Биосинтез фермента фитазы грибом Aspergillus niger тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Вардоян, Гаянэ Сашиковна

• Вардоян, Гаянэ Сашиковна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Вардоян, Гаянэ Сашиковна

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1.1 .Фитаты: распространение и пищевое значение

1.2. Фитазы - ферменты, дефосфорилируюише фитаты

1.2.1 .Фитазы растений

1.2.2.Микроорганизмы - продуценты фитаз

1.2.3.Характеристика микробных фитаз

1.3.Области применения грибных фитаз

1.3.1.Фитазы как кормовые добавки

1.3.2. Дефосфорилирование фдаЗт^шщевьгх

продуктов микробными фйтаз'&Мй

1.4. Техно логические аспекты биосинтеза микробных

фитаз

1.4.1.Поверхностная и глубинная ферментация

продуцентов. Источники углерода и азота

1.4.2.Влияние источника фосфора в среде на синтез фитаз

1.4.3.Влияние некоторых параметров ферментации

на синтез фитазы

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.Выявление микроорганизмов, гидролизующих фитин

2.2.Продуцент фитазы, методы и условия культивирования

2.3.Определение активности фосфатаз

2.3.1.Определение активности кислой фосфатазы

по фенолфталеинфосфату

2.3.2.Определение активности кислой фосфатазы

по р-нитрофенилфосфату

2.3.3.Определение активности кислой фосфатазы по

Р -глицерофосфату

2.3.4.Определение активности фитазы.,

2.4.Оптимизация состава питательной среды

2.4,1 .Полный факторный эксперимент

2,4.2.Метод Брандона

2.5.Концентрирование фермента фитазы

2.5.1 .Ультрафильтрация

2.5.2. Вакуум-выпаривание

2.6.Дефосфорил ирование фитатов соевой муки фитазой

2.6.1 .Определение содержания фитатов в соевых продуктах

2.6.2.Количественное определение фитатов в растворе

2.6.3.Ферментативный гидролиз соевых фитатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 .Скрининг продуцента фитазы из музейных культур

3.2.Синтез фермента фитазы культурой Aspergillus niger

3.3.Влияние условий культивирования на синтез фитазы

3.3.1.Влияние аэрации

3.3.2.Влияние значения рН питательной среды

на биосинтез фитазы

3.3.3. Сезонные изменения

3.4.Влияние компонентов питательной среды на синез фитазы

3.4.1 .Построение математической модели

биосинтеза фитазы

3.4.2.Влияние концентрации сахарозы на биосинтез фитазы

3.4.3.Использование мелассы для выращивания

продуцента фитазы

3.4.4.Влияние источника азота на активность фитазы

3.4.5.Синтез фитазы в условиях промышленного

производства лимонной кислоты

3.5.Изучение регуляции синтеза фитазы

3.5.1. Влияние фита га питательной среды на биосинтез фитазы

3.5.2.Влияние продуктов ферментативного гидролиза

фитина на синтез внеклеточной фитазы

3.6.Концентрирование фитазы культуральной жидкости

3.6.1. Ультрафильтрация

3.6.2.Вакуум-выпаривани е

3.7.Изучение свойств фитазы

3.8.Использование фитазы для дефосфорилирования

({штатов соевой муки

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биосинтез фермента фитазы грибом Aspergillus niger»

ВВЕДЕНИЕ

Одним из перспективных направлений биотехнологии является технология получения ферментных препаратов. Ферменты, как биологически активные вещества, широко используются в различных отраслях народного хозяйства. Основным источником ферментов являются микроорганизмы.

Разработка технологии получения гидролитического фермента фитазы началась только в последние годы в связи с широкой перспективой его практического использования. Под действием фитазы происходит дефосфорилирование фитиновой кислоты. Это соединение чрезвычайно широко распространено в природе и, особенно, в растениях. Фитаты -основная форма фосфорного запаса семян. Содержание фитиновой кислоты в семенах злаковых и бобовых культур составляет 0,5 - 5,0% от сухого веса. Присутствуя в пищевых продуктах из растительных семян, фитаты могут оказывать негативное влияние на некоторые процессы жизнедеятельности человека. Поэтому, актуальным является применение ферментов фитаз для удаления фитатов из растительных пищевых продуктов, особенно из продуктов на основе сои.

В начале 90-х годов в Европе две фирмы начали выпуск фермента фитазы, как кормовой добавки. Голландская фирма BASF предлагает на рынке препарат «Натуфос», а финская AI ко Ltd. Biotechnology - препарат «Финаза». Продуцентами в обоих случаях являются грибы рода Aspergillus. В России работы по получению и применению этого фермента не ведутся. Поэтому исследования в данном направлении актуальны.

Цель работы. В свете выше сказанного была поставлена цель настоящей работы: получить отечественный препарат фитазы путем микробиологического синтеза.

Научная новизна. Проведенный многоэтапный скрининг среди музейных культур эукариотных и прокариотных микроорганизмов по их фитатмобилизующей активности и способности синтезировать фитазу позволил выявить продуцент этого фермента - микромицет Aspergillus niger.

Исследованы условия биосинтеза экстрацеллюлярного фермента фи газы грибом A. niger на малокомпонентной питательной среде, содержащей универсальные источники углерода и азота.

Изучена регуляция синтеза фи т азы и показано, что продукт ферментативного гидролиза фитата - неорганический фосфат является репрессором биосинтеза фермента. При использовании подобранной питательной среды и условий культивирования продуцент синтезирует фитазу, которая по активности не уступает зарубежным аналогам.

Показано, что добавление хлорида кальция обеспечивает практически полное сохранение активности при концентрировании культуральной жидкости методом вакуум-выпаривания.

Практическая значимость. Разработан способ биосинтеза фитазы грибом A. niger на оптимизированной среде, содержащей в качестве источника углерода сахарозу (мелассу), источника азота - нитрат аммония. Показано, что с практической точки зрения получение фитазы можно совместить с промышленным биосинтезом лимонной кислоты, продуцент которой синтезирует не только кислоту, но и фермент.

Полученная фитаза A. niger обладает высокой фитатгидролизующей активностью, что позволяет при получении соевых белковых концентратов совместить процесс обогащения соевого белка с гидролизом антипитательных компонентов - фитатов. В оптимальных условиях возможно полное и быстрое удаление фитатов из соевых продуктов.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Вардоян, Гаянэ Сашиковна

ВЫВОДЫ.

1 .Проведенный четырех папный скрининг среди 69 коллекционных культур эукариотных и прокариотных микроорганизмов позволил выявить продуцент фитазы - гриб А. ш§ег, обладающий внеклеточной фитазной активностью.

2.Определен состав питательной среды (г/л): меласса (сахароза) - 15, нитрат аммония - 0,5, сульфат калия - 0,15, сульфат магния - 0,15, дрожжевой экстракт - 0,2, - при культивировании на которой продуцент синтезирует фитазу с активностью 0.7 Е/мл. Изучена регуляция синтеза фитазы и показано, что неорганический фосфат является репрессором биосинтеза фермента.

3.Установлено, что метод вакуум-выпаривания в присутствии стабилизатора (хлористого кальция) позволяет сконцентрировать фермент в 7 - 9 раз при сохранении активности на 95 - 100%, в то время как метод ультрафильтрации на мембране УПМ-50, позволяющий достичь той же степени концентрирования, приводит к снижению активности фитазы на 12-15%.

4.При исследовании основных свойств фитазы культуральной жидкости было выявлено, что фермент термостабилен при нагревании до 50°С, имеет два оптимума рН при значениях 2,2 и 5,0, стабилен при длительном хранении при температуре +4°С, обладает относительной субстратной специфичностью.

5.Эффективность применения фитазы А. ш§ег при дефосфорилировании фитатов соевых продуктов зависит от соотношения твердой и жидкой фаз, концентрации фермента и температуры. Полное дефосфорилирование соевых фитатов фитазой А. шger при значении рН=4,4 (соответствует

Ч^ Г" \ V» -4 изоэлектрическои точке соевых белков), соотношении твердой и жидкои фаз 1:50, содержании фермента в инкубационной среде 10 Е, температуре 50°С происходит за 30-40 минут, в то время как фшаза промышленного штамма А. Псиит гидролизует только 78% фитатов соевой муки за 15 часов.

115

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Вардоян, Гаянэ Сашиковна, 1999 год

ЛИТЕРАТУРА.

1. The nomenclature of eyclitols. Tentative rules. IUPAC Comm. on the nomenclature of organic cfaem,, IUPAK - I Li В Comm. on biochem. nomenclature/Eur. !. Biochem.- 1968.-V.5, №1- p. 1-12.

2. Дзвис Д., Джованелли Д., Рис Т. Биохимия растений- М.: Мир, 1966512 с.

3. Harland В. F., Morris Е. R. Phytate: a good or a bad food component?//Nutr. Research.--1995.-V. 15, №5,- p.737-754.

4. Maga J. A. Phytate, its chemistry, occurrence, food interactions, nutritional significance, and methods of analysis//!. Agric. Food Chem.-1982.-V.30, is« 1 .-■ p. 1-9.

5. Barrier-Guillot B. Wheat phosphorus availability: 1. In vitro study: Factors affecting endogenous phytasic activity and phytic phosphorus content// J. Sci. Food Agric,-1996.-V.70, №l.-p.62-68.

6. Jaffe G. Phytic acid in soybeans//!. Amer. Oil Soc.-l 981 .-V.58, №3.- p.87-96.

7. Torney P., Harkay-Vinkler M., Petres J. Study on the phytic acid content in food products of cereal base//Acta Alimentaria.-1994.-V.23, №4 - p. 347-357.

8. Blatny P., Kvasnicka F. Determination of phytic acid in cereal grains, legumes, an.d feeds by capillary isotachophoresis//!. Agric. Food Chem.-1995.--V.41, №1.- p. 129-133.

9. Saastamoinen M., Piaami S. Content of p-glurcans and phytic acid in genetyc types of oats cultivated in Finland//Acta Agric. Scandinavica.-1992.-V.42, №1,-p. 6-11.

10. O'Dell B. L,, de Boland A. Complexation of phytate with proteins and cations in corn germ and oilseed meals//!. Agric. Food Chem.-1976.-V.24, №4.-~ p. 804-807.

11. Siv R. D.. Talbot F. D. F. Preparation of low-phytate rapeseed protein by ultrafiltration: 1. The aqueous extraction of phvtate from deoiled rapeseed meals//JOA.CS -1982.-V. 82, №4,- p. 191-194.

12. Matthacus B. Determination of inositol phosphates IP3-IP6 in rapeseed and rapeseed meal by 11 PLC method. Part 2. Investigations of rapeseed meal and comparison with other methods//Fett Wissensctaft Technologie.-1995.-V.97, №10-p.372-374.

13. Wyatt C. J., Triana-Tejas A. Content of soluble and unsoluble Fe, Zn, Ca and phytates in ordinary food products in North Mexico//! Agric. Food Chem.-1994.-V.42, №10-p.2200-2209.

14. Tolerm I., Brues A. Phytic acid in fcods//Var Foeda.-1982.-V.34, №3,- p.79 -96.

15. The mineral content of commonly consumed Malawian and Papua New Guinea foods/E. L. Ferguson, R. S. Gibson, S. D. Weaver et al.//J. Food Comp. Anal-1989.-V.2.-p.260-272.

16. Mannan F., Biland I. Potential nutrients and phytic acid content of soybean seeds//Scientific Khiber.1995.-V.8, №1,- p. 1-8.

17. The phytate, non-starch polysaccharide, zinc, calcium, copper and manganese contenta of 78 locally grown and prepared African foods/E. L. Ferguson, R. S. Gibson, C. Opare-Obisaw et al.//J. Food Comp. Anal.-1993 -V.6,- p.87-99.

18. Phytate, zinc and calcium contents of 30 East African foods and their calculated phutate:zmc, Ca:phytate and (Ca)(phytate)/(Zn) molar rations/E, L. Ferguson, R. S. Gibson, L. U. Thompson et al.//J. Food Comp. Anal.-1988.-V.l.- p.316-325.

19. McKenzie-Parnell J. M., Guthrie B. E. The phytate and mineral content of some cereals, cereal products, legumes, legume products, snack bars, and nuts available in New Zealand//Biol. Trace Elem. Res.-.....1986,-V. 10.-p. 107-121.

20. Piatt S. R., Clydesdale F. M. Interaction of iron, alone and in combination with calcium, zinc and copper, with phytate-rich, fibre-rich fraction of wheat bran trade gastrointestinel pH conditions/ZCereal Chem.-1987.-V.64-p. 102-105.

21. Gifford S. R. , Clydesdale F. M. interactions among calcium, zinc and phytate with three protein sources//!. Food Sci.-1990.-V.55-p. 1720-1723.

22. Erdman J. W. Oilseed phytates: nutritional implications//.!. Am. Oil Chem. Soc.-1979.-V.56, №8— p. 736-741.

23. Davies N. T., Olpin S. E. Studies on the phytate:zinc molar contents as a determinant of Zn availability to young rats//Br. J. Nutr.1979.-V.41. ~- p.591-603.

24. Forbes R. M., Parker 11. M. Biological availability of zinc in and influenced by whole fat soy flour in rat diets/'/Nutr. Rep. Int-1977.-V.15, №6. p.681.......688.

25. Davies N. T., Reid II. An evaluation of the phytate, zinc, copper, iron and manganese contents of, and Zn availability from, soya-based textured-vegetable-protein meat-substitutes or meat-extenders//Br. J. Nutr.-1979.-V.41.- p.579-589.

26. Rim bach G. J., Pallauf K. Effect of phytic acid and microbial phytase on Ca accumulation, Zn status, and apparent absorption of Ca, P, Mg, Fe, Zn, Cu and Mn in growing rats/7 Ann. Nutr. Metabolism.-1996.-V.39, №6 - p.361-370.

27. Walker A. R. P. Cereals, phytic acid, and calcification/VEancet.-1951 -V.261 .-p.244-248.

28. Sandberg A.-S., Larsen T., Sandstrom B. High dietary calcium level decreases colonic phytate degradation in pigs fed a rapeseed diet//.!. Nutr.-1993.-V. 123.-p. 559-566.

29. Rossander-Hullen L. E. Inliibitory effect of oat products on non-hemc iron absorption in man//Eur. J. Clin. Nutr.-1990.-V.44, №11,-p.783-792.

30. Hulten L. E., Gramatkovski A. Iron absorption from the whole diet. Relation to

meal composition, iron requirements, and iron stores//Eur. J. Clin. Nutr-1995........

V.49, № 11.- p.794-808.

31. Brunvand L. iron deficiency among pregnant Pakistanis in Norway and the content of phytic acid in their diet/7 Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica.-l 995 - V.74, №7,- p.520-525.

32. Reddy M. B. The influence of different protein sources on phytate inhibition of nonheme-iron absorption in liumans//Am. J. Clin. Nutr,-1996-V.63. №2-p.203-207.

33. Eatta ML, Eskin M. A simple and rapid eolorimetric method for phytate determination//.!. Agric. Food Chem.-1980.-V.28, №6,-p. 1313-1315.

34. Vaintraub J. A., Lapteva N. A. Colorimetric determination of phytate in unpurified extracts of seeds and products of their processing//Anal. Biochem.-1988.—V. 175-p.227-230.

35. Davidsson L., Aimgren A. Manganase absorption in humans: The effect of phytic acid and ascorbic acid in soy formula//Am. J. Clin. Nutr. 1995. V.62, №5,- p.984-987.

36. Carmovaie E., Lugaro E., Lombardi-Boccia G. Phytic acid in faba bean and pea: effect on protein availabilityv/Cereal Chem.-1988.-V.65.- p. 114-117.

37. Yoon J. 11., Thompson L, U., Jenkins D. I. A. The effect of phytic acid in vitro rate of starch digestibility and blood glucose response//Am. J. Clin. Nutr-1983.-V.38-p.835-842.

38. Thompson L. U.,Button C. L., Jenkins 1). J. A. Phytic acid and calcium affect the in vitro rate of navy bean starch digestion and blood glucose response in humans/VAm. J. Clin. Nutr,--1987.-V.46.- p.467 -473.

39. Thompson L. U., Yoon J. H. Starch digestibility as affected by polyphenols and phytic acid//J. Food Sci. -1984,-V.49,- p. 1228-1229.

40. Effect of myo-inositol phosphate esters in vitro and in vivo digestion of protein/В. E. Knuckles, О. 1). Kurmicky, M. R. Gumbmann, A. A. Betschart et al.//J. Food Sci.-l989—V.54,— p. 1348-1350.

41. Deshpande S. S., Damodaran S. Effect of phytate on solubility, activity and

conformation of trypsin and chymotrypsin//.!. Food Sci.--1989.-V.54.-- p.695........

699.

42. Brooks J. R., Morr C. W. Phytate removal from soy protein isolates using ion exchange processing treatments//,!. Food Sci.-l982.-V.47,- p. 1280-1282.

43. Пат. 5248804 США, МКИ A 23 J 1/14, С 07 F 9/117 Separation on phytate from plant protein using ion exchange/Nardelli C. A., Mazer Т. В., Hogarth A. J. C. L, et al; Abbott Lab. .- №986651; Заявл. 08.12.92; Опубл. 28.09.93; НКИ 558/147.

44. Myo-inositol polyphosphate intermediates in the dephosphoryiation of phytic acid phosphatase with phytase activity from rice bran/T. Hayakawa, K. Suzuki, H. Miuraet al.//Agric. Biol Chem........1990.-V.54.- p.279.......286.

45. Eskin N. A. M., Wiebe S. Changes in phytase activity and phytate during germination of two fababean eultivars/'/J. Food Sci.-1983.-V.48.- p. 270-271.

46. Kikunaga S., Joshinobu K. Biochemical changes in phosphorus compounds and in the activity of phytase and «-amylase in the rice (Oryza sativa) grain during germination//! Sci. Food Agrie.-1991.-V.56, №3,- p.335-344.

47. Валиханов M. П., Игамназаров P. П., Асамов Д. К. Фитаза прорастающих семян хлопчатника и ее свойства//Физиология растений—1984.-Т.31, №2.-С.328-336.

48. Chang R., Schwimmer S., Burr П. К. Phytate: removal from whole dry beans by enzymatic hydrolysis and diffiision/Я. Food Sci.-1977.-V.42.- p. 1098 1101.

49. Beal L., Metha T. Zinc and phytate distribution in peas. Influence of heat treatment, germination, pH, substrate, and phosphorus on pea phytate and phytase/Д. Food Sci.-1985.-V.50.-p.96-115.

50. Han J. M. Removal of phytic acid from soybean and cotton seed meals by Aspergillus ficuum phytase/7.1. Agric. Food Chem.-1988.-V.36.-p. 1181-1183.

51. Sutardi. Buckie K. A. Phytic acid changes in soybeans fermented by traditional inoculum and six strains of Rhizopus oligosporus/Я. Appl. Bacterid.1985. -V.58.- p.539-543.

52. Zvta K. Mould phvtases and their application in food mdustry//World J. Microbiol. Biotechnol.-1992.—V.8.-p.467-472.

53. Фосфор в окружающей среде/Под ред. Э. Гриффина, А. Битона, Д. Спенсера, Д. Мигчелла.-М.:Мир, 1977.-757 с.

54. Павлова В. Ф., Муромцев Г.С. Роль микроорганизмов в трансформации соединений фосфора почвы//Проблемы сельскохозяйственной микробиологии-1980 — С 34-47.

55^ Shieh Т. R., Ware J. Н. Survey of microorganisms for the production of extracellular phyiase//Appl. Microbiol,-1968. -V.16, №9,-p. 1348-1351.

56. Phytase from Aspergillus niger/O. Volfova, J. Dvorakova, A. Hanzlicova, A. Jandera/ZFolia Microbiologica.-l994.-V.39, №6,- p.481-484.

57. Yamada K., Minoda Y., Yamamoto S. Phytase from Aspergillus terreus. Part 1. Production, purification and some general properties of enzyme//Agric. Biol. Chem.-1968.-V.32.-p. 1275-1282.

58. Ghareib M., Youssef K. A., Nourel Dein M. M. Enhancement of phytase

production by the use of sea water and metal ions media/ZIndian J. Exp. Biol.......

1986.-V.24, №7,- p.426-428.

59. Ghareib M. Biosinthesis, purification and some properties of extracellular phytase from Aspergillus carneus//Acta Microbiol. Hung.-1990.-V.37, №2-p. 159-164.

60. Wang H. L., Swain E, W., Hesseitin C. W. Phytase of molds used in oriental food lermentation/7.1. Food Sei.-1980.-V.45.- p. 1275-1282.

61. Al-Asher S., Duvnjak Z. Effect of glucose concentration on the biomass and phytase productions and the reduction of the phytic acid content in canola meal by Aspergillus carbonari us during a solid-state fermentation process/ZBiotechnol. Progress.........1994.-V.10, №4,- p.353-359.

62. Sutardi, Buckle K. A. Characterization of extra- and intracellular phytases from Rhizopus oligosporus used in tempeh production//!. Food Microbiol.—1988.-V.6-p.67-79.

63. Xiang W., Zhong Y. Degradation of phytic acid in rapeseed meal by two strains of molds//Weishegwu Xuebao.-1998.-V.38, Jvfcl.-p.44.......51.

64. Studies on induced mutation of Pénicillium strain producing phytase/!. Bai, K. Chen, Z. Meng et al.//Sh.anxi Daxue Xuebao, Ziran Kexueban.-l 997.-V.20, №4 —p.416—419.

65. Studies on screening for a phytase producing Aspergillus oryzae/Y. Zhang, X. Lin, Z. Wu, Y. Han//Shandong Daxue Xuebao, Ziran Kexueban.-1997.-V.32, №4,-p.466—471.

66. Nayini N. R., Markakis P. The phytase of yeast//Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie-1984V. 17.- p.24-26.

67. Lambrechts C. Utilization of phytate by some yeasts//Biotechnol. Lett-1992-V.14, №1—p. 61-66.

68. Greaves M. P., Anderson G., Wedley D. M. The hydrolysis of inositol phosphates by Aerobacter aerogeues//Biochini. Biophys. Acta.-1967.-V.132, №>2,-p.412-418.

69. Irving G. C., Cosgrove D. !. inositol phosphate phosphatases of microbiological origin. Some properties of partially purified bacterial (Pseudomonas sp.) phytase/ZAust..!. Biol. Sci.-l 971 .-V.24.- p.547-552.

70. Powar V. К., Jagannathan V. Purification and properties of phytase specific phosphatase from Bacillus subtil is//J. Bacteriol.-1982........V. 151, №3,- p.l 1021108.

71. Shimizu M. Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77//Biosci. Biotechnol. Biochem.-1992.-V.56, №8,- p.l266-1269.

72. Greiner R., Konietzny U., Jany Kl.-D. Purification and characterization of two phytases from Escherichia coli/VArch. Biochem. Biophys.-1993.-V.303, №1.-p. 107-113.

73. U11 ach A. H. J„ Gubson D. M. Extracellular phytase (E.C.3.1.3.8) from Aspergillus ficuum NRRL 3135: purification and characlerization//Prep. Biochim.-l987........V. 17, № 1.- p.63-91.

74. Ullah A. I I. J., Barry J. Cyclohexanedione modification of arginme at the active site of Aspergillus ficuum phytase/ZBiochim. Biophys. Res. Commun.-1991-V.178, №1- p.45-53.

75. Ullah A. 11. J., Dischinger H. C. J. Aspergillus ficuum phytase: complete primary structure elucidation by chemical sequencing//Biochim. Biophys. Res. Commun.-l993.-V. 192, №2,- p.747-753.

76. Полторак О. M., Чухрай Е. С. Физико-химические основы ферментативного катализа: Учеб. пособие.-М: Высш. шк., 1971.-312 с.

77. Jamamoto S., Minoda Y., Jamada К. Chemical and physicochemical properties

of phytase from Aspergillus terreus//Agric, Biol. Chem.-1972.-V.36, №12..........

p. 2097-2103.

78. Purification and properties of the phytase from Schwanniomyces castellii/E. Segueilha, C. Lambrechts, H. Boze et al.//J. Ferment. Bioeng.-1992.-V.74, №1,- p.7-11.

79. Shieh T. R., Wodzinski R. J., Ware J. II. Regulation of the formation of acid phosphatases by inorganic phosphate in Aspergillus ficuum//!. Bacteriol-1969.-V. 100 - p. 1161-1165.

80. Skowronski Т. Phytase activity in Aspergillus 11 iger//Polish I. Soil. Sci.--1976.........

V.9.-p. 145-150.

81. Skowronski T. Some properties of partially purified phytase from Aspergillus niger/ZActa Microbiol. Pol.-1978.-V.27,- p.41-48.

82. Вардоян Г.С., Шмелева В.Г., Яковлев В.И. Синтез фермента фитазы микроорганизмами/ТВсероссийская научная конференция «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств», Санкт-Петербург 21 -23 ноября 1996 г: Тезисы докладов,- Санкт-Петербург, 1996 - С, 10.

83. Illlali A. IT J., Phyllippy В. Q. Substrate selectivity in Aspergillus ficuum phytase and acid phosphatases using mio-inositol phosphates//!. Agric. Food Chem.-l994.-V.42, №2-p.423-425.

84. Zyta K. The role of acid phosphatase activity during enzymic dephosphorylation jf phytates by Aspergillus niger phytase/ZWorld f. Microbiol. Bioteehnol.

1993 -V.9 - p. 117-119.

85. Isolation, purification and characterization of phytase from AspergillusZS. S. Chun, Y.-Y. Cho, W. S. Cha et al.Z/Han'guk Sikp'um Yongyang Kwahak 1 loechi.-l998.-V.27, №1,- p.38.....45.

86. Irving G. C. J., Cosgrove I). J. Inositol phosphate phosphatases of microbiological origin. Some properties of the partially purified phosphatasts of Aspergillus ficuum NRRL 3135//Aust. !. Biol. Sci.-l 974.-V.27,- p.361- 368.

87. Ullach A. II. !., Gubson D. M. Production, rapid purification and catalytic characterization of extracellular phytase from Aspergillus ficuum//Prep. Biochlm.-1988.-V. 18, №4,- p.443-458.

88. Purification and characterizaition of phytase from Aspergillus oryzae/C. Zheng, IT. Liu, C. Dong et al./ZSichuan Daxue Xuebao, Ziran Kexueban.-1993.-V.30, №2,-p.253-259.

89. A novel enzyme application in com wet milling/A. Car ansa, M. Simell, M. Lehmussaari et al.ZZStaich, 1988.-V.40.- p.409-411.

90. Производство Ц+)-молочной кислоты из картофельных отходов с применением клеток Streptococcus bo vis/ Шамцян М.М., Булгак И. И., Вардоян Г.С., Шмелева В.Г., Яковлев В.И.//Всероссийская научная конференция «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств», Санкт-Петербург 21 - 23 ноября 1996 г: Тезисы докладов.-Санкт-Петербург, 1996 - С.33.

91. Pfeiffer A. The influence of phytase in phosphorus-reduced diets in the amount of P-excretion in the case of fattening pigs and estimates of the amount of P-concentration in faeces respectively//Zuechtungskunde.-1995.-V.67, №2-p. 147-157.

92. Кормовые добавки: Информационный справочник-BASF, 1994- 144 с.

93. Improvement of phosphorus availability by microbial phytase in broilers and pigs/P. С. M. Simons, 11. A. J. Versteegh, A. W. Jongbloed et al. //Br. J. Nutr -

1990.-V.64 — p.525-540.

94. Schoener F. J., Hoppe P. P., Schwarz G. Comparative effect of microbial phytase and inorganic phosphorus on performance and on retention of phosphorus, calcium and crude ash in broilers//!. Anim. Physiol. Anim. Nutr.-

1991.-V.66, №5,- p.248-255.

95. The beneficial effects of a microbial feed phytase in diets of broiler chickens and ducklings/D. J. Farreli, E. Martin, J. J. du Preez et a.l.//J. Anim.. Physiol. Anim. Nutr.-1993.-V.69,- p.278-283.

96. Yi Z., Kornegay E. Т., Denbovv D. M. Supplemental microbial phytase improves zinc utilization in broilers/zPoiilt. Sci.-1996.-V.75, №5,-p.540-546.

97. Supplemental microbial phytase improves bioavailability of dietary zinc to weanling pigs/X. Lei, P. K. Ku, E. R. Miller et al.//J. Nutr.-l993.-V. 1.23.-p. 1.117-1123.

98. Jongbloed A. W., Mroz Z., Kemme P. A. The effect of supplementary Aspergillus niger phytase in diets for pigs on concentration and apparent

digestibility of dry matter, total phosphorus, and phytic acid in different sections on the alimentary tract//!. Anim. Sci.- l 992,-V.70,- p. 1159-1168.

99. Beers S., Jongbloed A. W. Effect of supplementary Aspergillus niger phytase in diets for piglets on their performance and apparent digestibility of phosphorus//Anim. Prod.-1992.-V.55,- p.425-430.

100. Phosphorus studies in pigs. 3. Effect of phytase supplementation on the digestibility and availability of phosphorus in soya-bean meal for grower pigs/P. P. Ketaren, E. S. Batterham, E. B. Dettmann, D. J. Farrell//Br. J. Nutr.-1993.-V.70 .-p.289-311.

101. Efficacy of phytase in improving the bioavailability of phosphorus in soybean meal and corn-soybean meal diets for pigs/'G. L. Cromwell, T. S. Stahly, R. D. Coffey et al. //!. Anim. Sci.-1993.-V.7E- p. 1831-1840.

102. Young L. G., Leunissen M., Atkinson !. L. Addition of microbial phytase to diets of young pigs//!. Anim. Sci.-l 993.-V.71p.2147-2150.

103. Supplementing corn-soybean meal diets with microbial phytase lencarly improves phytate phosphorus utilization by weanling pigs/X. G. Lei, P. K. Ku, E. R. Miller, M. T. Yokovama//!. Anim. Sci.-1993.-V.7E-p.3359-3367.

104. Supplementing corn-soybean meal diets with microbial phytase maximizes phytate phosphorus utilization by weanling pigs/X. G. Lei, P. K. Ku, E. R. Miller et al.//!. Anim. Sci.-l993.-V.7l.-p.3368-3375.

105. Грибные фитазы из природных изолятов и коллекционных образцов/JI. Э. Семенова, Е. Накамура, Е. С. Морозова и др.//Биотехнология.-1998.-№5.-С. 12-24.

106. Sudarmadji S., Markakis P. The phytate and phytase of soybean tempeh//!. Sci. Food Agric.-1977.-V.28, №3,-p.381-383.

107. Siitardi, Buckle K. A. Phytic acid changes in soybeans fermented by traditional

inoculum and six strains of Rhizopus oligosporus//!. Appl. Bacteriol........1985.-

V.58.- p.539-543.

108. HoYvson S. J., Davis R. P. Production of phytate hydrolysing enzyme by some fungi//Enzyme Microb. Technof-l 983.-V.5.- p.377-382.

109. Nair V. C., Duvnjak Z. Reduction of phytic acid content in canola meal by Aspergillus flcuum in solid state fermentation process//Appl. Microbiol. Biotechnol.-1990.-V.34, №2.- p. 183-188.

110. Al-Asheh S., Duvnjak Z, Phytase production and decrease of phytic acid content in canola meal by Aspergillus carbonari us in solid-state fermentation/7World J. Microbiol. Biotechnol.-1995.-V.l 1.- p.228-231.

111. A note on the removal of phytate in soybean meal using Aspergillus usami/A. Ilyas, M. Hirabayashi, T. Matsui et al./7Asian-Aust. J. An im. Sei.- 1995,-V.8, №>2,-p. 135-138.

112. Serrai no M . R., Thompson L. U. Removal of phytic acid and protem-phytic acid interactions in rapeseed//!. Agric. Food Chem.-1984.-V.32,- p.38-40.

113. Han Y. W., Wilfred D. J. Phytate hydrolysis in soybean and cottonseed meals by Aspergillus ficuum phytase//!. Agric. Food Chem.-l 988.-V.36 - p.259-262.

114. Zyta K. In vitro and in vivo dephosphorylation of rapeseed meal by means phytate-degrading enzymes from Aspergillus niger//!. Sei. Food Agric. -1993.-V.61, №l.-p.l-6.

115. Han Y. W., Gallagher D. J., Wilfred D. J. Phytase production by Aspergillus ficuum on semi-solid substrate//!. Ind. Microbiol.-1987.-V.2- p. 195-200.

116. Zvta K., Korelesli !., Kujawski M. Dephosphotylarion of phytate compounds by

means of acid phosphatase from Aspergillus niger//!. Sei. Food Agric.........1989.—

V.49,-p.315-324.

117. Takahiko A., Nakanishi K. Enzymic elimination of phytate in soybean milk//Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi.-1985.-V.32, №3,-p. 174-180.

118. Greiner R., Konietzny U. Constraction of a bioreactor to produce special breakdown products of phytate//!. Biotechnol.-1996.-V.48, №2-p. 153-159.

119. Ullah A. H. !., Phyllippy B. Q. Immobilization of Aspergillus ficuum phytase: product characterization of the bioreactor//Prep. Biochem.-1988 - V. 18, №4,-p.483-489.

120. Ebune A., Al-Asheh S., Duvnjak Z. Production of phytase during solid state fermentation using Aspergillus ficuum NRRL 3135 in canola meal/VBioresours Technol.--1995.-V.53, № 1,- p.7.......12.

121. Ebune A., Al-Asheh S., Duvnjak Z. Effect of phosphate, surfactants and glucose on phytase production and hydrolysis of phytic acid in canola meal by Aspergillus ficuum during solid-state fermentation//Bioresours Technol - 1995.--V.54, №3.-p.241-247.

122. Al-Asheh S., Duvnjak Z. The effect of surfactants on the phytase production and the reduction of the phytic acid content in canola meal by Aspergillus carbonari us during a solid-state fermentation process/'/B i otechnol. Lett-1994.-V. 16, №2.-p. 183-188.

123. Han Y. W., Gallagher D. J. Phosphatase production by Aspergillus ficuum//!. Ind. Microbiol.-l987.-V. 1p.377-382.

124. Gibson D. M. Production of extracellular phytase from Aspergillus ficcum on starch media/ZBiotechnol. I ett. 1987 - V.5.- p.305-310.

125. Nair V. C,, Duvnjak Z. Production of phytase by Aspergillus ficuum and

reduction of phytic acid content in canola meal//!. Sei. Food Agric.-199L-.....

V.54,- p.355-366.

126. Вардоян E.G., Шмелева В.Г., Яковлев В.И. Использование культуры Aspergillus niger для синтеза фермента фитазы//Экологические проблемы биодеградации промышленных, строительных материалов и отходов производств: Сборник материалов Всероссийской конференции.-Пемза, 1998.- С. 126-127.

127. Звягинцев Д. Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии.-М.: Изд-во Моск. ун-та, 1991.-106 с.

128. Самойлова Т.С. Микробиологическая деградация инозитолфосфатов// Доклады ВАСХНИЛ—1980.-№9-С. 17-19.

129. Практикум по микробиологии/Под ред. И. С. Егорова.-М.: Изд. Моск. унта, 1976.-307 с.

130. Protein measurement with folinphenol reagent/O. 11. Lowrv, N. J. Rosbraigh. A. L. Fair et al.//J. Biol. Chem.-l951 .-V. 193, №2,- p.265-275.

131. Nelson N. A photometric adaptation on the Somogyi method for the determination of glucose/ZBiochem. J.-l 944.-V. 153, №2-p.375-380.

132. Fiske С. H., Subbarow Y., The colorimetric determination of phosphorus/.!. Biol. Chem.-l925 -V.66 - p.376-400.

133. Красильников IE А., Кошелев В. В. Качественное определение фосфатазной активности некоторых групп почвенных микроорганизмов//ДАН СССР.-1957,- Т. 117, №5.- С. 894-895.

134. Методы определения активности ферментов: Метод. указания/Сое г. : В. Г. Шмелева; СПГТИ(ТУ).- СПб., 1997,- 36 с.

135. Ашмарин И. П., Васильев И. EL, Амбросов В. А. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов.- Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1975 - 76 с.

136. Грачев К). П. Математические методы планирования экспериментов.- М.: Пжц. пром., 1979.-200 с.

137. Составление экспериментально-статистических моделей по методу Брандона: Метод, указания/Сост.:С. Н. Саутин, Е. Н. Иванова, Т. Ф. Петрик, В. М. Князьков; ЛТИ им. Ленсовета.- Л.,1988,- 24 с.

138. Ахназарова С. Л., Кафаров В. В. Методы оптимизации эксперимента в химической технологии - М.: Высш. шк., 1985 - 326 с.

139. Перт С. Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.........М.:

Мир, 1978.-332 с.

140. Хадеева В. В. Биосинтез кислой фосфатазы дрожжами ЗассЬаготусеБ сегеУ181ае: Дис....канд. тех. наук/ЛТИ им. Ленсовета-Л., 1988 - 139 с.

141. Биотехнология: Принципы и применение/Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Д. Джонса,- М: Мир, 1988,- 480 с.

142. Максимов В. Н. Многофакторный эксперимент в биологии - М.: Изд-во МГУ, 1980.-280 с.

143. Бирюков В. В., Кантере В. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза-М.: Наука, 1985.-296 с.

144. Грачева И. М. Технология ферментных препаратов - 2-е изд., перераб. и доп.-М'.: Агропромиздат, 1987.-335 с.

145. ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения активности,- М.:Изд-во стандартов, 1988,- 16 с.