Биотехнологические основы получения чистой культуры дрожжей для предприятий малой мощности, выпускающих напитки брожения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат наук Борисова Екатерина Валерьевна

• Борисова Екатерина Валерьевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Борисова Екатерина Валерьевна

Список сокращений

Введение

Литературный обзор

1. Пути регулирования метаболизма дрожжей сахаромицетов

1.1. Классификация и систематика дрожжей

1.2. Сравнение морфологических и физиологических свойств дрожжей

1.3. Метаболизм углеводов дрожжами вида 8асскаготусв8 свгву181ав

1.5.1. Эффект Пастера

1.5.2. Эффект Кребтри

1.5.3. Побочные продукты брожения

1.6.Основные стрессовые факторы

1.6.1.Этанольный стресс

1.6.2.Осмотическое давление среды

1.6.3.Влияние кислорода

1.7. Процессы культивирования микроорганизмов

1.7.1. Периодическое культивирование

1.7.2. Полунепрерывное культивирование

1.7.3. Полунепрерывное культивирование

1.7.4. Многоциклическое культивирование

1.7.5. Непрерывное культивирование

1.7.6. Схемы культивирования чистой культуры дрожжей на лабораторной стадии

1.7.7.Схемы культивирования чистой культуры пекарских дрожжей на производственной стадии

1.7.8.Схемы культивирования чистой культуры пивных дрожжей на производственной стадии

1.7.9.Схемы культивирования чистой культуры спиртовых дрожжей на производственной стадии

2. Материалы, объекты и оборудование

2.1. Материалы

2.2. Объекты

2.3. Методы исследования

2.3.1. Методы микроскопического анализа дрожжей

2.3.2. Способы стерилизации сусла,

инструментов и лабораторной посуды

2.3.3. Определение физиологической активности дрожжей

по методу Давыденко С.Г

2.3.4. Определение бродильной активности

2.3.5. Определение мутности пива на нефелометре

2.3.6. Определение стойкости пива методом ускоренного состаривания

2.3.7. Определение вицинальных дикетонов в пиве

2.3.8. Определение концентрации эфиров и ацетальдегида в пиве

2.3.9. Определение содержания сахаридов в мальтозном сиропе

и солодовом сусле

2.3.10. Определение физико-химических показателей пива

2.3.11. Определение осмоляльности

2.3.12. Определение константы скорости деления

2.3.13. Определение длительности лаг фазы

3. Результаты и обсуждения

3.1. Регулирование эффекта Пастера в стационарной культуре при различной степени аэрации

3.1.1. Влияние площади контакта фаз

3.1.2. Влияние условий культивирования на интенсивность размножения клеток

3.1.3. Обсуждение результатов. Влияние различной степени аэрации на размножение дрожжей

3.2. Влияние величины засева на интенсивность размножения дрожжей

4. Влияние природы углевода и его концентрации на метаболизм

дрожжей Saccharomyces cerevisiae

4.1. Влияние сахарозы на интенсивность размножения дрожжей Saccharomyces cerevisiae

4.1.1. Пивные дрожжи

4.1.2. Пекарские (штамм ЛВ7) и спиртовые (Ethanol Red) дрожжи

4.1.3. Обсуждение результатов. Влияние сахарозы на метаболическую активность пивных, спиртовых и пекарских дрожжей

4.2. Влияние мальтозы на интенсивность размножения дрожжей Saccharomyces cerevisiae

4.2.1. Гетерогенные условия культивирования

4.2.2. Стационарная культура с перемешиванием культуральной жидкости (гомогенная культура)

4.2.3. Периодическая культура с барботированием питательной среды

4.3. Влияние концентраций сахарозы и мальтозы на интенсивность образования диоксида углерода

5. Влияние осмоляльности среды на биосинтез вторичных метаболитов

5.1.Обсуждение результатов. Влияние осмоляльности среды на

биосинтез вторичных метаболитов

6. Разработка и производственные испытания технологии ЧКД на заводах малой производительности

6.1. Разработка ЧКД для минипивоваренного завода

6.1.1. Влияние технологии ЧКД на размножение дрожжей и качество пива

6.1.2. Исследование физиологической активности семенных дрожжей

6.1.3. Влияние технологии ЧКД на качество пива

6.1.4. Технология ЧКД с учетом установленных закономерностей

6.2. Разработка чистой культуры хлебопекарных дрожжей при производстве напитка «Мёд Хмельной» на заводе малой производительности «МЕДОВАРУС»

7. Заключение

8. Список литературы

9. Приложения

Приложение

Окраска дрожжей метиленовым синим

Окраска клеток метиленовым синим, сафранином и танином

Подсчет числа клеток в камере Горяева

Оценка морфологии исследуемых дрожжей

Приложение

Ускоренный метод определения физиологической активности дрожжей

Приложение

Приложение

Определение мутности пива

Приложение

Метод искусственного состаривания пива

Приложение

Определение вицинальных дикетонов и сероводорода в пиве

Приложение

Определение ацетальдегида, диметилсульфида, эфиров и высших спиртов в не фильтрованном, фильтрованном и готовом пиве методом газовой хроматографии

Приложение

Схемы культивирования ЧКД на лабораторных стадиях

Приложение

Количество клеток дрожжей в экспериментах по главе

Приложение

Лабораторная установка для выращивания ЧКД

Приложение

Фотографии дрожжевых клеток

Приложение

Акт производственных испытаний ООО «Ситик»

Приложение

Акт производственных испытаний ООО «МЕДОВАРУС»

Список сокращений

АСД - активные сухие дрожжи

ЧКД - чистая культура дрожжей

ЧК - чистая культура

МПЗ - минипивзавод

ПЭ - Пастеровский эффект

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АМФ - аденозинмонофосфат

Фр-6-Ф - фруктозо-6-фосфат

ЦТК- цикл трикарбоновых кислот

ДМС (DMS) - диметилсульфид

Aw - активность воды

FAN - свободный аминный азот

рН - водородный показатель

ППБ - побочные продукты брожения

СВ - сухие вещества

АА - ацетальдегид

ВС - высшие спирты

ER - спиртовые дрожжи Этанол Рэд

ЦКБТ - цилиндроконический бродильный танк

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнологические основы получения чистой культуры дрожжей для предприятий малой мощности, выпускающих напитки брожения»

Введение

Актуальность работы. В связи с развитием малого предпринимательства в России широкое распространение получили мини-производства, специализирующиеся на выпуске популярных напитков -пива, кваса, спирта, медовых и других напитков брожения.

В настоящее время на данных производствах в качестве посевного материала, как правило, используют сухие дрожжи, которые производят во Франции, Канаде, США и ряде других стран.

В то же время, в коллекциях ряда институтов России хранится значительное количество различных штаммов дрожжей 8асскаготусв8 свгву181ав, которые обладают всеми необходимыми производственно ценными свойствами для бродильной промышленности. Использование этих штаммов дрожжей позволило бы существенно расширить ассортимент напитков брожения, выпускаемых малыми предприятиями. Однако, для использования этих культур на предприятиях небольшой мощности необходима простая и, вместе с тем, эффективная технология производства чистой культуры дрожжей (ЧКД), начинающаяся с пробирочной культуры. Данная технология должна обеспечить максимально быстрое и эффективное накопление необходимого количества засевных дрожжей, отличающихся высокой физиологической активностью и не содержащих посторонних микроорганизмов. Наличие такой технологии позволит сократить производственные затраты, расширить диапазон выпускаемых напитков брожения, а также повысить их качественные характеристики.

Цель и задачи исследования. Целью работы является научное обоснование и разработка технологии получение чистой культуры дрожжей 8асскаготусв8 свгвУ81ав для малых предприятий, выпускающих напитки брожения.

В соответствии с поставленной целью решали следующие задачи:

- исследовать биохимические процессы, протекающие при культивировании дрожжей, применяемых в различных бродильных производствах;

- выяснить влияние диффузии кислорода воздуха в питательную среду на скорость размножения дрожжей и их физиологическую активность в простой периодической культуре;

- рассмотреть влияние величины засева дрожжей на физиологическое состояние ЧКД при различных условиях культивирования;

- установить зависимость концентрации сбраживаемых углеводов в питательной среде на проявление эффекта Кребтри;

- установить влияние природы углеводного субстрата на осмоляльность питательной среды;

- изучить влияние осмоляльности питательной среды, обусловленной концентрацией мальтозы, на синтез вторичных метаболитов брожения штаммами дрожжей, использующимися в различных бродильных производствах.

Научная новизна:

- изучена зависимость между площадью поверхности контакта фаз (субстрат - воздух) при различных способах культивирования дрожжей и показателями, характеризующими кинетику размножения клеток;

- изучено влияние величины засева дрожжей и способа культивирования на физиологическую активность клеток;

- получены уравнения, описывающие зависимость осмоляльности субстрата от концентрации в нем сбраживаемых углеводов (глюкозы, сахарозы, мальтозы);

- установлено влияние осмоляльности среды при различных условиях культивирования клеток и концентрациях сбраживаемых углеводов (сахарозы и мальтозы) на рост и размножение дрожжей вида

8асскаготусв8 свгву181ав;

- установлены общие закономерности и различия в метаболизме углеводов и синтезе вторичных метаболитов у штаммов пивных (штамм 34/70), пекарских (штамм ЛВ7) и спиртовых (Этанол Ред) дрожжей;

- на примере получения пива продемонстрирована зависимость качественных характеристик готового продукта, от технологии чистой культуры дрожжей.

Практическая значимость. На основании полученных закономерностей обоснованы режимы культивирования дрожжей на всех стадиях накопления биомассы чистой культуры. Разработана технология ЧКД пекарских и пивных дрожжей для заводов производительностью 1 -2

-5

м напитков брожения в сутки. Доказана зависимость качественных показателей целевых продуктов брожения от технологии выращивания посевного материала. Проведены производственные испытания технологии чистой культуры пивных дрожжей на минипивзаводе ООО «Ситик» и пекарских дрожжей при выпуске напитка «Мед хмельной» на ООО «МЕДОВАРУС».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на II, III и IV конгрессе молодых ученых (СПб, НИУ ИТМО ИХиБТ, 2013, 2014), а так же на XLII и XLIII научных и учебно-методических конференциях НИУ ИТМО, международной научной конференции и школе молодых ученых «Физиология растений -теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехнологий» (Калининград, 2014), на конференции ФГБНУ «Всероссийский НИИ пищевых добавок» "Продовольственная безопасность и научное обеспечение развития отечественной индустрии конкурентоспособных пищевых ингредиентов" (Санкт- Петербург, 2015)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных Высшей Аттестационной Комиссией Российской Федерации (ВАК РФ).

Основные положения, выносимые на защиту:

- регулирование эффекта Пастера при культивировании дрожжей в простой (гомогенной и гетерогенной) периодической культуре;

- регулирование эффекта Кребтри при выращивании дрожжей на различных углеводных субстратах;

- влияние осмоляльности питательной среды на длительность лаг-фазы и при различной степени диффузии кислорода воздуха в культуральную жидкость;

- влияние величины засева на физиологическую активность ЧКД в условиях гомогенной и гетерогенной культуры.

- влияние концентрации мальтозы на синтез вторичных метаболитов брожения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, списка литературы включающей 130 источника, из них 45 - иностранных, и 13 приложений. Диссертация содержит 140 страниц машинописного текста,54 иллюстрации и 41 таблицу.

Литературный обзор

1. Пути регулирования метаболизма дрожжей сахаромицетов 1.1. Классификация и систематика дрожжей

На протяжении многих лет в пищевой промышленности наибольшее значение имеет вид Saccharomyces cerevisiae, к которому относятся дрожжи, которые используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, в производстве кваса и спиртовом производстве. Согласно данным литературы [54,64,9,57,12] виды дрожжей & еШpsoideш, S.uvarum, S. carlsbergensis, S. oviformis, S. vini ранее рассматривались как самостоятельные. Исследования дрожжей по наследственным признакам позволяют заключить, что дрожжи, вызывающие процесс брожения, относясь к виду Saccharomyces cerevisiae, являются мутантами с частично утраченными признаками, селекционированными при определённых условиях или на определённых субстратах. Специалисты по классификации формируют видовые группы, объединяя их по общим признакам. С такой точки зрения используемое для обозначения пивных, винных, пекарских и спиртовых дрожжей современное наименование -Saccharomyces cerevisiae -вполне обоснованное и приемлемое [33,54,64,85].

Таким образом, по принятой на данный момент систематике и генетическим исследованиям, дрожжи Saccharomyces cerevisiae относятся к царству грибов - Mycota, к отделу - Eumycota, к классу - Ascomycetes, семейству - Saccharomycetaceae, к роду - Saccharomyces, виду - cerevisiae [33,64,4,2,53].

Впервые Меуеп в 1838 году, объединил пивные, винные и сидровые дрожжи в один род, а затем дал им и видовое обозначение, хотя понятие вид в биологии является с одной стороны важным, с другой стороны самым сложным. Все штаммы дрожжей, классифицированные как

8асскаготусв8 свгву181ав, способны в аэробных условиях утилизировать глюкозу, мальтозу, но не могут расти на лактозе и целлобиозе, они так, же различаются между собой по морфологическим, физиологическим и культуральным признакам.

Данный вид 8асскаготусв8 свгву181ав жил и развивался в условиях бродильной промышленности, однако существуют внутри вида разновидности именуемые расами или штаммами. Эти разновидности сформировались в результате направленного изменения, за счет длительного воздействия на них условий жизни в определенном производстве, а так же процессами селекции. Каждая такая разновидность вида 8асскаготусв8 свгву181ав в настоящее время представлена различными производственными культурами, которые в свою очередь применяются одна в производстве спирта, другая - в дрожжевой промышленности и т.д.

В определителе дрожжей 1984 года к синонимам свгву181ав отнесено более 80 видов дрожжей. В определителе дрожжей 1990 года, род дрожжей 8асскаготусв8 включает 10 видов, причем вид свгву181ав имеет более чем 130 синонимов [33,6,53].

В таблице 1.1 [85,115,89,90] представлены изменения в исторической классификации дрожжей 8асскаготусв8. Как следует из таблицы 1.1 положение дрожжей, используемых в бродильных производствах, в классификаторах периодически изменяется. Это связано с получением дополнительных знаний в развития микробиологии и биохимии дрожжей. Объединение пивных, пекарских, спиртовых и др. представителей дрожжей, применяемых в пищевой промышленности в один класс, свидетельствует об общности основных признаков.

Таблица 1.1- Историческая номенклатура дрожжей (1952-1984)

Классификация

Ьоддег & Кге§ег-уаи Ку, 1952 Ьоааег, 1970 Кге§ег-уаи Ку, 1984

Saccharomyces bayanus Б. bayanus

Б. oviformis

Б. pastorianus

Б. cerevisiae Б. cerevisiae

Б. cerevisiae var. ellipsoideus

Б. willianus Б. cerevisiae

Б. carlsbergensis Б. uvarum

Б. logos

Б. uvarum

Б. chevalieri Б. chevalieri

Б. ШИсш Б. ШИсш

Б. асеи

Б. diastaticus

Б. delbrueckii Б. delbrueckii Torulaspora

Б. rosei Б. rosei delbrueckii

Б. vafer

Б. acidifaciens Б. Ьайп Zygosaccharomyces

Б. Ьайп ЬаИи

Б. elegans

Б. fragilis Kluyveromyces К. marxianus

Б. marxianus marxianus

Б. ШсШ К. ШсШ

1.2. Сравнение морфологических и физиологических свойств дрожжей

В таблице 1.2. представлены сравнительные морфологические и физиологические показатели пекарских и пивных дрожжей.

Таблица 1.2 - Сравнительные характеристики морфологических и физиологических свойств дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae

Морфологические и Хлебопекарные дрожжи ЛВ 7 Пивные дрожжи 34/70

физио-

логические

показатели

Колонии на кремовые, гладкие, матовые, гладкие, кремовые,

солодовом блестящие, пастообразные, пастообразная; форма круглая;

сусле слегка возвышающиеся, с края ровные; внутренний узор

ровными краями. Диаметр однородный; профиль

колоний пятисуточной конусообразный.

культуры - 4,5 - 5,5 мм.

Вегетативные от круглых до овальных; форма - кругло-овальная;

клетки величина клеток диаметр клеток односуточной

односуточной культуры в культуры на солодовом сусле

солодовом сусло (8% - 10% (10% СВ) - 7-9 мкм

СВ) - (3,75 - 7,5)*(6,25 -

10,5)мкм

Тип почкование почкование

размножения

Отношение к факультативный анаэроб факультативный анаэроб

кислороду

Отношение к min 8°C, opt 30-35°C, max рекомендуемая температура

температуре 40°C брожения 9-15о С

Отношение к opt 4,2 - 5,5 opt 4,6 - 5,5

рН

Ассимиляция отсутствует отсутствует

нитратов

Образование не образует не образует

крахмало-

подобных

соединений

Из таблицы 1.2 видно, что в перечень характеристик штаммов не входит такой показатель как осмомоустойчивость, между тем в настоящее время, как в пивоварении, так и в спиртовой промышленности широко внедряются технологии сбраживания плотных сред.

Это также касается и культивирования пекарских дрожжей, которое также можно отнести к процессам, происходящим в плотных средах, когда кратность разведения мелассы составляет 1:3-1:4. Влияние осмоляльности среды, скорее всего, отразится на морфолого-физиологических свойствах, но при этом метаболизм дрожжей будет подчиняться общим законом.

Влияние осмоляльности среды, скорее всего, отразится на морфолого-физиологических свойствах, но при этом метаболизм дрожжей будет подчиняться общим законом.

1.3. Метаболизм углеводов дрожжами вида Засскагвтусвз свгвуЬзЬав

В живых клетках протекает множество биохимических процессов и последовательных ферментативных реакций, в которых продукт одной реакции является субстратом для протекания последующей реакции. По приведённым данным [61], они включают 156 реакций восстановления, 21 - декарбоксилирования, 17 дезаминирования, 14 - окислении, 10 -этерификации, 9- конденсации, 5 - гидролиза, 1 - аминирования.

Дрожжевым клеткам для их роста, размножения требуются не только незаменимые питательные вещества и металлоорганические соединения [5,6,79,59,78,96], но и соответствующие физико-химические условия, а также энергия в легкоусвояемой форме. В бродильных производствах используют такие свойства дрожжей, как анаэробное расщепление сахаров до этанола и СО2 (спиртовое брожение) и аэробное (окислительное) расщепление сахаров (респираторная активность или дыхание дрожжей).

Источниками углерода для дрожжей являются различные соединения: лучше всего дрожжи ассимилируют гексозы (моно- и дисахариды), некоторые виды хорошо растут на средах с пентозами. Некоторые штаммы утилизируют инулин. Углеводы, состоящие из 4 и более остатков простых сахаров, не метаболизируются дрожжами Бaccharomyces cerevisiae [5,111,104,128,89,120]. Кроме того, есть сведения, что источниками углерода могут служить органические кислоты (молочная, уксусная, яблочная, лимонная) [41], глицерин, манит, альдегиды [41,36], и другие углеродные субстраты. В работах [6, 2,41] указано, что в исключительно окислительных условиях и при отсутствии усвояемых сахаров дрожжи Бaccharomyces после некоторой фазы адаптации способны окислительно расщеплять уже образовавшийся этанол до СО2 и Н2О (респираторная активность) [2] таблица 1.3.

Таблица 1.3 - Теоретическое количество высвобождаемой дрожжами энергии на 1 моль источника углерода

Путь Реакции Д^0, Увеличение

метаболизма кДж содержания АТФ на одну дрожжевую клетку

Брожение СН12О6^2С2Н5ОН+2СО2 -260 2 моля 100 кДж

Респираторная С6Н12О6+6О2^ -2880 38 1900 кДж

активность 6СО2+6Н2О молей

Респираторная С2Н5ОН + 3О2^ -1310 17 850 кДж

активность 2 СО2 + 3Н2О молей

Так, при общности химизма углеводного обмена большая часть видов рода Бaccharomyces различаются между собой, прежде всего по отношению к углеводам.

Известно, что 98 % сахара уходит на брожение и только 2 % на дыхание [36]. Как видно из таблицы 1.4 отличие между штаммами пивных, пекарских и спиртовых дрожжей касается раффинозы, мелибиозы и галактозы.

В качестве питательных веществ дрожжи - сахаромицеты используют для биосинтеза сложных соединений (высокомолекулярных), простые, в таблице 1.5 представлены некоторые источники углевода для пекарских и пивных дрожжей [58]. Для повышения биотехнологических свойств дрожжей используют недостающие питательные вещества [81,50,102].

Таблица 1.4 - Отношение к сахарам у дрожжей рода Saccharomyces

Углеводы сбраживаемые Дрожжи рода Saccharomyces

Пекарские [33,55,58,2] Пивные низовые [36,20,2] Пивные верховые [2] Спиртовые [33,61,83,2]

Глюкоза + + + +

Фруктоза + + + +

Мальтоза + + + +

Сахароза + + + +

Мальтотриоза + + + +

Галактоза +/- + + +/-

Манноза + + + +

Мелибиоза - + - -

Лактоза - - - -

Целлобиоза - - - -

Раффиноза 1/3 3/3 1/3 1/3

Мальтотетраоза и высокомолекулярные продукты расщепления крахмала

Пентозы, ксилоза, арабиноза, рибоза, рамноза

+/- утилизация в зависимости от штамма

Давно известно, что не зависимо от штамма порядок усвоения углеводов, следующий глюкоза^сахароза^фруктоза^мальтоза.

Глюкоза первой легко проникает в клетку, с помощью ферментов-пермеаз и не задерживается в периплазматическом пространстве [6, 2,88].

Таблица 1.6 - Ассимиляция некоторых источников углевода дрожжами рода

Бaccharomyces

Углеводы Дрожжи рода Бaccharomyces Углеводы Дрожжи рода Бaccharomyces

Пекарские Пивные Пекарские Пивные

Глюкоза + + Дульцит - -

Галактоза + + Б-маннит - -

Ь-сорбоза - - Б-сорбит - -

Сахароза + + Ь-метил-Б-глюкозид +

Мальтоза + + Салицин - -

Трегалоза + + Б,Ь-молочная кислота + +

Лактоза Янтарная кислота

Мелибиоза + Лимонная кислота

Рафиноза + + Инозит - -

Мелецитоза + - Глицерин - +

Инулин - - Эритрит - -

Раствор/ крахмал Этанол +

Сахароза сначала гидролизуется до глюкозы и фруктозы ферментом Р-фруктофуранозидазы (инвертазы), содержащимся в клеточной стенке. В переплазматическом пространстве фруктоза сначала изомеризуется в глюкозу с помощью фермента фруктоизомеразы. Именно поэтому фруктоза потребляется позже, чем глюкоза. Мальтоза проникает внутрь клетки с помощью мальтопермеазы, где расщепляется эндоферментами мальтазой (а-глюкозидазой). Установлено, что усвоение мальтозы начинается при концентрации глюкозы в среде не более 0,20,75%. Мальтотриоза используется после усвоения мальтозы рисунок 1.1. [88,89,90].

гельность культивирования; Рисунок 1.1 - Порядок утилизации сахаров

Скорость вступления глюкоза в метаболизм дрожжей определяется эффектами Пастера и Кребтри.

1.5.1. Эффект Пастера

Дрожжи сравнительно быстро адаптируются к кислороду. Эту способность впервые обнаружил Пастер, и явление было названо пастеровским эффектом. Суть ПЭ заключается в подавлении брожения дыханием, снижении скорости потребления субстрата (глюкозы) и увеличении доли сахара, идущего на синтез биомассы.

Регулирование эффекта Пастера проходит на двух уровнях: на энергетическом и субстратном. Также имеет значение концентрация растворенного в среде кислорода [116]. Регулирование эффекта Пастера на энергетическом уровне связано с отношением между АТФ/АМФ.

Повышение содержания АТФ в клетках приводит к замедлению скорости реакции превращения Фр-6-Ф во Фр-1,6-дифосфат, катализируемой ферментом фосфофруктокиназой, и, наоборот, АМФ интенсифицирует скорость этой реакции. Регулирование эффекта Пастера на субстратном уровне можно рассматривать с точки зрения влияния концентраций ацетил-КоА и оксалоацетата - с одной стороны, и цитрата -с другой. Так при недостатке в питательной среде биотина и ионов 7п +2 резко уменьшается скорость образования оксалоацетата, в результате чего работа цикла замедляется, следовательно, снижается выход биомассы и увеличивается синтез этанола. К такому же эффекту приводит недостаточное снабжение клеток витаминами В1 (тиамин) и В3 (пантотеновая кислота), Это приводит к снижению скорости синтеза ацетил-КоА, в результате чего уменьшается образование цитрата, исходного компонента ЦТК.

Цитрат представляет собой второй аллостерический (по принципу обратной связи) регулятор активности фосфофруктокиназы (ФФК): увеличение содержания цитрата в дрожжах приводит к торможению активности ФФК.

Еще одним активатором ПЭ является кислород. Так, в присутствии

О2 пируват преимущественно превращается в ацетил-КоА, т.к. пируватдегидрогеназа имеет более выраженное сродство к пирувату, чем пируватдекарбоксилаза [39,7].

1.5.2. Эффект Кребтри

Особенность метаболизма сахаромицетов заключается в наличии у них эффекта Кребтри [117] (или глюкозный эффект, или катаболитная репрессия), суть которого состоит в том, что, несмотря на интенсивную аэрацию в среде с высокой концентрацией сахара часть субстрата сбраживается на спирт, т.е. имеет место «аэробное брожение».

Для эффекта Кребтри характерно действие одновременно двух энергетических путей (аэробного и анаэробного). При этом в зависимости от массовой доли и природы углевода в среде, выход биомассы изменяется в широких пределах.

Для З.сегеугягае установлено, что при концентрации глюкозы (фруктозы) в среде более 0,1%, наблюдается репрессия синтеза ферментов ЦТК, цитохромов и ферментов дыхательной цепи, даже при отсутствии лимита по кислороду. Эффект Кребтри при использовании в качестве углеводного питания глюкозы и фруктозы выражен значительно сильнее, чем на мальтозе, мальтотриозе или галактозе. Так для галактозы эта концентрация может превышать 0,5% наблюдается репрессия синтеза ферментов ЦТК Перт С. Дж [57] указывает, что мальтоза и мальтотриоза не вызывают репрессивного действия на дыхание у штаммов дрожжей низового брожения.

В отсутствии репрессирующей дыхание концентрации глюкозы и при наличии в среде достаточного количества растворенного молекулярного кислорода дрожжи метаболизируют глюкозу дыхательным путем. В этом случае глюкоза полностью окисляется до диоксида углерода и воды. Следовательно, именно массовая доля углевода в среде

определяет преобладающий тип энергетического обмена в клетках, а значит и выход биомассы [104,117].

1.5.3. Побочные продукты брожения

Как известно, в процессе роста дрожжевые клетки образуют основные продукты брожения - этиловый спирт и диоксид углерода, а так же множество других метаболитов, которые дрожжи синтезируют как побочные продукты при катаболизме углеводов, находящихся в субстрате, обмене аминокислот и т.д. Соединения эти могут накапливаться в среде в незначительных количествах, но иметь очень большое значение, так как от их состава зависит качество готового продукта [100, 89, 120, 85,107,127,118,128].

Высшие спирты.

Обязательными побочными продуктами брожения являются высшие спирты или «сивушные масла», такие как пропиловый, изоамиловый, бутиловый и изобутиловый.

Образование спиртов связано с составом сусла, особенно с аминокислотной его составляющей, с штаммовыми характеристиками дрожжей и технологией брожения. Катаболический путь связан с распадом амиссимилируемого азотанокислот, которые поступают в клетку из сусла, далее путём ряда реакций образуются спирты, содержащие на один атом углерода меньше, чем потреблённая аминокислота. Анаболический путь (путь Эрлиха) связан с синтезом аминокислот, и высшие спирты образуются как побочные продукты. Анаболический путь преобладает, если в питательной среде содержится небольшое количество ассимилируемого азота, причем оба способа образования высших спиртов имеют одинаковую активность. Синтез высших спиртов тесно связан с

метаболизмом аминокислот и углеводов, т.е. с жизнедеятельностью дрожжей [118,4, 49, 36,119,111].

Эфиры.

Эфиры - очень важная группа сенсорных компонентов, которые образуются при брожении, от которых зависит аромат готового напитка. Синтез эфиров зависит от интенсивности биосинтеза высших спиртов. Главным источником ацетил-КоА служит пировиноградная кислота, образующаяся в реакциях катаболизма глюкозы и некоторых аминокислот. Изоамилацетат или 3-метилбутилацетат синтезируется в ходе реакций из изоамилового спирта, который является главной составной частью сивушных масел [49,107]

Альдегиды и кетоны.

Дрожжи выделяют так же при брожении альдегиды и кетоньь ацетоин и диацетил. Важнейшим альдегидом является ацетальдегид, который образуется в первые дни брожения, затем его содержание идет на спад.

В процессе метаболизма дрожжей образуются предшественники вицинальных дикетонов, одним из которых является диацетил или 2,3-бутандион. Диацетил отмечают как один важнейших факторов образования букета зеленого пива. Диацетил и пентандион называют виценальными дикетонами, их формирование в пиве проходит в три этапа: в ходе первого образуются их предшественники, на втором превращение предшественников, и на последнем восстановление дикетонов, т.е. диацетил ^ ацетоин^бутандиол. На скорость образования предшественников вицинальных дикетонов - а-цетогидрокислот - влияют физико-химические условия питательной среды, а так же штаммовые особенности дрожжей. Он тесно связан с азотным обменом клеток и в

частности с метаболизмом аминокислот. От физиологического состояния дрожжей зависит как биосинтез ацетогидроксикислот, так и редукция дикетонов [49, 39,100].

Сульфосоединения.

В ходе брожения, при метаболизме дрожжей возникают летучие сернистые соединения. Одним из наиболее хорошо изученных суфосоединений, является диметилсульфид (ДМС). Уровень ДМС определяется содержанием в солоде предшественников ДМС и технологическими параметрами ведения процесса кипячения сусла с хмелем (давление/температура). Так же из сульфосоединений выделяют сероводород и меркаптаны. Сероводород тесно связан с жизнедеятельностью дрожжей и образуется в процессе брожения [49,36,100].

Образование глицерина.

Глицерин является побочным продуктом брожения. Известно, что при спиртовом брожении проходит ещё и глицерино- пировиноградное брожение, и, как следствие, образование глицерина внутри дрожжевой клетки. В период лаг-фазы возрастает синтез глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации глицерина. В обычных условиях культивирования, глицерин проникает через цитоплазматическую мембрану дрожжевой клетки, но при гиперосмотическом стрессе поры, через которые он выходит, закрываются и глицерин не выделяется в питательную среду. Образование глицерина хорошо изучено на примере метаболизма винных дрожжей. В ходе экспериментов установлено, что при сбраживании виноградного сусла 92 % молекул сахаридов идет на спиртовое брожение и 8 % молекул на глицерино- пировиноградное брожение [60, 101]. Синтез глицерина увеличивается при культивировании дрожжей в средах с

повышенным осмотическим давлением, что особенно важно при использовании высокоплотного пивоварения. При таком такой технологии лучше использовать дрожжи, синтезирующие меньше глицерина, так как при этом образуется меньше побочных продуктов брожения, которые не искажают сенсорный профиль пива.

Присутствуют в качестве побочных продуктов брожения летучие жирные кислоты: уксусная, пропионовая, масляная и изомасляная.

1.6.Основные стрессовые факторы

Условия культивирования дрожжей 8асскаготусв8 свгву181ав существенным образом влияют на метаболизм клеток. Адаптация дрожжей вида Saccharomyces сerevisiae к стрессовым факторам тщательно изучается в последние годы [101, 92, 93, 94, 95, 87, 128, 18, 77, 86, 97, 105, 106,108]. Часто дрожжевые клетки используются, как модельные системы, для изучения стрессовых реакций лежащие в основе стрессоустойчивости эукариотических клеток [95, 99, 119]. Повышенное содержание сухих веществ и низкая температура затрудняют проникновение питательных веществ через клеточную стенку в дрожжевую клетку, тем самым снижая её термоустойчивость и осмоустойчивость.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Борисова Екатерина Валерьевна, 2015 год

8. Список литературы

1. Алиханян С.И., Налбандян Г.М. Селекция винных дрожжей с применением мутагенов //Генетика. - 1971. т.№9.- с. 125-131

2. Аннемюллер Г., Мангер Г. - Й., Литц П. Дрожжи в пивоварении - Пер. с англ. Под научн. ред. С. Г. Давыденко. - СПб.: ИД Профессия, 2015. - 428с., табл., ил.

3. Аннемюллер Г., Мангер Х.-И. Аэрация при получении чистой культуры дрожжей - максимально не значит оптимально // Brauwelt. Мир пива, 2001, №2. -С.7-24.

4. Бабьева, И. П. Биология дрожжей / И. П. Бабьева, И.Ю. Чернов. - М.: К 250-летию Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова, 2004. - 239 с.

5. Бекер М. Е. Введение в биотехнологию / М. Е. Бекер - «пищевая промышленность», 1974. - 230с.

6. Берри Д. Биология дрожжей / Д. Берри. - Москва «Мир», 1985. - 95с.

7. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. - 779 с.

8. Блажевич О. В. Культивирование клеток: Курс лекций / О. В. Блажевич -Мн.: БГУ, 2004. - 78 с.

9. Борисова С. В. Использование дрожжей в промышленности / С. В. Борисова, О. А. Решетник, З. Ш. Мингалеева - Спб.: «Гиорд», 2008. - 215с.

10. Бурьян Н. И. Микробиология виноделия / Н. И.Бурьян, Л. В. Тюрина — М.: «Пищевая промышленность», 1979. - 271с.

11. Бурьян. Н.И.Микробиология виноделия / Н. И.Бурьян - Институт «Магарач», Ялта - 431с.

12. Бэмфорт, Ч. У. Новое в пивоварении /Ч.Бэмфорт, (ред.) пер. с англ. И.С. Горожанкиной, Е.С. Боровиковой. - СПб.: Профессия, 2007. - 520 с.

13. Витринская А. М. Стимулирующий эффект дестибиотина различных условиях культивирования дрожжей //Хлебопекарная и кондитерская промышленность. - 1985. - № 6. - С. 41-44.

14. Давыденко, С.Г. Применение методов окраски дрожжей для оценки их физиологического состояния/ С.Г Давыденко, Л.М. Васильева, Б.Э. Баташов, А.Т. Дедегкаев // Пиво и напитки. - 2011. - № 5. - С. 8-11

15. Давыденко, С.Г. Создание и применение нового экспресс-метода оценки качества семенных дрожжей. // Пиво и напитки. - 2012. - № 5.- С.

16. Давыденко, С.Г., Создание штамма дрожжей для нового пивного бренда «Балтика «Кулер» / С.Г Давыденко, Д.В Афонин, Б.Э. Баташов, А.Т. Дедегкаев // Пиво и напитки. - 2011. - №3. - С. 43-47.

17. Дарков, Г. В. Исследование кинетике роста чистой культуры пивных дрожжей в кожухотрубном струйно-инжекционном аппарате (КСИА): Автореф. Дис. на соискание ученой степени кандидата технических наук. Санкт-Петербург, 2002 - 15 с.

18. Дедегкаев, А.Т. Глицерин - антистрессовый метаболит дрожжей S. cerevisiae / А.Т. Дедегкаев, Д.В. Афонин, Т.В. Меледина, С.А. Черепанов //Вестник МАХ С. 47-48.

19. Ермолаева, Г.А. Справочник работника лаборатории пивоваренного предприятия / Г.А. Ермолаева - СПб.: Профессия, 2004. - 536 с.

20. Жвирблянская, А. Ю.Дрожжи в пивоварении / А. Ю. Жвирблянская, В. С.Исаева - Москва: Издательство «Пищевая промышленность», 1979.- 247с.

21. Кайтуков, Ч.М. Системы пропагации пивных дрожжей часть 1/ Ч.М. Кайтуков //Индустрия напитков.- 2003.- №6.

22. Кайтуков, Ч.М. Системы пропагации пивных дрожжей часть 2 / Ч.М. Кайтуков //Индустрия напитков. - 2006. - №4.

23. Кайтуков Ч.М. Развитие систем пропагации пивных дрожжей Автореф. Дис. на соискание ученой степени кандидата технических наук. - Москва, 2007.- 24с.

24. Карпенко, Д.В.Способы активации дрожжей при сбраживании плотного сусла / Д.В. Карпенко, Е.О. Чуланов // Пиво и напитки. 2008. - №5.- С. 26-27.

25. Качмазов, Г. С. Сравнительная характеристика осмотической устойчивости дрожжей спиртовых рас / Г. С. Качмазов, Г. С. Качмазова, С. Ю. Гугкаев, К. О. Хаметова // Производство спирта и ликероводочных изделий. -2007. - №3. - С.31.

26. Качмазов, Г. С. Дрожжи бродильных производств. Практическое руководство. Учебное пособие / Г. С. Качмазов - Лань.: СПб. - 2012. - с.224.

27. Кишковская С.И. Разработка технологии биологического кислотопонижения виноградного сусла, мезги и вин с использованием дрожжей рода 8сЫ208асскаготусв8, Дис. Д.т.н.-Ялта, 1990.-252 с.

28. Клещев, Н. Ф. Общая промышленная биотехнология: Технология бродильных производств. Учебное пособие. / Н. Ф., Клещев, М. П. Бенько -Харьков: НТУ "ХПИ", 2007. - 200 с.

29. Климовский, Д.Н. Технология спирта / Д.Н. Климовский, В. А. Смирнов, В. Н. Стабников - Издательство «Пищевая промышленность», 1967. - 452с.

30. Козьмина Н. П. Биохимия хлебопечения, Издательство «Пищевая промышленность», 1978. - 277с.

31. Коростелева Н.И. Биотехнология: учебное пособие / Н.И. Коростелева, Т.В. Громова, И.Г. Жукова - Барнаул: Изд-во АГАУ, 2006. - 127 с.

32. Котенко, С. Ц. Штамм дрожжей 8асскаготусв8 свгву181ав В-3855, используемый для производства спирта/ С. Ц. Котенко, Э. А. Халилова, Э. А. Исламмагомедова // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2013. - №3.

33. Кудрявцев, В.И. Систематика дрожжей. / В.И. Кудрявцев - М.: Изд. Академия наук СССР, 1954. - 427 с.

34. Кудрявцев В.И. О непрерывной селекции микроорганизмов из производства.// Микробиология,-1951-20.-№2.- С.155-167.

35. Кудрявцева Л. В. Разработка технологических приемов для повышения качества и стабильности пива: Автореф. Дис. на соискание ученой степени кандидата технических наук. Москва, 2002.

36. Кунце, В. Технология солода и пива/ В. Кунце, Г. Мит пер. с нем., Изд-во «Профессия», 2003. - 912 с.

37. Кхалил, М. М. Исследование влияния параметров процесса культивирования на закономерности роста и размножения хлебопекарных дрожжей в аппаратах разной конструкции и разработка высокоэффективных технологий накопления биомассы: Автореф. Дис. на соискание ученой степени кандидата технических наук. Санкт-Петербург, 2007.-15 с.

38. Лабинская, А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А. С. Лабинская - Издательство: Медицина 1978. - 394 с.

39. Ленинджер, А. Основы биохимии / А. Ленинджер - М.: «МИР», -1985. -320с.

40. Лысак, В.В. Микробиология : учеб. пособие / В. В. Лысак. - Минск : БГУ, 2007.- 426 с.

41. Маринченко, В.А. Технология спирта / В.А. Маринченко, В.А. Смирнов, Б.А. Устинников - М.: Легкая и пищевая технология, 1981. - 416 с.

42. Меледина Т. В. Научное обоснование и разработка высокоэффективных технологий дрожжей 8асскаготусв8 свгву181ав: Автореф. дис... д-ра техн. наук. - СПбГУНиПТ, 2002. - 32с.

43. Меледина, Т.В. Особенности метаболизма трегалозы у пивных дрожжей низового брожения/ Т.В. Меледина, С.А.Черепанов // Пиво и напитки, №4, 2004. С. 24-27.

44. Меледина, Т. В. Пиво с высокой долей сухих веществ. Часть I / Т.В. Меледина, С. А.Черепанов // Индустрия напитков, 2006. - №5. -С. 12-18.

45. Меледина, Т. В.Пиво с высокой долей сухих веществ. Часть II / Т. В. Меледина, С. А. Черепанов // Индустрия напитков, 2006. - №6. -С. 24-29.

46. Меледина, Т.В. Пиво с высокой долей сухих веществ. Часть III / Т. В. Меледина, С. А. Черепанов // Индустрия напитков, 2007. - №1. -С. 10-12.

47. Меледина, Т.В. Закономерности роста и размножения хлебопекарных дрожжей на бесприточных стадиях технологического процесса накопления биомассы / Т.В. Меледина, М.Кхалил // Вестник МАХ. 2006. № 4.

48. Меледина, Т.В. Сырьё и вспомогательные материалы в пивоварении / Т.В. Меледина СПб.: "Профессия", 2003. — 304 с.

49. Меледина, Т. В. Качество пива: стабильность вкуса и аромата, коллоидная стойкость, дегустация / Т. В. Меледина., А. Т. Дедегкаев, Д. В. Афонин - СПб.: ИД «Профессия», 2011. - 220 с.

50. Меледина, Т.В. Физиологическое состояние дрожжей. Учебное пособие для магистрантов / Меледина Т.В., Давыденко С.Г. — СПб.: НИУ ИТМО ИХ и БТ, 2012. - 48 с.

51. Меледина Т.В. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Морфология, химический состав, метаболизм. / Меледина Т.В. Учебное пособие — СПб.: Университет ИТМО, ИХ и БТ, 2014. - 108 с.

52. Методы культивирования клеток: Сборник науч. трудов. — Л.: Наука, 1988. — 313 с.

53. Наумова, Е. С. Эволюционная и таксономическая генетика дрожжей Автореф. Дис. на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме науч.доклада. Москва, 2006

54. Никитина, Е. В. Микробиология учебник / Е. В. Никитина, С. Н. Киямова, О. А.Решетник - Спб, «Гиорд», 2009. - 400с.

55. Новаковская,С.С. Производство хлебопекарных дрожжей/ С.С. Новаковская, Ю.И.Шишацкий - М: Агропромиздат, 1990. - 336с.

56. Новаковская, С.С. Справочник технолога дрожжевого производства / С.С. Новаковская -М.:Пищевая промышленность, 1973.-288с.

57. Перт, С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Перт; пер. с англ. Петровой Т.А., Позмоговой И.Н.; ред. Работнова И.Л. - М.: Мир, 1978. - 330 с.

58. Пономарева О.И., Черныш В.Г. Микробиология производства хлебопекарных дрожжей Учебное пособие. / О.И.Пономарева, В.Г.Черныш -СПб.: Санкт-Петербургский государственый Университет низкотемпературных и пищевых технологий. - 2009. - 200 с.

59. Прист Ф.Дж., Й.Кэмпбелл Микробиология пива / пер. с анг. под общ. ред. Т.В.Мелединой, Т.Сойлда. - СПб.:Профессия, 2005. - 368с.

60. Риберо - Гайон, Ж. Теория и практика виноделия. Т. 2 Характеристика вин. Созревание винограда. Дрожжи и бактерии. / Ж. Риберо - Гайон. Э. Пейно, П. Риберо - Гайон, П. Сюдро пер с франц., -М.: Пищевая промышленность, 1979. -352 с.

61. Римарева, Л. В. Теоретические и практические основы биотехнологии дрожжей / Л. В. Римарева. - М.: ДеЛи принт, 2010. - 252 с.

62. Римарева, Л. В. Влияние ферментативных систем на биохимический состав зернового сусла и культуральные свойства осмофильной расы спиртовых дрожжей 8асскаготусв8 свгву181ав / Л. В. Римарева, М. Б. Оверченко, Е. М. Серба, Н. И.Игнатова // Производство спирта и ликероводочных изделий. -2013. - №1.

63.

Родопуло, А.К. Основы биохимии виноделия / А.К. Родопуло - Легкая и пищевая промышленность, 1983, - 240с.

64. Саришвили, Н. Г.Микробиологические основы технологии шампанизации вина / Н. Г. Саришвили, Б. Б.Рейтблат - М.: Пищевая промышленность, 2000

65. Семихатова Н. Т. Хлебопекарные дрожжи / Н. Т.Семихатова - М.: Пищевая промышленность, 1980. - 199с.

66. Серба, Е. М. Исследование матаболитов, сопутствующих синтезу этанола при сбраживании концентрированного зернового сусла осмофильным штаммов дрожжей 8асскаготусв8 свгву181ав // Е. М. Серба, М. Б. Оверченко, Л. В. Римарева, Н. И.Игнатова, О. В. Веселовская, Н. В. Шелехова // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2013. - № 2. - С. 16-19.

67. Скиба, Е. А. Технология производства дрожжей: учебное пособие / Е.А. Скиба; Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. - Бийск: Изд-во АГТУ, 2010. - 121 с.

68. Тамазян, Г. А. Влияние условий аэрации на кинетику сбраживания пивного сусла и качество пива на минипивзаводах: Автореф. Дис. на соискание ученой степени кандидата технических наук. Санкт-Петербург, 2010. - 15 с.

69. Тишин, В. Б. Культивирование микроорганизмов: кинетика, гидродинамика, тепломассообмен / В. Б. Тишин- СПб., 2012. - 181 с.

70. Третьяк, Л. Н. Технология производства пива с заданными свойствами / Л. Н. Третьяк - СПб.: ИД «Профессия», 2012. - 463 с.

71. Третьяк, Л. Н. Методологические проблемы обеспечения качества и безопасности пива / Л. Н. Третьяк // Труды Международного симпозиума «Надежность и качество» том 2. - 2010

72. Третьяк, Л. Н. Номенклатура показателей качества и безопасности пива как пищевого напитка // Л. Н. Третьяк ВЕСТНИК ОГУ. - 2012. - №1.

73. Третьяк, Л. Н. Новый взгляд на проблемы пивоварения / Л. Н.Третьяк, Е. М. Герасимов // ВЕСТНИК ОГУ. - 2003. - № 2.

74. Устинова, А. С. Разработка технологии сбраживания высококонцентрированного сусла из ячменя: Автореф. Дис. на соискание ученой степени кандидата технических наук. Санкт-Петербург, 2013. - 16 с.

75. Утенков Д. М. Микрогенерирование / Д. М. Утенков -М.: Сов. наука, 1941.- 152 с.

76. Фараджева, Е. Д. Общая технология бродильных производств / Е. Д. Фараджева, В. А. Федоров - М.: Колос, 2002.

77. Филимонова, Т.И. Влияние этанольного и осмотического стресса на пивные дрожжи / Т.И. Филимонова, Е.И. Несс, О.А.Борисенко, К.В.Кобелев // Пиво и напитки. - 2002. - №5. - С. 12-14.

78. Халилова, Э.А. Элементный состав клеток штамма 8асскаготусв8 свгву181ав Y-503, культивируемого на различных питательных средах / Э.А. Халилова, Э. А. Исламмагомедова, С. Ц. Котенко, С. А. Магадова // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2011. - №4.

79. Халилова, Э.А. Содержание свободных аминокислот и витаминов группы В в дрожжах 8асскаготусв8 свгву181ав Y-503 в аэробных и анаэробных условиях культивирования / Э.А. Халилова, С. Ц. Котенко, Э. А. Исламмагомедова // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2010. -№3.

80. Эртен, Х. Влияние нормы задачи дрожжей на процесс брожения и вкусоароматические соединения при высокоплотном пивоварении // Х. Эртен, Х. Тангулер, Х. Какироз // Индустрия напитков. - 2013. - № 2. - С.24-30.

81. Шишков, Ю. И. Повышение биотехнологических свойств пивных дрожжей / Ю. И. Шишков, С. С. Айвазян // Пиво и напитки. - 2006. - № 3. - С. 22-23.

82. Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлегель: Пер. с нем. - М.: Мир, 1987. - 567с.

83. Яровенко, В.Л.Технология спирта/ В.Л. Яровенко, В.А. Маринченко, В.А.Смирнов - М.: "Колос", "Колос - пресс", 2002. - 465с.

84. Инструкция по микробиологическому и технохимическому контролю дрожжевого производства// Москва "Легкая и пищевая пром-сть", 1984. - 190с.

85. Annemuller, G. The Yeast in the Brewery. Management-Pure yeast cultures-Propagation./ G. Annemuller, H.-J.Manger , P. Lietz - Published by VLB Berlin. -2011. - p 440.

86. Ansanay-Galeote, V. Stress effect of ethanol on fermentation kinetics by stationary-phase cells of Saccharomyces cerevisiae / V. Ansanay-Galeote, B.Blondin, S. Dequin, J.-M. Sablayrolles // Biotechnology Letters. - 2011.- 23. - P. 677-681.

87. Attfield, P V. Stress tolerance: the key to effective strains of industrial baker's yeast / P V.Attfield // Nature biotechnology. 1997. - 15. -P.1351-1357.

88. Boulton, C. Brewing yeast and fermentation / C. Boulton, D. Quain -Blackwell Publishing LTD. - 2001. - p. 644.

89. Boulton, C. Brewing Yeast and Fermentation / C. Boulton, D. Quain - Blackwell Science, Oxford.- 2006.

90. Briggs D. E. Brewing Science and practice / D. E. Briggs, C. Boulton, Peter A. -Brookes and Roger Stevens Woodhead Publishing Limited and CRC Press LLC. -2004. - p.860.

91.Casey, G. P. Ethanol tolerance in yeasts / G. P. Casey, W. M.Ingledew // Critical reviews in microbiology - 1986. - № 13 - P. 219-280.

92. Chandler, M. A genomic approach to defining the ethanol stress response in yeast / M. Chandler, G. Stanley, P. Rogers, P. Chambers // Annals Microbiol. - 2004. -54. - P. 427-454.

93. Chandler, M. Defining the ethanol - stress response in Saccharomyces cerevisiae. A thesis submitted for the degree of doctor of philosophy In Victoria University School of Molecular Sciences, Australia. 2004

94.Chi, Z. Saccharomyces cerevisiae strains with different degrees of ethanol tolerance exhibit different adaptive responses to produced ethanol / Z. Chi, N.Arneborg //Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. - 2000. - 24. -P. 75-78.

95. Costa, V. Oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae: Molecular mechanisms of ethanol and hydrogen peroxidestress responses/ Vítor Manuel Vieira da Costa Universidade do Porto. - 1998. - p.136.

96. De Nicola R. Zinc accumulation and utilization by wine yeasts/ R. De Nicola, N. Hall, T. Bollag, G. Thermogiannis, G. M. Walker // International Journal of Wine Research. - 2009. - 1. - P. 85-94.

97. D'Amore, T., Panchal, D.J., Russell, I & Stewart, G.G. 1990 A study of ethanol tolerance in yeast. Critical Reviews in Biotechnology 9, 287-304.

98. Dihn, T. N. Adaptation of Saccharomyces cerevisiae Cells to High Ethanol Concentration and Changes in Fatty Acid Composition of Membrane and Cell Size / T. N. Dihn, K. Nagahisha, T. Hirasawa, C. Furusawa, and H. Shimizu // PLoS ONE. - 2008. - № 3. - P. 1-7.

99. Feldmann, H. Yeast: Molecular and Cells Biology/ H. Feldmann - Wiley VHC Verlag GmbH & Co KGaA, Wienbeim. - 2010. -p.- 329.

100. Hammond JRM Brewing yeast /The Yeasts, 2nd edn (RoseAH & HarrisonJS, eds), pp. 5-67.// Academic Press, London. - 1993.

101. Hohmann, S. Yeast stress response / S. Hohmann, W.H. Mager - Chapman and Hall: New York, NY; 1997.

102.Hucker, B. Vitamins in brewing the impact of wort production the thiamine and riboflavin vitamer content of boiler sweet wort/ B. Hucker, L.Wakeling, F.Vriesekoop //Journal of the Institute of Brewing. 2014.- Volume 120, Issue 3. - P. 164-173.

103. Jouhten, P. Oxygen dependence of metabolic fluxes and energy generation of Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-1A / P. Jouhten, E. Rintala, A. Huuskonen, Anu Tamminen, M.Toivari, M. Wiebe, L. Ruohonen, M. Penttilä and H. Maaheimo // BMC Systems Biology. - 2008.

104. Johannes R van Dijken, Ruud A. Weusthuis & Jack T. Pronk / Kinetics of growth and sugar consumption in yeast // ARTICLE in ANTONIE VAN LEEUWENHOEK JANUARY 1993

105.Kalmokoff, M. L. Evaluation of ethanol tolerance in selected Saccharomyces strains / M. L. Kalmokoff, W. M. Ingledew //ABSC Journal. - 1985. - 43. - P.189-196.

106. Kubota, S. Effect of ethanol on cell growth of budding yeast: Genes that are important for cell growth in the presence of ethanol / S. Kubota, I. Takeo, K. Kume, M. Kanai, A. Shitsmukai, M. Mizunuma, T. Miyakawa, H. Shimoi, H. Iefuji, D.Hirata //Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2004. - 68. - P. 968-972.

107. Lei, H. Effects of wort gravity and nitrogen level on fermentation performance of brewer's yeast and the formation of flavor volatiles / Lei, H., Zhao, H., Yu, Z., and Zhao, M. // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2012

108. Lentini, A. The impact of ethanol stress on yeast physiology / A. Lentini et al. // Brewing yeast fermentation performance. - 2003. - P. 25-38.

109. Meledina, T.V. Yeast Physiological State Influence on Beer Turbidity/ T.V. Meledina, S.G. Davydenko and A.T. Dedegkaev // Agronomy Research. -2015. - Vol. 13, № 4.

110. Moneke, A. N. Selection and characterization of high ethanol tolerant Saccharomyces cerevisiae yeasts from orchard soil / A. N. Moneke, B. N. Okolo, A. I. Nweke, L. I. Ezeogu, F. S. Ire // African Journal of Biotechnology. - 2008. - Vol. 7 (24) Dec. - P. 4567-4575.

112. Okolo, B. Toxicity of ethanol, n-butanol, and iso-amyl alcohol in Saccharomyces cerevisiae when supplied separately and in mixtures / B. Okolo, J. R. Johnston, D. R. Berry // Biotechnology Letters. - 1987. - № 9. - p. 431-434.

113. Panchal, C. J. Genetic manipulation of brewing and related yeast strains / C. J. Panchal, I. Russell, A. M. Sills and G. G. Stewart // Food Technology 99, 1984. -P.1068-111.

114. Pietercelie, A. Why vitamins are so important for brewing industry? / A. Pietercelie, A. Debourg //Cerevisia. - 2003. - T. 28. - №. 1. - P. 26-30.

115. Reed, G. Yeast technology (2nd ed.). / G. Reed, T. W.Nagodawithana -Published by Nostrand Reinhold New York. - 1991.- p. 454.

116. Rose, A. H. Alcoholic beverages in Economic / A. H. Rose // Microbiology. London Academic Press. - 1977. - V.1.

117. R.H.De. Deken The Crabtree Effect: A Regulatory System in Yeast //Journal of general microbiology. - 1966. -№ 9.

118. Schulthcss D. Influence of the concentration of branched amino acids on the formation of fusel alcohols/ D. Schulthcss, L. Ettlinger // Journal of the Institute of Brewing, 1978, № 84, pp. 240-243.

119. Slaughter, J. C. Biochemistry and physiology of yeast growth / J. C. Slaughter //Brewing Microbiology. - Springer US, 2003. - P. 19-66.

120. Smart, K. Brewing Yeast Fermentation Performance // Blackwell Science 2003. - p.307

121. Stanley, D. Generation and Characterisation of ethanol-tolerant Saccharomyces cerevisiae mutants / D.Stanley PhD Thesis, School of Engineering and Science, Victoria University, Melbourne. - 2009.

122. Stanley, D. The ethanol stress response and ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae - Review / D. Stanley, A. Bandara, S. Fraser, P.J. Chambers, G.A. Stanley //Journal of Applied Microbiology . - 2010.p. 1-12.

123. Stewart , G. G. Studies on the uptake and metabolism of wort sugars during brewing fermentations // Tech Q Master Brew Assoc. - 2006. - p. 265-269.

124. Titze, J. The Possibilities of Particle Analysis Demonstrated by the Measurement of the Colloidal Stability of Filtered Beer / J. Titze, Fritz J., Parlar H., Ilberg V./Manuel Christian // Journal of the Institute of Brewing. - 2010. -№ 4.

125. Van Uden, N. Alcohol Toxicity in yeasts and bacteria Effects of alcohols on membrane transport in yeasts / N. Van Uden - 1989. - Chapter 5. p.135-140.

126. Vidgren, V. Characterization and functional analysis of the MAL and MPH loci for maltose utilization in some ale and lager yeast strains./ Vidgren, V., Ruohonen, L., and Londesborough, J. // Appl. Environ. Microbiol. - 2005.

127. Verbelen, P. J. Impact of pitching rate on yeast fermentation performance and beer flavor/ . P. J. Verbelen, T. M. L. Dekoninck, S. M. G. Saerens, S. E. Van Mulders, J. M. Thevelein, F. R. Delvaux // Journal: Applied Microbiology and Biotechnology - APPL MICROBIOL BIOTECHNOL. - 2009. vol. 82, no. 1, pp. 155-167.

128. Walker, G.M. Yeast Physiology and Biotechnology / G.M. Walker -JohnWiley & Sons Ltd, Chichester, UK. - 1998. p. 362.

129. White, C. Yeast. The Practical Guide to Beer Fermentation / C. White, J.Zainasheff - Brewers Publications. - 2010. - p. 305.

130. White, P.A. The osmotic stress response of ale and lager brewing yeast strains. In Brewing yeast fermentation performance / P.A. White, A.I. Kennedy, K.A. Smart // 2nd edition, edited by Katherine Smart. - Blackwell Publishing Company. - 2003. -P. 46-60.

9. Приложения

Окраска дрожжей метиленовым синим

Посуда и приборы:

- микроскоп (светопольная микроскопия);

- предметные и покровные стекла;

- тонкая стеклянная палочка;

- фильтровальная бумага.

Реактивы:

- рабочий раствор метиленовой сини

Материалы:

- суспензия дрожжей концентрацией около 107 клеток/мл.

Методика окрашивания. На предметное стекло наносят каплю дрожжевой суспензии и раствора метиленовой сини (0,01 %), закрывают покровным стеклом, излишек жидкости удаляют фильтровальной бумагой, далее наблюдают окрашенный препарат с помощью микроскопа. В поле зрения микроскопа считают общее количество дрожжевых клеток, затем только синие. Таким образом, подсчитывают общее количество клеток (не менее 500) в пяти полях зрения. После подсчета вычисляют количество мертвых клеток в процентах, от общего количества клеток.

Окраска клеток метиленовым синим, сафранином и танином

Приборы и посуда:

- микроскоп;

- предметные и покровные стекла;

- тонкая стеклянная палочка.

Реактивы:

- 0,01 % раствора метиленового синего;

- 1% раствор сафранина в воде;

- 5% раствор танина в воде;

- физиологический раствор (0,9% раствор №С1).

Материалы:

п

- суспензия дрожжей концентрацией около 10 клеток/мл.

Методика окрашивания.

Дрожжи отцентрифугировать в течение 5 мин при 4000 об/мин. Слить надосадочную жидкость, промыть физиологическим раствором и снова отцентрифугировать. Приготовить суспензию дрожжей.

Нанести каплю, суспензии дрожжей на обезжиренное мылом предметное стекло. Оставить высыхать на воздухе при комнатной температуре. После высыхания капли зафиксировать препарат (10 раз провести стеклом в пламени спиртовки). Нагревать несильно. Не пережигать. Залить стекло раствором метиленового синего и выдержать 4 мин при комнатной температуре. Смыть краситель теплой водой. Залить стекло свежеприготовленным раствором танина на 2 минуты. Смыть краситель под струей воды. Залить стекло раствором сафранина на 16 минут. Смыть краситель. Окрашенный препарат приобретает красноватый, а не фиолетовый оттенок. Красным цветом окрашиваются ядра, которые выявляет сафранин.

Микроскопирование проводить нефлюоресцирующим маслом при 400 - кратном увеличении.

Подсчет числа клеток в камере Горяева

Посуда и приборы:

- микроскоп (светопольная микроскопия);

- Камера Горяева;

- тонкая стеклянная палочка;

- фильтровальная бумага.

Материалы:

п

- суспензия дрожжей концентрацией около 10 клеток/мл.

Методика подсчета.

Камера Горяева это предметное стекло, на которое нанесены бороздки в виде сетки. В центральной части бороздки глубже, чем в боковых на 0,1 мм (эти размеры указываются на стекле). Сетка делиться на маленькие и большие квадраты. Площадь одного маленького квадрата-1/400 кв. мм, площадь большого квадрата- 1/25 кв. мм.

Клетки можно считать, как в больших, так и в малых квадратах сетки. На камеру Горяева наносится капля исследуемого препарата и в притирку накрывается покровным стеклом. Число клеток в одном квадрате не должно быть больше 20. Суммируется количество клеток лежащих в квадрате и пересекающие правую и верхнюю границы. Стекла должно прилегать очень плотно друг к другу. На Камере Горяева нанесено две сетки, клетки обычно считают в обеих, для более точных результатов. Клетки считаются в количестве не менее 600. Кол-во клеток в 1 см3 считают по формуле:

а

м=-

Где М - кол-во клеток в 1 см3 суспензии; a - среднее ко-во клеток в 1 квадрате; h - глубина засечки(1/10мм); Б - площадь 1 квадрата сетки, мм2 Кол-во клеток в 1смэ суспензии: 1) а><25х104 2) ах4хю6

Если препарат разводили перед подсчетом, нужно умножить полученный результат на разведение.

Оценка морфологии исследуемых дрожжей

Посуда и приборы:

- микроскоп (светопольная микроскопия);

- предметные и покровные стекла;

- тонкая стеклянная палочка

- фильтровальная бумага.

Материалы:

п

- суспензия дрожжей концентрацией около 10 клеток/мл.

Изменение состава сусла приводит к физиологическим изменениям в нутрии клетки, которые отражаются на интенсивности размножения, дыхания и ряде других параметров. Следовательно, перестройка физиологии сопряжена с изменением в микроморфологии. Размер клеток оценивали с помощью лабораторного микроскопа отраженного света фирмы Karl Zeiss Axio Lab.Al при увеличении объектив 40 и окуляр 10. При микроскопировании учитывали размер клеток, количество почкующихся клеток, количество клеток с вакуолями и ряд других параметров. Готовили препарат дрожжевой суспензии методом «раздавленной каплей», капля суспензии наносится на предметное стекло и накрывается покровным стеклышком. При микроскопировании учитывали размер клеток, зернистость. Подсчитывали общее количество клеток, количество почкующихся клеток, количество клеток с вакуолями в вычисляли в процентах от общего количества.

Ускоренный метод определения физиологической активности

дрожжей

Приборы и посуда:

- одноразовый медицинский шприц фирмы ХЕЛЬМ Медикл ГмбХ , Гамбург ФРГ объемом 10 мл;

- стеклянный стакан вместимостью 50 мл;

- пипетка на 0,5 или 1,0 мл.

Реактивы:

- 40% раствор глюкозы;

- 40% раствор мальтозы;

- восьмикратная питательная среда УР (16% пептона, 16% дрожжевого экстракта)

Материалы:

- суспензия семенных дрожжей.

Методика определения.

1 мл исследуемых семенных дрожжей из дрожжевого сборника поместить в стеклянный стакан объемом 50 мл и добавить 0,5 мл 40% глюкозы или мальтозы, 0,25 мл 8-кратной среды УР и 0,25 мл воды. Все тщательно перемешать пипеткой и набрать в одноразовый медицинский шприц объемом 10 мл, стараясь избежать образование пузырей воздуха. Выдавить остатки воздуха из шприца и герметично запаять его конец. Для этого следует нагреть конец для иглы в пламени спиртовки и расплавившийся пластик сжать металлическим пинцетом рис.8.1.

Герметично запаянные шприцы поставить в термостат при 30°С на 1 час. Через час замерить высоту подъема поршня в шприце. По высоте подъема поршня определить количество образовавшегося СО2 . По количеству выделившегося диоксида углерода можно оценить бродильную активность семенных дрожжей.

Определение бродильной активности

Газометрический прибор (микрогазомер) риунок 9.1., сконструированный И. К. Елецким, изготовляется из стекла и

состоит из стаканчика, чашки с насыщенным раствором поваренной соли, мерной трубки, газоотводной трубки и трехходового крана. Мерная трубка служит для определения количества выделившегося СО2 по высоте столба насыщенного раствора N0, которым наполняют чашку. Газоотводная трубка служит для прохождения газа из стаканчика в чашку. Кран служит для выравнивания внутреннего давления с атмосферным.

Перед началом работы необходимо приготовить насыщенный раствор №С1 и заполнить им чашку до нулевой точки мерной трубки. Насыщенный раствор поваренной соли (40 г №С1 в 100 мл воды), подкрашенный метиленовой синью.

Шлифованные поверхности чашки и стаканчика, а также крана должны быть смазаны техническим вазелином, для того, чтобы прибор не пропускал СО2. Ход определения:

В стеклянный стаканчик 1 внесли 50 мл. питательной среды, далее добавили дрожжевую суспензию в количестве 1,5* 106млн/мл. закрыли стакан манометрической крышкой, притерли ее и смазали вазелином. Затем открыли кран для выравнивания внутреннего давления прибора с атмосферным и поставили прибор в термостат при 30°С. Прибор оставляют в термостате для полного заполнения трубки до отметки 10 мл. отметили время. Прибор И. К. Елецкого используют также для определения мальтазной активности и осмочувствительности дрожжей [55,56].

2

4

1

Рисунок 9.1 - Прибор Елецкого 1 - стакан с манометрической крышкой, 2 - чашка, 3 - измерительная трубка; 4 - газоотводная трубка, 5 - трехходовой кран.

Определение мутности пива

Для определения общей мутности пива (Total Haze) используется методика МВИ 56-05-02. Для измерения мутности используется мутномер Haffmans VOS ROTA 90/25 диапазон измерения от 0,00 до 100,00 ед. ЕВС, разрешение 0,01 ед. ЕВС, красный светофильтр, длина волны 650+30 нм . Измерение проводится в кювете 0,60 мм.

Подготовка пробы:

В химический стакан вместимостью не менее 250 см наливают пиво объемом приблизительно 200 см3. Пробу нагревают до 100оС и отстаивают в течение 10-15 минут для прекращения газовыделения. Допускается аккуратное перемешивание пробы стеклянной палочкой для ускорения процесса газовыделения.

Готовность пробы оценивают визуально, по прекращению выделения пузырьков углекислого газа по всему объему стакана.

Проведение анализа.

Для фильтрованного пива с содержанием алкоголя не более 6,0 (% об.) используют диапазон «0-1»; для крепких сортов пива - диапазон «02,5»; для мутного пива - диапазон «0-10».

Мутномер включают и готовят к работе в соответствии с «Инструкцией по эксплуатации». Кювету мутномера заполняют до ребра цилиндрической части (на высоту 60±2 мм) дистиллированной водой и устанавливают показания Н90 = 0,00 ЕВС и Н25 = 0,00 ЕВС в соответствии с «Инструкцией по эксплуатации». Кювету мутномера заполняют до ребра цилиндрической части (на высоту 60±2 мм) пивом не менее двух раз ополоснув ее этим же пивом.

Выполнение измерений и обработка результатов:

Фиксируют значения Н90/Н25, полученные на пятом цикле наблюдения. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений:

Еср= 0,5 *(Е1+Е2)

где Е1 - значение мутности пива пробы № 1, ЕВС; Е2 - значение мутности пива пробы № 2, ЕВС.

Результат записывают с количеством знаков после запятой, соответствующим количеству знаков после запятой в значении погрешности, указанной в таблице № 1 настоящей инструкции.

Результаты измерения мутности пива при записи в документах представляют в виде:

(Е ±Д), ЕВС (Р=0,95) где Е - среднее значение результатов двух параллельных измерений, ЕВС; А - показатель точности результата измерений для соответствующего диапазона.

Погрешность измерения для мутномера с красным светофильтром и, длиной волны 650+30 нм находят из таблицы № 1 настоящей инструкции для соответствующего диапазона измерений.

Таблица 9.1 - Погрешности измерения для мутнометра

Диапазон измерений мутности, ЕВС Границы абсолютной погрешности результатов измерений (при доверительной вероятности 0,95)

От 0,25 до 1,00 ± 0,03

Св. 1,0 до 10 ± 0,3

Св. 10 до 20 ± 0,6

Св. 20 до 40 ± 1,1

Св. 40 до 60 ± 1,6

Св. 60 до 100 ± 2,6

Метод искусственного состаривания пива

Коллоидная стойкость определяется путем выдержки пива в термостате при 20 0С и занимает длительный период времени. Для ускорения процесса образования коллоидов с целью прогнозирования стойкости пива используют методы ускоренного старения, в частности, один из методов, предложенный аналитической комиссией стран центральной Европы (МЕВАК).

Приборы: -нефелометр (мутномер, турбидиметр);

-термостат, позволяющий поддерживать температуру 60±0,5°С и 0±0,5°С.

Материалы: - пиво.

Проведение испытаний.

В трех образцах пива одной партии измеряют, мутность при 20°С. Образцы выдерживают при температуре 60°С в течение 24 ч в термостате. Затем образцы охлаждают до комнатной температуры и ставят их в термостат на 24 ч при 0°С.

Мутность пива измеряют при 0°С и выражают в формазиновых единицах (ед. мутности) ЕВС. Показания прибора записывают с точностью до десятых долей. Расхождения между параллельными значениями в образцах одной партии пива не должно превышать 0,2 ед. мутности ЕВС. Далее образцы нагревают до комнатной температуры и ставят в термостат при 600С. Цикл: «нагрев-охлаждение» повторяют до тех пор, пока среднее значение мутности не превысит 2,0 ЕВС или не будет наблюдаться опалесценция.

Один цикл нагревания соответствует одному месяцу хранения

пива.

Для более точных результатов проводят исследования с целью определения коэффициента пересчета К.

Для этого те же образцы пива, которые подвергались ускоренному старению, оставляют на хранение при нормальных условиях (в термостате при 20°С). Через определенные промежутки времени (например, через две недели) образцы выдерживают при 0 0С в течение 24 часов и измеряют мутность. Процесс повторяют до тех пор, пока мутность не превысит 2,0 ед. мутности ЕВС

Расчет коэффициента пересчета (К):

К=К / М,

где

N - количество суток, которое выдержал образец пива при 20°С,

М - количество циклов "нагрев-охлаждение", которое выдержал образец пива той же партии при 60°С.

Время (в сутках), в течение которого данная партия пива сохранит прозрачность, находят умножением коэффициента пересчета на количество циклов "нагрев-охлаждение", в течение которых среднее значение мутности образца не превысила 2,0 ед. мутности ЕВС.

В случае необходимости точного определения срока годности пива, его необходимо выдерживать 3 или 6 мес. при температуре 200С.

Определение вицинальных дикетонов и сероводорода в пиве

Для определения содержания вицинальных дикетонов использовали газохроматографическую систему фирмы Hewlett Packard HP 6890 с электронно-захватным и пламенно-фотометрическим детекторами.

Диацетил, 2,3-пентандион и сероводород разделяются в хроматографической колонке и на выходе из нее детектируются. Первые два соединения детектируются электронно-захватным детектором, третье -пламенно-фотометрическим.

В состав системы входят:

- капиллярная хроматографическая колонка, изготовленная из кварцевого стекла, с внутренним диаметром 0,32мм, длиной 50м, неподвижной жидкой фазой; полиметилсшиконом и толщиной пленки 4мкм, выпускаемая фирмой Agilent Technologies или аналогичная;

- автоматический дозатор парогазовых проб фирмы Hewlett Packard HP 7694.

- генератор водорода модели 75-32 фирмы Whatman, США; Система очистки сжатого воздуха модели 75-83 фирмы Whatman, США;

- установка для приготовления деионизированной воды Elix 10+Milli Q, выпускаемая фирмой Millipore, США.

Погрешность данного метода измерения составляет ±10%. Метод основан на определении в ходе одного газохроматографического анализа 2,3-бутандиона (диацитила), 2,3-пентандиона и веществ, образующих указанные соединения в процессе их превращения (в пересчете на диацетил и 2,3-пентандион), а также сероводорода.

Определяемые в ходе анализа количества диацетила и 2,3-пентандиона в пиве соответствуют максимально возможному их

содержанию с учетом превращения ряда компонентов в исследуемом продукте в анализируемые соединения. Материалы:

- вода деионизированная, ГОСТ 6709;

- спирт этиловый ректифицированный, ГОСТ 5962, содержание основного компонента в котором не ниже 96,2%;

- диацетил, содержание основного компонента, в котором не ниже 95 %, выпускаемый фирмой АЫпеИ, США или аналогичный;

- 2,3-пенгандион, содержание основного компонента, в котором не ниже 97 %,%, выпускаемый фирмой АМпсИ, США;

- азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25-89;

- кизельгур;

- бумага фильтровальная лабораторная, ГОСТ 12026.

Проведение испытаний.

Пробы пива, находящегося на различных стадиях брожения доставляются на анализ в банках ёмкостью 250 см с герметично закрывающейся крышкой. Исходная информация для идентификации этих проб: сорт, номер цилиндро-конического танка (ЦКТ), сутки брожения.

Пробы сусла доставляются на анализ из варочного цеха в банках ёмкостью 250 см3 с герметично закрывающейся крышкой, заполненные пробой до верха. До момента обработки, пробы сусла должны находиться в холодильнике при температуре не выше 7 °С. Продолжительность хранения проб сусла не должна превышать 48 часов. Исходная информация для идентификации этих проб: сорт, дата и номер варки, а также номер ЦКБТ, для которого эта варка предназначена.

Подготовка проб сусла и готового пива. Пробы отфильтрованного пива из форфасов, пробы пастеризованного пива из укупоренных бутылок и пробы сусла не требуют дополнительной обработки перед отбором на анализ. Мерным цилиндром отмеряется проба объемом 10 см , переносится в бутылочку для

автоматического дозатора емкостью 20 см , после чего бутылочка герметично закрывается алюминиевым колпачком с уплотнительной прокладкой.

Пробы пива различной степени сбраживания перед отбором на анализ требуют проведения следующей обработки: в коническую колбу

3 3 3

вместимостью 100 см помещают около 50 см пробы и 5 см кизельгура, которые тщательно перемешиваются в течение 1 минуты. Затем содержимое колбы отфильтровывается через бумажный фильтр. Первые

-5

10 см фильтрата отбрасываются, а из остального объема отбирается 10

-5

см пробы в мерный цилиндр, из которого она переносится в бутылочку автоматического дозатора и герметично закрывается алюминиевым колпачком с уплотнительной прокладкой.

Подготовка газохроматографической системы проводится в соответствии с инструкцией по её эксплуатации, разработанной фирмой-изготовителем. Рекомендуемые параметры газохроматографического анализа: Температура колонки начальная 400С, через 0,5 минут подъем температуры до1000С, далее подъем до 1400С и выдержка в течение 8,5 мин при температуре 1400С. Общее время анализа. 21,8 мин.

Давление газа-носителя на входе в колонку при температуре колонки 400С - 16,6 psi. Температура пламенно-фотометрического детектора - 1800С. Рекомендуемые рабочие параметры автоматического дозатора: температура термостатирования пробы - 600С; время термостатирования - 30 минут при анализе диметилсульфида, диацетила и 2,3-пентандиона и 5 минут при анализе сероводорода.

Генератор водорода обеспечивает расход водорода не менее 50

-5

см /мин при давлении до 2 атм. для нормальной работы пламенно-фотометрического детектора.

Система очистки сжатого воздуха обеспечивает расход очищенного

-5

воздуха не ниже 200 см /мин при давлении до 6 атм. для нормальной работы пламенно-фотометрического детектора,

Приготовление градуировочных растворов диацетила, 2,3-пентандиона. Для приготовления стандартных растворов используемых для градуировки хроматографической системы применяется исходный спиртовой раствор, который готовят растворением в 50 см эталона диацетила и 2,3-пентандиона. Для приготовления исходного раствора применяется мерная колба емкостью 50 см с притертой стеклянной пробкой и микрошприц МШ-10м. Концентрация анализируемых компонентов в исходном спиртовом растворе составляет: диацетил 100 ррт 98,2 мг/л; 2,3-пентандион 100 ррт 95,7 мг/л; диметилсульфид и сероводород 100 ррт, 84,6 мг/л. Срок хранения исходного раствора - 1 день при температуре не выше +4°С.

з

В 7 стеклянных бутылочек емкостью 20 см для автоматического

з

дозатора вводится 1,0 см воды; 4 бутылочки сразу же укупориваются, 3 -остаются открытыми. Далее, в каждую из бутылочек вводится исходный раствор. В четыре укупоренных бутылочки исходный раствор вводится микрошприцем через уплотнительную прокладку, в три остальные

3 3

бутылочки - пипеткой емкостью 0,1 см с ценой деления: 0,001 мм . Сразу после этого оставшиеся открытые бутылочки герметично закрывается алюминиевыми колпачками с уплотнительными прокладками.

Вводимый объем исходного раствора и концентрации стандартных растворов сведены в таблица 9.2.

Для построения градуировочного графика используют данные анализа стандартных растворов с содержанием анализируемых компонентов.

Компоненты идентифицируют по абсолютным временам удерживания, используя информацию, накапливаемую в ходе проведения градуировки.

Построение градуировочного графика осуществляется с применением программы «Chemsta-tion», разработанной фирмой Hewlett Packard и поставляемой вместе с системой.

Таблица 9.2 - Схема приготовления градуировочных растворов диацетилаи , 2,3-пентаидиона для проведения анализов пива и сусла

Номер образца Вводимый объем исходного раствора Концентрация,

мкг/л мкг/л

диацетил 2,3-пентандион

1 0,001 9,82 9,57

2 0,002 19,64 19,14

3 0,004 38,28

4 0,008 78,56 76,56

5 0,016 157,12 153,12

6 0,032 314,24 306,24

7 0,064 628,48 612,48

Градуировка прибора выполняется 1 раз в 6 месяцев в том случае, если за этот период не проводилось никаких мероприятий, заведомо приводящих к её изменению. В противном случае градуировка выполняется непосредственно после проведения таких мероприятий. Проведение испытания. Бутылочки с подлежащими анализу пробами помещаются в ячейки дозатора. Все исходные данные об анализируемых пробах и градуировочных растворах заносятся в программное обеспечение прибора. В соответствии с инструкциями проводится анализ градуировочных растворов и подлежащих анализу проб.

Пробы термостатируются при температуре 60°С в течение 30 мин. За это время устанавливается равновесное распределение исследуемых веществ в жидкой и парогазовой фазах.

Количественное содержание анализируемых компонентов определяется по величине площади соответствующих им

хроматографических пиков с учетом предварительно проведенной градуировки методом внешнего стандарта.

Обработка результатов. Программное обеспечение

хроматографической системы позволяет выполнить необходимые расчеты для построения градуировочных графиков, на основании которых также автоматически проводится вычисление содержания анализируемых компонентов в пробах.

Определение ацетальдегида, диметилсульфида, эфиров и высших спиртов в не фильтрованном, фильтрованном и готовом пиве методом

газовой хроматографии

Данная методика применяется ко всем видам пива с содержанием этанола 4-6 % (V/V). Другие виды пива должны быть доведены до 5% содержания этанола (V/V). Эфиры и спирты - это компоненты, которые наряду с ацетальдегидом и диметилсульфидом (DMS) в значительной степени влияют на вкус и аромат пива, которые формируются в процессе брожения. Поскольку описываемый анализ затрагивает относительно летучие компоненты, возможно применение парофазного впрыскивания, что означает, что часть паров над образцом пива впрыскивается в газовый хроматограф после установления равновесия перехода образца из одного состояния в другое при фиксированной температуре.

1. Принцип действия:

После установки равновесия при заданной температуре, часть паров, образовавшихся над исследуемым образцом, впрыскивается в газовый хроматограф, предпочтительно с помощью автоматического пробоотборника.

Разделение компонентов достигается использованием полярной капиллярной колонки с маленьким диаметром. Для определения используется Пламенно-ионизационный детектор (ПИД). Для расчета концентраций в образцы пива добавляется внутренний стандартный раствор.

2. Реактивы

2.1. Химические компоненты

Компонент Чистота Хранение Поставщик Катал. №

Этанол 99,9% RT Merck 1.00983

4-Гептанон 98% RT Aldrich 10,174-5

n-Бутанол 99% RT Aldrich В8,590-0

Дистилл. вода - - - -

2.2.Растворы

2.2.1 Основной внутренний стандартный раствор

Основной внутренний стандартный раствор: (более подробную информацию см. 9.1 и 9.5)

3,0 мл 4-гептанола и 30,0 мл n-бутанола в 100 мл 50% (V/V) этанола. Подготовка: налейте 50 мл этанола в 100 мл мерную колбу. Добавьте в колбу 3.0 мл 4-гептанола и 30,0 мл n-бутанола, используя мерные пипетки. Долейте до 100 мл дистиллированной водой и перемешайте. Стабильность: в течение 1 месяца в холодильнике (0-10° С).

4.2.2. Рабочий внутренний стандартный раствор 20 мл основного раствора (2.2.1) в 1000 мл 5% (V/V) этанола. Подготовка: Налейте 50 мл этанола и около 400 мл дистиллированной воды в 1000 мл мерную колбу. С помощью пипетки добавьте в колбу 20.0 мл основного раствора (2.2.1.). Долейте дистиллированной водой до 1000 мл и перемешайте. Перед использованием переместите раствор в бутылку с диспенсером. Стабильность: в течение 1 месяца в холодильнике, но не дольше, чем раствор 2.2.1.

2.3.Калибровочные компоненты (см. Примечание 9.2 и 9.4.)

Компонент Чистота Хранение Катал. № Aldrich

Heineken Esters & Alcohols Calibration Mix См. сертификат 2-8 ° С 4735-U

Калибровочная смесь включает ацетальдегид, диметилсульфид,

этилацетат, 1-пропанол (п-пропанол), З-метил-1 -бутил ацетат

(изоамилацетат), 2-метил-1-пропанол (изобутанол), 2-метил-1-бутанол

(опт. акт. амилалкоголь), З-метил-1-бутанол (изоамил алкоголь),

этилформиат, 2-пропанон (ацетон), метанол, этилпропионат, этилгексаноат

(этилкапроат), 2,3-бутандион (диацетил)*, 2,3-пентандион*

* - 2,3-бутандион (диацетил) и 2,3-пентандион используются только в комбинации с HLI процедурой 02.12.04.102 (Packaged beer:

Diacetyl ahd 2.3-Pentanedione by Gaschromatography.

При приобретении данных компонентов обращайте внимание на их свежесть. Максимальный срок хранения - 12 месяцев. 4.4.Газы:

- водород, азот (минимальная степень чистоты 99.995 %)

- воздух (технического качества

3.Приборы

3.1.Оборудование (см. 9.3. и 9.4.) Все настройки оборудования определяются индивидуально.

Газовый хроматограф для капиллярных колонок с инжектором деления

образца и пламенно-ионизационным детектором (ПИД):

Температура печи : 60-150 ° С

Предел температуры печи : 150 ° С

Температура инжектора: 155 ° С

Температура детектора : 155 ° С

Газ-носитель: Н2, N2, или Не

Давление газа-носителя: 30-60кРа

Скорость потока газа-носителя: 10-20 мл/мин

Скорость потока на нижнем расщеплении: 10-30 мл/мин Скорость потока на верхнем расщеплении: 2 мл/мин Давление воздуха (FID): 100 кПа Давление водорода (FID): 55 кПа

Автоматический парофазный пробоотборник: напр., Turbomatrix HS-40 (информацию о ручном впрыскивании см. в Приложении п. 11.3) Температура термостатирования в автоматическом пробоотборнике : 40 ° С Время установки равновесия в автоматическом пробоотборнике : 20 мин Кол-во впрыскиваемого образца : 0.5-0.75 мл Температура ввода образца: 60 ° С

РС+ программное обеспечение для газового хроматографа и лазерный принтер или интегратор/записывающее устройство. Аналитические весы Mettler Toledo, точностью 0,1 мг Водный насос

Центрифуга Sigma 2-5 и пробирки для центрифуги

3.1.Капиллярная колонка Колонка DPWAXETR, 60 м * 0.53 мм i.d, с плавленым кремнием, df = 1.0 цм

3.2.Стеклянная тара и аксессуары (см. п.9.5)

3.3.1. 250 мл стеклянные инфузионные бутылки

3.3.2. 250 мл стеклянные инфузионные бутылки с закручивающимися крышками и силиконовыми септами ( для подготовки образцов)

3.3.3. 250 мл мерный цилиндр (для отбора образцов)

3.3.4. 2 мл диспенсер ( или мерная пипетка) (для добавления внутреннего стандарта)

3.3.5. 1 мл стеклянный шприц (3 шт.) (для добавления калибровочных стандартов)

3.3.6. 50 мл, 100 мл, 200 мл, 1000 мл мерные колбы (для приготовления рабочих и калибровочных растворов)

3.3.7. 100 мл мерный цилиндр (для добавления этанола)

3.3.8. 250 мкл стеклянный шприц или пипетка (для приготовления внутреннего стандарта)

3.3.9. виалки для автосемплера, крышки с силиконовыми септами и кримпер.

4. Подготовка образцов

4.1. Отбор проб

При отборе проб во время производства или из кег важно сократить пустующее пространство в горлышке. Этого можно достичь с помощью вспенивания, тогда верхнее пространство будет в основном заполнено С02.

4.2. Хранение образцов

Окончательный продукт (пастеризованный) может храниться при комнатной температуре (20 °С) в темноте максимум 4 месяца. Так как анализируются холодные образцы (0 - 1°С), для предотвращения обильного пенообразования образцы предпочтительно хранить в холодильнике (отдельно от калибровочных компонентов). Образцы комнатной температуры перед началом анализов необходимо охладить в течение 3 часов в холодильнике или в течение 20 мин в тающем льде. Образцы из кег могут храниться в холодильнике (0 - 10 °С) в течение 1 недели.

4.3 Подготовка образцов Если процентное содержание этанола в образце менее 4% (V/V), этанол добавляется в соответствии с таблицей в Приложении 11.1. Образцы пива с содержанием этанола выше 6 % (V/V) разбавляются в соответствии с таблицей см. 11.2. Стандартная процедура приготовления:

- Медленно заполните 250 мл. градуированный мерный цилиндр холодным образцом (0-10 °С).

- С помощью струйного насоса удалите избыточное пиво или пену до необходимых 250 мл.

- Мерной пипеткой или диспенсером добавьте 2 мл стандартного рабочего раствора (2.2.2.) в инфузионную бутылку.

- Затем немедленно добавьте образец

- Закройте завинчивающейся крышкой с силиконовой септой и тщательно перемешайте.

Таким образом, образцы подготавливаются один за другим. После того как приготовлена серия образцов, каждая инфузионная бутылка хранится закрытой, по крайней мере, 5 мин. во избежание пенообразования.

Подготовленные образцы могут храниться в холодильнике (0-10 °С) в течение 2 дней.

5. Процедура

5.1 Калибровка (см. 9.4 по процедуре калибровки с использованием отдельных компонентов). Калибровка проводится с использованием калибровочной ампулы (2.3.) и 5% раствора этанола (см. 6.5). 5.2 Использование ампулы (см.4.3)

Сразу после извлечения ампулы с Heineken Esters & Alcohols Calibration Mix из морозильной камеры, поместите ее содержимое в виалу для автоматического пробоотборника,сломав верхушку ампулы и перелив смесь в виалу Немедленно укупорьте виалу с помощью кримпера. Оставьте виалу на столе, пока температура микса не достигнет комнатной. После этого, смесь готова к использованию.

5.3. Приготовление калибровочной матрицы (5% V/V раствора этанола

Налейте 200 мл чистого этанола (99,9%) в 6 л колбу и добавьте 3800 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешайте, переворачивая колбу. Этого количества раствора достаточно для одной калибровки.

5.4. Подготовка калибровочных образцов (см.7.5).

- Подготовьте 13 инфузионных бутылок с 5% (V/V) раствором этанола, как описано в параграфе 4.3 «Подготовка образцов», начиная со слов: «Медленно заполните 250 мл градуированный мерный цилиндр...»., но заменив пиво 5 % (V/V) ратвором этанола (7.1.2)

- Добавьте через септу, используя 1000 мкл шприц, соответственно: 0, 100, 100, 100, 200, 200, 400, 600, 800, 800, 1000, 1000 и 1000 мкл Heineken Esters & Alcohols Calibration Mix

-Тщательно размешайте. -Подождите 5 мин перед открытием бутылок. 5.5. Анализ калибровочных образцов