Разработка штамма-реципиента Komagataella phaffii для конструирования высокоактивных безмаркерных рекомбинантных продуцентов фитазы и β-амилазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ткаченко Артур Александрович

• Ткаченко Артур Александрович
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Ткаченко Артур Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Экспрессионные системы для производства гетерологичных белков

1.1.1 Прокариотические системы экспрессии

1.1.1.1 Система E. coli

1.1.1.2 Системы Bacillus sp

1.1.2 Эукариотические системы экспрессии

1.1.2.1 Мицелиальные грибы

1.1.2.2 Дрожжи

1.2 Komagataella phaffii - платформа для производства гетерологичных белков

1.2.1 Общая характеристика K. phaffii

1.2.2 Характеристика штаммов-реципиентов K. phaffii

1.2.3 Генетические элементы экспрессионной системы K. phaffii

1.2.4 Современные подходы к получению безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков на основе K. phaffii

1.2.4.1 Использование ауксотрофных штаммов

1.2.4.2 Использование систем сайт-специфической рекомбинации

1.2.4.3 Применение системы редактирования генома CRISPR/Cas9

1.2.5 Подходы к повышению продуктивности штаммов на основе K. phaffii

1.3 Фитазы

1.3.1 Общая характеристика и распространение

1.3.2 Классификация и свойства

1.3.3 Промышленное производство и применение

1.4 ß-Амилазы

1.4.1 Общая характеристика, распространение и свойства

1.4.2 Промышленное производство и применение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Реагенты и среды

2.2 Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды

2.3 Манипуляции с ДНК

2.4 Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей

2.5 Конструирование плазмид

2.5.1 Конструирование эписомальных плазмид

2.5.2 Конструирование интегративных экспрессионных плазмид

2.6 Конструирование штаммов К. phaffii

2.7 Разработка способа последовательной интеграции экспрессионных кассет в геном К. phaffii

2.8 Ферментация дрожжевых штаммов

2.9 Измерение активности фитазы и Р-амилазы

2.10 ПЦР в реальном времени

2.11 Культивирование рекомбинантных штаммов в биореакторе

2.12 Характеристика гетерологичной фитазы

2.13 Характеристика гетерологичной Р-амилазы

2.14 ДСН-ПААГ электрофорез белков

2.15 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Выбор штамма-реципиента с оптимальными свойствами

3.1.1 Изучение экспрессионного потенциала штаммов К. phaffii из коллекции БРЦ ВКПМ

3.1.1.1 Разработка интегративных экспрессионных кассет

3.1.1.2 Оценка продуктивности трансформантов исследуемых штаммов

3.1.2 Сравнение активности промотора АОХ1 в клетках штаммов ВКПМ У-4287 и Х-33 на средах с различными источниками углерода

3.1.3 Сравнение ростовых характеристик штаммов

3.1.4 Исследование продуктивности штаммов при различных температурах

3.2 Разработка штамма-реципиента с использованием системы СК18РК/Са89

3.2.1 Разработка ауксотрофных штаммов-реципиентов

3.2.2 Разработка протеазодефицитного штамма-реципиента

3.2.3 Разработка штамма-реципиента для получения штаммов с повышенной продукцией гетерологичных белков

3.3 Получение многокопийных безмаркерных рекомбинантных штаммов-продуцентов гетерологичных фитазы и Р-амилазы

3.3.1 Применение систем сайт-специфической рекомбинации СгеЛохР и FLP/FRT

3.3.2 Применение системы редактирования генома CRISPR/Cas9

3.3.2.1 Применение одностадийного способа интеграции экспрессионных кассет в геном ^ phaffii

3.3.2.2 Разработка и применение многостадийного способа интеграции экспрессионных кассет в геном ^ phaffii

3.4 Культивирование многокопийных рекомбинантных штаммов-продуцентов фитазы и Р-амилазы в лабораторном биореакторе

3.5 Биохимическая характеристика новых гетерологичных ферментов

3.5.1 Характеристика фитазы из C. giUemi

3.5.1.1 Определение молекулярной массы и удельной активности

3.5.1.2 Определение рабочего профиля температуры и рН

3.5.1.3 Определение кинетических характеристик

3.5.1.4 Анализ рН-стабильности, термостабильности и протеолитической устойчивости

3.5.1.5 Изучение субстратной специфичности, влияния ионов металлов и модуляторов на активность PhyCg

3.5.2 Характеристика Р-амилазы из P. flexa

3.5.2.1 Определение молекулярной массы и удельной активности

3.5.2.2 Определение рабочего профиля температуры и рН

3.5.2.3 Определение кинетических характеристик и субстратной специфичности

3.5.2.4 Анализ рН-стабильности и термостабильности

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

В настоящее время активно ведутся исследования по разработке штаммов-реципиентов с улучшенными технологическими свойствами (Dalvie et al., 2019; Offei et al., 2022). Это обусловлено растущей потребностью биотехнологической промышленности в высокоэффективных микробных платформах для производства гетерологичных белков. Для решения этой задачи применяют современные подходы, включая метаболическую инженерию и направленное редактирование генома. Например, зачастую осуществляется инактивация или сверхэкспрессия определенных генов с целью увеличения выхода гетерологичных белков (Bustos et al., 2022; Pan et al., 2022).

В биотехнологии используются экспрессионные системы бактерий, грибов, дрожжей, клеток млекопитающих и другие. Каждая из систем имеет ряд технологических преимуществ и недостатков.

Бактериальные системы экспрессии, например, Escherichia coli, обладают рядом преимуществ, таких как быстрый рост на недорогих средах, высокий уровень экспрессии и широко изученный молекулярно-генетический инструментарий. Однако внутриклеточная агрегация и неправильный фолдинг некоторых гетерологичных белков ограничивают ее промышленное применение (Rosano et al., 2014). Получение гетерологичных белков с использованием бациллярных систем экспрессии, например, Bacillus subtilis, ограничивается нежелательным протеолизом целевого белка, связанным с секрецией протеаз в культуральную среду, а также необходимостью использования богатых питательных сред для культивирования штаммов-продуцентов (Terpe, 2006). Система экспрессии на основе клеток млекопитающих используется для производства различных биофармацевтических препаратов, но не подходит для промышленного производства ферментов вследствие медленного роста клеток, строгих требований к условиям культивирования и дорогостоящих питательных сред (Yin et al., 2007).

Дрожжевые системы экспрессии, напротив, стали популярной платформой для промышленного получения множества гетерологичных белков. Метилотрофные дрожжи Komagataella phaffii (Pichia pastoris) являются наиболее перспективным объектом для производства гетерологичных белков (Karbalaei et al., 2020). Они сочетают в себе ряд преимуществ, включая высокий уровень биобезопасности, простоту молекулярно-

генетических манипуляций, мощные системы экспрессии генов и секреции гетерологичных белков, а также способность достигать высоких плотностей клеток при культивировании в минимальных средах (Ahmad et al., 2014). Однако потенциал этих микроорганизмов далеко не исчерпан. Перспективно как усовершенствование систем экспрессии штаммов, доступных исследователям, так и разработка новых штаммов-реципиентов на основе штаммов, выделенных из природных источников. Кроме того, технологии получения ферментов постоянно совершенствуются, и чтобы быть конкурентоспособными, необходимо развивать новые эффективные экспрессионные платформы.

В настоящее время зарубежные штаммы-реципиенты K. phaffii, например, K. phaffii GS 115 и K. phaffii X-33, имеют коммерческий статус и принадлежат компании Invitrogen (США). Использование таких штаммов разрешено исключительно в исследовательских целях, что ограничивает получение на их основе штаммов-продуцентов для промышленного производства гетерологичных белков (Розанов и др., 2020). В России штаммы-реципиенты, аналогичные коммерческим штаммам компании Invitrogen, отсутствуют. Поэтому поиск и разработка новых штаммов с улучшенными технологическими характеристиками, способных к высокоуровневой продукции гетерологичных белков, является актуальной задачей.

Для получения продуцентов гетерологичных белков на основе прототрофных штаммов необходимо использовать экспрессионные кассеты, содержащие гены устойчивости к антибиотикам в качестве селективных маркеров. В промышленной биотехнологии существуют жесткие ограничения на использование штаммов-продуцентов, устойчивых к антибиотикам, для предотвращения распространения антибиотикорезистентных микроорганизмов в окружающей среде в результате возможного горизонтального переноса генов (Van Elsas et al., 2003). Поэтому в современных биотехнологических производствах актуальным и предпочтительным является использование безмаркерных штаммов-продуцентов, не содержащих гены устойчивости к антибиотикам.

В настоящее время в России приоритетным направлением является получение отечественных ферментов, востребованных в различных отраслях промышленности. Фитазы являются ценными пищевыми ферментами, которые широко используются в сельском хозяйстве для повышения питательности кормов за счет перевода растительного

фитат-связанного фосфора в легкоусваиваемый неорганический фосфор (Гесслер и др., 2018). Однако для применения в промышленности требуются фитазы с различным набором свойств, которым в полной мере не обладают известные в настоящее время фитазы. Особенно актуален поиск новых фитаз, обладающих свойствами, пригодными для применения в аквакультуре (Ьешо8 е! а1., 2017).

Р-Амилазы гидролизуют крахмал с образованием мальтозы и являются востребованными ферментами для производства мальтозных сиропов и пива (Ва1акп8Ипап е! а1., 2018). В настоящее время Р-амилазы получают в основном из растительного сырья. Известно, что Р-амилазы растительного происхождения характеризуются низкой стабильностью, неспособностью к гидролизу сырого крахмала, а также высокой ценой из-за увеличивающегося спроса на растительную продукцию (Ба8 е! а1., 2019). Р-Амилазы бактериального проихождения предпочтительнее для промышленного применения, так как они более стабильны, обладают высокой удельной активностью и могут гидролизовать сырой крахмал. Микробными источниками Р-амилаз являются различные виды грамположительных бактерий. Однако несмотря на применяющиеся в настоящее время скрининг природных штаммов, оптимизацию процесса ферментации и экспрессию генов, кодирующих Р-амилазы, в различных экспрессионных системах, основной проблемой для их промышленного получения остается низкая продуктивность получаемых штаммов (Биап е! а1., 2021).

Получение новых высокопродуктивных рекомбинантных штаммов дрожжей ^ phaffii, продуцирующих фитазу или Р-амилазу с промышленно-ценными свойствами, позволит преодолеть зависимость сельскохозяйственной, крахмалоперерабатывающей и пищевой промышленностей от импортных ферментных препаратов.

Таким образом, разработка штамма-реципиента на основе дрожжей ^ phaffii и оценка уровня продукции новых гетерологичных фитазы и Р-амилазы в экспрессионной системе K. phaffii является актуальным и практически значимым исследованием.

Цель работы: разработка штамма-реципиента метилотрофных дрожжей ^ phaffii, позволяющего получать на его основе высокоактивные безмаркерные продуценты гетерологичных белков на примере фитазы и Р-амилазы.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. Провести скрининг штаммов дрожжей вида ^ phaffii из коллекции БРЦ ВКПМ и выбрать штамм, обладающий высоким экспрессионным потенциалом и ростовыми

характеристиками, сравнимыми или превосходящими таковые для коммерческих штаммов-реципиентов.

2. Разработать новый штамм-реципиент на основе выбранного штамма путем направленного редактирования его генома.

3. Разработать эффективный подход для получения многокопийных безмаркерных штаммов-продуцентов.

4. На основе разработанных штаммов-реципиентов получить высокоактивные многокопийные штаммы-продуценты фитазы и Р-амилазы, не содержащие генов устойчивости к антибиотикам.

5. Охарактеризовать новые гетерологичные фитазу и Р-амилазу.

Научная новизна работы

В результате скрининга из коллекции БРЦ ВКПМ выявлен природный штамм K. phaffii ВКПМ У-4287, экспрессионный потенциал и ростовые характеристики которого превосходят таковые для зарубежных штаммов-реципиентов.

Было обнаружено, что в присутствии глицерина и глюкозы в клетках выявленного штамма происходит меньшая репрессия промотора АОХ1, чем в штамме-аналоге K. phaffii Х-33.

Выявленный штамм способен к более эффективной продукции гетерологичных белков при температурах, превышающих оптимальную, по сравнению с коммерческими штаммами.

Получен набор производных штамма K. phaffii ВКПМ Y-4287 с инактивированными генами HIS4, LEU2, PEP4, OPI1. Разработан новый штамм-реципиент K. phaffii ВКПМ Y-5229 (Ahis4Aopi1). Впервые показано, что инактивация гена OPI1 приводит к увеличению продукции гетерологичных фитазы и Р-амилазы.

Впервые система CRISPR/Cas9 была успешно применена для получения ауксотрофных штаммов K. phaffii.

Разработан способ последовательной интеграции генетического материала в геном дрожжей K. phaffii с использованием системы геномного редактирования СК18РК/Са89, который позволил получить высокоактивные многокопийные безмаркерные рекомбинантные штаммы-продуценты фитазы и Р-амилазы, не содержащие гены устойчивости к антибиотикам.

Впервые в дрожжах K. phaffii была показана эффективная экспрессия гена phyCg-op, кодирующего новую фитазу из Citrobacter gillenii, и гена amyPf кодирующего ß-амилазу из Priestia flexa, а также охарактеризованы новые гетерологичные фитаза и ß-амилаза.

Была разработана система определения числа копий экспрессионных кассет, содержащих сигнал секреции MF4I, в хромосомах штаммов-продуцентов K. phaffii методом ПЦР-РВ в независимости от последовательности целевого гена.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработанные отечественные штаммы-реципиенты K. phaffii ВКПМ Y-5013 (Ahis4), K. phaffii ВКПМ Y-5014 (Aleu2) и K. phaffii ВКПМ Y-5229 (Ahis4Aopi1) можно использовать для конструирования высокоактивных безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков, не содержащих гены устойчивости к антибиотикам. Штамм-реципиент K. phaffii ВКПМ Y-5228 (Ahis4Apep4) можно использовать для получения белков, чувствительных к протеолизу.

Показана возможность использования экспрессионной системы K. phaffii для эффективного получения гетерологичных ферментов: фитазы из C. gillenii и ß-амилазы из P. flexa.

Разработанный способ последовательной интеграции генетического материала в хромосому дрожжей K. phaffii может быть применен для получения многокопийных безмаркерных штаммов-продуцентов других промышленно-ценных белков.

Получены рекомбинантные штаммы-продуценты фитазы из C. gillenii и ß-амилазы из P. flexa, потенциально перспективные для использования в промышленности.

Новая гетерологичная фитаза обладает промышленно-ценными свойствами, а именно способна работать при пониженной температуре и слабокислых значениях pH, что делает ее потенциально перспективной кормовой добавкой для аквакультуры.

Новая гетерологичная ß-амилаза обладает промышленно-ценными характеристиками, соответствующими требованиям, предъявляемым к ферментам, используемым в процессах переработки крахмала и пивоварении, что делает ее потенциально пригодной для использования в пищевой промышленности.

Разработанная система тестирования количества вставок в хромосомах штаммов K. phaffii позволяет определять количество экспрессионных кассет методом ПЦР-РВ в независимости от последовательности целевого гена.

Методология и методы исследования

Работа выполнялась с применением стандартных микробиологических, молекулярно-биологических и генно-инженерных методов, включая ПЦР, электрофорез ДНК, клонирование генов, конструирование плазмид, трансформация дрожжевых и бактериальных клеток, ПЦР-РВ, ДСН-ПААГ электрофорез белков. Для редактирования генома ^ phaffii использовалась система СК18РК/Са89. Продуктивность рекомбинантных штаммов определяли по уровню активности фитазы или Р-амилазы.

Личный вклад автора заключается в выборе направлений исследования, планировании и выполнении экспериментов, анализе и интерпретации полученных результатов, написании тезисов, статей, патентов и апробации работы на конференциях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Выявленный природный штамм дрожжей ^ phaffii ВКПМ У-4287 обладает высоким экспрессионным потенциалом. Продуктивность трансформантов штамма ВКПМ У-4287, секретирующих фитазу из C. giUenii, более чем в 1,8 раза, а, секретирующих фитазу из C. freundii, более чем в 2 раза превышает продуктивность трансформантов коммерческих штаммов-реципиентов ^ phaffii 08115 и ^ phaffii Х-33.

2. Продуктивность трансформантов разработанных штаммов ^ phaffii ВКПМ Y-5013 (Ahis4) и ВКПМ Y-5014 (А1еи2), секретирующих Р-амилазу из P. flexa и фитазу из C. giПemi, превышает более чем в 1,5 раза таковую для трансформантов на основе штамма-аналога ^ phaffii 08115 (AЫs4).

3. Разработанный штамм-реципиент ^ phaffii ВКПМ Y-5229 (AЫs4Aopi1), полученный путем инактивации гена OPI1 в штамме ВКПМ Y-5013 (Ahis4), позволяет получать на его основе трансформанты с увеличенной продукцией Р-амилазы из P. flexa и фитазы из C. giUemi на 18 и 25 % соответственно.

4. Разработанный способ последовательной интеграции генетического материала в геном дрожжей ^ phaffii с использованием системы геномного редактирования СК18РК/Са89 позволяет получать многокопийные безмаркерные штаммы-продуценты гетерологичных фитазы и Р-амилазы, не содержащие гены устойчивости к антибиотикам.

5. Новая гетерологичная фитаза из С giПemi обладает высокой удельной активностью (1577 ± 12 ед/мг), сохраняет более 50 % активности при рН 6,0 и более 40 % активности

при 25 °С, что делает ее перспективной кормовой добавкой для аквакультуры. Новая гетерологичная Р-амилаза из P. flexa обладает высокой удельной активностью (3411 ± 13,9 ед/мг), а также сохраняет более 70 % активности при pH 5,5 и 83 % активности при 60 °С, поэтому является потенциально пригодной для использования в пищевой промышленности.

Степень достоверности полученных данных подтверждается использованием современных общепринятых экспериментальных методик, актуальных методов анализа и статистической обработки экспериментальных данных.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка штамма-реципиента Komagataella phaffii для конструирования высокоактивных безмаркерных рекомбинантных продуцентов фитазы и β-амилазы»

Апробация работы

Результаты диссертационного исследования были изложены на VIII международной научно-практической конференции «Биотехнология: наука и практика» (Ялта, Россия, 2020); на XI Международной конференции молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов (Наукоград Кольцово, Россия, 2022); на XVII Курчатовской молодёжной научной школе (Москва, Россия, 2023) и на тематическом семинаре Курчатовского комплекса НБИКС-ПТ «Молекулярная генетика про- и эукариот» (Москва, Россия, 2024). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании Научно-технического совета Курчатовского комплекса НБИКС-пт НИЦ «Курчатовский институт» (Протокол № 109-7прНТС от «5» июля 2024 г. заседания № 7).

Публикации

Результаты работы отражены в 10 публикациях, в том числе 4 статьях, опубликованных в отечественных и международных рецензируемых журналах, индексируемых в базах Scopus и Web of Science и рекомендованных ВАК, а также 3 патентах и 3 тезисах докладов. В статьях, опубликованных в соавторстве, основополагающий вклад принадлежит соискателю.

Структура и объем диссертации

Настоящая работа состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список сокращений и условных обозначений», «Список литературы». Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и 26 таблиц. Список литературы включает 263 источника.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Экспрессионные системы для производства гетерологичных белков

В настоящее время производство гетерологичных белков связано с использованием различных систем экспрессии, выбор которых обусловлен назначением, количеством и требуемыми свойствами получаемых белков. Однако в случае производства гетерологичных белков - промышленно-ценных ферментов, основными используемыми экспрессионными системами являются прокариотические - на основе клеток E. coli и Bacillus sp., а также эукариотические - на основе клеток грибов и дрожжей.

1.1.1 Прокариотические системы экспрессии 1.1.1.1 Система E. coli

Наиболее широко используемой, изученной и экономичной прокариотической экспрессионной системой является грамотрицательная палочка E. coli. Она обладает рядом важных преимуществ, таких как быстрый рост и размножение на недорогих субстратах, простота культивирования, изученность генетики и физиологии, быстрый и легкий процесс трансформации, а также простота генетических манипуляций. Кишечная палочка может накапливать рекомбинантные белки до 80 % своего сухого веса и выживает в различных условиях окружающей среды (Schmidt et al., 2004; Demain et al., 2009).

Тем не менее, система экспрессии E. coli имеет ряд недостатков, таких как смещение кодонов, внутриклеточное накопление белка, агрегация и неправильный фолдинг белков, отсутствие посттрансляционных модификаций, присущих эукариотическим системам, протеолитическая деградация целевого продукта, а также его контаминация эндотоксинами (Rosano et al., 2014). Несмотря на вышеперечисленные недостатки, в настоящее время данная экспрессионная система широко используется для производства, в основном, ряда терапевтических продуктов, таких как фактор некроза опухоли, инсулин, эритропоэтин, гормон роста человека, интерлейкины и другие, а также

для промышленного получения различных аминокислот (Jozala et al., 2016; Pontrelli et al., 2018).

1.1.1.2 Системы Bacillus sp.

В качестве альтернативы E. coli для получения рекомбинантных белков также используют грамположительные бактерии рода Bacillus, в частности, B. subtilis, B. megaterium, B. brevis, B. pumilus, B. licheniformis и B. amyloliquefaciens. Многие промышленно- и фармацевтически-значимые белки, такие как а-амилаза, целлюлаза, липаза А, эпидермальный фактор роста человека, интерферон альфа-2 и другие были успешно экспрессированы в различных бациллярных штаммах. Бациллярные системы экспрессии обладают теми же преимуществами, что и E. coli. Тем не менее, их клеточная стенка не содержит липополисахаридов, которые являются пирогенными для человека и других млекопитающих. В связи с этим им был присвоен международный статус "GRAS". Кроме того, бациллярные системы экспрессии обладают естественной высокой способностью к секреции по сравнению с E. coli и секретируют белки непосредственно во внеклеточную среду (Terpe et al., 2006).

Однако системы экспрессии на основе Bacillus sp. не лишены недостатков. Во-первых, штаммы Bacillus sp. секретируют в КЖ множество протеаз, которые могут вызывать деградацию целевого белка. Во-вторых, в штаммах зачастую возникает проблема низкой экспрессии целевого гена или ее отсутствие. Вместе с тем, рост микроорганизмов рода Bacillus с высокой плотностью клеток возможен только на богатых питательных средах, содержащих дорогостоящие компоненты. Указанные недостатки ограничивают промышленное применение штаммов Bacillus sp. в качестве экспрессионных систем для производства гетерологичных белков (Gomes et al., 2016).

Применение большинства известных прокариотических систем экспрессии ограничено получением белков, которые не гликозилируются естественным путем, таких как инсулин, гирудины или соматотропины, а также белков, которые функционально активны без гликозилирования, подобно различным цитокинам (Schmidt, 2004).

1.1.2 Эукариотические системы экспрессии 1.1.2.1 Мицелиальные грибы

Традиционно, для получения гетерологичных белков, в частности ферментов, используются штаммы грибов рода Trichoderma, Aspergillus и Penicillium (Su et al., 2012). Преимуществом грибных штаммов являются такие технологически значимые свойства, как способность расти на простых по составу средах, состоящих из дешевых компонентов, и эффективно секретировать целевой фермент в культуральную среду. Мицелиальные грибы A. niger, A. oryzae и T. reesei способны секретировать значительные количества целевого фермента, достигая уровня несколько десятков граммов белка на литр. Они не образуют токсины, не патогенны, а их многолетнее использование для производства белков подтверждает их безопасность в производстве пищевых продуктов и лекарств (имеют статус "GRAS").

Однако такая система экспрессии имеет существенные недостатки. Во-первых, значительное количество гетерологичных белков, синтезируемых мицелиальными грибами, подвергается неправильным посттрансляционным модификациям, что приводит к низкому выходу целевого продукта (Nevalainen et al., 2014). Во-вторых, у грибных штаммов наблюдается избыток нативных метаболических путей, в результате чего синтез целевого продукта конкурирует с синтезом метаболитов самого хозяина, что в конечном итоге снижает выход гетерологичного белка (Маркина и др., 2020). Вместе с тем значительные временные и трудовые затраты на проведение генно-инженерных работ, а также необходимость введения в геном организма нескольких типов мутаций для эффективной экспрессии гетерологичных генов, также являются главными недостатками этой экспрессионной системы и ограничивают ее применение для промышленного производства гетерологичных белков (Su et al., 2012). Поэтому в настоящее время конкурентами грибным системам экспрессии выступают различные дрожжевые экспрессионные системы.

1.1.2.2 Дрожжи

Дрожжи являются одноклеточными микроорганизмами, которые обладают способностью осуществлять сборку, сворачивание и посттрансляционные модификации белков подобно высшим эукариотам. В настоящее время системы экспрессии на основе дрожжей получили широкое распространение при производстве рекомбинантных белков промышленного и медицинского назначения. С точки зрения биохимии и молекулярной биологии, на сегодняшний день, дрожжи являются превосходно изученными микроорганизмами.

Saccharomyces cerevisiae

S. cerevisiae используется для экспрессии большинства рекомбинантных белков с 1980 года. Эти дрожжи обладают рядом преимуществ, таких как высокая скорость роста на дешевых питательных средах, простота культивирования, статус "GRAS", наличие пострансляционных модификаций, секреция белка в КЖ, отсутствие эндотоксинов и онкогенов. Эти дрожжи являются наиболее генетически охарактеризованным эукариотическим организмом и остаются преобладающим видом дрожжей, который используется для производства рекомбинантных белков фармацевтического назначения (Schmidt et al., 2004). С использованием S. cerevisiae были получены инсулин, поверхностный антиген гепатита В, уратоксидаза, глюкагоны, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, гирудин и тромбоцитарный фактор роста (Baghban et al., 2019). S. cerevisiae также применяется для производства вакцин против вирусов папилломы человека и гепатита В (Gomes et al., 2016).

Однако существуют некоторые недостатки системы экспрессии на основе S. cerevisiae, ограничивающие получение ряда рекомбинантных белков. К ним относятся: гипергликозилирование белков, низкий выход целевого продукта, низкая эффективность секреции и нестабильность экспрессионных плазмид (Xie et al., 2018). Эти ограничения привели к разработке альтернативных систем экспрессии, включая дрожжи Yarrowia lipolytica и Kluyveromyces lactis, а также метилотрофные дрожжи Hansenula polymorpha и K. phaffii.

Yarrowia lypolytica

Y. lipolytica, как гемиаскомицетные дрожжи, широко используются в промышленности благодаря способности расти на n-парафинах и выделять большое количество органических кислот, например, лимонной кислоты (Trassaert et al., 2017). Получение гетерологичных белков в экспрессионной системе Y. lipolytica становится все более популярным по следующим причинам: возможность ферментации с высокой плотностью клеток, способность секретировать большое количество гетерологичных белков с высокой молекулярной массой; секреция белков посредством котрансляционного пути транслокации, который аналогичен пути высших эукариот; секвенированный и аннотированный геном; общепринятый статус "GRAS" и разработанный генетический инструментарий (£elik et al., 2012).

Штаммы дикого типа Y. lipolytica отличаются высокой секрецией различных белков. Они успешно использовались для производства щелочной и кислой протеаз, а также нескольких липаз и фосфатаз, РНКазы и эстеразы (Madzak et al., 2013). Тем не менее, эти дрожжи могут использовать только ограниченный набор сахаров, таких как глюкоза, фруктоза и манноза, но также могут использовать ацетат, спирты и гидрофобные субстраты, включая масла, алканы и жирные кислоты в качестве источников углерода. С использованием дрожжей Y. lypolytica было успешно получено более ста различных гетерологичных белков. Однако в настоящее время данная экспрессионная система преимущественно используется для получения различных химических веществ, включая органические кислоты, многоатомные спирты, терпены и терпеноиды (Trassaert et al., 2017; Zhang et al., 2017).

Kluyveromyces lactis

K. lactis используются в пищевой промышленности для производства лактазы (ß-галактозидазы) и для гетерологичной экспрессии бычьего химозина (ренина). Дрожжи K. lactis имеют статус "GRAS", обладают способностью продуцировать белки с высокой молекулярной массой и характеризуются наличием сильного строго индуцибельного промотора LAC4. Для этих дрожжей расшифрована полная последовательность генома, а также разработана коммерческая система экспрессии для получения рекомбинантных белков (£elik et al., 2012). Однако эта экспрессионная система является менее изученной

по сравнению с другими дрожжевыми системами экспрессии и редко применяется для промышленного получения гетерологичных белков.

Ogataea polymorpha

Метилотрофные дрожжи O. polymorpha (Hansenula polymorpha) эффективно используются в качестве хозяина для экспрессии гетерологичных белков. В качестве источника углерода, помимо метанола, они могут использовать глицерин, глюкозу, ксилозу и целлобиозу (Ryabova et al., 2003). Основными промоторами О. polymorpha в генно-инженерных стратегиях являются сильные индуцируемые метанолом промоторы гена FMD, кодирующего формиатдегидрогеназу, и гена MOX, кодирующего метанолоксидазу.

Преимущества О. polymorpha для промышленных процессов включают: ферментацию с высокой плотностью клеток, быстрый рост на недорогих субстратах, простые условия культивирования и статус "GRAS". Одним из важных свойств для промышленных ферментаций является термотолерантность дрожжей О. polymorpha, а именно, их способность расти при температурах от 30 до 50 °C, что снижает потребность в дорогостоящем охлаждении и уменьшает вероятность контаминации биореактора (Cabe5-Silva et al., 1984). Эта способность также является преимуществом в отношении производства белков млекопитающих, которым для сохранения биологической активности требуется температура 37 °C (Van Dijk et al., 2000). В основном, O. polymorpha применяется для получения терапевтических препаратов, таких как вакцина против гепатита В, интерферон альфа-2а, гирудин, инсулин (£elik et al., 2012) и редко используется для промышленного получения гетерологичных ферментов, в отличие от экспрессионной системы K. phaffii.

K. phaffii

В последние годы все чаще в промышленных биотехнологиях используются рекомбинантные дрожжевые продуценты, сконструированные на основе метилотрофных дрожжей K. phaffii. Эти дрожжи успешно используются для производства множества гетерологичных белков благодаря ряду преимуществ по сравнению с другими эукариотическими и прокариотическими системами экспрессии. К преимуществам относятся: высокая скорость роста при ферментации с плотностью клеток до 150 г/л КЖ

при периодическом культивировании в биореакторе; простота питательных сред, условий культивирования и генетических манипуляций; более эффективный механизм секреции целевых белков по сравнению с другими видами дрожжей; секреция целевого белка в больших количествах в КЖ, что значительно упрощает процесс его выделения и очистки; менее обширное гликозилирование по сравнению с другими дрожжами, такими как S. cerevisiae. Кроме того, K. phaffii могут осуществлять фолдинг и посттрансляционные модификации белков, аналогичные процессам высших эукариот, а также имеют статус "GRAS". Разработанный молекулярно-генетический инструментарий расширяет возможности разработки новых и улучшения существующих штаммов K. phaffii (Bustos et al., 2022).

На сегодняшний день в системе экспрессии K. phaffii были получены свыше 5000 различных гетерологичных белков, включая промышленные ферменты и биофармацевтические препараты (Jahic et al., 2006; Baghban et al., 2019; Liu et al., 2022). Например, с использованием K. phaffii промышленно получают рекомбинантные фитазу, протеиназу К, трипсин, нитратредуктазу, фосфолипазу С, коллаген и др. (Ahmad et al., 2014). Метилотрофные дрожжи K. phaffii активно используются для экспрессии генов, кодирующих фитазы из различных микроорганизмов. В K. phaffii были успешно экспрессированы гены, кодирующие фитазы из E. coli, Citrobacter braakii, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Obesumbacterium proteus, Yersinia rohdei, Yersiniapestis, Yersinia intermedia и A. niger (Chen et al., 2004; Luo et al., 2006; Luo et al., 2007; Гордеева и др., 2018; Merchant et al., 2011).

Таким образом, метилотрофные дрожжи K. phaffii являются важным объектом для биотехнологии и наиболее часто используемой экспрессионной системой для производства различных гетерологичных белков, включая ценные промышленные ферменты. Это связано с тем, что эти дрожжи обладают рядом преимуществ, необходимых для конструирования высокоэффективных рекомбинантных штаммов-продуцентов гетерологичных белков, по сравнению с другими системами экспрессии.

1.2 Komagataella phaffii - платформа для производства гетерологичных белков

1.2.1 Общая характеристика K. phaffii

Метилотрофные дрожжи K. phaffii были впервые описаны в 1920 году Александром Гильермоном и названы Zygosaccharomycespastori (Guilliermond et al., 1920). В 1956 году они были переименованы Германом Фаффом в Pichia pastoris (Phaff et al., 1956). В конечном итоге, ввиду значительных различий нуклеотидных последовательностей, кодирующих домены D1/D2 большой субъединицы 26S рДНК, между P. pastoris и другими метилотрофными дрожжами, дрожжи P. pastoris были переклассифицированы в род Komagataella, который затем был разделен на семь видов: K. pastoris, K. phaffii, K. pseudopastoris, K. populi, K. ulmi, K. kurtzmanii и K. mondaviorum (Yamada et al., 1995; Dlauchy et al., 2003; Kurtzman, 2005, 2009, 2012; Naumov et al., 2013, 2016, 2018).

За последние несколько десятилетий дрожжи K. phaffii прошли путь от обычных кормовых дрожжей до одной из самых популярных и широко используемых клеточных фабрик для производства гетерологичных белков. В 1970-х годах компания Phillips Petroleum (Бартлсвилл, Оклахома, США) начала исследования и оптимизацию ферментаций штамма K. phaffii (CBS7435) с целью промышленного производства кормового белка для сельскохозяйственных животных. Рентабельность производства обуславливалась процессом ферментации с высокой плотностью клеток с использованием метанола, который в то время был сравнительно дешевым источником углерода (Wegner, 1983, 1990). Однако последовавший в скором времени мировой нефтяной кризис привел к росту цен на метанол, и производство дрожжевой белковой биомассы стало невыгодным по сравнению с белками, получаемыми из сои и других источников (Damasceno et al., 2012).

В 1980-х годах компания Phillips Petroleum совместно с компанией SIBIA (Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, США) начали разработку экспрессионной системы на основе K. phaffii для производства гетерологичных белков с использованием мощного и строго регулируемого промотора AOX1 (Cregg et al., 1989). Компания SIBIA разработала экспрессионные векторы и штаммы-реципиенты, а также соответствующие протоколы для генетических манипуляций с K. phaffii. В сочетании с процессом ферментации, ранее оптимизированным для производства кормового белка, это привело

к получению высокоуровневой продукции гетерологичных белков на основе метанол-индуцируемой системы экспрессии. Так, в 1990-х годах был запущен один из первых крупномасштабных промышленных производственных процессов, в ходе которого удалось достичь уровня продукции фермента гидроксинитриллиазы более 20 г/л КЖ (Hasslacher et al., 1997). В 1993 году компания Phillips Petroleum продала свою патентную позицию на систему экспрессии K. phaffii компании Research Corporation Technologies (Тусон, США), а также выдала разрешение компании Invitrogen на продажу компонентов этой системы. Быстрое коммерческое распространение среди исследовательского сообщества способствовало росту ее популярности в качестве платформы для производства гетерологичных белков.

Метилотрофные дрожжи K. phaffii относятся к классу аскомицетов. Они образуют выпуклые колонии молочно-белого цвета с гладкой поверхностью и в основном существуют в гаплоидной форме. K. phaffii оптимально растут при температуре 28-30 °C при значениях pH 3,0-7,0. В качестве источника углерода они могут усваивать различные соединения, такие как глицерин, глюкоза, L-рамноза, формиат и другие. (Zha et al., 2023). Благодаря присутствию в пероксисомах ферментов (алкогольоксидаза, дигидроксиацетонсинтаза, пероксидаза и другие), участвующих в метаболизме метанола, эти дрожжи могут использовать метанол в качестве единственного источника углерода и энергии (Kurtzman et al., 2005). Экспрессия гена ^OX, кодирующего алкогольоксидазу, строго индуцируется и контролируется метанолом, поэтому активность фермента может быть обнаружена только при росте на среде, содержащей метанол (Vogl et al., 2016). K. phaffii может использовать сульфат аммония, пролин и пептон в качестве источника азота. При использовании сульфата аммония уровни экспрессии основных генов, связанных с утилизацией метанола (ген MUT) и биогенезом/деградацией пероксисом (ген PEX), являются максимальными. Кроме того, соответствующая концентрация NH4+ благоприятствует росту клеток и продукции гетерологичных белков. В некоторых случаях использование сложных источников азота, таких как казаминовые кислоты и пептон, может снизить возможную протеолитическую деградацию гетерологичных белков (Zha et al., 2023).

1.2.2 Характеристика штаммов-реципиентов K. phaffii

Большинство штаммов-реципиентов, в настоящее время использующихся в исследовательских целях и для промышленного производства гетерологичных белков, произошли от штамма дикого типа K. phaffii NRRL Y-11430 (Northern Regional Research Laboratories, Пеория, Иллинойс, США). Широко используемые штаммы-реципиенты K. phaffii, применяющиеся в настоящее время для получения продуцентов гетерологичных белков, представлены в Таблице 1.

Таблица 1 - Широко используемые в качестве реципиентов штаммы K. phaffii (Cregg et al., 1987; Lin-Cereghino et al., 2007; Kramer et al., 2012)

Штамм K. phaffii Генотип Фенотип

Y-11430 (CBS7435) Дикий тип Дикий тип

X-33 Дикий тип Mut+

GS115 Ahis4 Mut+ His-

KM71 Ahis4, aox1A::SARG4 MutS His-

KM71H aox1A::SARG4 MutS

SMD1163 Apep4Aprb1Ahis4 Mut+ His-

SMD1165 Aprb1Ahis4 Mut+ His-

SMD1168 Ahis4Apep4 Mut+ His-

SMD1168H Apep4 Mut+

MC100-3 Aaox1::SARG4Aaox2 ::Phis4 Ahis4 Mut- His-

Примечания - MutS - methanol utilization slow (замедленный рост на среде с метанолом), Mut- - methanol utilization minus (отсутствие роста на среде с метанолом)

Наиболее часто используемыми в исследовательских целях и в биотехнологических производствах являются штаммы ^ phaffii Х-33, ^ phaffii GS115 и ^ phaffii КМ71, которые запатентованы компанией 1пу11го§еп. Штамм ^ phaffii 08115, который вследствие мутации в гене HIS4 является ауксотрофом по гистидину, был получен химическим мутагенезом штамма ^ phaffii КККЬ У-11430 с использованием нитрозогуанидина. Штамм ^ phaffli Х-33, относящийся к дикому типу, был получен путем интеграции нативного гена HIS4 в геном штамма ^ phaffli 08115 (Ып-Сеге§Ыпо е! а1., 2007). Также был получен ряд ауксотрофных штаммов, таких как GS190 (Aarg4), 1С220 (Aade1) и JC254 (Awa3) и других, однако, в качестве реципиентов они используются значительно реже (Ып-Сеге§Ыпо е! а1., 2001).

За способность утилизировать метанол у дрожжей K. phaffii отвечают гены AOX1 и AOX2, кодирующие две алкогольоксидазы, которые сходны на уровне нуклеотидной и предполагаемой аминокислотной последовательностей на 92 и 97 % соответственно. В отличие от гомологии, наблюдаемой в белок-кодирующих последовательностях генов AOX1 и AOX2, среди 5'- и З'-некодирующих участков этих генов гомология не обнаруживалась (Koutz et al., 1989). Было показано, что основным ферментом, отвечающим за утилизацию метанола, является алкогольоксидаза, кодируемая геном AOX1. При нокауте этого гена рост K. phaffii на метаноле резко замедляется и штамм приобретает так называемый фенотип MutS (methanol utilisation slow). Например, путем удаления и замены гена AOX1 на ген ARG4 S. cerevisiae в штамме K. phaffii GS115 был получен штамм K. phaffii KM71 (Charoenrat et al., 2013). Ауксотрофный фенотип такого штамма может быть легко комплементирован на прототрофный путем интеграции трансформированной ДНК любого вектора, содержащего последовательность гена HIS4. Так, например, был получен штамм K. phaffii KM71H (Aaox1). Несмотря на то, что больше всего исследований проводится на штаммах c фенотипом Mut+, при получении некоторых гетерологичных белков штаммы с фенотипом MutS оказываются более продуктивными, чем штаммы с фенотипом Mut+ (Orman et al., 2009; Krainer et al., 2012). Штаммам MutS требуется гораздо меньше метанола для индуцирования экспрессии, а также для них характерны меньшее выделение тепла и меньшая потребность в кислороде, по сравнению со штаммами Mut+. Все эти преимущества могут быть полезны при проведении крупномасштабных промышленных ферментаций (Krainer et al., 2012).

Существуют также штаммы, не способные расти на метаноле, как на единственном источнике углерода, из-за нокаута обоих генов AOX1 и AOX2. Например, такой штамм K. phaffii MC100-3 был получен путем замены гена AOX2, кодирующего вторую алкогольоксидазу, на ген HIS4 K. phaffii в штамме KM71 и имеет фенотип Mut- (Cregg et al., 1987).

Дрожжи K. phaffii характеризуются низким уровнем секреции эндогенных белков, что позволяет выделять относительно чистые рекомбинантные белки. Тем не менее, одной из основных проблем K. phaffii является постсекреторная деградация гетерологичных белков специфичными для штамма протеазами, которые присутствуют в клетке в относительно высоких концентрациях и легко индуцируются стрессами окружающей среды, особенно во время процессов ферментации с высокой плотностью

клеток. При длительном культивировании в биореакторе вакуолярные протеазы, такие как протеаза A, кодируемая геном PEP4, и протеаза B, кодируемая геном PRB1, могут высвобождаться в КЖ в результате лизиса клеток, что приводит к протеолитической деградации целевого белка.

Чтобы решить эту проблему, на основе штамма K. phaffii GS115 были созданы различные протеазодефицитные штаммы, например, SMD1163 (Apep4Aprb1Ahis4), SMD1165 (Aprb1Ahis4) и SMD1168 (Ahis4Apep4), а также была продемонстрирована их эффективность в снижении протеолитической деградации некоторых гетерологичных белков (Cereghino et al., 2000). Наиболее часто используемым является штамм K. phaffii SMD1168, дефицитный по протеазе А, поскольку у него также отсутствует активность карбоксипептидазы Y и наблюдается частично сниженная активность протеазы B из-за отсутствия ее активации протеазой А. Несмотря на явные преимущества использования протеазодефицитных штаммов K. phaffii при производстве гетерологичных белков, невысокая скорость роста, низкие эффективность трансформации и жизнеспособность, а также необходимость осторожного обращения при выращивании и хранении по сравнению со штаммами дикого типа (как в случае со штаммами S. cerevisiae), препятствуют их широкому распространению и применению для экспрессии гетерологичных белков (Cereghino et al., 2000; Cregg, 2007).

В работе Brady J. R. и соавторов был проведен сравнительный геномный и транскриптомный анализ одиннадцати штаммов K. phaffii, включая K. phaffii X-33 и K. phaffii GS115. Геномный анализ штаммов показал наличие функциональных и нефункциональных однонуклеотидных полиморфизмов, влияющих на репарацию ДНК, клеточный цикл, структуру клеточной стенки и другие процессы. Транскриптомный анализ штаммов показал различия в уровнях экспрессии генов, участвующих в пентозофосфатном пути, пути утилизации метанола и других путях при различных условиях роста. По сравнению с другими штаммами, более высокие эффективность трансформации и секреции белка у штаммов K. phaffii X-33 и K. phaffii GS115 может быть обусловлена увеличенной проницаемостью их клеточной стенки (Brady et al., 2020).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ткаченко Артур Александрович, 2025 год

— — -

_ ...... ...... - -

- .......f.....

F AM

- - к ОХ i _ _

...... ......

_

— —

_ _ z _

1 2 3 4 5 6 7

Э 10 L1 12 13 14- 15 16 17 la 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 3: Пороговый цикл

Рисунок 30 - Прохождение реакций контрольного образца (смесь синтетических контролей гена phyCg-op (канал FAM) и гена GAP (канал ROX) в соотношении 1:1)

Рисунок 31 - Прохождение реакций исследуемого образца (геномной ДНК штамма Y-5127), гена phyCg-op (канал FAM) и гена GAP (канал ROX)

гл с с

Значения пороговых циклов в результате пройденных реакций представлены в Таблице 21.

Таблица 21 - Результаты определения значений пороговых циклов С!

Образец Ct FAM Ct ROX ACt (Ct ROX-Ct FAM) Среднее ACt

ВКПМ Y-5127 20,13 22,54 2,41 2,39

ВКПМ Y-5127 20,29 22,77 2,48

ВКПМ Y-5127 20,1 22,43 2,33

ВКПМ Y-5127 20,1 22,45 2,35

контроль 1:1 22,74 22,71 -0,03 -0,02

контроль 1:1 22,63 22,65 0,02

контроль 1:1 22,69 22,65 -0,04

контроль 1:1 22,66 22,61 -0,05

Из данных, приведенных в Таблице 21, следует, что ACt контрольного образца и исследуемого образца составляет 2,41 цикла (0,02 + 2,39).

Подставив значение n = 2,41 цикла и эффективность (E) = 0,94 в формулу (1), получаем:

P ~ (1 + 0,94)2,41 = 4,94.

Следовательно, на 1 копию референсного гена GAP приходится 5 копии гена phyCg-op. Таким образом, в геноме штамма ВКПМ Y-5127 содержится 5 копий гена phyCg-op.

Повторная интеграция трех дополнительных копий гена phyCg-op в геном штамма Y-5013/PHF1 привела к увеличению продукции фитазы из C. gillenii почти в 1,7 раза. Ранее сообщалось, что шестикратное увеличение количества копий гена, кодирующиего фитазу из C. amalonaticus, увеличило продуктивность штамма на 141 %, по сравнению с однокопийным штаммом (Li et al., 2015).

Таким образом, была показана применимость способа последовательной интеграции экспрессионных кассет в геном штамма-реципиента ВКПМ Y-5013 с использованием системы CRISPR/Cas9 для получения безмаркерного многокопийного штамма-продуцента фитазы из C. gillenii, не содержащего генов устойчивости к антибиотикам.

Далее изучали влияние инактивации гена ОРИ на продуктивность полученного многокопийного штамма ВКПМ У-5127 - продуцента фитазы. Этот штамм характеризуется усиленной экспрессией гена ркуС^-ор и повышенной продукцией гетерологичной фитазы. Предполагается, что инактивация гена ОРИ может также влиять на размер ЭР в К. рка//и, что, вероятно, положительно скажется на фолдинге фитазы и увеличит ее выход.

Для инактивации гена ОРИ клетки штамма ВКПМ Y-5127 трансформировали ранее полученной эписомальной плазмидой р0ЛР-8§ККЛ_орИ-рТЕР-Са89-Кт и отбирали трансформанты на среде УРБ2 с добавлением 0418. Далее осуществляли выщепление эписомальной плазмиды из клеток трансформантов и отбирали трансформант с инактивированным геном ОРИ, как описано в п. 3.2.3. В результате был получен штамм-продуцент фитазы К. рка//и ББ1 (АорИ) с инактивированным геном ОРИ. Затем, проводили культивирование этого штамма и родительского штамма ВКПМ У-5127 в трех повторностях. В конце ферментации измеряли оптическую плотность КЖ, клетки осаждали центрифугированием, а супернатанты анализировали на наличие фитазной активности. На основании полученных данных определяли среднюю продуктивность исследуемых штаммов относительно оптической плотности КЖ (Таблица 22).

Таблица 22 - Влияние инактивации гена ОРИ в штамме ВКПМ Y-5127 на продукцию гетерологичной фитазы

Штамм К. рка//И Средняя продуктивность трансформантов, ед/мл/1 о.е. Относительная продуктивность, %

ВКПМ У-5127 27,11 ± 1,78 100

(АорИ) 34,19* ± 2,18 126

* - различие между средними значениями продуктивности трансформантов контрольного и исследуемого штаммов статистически значимо при уровне а = 0,05

Как видно из данных, представленных в Таблице 22, инактивация гена ОРИ в многокопийном штамме-продуценте фитазы ВКПМ Y-5127 (с получением штамма ББ1) привела к увеличению его продуктивности на 26 %. Штамм ББ1 был депонирован в БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» под номером ВКПМ Y-5277.

Конструирование штамма-продуцента fi-амилазы на основе разработанного штамма-реципиента ВКПМ Y-5229 (Ahis4Aopi1)

Была сконструирована экспрессионная интегративная плазмида pDUET-bAmy-HIS. Плазмиду линеаризовали по сайтам PscI и BcuI и получали экспрессионную кассету bAmy-NTS (Рисунок 32).

^ FpHis4_ д^

Рисунок 32 - Схематическое изображение интегративной экспрессионной кассеты bAmy-NTS. Кассета содержала в своем составе: фланкирующие 5'- и 3'-фрагменты NTS рДНК для многокопийной интеграции в область NTS рДНК K. phaffii; две тандемно расположенных нуклеотидных последовательности, включающих ген amyPf, кодирующий Р-амилазу из P. flexa, слитый в единой рамке считывания с модифицированной последовательностью MF4I сигнального пептида а-фактора из S. cerevisiae, под контролем сильного индуцибельного промотора AOX1 и терминатора транскрипции TTAOX1; также селективный маркер PpHIS4, комплементирующий ауксотрофную мутацию в гене HIS4 K. phaffii

Известно, что для получения многокопийных штаммов применяются интегративные экспрессионные плазмиды, содержащие несколько копий целевых генов, расположенных тандемно. Такой подход дает возможность за один этап трансформации интегрировать сразу несколько копий целевого гена в геном штамма-реципиента (Li et al., 2017).

Решение использовать модифицированную последовательность MF4I сигнального пептида а-фактора из S. cerevisiae объясняется тем, что ее применение увеличивает секрецию гетерологичных белков. Например, в работе Xiong A.-S. и соавторов было показано, что использование модифицированной последовательности MF4I сигнального пептида привело к семикратному увеличению секреции фитазы из A. niger SK-57 по сравнению с использованием сигнального пептида дикого типа а-фактора из S. cerevisiae (Xiong et al., 2005).

Для получения многокопийного штамма-продуцента Р-амилазы клетки разработанного штамма-реципиента ВКПМ Y-5229 (Ahis4Aopi1) трансформировали экспрессионной кассетой bAmy-NTS и на среде YNBD отбирали 20 ПЦР-положительных трансформантов, которые культивировали и изучали их продуктивность, измеряя Р-

амилазную активность в супернатантах КЖ. По результатам ферментации был отобран штамм bAmy3, секретирующий в КЖ ß-амилазу из P. flexa в количестве 367 ± 8,7 ед/мл за 48 ч от начала индукции метанолом.

В штамме bAmy3 осуществляли инактивацию маркерного гена HIS4, для возможности проведения повторной интеграции экспрессионной кассеты bAmy-NTS в геном. Для этого клетки штамма трансформировали ранее полученной эписомальной плазмидой pGAP-sgRNA3_his4-pTEF-Cas9-Km и отбирали трансформанты на среде YPD2 с G418. У отобранных трансформантов исследовали появление фенотипа His- по способности к росту на минимальной среде YNBD. В результате было отобрано 20 трансформантов, ауксотрофных по гистидину.

Полученные ауксотрофные трансформанты культивировали и изучали их продуктивность в сравнении с родительским прототрофным штаммом bAmy3. Проверка продуктивности трансформантов показала отсутствие влияния введенной мутации с использованием системы CRISPR/Cas9 на продукцию гетерологичной ß-амилазы.

Для дальнейшей работы был отобран ауксотрофный штамм bAmy3/Ahis4. Клетки этого штамма повторно трансформировали экспрессионной кассетой bAmy-NTS (Рисунок 32). Трансформанты с комплементированной ауксотрофностью отбирали на среде YNBD и в количестве 20 штук культивировали. По результатам ферментации был отобран наиболее продуктивный штамм bAmy6, секретирующий в КЖ ß-амилазу из P. flexa в количестве 402 ± 10,1 ед/мл за 48 ч после начала индукции метанолом. Штамм bAmy6 был депонирован в БРЦ ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» под номером ВКПМ Y-5271. Полученное значение продуктивности свидетельствует о том, что экспрессионная система K. phaffii является перспективной для получения на ее основе продуцентов гетерологичной ß-амилазы из P. flexa. Для сравнения, продуктивность природного штамма P. flexa составила 121 ед/мл за 36 ч культивирования в среде LB с содержанием 15 % (масс./об.) растворимого крахмала (Wu et al., 2015). Продукция ß-амилазы из P. flexa в экспрессионной системе E. coli составила 43,5 ед/мл на 47 ч культивирования в среде LB (Matsunaga et al., 2009).

Разработка универсальной системы для определения копийности штаммов-продуцентов методом ПЦР-РВ

Для определения количества копий Р-амилазы в полученных штаммах bAmy3 и bAmy6 (ВКПМ Y-5271) была разработана универсальная система на основе метода ПЦР-РВ. Для определения количества копий искомого гена в геномах штаммов-продуцентов методом ПЦР-РВ с использованием технологии TaqMan обычно используют набор специфичных праймеров и зонда к последовательности искомого гена, кодирующего гетерологичный белок (Ребриков и др., 2020).

Для получения штаммов-продуцентов Р-амилазы использовалась экспрессионная кассета, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид MF4I. Эта последовательность не встречается в геноме K. phaffii. Вместе с искомым геном (amyPf) она в равном количестве интегрируется в геном штамма-реципиента. Следовательно, последовательность MF4I можно использовать в качестве универсальной для определения количества копий любого искомого гена.

Поэтому в настоящей работе были подобраны специфичные праймеры и зонд (Таблица 8) к последовательности MF4I. Разработанная система включала в себя праймеры Alpha-F и Alpha-R, а также зонд Alpha-X, меченный флуорофором FAM и гасителем флуоресценции RTQ-1 для последовательности MF4I, а также праймеры GAPref-F, GAPref-R и зонд GAP-X, меченный флуорофором ROX и гасителем флуоресценции BHQ-2, для референсного гена GAP, представленного в геноме дрожжей K. phaffii в одной копии (Waterham et al., 1997).

Разработанные праймеры и зонд использовали для определения относительного количества копий гена amyPf, в геномах штаммов bAmy3 и ВКПМ Y-5271, полученных в настоящей работе.

Для диагностики работы праймеров и зондов, подобранных для последовательностей MF4I и гена GAP, синтезировали двухцепочечные контроли для каждой из них, содержащие последовательности, ограничиваемые подобранными праймерами:

Синтетический контроль последовательности MF4I 5'-ATTCTCCAACTCCACCAACAACGGTTTGTTGGAGGAGGCTGAAGCTGAAGCTGA ACCTAAATTCATCAACACTACTATCGCTTCTATCGCTGC-3'

Синтетический контроль гена GAP 5'-TTTCCAGAGCTGACATCAAGGTTGTTGCTATCAACGACCCATTCATTGCTCCAG AATACGCTGCTTACATGTTCAAGTACGACTCTACCCACAAGGCTTACAAG-3'

Синтетические контроли использовали в качестве матрицы для диагностики повторяемости и эффективности реакций для последовательности MF4I и гена GAP. Эффективность реакции для последовательности MF4I (Е) составила - 97 %, для гена GAP - 92 %, что является приемлемым результатом.

В качестве контрольного образца, где соотношение кол-ва копий последовательности MF4I и гена GAP составляет 1:1, использовали смесь синтетического контроля последовательности MF4I с синтетическим контролем гена GAP (результат прохождения реакции представлен на Рисунке 33). В качестве исследуемых образцов использовали геномные ДНК штаммов bAmy3 (результат прохождения реакции представлен на Рисунке 34) и ВКПМ Y-5271 (результат прохождения реакции представлен на Рисунке 35).

Рисунок 33 - Прохождение реакций контрольного образца (смесь синтетических контролей последовательности MF4I (канал FAM) и гена GAP (канал ROX) в соотношении 1:1)

Рисунок 34 - Прохождение реакций исследуемого образца (геномной ДНК штамма bAmy3), последовательности MF4I (канал FAM) и гена GAP (канал ROX)

Рисунок 35 - Прохождение реакций исследуемого образца (геномной ДНК штамма ВКПМ Y-5271), последовательности MF4I (канал FAM) и гена GAP (канал ROX)

П U U

Значения пороговых циклов в результате пройденных реакций представлены в Таблице 23.

Таблица 23 - Результаты определения значений пороговых циклов Ct

Образец Ct FAM Ct ROX ACt (Ct ROX-Ct FAM) Среднее ACt

контроль 1:1 15,11 11,76 -3,35 -3,46

контроль 1:1 15,06 11,71 -3,35

контроль 1:1 15,06 11,52 -3,54

контроль 1:1 15,34 11,74 -3,6

bAmy3 27,75 27,29 -0,46 -0,42

bAmy3 27,88 27,56 -0,32

bAmy3 27,89 27,43 -0,46

bAmy3 28,03 27,59 -0,44

ВКПМ Y-5271 26,16 26,76 0,6 0,615

ВКПМ Y-5271 26,15 26,82 0,67

ВКПМ Y-5271 26,14 26,74 0,6

ВКПМ Y-5271 26,18 26,77 0,59

Из данных, приведенных в Таблице 23, следует, что ACt контрольного образца и исследуемого образца (bAmy3) составляет ~ 3,04 цикла (-0,42 + 3,46).

Подставив значение n = 3,04 цикла и эффективность (E) = 0,97 в формулу (1), получаем:

P ~ (1 + 0,97)3'04 = 7,9.

Следовательно, количество последовательностей MF4I в геноме штамма ВКПМ Y-5271 больше, чем гена GAP примерно в 8 раз. Учитывая, что количество копий нуклеотидной последовательности MF4I соответствует количеству копий гена amyPf, следовательно, в геноме штамма bAmy3 содержится 8 копий гена amyPf. Так как в экспрессионной кассете bAmy-NTS содержится две копии гена amyPf, то в геном штамма bAmy3 интегрировалось 4 копии экспрессионной кассеты bAmy-NTS и соответственно, 4 копии маркерного гена HIS4. Таким образом, с помощью системы CRISPR/Cas9 было одновременно инактивировано 4 копии гена HIS4 в штамме bAmy3 перед этапом повторной интеграции экспрессионной кассеты bAmy-NTS.

Аналогично определяли количество копий гена amyPf в геноме штамма ВКПМ Y-5271. Из данных, приведенных в Таблице 23, следует, что ACt контрольного образца и исследуемого образца ВКПМ Y-5271 составляет ~ 4,08 цикла (0,615 + 3,46).

Подставив значение n = 4,08 цикла и эффективность (E) = 0,97 в формулу (1), получаем:

P ~ (1 + 0,97)4,08 = 15,9.

Следовательно, количество последовательностей MF4I в геноме штамма ВКПМ Y-5271 больше, чем гена GAP примерно в 16 раз. Это означает, что в геноме штамма ВКПМ Y-5271 содержится 16 копий гена amyPf. Из этого следует, что во время повторной интеграции в геном штамма bAmy3 дополнительно интегрировалось 8 копий гена amyPf или 4 копии экспрессионной кассеты bAmy-NTS.

Таким образом, было определено, что штамм bAmy3, продуктивностью 367 ± 8,7 ед/мл, содержит 8 копий гена amyPf, а штамм ВКПМ Y-5271, продуктивностью 402 ± 10,1 ед/мл, содержит 16 копий гена amyPf. Как видно, дополнительное увеличение числа копий гена, кодирующего Р-амилазу, в штамме bAmy3 привело к незначительному увеличению продуктивности штамма. Известно, что взаимосвязь между количеством копий генов и продукцией белка не всегда линейна, и в некоторых случаях увеличение числа копий гена может приводить даже к значительному снижению продукции, особенно для секретируемых белков (Aw et al., 2013). Тем не менее, разработанный способ последовательной интеграции экспрессионной кассеты в геном K. phaffii позволил с высокой эффективностью получить 16-ти копийный штамм-продуцент Р-амилазы из P. flexa.

Универсальность разработанной системы позволит использовать ее для определения числа копий генов в хромосомах штаммов-продуцентов, полученных с использованием интегративных экспрессионных кассет, в состав которых входит последовательность MF4I.

Полученные многокопийные штаммы-продуценты фитазы и Р-амилазы показали высокую генетическую стабильность и сохраняли исходный уровень продукции гетерологичных ферментов после 20 пересевов на неселективной среде YPD2.

3.4 Культивирование многокопийных рекомбинантных штаммов-продуцентов фитазы и р-амилазы в лабораторном биореакторе

Было проведено исследование уровня продукции фитазы из С. gillenii и Р-амилазы из Р. Аеха при культивировании рекомбинантных штаммов-продуцентов ВКПМ У-5277 (Рисунок 36) и ВКПМ У-5271 (Рисунок 37) в 3-литровых биореакторах с рабочим объемом 1 л.

А

с 16000

2

"Й 14000

е

j 12000

н

о о 10000

н

m и 8000

Ё га 6000

я га н 4000

м

га й 2000

и

е 0

Активность

— OD600

-г

24

"Г

48

"Г

72

"Г

96

т-1-г- 0

120 144 168

Время индукции, ч

Б

Рисунок 36 - Рост и продукция фитазы штаммом ВКПМ Y-5277 при периодической ферментации в 3-литровом биореакторе. График зависимости активности фитазы и плотности клеток от времени (А). Анализ собранных культуральных супернатантов методом ДСН-ПААГ электрофореза (Б), где М - маркер молекулярной массы (Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™, Bio-Rad); линии 1-7 - супернатанты КЖ, отбиравшиеся каждые 24 ч в течение 168-часовой фазы индукции метанолом

0

Как видно из Рисунка 36А, в течение всего процесса ферментации штамма ВКПМ Y-5277 кривые роста ферментативной активности и биомассы (OD600) сначала увеличивались экспоненциально, а затем приблизились к S-образной кривой. Максимальная продукция фитазы наблюдалась на 144 час от начала индукции метанолом и составила 13993 ± 214 ед/мл, что является неплохим результатом.

Для сравнения, продукция коммерческой фитазы из E. coli штаммом K. phaffii, с учетом оптимизация ферментации, в 5-литровом биореакторе составила 4946 ед/мл на 192 час от начала индукции (Chen et al., 2004). В работе Xiong A.-S. и соавторов продукция коммерческой фитазы из P. lycii в K. phaffii достигла 10540 ед/мл в 5-литровом биореакторе на 80 час индукции метанолом (Xiong et al., 2006). Продукция фитазы из C. amalonaticus составила 35032 ед/мл в 10-литровом биореакторе на 120 час индукциии метанолом (Li et al., 2015). Тем не менее известно, что значение удельной активности этой фитазы составляет 3548 ед/мг (Li et al., 2015), превышая таковое в 2,2 раза для фитазы из C. gillenii (1577 ед/мг).

Динамика накопления Р-амилазы в КЖ при периодическом культивировании рекомбинантного штамма в биореакторе представлена на Рисунке 37.

А

Б

6000

ц

2

"Й е 5000

ь,

т с о 4000

н

в

и кт 3000 -

га

я о

га н 2000 -

м

га

С и 1000 -

м

га

CL 0 а

Активность

— OD600

200

150

100 £

O

50

24 48 72

Время индукции, ч

96

Рисунок 37 - Рост и продукция Р-амилазы штаммом ВКПМ Y-5271 при периодической ферментации в 3-литровом биореакторе. График зависимости активности Р-амилазы и плотности клеток от времени (А). Анализ супернатантов КЖ методом ДСН-ПААГ электрофореза (Б), где М - маркер молекулярной массы (Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™, Bio-Rad); линии 1-3 - супернатанты КЖ, отбиравшиеся через 24, 39 и 72 ч от начала фазы индукции метанолом

0

0

Продукция гетерологичной Р-амилазы штаммом ВКПМ У-5271 достигла максимума на 39 час от начала индукции метанолом и составила 5261 ±119 ед/мл (Рисунок 37А). Таким образом, в лабораторном ферментере был достигнут уровень

п и «

продукции р-амилазы, сравнимый с существующими на данный момент мировыми аналогами, описанными в научной литературе.

Например, продукция Р-амилазы из B. megaterium в экспрессионной системе B. subtilis на 27 час ферментации в полной питательной среде составила 4966 ед/мл (Zeng et э1., 2021). Продукция Р-амилазы из B. aryabhattai в экспрессионной системе Brevibacillus choshinensis на 66 час культивирования в 3-литровом ферментере составила 5371,8 ед/мл. Тем не менее, в качестве источника азота в ферментационной среде использовались дорогостоящие компоненты - мясной экстракт (10 г/л) и свиной пептон (30 г/л) ^шп et э1., 2019). Использование в составе ферментационной среды дорогостоящих компонентов увеличивает общую себестоимость целевого продукта, снижая его экономическую выгоду и конкурентноспособность, особенно в условиях масштабного производства. Напротив, для культивирования продуцента Р-амилазы, полученного в настоящей работе, используется дешевая минимальная среда, что является более предпочтительным для промышленного получения Р-амилазы. Полученные результаты свидетельствуют о высокой перспективности и потенциальной возможности масштабирования процесса получения Р-амилазы с использованием экспрессионной системы метилотрофных дрожжей ^ phaffii.

3.5 Биохимическая характеристика новых гетерологичных ферментов 3.5.1 Характеристика фитазы из С. gillenii 3.5.1.1 Определение молекулярной массы и удельной активности

Гетерологичная фитаза PhyCg была очищена методом катионообменной хроматографии. Также была определена молекулярная масса фермента по данным ДСН-ПААГ электрофореза в полиакриламидном геле (Рисунок 38).

Рисунок 38 - ДСН-ПААГ электрофорез очищенной фитазы PhyCg, где М - маркер молекулярной массы (PageRuler™ Unstained Broad Range Protein Ladder), 1 - очищенная фитаза, 2 - очищенная фитаза, дегликозилированная EndoH

По результатам ДНС-ПААГ электрофореза молекулярная масса очищенного белка составила около 60 кДа, что выше теоретически рассчитанной массы белка (47,6 кДа). Обработка фермента эндогликозидазой Н1 (EndoH) привела к снижению молекулярной массы фитазы PhyCg до значения, близкого к теоретически рассчитанному. В результате было подтверждено, что фитаза PhyCg является N-гликозилированным белком.

Удельная активность фитазы составила 1577 ± 12 ед/мг. Данная активность намного выше активности промышленной фитазы из A. niger (100 ед/мг) (Huang et al., 2006a), а также выше активности коммерческой фитазы из P. lycii (1080 ед/мг) (Xiong et al., 2006) и сравнима с активностями промышленных фитаз из C. freundii (2072 ± 18 ед/мг) (Zhao et al., 2010) и E. coli (1800 ед/мг) (Golovan et al., 2000).

3.5.1.2 Определение рабочего профиля температуры и pH

Были исследованы температурный и рН профили гликозилированной и дегликозилированной форм фитазы PhyCg (Рисунок 39).

А

Гликозилированный PhyCg

- -О- - Дегликозилированный PhyCg

а

110 100

Г 90 80

о

5 £ 70

с ш

60

S 50

0 к

1 я 40 О й 30

t 20 10

0

Б —■—Гликозилированный PhyCg

- -О- - Дегликозилированный PhyCg

110

100

90

к

а н

з

¡^ 80

■frjf

S Б

" S g£

иа

о ™

о н

н О

70 60 50 40 30 20 10 0

20 30 40 50 60 Температура, °C

70

45 pH

Рисунок 39 - Температурный (А) и рН (Б) профили фитазы PhyCg. Представленные значения являются средними трех независимых экспериментов, стандартное отклонение отражено планками погрешностей

Установлено, что оптимальными условиями для работы фермента являются значение pH 4,5 (Рисунок 39А) и температура 50 °С (Рисунок 39Б). Гликозилирование не оказывает существенного влияния на температурный и pH-оптимумы. Кроме того, фитаза обладает широким рабочим диапазоном рН: при pH 3,0 сохраняется более 50 % активности, при рН 5,5 - около 85 %, а при рН 6,0 - более 50 %.

Фитаза PhyCg, проявляя более 40 % активности при 25 °C и сохраняя более 50 % активности при pH 6,0, предположительно, обладает значительным потенциалом для промышленного применения в качестве кормовой добавки для аквакультуры. Оптимальная температура для выращивания аквакультуры составляет 20-30 °С (Lemos et al., 2016, Pal Roy et al., 2017), однако, не все фитазы могут проявлять высокую активность в таком температурном диапазоне. Например, фитазы из E. coli и C. freundii проявляют менее 30 % активности при 25 °С (Zhao et al., 2010; Golovan et al., 2000).

Рыбы семейств карповых (лещ, плотва, сазан, язь и другие) и тилапии, а также некоторые другие виды рыб и ракообразных относятся к агастрическим водным организмам, у которых отсутствует желудок как отдельный орган пищеварительной системы. Вместо этого пища попадает из пищевода непосредственно в кишечник, где и происходит процесс переваривания в слабокислой или почти нейтральной среде (pH 6,07,5), поэтому известные бактериальные кислые гистидиновые фитазы в агастрических

2

3

6

7

рыбах малоэффективны (Ji et al., 1999, Cao et al., 2007). Например, фитаза из C. freundii проявляет менее 5 % активности при pH 6,0 (Zhao et al., 2010), а фитаза из E. coli - менее 15 % активности (Golovan et al., 2000). В настоящее время грибные (A. niger, A. oryzae, A. awamori) и бациллярные (Bacillus sp.) фитазы, способные работать при слабокислых, нейтральных и щелочных значениях рН, показали эффективность при кормлении рыб. Однако их использование ограничивается низкими удельными активностями, что предполагает введение очень больших количеств ферментных препаратов в корма (Lemos et al., 2016). Например, удельная активность промышленной фитазы из A. niger, широко применяющейся в качестве кормовой добавки при кормлении рыб, составляет около 100 ед/мг, а бациллярных фитаз из B. amyloliquefaciens, B. subtilis и Bacillus aryabhattai RS1 -20; 9,0-15 и 72,97 ед/мг (Huang et al., 2006a; Cao et al., 2007; Pal Roy et al., 2017).

Кроме того, фитаза PhyCg может применяться для кормления сельскохозяйственных моногастричных животных, так как обладает широким рабочим диапазоном рН. Так, у домашней птицы, в основном, переваривание корма происходит в зобе при рН 4,5, а также в мышечном желудке при рН 2,5-3,5. Было показано, что 6986 % активности добавленной микробной фитазы обнаруживалось в зобе и 31-38 % - в мышечном желудке (Liebert et al., 1993). В пищеварительной системе свиней фитаза наиболее активна в желудке (70-80 % активности). Величина pH желудка свиней колеблется около 2,5, увеличиваясь с приемом корма до 3,5-4,5 (Merchant et al., 2011; Parks et al., 2013). Ввиду того, что кормовые ферменты всасываются вместе с кормом, то действие фитаз в сильнокислотных условиях не имеет значения. Следовательно, эффективность коммерческих фитаз не должна дифференцироваться на основе их активности при сверхнизких уровнях рН, созданных в лабораторных анализах (Parks et al., 2013). Таким образом, действуя в широком диапазоне pH с оптимумом 4,5, фитаза PhyCg будет эффективно гидролизовать фитат в желудочно-кишучном тракте животных.

Исходя из данных Рисунка 28А, фитаза проявляет максимальную активность при температуре 40-60 °С с оптимумом при 50 °С, сохраняя более 55 % активности при 40 °С. Учитывая, что нормальная физиологическая температура свиней составляет 39,2 °С (Swenson, 1970) или 38-40 °С (Ruckebusch et al., 1991), а бройлеров - 42 °С (Welker et al., 2008), фитаза, предположительно, будет эффективно работать в организме животных.

3.5.1.3 Определение кинетических характеристик

Для исследования кинетических параметров гетерологичной фитазы измеряли начальную скорость ферментативной реакции при различных концентрациях фитата натрия согласно методу Лайнуивера-Берка. Значение константы Михаэлиса (Km) для фитазы составило 0,185 ± 0,06 мМ. Следовательно, фермент обладает очень высоким сродством к субстрату. Данное значение ниже, чем у коммерческих фитаз из E. coli (0,228 мМ), C. braakii (0,364 мМ), Buttiauxella sp. (0,272 мМ) и E. coli (0,228 мМ) (Menezes-Blackbum et al., 2015), а также из C. freundii (0,52 ± 0,04 мМ) (Zhao et al., 2010), но немного выше, чем у фитазы Y. intermedia (0,125 мМ) (Huang et al., 2006a). Таким образом, фитаза PhyCg гидролизует фитат более эффективно, чем большинство коммерчески доступных фитаз. Это обеспечивает стабильную и высокую скорость реакции даже при изменениях концентрации субстрата, что повышает общую производительность процесса гидролиза фитата.

Максимальная скорость реакции (Vmax) для PhyCg составила 2185 ± 22 ед/мг, что превышает значения для коммерческих фитаз из A. niger (226 ед/мг) (Huang et al., 2008), Buttiauxella sp. (1390 ед/мг) (Shi et al., 2008), и сопоставимо с фитазой C. freundii (2380 ± 84 ед/мг) (Zhao et al., 2010), но ниже, чем для фитазы C. braakii (3300 ед/мг) (Huang et al., 2006b).

Таким образом, гетерологичной фитаза из C. gillenii обладает кинетическими параметрами, характерными для высокоактивных ферментов. Использование фитазы, как кормовой добавки, с низким значением Km и высоким значением Vmax способствует повышению эффективности кормов для животных, снижению кормовых затрат и увеличению общей продуктивности сельского хозяйства.

3.5.1.4 Анализ pH-стабильности, термостабильности и протеолитической

устойчивости

Была изучена стабильность фермента PhyCg при различных значениях pH и температуры (Рисунок 40).

А

100

к га

м 80 га о^ н ,

S JÛ ■в- £ 60

к о га х

I m 40 TS 40

° £

га га 20

о

О

0

Б

5 pH

100

Гликозилированный PhyCg

к га х

О «о

га

н ,

S JÛ

к о га х х m

т s ° £

га га н о О

80

60

40

20

-О

50 55 60 65 Температура, °C

70

Рисунок 40 - Остаточная фитазная активность после инкубации фермента при различных значениях pH в течение 1 ч при 37 °С (А) и нагревания гликозилированной и дегликозилированной фитаз при различных температурах в течение 5 мин (Б). Представленные значения являются средними трех независимых экспериментов, стандартное отклонение отражено планками погрешностей

Остаточная активность фитазы в диапазоне pH 2,0-8,0 почти не изменяется и составляет более 95 % (Рисунок 40А), что выше, чем у фитазы из Y. intermedia (около 80 % при pH 3,0-6,0) (Mirzaei et al., 2016). Следовательно, предполагается, что, проявляя высокую стабильность в широком диапазоне pH, фитаза PhyCg будет эффективно работать на протяжении всего желудочно-кишечного тракта животных.

Как видно из Рисунка 40Б, фитаза PhyCg является термолабильным белком, теряя более 70 % активности после прогрева при 70 °С в течение 5 мин. Примечательно, что дегликозилированная форма этого белка практически полностью теряет активность при аналогичных условиях. Это свидетельствует о том, что гликозилирование увеличивает термостабильность фитазы PhyCg. Большинство фитаз бактериального происхождения действительно характеризуются низкой термостабильностью. Например, фитаза из C. freundii полностью теряет активность уже после 4 минут прогрева при 60 °С (Luo et al., 2006). Известно, что в процессе приготовления корма подвергаются кратковременному (5-10 мин) прогреву при повышенных температурах, что обуславливает необходимую термостабильность фитаз. Тем не менее, в настоящее время для термочувствительных ферментов разработаны альтернативные, более щадящие технологические подходы, позволяющие минимизировать применение высоких температур при кормопроизводстве (Humer et al., 2015).

0

2

3

4

6

7

8

Была исследована термостабильность фитазы PhyCg при различных значениях рН (Рисунок 41).

100

л 80 н

о к о

оа 60

7 5

° ё га га

40

о

м £ 20

рН 3 рН 4 рН 5 рН 6 рН 7 рН 8

50 55 60 65

Температура, °С

70

75

Рисунок 41 - Остаточная активность фитазы после прогрева при различных температурах и рН в течение 5 мин. Представленные значения являются средними трех независимых экспериментов, стандартное отклонение отражено планками погрешностей

Было установлено, что гетерологичная фитаза проявляет максимальную термостабильность при рН 6,0.

Исследование устойчивости фитазы к протеолитическим ферментам (пепсину и трипсину) проводили путем инкубации фермента в буферных растворах, содержащих пепсин и трипсин в массовом соотношении 1:10 (протеаза/фитаза) при оптимальных значениях рН для работы этих ферментов (Рисунок 42).

■-о- - Пепсин

-Трипсин

100

к

а

« ^ 80

га о^ т,

■&Й 60

к о

ан х со 40

7 5

£ Ё а а20 ст

0 0

10 20 30 40 Время, мин

50

60

Рисунок 42 - Остаточная активность фитазы после инкубации с пепсином и трипсином в течение 1 ч при 37 °С. Представленные значения являются средними трех независимых экспериментов, стандартное отклонение отражено планками погрешностей

0

0

Результаты показали, что фитаза является неустойчивой к пепсину, теряя практически 95 % активности при выдерживании в течение часа. Для сравнения, фитазы из A. niger, P. lycii и Buttiauxella sp. после воздействия пепсина в течение 45 минут, сохраняют соответственно 47 %, 34 % и 85 % фитазной активности (Menezes-Blackburn et al., 2015). Однако фермент проявил высокую устойчивость к трипсину, сохранив около 100 % активности через 1 час инкубирования с трипсином, что является лучшим показателем, чем у Y. intermedia (90 %) (Huang et al., 2006a) и E. coli (65 %) (Tai et al., 2013).

Протеолитическая устойчивость фермента может быть улучшена путем сайт-направленного мутагенеза, приводящего к нарушению субстратного предпочтения протеазы к аминокислотным остаткам полипептидной цепи. Например, замена аминокислотных остатков, входящих в состав сайтов расщепления пепсином, в последовательностях фитаз из Yersinia kristensenii и Yersinia enterocolitica привела к увеличению устойчивости к пепсину, улучшению стабильности при 60 °C и pH 1,0-2,0, а также увеличению каталитической эффективности (Niu et al., 2017).

3.5.1.5 Изучение субстратной специфичности, влияния ионов металлов и модуляторов на активность PhyCg

Была исследована специфичность фитазы PhyCg к гидролизу различных фосфорилированных субстратов (Таблица 24). Активность фитазы по отношению к фитату натрия была принята за 100 %.

Таблица 24 - Субстратная специфичность фитазы PhyCg

Субстрат Относительная фитазная активность, %

Глюкозо-6-фосфат 0,16 ± 0,09

Фруктозо-6-фосфат 0,11 ± 0,08

Рибозо-6-фосфат 0,05 ± 0,01

Нафтол-АС-Е-фосфат 0,1 ± 0,05

АМФ 0,94 ± 0,6

АДФ 1,52 ± 0,59

АТФ 1,76 ± 0,80

НАДФ 0,29 ± 0,13

Примечание - Представлены средние значения ± стандартные отклонения

Результаты показали, что фитаза обладает субстратной специфичностью только по отношению к фитату натрия. Специфичность по отношению к другим субстратам была незначительной. Похожие результаты были получены при исследовании фитазы из C. braakii (Kim et al., 2003).

Было исследовано влияние потенциальных модуляторов, включая различные восстановители, денатурирующие агенты и детергенты, на активность фитазы PhyCg (Таблица 25). Фитазную активность без добавления модуляторов принимали за 100 %.

Таблица 25 - Влияние различных модуляторов на активность фитазы PhyCg

Модулятор Остаточная фитазная активность, %

Лимонная кислота 77,89 ± 2,02 (1мМ) 56,48 ± 0,68 (25мМ) 43,01 ± 3,84 (50мМ)

Глицерин 113,25 ± 4,94 (1 % об./об.) 88,72 ± 3,13 (5 % об./об.) 62,2 ± 4,80 (10 % об./об.)

ДТТ 92,4 ± 2,61 (1мМ) 83,36 ± 4,08 (5мМ) 75,45 ± 1,08 (10мМ)

ЭДТА 119,88 ± 1,51 (1мМ) 99,35 ± 1,15 (5мМ) 94,63 ± 3,75 (10мМ)

Мочевина 97,22 ± 2,29 (0,5М) 80,27 ± 1,43 (1М) 76,24 ± 5,03 (2М)

ДСН 52,55 ± 5,17 (1мМ) 31,23 ± 3,31 (5мМ) 14,62 ± 2,02 (10мМ)

Твин-20 108,7 ± 3,32 (0,1 % об./об.) 119,13 ± 5,54 (0,5 % об./об.) 131,54 ± 1,65 (1 % об./об.)

Твин-80 111,22 ± 3,49 (0,1 % об./об.) 120,42 ± 2,71 (0,5 % об./об.) 126,2 ± 4,54 (1 % об./об.)

Примечания - Представлены средние значения ± стандартные отклонения, концентрация модулятора указана в скобках

Результаты показали, что дитиотрейтол (ДТТ), додецилсульфат натрия (ДСН), мочевина, глицерин (5 и 10 % об./об.) и лимонная кислота оказывают ингибирующее действие на активность фитазы PhyCg. Отрицательное действие додецилсульфата натрия заключается в том, что он, как ионный детергент, может связывается c белком и вызывать в нем конформационные изменения (Singh et al., 2009). ЭДТА (1 мМ), глицерин (1 % об./об.), твин-20 и твин-80 незначительно повышали активность PhyCg.

Было исследовано влияние ионов металлов на активность гетерологичной фитазы PhyCg (Рисунок 43).

Контроль Мд2+

Рисунок 43 - Влияние ионов металлов на активность гетерологичной фитазы. Представленные значения являются средними трех независимых экспериментов, стандартное отклонение отражено планками погрешностей

Результаты показали, что ионы Ca2+, Ni2+, Mg2+ и Mn2+ оказывают незначительное стимулирующее действие. При добавлении ионов Ni2+ и Mn2+ наблюдается наибольшее увеличение активности, на 25 % и 22 % соответственно. Напротив, ионы Fe2+ и ^^оказывают ингибирующее действие, снижая активность фермента на 77 % и 23 % соответственно. Похожие результаты были получены при изучении фитазы из A. fumigatus WY-2 (Wang et al. 2007), а также из C. freundii (Luo et al. 2006), E. coli (Tai et al. 2013) и C. braakii (Kim et al., 2003).

Таким образом, исследования показали, что гетерологичная фитаза PhyCg из C. gillenii обладает промышленно-ценными характеристиками для использования в качестве кормовой добавки для аквакультуры.

3.5.2 Характеристика ß-амилазы из P.flexa 3.5.2.1 Определение молекулярной массы и удельной активности

Гетерологичная Р-амилаза была очищена комбинацией анионообменной и гель-проникающей хроматографии. По данным ДСН-ПААГ электрофореза в полиакриламидном геле была определена ее молекулярная масса (Рисунок 44).

Рисунок 44 - ДСН-ПААГ электрофорез очищенной Р-амилазы, где М - маркер молекулярной массы (Precision Plus Protein™ «Broad-Range SDS-PAGE Standard»), 1 -очищенная Р-амилаза, 2 - очищенная Р-амилаза, обработанная EndoH

Как видно из Рисунка 44, молекулярная масса очищенного белка составила около 63 кДа, что превышает значение расчетной молекулярной массы белка (57,6 кДа). Обработка фермента эндогликозидазой Н (Б^оН) привела к снижению молекулярной массы Р-амилазы до значения, близкого к теоретически рассчитанному. Следовательно, Р-амилаза является К-гликозилированным белком.

Одной из важнейших характеристик промышленных ферментов является высокая удельная активность, благодаря которой можно сократить время ферментативной реакции и снизить дозировку фермента. Новая гетерологичная Р-амилаза из P. flexa характеризуется высокой удельной активностью, которая составила 3411 ± 13,9 ед/мг. Она превосходит таковую для микробных Р-амилаз из B. cereus (2182 ед/мг), P. polymyxa (1500 ед/мг), B. circulans (0,77 ед/мг) (Биап й а1., 2021), B. suЫШs (3,57 ед/мг) ^еть01а Й а1., 2013) и промышленной Р-амилазы из сои (880 ед/мг) (Оей1ег й а1., 1965), и немного ниже, чем у рекомбинантной Р-амилазы из B. aryabhattai (3798,9 ед/мг) фиап et а1., 2021).

3.5.2.2 Определение рабочего профиля температуры и pH

Были исследованы температурный и рН профили Р-амилазы (Рисунок 45).

А

Б

I

н

о о

О 0

1-1-1-1-1- р

30 40 50 60 70 О

Температура, °C

0 42

3456789 10 pH

Рисунок 45 - Температурный (А) и рН (Б) профили Р-амилазы. Представленные значения являются средними трех независимых экспериментов, стандартное отклонение отражено планками погрешностей

В основном, оптимум температуры для большинства как растительных, так и бактериальных Р-амилаз находится в пределах 50-65 °С (Das et al., 2019). Исходя из данных, представленных на Рисунке 45А, оптимальная температура для работы фермента составляет 55 °С, что аналогично температурному оптимуму Р-амилазы из ячменя. Кроме того, фермент проявляет 83 % активности при 60 °С, что превосходит показатели Р-амилазы из ячменя, которая проявляет около 75 % активности при 60 °С (Yoshigi et al., 1995). Например, микробные Р-амилазы из B. megaterium, B. aryabhattai и B. circulans проявляют максимальную активность при 50 °С, а Р-амилазы из B. cereus и P. polymyxa -при 40 °С и 45 °С соответственно (Duan et al. 2021). Ранее сообщалось, что Р-амилаза из пшеницы проявляла максимальную активность при 40 °С и оставалась активной даже при 55 °С (Zhang et al., 2005). Однако существуют данные, где сообщается, что оптимальной температурой для работы Р-амилазы из пшеницы является 55 °С (Daba et al., 2012). Тем не менее, в нескольких источниках сообщалось, что технологический процесс осахаривания желатинизированного крахмала Р-амилазой осуществляется, в основном, в диапазоне температур от 55 °С до 60 °С (Taniguchi et al., 2009; Sun et al., 2016), а процесс затирания солодовых зерен в пивоварении - при 62-63 °С (Viader et al., 2021).

Следовательно, предполагается, что гетерологичная Р-амилаза из P. flexa будет эффективно гидролизовать крахмал в процессе получения мальтозных сиропов и пивоварении.

Как видно из данных, представленных на Рисунке 45Б, Р-амилаза проявляет высокую активность в диапазоне рН 6,0-9,0 с оптимумом рН 8,0. В диапазоне рН 5,5-6,0 Р-амилаза сохраняет от 70 % до 90 % активности, что соответствует требованиям промышленного производства, в котором процесс осахаривания крахмала Р-амилазой происходит при рН 5,5-6,0 (№и е! а1., 2018). Таким образом, гетерологичная Р-амилаза обладает ценными промышленными свойствами и может быть с высокой эффективностью применена в процессе осахаривания крахмала в крахмалопаточной и пивоваренной промышленностях.

3.5.2.3 Определение кинетических характеристик и субстратной специфичности

Константа Михаэлиса (Кш) для гетерологичной Р-амилазы составила 2,02 ± 0,21 мг/мл. Ранее сообщалось, что для большинства как растительных, так и микробных Р-амилаз Кш составляет 1-3 мг/мл (Ба8 е! а1., 2019). Например, для Р-амилазы из B. сегеш Кш составляет 0,73 ± 0,02 мг/мл (Нка1а е! а1., 2004). Тем не менее, по сравнению с Р-амилазами из B. aryabhattai и B. suЫШs, для которых Кш составила 9,9 ± 2,1 мг/мл (Биап е! а1., 2021) и (4,7 мг/мл) (Беш1-01а е! а1., 2013), Р-амилаза из P. flexa обладает лучшим сродством к субстрату. Максимальная скорость реакции (Кшах) для Р-амилазы составила 4399 ± 16,6 ед/мг.

Была исследована специфичность гетерологичной Р-амилазы по отношению к различным субстратам (Таблица 26).

Таблица 26 - Субстратная специфичность Р-амилазы

Субстрат Относительная в-амилазная активность, %

Растворимый крахмал 100 ± 2,1

Амилопектин 81 ± 1,8

Кукурузный крахмал 97 ± 2,8

Мальтодекстрин (ДЭ 4-7) 81 ± 3,7

Мальтодекстрин (ДЭ 18-20) 20 ± 2,4

Продолжение таблицы 26

Субстрат Относительная ß-амилазная активность, %

Пуллулан 0

ß-циклодекстрин 0

Амилоза 98 ± 1,6

Примечание - Представлены средние значения ± стандартные отклонения

Результаты показали, что в присутствии растворимого крахмала фермент проявлял максимальную активность. В присутствии кукурузного крахмала и амилозы фермент проявлял активности, близкие к максимальным (97 и 98 % соотвественно). Кроме того, ß-амилаза проявляла высокую активность (81 %) в присутствии мальтодекстрина с низким декстрозным эквивалентом (ДЭ) и низкую (20 %) - в присутствии мальтодекстрина с высоким ДЭ. Похожие результаты были получены при исследовании ß-амилаз из B. polymyxa (Sohn et al., 1996), B. aryabhattai (Duan et al., 2021), P. flexa, ячменя, пшеницы и сои (Sugita et al., 2011).

3.5.2.4 Анализ pH-стабильности и термостабильности

Было проведено исследование pH стабильности и термостабильности гетерологичной ß-амилазы (Рисунок 46).

А

Б

100

к га

« 80

2 га

е-

к га х

У

о н га н о О

¡£ 60

о

о

m 40

s

£

« 20

23456789 10 pH

100

к га

2 80 I *