Разработка технологии получения гидрофобинов грибов для применения в пищевых отраслях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат наук Колесников Борис Алексеевич

• Колесников Борис Алексеевич
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Колесников Борис Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Грибы, как источники биологически активных веществ

1.2 Глубинное культивирование грибов

1.3 Гидрофобины. Общая характеристика

1.4 Структура и свойства гидрофобинов

1.4.1 Структура гидрофобинов

1.4.2 Гидрофобины в водном растворе и межфазная самосборка гидрофобинов

1.4.3 Связывание гидрофобинов с твёрдыми поверхностями

1.5 Функции гидрофобинов

1.6 Применение гидрофобинов

1.7 Методы выделения гидрофобинов

1.8 Эмульгаторы в пищевой промышленности

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Глубинное культивирование грибов

2.3 Подбор условий культивирования продуцентов

2.3.1 Оптимизация состава питательной среды

2.3.2 Исследование влияния аэрации на биосинтез целевых продуктов

2.4 Экстракция гидрофобинподобных белков

2.4.1 Экстракция гидрофобинподобных белков из биомассы гриба

Coprinus lagopides

2.4.2 Экстракция гидрофобинподобных белков из культур грибов Trichoderma viride и Aspergillus niger

2.4.2.1 Экстракция с применением 1% раствора SDS

2.4.2.2 Спиртовая экстракция ГФБ

2.5 Определение концентрации белка в полученных экстрактах

2.6 Анализ экстракта из культуры Coprinus lagopides

2.6.1 Анализ экстракта с помощью метода высокоэффективной

жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

2.6.2 Определение молекулярной массы ГФБ методом электрофореза

в полиакриламидном геле

2.7 Очистка и анализ экстракта из культуры Trichoderma viride

2.7.1 Очистка ГФБ методом ионообменной хроматографии

2.7.2 Определение молекулярной массы белка

2.8 Очистка и анализ экстракта из культуры Aspergillus niger

2.9 Оценка влияния полученного продукта на образование и

стабильность пены

2.10 Измерение краевого угла смачивания методом растекающейся

капли

2.11 Определение молокосвёртывающей и протеолитической

активности культуры гриба Coprinus lagopides

2.11.1 Определение МСА

2.11.1.1 Определение МСА методом Каваи-Мукаи

2.11.1.2 Определение МСА по ГОСТу «Р 52688-2006»

2.11.2 Определение протеолитической активности фермента

2.12 Очистка и концентрирование раствора молокосвертывающего

фермента методом ультрафильтрации

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Культурально-морфологические признаки выбранных

продуцентов

3.2 Отработка методики выделения гидрофобинподобных белков из исследуемых культур

3.3 Подбор условий культивирования продуцентов

3.3.1 Оптимизация состава питательной среды

3.3.2 Подбор режима аэрации среды культивирования

3.4 Определение гидрофобинов в полученных экстрактах

3.4.1 Анализ экстракта из культуры Coprinus lagopides

3.4.2 Очистка и анализ экстракта из культуры Trichoderma viride

3.4.3 Очистка и анализ экстракта из культуры Aspergillus niger

3.5 Оценка поверхностно-активных свойств экстрактов, выделенных

из биомассы грибов

3.5.1 Оценка пеностабилизирующих свойств

3.5.2 Оценка влияния экстрактов на изменение краевого угла

смачивания

3.6 Разработка комплексного метода получения ГФБ и

молокосвёртывающего фермента из культуры Coprinus lagopides

3.7 Оценка возможности получения ГФБ и целлюлолитического

фермента из культуры Trichoderma viride

3.8 Оценка возможности получения ГФБ и лимонной кислоты из

культуры Aspergillus niger

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

ПРИЛОЖЕНИЕ В

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии получения гидрофобинов грибов для применения в пищевых отраслях»

Актуальность темы.

Грибы являются источником большого количества разнообразных биологически активных соединений. Царство грибов включает в себя по разным оценкам от 100 до 250 тысяч видов, однако, только малая их часть изучена в качестве источника различных ценных веществ. Соединения, содержащиеся в грибах, могут обладать не только биологической, но также и высокой поверхностной активностью. В середине 80-х годов во время поиска генов, экспрессирующихся при образовании воздушных гиф на мицелии гриба Schizophyllum commune, были обнаружены особые белки, названные гидрофобинами. Эти белки обладают интересными физическими свойствами и являются перспективным объектом для изучения и применения в различных областях промышленности. Уникальным свойством гидрофобинов является их способность к самосборке в амфипатическую мембрану и преобразованию свойств поверхности контакта.

Диапазон предполагаемого применения гидрофобинов включает в себя использование их в качестве поверхностно-активных веществ, пищевых эмульгаторов, в качестве индикаторов гашинга пива, поверхностных покрытий, при иммобилизации, и др. Наиболее перспективными областями их применения в настоящее время считается медицина и фармакологический сектор. Поверхностно-активные свойства гидрофобинов и их способность к самосборке делают возможным их применение для модификации поверхности и иммобилизации ферментов, антител и других белков. Они могут также использоваться в качестве покрытий для хирургических имплантатов с целью повышения их биосовместимости.

Известно, что сборка гидрофобинов на границе раздела между гидрофобной и гидрофильной жидкостями может стабилизировать эмульсии. В связи с этим одним из перспективных направлений использования гидрофобинов считается их применение в качестве стабилизаторов пищевых пен и эмульсий. Эффект,

вызываемый ГФ, намного выше, чем у многих известных в настоящее время натуральных эмульгаторов, используемых в пищевой промышленности. К тому же, эмульсии, образуемые гидрофобинами, по своим консистенции и вкусу способны имитировать пищевой жир. Таким образом, использование гидрофобинов в очень низких концентрациях может приводить к улучшению физических и сенсорных свойств целого ряда продуктов, одновременно позволяя значительно снижать в них содержание жиров.

Гидрофобины имеют большой потенциал применения, однако, возможность их использования в настоящее время сильно ограничена. Это связано с тем, что выход гидрофобинов в лабораторных установках недостаточен для широкого испытания их применения, а крупномасштабного производства гидрофобинов не существует. В связи с этим актуальной является задача по поиску новых продуцентов гидрофобинов, а так же по разработке новой технологии их выделения и очистки, которая могла бы обеспечить наибольший выход продукта и значительно удешевить процесс производства. Одним из возможных способов повышения эффективности получения гидрофобинподобных белков грибов является разработка комплексного способа их получения одновременно с другими ценными продуктами. В частности, поскольку грибы обладают богатым ферментативным комплексом, представляется целесообразным разработка комплексного способа получения поверхностно-активных белков совместно с ферментными препаратами.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось изучение глубинной культуры грибов Trichoderma viride, Aspergillus niger (аскомицеты) и Coprinus lagopides (базидиомицет) в качестве потенциальных источников гидрофобинов, а также разработка комплексного метода выделения гидрофобинподобных белков и других ценных продуктов биосинтеза. Выбор грибов Trichoderma viride и Coprinus lagopides в качестве объектов исследования обусловлен наличием высокой ферментативной активности нативного раствора культуральной жидкости этих культур.

Trichoderma viride является известным промышленным продуцентом целлюлаз. У культуры Coprinus lagopides нами ранее была выявлена высокая молокосвёртывающая активность. Выбора гриба Aspergillus niger обусловлен тем, что он является известным промышленным продуцентом лимонной кислоты.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- провести анализ культур грибов Trichoderma viride, Coprinus lagopides и Aspergillus niger на наличие гидрофобинподобных поверхностно-активных белков;

- подобрать для исследуемых культур оптимальные условия роста и биосинтеза поверхностно-активных белков и ферментов;

- отработать методику выделения поверхностно-активных белков из культуральной жидкости продуцентов и методы их последующей очистки;

- оценить молекулярную массу полученных поверхностно-активных белков;

- оценить пеностабилизирующую способность поверхностно-активных белков в сравнении с пеностабилизирующими агентами, используемыми в настоящее время в пищевой промышленности.

- оценить поверхностную активность полученных гидрофобинподобных белков;

- изучить возможность одновременного получения гидрофобинподобных белков и других ценных продуктов биосинтеза.

Научная новизна работы

Представленная работа является первым исследованием гидрофобинподобных белков культур грибов Trichoderma viride, Coprinus lagopides и Aspergillus niger.

Разработан оригинальный способ очистки гидрофобинподобных белков грибов при помощи жидкостной хроматографии с использованием нового гидрофобного сорбента Сфероцелл С-80, позволяющий получить препаративные количества гидрофобинподобных белков.

Разработан комплексный метод получения гидрофобинподобных белков и молокосвёртывающего фермента из глубинной культуры гриба Coprinus lagopides. Показана возможность одновременного получения гидрофобинподобных белков и целлюлолитических ферментов из глубинной культуры гриба Trichoderma viride, а также гидрофобинподобных белков из биомассы гриба Aspergillus niger, являющейся отходом производства лимонной кислоты.

Практическая значимость работы

Показана возможность получения гидрофобинподобных белков из культур грибов Trichoderma viride, Coprinus lagopides и Aspergillus niger.

Подобраны составы питательных сред и условия культивирования исследуемых продуцентов, обеспечивающие высокий выход целевых продуктов.

Разработаны методы выделения и очистки поверхностно-активных белков из культуральной жидкости продуцентов.

Полученные препараты гидрофобинподобных белков по своим пеностабилизирующим свойствам намного превосходят исследованные промышленные эмульгаторы.

Показано, что полученные белки даже в невысоких концентрациях значительно снижают поверхностное натяжение воды.

Разработан комплексный метод получения гидрофобинподобных белков и молокосвёртывающего фермента из глубинной культуры гриба Coprinus lagopides в результате одного культивирования, позволяющий значительно повысить экономическую эффективность процесса производства и удешевить себестоимость конечных продуктов. Разработан соответствующий лабораторный регламент.

Показана возможность реализации комплексного метода получения гидрофобинподобных белков и целлюлолитических ферментов из глубинной культуры гриба Trichoderma viride. Для получения гидрофобинподобных белков данным методом использована мицеллиальная биомасса гриба, являющаяся

отходом получения целлюлолитических ферментов. Также разработан метод получения гидрофобинподобных белков из культуральной жидкости гриба Trichoderma viride. Разработан соответствующий лабораторный регламент.

Показана возможность получения гидрофобинподобныхбелков из биомассы гриба Aspergillus niger, выращенного на среде, используемой при производстве лимонной кислоты методом микробиологического синтеза.

Проведены испытания полученных препаратов в промышленных условиях, показавшие высокую поверхностную активность гидрофобинподобных белков и высокую молокосвёртывающую активность выделенного фермента. Составлены акты о проведённых испытаниях.

Апробация работы

Результаты работы доложены на:

1. 14th European Congress on Biotechnology, Barcelona, Spain 13-16 September,

2009

2. EFFoST Conference "New Chalanges in Food Preservation" Budapest, November, 10-14, 2009.

3. X Международной Конференции Молодых Учёных «Пищевые технологии и биотехнологии». 13-16 апреля, 2010 г., г. Казань.

4. Научно-практической конференции, посвящённой 182-й годовщине образования Санкт-петербургского государственного технологического института (технического университета). 25-26 ноября 2010 г., г. Санкт-Петербург.

5. 5th Central European Congress on Food, 19th - 22nd May 2010, Bratislava, Slovak Republic.

6. VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 21 - 25 марта, 2011 г., г. Санкт-Петербург

7. 18th "George Baritiu" University Invernational Conference on CDAIBE'11, Brasov, Romania. 24-25 November, 2011.

8. Второй научно-технической конференции молодых учёных «Неделя науки - 2012» Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). 28-29 марта 2012 г., г. Санкт-Петербург.

9. The First North and East European Congress on Food NEEFood-2012. April 22-24, 2012. St. Petersburg.

10. VII Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития", ЗАО " Экспо-биохим-технологии", РХТУ им. Д.И. Менделеева. 19-22 марта, 2013, г. Москва.

11. IV Международной научной конференции «Химия, структура и функция биомолекул». 17-19 октября 2012. Белоруссия, Минск.

12. The Second North and East European Congress on Food. Украина, Киев, НУХТ. 26-29 мая, 2013.

13. The Third North and East European Congress on Food. Brasov, Romania. 2023 May, 2015.

14. 1st Black Sea Association of Food science and Technology Congress. Ohrid, Macedonia. 22-24 September, 2016.

15. 4-й Съезд микологов России. г. Москва,12-14 апреля, 2017.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Грибы, как источники биологически активных веществ

Грибы являются источником большого количества разнообразных биологически активных соединений. Они также издавна известны своей питательной ценностью, и многие рассматриваются как функциональные продукты питания. Содержание белка в грибах больше, чем в большинстве овощей, и немного меньше, чем в мясе и молоке. При этом они содержат все незаменимые аминокислоты, а также богаты пищевыми волокнами, вследствие чего обладают низкой калорийностью. Грибы являются хорошим источником витаминов, особенно тиамина (В1), рибофлавина (В2), ниацина, биотина и аскорбиновой кислоты. Таким образом, съедобные грибы являются питательным и вкусным источником пищи и могут выступать важным диетическим пищевым компонентом для вегетарианцев [1].

Исторически сложилось так, что грибы собирали в дикой природе для употребления в пищу и в лечебных целях. И только во второй половине 20 в. технологии выращивания грибов стали активно развиваться, в результате чего к концу 20 в. мировой рынок грибов достиг 45 млрд. долларов. [2]

Культура употребления грибов в пищу и использования в лечебных целях уходит вглубь веков. Древние египтяне верили, что грибы являются «растениями бессмертия» и «подарком бога Осириса», а употребление грибов в пищу было разрешено только фараонам. Древние римляне считали грибы едой богов и вкушали их только во время больших праздников. Викинги ели грибы перед тем как «идти на берсерк», в то время как коренные американцы использовали их для достижения «магического» галлюциногенного эффекта [1].

Много лет назад люди признали, что грибы могут оказывать положительное влияние на здоровье. Даже шаманы народов палеолита использовали грибы для борьбы с заболеваниями. В течение длительного времени человечество накапливало и ассимилировало традиции народной медицины, связанные с грибами. Большинство традиционных знаний о биологически-активных свойствах

грибов пришло к нам из Восточной Азии. Так, китайские фармакопеи хранят информацию о более чем 100 видах грибов, используемых специалистами в области традиционной китайской медицины для широкого круга заболеваний.

На мировых фармацевтических и продовольственных рынках существует большое количество грибных соединений, представляющих новый класс нутрицевтических или функциональных пищевых добавок.

В настоящее время довольно много внимания сосредоточено на различных иммунологических и противоопухолевых свойствах грибов [3, 4]. Использование грибов для лечения различных иммунных расстройств практиковалось ещё в Древнем Китае, однако, исследования иммуностимулирующих свойств грибов было начато только пол века назад.

Грибы могут обладать и другими важными терапевтическими свойствами, такими как антиоксидантная активность, способность снижать уровень холестерина, противовоспалительное действие и др. [1, 5-8]. На сегодняшний день известно около 700 видов грибов, обладающих лекарственными свойствами или оказывающих определённый терапевтический эффект [9].

Соединения, содержащиеся в грибах, могут обладать не только биологической, но также и высокой поверхностной активностью. В середине 80-х годов во время поиска генов, экспрессирующихся при образовании воздушных гиф на мицелии гриба Schizophyllum commune, были обнаружены особые белки, названные гидрофобинами [10]. Эти белки обладают интересными физическими свойствами и являются перспективным объектом для изучения и применения в различных областях промышленности.

1.2 Глубинное культивирование грибов

Грибы являются продуцентами большого количества биологически-активных веществ, а также представляют собой хороший источник пищевого белка, дефицит которого сейчас остро ощущается во всём мире. Промышленное культивирование грибов в настоящее время налажено во многих странах. Однако,

«классический» способ выращивания грибов на твёрдом субстрате в виде плодовых тел имеет ряд существенных недостатков. Процесс выращивания плодовых тел сложно контролировать, субстрат требует серьёзной подготовки, а само культивирование занимает довольно длительное время - до нескольких недель. К тому же, если выращиваемый гриб рассматривается в качестве источника внеклеточных БАВ, возникают сложности при выделении целевого продукта.

Культивирование грибов в объёме жидкой фазы (глубинное культивирование) лишено этих недостатков и позволяет получить грибную биомассу, по своим свойствам не уступающую плодовым телам. Процесс глубинного культивирования относительно короткий по времени, а использование специального оборудования позволяет контролировать процесс и поддерживать условия культивирования на заданном уровне. Нативный раствор культуральной жидкости грибов содержит в себе большое количество биологически-активных веществ, и работа с ним значительно облегчает возможность их получения и выделения.

В свою очередь, на морфологию и развитие гриба в процессе глубинного роста влияют многочисленные факторы - состав среды, температура, рН, посевной материал и др. Все эти факторы в сочетании и по отдельности также непосредственно отражаются на производстве и экскреции грибных метаболитов.

Влияние на морфологию выращиваемого гриба оказывает тип исользуемого штамма. От морфологических особенностей роста сильно зависит реологическая обстановка в биореакторе, влияющая на синтез метаболитов [11]. Так, например, при культивировании трёх различных штаммов А. о^ае в одних и тех же условиях наблюдалась различная морфология роста, варьирующиеся от дисперсного мицелия до пеллет [12].

Одним из основных факторов, влияющих на процесс глубинного культивирования, является концентрация и тип источника углерода. Грибы обладают сложной ферментативной системой, что открывает широкие возможности для использования различных углеродсодержащих субстратов.

Результаты многолетних исследований показали, что в качестве таких субстратов могут успешно выступать различные богатые сахарами отходы, получаемые при переработке фруктов, сахарной свёклы, овощей кукурузы, молока и других сельскохозяйственных продуктов [13].

Р. Сакамото с соавторами показали эффективность выращивания Pleurotus ostreatus и Lentinus edodes на средах с высоким (7-10%) содержанием крахмала.

В качестве субстрата могут успешно применяться и неуглеводные источники углерода, например, алифатические спирты, п-алканы, органические кислоты и др. Так, выход мицелия Pleurotus ostreatus на среде, содержащей 2% этанола, составляет 10,5 г/л через 72 ч культивированиях [13].

В качестве источников углерода могут выступать и различные сахара, такие как сахароза, глюкоза, ксилоза и др. Влияние концентрации сахарозы на морфологию роста A. niger изучалась Яуоо [14]. Было отмечено, что фрактальная величина мицелия и средний диаметр пеллет снижались с увеличением концентрации сахарозы в среде. Исследования Синха и др. [15] о влиянии концентрации сахарозы на морфологию Paecilomyces japonicus, наоборот, показали, что пеллеты увеличиваются в размере при повышении начальной концентрации сахарозы с 20 г/л до 60 г/л. Однако, при начальной концентрации субстрата 80 г/л образование пеллет не наблюдалось, а вся грибная популяция характеризовалось нитчатым ростом. Эль БпвИау и др. [16] изучали влияние различных источников углерода на морфологию A. niger в биореакторе с мешалкой. В среде на глюкозе и ксилозе в основном наблюдался рост нитевидной форме с небольшими пеллетами, не превышающими 400 мкм в диаметре. С другой стороны, рост на фруктозе, в основном, проходил в форме пеллет.

Влияние различных источников углерода на рост биомассы изучалось также у культуры гриба Coprinus comatus. В качестве субстрата использовали глюкозу, фруктозу и сахарозу. Результаты показали, что наилучшим источником углерода для глубинного роста Coprinus comatus является глюкоза [17].

Для нормального роста гриба также важен выбор источника азота. Грибы могут использовать как органические, так и неорганические источники азота. Основными источниками неорганического азота являются аммонийные соли и нитраты. Из органических источников обычно используются мочевина и аминокислоты [13].

Feifei Wang и соавторы проводили оптимизацию условий глубинного культивирования для роста мицелия и производства внеклеточных полисахаридов Coriolus versiolor. В качестве наиболее подходящих источников глюкозы и азота ими были выбраны соответственно глюкоза и дрожжевой экстракт. Концентрация глюкозы и дрожжевого экстракта были оптимизированы и, в конечном итоге, составили 30 г/л и 7,0 г/л соответственно. При оптимальных условиях культивирования, максимальный выход мицелия в пятилитровом биореакторе с мешалкой составил 8,55 г/л, что соответствовало повышению выхода на 39,42% по сравнению с исходными результатами [18].

Т. А. Пучкова и соавторы изучали влияние состава питательной среды на рост и выделение биологически-активных веществ грибами рода Cordyceps -C. sinensis и C. militaris. Исследования показали, что в качестве источников углерода более предпочтительными оказались глюкоза, крахмал, лактоза и мальтоза, среди источников азота - пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты. Однако, наиболее высокий выход биомассы исследуемых грибов (23,0-26,0 г/л) получен при использовании комплексной питательной среды на основе соевой муки и мелассы [19].

Изучалось влияние состава среды на глубинный рост гриба Xylaria sp. Были использованы четыре вида питательных сред бульоне с солодовым экстрактом, бульоне с картофельной декстрозой и дрожжевым экстрактом, бульоном с картофельной декстрозой и базальной. Максимальный выход биомассы (1,5 г/л) наблюдался на бульоне из картофельной декстрозы [20].

Du и др. [21] изучали влияние различных источников азота на морфологию роста и производства антибиотиков Р. chinesis. Было отмечено, что самый высокий уровень производства антибиотика, сопровождающийся ростом пеллет,

был достигнут на среде, содержащей кукурузный ликёр. Рост пеллет наблюдался также в среде с использованием сульфата аммония, однако пеллеты отличались структорой и размером. Рост был в форме дисперсного мицелия, когда среда содержала пептон, и в виде запутанных нитей, когда среда содержала дрожжевой экстракт. Не только тип источника азота влияет на морфологию роста, но и его концентрация. Бай и др. [22] изучали влияние аммиачной селитры на морфологию роста R. oryzae. Повышение концентрации нитрата аммония в питательной среде одновременно увеличало конечную концентрацию биомассы. Исследование показало изменение грибной морфологии от нитевидной к пеллетам при добавлении нитрата аммония к питательной среде. Дальнейшие исследования показали, что увеличение концентрации нитрата аммония вызывало увеличение грибных пеллет в размерах, но приводило к уменьшению плотности и количества на единицу объема.

M. L. Lomberh и соавторы [23] исследовали глубинное культивирование лекарственных грибов. В качестве источников углерода и азота выступали декстроза и пептон.

На рост и развитие гриба значительное влияние оказывает аэрация среды. Кислород является наименее растворимым в воде субстратом, и его концентрация во многом определяет скорость процессов, происходящих в культуральной среде.

Тан и Чжун [24] изучали влияние подачи кислорода на рост и производство полисахаридов и ганодеровой кислоты (ГК) из Ganoderma lucidum, в интервале начальных значений коэффициента объемного переноса кислорода (KLa) от 16,4 до 96,0 ч-1. С точки зрения производства биомассы и внутриклеточных полисахаридов, лучший начальный KLa - 78,2 ч-1, который обеспечивает концентрацию биомассы 15,6 г/л, выход внутриклеточных полисахаридов 2,19 г/л.Увеличение первоначального KLa до 96,0 ч-1 приводило к образованию более крупных мицелиальных агрегатов. Это увеличение начального KLa также максимизировало выход и производительность ГК, которые были в 1,8 раза больше, чем значения, полученные при начальном KLa 16,4 ч-1.

Мао и Чжун [25] исследовали влияние подачи кислорода на производство антибиотика кордицепина при глубинном культивировании Cordyceps militaris в 5-литровом биореакторе с турбинной мешалкой. Начальные значения KLa значительно влияли на производство кордицепина в диапазоне от 11,5 до 113,8 ч-1. Самая высокая концентрация кордицепина 168 мг/л была получена при начальном значении KLa 54,5 ч-1.

1.3 Гидрофобины. Общая характеристика

Гидрофобины - семейство небольших, богатых цистеином белков, содержащих около 100 аминокислотных остатков. Название «гидрофобины» возникло из-за обилия гидрофобных аминокислот в составе белков [26]. Гидрофобины встречаются исключительно в мицелиальных грибах. Эти белки и кодирующие их гены были выделены из аскомицетов и базидиомицетов [27] . Некоторые данные указывают на то, что гидрофобины встречаются в зигомицетах и, возможно, хитридиомицетах [28].

Гидрофобины были открыты при поиске генов, экспрессирующихся при формировании воздушных гиф на мицелии Schizophyllum commune.

В настоящее время большая часть гидрофобинов известна только как последовательность генов, а их важная роль в росте и развитии грибов главным образом объясняется, основываясь на мутагенезе (удаление или разрушение гена). Лишь немногие гидрофобины выделены и изучены на молекулярном уровне.

Гидрофобины выполняют широкий спектр функций в росте и развитии гриба. При этом они обладают своеобразными поверхностно-активными и биофизическими свойствами. Они способны к спонтанной самосборке на границе гидрофобной и гидрофильной фаз с образованием амфипатической мембраны, которая придаёт воздушным гифам и спорам водоотталкивающие свойства.

Биофизические свойства гидрофобинов объясняется их структурной специфичностью, а не специфичностью их аминокислотной последовательности. Последовательность аминокислот гидрофобинов весьма разнообразна, но все они

имеют восемь остатков цистеина, в том числе 2 пары смежных остатков цистеина, образующих 4 дисульфидных мостика.

Распределение цистеина и кластеризация гидрофильных и гидрофобных остатков позволяет сгруппировать гидрофобины в 2 класса, I и II. Агрегаты, образованные этими двумя классами, можно различить, основываясь на их растворимости и морфологии.

Гены гидрофобинов I класса были выделены из аскомицетов и базидиомицетов, в то время как гены, кодирующие гидрофобины II класса, не были идентифицированы в базидиомицетах.

Мембрана, образуемая гидрофобинами I класса, обладает крайне низкой растворимостью (даже в 2% растворе БББ при 100°С) и может быть диссоциирована только высококонцентрированными кислотами (такими как муравьиная кислота или чистая трифторуксусная кислота). Комплексы, образованные гидрофобинами II класса, менее стабильны, и могут быть легко растворены в 60% этаноле или 2% растворе БББ. Большая часть гидрофобинов I класса образует микроскопически идентифицируемые палочковые структуры на внешней стороне клеточной стенки [29-31]. Гидрофобины II класса образуют комплексы, которые не имеют определённой палочковой морфологии и могут быть растворены в детергентах и спиртовых растворах. Несмотря на эти морфологические различия, очевидного различия между функциями гидрофобинов I и II класса в жизненном цикле грибов пока ещё не выявлено.

1.4 Структура и свойства гидрофобинов 1.4.1 Структура гидрофобинов

Гидрофобины I и II класса состоят из около 100 аминокислотных остатков, имеют характерную гидропатичную структуру и содержат восемь постоянных цистеиновых остатков [27, 32], которые образуют межмолекулярные дисульфидные мостики [28, 33]. При этом второй и третий, шестой и седьмой цистеиновые остатки всегда смежные. Гидрофобины II класса обычно меньше,

чем белки I класса, и обнаруживают существенно больше схожих друг с другом последовательностей. Длина полипептидных участков между цистеинами 3 и 4 (петля цис3-цис4) и между цистеинами 4 и 5 (петля цис4-цис5) полностью сохраняется у гидрофобинов II класса. Длина других межцистеиновых участков также обычно постоянна. У гидрофобинов I класса, наоборот, наблюдается намного большее варьирование последовательностей [34].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Колесников Борис Алексеевич, 2018 год

Список оборудования

1 - Ёмкость 7 - Ёмкость 13 - Ротационный испаритель

2 - Колбы Эрленмейера 8 - Сушильный шкаф 14 - Сушильный шкаф

3 - Качалка 9 - Ёмкость 15 - Флаконы

4 - Центрифуга 10 - Ротационный испаритель 16 - Ультрафильтрационная установка

5 - Ёмкость 11 - Ёмкость 17 - Сублимационная сушка

6 - Центрифуга 12 - Центрифуга 18 - Флаконы

1

Технологический процесс получения гидрофобина и молокосвёртывающего фермента из культуры Coprinus lagopides состоит из следующих основных стадий:

I. Поддержание и выращивание исходной культуры

II. Подготовка питательной среды

III. Подготовка посевного материала

IV. Глубинное культивирование культуры продуцента Coprinus lagopides

V. Отделение биомассы от нативного раствора культуральной жидкости

VI. Ультрафильтрация нативного раствора культуральной жидкости

VII. Лиофильная сушка полученного концентрата

VIII. Измельчение и упаковка препарата молокосвёртывающего фермента

IX. Экстракция примесей из биомассы 1% раствором БББ

X. Отделение биомассы от экстрагента

XI. Промывка и сушка биомассы

XII. Обработка биомассы 99% ТФУ

XIII. Выпаривание ТФУ

XIV. Спиртовая экстракция гидрофобинов из биомассы

XV. Отделение спиртового раствора от биомассы

XVI. Выпаривание этанола и сушка

XVII. Измельчение и упаковка препарата гидрофобина

I. Поддержание и выращивание исходной культуры Исходная культура Coprinus lagopides хранится в пробирках со скошенным сусло-агаром (4° по Баллингу) и поддерживается периодическими пересевами. Частота пересевов - раз в два месяца. Инкубация культуры проводится при температуре 28-30°С в течение 7-10 дней (до полного зарастания поверхности агара), после чего штамм хранится в холодильнике при температуре +4 °С.

II. Подготовка питательной среды В отдельной посуде суспендируют 15 г глюкозы, 4 г пептона, 0,6 мг КН2РО4, 0,4 мг К2НРО4, 0,5 мг МgSO4 , 0,001 мг 7и804 X 7Н20 , 0,005 мг Бе804 X 7Н202 0,05 мг СаС12, 0,5 мг КаС1, 2 г дрожжевого экстракта в 1 л водопроводной воды. Перемешивание продолжают до получения гомогенной массы. рН полученного раствора доводят до 5,8 - 6,0 ед. Стерилизацию сред проводят в автоклавах при 0,5 атм. в течение 30 минут.

III. Подготовка посевного материала

Посевной материал для глубинного процесса получают в два этапа. На первом этапе культуру Coprinus lagopides выращивают в пробирках на сусло-агаре при температуре 28-30°С в течение 7-10 дней. На следующем этапе 2-3 кусочек мицелия (размером около 50 мм2) пересевают с агаризованной среды в плоскодонные колбы объёмом 0,5 л со 150 мл среды. На дно колб насыпают стеклянные или керамические бусы диаметром 7-10 мм. Посевной материал выращивают в стационарных условиях при температуре 28-30 °С в течение 7-10 дней до полного зарастания поверхности среды пленкой мицелия.

Выросший поверхностный способом посевной материал измельчают с помощью стеклянных бус при встряхивании колб на качалке. Полученную суспензию используют в качестве посевного материала на стадии ферментации.

IV. Глубинное культивирование культуры продуцента Coprinus lagopides

В стерильных условиях 10 мл измельченного посевного материала вносят в колбы Эрленмейера с питательной средой объёмом 100 мл. Далее засеянные колбы Эрленмейера ставят на качалку (230 об/мин) при 28-30°С и проводят глубинное культивирование в течение 7 дней.

V. Отделение биомассы от нативного раствора культуральной жидкости Биомассу гриба отделяют от нативного раствора культуральной жидкости

путём центрифугирования при 4100 х g в течение 10 минут.

VI. Ультрафильтрация нативного раствора культуральной жидкости

Для концентрирования и очистки раствора от низкомолекулярных примесей используют метод ультрафильтрации.

Процесс ультрафильтрации проводят в ячейке непроточного типа марки «ФК 01-1000» с ультрафильтрационной мембраной «МИФИЛ-ПА-20», для создания избыточного давления используют компрессор УК25-1.6П.

Процесс ультрафильтрации проводят при рабочем давлении 0.23 МПа, культуральный фильтрат при этом концентрируют в 3.7раза.

VII. Лиофильная сушка полученного концентрата

Полученный культуральный фильтрат с целью сохранения ферментативной активности препарата подвергают лиофильной сушке.

VIII. Измельчение и упаковка препарата молокосвёртывающего фермента Полученный в результате лиофильной сушки препарат измельчают на

измельчителе и упаковывают в стеклянные флаконы с резиновой пробкой.

IX. Экстракция примесей из биомассы 1% раствором SDS

Для более полной очистки гидрофобинов проводят экстрагирование примесей из биомассы. Биомассу гриба, отделённую от нативного раствора культуральной жидкости, выдерживают в кипящем растворе трис-НС1 буфера (рН

X. Отделение биомассы от экстрагента

По окончании процесса экстракции биомассу отделяют от экстрагента путём центрифугирования при 4100 х g в течение 10 минут.

XI. Промывка и сушка биомассы

Биомассу промывают дистиллированной водой с целью удаления остатков экстрагента и высушивают в сушильном шкафу при температуре 50 °С.

XII. Обработка биомассы 99% ТФУ

Для разрушения агломератов, образуемых гидрофобинами, биомассу обрабатывают 99% ТФУ в течение 1 часа.

XIII. Выпаривание ТФУ

После завершения обработки биомассы раствор ТФУ выпаривают на роторном испарителе при температуре 20 °С.

XIV. Спиртовая экстракция гидрофобинов из биомассы

Экстракцию гидрофобинов из биомассы проводили с помощью 60% этилового спирта при комнатной температуре в течение 1 часа.

XV. Отделение спиртового раствора от биомассы

По окончании экстракции этиловый спирт отделяют от биомассы на центрифуге при 4100 х g.

XVI. Выпаривание этанола и сушка

Этиловый спирт из полученного раствора удаляют путём выпаривания на роторном испарителе при температуре 40 °С. Оставшийся водный раствор высушивают в сушильном шкафу при температуре 50 °С. Перегнанный этиловый спирт возможно повторно использовать повторно на данной стадии.

XVII. Измельчение и упаковка препарата гидрофобина

Полученный сухой препарат измельчают на измельчителе и упаковывают в стеклянные флаконы с резиновой пробкой.

РАЗДЕЛ VI

Переработка и обезвреживание отходов производства

ТФУ после перегонки на роторном испарителе возможно повторно использовать для обработки биомассы и разрушения агломератов гидрофобинов.

Этанол, остающийся после перегонки на роторном испарителе, возможно повторно использовать для растворения гидрофобинов.

РАЗДЕЛ VII

Контроль производства и управление технологическим процессом

Стерилизацию стеклянной посуды и питательных сред проводят в автоклавах при 1,0 атм. и 0,5 атм. в течение 1 и 0,5 часа, соответственно.

Поддержание, выращивание исходной культуры, подготовку посевного материала и перенесение его в колбы Эрленмейра проводят в стерильных условиях.

Глубинное культивирование осуществляют в колбах Эрленмейра объемом 0,75 л со 100 мл среды на качалке (230 об/мин) при 28-30°С в течение 7 дней. Культуральная среда после глубинного культивирования представляет собой прозрачную светло-жёлтую жидкость, в которой содержится выращенная биомасса гриба в виде пеллет.

Ультрафильтрацию нативного раствора культуральной жидкости проводят при давлении 0,23 МПа.

В нативном растворе культуральной жидкости, а также в культуральной фильтрате и сухом препарате молокосвёртывающего фермента определяется

содержание белка по методу Лоури [1] и величина молокосвёртывающей активности по методу Каваи-Мукаи [2].

Конечный продукт молокосвёртывающего фермента представляет собой сухой белый порошок.

Центрифугирование культуральной жидкости, раствора БББ со взвесью биомассы, а также спиртового раствора гидрофобина со взвесью биомассы и нерастворимых в спирте компонентов проводят при 4100 х g.

Выпаривание этилового спирта на роторном испарителе проводят при температуре 40 °С.

Выпаривание этилового спирта на роторном испарителе проводят при температуре 20 °С.

По окончании экстракции гидрофобина, а также после его очистки методом ВЭЖХ осуществляется контроль содержания белка по методу Лоури [1].

Конечный продукт гидрофобина представляет собой сухой белый порошок.

145

РАЗДЕЛ VIII Материальный баланс

Общие требования к безопасному ведению технологического процесса должны обеспечиваться в соответствии со стандартами системы безопасности труда (ССБТ), «Правилами техники безопасности при эксплуатации электроустановок потребителей (ПТБ), «Санитарными правилами организации технологических процессов и гигиеническими требованиями к производственному оборудованию» (СанПин 11-04-74), «Санитарными нормами микроклимата производственных помещений» (СанПин №11-13-94), «Перечнем регламентированных в воздухе рабочей зоны вредных веществ» (СанПин №11-19940).

Персонал допускается к работе только в спецодежде. Технологический процесс производственный персонал обязан вести в соответствии с действующим регламентом. Необходимо знать специфические свойства применяемых веществ и соблюдать установленные правила работы с ними.

Помещения опытно-производственной лаборатории обеспечиваются первичными средствами пожаротушения согласно действующим нормам. Все работники должны уметь пользоваться средствами пожаротушения и уметь оказывать первую помощь при несчастном случае.

Не допускается загромождения рабочих мест, проходов, выходов из помещений и здания, доступа к противопожарному оборудованию.

РАЗДЕЛ X Перечень производственных инструкций

- по эксплуатации и технике безопасности при работе с автоклавом;

- технологическая инструкция при работе в боксе;

- по эксплуатации и технике безопасности при работе с центрифугой;

- по эксплуатации и технике безопасности при работе с сушильным шкафом;

- по эксплуатации и технике безопасности при работе с роторным испарителем;

- по пожарной безопасности в лаборатории;

- план локализации аварийных ситуаций и аварий.

1. Oliver H. Lowry, Nira J. Rosebrough, A. Lewis Farr and Rose J. Randall. PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT. The Journal of Biological Chemistry. - 1951, 193:265-275.

2. Kawai M., Mukai N. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes.I. Screening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes//Agr. Biol. Chem. -1970. -Vol. 34,N2.-P. 159-163.

Препарат представляет собой сухой белый порошок, полученный из культуры гриба Trichoderma viride, основной составляющей которого (99%) составляет белок гидрофобин. Гидрофобин - низкомолекулярный белок с молекулярной массой около 14 кДа.

Препарат можно использовать в качестве стабилизатора пищевых пен и эмульсий. Также возможно его использование для модификации поверхности и изменения её гидрофильных или гидрофобных свойств. Действие препарата основано на его высокой поверхностной активности и способности самособираться в амфипатическую мембрану на границе раздела фаз.

ВР - 1.1. Хранение и воспроизводство исходной культуры

ТП - 1.1. Подготовка посевного материала

Посевной материал

Штамм-продуцент

Ферментация

Вода водопроводная Пептон

Дрожжевой экстракт Глюкоза

Неорганические соли

ВР 1.2.1. Приготовление ферментационной среды

ВР 1.2.2. Стерилизация ферментационной среды

Культуральная жидкость

ТП- 1.3. Отделение биомассы от культуральной жидкости

нативный раствор биомасса,

нерастворимый осадок

I

на ТП-2

I

на ТП-3

Нативный раствор

ТП-2.1 Вспенивание раствора

I

ТП-2.2 Механическое отделение пены

ТП-2.3 Растворение пены в спирте -70% этанол

ТП-2.4 Центрифугирование-► нерастворимый в спирте осадок

ТП-2.5 Выпаривание спирта-► этанол

ТП-2.6 Сушка

ТП-2.7 Ионоо

бменная хроматография

ТП-2.8 Эксклюзионная хроматография

ТП-2.9 Сушка и измельчение

Препарат гидрофобина

I

ТП-3.1 Ультразвуковое разрушение клеточной стенки

I

ТП-3.2 Отделение внутриклеточной -► биомасса

жидкости

ТП-3.3 Вспенивание жидкости 1

ТП-3.4 Механическое отделение пены

ТП-3.5 Растворение пены в спирте -70% этанол

о

ТП-3.6 Центрифугирование-► нерастворимый в спирте осадок

р

ТП-3.7 Выпаривание спирта-► этанол

ТП-3.8 Сушка

ТП-3.9 Ионообменная хроматография

ТП-4.0 Эксклюзионная хроматография

ТП-4.1 Сушка и измельчение

Препарат гидрофобина

ХАРАКТЕРИСТИКА ИСХОДНОГО СЫРЬЯ, ХИМИКАТОВ, МАТЕРИАЛОВ И ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Таблица 1.

Требования к качеству применяемых в производстве сырья, химикатов и материалов

№№ пп Наименование сырья и материалов Обозначение действующей нормативно-технической документации Сорт или марка Примечание

1 2 3 4 5

А. Сырье и химикаты

1 Вода питьевая

2 Глюкоза ГОСТ 975-88 б/в

3 Железо сернокислое (||) 7/в ГОСТ 4148-78 Зеленовато-голубые кристаллы, растворимые в воде, нерастворимые в спирте

4 Калий фосфорнокислый однозамещённый ГОСТ 4198-75 Не менее 99,5%

5 Калий фосфорнокислый двузамещённый, 3/в ГОСТ 2493-75 Белый кристаллический порошок, растворимый в воде

5 Кальций хлористый ТУ 6-09-4711-81 Бесцветные кристаллы

6 Магний сернокислый 7/в ГОСТ 4523-77 Белый кристаллический порошок, растворимый в воде; на воздухе выветривается

7 Натрий хлористый ГОСТ 4233-77 Не менее 99,9%

8 Цинк сернокислый 7/в ГОСТ 4174-77 Белый

кристаллический порошок или кристаллы, выветривающиеся в сухом воздухе, растворимый в воде, нерастворимый в спирте

9 Этиловый спирт, пищевой ГОСТ 18300-72 Содержание этанола - 95-96%

10 Экстракт дрожжевой ТУ 9385-007-39484474-03, НИЦФ-041110

ОПИСАНИЕ АППАРАТУРНОЙ СХЕМЫ И СПЕЦИФИКАЦИЯ ОБОРУДОВАНИЯ

Аппаратурная схема получения препаратов гидрофобина и спецификация оборудования представлена на рис. 1.

Полученную питательную среду в ёмкости 1 (рис. 1.) разливают по колбам Эрленмейра и стерилизуют в автоклаве 2. После стерилизации в них производят засев культуры Trichoderma viride в стерильном боксе 3 и ставят на качалку 4. Культивирование гриба Trichoderma viride продолжается в течение 3 дней, после чего биомассу гриба отделяют от нативного раствора с помощью центрифуги 5. Биомассу гриба подвергают воздействию ультразвука на ультразвуковом дезинтеграторе 6 с целью разрушения клеточной стенки и измельчают 7. Выделившуюся внутриклеточную жидкость отделяют от биомассы на центрифуге 5. Дальнейшее выделение выделение гидрофобинов из внутриклеточной жидкости и нативного раствора проводят по одинаковой схеме. Нативный раствор и внутриклеточную жидкость вспенивают в аппарате 8, после чего механически отделяют пену 9. Пену растворяют в 70% этаноле 10, затем отделяют нерастворимый в спирте осадок на центрифуге 5. Этиловый спирт из раствора выпаривают на роторном испарителе 11 при 40 °С. Оставшийся после выпаривания спирта раствор высушивают в сушильном шкафу 12 при температуре 50 °С. Полученный препарат очищают методом ионообменной хроматографии на колонке 13 и последующей эксклюзионной хроматографии на колонке 14. Фракцию, содержащую гидрофобин, высушивают в сушильном шкафу 12, и измельчают полученный сухой препарат в измельчителе 15. Сухой препарат упаковывают в стекляные флаконы из расчёта 1г препарата на флакон и закрывают резиновой пробкой.

2

15

14

13 12

6

7

Г Л

V у

8

Список оборудования

5

1

1 - Ёмкость 7 - Аэратор 12 - Колонка для ионообменной хроматографии

2 - Колбы Эрленмейера 8 - Ёмкость

3 - Качалка 9 - Центрифуга 13 - Колонка для эксклюзионной хроматографии

4 - Центрифуга 10 - Ротационный испаритель

5 - Ультразвуковой дезинтегратор 11 - Сушильный шкаф 14 - Сушильный шкаф

6 - Центрифуга 15 - Флаконы

Технологический процесс получения гидрофобина из культуры Trichoderma viride состоит из следующих основных стадий:

I. Поддержание и выращивание исходной культуры

II. Подготовка питательной среды

III. Подготовка посевного материала

IV. Глубинное культивирование культуры продуцента Trichoderma viride

V. Отделение биомассы от нативного раствора культуральной жидкости

VI. Выделение внутриклеточной жидкости из биомассы

VII. Вспенивание внутриклеточной жидкости и нативного раствора

VIII. Растворение пены в этаноле

IX. Отделение нерастворимых в этаноле компонентов

X. Выпаривание этанола и сушка

XI. Ионообменная хроматография

XII. Эксклюзионная хроматография

XIII. Измельчение, сушка и упаковка

I. Поддержание и выращивание исходной культуры Исходная культура - Trichoderma viride хранится в пробирках со скошенным сусло-агаром (4° по Баллингу) и поддерживается периодическими пересевами. Частота пересевов - раз в два месяца. Инкубация культуры проводится при температуре 28-30°С в течение 7-10 дней (до полного зарастания поверхности агара), после чего штамм хранится в холодильнике при температуре +4 °С.

II. Подготовка питательной среды

В отдельной посуде суспендируют 15 г глюкозы, 4 г пептона, 0,6 мг КН2РО4, 0,4 мг К2НРО4, 0,5 мг MgSO4 , 0,001 мг ZnSO4 X 7H2O , 0,005 мг FeSO4 X 7H2O, 0,05 мг CaCl2, 0,5 мг NaCl, 2 г дрожжевого экстракта в 1 л водопроводной воды. Перемешивание продолжают до получения гомогенной массы. рН полученного раствора доводят до 5,8 - 6,0 ед. Стерилизацию сред проводят в автоклавах при 0,5 атм. в течение 30 минут.

III. Подготовка посевного материала

Посевной материал для глубинного процесса получают в два этапа. На первом этапе культуру Trichoderma viride выращивают в пробирках на сусло-агаре при температуре 28-30°С в течение 7-10 дней. На следующем этапе 2-3 кусочек мицелия (размером около 50 мм2) пересевают с агаризованной среды в плоскодонные колбы объёмом 0,5 л со 150 мл среды. На дно колб насыпают стеклянные или керамические бусы диаметром 7-10 мм. Посевной материал выращивают в стационарных условиях при температуре 28-30°С в течение 7-10 дней до полного зарастания поверхности среды пленкой мицелия.

Выросший поверхностный способом посевной материал измельчают с помощью стеклянных бус при встряхивании колб на качалке. Полученную суспензию используют в качестве посевного материала на стадии ферментации.

IV. Глубинное культивирование культуры продуцента Trichoderma viride

В стерильных условиях 10 мл измельченного посевного материала вносят в колбы Эрленмейра с питательной средой объёмом 100 мл. Далее засеянные колбы Эрленмейра ставят на качалку (230 об/мин) при 28-30°С и проводят глубинное культивирование в течение 3 дней.

V. Отделение биомассы от нативного раствора культуральной жидкости Биомассу гриба отделяют от нативного раствора культуральной жидкости

путём центрифугирования при 4200 х g в течение 10 минут.

VI. Выделение внутриклеточной жидкости из биомассы

Биомассу гриба подвергают воздействию ультразвука в течение 10 минут с целью разрушения клеточной стенки и выделения внутриклеточной жидкости. Полученную в результате суспензию центрифугируют при 4200 х g в течение 15 минут, после чего отделяют внутриклеточную жидкость от биомассы.

VII. Вспенивание внутриклеточной жидкости и нативного раствора Внутриклеточную жидкость и нативный раствор вспенивают путем

пропускания воздуха под давлением через жидкость. Для подачи воздуха используется компрессор. Образовавшуюся пену отделяют механически.

VIII. Растворение пены в этаноле

Собранную пену растворяют в 70% этаноле из расчёта конечного получения 60% раствора этанола.

IX. Отделение нерастворимых в этаноле компонентов

Полученный раствор этанола со взвесью нерастворимой в этиловом спирте субстанции подвергают центрифугированию при 4200 х g в течение 15 минут. Далее спиртовой раствор отделяют от осадка.

X. Выпаривание этанола и сушка

Этиловый спирт из полученного раствора удаляют путём выпаривания на роторном испарителе при температуре 40 °С. Оставшийся водный раствор высушивают в сушильном шкафу при температуре 50 °С. Содержание гидрофобинов в сухом порошке составляет 30%. Перегнанный этиловый спирт используется повторно на стадии VIII (растворение пены в этаноле).

XI. Ионообменная хроматография

Дальнейшую очистку гидрофобина проводят путём ионообменной хроматографии. Для проведения хроматографии используют стеклянную колонку размером 170 х 17 мм. В качестве сорбента используется гидрофобный сорбент Сфероцелл С-80 (размер пор 80-125 мкм). Объём сорбента - 30 мл, объём пробы -0.5 м. Колонку уравновешивают 0,1М ТпБ/НС1-буфером, рН 7,7. Элюирование осуществляют этиловым спиртом в градиенте концентраций от 5 до 70%. Выход гидрофобина с колонки происходит с фракцией, содержащей 10 % спирта. Чистота полученного в результате проведения хроматографии продукта составляет 80%.

XII. Эксклюзионная хроматография

Конечную очистку белка проводили методом эксклюзионной хроматографии. Для проведения хроматографии используют стеклянную колонку размером 590 х 10 мм. В качестве сорбента используют Сефадекс 0-75. Объём сорбента - 38 мл, объём пробы - 200 мкл. Колонка уравновешивается 1% водным раствором этилового спирта. Скорость протока - 0,08 мл/мин. Чистота полученного в результате проведения хроматографии продукта составляет 99%.

XIII. Сушка, измельчение и упаковка

Фракцию, содержащую гидрофобин, сушат в сушильном шкафу при температуре 50 °С. Полученный сухой препарат измельчают на измельчителе и упаковывают в стеклянные флаконы с резиновой пробкой.

РАЗДЕЛ VI

Переработка и обезвреживание отходов производства

Этанол, остающийся после перегонки на роторном испарителе, возможно повторно использовать для растворения пены.

Контроль производства и управление технологическим процессом

Стерилизацию стеклянной посуды и питательных сред проводят в автоклавах при 1,0 атм. и 0,5 атм. в течение 1 и 0,5 часа, соответственно.

Поддержание, выращивание исходной культуры, подготовку посевного материала и перенесение его в колбы Эрленмейра проводят в стерильных условиях.

Глубинное культивирование осуществляют в колбах Эрленмейра объемом 0,75 л со 100 мл среды на качалке (230 об/мин) при 28-30°С в течение 4 дней. Культуральная среда после глубинного культивирования представляет собой прозрачную светло-жёлтую жидкость, в которой содержится выращенная биомасса гриба в виде пеллет.

Центрифугирование культуральной жидкости, а также спиртового раствора гидрофобина со взвесью нерастворимых в спирте компонентов проводят при 4200 х Е.

Выпаривание этилового спирта на роторном испарителе проводят при температуре 40 °С.

После стадий сушки экстракта, ионообменной и эксклюзионной хроматографии осуществляется контроль содержания белка по методу Лоури [1].

Конечный продукт представляет собой сухой белый порошок.

163

РАЗДЕЛ VIII Материальный баланс

Общие требования к безопасному ведению технологического процесса должны обеспечиваться в соответствии со стандартами системы безопасности труда (ССБТ), «Правилами техники безопасности при эксплуатации электроустановок потребителей (ПТБ), «Санитарными правилами организации технологических процессов и гигиеническими требованиями к производственному оборудованию» (СанПин 11-04-74), «Санитарными нормами микроклимата производственных помещений» (СанПин №11-13-94), «Перечнем регламентированных в воздухе рабочей зоны вредных веществ» (СанПин №11-19940).

Персонал допускается к работе только в спецодежде. Технологический процесс производственный персонал обязан вести в соответствии с действующим регламентом. Необходимо знать специфические свойства применяемых веществ и соблюдать установленные правила работы с ними.

Помещения опытно-производственной лаборатории обеспечиваются первичными средствами пожаротушения согласно действующим нормам. Все работники должны уметь пользоваться средствами пожаротушения и уметь оказывать первую помощь при несчастном случае.

Не допускается загромождения рабочих мест, проходов, выходов из помещений и здания, доступа к противопожарному оборудованию.

165

РАЗДЕЛ X Перечень производственных инструкций

- по эксплуатации и технике безопасности при работе с автоклавом;

- технологическая инструкция при работе в боксе;

- по эксплуатации и технике безопасности при работе с центрифугой;

- по эксплуатации и технике безопасности при работе с сушильным шкафом;

- по эксплуатации и технике безопасности при работе с роторным испарителем;

- по пожарной безопасности в лаборатории;

- план локализации аварийных ситуаций и аварий.

1. Oliver H. Lowry, Nira J. Rosebrough, A. Lewis Farr and Rose J. Randall. PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT. The Journal of Biological Chemistry. - 1951, 193:265-275.

Утверждаю Исполнительный директор

ООО «РОСБИО» Фахрутдинов А. М.

АКТ

опытно-промышленных испытаний

1. В ходе опытно-промышленных испытаний в качестве продуцента молокосвёртывающего фермента был использован штамм Соргтш \ctgopides.

2. Ферментационная среда имела следующий состав:

глюкоза - 17,5 г/л, пептон - 4 г/л, КН:Р04 - 0.6; К2НР<Х, - 0.4; СаС12 - 0.05; №С1 - 0.5; дрожжевой экстракт - 2.0 (по сухому весу); рН среды до стерилизации - 5.8-6.0.

3. Культура гриба выращивалась в ферментационной установке объёмом

4. Для очистки и концентрирования молокосвёртывающего фермента использовали следующее оборудование: фильтр-пресс В9-ВФС/423-56, ультрафильтрационная установка, установка для лиофильной сушки.

5. Молокосвёртывающую активность (МСА) препарата на различных этапах очистки определяли с помощью метода Каваи-Мукаи.

6. Определение общей протеолитической активности (ПА) препарата на различных этапах очистки проводили в соответствии со стандартным методом, рекомендованным ГОСТом «20264.2 - 88»

16 м3.

7. Результаты опытов представлены в таблице:

Стадии очистки и концентрирова ния Объем V, мл Масса М, г* Белок, мг/мл мг/г* Молокосвертывающая активность МСА/ПА Выход МСА, %

Е/мл Е/г* У*Е/мл М*Е/г* Е/мг

исходный КФ 800 1,26±0.05 20.2±0.2 16160 16.0±0,3 610:1 100

ультрафильтрат 230 0.90^0.04 61.2—0.2 14076 68.0±0.3 910:1 87.1

сухой у л ьтраф и л ьтрат 8,8* 24,65± 0.08* 14б!± 7* 12857* 59.3±0.4 840:1 79.6

8. В результате опытов установлено:

1) Ферментный препарат, полученный из гриба Coprinus lagopides, обладает высоким уровнем молокосвёртывающей активности;

2) Ферментный препарат обладает низким уровнем общей протеолитической активности;

3) Предложенный для производства препарата способ позволяет получить сухой препарат фермента, обладающий МСА = 59.3 Е/мг и имеющий соотношение МСА/ПА = 840:1.

Зам. директора по научной работе, д.т.н.

Инженер-биотехнолог

От СПбГТИ(ТУ)

Ассистент

Доцент

Утверждаю Исполнительный директор г! И ООО «РОСБИО»

Фахрутдинов А. М.

АКТ

опытно-промышленных испытаний

1. В ходе опытно-промышленных испытаний в качестве продуцента гидрофобинподобного белка был использован штамм гриба ТпсИрфгта

У1Г1с1е.

2. Ферментационная среда имела следующий состав:

глюкоза - 17,5 г/л, пептон - 4 г/л, КН2Р04 - 0.6; К2НР04 - 0.4; СаС12 - 0.05; №С1 - 0.5; дрожжевой экстракт - 2.0 (по сухому весу); рН среды до стерилизации - 5.8-6.0.

3. Культура гриба выращивалась в ферментационной установке объёмом 16 м3.

4. Для выделения гидрофобинподобного белка использовали следующее оборудование: фильтр-пресс В9-ВФС/423-56, компрессор, перколятор фильтрующий объёмом 1,2 м3, установка для лиофильной сушки.

5. Для определения поверхностной активности экстракта, содержащего гидрофобинподобный белок, проводили измерение краевого угла смачивания методом растекающейся капли.

6. Определение концентрации белка в экстракте осуществляли с помощью метода Лоури.

7. Результаты опытов представлены в таблицах:

Масса экстракта, мг/г сухой биомассы 63,7

Содержание белка в экстракте, % 30

Концентрация белка, мг/г сухой биомассы 19,1

Концентрация белка, мг/л культуральной жидкости 70,7

Краевой угол смачивания,0

Вода 0,01% раствор белка из культуры Trichoderma viride 0,1% раствор белка из культуры Trichoderma viride 1% раствор белка из культуры Trichoderma viride 1% раствор SDS

92±2 60±3 37±2 30±2 34±2

8. В результате опытов установлено:

1) Из нативного раствора культуральмой жидкости гриба Trichoderma viride получен экстракт, содержащий белок, растворимый в 60% растворе этанола;

2) Экстракт, полученный из гриба Trichoderma viride, обладает высоким уровнем поверхностной активности;

3) Предложенный для производства препарата способ позволяет получить сухой экстракт, содержащий 30% белка.

Зам. директора по научной работе, д.т.н.

Инженер-биотехнолог

От СПбГТИ(ТУ) Ассистент

Доцент