,900 1,948

2,080 6,18 3,000 1,442

1,766 6,62 1,000 0,566

1. На основании полученных данных сделан вывод о том, что фитазная активность повыпшлась в течение трех суток и затем снижалась.

2. Аналогичная тенденция отмечена и для белоксодержашнх веществ.

3. Количество кислоты увеличивалось до четвертых суток и незначительно снижалось к пятым суткам процесса.

^ 04 Альманах научных работ молодых ученых

Ж, УД научной и учебво-мётодЕгчесЕдй конференции Университета ИТМО. Том 4

Оскимбекова Гулшя Есенгелдневна

Гол рождения: 1995

Университет ШМО. факультет пшцевых биотехнологий и инженерии, кафегци технологий производства пищевых микроинтрелыентов. студент группы Т4113

Направление додготовш: 19.04.01-Биотехнология e-mail: suMaudiimbekova^gniailconi

Пуста Оглы Нар гуль

Гол рождения: 1992

Университет ШМО. факультет шпцевой биотехнологии и инженерии, кафегци технологии производства шпцевьгх микроикгрелыентов. аспирант

Направление додготовш: 19.06.01-Промышленная экология и биотехнологии e-mail: narEul m «maiJ.ni

Шарова Наталья Юрьевна

Гол рождения: 1967

Университет ШМО. факультет шшгевой биотехнологии и инженерны, кафедра технологий производства пищевых микроикгрелыентов. л.т.н., профессор e-mail: natalva shaiova 1(aJmsiLni

УДК S77.Lf2.54:661.746.? ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ФИТ АЗЫ, СИНТЕЗИРУЕМОЙ ASPERG^LLUS

Оскимбекова ГЕ, Муста Оглы Н. Научный руководитель - д.т.н,. профессор Шарова! НЮ.

По результатам этан работы наиболее оппоильнымв условный ш ддидуши штзжма-продуцент! Дзреа^Шиг шрег Ъ-4. сннтезнр'уншего фнгэзу. явпнклйя ддпрщри ЗГ'С и Бремя Еуньтшнровання 72 ч_

Ключевые глава: филы. лимонная ннслотэ. А^рег^Шш; швы1. гнлролнжзт краяаэ.тз. фитиновая

1ЖЛ111

Важным направлением биотехнологии является получение ферментных препаратов. Ферменты широко используются в различных отраслях. Основные продуценты ферментов -микроорганизмы [1].

Технология получения фитазы стала известна только в последние годы в связи с широкой перспективой ее практического использования. Под ее действием: происходит дефосф оршшрование фитиновой кислоты. Это соединение распространено в природе и особенно в растениях Фнташ являются основной формой фосфорного запаса семян. Содержание фитиновой кислоты в семенах злаковых и бобовых культур находится в пределах 0,5-5,0% от сухого веса. Фитаты могут оказывать негативное влияние на некоторые пропессы жизнедеятельности человека. Применение фитаз для удаления фигатсю из растительных пишевых продуктов является актуальный [2].

По мнению специалистов агропромышленных предприятий, введение фитазы в корма позволяет снизить затраты на дорогостоящие компоненты. К ним относятся в первую очередь кормовые фосфаты, а также аминокислоты, белки н источники угаерода.

Альманах научных работ молодых ученых XLVII научаем и учебно-методической

ИНУЮ Том 4

С открытием фжтазы особую важность приобретает изучение биохимических свойств ферментов различного происхождения. Фитаза является дщм добавкой, н ванными свойствами фермента являются высокая специфическая активность, широкая: субстратная специфичность, стабильность в широком диапазоне рН. стабильность при хранении дражированни корма и прохождение через пищеварительный тракт [3].

Учитывая все вышесказанное, пелькэ данной работы явилось исследование ферментативной активности фитазы. синтезируемой промышленным штаммом Азрег^из ш^ет Ь-4 продупенгом лимоннсш кислоты щш ферментации гидролтгзата крахмала.

Активность фитазы во всех препаратах обычно обозначают в единицах фитазнои активности в 1 г конечного продукта (РТи/д или ЕТТф. Одна единила фшаэнои активности (1ЕТЦ) соответствует количеству фермшта. которое высвобождает 1 мкмоль неорганического фосфора в минуту из субарата в концентрации 5,1 икмоль при рН 5,5 и температуре 37°С [4].

На рисунке представлен график интрапеллюлярной фнгазной активности фермента при условиях культивирования пггамма АьрещШия ш.еег Ы на гидролизате крахмала. Температура процесса культивирования составляла 29°С, 32°С, 34"С. Фитаза по своей природе — белковое соединение, поэтому необходимо изучить ее термоустоячивостъ. Как показывают результаты исследований, уровень фигазной активности на 24 ч был незначительным и составил при данных температурах 43,96 ед/г, 52,12 ея/г. 40.28 едЛг соответственно. Однако при увеличении возраста посевного мицелия и времени культивирования фитазная активность также возрастала. Наибольшую фитазвую активность штамм-продупент лимонной кислоты проявил на 72 ч культивирования для всех трех температур. На 48 ч и 120 ч фитазная активность находилась на уровне, незначительно отличающимся от 3-х суток. Начиная с 96 ч по 120 ч наблюдался спад активности фермента в 1-1,5 раза, во

•is "с -12'С 34'С

Нч 4Эч 72ч Кч 120ч

Бремн. сут

Рисунок. Зависимость интрацеллюлярном фнтаэной активности при культивированин продуцента лимзннэи кислоты - штамма Aspeng ill us riger L-4 на пщролизагте крахмала

Таким образом: наиболее оптимальными условиями дня культивирования ппамма-продупента А&рещШиь niser L—4, синтезирующего фнхазу. являются температура 32аС н время к^швнрования 72 ч.

Литература

1. Suzuki U., УозЫшша К and Tataishi М. About the enzyme "phytase". which splits :'anhvrinw}xy-methylene ¿¡phosphoric acid it Bulletin of the College of Agricuhnie. - 1907.—V. 7. - P. 503-512.

2. Редкоз\бов OJE. Фитаза. Что изменилось за последние 15 лет I! Комбикорма. - 2014. -Вып. 12.-С. 71-74.

3. Вардоян Г.С. Биосинтез фермента фитазы грибом АьрегаШиь niger: лис. ...канд. оно. наук - СПб., 1999. - 129 с.

4. Савинов В Л., Самбук Е.В., Падкина М.В. Природные и рекомбинангные фитазы микроорганизмов И Вестник Санкт-Петербургского ^гннверитета. - 2007. - Вып. 2. -С. 66-74.

УДК 577_ 152 _54 IÓ61.746.5

Биосинтез фитазы микромицетом Asrpergífíus íiiger при ферментлцнп шдрол из.ттов кукурузного крахмала в лабораторных условиях

Н.М. Муста Оглы', naigu]_m(ffimail.m д-р техн. наук Н.Ю. Шарова IJnatalya_sliaMvai(®maiI.ni Т,Б,Быборнова:. yjtKjrEuova.t^inbaK.FU

'Университета JJUÍO 191002, Россия, Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 5 JВН1Ш пищевых добавок - филиал Федерального научного центра пигцееьиг njnne.ii их, В Jf. Ibpéamoea РАН 191014, Россия, Санхт-Петербург, Литейный 7tp. 55

Наследовали Зносннтез фпгззи при кулътпвпрованнп прсмытешсп» пгтамна зпБрошщщ-тшсл oiooópa.3 ователл .4spcrgil!us niger Л-4 на пцралиатл: kjtjtfi^emo с разлзгтнос

степенью пгцрыпзавл^эсратореыхуслсвпях- Oóieinziai изиенш являлись зиси

црвдГЧРвгга AíjíёrgiÍTuí ni^r Л-4 и напшные растворы, по т: ленные при ферментации пцр&шгапь

врахмиа (ГОСТ 3-i±5Q-=o±3) со степенью пщишва. харатерп гуемоп ДЕ = =0,9 ± п ДЕ = 31.8 ± -j?c. ФфмгатливЕ^ш активность определяли согласно ГОСТ 314&--ÍOÜ. Содержание ije.uíOEbix веществ, сcp-ñHыдтп зитадон Лоурп. Б qiiBHemai с pasee n^Ti^eнжгпi результатами псследовптпп"[ крzdшсодсржлшего сырья - шдратпгап помола, верна рил. внутриклеточная (пнтрдпелдюллрная,! фит^знзл активность па пятые ^иш фермеятаща! при культдгвпровансп продуцента в условиях птепхера-пш^-батора MuhitroШэьш в ю раз выше и составила 1.2 = 0.1 ед/г, Внеклеточная (жпрапеллв харкая) фнтазная активность в конце ó□ отезжпоппп«кого процесса HixojiLiacb ва уровне 6,S ± о^ í^/cm1. тто в 18 рас омьше по сравнению с гщро.вппсн помо.тл зерна рнш, Повышенная как внутри-. тал. п внеклеточная фтгааная акпшЕости щншгщты при проведении miotíзло,юпгс-еского процесса i.iaínpaiupEO» ферментаторе Eio sta(L Cplns — Сго-зМО п со ставила [ соответственно 5.3 ± o.j ец/г >шц«.шя и ü.i ± 1.1 вд/сл1 напевного раствора. Доказано, что наиболее предпочии+^тьеьве (^-бстрлол дш ónodoreia фтазы rpni№i-кпсютодар 13омтые^1 Aspergilhis niger Л-4 является гпдролнзат куд;рузного кризлн с денстрозньтм эквивалентом (ДЕ), рчвньг.] 31,8 ± Проективные Злспштеа фшааы приводится па логарпфмагчестгуто

фазу роста микром: спет л. а активная экскреция фермент л - на стационарную фазу его разиагшл. Для уъелпчендтя: уровня фжаавоЕ астпвностп пеле-соооразно проводить бпотешатеппеекш процесс в ферментаторе. обеспечивающий пнгененвное воздупия^вешн.

Ключевые словл. внутрнпслесулярные трансферты; лтпчоннля кислота; фита зная ахтнвность; гидролиза т кра-^ала. ^sperjiJías niger; :шеешш напшныерастворы.

DOIi 10.1758fi\231(Mlí4-10IO-l(>-]-9l-9E

Phytase biosynthesis withAsjjergiiriis Niger niicroniycete during laboratory starch fermentation of corn starch by drolvsates

Nar<pil M. Miista Ogly', nar^ul_in@iiiail,n] D. Sc. Natal;^ Yu. Shaio^1*,11atalya_3haT0ra1@n1ail.n1

Tatyaiia V. Yyboruova1, vybomova.tig-mlxtx.rij

1ITMO ITniiwrsirp 9, LomoTtosovstr., St. Petersburg, 191002. Russia

2AH-Russian Scientific Research Institute of Food Additives -Bivmch of the Federal Scientific Center named ¡¡/fier VJi. GorfMlmM, RAS 55,Liteiny aoe., St. Jttereiiuiy, 191014, Russia

Hie aim of this work wis to investigate the phrase biosynthesis during cuhnatios of an mdostrlaJ strain of .-tipir^illuf iiiger L-4 micromycetic acid-forming age lit on corn starch hydrolysates iritL various degrees of hydra-lysis in laboratory- conditions, Objects of sttidy — the mycelial mass of the ,4spcrgilft!s iiiger L-4 producer and native solutions obtained by fermentation of corn starch hydroh satei (State Stanlart 3=1^9-^013) ivith a degree of hydrolysis characterized by DE = =0,9 ± 1,5 id and DE = 31.8 ± Enzymatic activity «■as determiaied according to State Standart 3i48r-=oi=.

The content of protein substances «■as determined by the Lomy method, Compared with the previously obtained results of studies of starch-containing raw materials — rye grain grinding hydrolyzate. intracellular (intracellular) phjtise activity on the fifth day of fermentation when the producer (fas cultured under the conditions of the Multitron shaker-incubator was 10 times higher and amounted

to l.3. ± o. i u/g. EïtracelMar (extracellular) phytase activity" at the eui of tine biotechnologies] process iiji it the levil of 6.8 ± 0.5 nnib/cnij, tvfaicL is 18 times more than the rye grain grin ding hydrohiate. Increased both intra- and extrmMu phjtisi activity iter€ ichiiiei during the bictechnologica] process ill the Rio 5tatïCphis—C20-3MO laboratory fermenter and ainonnted to 5.3 ± 0.3 imits-'g ot mycelium and 1-.1 ± 1.1 units/cms of native solution respectively. It has been proved that the most preferred substrate for the phytase biosynthesis by niger L-4 fungus-acid former is com

starch Lydretrzate with a dtitrcse equivalent (I>E) of 31.fi ± s.iSe. Productive phytase biosjutbesis occurs in the logarithmic phase of micromycete growth, and active e\cretic-n of tlie enzyme occurs in the stationary' phase of its development, To increase the level of phytase activity it if advisable to carry ont a biotethnological process in a fermenter that provides intensiv e air supply,

Keywords: lintennolecrilar transferases: citic acid; jJiytase activity; starch bjidrolysale; Aspergillus rdgeri n^iceliTun; nafi'.t sohitkms.

Введение

В дшцрв годы фитазы привлекают внюнние в качестве техно л огжчес toro кжи шятшт средства при переработке и производстве пищевых продуктов, Снижение содержания фптата в шпце в результате действия фигаз способствует повышению бподоступности минеральных веществ,

До настоящего времени фитазы в основном, если не исключительно- использовались в качестве кормовой добавки для животных в рационах, главным образом для свиней и птицы, и в некоторой степени для рыб. Первые коммерческие фитазы были выпущены на рынок в 1991 паду. Между тем, объем рынка находится в диапазоне 150 мтш евро [1].

Существует также большой потенциал для использования фптаз в переработке и производстве продуктов шгтания для человека: но до шх шор ни один фптээнып продукт для соответствующего пршкнения в пищевой промышленности не попал на рынок. Исследования в этой области вапранлены ва улучшение питательЕоп пенности растительных продуктов, а также ва техническое совершенствование со работки пищевых продуктов. Усиленное питание фитатсодержащпмп продуктами приводит к значительное снижению абсорбции минеральных веществ в рационе [а], а дефосфорилирование фптата во время обработки пищевых продуктов приводит к образованию только частично фосфоритшрованных сложных эфпров мпоивозптолфоофата с меньшей способностью ухудшать всасыванне в кишечнике минеральных веществ б рационе. Кроме того, существуют убедительные доказательства того, что фитат-белковые взаимодействия негативно влияют на перевариваемом бедка ш ifitro, и степень этого эффекта зависит от источника белка. Было показано [3], что индивидуальные двойные эфиры миоинозптолфосфата имеют несколько важных фпзполопгческих функпии у человека. Таким образом, фитазы могут найти прюквение в пищевой промышленности для производства функциональных пищевых продуктов [4], если такие биохимически активные эфиры миапноэитолфосфага смогут генерироваться фитазами п всасываться в пищеварительном тракте человека. Сообщалось о технических усовершенствованиях, связанных с добавлением фитаз в процессе обработки пищевых продуктов, в том числе о запрещении при изготовлении хлеба, производстве □залягав растительных белков, шиняи кукурузы во влажном состоянии и фракционировании зерновых отрубей [5].

Фитазы [миоинозитол (1,2^,5,6) геиакисфосфатфосфогидролазы] были обнаружены в растениях, микроорганизмах и тканях животных [6]. Префикс «гексакпс» (в отличие оп «renca») означает, что фосфатные труппы не связаны друг с дротом. Они представляют собой подгруппу фосфатаз, которые способны инициировать поэтапное дефоофорилиравание фитата [миопнозитол (1,2,3,4,5,6) гексакисфосфат], наиболее распространенного иввзитлфосфата в природе, Эта классификация не -зависит от их функции in vivo, Еоторая обычно остается неизвестной [7],

Ранее проведенные во БНГШ пищевых добавок (БНШШД] исследования показали, что штамм Aqjenjiílus niger Л-4 - продуцент лимонной кислоты синтезирует фитазу при ферментащш утлеводоодержатцпх сред.

Цедь данной работы - исследовать биосинтез фитазы при кульшвированпи промышленного штамма Aipergfííus пщег Л-4 на гидролизатах кукурузного крахмала с различной степенью гидролиза в .лабораторных условиях.

Материалы п методы исследования

Объектами исследования являлись мицедиальная масса продуцента Asperffiiius пщег Л-4 п нативные растворы, полученные при ферментации гидролпзатов кукурузного крахмала {ГОСТ 32159-2013) со степенью гидролиза, характеризуемой ДЕ = 20,9 ± 1,586 и ДЕ = 31,8 ± 2,1Й4.

Для гидролиза кукурузного Ерахмада использовали ферментный препарат Амитгосубталпн Гзх {ПО «Сиббиофарм», Россия) с амило.лишческой активностью 850 ед/г (ГОСТ 23635-90).

Состав питательной среды для получения посевного материала, г/дм^ сахароза - 50, меласса - 17; нитрат аммония - 2,5; сульфат магния семпводный - 0,25; фосфат кадия одиозамегценный - 0,16; рН - 6,5, согласно [в].

Состав ферментационной среды, г/дм^: углеводный источник — 150; нитрат аммония — 2,5; сульфат магния семиводныи - 0,35; фосфат калия однозамегценный - 0,16; рН 6,5.

Ферментацию осуществляли в Еачадочных колбах вместимость» 750 от1 периодическим способом с применением технологии концентрированных сред в шейкере-инкубаторе Multitron (ENFORS, Швейцария) и в ферментаторе Bio3tat«Cpliis-C2a-3MO (Sartoiius, Германия) при следующих режимах;

> получение посевного материала - температура (32 ± i)°C. Длительность процесса - 48 ч.

> ферментация - температура {32 ± 2)"С, Длительность процесса - 120 ч, Количество посевного материала для процесса ферментации составляло 15% OTO&btMa ферментацпонной среды.

Гидролизат кукурузного крахмала для ферментатцш готовили следующим образом; навеску крахмала смешивали с водопроводной водой {гидромодуль 1:3} н добавляли ферментный препарат Амилосубтплин в количестве i ед/г крахмала в пересчете на сухпе вещества, Ферс.кыныи препарат предварительно растворяли в 20 см* воды. Суспензию крахмала и ферментного препарата нагревали до температуры от 8о до ^"С ивыдерживатш при .згой гэшературев течение 14 постоянно перемешивая. Б гидротшзате определяли количество Сахаров пи сахариметру и содержание гуутгу веществ по рефраЕтометру. По окончании ферменташш биомассу микромицета отделяли на воронке Бюхнера. Ббшомаосе и в нативном расгаоре определяли фитазную активность (ФА) методом, основанным на определении содержания неорганических фосфатов, образующихся в результате дейстаия фермента на субстрат, согласно ГОСТ 31487-2012.

Содержание белковых веществ определяли методом Лоури.

Полученные опытные данные обрабатывали на практике с помощью методик математической статистики, а также пакета программ Microsoft Office.

Результаты и обсуждение

Ранее проведенные исследования показали, что значительное накопление фптаэы экскретируется из кдетки на первых стадиях развития гриба Aspergillus тадег Л-4 при культивировании на различных утлевсдоодержащих средах [9-10]. Литературный обзор показывает, что в работах других авторов различные продуценты фитазы также обладают способностью к биосинтезу внеклеточной (зксграпелтполярной) фитазы [11-14]. В исследованиях [15-17] приведены данные о биосинтезе и накопленш! фитазы в клетке (иптрацеллюлярная),

На рисунках i и 2 представлены эксперпмешгадьные данные, полученные в результате исследования внутри- и внектгеточной фигазной активности при культивировании штамма Aspergillus шдст Л-4 на тидролизатах крахмала с ДЕ = 20,9 ± l^X и ДЕ = 31,8 ± цА в шепкере-инкубаторе,

Характер динамики внутри- и внектгеточной фитазы различается. Внутри клетки активность фермента увеличивалась в течение трех (уток процесса ферментации пщролизата крахмала с ДЕ = 20,9 ± iiS%. Но ближе к концу процесса (на четвертые и пятые сутки) ФА снижается. На первые сутки ФА была равна 0,4 ± 0,1 ед/г, к средине бшотехвологическоапо процесса ФА была равна 1,9 ± 0,2 ед'г, на четвертые сутки - 1,3 ± 0,1 ед/г, а к концу процесса ферментации снизилась до 0,65 t 0,07 ед/г. По-видимому, синтезированная фитаза к окончанию процесса ЗЕСкретируется из клетки: чем и объясняется более высокая экстрацелтгюлярная ФА,

v

us

.JE=30.9tl.SW

ДЕ = 31.8=2.1?«

i г э ♦ j

Длительность процесса, cyr

ДЕ=20.«1.5%

tats

Длительность прибил, tyr.

PzizyKiy: i - Динамика активности ^пшлзы при к^тьтивиро-вйнии шгшисма Aspergillus nigerJI-4 на гидрализатш грашала сДЕ = 20,9 ±1,5*6 иДЕ = ;ц.н? ± в шейкере Multitron (ISFOES, Швейцария): А - дил шнасшь, еб/г .икчыия; Б - экстра ^ививржи активности ed/att

Fi'^urs i Dynamics ofphyt2i£ aictiuiiy during cufrit4iiwpt cfAspergillus nigerL-4 strain on starch hydrol-ysata UTtfi DE = 20.9 ± 1.5% and DE =3i.S± sa% in 11 Jliuifrt743Fi shaltEr fCVFOKS, Switzerland): A - intraceitular activity, units/g of mycelium: В - ertraceflufar actiiit!/, units/cm*.

В работе [lfi] авторы исследовали способность дрожжевого пггамма Candida meJitiosica 2491 синтезировать фнтазу и обнаружили, что данный штамм является продуцентом внутриклеточной фитазы. Кроме кию, там же было исследовано влияние различных параметров при культивировании дрожжевого штамма в качалочных колбах н биореакторе на биосинтез фитазы, среди которых изучалось и влияние аэрапии. Авторы отмечают, что изменение скорости перемешивания огг 300 до боо мин 1 существенно не влияло на развитие клетки, во для биосинтеза фермента это был важный фактор. Об^разование дрожжевой биомассы усиливалось за счет увеличения степени аэрации. При понижении скорости перемешивания как накошенная биомасса, так и активность ферментов быта в два раза ниже максимальных значений.

Результаты проведенных исследований показали, что ФА в нашвных растворах (экстрацеялюлярнал фптазная активность) до третьих суток биотекнологического процесса включительно, также как и внутри клетки, возрастала. Результаты работ дзугих авторов тоже показывают увеличение ФА с увеличением времени ферментации [14,19, 21]. На третьи сутки ФА вне клетки была более чем в а раза больше, чем в тот же период внутри клетки {44 ± од ед/см? против ± 0,2 чд/г). Четвертые и пятые сутки характеризуются одинаковым уровнем ФА Б указанный период времени прирост ФА был максимальным,

Для щдролвзата крахмала с ДЕ = 31,8 ± 2,i% характер кривых, описывающих динамику изменения ФА внутри и вне оетжи, аналогичен динамике изменения ФА в мицелии и нативвом распоре для щдролизата крахмала с ДЕ = го,9 ± 1,58s. Повышенная продуктивность биосинтеза фитазы обусловлена, возможно, более глубокой степень» гидролиза, а следовательно, и более высоким содержанием простых Сахаров (глюкоза, мальтоза), которые потребляются продуцентом для накопления биомассы, формирования ферментной системы и активизации ферментативных процессов (таблица i).

Таблица i — Содержание углеводов в гидро*1изатпх KpamtfLia

ТаЫе 1, The cuF-boJt^dnate contend of starch hydrolysates

Степень гкзршшза Е^агмала Доля углеводов в суmi Сахаров в гпдролпзагах: %

Г.ТЮИЗ! ^ыльтаза декстрины

ДЕ = 20,9 ± ад* ЗД * 0,2 19,8 ± ф 77ji ± 7,*-

ДЕ = 31,0 ± 2;1» 4А ± 2Tl4 6S,£ ± 6)1

Штамм АврегдШиз тдег Л-4 янляется промышленным продуцентом лимонной кислоты п поэтому важло отметить, что с третьих по пятые сутки наблюдается активньп: синтез оргашгчвских кислот, Б начале ферментации (24-40 ч) рН ооставил 2,66 и снижался до 1,72 в конце процесса ферментации. То, что на четвертые и пятые сутки прирост ферментативной активности приостанавливается и перестает увеличиваться, может быть объяснено тем, что возможно основной метаболит - лимонная кислота -

подавляет ФА. Pasee авторы [го] установили подобное явление ингабиравання лимонной кислотой активности амитюлитческих ферментов, синтезируемых Aspergillus пiger Л-4. Авторы работы [21] провали модельный эксперимент по изучению влияния состава ферментационной среды, в которую были внесены различные добавки, одна из которых - лимонная кислота (о¡.lit.) еле отдельный компонент-добавка и в комбинации с экстрактом дрожжей и Твпн-ßo, на биосинтез фермента. В результате выявлено сильное пнгпбцрлощее действие .лимонной кислоты в концентрации од5б на биосинтез фптазы штамма Г. ¡anugirtasus EMI 096218. Активность была почти на 90% ниже контрольной.

Приостановление роста ФА также может быть вызвано действием ингибитора фнтазы белкового шпа: содержащегося в злаковых кушлурах (в данной работе это не исследовалось). Так в работе [22] авторы впервые сообщают, что зерновые компоненты ячменя, риы: пшенины и кукурузы могут ингибировать активность фитазы Aspergillus finann. Ингибирование фитазы зависело от количества зернового субстрата в питатетгьной среде и значительно варьировало в зависимости on вида злаковой культуры. После выделения ингибитора из зерен ячменя с помощь» Superdex G200 был вдентофицирован белок с молекулярной массой 30-35 ЕДа, Тестирование очищенного ингибитора фптазы вместе с фитазап A.ficuum и спегшфпчвскими ингибиторами протеазы пвпстатином А, Е64, ЗДГА и ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид) выявило, что пепсташн А приостанавливает ингибирование фитазы. Авторы указывает на то, что наблюдаемое инги0ироваш]е фитазы А ficinun экстрактами зерновых культур обусловлено действием протеаз по типу аспарагиновой иротеиназы.

Конпентрация белка в исследуемых нативных растворах при ферментатши гидролизата крахмала с ДЕ = 20,9 ± 1,5% была на уровне [44 ± а^з) мт/снР на первые сутки и падала до {11,2 ± 0,1) мг/см? квонцу процесса ферментащш, При ферментации гидролизата крахмала с ДЕ = 3i,& ± 2,1% динамика накопления эксгращеллюлярного бедка имеет аналогичный характер. Причиной снижения уровня эксгращелдюлярного белка, начиная с четвертых суток, предположительно, могут быть иротеиназы. Подобный факт был установлен в работе [23], Удельная ФА при культивировании пгтамма-мпкромпцета на гвдролизатах с ДЕ = 20,9 ± 1,5% и ДЕ = 31,8 ± 2,1 % повышалась.

Однако содержание белка в биомассе на протяжении всего процесса ферментации исследуемых щдролшатов крахмала повышается,

На рисунке 2 представлена динамика изменения фитазной активности при ферментации гидролизатчв с ДЕ = 20,9 ± 1,5% и ДЕ = 31^8 ± 2,1% в ферментаторе,

Рисунок г - Динакикд ¿г.1.тпивно:гм;; при культивировании продуцента лидюннсщ хасшяви -

шталшл Aip^rgiRvs nigerJI-4 на ?цдра..щзагпй1' сДЕ = 20,9 ±1,5% иДЕ = jirB а

^ep.weumanjopeiiostaiSCiiiui - С20-3УЮ: А - нмпцицеллки-фнал аил шнасть, ed/г .икчыша; Б - экстра цемпиршн активности ей/см* fljure 2, Dynamics cfpkytase acfiurfy during cuhiuatwri of citric acitiproducer - Aspergillus nigerL-4 strain on rturch ftifdraTifiaiiea iwfft DE = 50.9 ± 1.5% andDE = зл.8±2л%тАе ДоЯщ^Кн^рГшУЁтгтГЕГ - См -3MO: A - infrnjHfltiJar ¡¡Unity, vnils/g qfmycelmm.iB-ertTacelhilar ocfiiity, ишй/ппз

Сравнительные данные по содержанию белка и других показателей процесса ферментации в шейкере-инкубаторе и в ферментаторе Eiostat®Cplua — Сго-зМО указаны в таблипе 2.

Таблица s. Показатели процесса ^ершемпта^ии ¡идро.1изатов FipoiiftLia (конец процесса- i^o ч) ГлЬГед. ГгъЛ'оайи-з of the fermentation process of starch hydrolysates (end of fhe process- isa Jiouri)

Уел: Е-с я ЕуЛЪТНВЕраВ ¿ноя ДЕ гидролиза та Ерахгала. % ПасазателЕ пронесся фзг с

рн «¡ДЕржливе «лез аЕггнвность uimzb]

в ЛНЦЕЛНЕ, лг/г лицйлня Б ВаТЯВН-Э?! piniope, лг/ся1 ввтранелл велярная экстрацеллклЕрная

6Д/Г ПНВеЯЕЯ угельнш. ец/гаг МЛЕа ед/сш бзгнвбого раствора удельвая, ед/нг МЛЕа

ШВНЕнр- KEEjtinDp Hnltitiaii ID,9 ± ±,73 4,5 ± 0,3 1,2 ± ОД 0,65 ± Q.07 С ,13 ± O.Dl 4,3 ± од 3,6 ± од

1,75 6,1 ±0,5 М =>= 1.2 ± 3,1 □ .11 ± 0,02 □ ,й ± 0 j 6,2 ± 0.2

Ферментатор Bioita ttplTis - С20-3МО ю,9 ± 1,75 5,1 ±о,4 24 ± 0,2 4А± э,Ва ± о,09 ю,9 ± 1,2 4,4 ± од

31^ ± i,i fi,fi =fc D,7 2,9 ± од 53 ± а,3 o.Ea ± о,эВ ± 1.1 4,2 ± 0,2

Динамика изменения уровня ФА, определенной в биомассе^ полученной при культивировании штамма аспергилла на гидролизате крахмала с ДЕ = 20^9 ± в ферментаторе^, аналогична динамике изменения фитазной активности, определенной в биомассе при ферментации того же гидрализата в шейкере-инкубаторе. В биотехнолотческом процессе в условиях ферментатора активный рост ФА также наблюдался на протяжении 3 суток. Уровень фитазы в мипелии и иатнвиом растворе при проведении процесса в ферментаторе превошодпл уровень активности фермента при культивировании пгтамма асшертлла в шейкере-инкубаггоре в 2,3-4,3 раза. Значительная разница определена для первых и последних суток биотехнологичесЕого процесса. Однако в отличие от уровня интрацеллюлярной фитазной активности: полученной в условиях шейкера-инкубатора, уровень акгпвнсстп фитазы, выявленной в условиях ферментатора, снижается незначительно — на 0,5 ед. Возможно, это связано с различными условиями аэрации. Так в работе [24] авторами было изучено влияние аэрапип на биосинтез фермента AsperyiJius niger St-б, Подачу воздуха в ферментатор осуществляли с различными скоростями (о^ 04; 0,6; 0,8 и 1,0 дер/дм^мпн). При интенсивности аэрапип о,б дар/дм^мпн выявлено максимальное накопление фермента {7560 ед/л/мин). Однако, при повышении воздухоснабжения (1,0 дар/дм^-мин) накопление фермента значительно снижалось.

Экстрацеялюлярная фитаэная активность при ферментации среды в ферментаторе, как показали исследования, также активно растет в течение трех сукх., далее рост ФА практически полностью прекращается. Следует отметать, что в данный период также происходит активное кислотонакопленпе, с чем может быть связано интоиравание активности фитазы, Данное явление подтверждалось в работе [21] для фитазы: другого штамма и в работе [so] для амилолтических фермштов, синтезируемых Aspenjiiius nitrer.

Отличие в ко.личЕстве синтезируемого фермента, опенпваемое по его бпокаталптической активности, при различных условиях культивирования (шейкер-инкубатор, ферментатор), скорее всего, объясняется уровнем воздухосвабжения в процессе культивирования пггамма. Авторы работы [25] также отмечают увеличение продуктивности биосинтеза фитазы шгамммом ibeuifomonas aenjjgirioaa рб с повышением уровня аэрапип.

Авторы работы [26] исследовали биосинтез фитазы штаммом AsperiiflusJicTiuni РТСС 5288 при культивировании в лабораторном ферментаторе (The Majer Saence-Fi-S-3L, Тайвань) вместимостью 3 дьр с рабочим объемом i дар. Они также отмечают значительное влиянне скорости аэрации на продуцирование фитазы в силу того, что штаммы грибов рода Aspergillus являются аэробными.

Исследователи [27] также сообщают о том, что продащрование фитазы штаммом Aspergillus niger FS3 в биореакгоре колонного типа повышается в результате принудительной подачи воздуха,

Заключение

В биомассе, полученной при ферментации гидролизата кукурузного крахмала с ДЕ = 20,9 ± lj&t и с ДЕ = 31,6 ± 2,i% как в качалочных колбах, так и в лабораторном ферментаторе, активность фитазы возрастала в течение трех суток и далее фермент экскретпровался из клетки. Гидрализат кукрутшого

крахмала с декстрозным эквивалентом (ДЕ), равным 31,6 ± 2,1%, является наиболее предпочтительным для биосинтеза фитазы гтибом-кпститообразователем АзрегдШш тидгг Л-4.

Показатели биогехнологического процеоса, порученные при гультпвирсвании штамма Aspergillus niger Л-4 в фермеетаторе: превышают таковые е качалочных колбах.

Прирост ФА в нишном растворе наблндатгся е течение первых трех суток процесса и ,цалее приостанавливал ся, возможно, вследствие интибии-лощепо действия лимонной кислоты, так как к окончанию процесса ферментации штамм активно продуцирует основной метаболит - лимонную кислоту.

Причиной снижения содержания экстрапатстллрного белка, предположительно, может быть синтез протеиназ.

Поскольку механизмы и факторы, ретуширующие биосинтез фитазной активности микромицетов, представлены различными исследователями сравнительно ограниченно, то требуется их дальнейшее изучение. Полученные экспериментальные данные являются предпосылкой для разработки технологии получения ферментного препарата: обладающего фитазной активностью: и текналюгичЕскшо вспомогательного средства на его основе.

References

I. HaefherS., KnietsdiA., ЗсЬо№еп Z,: Lraua J.: Lciscbeiit M.. Zildi: O, Biotechnalagical production and applications of ptytiF.es, App ЫЖ& тоЫЫоду and ЯьоАесЛпоЗсвд, гид, V. pp. jSE—397.

д. Kjonietzny Greiner R. Phytic acid: null ifimnl impaci. In Caballero E., Trugo L.; Finglas P. (Eds.)

Encyclopedia of food science and nutrition. flsevier, London: UK, 2003, pp, 4555-45-63. 3. Shears 5 ,E Hue versatility of inositol phosphates as cellular signals. Eiochimica et Eiophysijca Ada, 1996, V. 1436,

PP 49-674 Greiner R.: lArssuu AM.: Carkson N.G., Muiquiz M.: Eoibamo C, Cuadrado C, Pedrosa Ш,, Gcynajja C. Enzymatic phytntE degradation — a possibility to design Junctional foods? RJisA Лжгты! 0/Food and JAiiriiwn Scierras, 2002, V.aa, pp. 50-54

5. Caransa A., SimeD M., Lehmussaari M.: Vaara M.: Vaara T. A novel enzyme application in com wet milling. Starch. 1986, V. 40, pp. 409-411.

& Kjonietzny U.: Greiner R. Molecular and catalytic properties of pbytate-degradin^ enzymes (pbytases),

IntErnatioFM I Journal of Food Science & Technology. 2002, V, 37, pp, 791-612. 7. Chn H.M., Guo R.T.J Lin T.W., Chou C.C., Ebi H.L.- Lai H.L- Ting T.T, Cbenj EJ., Seknger ВХ.; IVang AJLJ. Structures of Selenotnonas ruminantium phytase in complex with persnKated phytate: DSP phytase fold and mechanism for sequential substrate hydro]}™is. Sfrucfune. 2004, V. 12, pp. 2015—2024.

6. Sharova N.Yu. Development of the scientific founfhjbans of ueivtechrualogies fc-i food additires and ingredients, using starch-containing raw materials, Etferuied abstract of candidate s fJtcsis. St, Petersburg, 2013,233 p. [in Russian].

9. Masta Osrly N,, Sharova N.Yo,, Yushkaoskajte A.R, Aspergillus mger micromycet phytase — a potential food microingredjeiit ETnruersily News. Applied Chemistry and Biotechnology. 2016, V. E, no. 1(24), pp. 82—91 (Гп Assam).

10. Musta Ojdv N.. Sharova li.Yu., Vv bonwjva T.V. Eicsvnthesir of mushroom phytase chrome mycelium — AspcTTjifiiis пщег acid-forming agent on starch hydrodisata Technology arui ilimrJiaFtdisirig of the Imtovaliue Foodstuff. 2019,110. 1(54), PP. 23-26 (In Russian).

II. Gautam P., Sabu A., Pandey A., Sialiacs G., Scccol C. FL. Microbial production of extra-cellular phytase using polystyreneas inert solid support. Bioresource Technology. 2002, V. 83; pp. 229-233.

12. Rjocky^Salimi K.: Hashemi M,, Safari M, Mousi\3nd M. A novel phytase characterized by thermostability and high pH tolerance from rice phyflosphere isolated Вол'Лш subfifdi E.S.16. Journal of Advanced Research. 1016, V. 7, pp. 381-390.

13. Greiner R,, Gomes da Sdva L., Couri S. Purification and characterisation of an extracelMar phytase from AspeTgifius nijcr иТдзАд. Brazilian Journal of Microbiology. 2009, V. 40- pp. 795—607.

14. iindhya A., Srice^i A, Su^'^malatha I>evi P, and Narasimha G, Production and optimization of phytase by Aspergiffus niger, Scholars Research Library. Der Pharmacia Leitrc. 2015, V, 7(12), pp, 146-153.

15. Gargova S,, Sarr- skri M. Effect of cilhie conditions on the biosynthesis of Aspergillus niger phytase and acid phosphatase^ Enzyme and Microbial Technology. 2003, V. 32, pp, 231-235.

16. Amad Helal >LM,:. Dania], EJT.: Esav.y M A Optimiration of phytase prodnciion bj'PFm'riilium ригригодепшп GEi undeT solid state fennemtatioc by using Бол-Eehnben desdja, Siiudi' Jsvmsl of Biciogical Sciences, 2014, V. 21(1], pp. 61-BS.

17. Nahas E. Control of acid phosphatases egression froim Aspcngiiiui niijer by 5oi] charactieristias, Brazilian Areftitjes of Biology and Technology. 2015, V. pp, 658-666.

18, Georgiev D., Gotcheva V., Angelov A., Slaivcbev A,, Gargova St. Fhj'tase procuction by GaptJu^i mefibiosira 2491 aEkalophjiLc strain. Emirates Journaf of Food and Agriculture. 2013, V. 23; pp, 342-346,

19, Bae-Hee L, Sun-Uk Ch.- Ycns-Il H Culture conditions and characterizations of a new pt;-"tase-p:c dtcin^ fungal isolate: Aipergiffus sp. L117, Myeobiology, 200g, V. 33(4}, pp. 223-229.

20, Sharova N.Yn, Hue production of an amylase inhibitor during the fermentation of stanch hydrolysaites with an acid-forming strain of Aspepuji/ius nioer L-4. Herald of the Jîeissîuîi Academy of Agricultural Sciences, 2013, no. 3: pp. 45-47 (In Enssiaa).

21, Bujna E.j Rezessy-Szabô J,M,, Ngayen D.V.f Nguyen D,Q, Production and some ptoperties of extracellular phytase from TÎiermomyces fanugiraojus EMI 09621Î} on. rice floor as substrate. JfijeoîpJiene. 2016, V. 7, Is. io, pp. 1576-1587.

Eekahi Z.E.. Madsen Dionisio G., Erinjch-Ped-eisen H. Aspergions ficuum pbyiase activity is inhibited by ccieal grain components, FLoS ONE. 20d7j V. ±2(5):eoi76838.

23. Sharova N.ïu., fAifccora TA. Regulation of the biosynthesis of citric, acid during the bioconversion of stardi hvdiullYsates with Asperfli/Jus niger mold, Jourptaf of the Kussian Academy of Agricultural Sciences, 20071 no. 6- pp. 19-21. (In Rjnssian).

34. Tahii A.: Mateen E.; Saeed S.; Uslt H. Studies on the production of commercially important phytase frcm Aspergiîïus Fiijer st?-6 isolated from. dwajMig organic soil. Afzcologzn Aphcada JntemnCiima!. 2010, V. 221(2}, PP-51-57-

25. Sasiiekha E.: Eedashree T,: Champa K.L. Optimization and partial poiifiication of extracellular phytase horn Pseudomonos aeruginosa p6. Pe!agia Research Library European Journal of Experimental Biology, 2012, V. pp, 95-104-

Badamdii M.. Hamidi-Esfahani Z., Abbasi 3. Comparison of phytase production by Aspergillus Picuu m under submerged and solid state fermentation conditions; iîmrusi'nij on Modem Food industry [FMFI), 2013, V, 2 Is 3, pp. 129-137.

27. ipie: M.IL, Wojciechowski AL, Letti LA: et al. Moniloting fermentation parameters during phytase production in colimm-type bioreactor nsing a nev.' dita acquisition s;.stem. Fioprj^ess and BiLKLjstienis Engineering, jzoio, V. 33Î9)jPp. 1033—1041.

CmaFitiiS nocmipinufl e pedaiaiujo 30.01 joso

Научные основы дпшевы! тинологпп

УДК 577.152.54:661.746.5

Н. МУСТА ОГЛЫ. Н.Ю. ШАРОВА, Г.В. ВЫЬОРНОВА

БИОСИНТЕЗ ГРИБНОЙ ФИТАЗЫ МИКРОМИЦЕТОМ -КИС ЛОТО ОБР АЗОВ АТТЛЕМ ASPERGILLUS NIGER НА ГЕДРОДИЗАТЕ КРАХМАЛА

В работе ¡.тгмс&лнлка пйк«л,ч?пяь фермента фитазы расщеплять фатап\ катрю. Ооъехлп исследования сашющраат ишипаюиAspergillus niger.1-4 при г\льж\:вировании мик-ромииета но гидролизате урахмала. В итоге работы выявлено, что сидролизат краг\к1~а яе-ляется шшшс ; юйсодяще ii средой для цпняыпфившis jvnmimm Aspergillus niger Л-4-npoty-цешна звионлой к\1сломы, синтезирующего дшбнуа и белоусодерлсащие соединения.

Ключегые слоге: биотехнологии, упе&одсвдержащее сырье, фитазная

активность, Aspergiiiu: niger.

СШ1С0К ЛИТЕРАТУРЫ

1. Fugtboiig. A. Biocteccica] слатсссегт^сют and ш vtttio diggtibahly assay of ЕцмдОии ралтши (BCC17W4) pbytase eqjrassEd ia Puchia pastcns / A. Fugtbraig. K. Boonyapaknm, W. Samlek. 5. Tanapongpipat L. Eormlaichitr. K. Pootanalrit № Proteui EipresriiHi and Purification -1010. - VoL 70-, Issue 1. - P. MHS7.

2. (Згашег. E. Myo-Inosito] phosphate isoiuerL зепетатн! Ъу th.e action of a phytalie-degiadiiig eiz>tl2 ícli KlebiMLi TETigEHi mphytate ,'E. Отнпкг, H. Caiisym// Myaobiolcgif. - MM. - VoL 52, Issue B. - P. ííü-íti.

i. larimslla. JUL Rioe-tnan producís: phirtonutriEEts uilzi potential applications in preventive and clinical medicine /RJ. JariKalla И Drugs Esperimenla] and Clínica] Research. - 2001. - Vol. 17, Issue 1. - P. 17-IS.

4. С арычев, EX. Теюкоогв! ж слоями рваного злеоа 1 EX. Сэрычев. - Ы.. Шппелртвтлйг, 1959.

— С. 7-5.

5. Трумэнов. О.В. Фнлата i шрхленнп шдддкдмш iilkbcthec-: н жпы / ОВ. Труфаиоь.

- Киев: ПспзарафИныз, 2011.-С. B4J7.

6. Шарова, HJO. Разработка научных ksdi новвгс тешвлвпш wmiv лобавок и пнгрегпентсв с шг-полваованвем )раи«ал)созержашего сырые: 0Í.13.07 «Бвогенвогзогня жппеввс: прсауъюв в снопопиескп активных вешестк»: атореф. лнсс. ва секи ym eren. л-сстор теле натле - СПб.: 2013. - 233 с.

7. ГОСГ31437-2012. Мезтооларственныв стандарт. Препараты ферментные. Метопы опрелеленше фер-ягнташЕноп ШМИН-Ш фитазы. ЬвСС 07.10130 45J2Q. -Вяед. 2013-07-01.-11.: С танларпшфори. 2012. -10 с.

3. Mycia Оглы, H1L Свжтеэ фта;ш прел?центом пшеннс:1! шслсты I H.bL Ьlycra Оглы, Н JO. Шарова И КАЗАХСХ4Н-ХОЛОД-М16: с борнп:-: ловлалсв \Я1ме:кл;.:нароиоп жияференпни. - Алмазы. M1Í.-C. 51-59.

9. Шарова. КЮ. Цщщид» Еовонтора амялаз лрв ферменгатзз гвлрогтэагов кра.\мала хжлото-асраг.лошнм плалмом Aspergillus шщагЛ-4 /НПО. Шаргва .''.' ВестшЕсРоссннолн aiazsMin сельсыгсогяйсгиен-ных науи - Ml 1. - 3. - С. 45^7.

10. Ы^тта Оглы. Н. Фнлаэа мш-^омзжета asper^illus Biger — погенш^'.^ввл шплевок мш^опкгрелнент t Н. Мтета Оглы: Н.Ю. Шарова. AJP. Юпплмскажк ¡I Иьвесгиа bj"íbb. Пршлалкая цпмп.ч □ оиогсшвлвгяа. - 201В. -X а.,.^1С!4>-С.Е2-91.

Муоа Ог.ты Нярптль

Т :-шверсптет нвфщмддЕОmm г^сполупш ме^ш^лз к опшн

Аспирант 2-гов^рса у^фелры гекнопогнн лроваволства лпшевес; мпкропнгтелпентов 1S1Q02, Сани-Пе1еро>рг.,^. Ломонисова, 9, В-дд± NaigaJ_iii'iÍJuail.m

Шарова Наталья Юрьевна

Всерос; писваш налтво-н^слеловагельекпн ннгтнпт ^вгевве; гооав;:-: (фплшл} ФГЕШ" «ФНЦ л лггвьс; сп;ге.ч пл. В Л. Г;;роаива> Р.ЛН Дирепор. □окгар Ha>t; профессор РАН

191014, Сашл-Петербург. ЛптеЬсын проспект. 55. E-mail, naislyлгто'.а 1 ¿¡шаЛju Выоорновп Тптъзнл В.тллпчпроввд

ВсеросспнсБаш налтво-нсслеловагельскпн ннггнпт шшщш зобавск (фплшл) ФГЕШ" «ФНЦ л пггвьс; cixtím пл. В Л. Г;;роаива> Р.ЛН Нз^тгтш i uu i-

191014, Сажкт-Петербург. ЛптеЬсын проспект. 55. E-mail, naislyлгто'.а 1 ¿¡иаЛju

íi 1(54) :019

TeiB-pa&nn n TOBapoBezeHHe ¡mnHgwmn nnmeBhii npojyKTQB_

N. MUSTA OGLY, N.YU. SHAROVA, T.V. VYBORNOVA

FDNGTOM PHYTASE BIOSYNTHESIS BY MICROMICEITE -ASPERGILLUS NIGER ACIDE R ON BAIRDRESSENG HYDROGEN

Ttiei&iHiy enzymepfyltze to deamyxxe sodiumph}1asr is vnestigated. Ihe ol^ecl ttf tin nu^v synthesizedthe strain Aspergillus nigeria, w hem the mjcFOTi^to war rviwredon the siarcf! fn.dn3r.zax. As a result qfihe verlr. ¡twasßmnd that the search hydrvlyzax ¿s a less snitabie medium Jbr cultivating the Jsp&gillus niga- qf the L-4 citric acid producer s}TvhesiiingfingaiphytiEí ard prozem-caitmning compounds.

Xeyrrerds: microbial biotechnologi', aaiwhydrate-co'itainmg rav mazenaL:, ph;nase activity, AspergíIIiás niger.

BIBLIOGRAPHY (TRANSLITERATED)

1. Fugthong. A_ Biocheccical characterization and ini vitro digestibility assay of Zupeoicillimu parvum (BCC17W4) Phytase eq>ressEd in. Puchu pastons I A. FhstL;l£. K. Boonyapakrtm, W. Somlek. S. Tanapongpipat L. Eurwiliichiir. E. Pootaaaiit It Protein Egression and Pu-Tficitioi -1010. - "VoL 70, Issue 1. - P. MHS7.

2. Greener. R. Myo-Inositiö] phosphate isomers generated by rL; action of a phytate-degracing erzyir; fon lUe'o; iel Ii. TEirigEni ai phytate.'E. t-reiiier, N. Caiisson 1/ Myaobiologie. - 20M. - Vol. 52, Issue 8. - P. 59-08.

3 lariwalla. E.T. Rice-bran producti phytonutnaaits with paremia] applications La preventive and clinical med-Lcizue HJ. Jarin-aUa ;■'Drugs Espennienia] and Clínica] Regard. - 2001. - VoL 11, Issue 1. - P. 17-2Í.

4. Saiycbev. E.G. Tekhmologiya i bioburiva izhamaga Meba f B.G. Sarjthev. - M.. Pishchepiomizdal. 1959.

- S. 7-9.

i IYu&nov, O.V. Fitaza v koraiUnii Bet úsoajozvaisrveanvh zMvQtavh i pticy / O.V. IYu&nor. — Eier.-: Poligjaflnko. 2011.-5. S4-E7.

6. SHaroi.'a, N.YU. Hazraboia nauclmyh osnoY nm"yli tekhnologij pishchevyh dobavok L ingrediEjUov 5 ÍLpcl"z<irL™ijEni krahniilBö&erzliashchego qi^i: 0i.lS.ff7 iiBiiHEkhiiölagiya pishchevyh produktiv i biologicheski ák-Irvnjii veshchestL-)! ivroref. diss. ua soLsk. uchyou. step, dotier Dekan naide. - SPb.: Ml J. — 233 s.

7. GO ST 314*7-2012 MezhgoaidarstMeiLnY] slandari. Pmparaty fermenluye. Mietody opredElEiiiya feniHLt-muoj afctivujosti fitazy. MES 07.100.30 65.120, - VredL 20134)7-01. - Ml: StandaitiníomL 2012. -10 s.

5. Musta Og]y. Nil. Sintez fitazy produrentom jnomo; kisloty / N.M. }.fuita Ogiy. N.YU. SHarova II KAZABSTAN-HGLOD-201S: ibomit dokladov VII mezhimiaradnioi loift-iatii. - Ainoaty. 201 <5. -£. 51-Í9.

9. SHaiova, N.YU. Prodncirc^aniie ingibiluia anuLaz pn fen^eoiacii ziétoIizíidv trainera kislotoobcazu^mh-djin shlaraiLioiu AspergiHiis eieei L-4 / NYT7. SHartrva // VeBtnik Edssijskcj akadeciL sel'skcbozyaj-shienn^'b iiaiik.

- 2013.45^47.

10. Musta Oily. N. Fitaza initromioela asper^illus Diser- poteniial'ny] pisbcliei'oj mflgotcgradietit IK. Must.1 Ogiy, N.YU. EBaroT-a. AJI. Ymtnatajte II faiestiya i.nzov. PrikLadnaj-a imriya i bwstekhnjoLoája. - 2018. - T. fL Ki 1¿4). - S. 82-91.

Mu-Ltn OglT Narsml

UmT^erstty of In:cnii.a;iL Technologies Ihhäi aod Optics

Postgraduate STudaur of Hie departuaK of tecxuologues for tbe production of food zmau-iug^edieiib 191Q02, St. Petersburg, u], Lomnnosieva, 9, E-mail: Nargiil_niiiftjiiaiLni

Sharova Natalia Yure-.Tia

All-RuLÚan ieLLfic Research InstiTure of Food Addrti^.

a biaudi of He FGBNU «FNTS» V.M. Goibator of 1äie Russian Academy of Scuences Director, doctor of feAÉJ sciences, piofessoj of the Rmain Academy of Scíekbs 191014, St. Petersburg. Uteiuy Prospect, 55, E-mail. nata]ya_shararal^mailxu

Vyboroovi latum MaditnirKiiiHa

All-Russian ScdentiEc Research Institute of Food Additives.

a biaudi of die FGBNU «FNTS» V.M Goibator of die Russian Academy of Sciences Scientific empIovEe

191014, St. Petersburg. Uteiuy Prospect, 55, E-mail. nata]ya_sharaval^maflxu

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПИЩЕВЫХ ТЕХНОЛОГИИ

УДК 577.152.54:661.746.5

ЮЛ МУСТА ОГЛЬЦ HJO. ШАРОВА

СИНТЕЗ ФИТАЗЫ МИКРОННЦЕТОМ - КИС ЛОТООБР АЗОВ ATE ЛЕН

ASPERGILLUS NIGER

BiXrmoii работе исследовалась ферметястшечсп апиан фг.тллз», синтниф c.voiV шташши Aspergillus niger ,1-4—продуцента!/ лаииоит вж.тчллы, при культивировании злвгро-Mtnftma iii iljiim Hi yptir.iiiiiff. А нкткже тредегхние наиболее олягшшмгыкзЕиагш vp'.Tbijjji-вирования шгаоц л/Jjr кете/тазг rj.Tmjijjiji^iJwrja hmoo.-rbJijiW на«■■ ффшноо фвшвд с iou.n(?jirF№fTTJb№ йшюмыюнюо постигши itf^.ucTiiJiff фнтазы в качестве дапвяишпвлынюа i^nr-вого npotrinria михробиатогическко синтеза.

Ключные слееа: лимонная шойщ углеводсодержащие среды, ф:т\а!ная оюнмг-ностъ, Aspergillus liger.

ВВЕДЕНИЕ. 'Л¿тая природа— комплекс взаимосвязанных между собой элементов, выполняющих различные функции. Все эю имеет перед собой одну цель - развитие и поддержание жизни ГИ Ферменты регулируют жизнедеятельность всех:живыхорганизмов. Механизм регуляции лих пропессов сопряжен с прочной связью ферментов ¡1 ¡к ингибиторов—веществ, тормозящих или полностью блокирующих протекание нежелательных ферментативных реакций. Самым показательным примером этого служат зерна, орехи и семена потому что ohei содержат наиболее сильный ингибитор ферментов Г21. Гидролиз фитата в природе осуществляется такими ферментами как фитазы. Известны фитазы растительного происхождения ii фитазы, синтезируемые микроорганизмами {грибные, дрожжевые).

Преимущество грибной фитазы по сравнению с другими вшами фита? заключается в высокой термостабильносш. устойчивости к действию трипсина в пепсина. Рабочий диапазон рН фермента составляет от 1,5-6,5 [3].

Штампы микромшгетау^етт^Цш nigerявляются продуцентами различных ферментов. Например, селекционированные во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевых добавок (ФГБНУ ВНИИПД) штазыы наряду с основным целевым продуктом-лимонной кислотой, являются продуцентами амилолишческих ферментов, илвертазы. глюкоами-лазы, фитазы. Данная характеристика позволяет рассматривать данный микромипет в качестве перспективного продуцента для создания лит—вшишп технологий, предусматривающих в одном технологическом процессе получение не одного пелеваго продукта, а двух и более, то есть разрабатывать мсовмешенные:> технологии [4].

В связи с этим представляет научный интерес исследование биосинтеза фитазы штаммом Л4 микромжгета Aspergillus niger, селекционированным в ФГБНУ ВЕИИПД для фер-ментапии мелассы в лимонную^ кислоту", на различных угпеволоолержашнх средах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Объект исследования - штамм микромипета Aspeigillus niger Л-4, селекционированный в ФГБНУ ВНИИПД для ферменташш мелассы [5].

Ферментацию проводили периодическим способом по технологии канпендрнрованных сред в условияхшеш-:гра-иаьг,"батС'р1 Miilbtron i|TNFOES: Швеёпар!1я) в колбах вместимостью 750 см3.

Для исследований в качестве углеводного субстрата использовали сахарозоминераль-нун> среду (ГОСТ 32159-2013). Источником азота являлся нитрат аммония (ГОСТ 22867-77), источником фосфора - калий фосфорнокислый олнозамешённый {ТОСТ 419S-75).

Состав приготовленной среды лллферменшпии. г/ли3: углеводный субстрат -150; нитрат аммония (NH+NOs) -2,5; сульфат магния семиволный (MgSQWHsO)- 0,25; фосфат калия олнозамешенкый {КН1РО4}- 0,16 рН 6,5.

Процесс проводили при температуре 32 (±1)°С. Возраст посевного материал был равен 24, 48,72,96 и 120 ч. Количество мипелия к объему" исходной питательной среды составляло 15%.

Фитазную активность оценивали колориметрическим методом при длине водны от 400 до 415 им в модификации [б]. Модификация обусловлена тем, что значение рН исследуемых

№ j(f о) жз

Технология п товароведение пндовдпнонБт ппшевьи продуктов

нативньк растворов находится в диапазоне от 1.7 до 2,4, который ниже уровня рН-оптимугма проявления фитазной активности микромипета. Ранее проведённые исследования показали, что прп таких значениях рН активность фигазы составляет 0,5-0,3 ex/ai3 [7]. Для определения фитазной активности в условиях, оптимальных лля проявления действия фермента, растворы подщелачивали раствором гидроокиси натрия {0,1М) до рН = (5,5cb0.1). В нативньк растворах, полученных в результате культивирования пггамма-кислотоооразователя микромипета Aspergillus niger Л-4 на мелассной и сахарозоминеральной среде, фитазная активность находилась на уровне от 1,1 до 2,5 ex/ai3. Содержание кислоты определяли метолом титрования слабой кислоты сальным основанием. Обработку экспериментальных данных проводили с помощью 1ктолов математической статистики и программ Excel ХР. На рисунке 1 представлена фитазная активность в нативном растворе.

В реплтьтате выявлено, что в течение первых лвгх суток биотехнолопиеского процесса фитазная активность не изменяется. Наибольшая активность фермента приходилась на третьи сутки активность увеличилась в 2 раза. На четвертые сутки активность была на уровне значения первых суток :i к пятьи суткам процесса в нативном растворе не илен-

1 GUI 2 сжв 3 с\тхв 4 cjTEE 5 cyrïi Время, сут

Ршунок 1 - JfliNCJiuefjffb ^NFjjiTjjfiн aymumocmu (еб'Ъг) s Hamit&HQM pacmsvpe при qiTbWJW^PNHHif пройуценти лимеиноп кыслетьг - mmucvg Aspergillus niger.Т-4 на oiiàpa.-imejne fjwxMe.ie

(ftpràHtHMbteàûHHHf)

Следует отметить, что период процесса с третьих по пятые сутки характеризуется активным кислотообразованием. Значение рН нативного раствора составляло 2,7 на первые сутки ферменташш и снижалось до 1,7 к пятым суткам процесса. Вероятно, что основные метаболиты- лимонная и глюконовая кислоты подавляют активность фитазы, что корректно возможно установить в результате выделения Е1 очистки фермента. Количество белка, синтезированного микромипетом .4хрег%И1ш идет Л-4 составляло в кативном растворе ог 1,65 до 5,12 иг/см1. Концентрация белка снижалось с увеличением времени культивирования. Наибольшее количество белка было обнаружено в первые сутки в количестве 5,12 шУсм5

В сравнительном аспекте ранее нами в работе [£] было показано, что при ферменташш сахарозоминеральной среды при той же температуре 32*^ активность фитазы в нативньк растворах составляла от 25,0 до 40.6 ед./см5. Наибольшее значение активности фермента при данной температуре наблюдалось на вторые сутки процесса ферменташш. Причел количество белка в представленных результатах исследований оказалось значительно ниже. Следует отметить, что сахарозоминеральная срепа, исходя из выше указанного, является более предпочтительной для культивирования штамма Л4 микромипета Азре^Иш пюег по фитазной активности и по количеству синтезированного белка.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

L Dr. Е iwsrd Howell (Enzyme duet. ТЪе concept of food enzyme;;) ."Lotos Press, 1994. — pp. 5-10.

2. Способ псгл™ ггнмонжоп ыпсгготш н ыомтега ыпг.тсгостаонльньг; алгпдпзггггккгг; ферментов: наг. ÏÏMÏ71 Рог. Фелерадзн: МЛТ С12Р7.4Е, C12N1/14 ! Шарова Н.Ю.; зазжкте.та н штетоооладагепь Гасу-хьрсгвена>е ^"чреаийнле Всеросснгсыш нэучна-нс следовательский ннстнгт шпп^вых ароматизаторов. кислот ж ьрасгггелей Российской академии сепкытаоззвственньс; bsyk (ГУ НШШИКК}. - № MOSlCHilS.lî; заявл. 16.03 J005- onrôi 27.07.Ю07,1юх Уз в. -19 с.

Шарон. Н.Ю. Геиепсчесьаа паслортплаппг пгзмиа JspergiSu: mger Л-4 - прсмыпенхото лролу-лвжга лимонной ккслопл ; шлсоьес-генолшгс АЕи-сш^ерсскшлжа НЮ. Шароьа, В.И. Сафронова .■',■'Сеть-спкиляйстненная -сиопогея.-2016. - Том 51, №2.-С. 204-212.

4. Способ пол;-чешЕ ткмонхоп шслога, —j---н пншшшвзе: пат. 2ÎSS712 Рос. Фелератш:

МНЕ: C12P7.4Î, C12NW3Q, С12Н9.'34.Т11ароы НЮ., Шзлижвва Т_4_. Вшпсрнова Т.В.> Кулев ДJÎ.: ¡ааЕптель п патентообладатель Государственное учрежден» Всеросшн-сннй научБО-псслелоителыллй ннстнттт шппевъп; ароматизаторов. напил a ьраснлелей Poccnnrton а:-:але:ипп селыкопсоздйсгвенньЕ; наук [ГУ ВНИШ11ЕК).

№ :oiî

Нд^ЧНЫ? OfHOBU ШШ(ЕЫ1 Mjjjgn

-№ M071I57IS/13; um 06.07.2007; onywL 1109.2009, Еюл. .4i2S. -6 с.

5. ГОСГ31487-2012. Гтепат^.ть: ферментные. Методы определено: ферментатнвн-гп автпБностпфнгазы. МКС 07.100.10 65.1М. - Ввел. 1013-07-01. - Ы.: Сгэнларпы-форя: 70Ii -10 с.

6. Ыуста Оглы, H1L Сшлеэ фптавы щит-агентом лимонной шслетыI Н.М. Ь lycra Оглы, Н JO. Шарова II Сборннь: ловлалов ЧП м^ьлуваролнон конференшш «КАЗАХСТАН-ХОЛОД-2016», 2016. - С. 51-59.

7. Муста Ог.ты, НМ -i-птаза мпкрсмгЕгега Aspergillus DigEr - миащпддш лпшевой мгщзолнгрелпеп ! HJM. Мтлсга Огш. НЮ. Шарова И Соорнж лонталов XLYH научной н ^чеоио-мегелпческси хевферешпы.

2ои.-сбз-бз.

Муоа Ог.ты Нярптль

Т i-шверстзтет нвфррмзцщ)mm г^спопупш мб^ш^лз к опшн

Аспирант 2-гож^рса хэфелры гекнолопнн прожзволства -тпг«ыу мпкропнгтелпенгов 191Q02, Сани-Петербург Ломоносова, В-дд± Naigtji^Ml —

Шлрода Наталья Юрьевна

БсероссшсБтш нал-чво-исслеловательсЕого ннстпг^т шппевът: авсв Диреьлор. лектор тангасхш вэуь: профессор РАН

191014, Саньл-Петербург. Лптей:-:ый проанео. 55. E-mail. 3atal>3_sbaom-aliiiiiiaiLni

NU MUSTA OGLY, N YU SHARQVA

SYNTHESIS ОТ PHYTASE BY MICROMYCETH - ACID-FORMING ASPERGHLITS NIGER

Ji this rti tnzpna:тс actnity ofpl^tur-s, ^»IhesTzed ij- the Aspergillus niger strain of tin A-4-atrie acidproducer, ш studied fy cultivating jfci тятихцммЛ cm ike ssircft työwipoto. And also the determination of the mojf optimal conditions fbr the cultivation iff the strain in иййсА the greatest шпоит ofthephyace enzyme is synthesized wirt the possibility effirther obtaining ihephyaae m^i™ as an additional targetprvduct of microbiological ^nütasii.

Lryrfords: citric acid, carbohydrate-containing jnedia, phylaw activity, Aspergillus niger.

BIBLIOGRAPHY (TRANSLITERATED)

L Dr. Edward Howell -Etzyne diet. Tlie Loncep-t el food enzymes) .■'.■'Lotos Press, 1994.— pp. 5-10.

2. Sposob poludi-enija jjjollvJ ldsloly i fcomplekia fciilotoslabil'iijli anjlriiiidgJdh fenueatov: pat. 2294371 Ens. Federacija: MPK: С12Р7.,48,С1Ж1.,И : bharoraNJn.; zajsriiteT i patentoabladitel ОоЕисалтелш» uchrezbdesie VseroEsijbliLj luucj^o-iasLedoratel'skij hirirji pishhewb aromatizatoTdY. kislot i fccashelei Rossi'-ikoi aiaoeirii <el iko-liogqsftHiiijiiiiHuk {GUVNnPAEK). - №2005104519/15; lajavl. 18.02:3005; opcbl. 27.07J007; Bjiil. Vefi »i

3. Sbaroya. hi Jo. GeciTiclieüiaja pasponizaidja :.1лаш Aspergilli niserL^I-pToniyslilerniogo produ-cenra luLoauiöj fcibloty 3 pcjjo^LL j'.l ^наонал sa AFLP-fingeipriji1m^ У NJu. Sbanova. V.I bafionova II Sed'skafcozjajEhien-Baja biologija.-2016. - Torn51, .4;2.-S. 204-211.

4. Sposob Tcl jcbeLjji. liaaooooj ldskity. al fa-aucilazy i gljukoajmLazy: pat. 2366712 Fx1.. Fadieracija: MPK. C1IP7/4E, ClJNP.i'30, C12N9.-34 / Sbaioya NJil, Puidnjato^a TJl. TTj1iimi i r.V., EjdIh" D.H.; zsj a^lte]1 i piteD-tioobladabel' OcsudarahEiuioe n;lr;zLi;xe Vsenmij Blii Lii.L.:Loo-htLedo7.TaTeUtij uiEtilut puMe\7ti aioLuri^axro1.', tiilot i kraiitelaj EnKiijstoj akadecrü Eel'stoboqajsnajm-vt oaok (BD \ГШ1РАЕЕ]. - № 200712572B/13; zaija\1. 0fl.07j007: opubl. 10.09.2009, Bjul. .tiS. - 6i.

5 GOST 314S7-2012. Pieparaty femsEtije. Mietody apiedelenija iermenlaTK-noj atmniKti fitazy. MKS 07.100.30 65.120.-VT-ed. 2013-07-01.-M.. ^[iadaniaform. 2012 -10 a.

6. Musta Ofty. N.MI Sinlez fitazv poodmoeiilDni liajsm-rj kisloty ,■' K.M1 Musta Ogly, NJo. Shaiuva II bbcmiii dofctadm- Vn koDJereaiii «KAZAHSTAN-HOLOIXlOiea, 2016. -S. 51-59.

7. MustaOfty.N.M-Fitaza rpikrjmi гим A ^pcraillii^ ni^»' - pimam-ul 4iщ pi ьЪТип лд EutroinEmiiEnt/HitMoita Osly. VI Jl.. Sbaro^ I/ Voomil dotlado1^ ХЬМЗопсллс;: ucbebiu-malodiclieBliaj Ic^fsren: j . ЭШ.-1 63 -63.

llllita OgtY \ДГ5Т1]

UniTierLbty of Infonii.oci: Technologieb Mechamicb and Optirr

PoLtzraduate 3TudEut cf Hue departuEn: of tecxualo^ueä for tbc producliou of food mi ."Dt-iL^2±6LrL 191Q02, it. Peleräbur^. ol. Lcummciuni, 9, b-mail: Nargiil_niiiifjiiaiLni

Sbarova Natalia Vure^Tia

А11-Кшиш ienefie Kesearch Гш-йтше ;-f Food Additives

Direcm:. doctnrof tacimical LciEucea. professor of tbe ЕлиыалАс^ыщ' of ^gekes

191014, St. Petersburg- Uteiny Prospect 55, E-mail. E.i[alyf._blarcval -ijuLailxu

№ J(f 0) :oi3

1714 РестчriK Башкирского государственного медицинского университета П рилонение N5 1.. 2019 г

145. Могшшо EC. Betensky RA. Hedden Т, Sdmltz АР, Wand A, Huijbers W, et a1. Amyloid and APOE (A interact to influence ahDrt-terai decline in preclinical Alzheimer disease. Neurology. 2015;32:1760-7. doi: 10.1212/WNL

УДК5Т7.152.54:661.746.5

Муста Оглы H. Л.Аоликлилловп

НОВЬШ ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ ФИТАЗЫ Научный руководитель - д.т.н., профессор Н. Ю.Ша ровя

Универсвтет 1ГТЫО, ЧОУ ВО С Пб MCII, ВНШП1Д - филиал ФГБНУ «ФНЦ

пшиевых опт им. В.М. Гороатовал РАН. г. Санкт-Петербург.

Резюме: Целью данной работы является исследование яюяыеностг; фггшны, синтезируемой промышленным wmauHMi Aspergillusniger Л-4, подбор условий культивирования шридмчл ¿тя продуктивного биосинтеза фитагпдеградирующего фермента с целью разработки биотехнологии фермента ня углеводсодержащем сырье для практического применения. По полученным ¿¡днньш можно сделать вывод, что фшнащ синтезируемая продуцентом лимонной Kijслоты, является кислой фосфатазой. По преданаял ет ным результатам исследований наибольшая выявленная активность фитазная приходится на пятый сутки и составляет 0,31 ± 0,01 ed/auJ.

Ключевые слова: фитаза, Aspetgillusniger, помол зернаржцферментативная активность.

Мила Ogh" N.. Abdibamakiva Pi. NEW PRODUCER OF ACID PHYTASE Scientific Adiisot — Ph. D. In tecliniical sciences,professor N.Yn Sbrovi EFMO University, PEI HE St. Petersburg MSI2, YNHPD - filial of FSFSE «FSC of food systems of V, M Gash it№> RAS), Saint-Petersburg. Abstract: The purpose of this mi is to stud)' the enzymatic activity of phytase synthesized by- the industrial strain Aspergillus niger L-4, the selection of optimal cultivation conditions of the strain for productive biosynthesis ofphytaie-degrading en rime in order to develop the bioiechnology of the вщуте on carbohydraie-comaining raw materials for practical use.

1714

171Б РестчriK Башкирского государственного медицинского университета П рилонение N5 1.. 2019 г

According to the data obtained, we can conclude that the phytase synthesized by the producer of citric acid ii an acid phosphatase. According to the presented research results, the highest phytase activity detectedfalls on the fifth liqj1 and is 0.31 ± 0.01 u/cm'. Keywords phytase, Aspergillus niger, grinding of rye grain, ena:matic activity-. Актуальность .Фитаза - это фермент из класса фосфатая. который катализирует или стимулирует пиролиз фитиновой кислоты и ее солей - фитатов. Фитиновая кислота является неучсвояемоифорыой фосфора, который присутствует в растительные продуктах таких как злаки, скпепипа и различные злаки [1].

Для живого организма реакпия расщепления фитиновой кислоты и ее солей ли мии-инознтола и фосфатов является важной реакцией обмена энергией. Фитиновые кислоты и продукты их деградации вовлечены в регуляцию клеточной пролиферации и лиффереицыровки. контроль уровня глюкозы и холестерола в крови, противоопухолевые пропессы. лечение болезней Паркинсона и Альпгеймера [3].Минералы. такие как кальций, магний, железо и цинк, часто связаны (хелатированы) в молжупе фишновои кислоты. Этот процесс обеспечивает фосфор, необходимый для здорового питания Во время химической реакпиы фитаза также освобождает калыпш. цинк. железо, магний п марганец, что делает эти ^шнералы диудныи 1щя организма.

Обычно встречающаяся в растительном ыатериалег фитаза является одним из многих ферментов, необходимых для процесса пищеварения. Фитаза разрушает и повышает питательные качества зерна, бобовых, семян и кукурузы. Этот фермент ыожет помочь снизить потребность в фосфате кальция и улучшить здоровье пишеварения[б]. Обзор проведенный Федеральным научно-исследовательским пентром по вопросам шггания и продуктов питания в Германии, показал, что добавление фитазы ыожет привести к значительному увеличению освоения минералов и снижению содержания фитата в злаках и продуктам шпання из бобовых: Это исследование пришло к выводу, что добавки фитазы. которые обычно и традиционно используются для повышенного содержания минералов в кормах для животных, имеют важное значение для пищеварения человека, особенно для щелочной фосфатазы ьшлечника человека Это также может быть способом сокращения деф штата минеральных веществ в уязвимых группах, таких как рождающие женщины, веганы вегетарианцы и люди в развивающихся странах! 7,8].

На сегодня известны следующие факты о мио-иноштол фосфатах;

1. Они являются важными компонентами сигнальных систем всех живьех организмов, обладают фармакологическими свойствами;

1715

1716 Рестчrik Башкирского государственного медицинского университета П рилоненне N5 1.. 2019 г

2. уменьшают интенсивность симптомов сердечно-сосудистых заболевании (Jaiiwalla. Drugs Esp. Clin. líes.. 2001);

3. служат профилактикой образования камней в почках (Grases. J. Nu ti. BiocbeuL.

2001),

4. снижают риск возникновения рака толстой кшпки (Vuoenik. J. Nutr., 2003). Положение фосфатной группы в инозитольном кольце влияет на физиологические

функции соединения. Фитазы гидролизуют мио-ннозитолгексакнсфосфаты последовательно и стереоспецифично. поэтому получение предшественников мно-инозитол фосфатов и свободного мио-инозитола с помощью фитаз является потенциальной альтернативой химическому сннтезу[4].

Цель исследования: поиск новых штаммов - продуцентов фитаз: исследование активности фитазы. синтезированной штаммом AspergillusnigerJl-A при культивировании на гидролизате ржаного помола.

Материалы и методы. Объект исследования - нативные растворы, подученные пры культивировании микромицета - кислогообразователя: Aspergillus niger JI4 на гидролизате помола зерна ржи. В качестве углаолного субстрата применяли гилролизат помола ржаного зерна Ферментацию проводили периодическим способом по технологии концентрированных срез в условиях шейкера-1шкубатордМ1й11&оь (INFORS. Швейцария) в колбах вместимостью 750 см3. Источники! азота являлся нитрат аммония {ГОСТ 22В67-77). источником фосфора-калий фосфорнокислый однозамещёвный (ГОСТ 4193-75).

Состав среды для ферментации, rfaM3: углеводный субстрат - 15(1; нитрат аммония (NH+NOi) - 2,5; сульфат магния семиволный (MgSO^THsO) - 0Д5; фосфат калия одвозамещеиный (KHjPO^) - 0,16; pH 6,5 [2,5].

Процесс проводили при температуре (32 = 1) °С в течение 120 ч. Фитазную активность оценивали колориметрическим методом при длине волны от 400 до 415 ем. Результаты и обсуждение: результаты исследования представлены на. рисунках 1, 2.

171Й

1717 Вестиик Б ашкираю го государствен н ого медицинского ун и верситета Приложение 45 1, 201Э г

Рис. 1. Завн

имостъ фитазной активности

от времени культивирования продуцента лимонной кислоты -пггамма А^егрДизпгеег Л-4

на гндролизате помола зерна ршт.

Рис .2. Содер

ание лимоннои кислоты.

синтезировано« мшсромнцетом при клзЕьтивировапнн на гидролизате поыола зерна рсжи На рисунке I представлена зависимость увеличения фитазной акпшности от длительности культивирования. Прирост активности фермента на весь период биотехнологнческого пропесса хорошо заметен. Аналогичная тенденция наблюдается и дляпроцесса биосинтеза кислоты (рисунок 2). количество которой также растет по мере ферментации гидролизата поыола зерна ржи.Слелует отметить, что уровень рН культуральной среды снижался с увеличением длительности ферментаспш и достигал значения 1,9 — 2,3. 'Заключение и выводы: на основании того, что при культивировании микромицета Азрш^Лв игсря- Л-4 на гидролизате поыола зерна ржи фитаэная активность и количество синтезируемой кислоты увеличивалось по мере увеличения длительности биотехнологического процесса, сделано заключение о том, что исследуемое сырьё перспективно дгя получения нескольких метаболитов в качестве потенциальных пишевых ц кормовых микроингредиевтов. С учётом тош, что рН культуральной среды находится в кислой области, можно сделать вывод о том, что фитаза. синтезируемая продуцентом лимонной кислоты, является кислой фосфатазой. Наибольшая фитазная активность, при описанных в экспериментальной части условиях, приходится на пятые сутки и равна 0,31 = 0,01 ед/см5. Таким образом: гидролиэат помола

1717

1713. Еестчик Башкирского государственного медицинского университета Приложение № 1, 2019 г

зерна ржи можно рекомендовать в качестве компонента питательной среды для выращивания аспергиплов - продуцентов ферментов для создания лекарственных субстанции или БАД содержащих фитазу. Список литературы:

1. Муста Оглы Н.. Шарова Н.Ю.. Юшкаускайте А.Р. Фитаэа микромицета Aspergillusniger— потенциальны!! пшцевой микроынгредиент Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2018. Т. 8,№ 1(24) С. 82-91.DOI: 10.21285/2227-2925-2018-8-1-82-91.

2. Никифорова Т^А.. Шаров а Н.Ю.. Губасова Т Л. Биотехнология и производство пищевых добавок // Хранение и переработка сельлозсырья. 2014. N 8.С. 24-26.

3. Савинов В. А, Самб(ук Е. В.. Падкина М. В. Природные и рекомбинантные фитазы микроорганизмов.'1'' Вестник СПбГУ. 2007. Т.З, выпуск 2. С.66-75

4. Сулейманова А^Д. Новая гистидиновая кислая фигаза Pantoea vagans: выделение и свойства: автореф.дисс.на соискание степени канд.биолнаукб 03.02.03 / Сулейманова АД.; ФГБОУ ВТО; Ндуч.рук. М.Р.Шарипова - Казань.2013. - 26с.

5. Шарова Н.Ю. Продуцирование ингибитора амилаз при ферментации галролнзагов крахмала кислотообразующим штаммом Aspergillus niger Л-4. /■' Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2013. № 3. С. 45-47.

6. Biochemical characterization and in vitro digestibility assay ofEupenicillium

parviim (BCC17694) phytase expressed in Pichiapastoris ■FugthonsA-. BoonyapakronK.Sonilek W., Tanapon|pipat S., Eunvilaicbitr L., Pootanakit K. // Protein Expression and Purification. 2009. VoL 70. Issue l.Pp. 60-67

7. Phytase Modulates Deal Microbiota and Enhances Growth Performance of the Broiler Chickens t Ptak A, Bedford M.E.. Swiatkiewicz S, Zyla К JoaefiaLD. if PLoS One. 2015. VoL 17. Iss. 10(3). doi: 10.1371/joumaLpone.Q 11.9770

8. Influence of phytase or mj'o-inosrtol supplements on performance andphytate degradation products in the crap, ileum, and blood of broiler chickens / Sommerfeld V., Кппге] 5., Schollenberger M., КШш I.. Fodehutscord M. U Poultry Science. 2018. VoL 97,Iss. Idoi: 10.3382/p& /рнгЗЭД.

171S

УДК 577.Is2.s4661.7А6.5

СИНТЕЗ ФИТАЗЫ ШТАММОМ ASPERGILLUS NIGER ПРИ КУЛЬТИВИРОВАШШ НА ГИДРОЛИЗАТЕ ПОМОЛА ЗЕРНА РЖИ

Абдикаыалова Н.Б.. Оскимбекова Г. Е., Муста Огпы Н.М., Шарова Н.Ю.

Университет ИГМО. г. Санкт-Петербург Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых добавок — филиал ФГБНУ "Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М Горбатова" РАН, г. Санкт-Петербург

Научный руководитель: л.т.н., профессор РАН Шарова НJO.

Университет ИТМО. г. Санкт-Петербург Всероссийский научно-исследовательский институт пишевых добавок - филиал ФПБНУ "Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М Горбатова" РАН, г. Санкт-Петербург

Ферменты, участвующие в синтезе и гидролизе фосфатов инозигола. называют фитазамы. На основании изучения Ьшшявдш свойств белков ы определения последовательностей аминокислотных остатков фитазы подразделены на два больших класса: кислые и шелочные. Многие фитазы бактерий: грибов и растений относятся к кислым фосфатазам. Фитазы Aspergillus niger являются тетрамерньвш белками.

Цель этой работы - исследование активности фитазы. синтезируемой штаммом Aspeigillus niger Л-4 на гидролизате помола зерна ржи.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Оглавление диссертации кандидат наук Муста Оглы Наргуль

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биотехнология пищевых продуктов (по отраслям)», 05.18.07 шифр ВАК

Биосинтез фермента фитазы грибом Aspergillus niger1999 год, кандидат биологических наук Вардоян, Гаянэ Сашиковна

Новая гистидиновая кислая фитаза Pantoea vagans: выделение и свойства2013 год, кандидат наук Сулейманова, Алия Дамировна

Направленный биосинтез лимонной кислоты при периодической и непрерывной ферментации гриба Aspergillus niger1997 год, доктор технических наук Авчиева, Пенкер Бабаевна

Разработка технологии получения гидрофобинов грибов для применения в пищевых отраслях2018 год, кандидат наук Колесников Борис Алексеевич

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнология пищевых продуктов и биологически активных веществ (технические науки)»

Похожие диссертационные работы по специальности «Биотехнология пищевых продуктов (по отраслям)», 05.18.07 шифр ВАК

Разработка технологии зернового концентрата из ферментированного зерна для использования в хлебопечении2013 год, кандидат наук Клепов, Роман Евгеньевич

Фитаза отечественного производства в комбикормах для бройлеров и кур-несушек2022 год, кандидат наук Сысоева Инна Григорьевна

Получение трансгенных растений Arabidopsis thaliana с геном фитазы микробного происхождения под контролем вирусного промотора2016 год, кандидат наук Валеева, Лия Рашитовна

β-пропеллерная фитаза Bacillus ginsengihumi: клонирование гена, очистка белка, свойства фермента2013 год, кандидат наук Ахметова, Алина Ильдусовна

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Муста Оглы Наргуль, 2020 год