Биотехнология пива с применением дрожжей Brettanomyces: особенности производства и новый ассортимент продукции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат наук Юрицын Илья Александрович

• Юрицын Илья Александрович
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Юрицын Илья Александрович

И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Схема экспериментальных исследований

2.2 Характеристика объектов исследований

2.2 Методы исследования

Глава 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ

НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ BRETTANOMYCES

3.1 Исследование влияния интенсивности аэрации на жизнедеятельность дрожжей Brettanomyces bruxellensis

3.2 Условия продуцирования уксусной кислоты дрожжами

Brettanomyces

Глава 4 ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК

И МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ДРОЖЖЕЙ BRETTANOMYCES

4.1 Исследование кинетики утилизации глюкозы дрожжами Brettanomyces bruxellensis

4.2 Моделирование процесса брожения

Глава 5 ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ОСНОВНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

5.1 Установка для пропагации чистой культуры дрожжей

5.2 Технология пива с применением дрожжей Brettanomyces

5.3 Исследование сенсорного профиля образцов пива

5.4 Расчет технико-экономических показателей

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. В настоящее время в пивоварении часто применяют для сбраживания сусла дрожжи 8асскатотусе8 сегеу181ае как в виде чистых культур, так и в сухом виде. Многообразие сортов пива требует проведение эффективной и высококачественной ферментации с помощью других видов дрожжей без вероятности контаминации среды дрожжами-вредителями производства и бактериальной микрофлорой.

Один из способов повышения микробиологической стойкости пива и стабилизации его вкуса - использование стандартного посевного материала. Решением этой проблемы для заводов малой производительности является применение сухих активных пивных дрожжей (АСПД), полученных в асептических условиях и имеющих высокую ксерорезистентность - сохранение жизнеспособности во время обезвоживания и длительного хранения в дегидратированном состоянии.

На сегодняшний день все более востребованным в пивоварении становится намеренное применение других видов дрожжей, микроорганизмы в процессе биохимического расщепления углеводов, органических кислот, углеродсодержащих соединений создают особый вкусо-ароматический профиль готового напитка.

Дрожжи ВгеШпотусе8 при применении в специфичных условиях часто превосходят сегеугзгае: в среде со сниженным содержанием аминного азота, низким значением pH и повышенным уровнем этанола, а также в условиях лимитированного содержания углеводов и кислорода в среде показывают более высокую скорость роста, чем сегеу181ае.

При применении дрожжей ВтеИапотусе8 необходимо применение установки для пропагации c сокращением количества генераций, применяемых при ферментации сусла, снижением опасности инфицирования, увеличением периода адаптации дрожжевых клеток к суслу, повышением стабильности качества продуктов пивоварения.

Актуально совершенствование машинно-аппаратурных схем для пропага-ции чистых культур дрожжей Brettanomyces (ЧКД) при получении засевных дрожжей за определенный промежуток времени в достаточном количестве, с гарантированной микробиологической чистотой и высокой жизнеспособностью.

Исследования направлены на разработку технологии напитков с применением дрожжей Brettanomyces, что позволит расширить ассортимент и конкурентоспособность пивоваренной продукции в России.

Степень разработанности темы. Исследованиями в области биологии, условий жизнедеятельности, обмена веществ дрожжей, применяемых в пивоварении, занимались Т.В. Меледина, М.В. Гернет, К.В. Кобелев, Б.Н. Федоренко, В.А. Помозова, Е.Д. Фараджева, Л.В. Пермякова, J. Steensels, E. Meersman, K.J. Verstrepen, J. Blomqvist.

Работа выполнена в рамках прикладных научных исследований и экспериментальных разработок приоритетного направления развития НОЦ «Живые системы» ВГУИТ «Живые системы в технологиях переработки сельхозсырья и обеспечении здорового питания»; плана госбюджетной инициативной научно-исследовательской работы кафедры «Технология бродильных и сахаристых производств» по теме «Совершенствование технологических процессов бродильных и сахаристых производств с использованием физико-химических, ресурсосберегающих, биохимических методов воздействия и нетрадиционного сырья».

Цель диссертационной работы: научное обоснование преимуществ и условий производства сортов пива на основе идентификации физиолого-био-химических особенностей дрожжей Brettanomyces.

В соответствии с поставленной целью решались задачи: провести исследование влияния интенсивности аэрации среды на процесс накопления биомассы дрожжей Brettanomyces, изменение концентрации этанола и уксусной кислоты в среде при культивировании;

изучить условия продуцирования уксусной кислоты и биосинтеза этанола различными видами дрожжей Brettanomyces в процессе выращивания биомассы;

с помощью методов математического моделирования оптимизировать режимы процесса культивирования дрожжей ВтеИапотусе8 в цеховой стадии;

исследовать и математически описать кинетику утилизации углеводов в среде, разработать математическую модель процесса спиртового брожения дрожжами ВгеШпотусе8;

предложить и обосновать модифицированный способ пропагации дрожжей ВгеШпотусе8 для применения в условиях пивопроизводства;

разработать проекты технической документации, провести апробацию технологии в опытно-производственных условиях, рассчитать экономическую эффективность технологических решений. Научная новизна.

Изучено влияние уровня аэрации на изменение концентраций субстрата, уксусной кислоты и этанола при культивировании дрожжей ВгеШпотусе8 для получения максимального количества дрожжевых клеток. По концентрационным зависимостям количества биомассы от продолжительности процесса выявлен оптимальный уровень аэрации для роста культуры в рассматриваемых условиях: для получения максимальной концентрации биомассы 8,5 г/дм3 уровень аэрации составил 60 дм3/ч.

Получено стехиометрическое уравнение в общем виде для проведения расчетов количественного изменения концентрации этанола и уксусной кислоты в среде в зависимости от режима аэрации в условиях роста биомассы дрожжей ВгеШпотусе8.

Исследована способность различных штаммов дрожжей В. Ъгихе11ет18, В. ШегтеШш, В. стХетягапт, В. с1ашепи к выработке уксусной кислоты в среде: штаммы дрожжей сбраживают углеводы с различной интенсивностью, по уровню биосинтеза располагаются в ряду по убыванию при единых условия выращивания.

Оптимизированы режимы процесса культивирования дрожжей в среде при постоянном уровне аэрации в течение 90 ч с помощью математических методов (центральное композиционное ротатабельное униформпланирование

и полный факторный эксперимент 32) с варьированием температуры среды и режимов перемешивания в аппарате.

Разработаны математические модели для анализа процессов спиртового брожения среды дрожжами Brettanomyces с формализованным описанием кинетики утилизации субстрата, накопления биомассы дрожжевых клеток, биосинтеза вторичных и побочных продуктов брожения.

Теоретическая и практическая значимость.

Обосновано применение дрожжей B. bruxellensis (Y966) с биосинтезом уксусной кислоты и этанола для производства специфичных сортов пива. Определены условия и режимы культивирования дрожжевых клеток в цеховой стадии при различных уровнях аэрации среды, температуры процесса пропагации и перемешивания. Оптимальными условиями для максимального объемного выхода уксусной кислоты - 0,114 г/(дм3*ч) были выбраны температура среды 28 °C и скорость вращения мешалки 250 об/мин.

Перечень установленных закономерностей формируют знания в области применения «живых систем» в технологиях пищевых продуктов. Результаты экспериментальных исследований используются в образовательном процессе для подготовки бакалавров и магистров по направлениям 19.03.02, 19.04.02 «Продукты питания из растительного сырья», 19.03.01, 19.04.01 «Биотехнология».

Конкретизирована технология пива с применением дрожжей Brettanomyces. Разработаны рецептуры напитков, что позволит повысить эффективность технологического процесса, увеличить ассортимент и конкурентоспособность продукции. Разработан способ выращивания биомассы дрожжей Brettanomyces на установке для пропагации с применением разработанных технических решений.

Новизна технических решений и практическая значимость работы подтверждена патентом на полезную модель «Установка для пропагации чистой культуры дрожжей», зарегистрирован программный продукт «Программа для расчета характеристик процесса ферментации пива».

Разработаны проекты технической документации на сорта пива с применением дрожжей ВтеШпотусез: ТУ 9184-501-02068108-2019, ТИ ТУ 9184-50102068108-2019. Установлены регламентируемые показатели качества и безопасности, дана комплексная оценка, обоснованы режимы и сроки хранения разработанной продукции. Основные финансово-экономические показатели выполненных разработок доказывают экономическую целесообразность внедрения разработанных технологических и технических разработок в производство: расчетный экономический эффект от реализации предлагаемых технических и технологических решений составляет 2 378,03 тыс. руб. при производстве 90 000 дал пива в год.

Методы исследования.

В работе применяли современные инструментальные, химические, орга-нолептические, биохимические, микробиологические методы исследования сырья, полуфабрикатов и готовой продукции. Экспериментальные результаты представлены после статистической обработки данных выборки из 3-5 опытов.

Научные положения, выносимые на защиту:

физиолого-биохимические особенности дрожжей Brettanomyces: кинетика биосинтеза этанола, уксусной кислоты при выращивании биомассы на уг-леводсодержащих средах;

рациональные и оптимальные условия реализации процесса пропагации дрожжей ВтеШпотусез, полученные с помощью математического моделирования: уровень аэрации, температура процесса, режим перемешивания;

математические модели для анализа процессов спиртового брожения среды дрожжами Bтettanomyces с формализованным описанием кинетики утилизации субстрата, накопления биомассы дрожжевых клеток, биосинтеза вторичных и побочных продуктов брожения;

модифицированная технология производства специфичных сортов пива с применением технических решений для разработки установки для пропага-ции дрожжей Bтettanomyces в цеховой стадии.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертационное исследование соответствует пп. 2, 5, 11 паспорта специальности 05.18.07 - «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ».

Степень достоверности и апробация результатов.

Основные результаты работы подтверждены сравнительной проработкой информационно-патентных данных; применением современных объективных методов анализа, математической обработкой результатов исследования. Основные положения диссертационной работы опубликованы в научных изданиях, доложены и обсуждены на ежегодных научных сессиях в ФГБОУ ВО «ВГУИТ», на российских, международных, всероссийских научно-практических конференциях: «Инновационные решения при производстве продуктов питания из растительного сырья», Воронеж, 2016; «Современные проблемы техники и технологии пищевых производств» (Барнаул, 2017, 2019); «Актуальные вопросы нутрициологии, биотехнологии и безопасности пищи» (Москва, 2017); «Продовольственная безопасность: научное, кадровое и информационное обеспечение» (Воронеж, 2017, 2018), «Новое в технологии и технике функциональных продуктов питания на основе медико-биологических воззрений» (Воронеж, 2019), «Современные проблемы техники и технологии пищевых производств» (Барнаул, 2019). Результаты работы экспонировались на выставке инновационных продуктов VIII Международного Агропромышленного конгресса (Воронеж, 2018), на выставке III Международного семинара компании «Профимальт» (Липецк, 2019), IV Международной выставке изобретений и инноваций (Воронеж, 2019).

Проведена апробация предлагаемых технологий в опытно-промышленных условиях ООО «П.И.Н.Т.А КРАФТ» (г. Воронеж, 2018-2019 гг.), подтвердившая реальные возможности внедрения предложенных технологических и технических решений (акт испытаний).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 6 статей в изданиях РИНЦ (1 статья в издании, индексируемом в БД Web of Science), получен один патент на полезную модель, одно свидетельство РОСПАТЕНТА о регистрации программ для ЭВМ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов по основным результатам работы, списка литературы из 139 наименований, в том числе 68 на иностранных языках, приложений, представлена на 127 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы, 31 рисунок.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации, состоит в анализе информации по изучаемой проблеме, выборе направления исследований, постановке и выполнении основной части экспериментов, исследовании влияния различных факторов на эффективность процесса пропагации, разработке математических моделей процесса культивирования биомассы и спиртового брожения с помощью дрожжей Brettanomyces, оценке качества готовой продукции. Автором разработаны проекты технической документации на новые виды продукции, проведена промышленная апробация предлагаемых технических и технологических решений.

Условные обозначения

х - концентрация биомассы, г/дм3; s - концентрация глюкозы, г/дм3; pi,p2 - концентрация этанола и уксусной кислоты соответственно, г/дм3; ¡max - максимальная удельная скорость роста, 1/ч; Yx/s - выход биомассы по отношению к субстрату, г/г; а - отношение удельной скорости роста к выходу продукта, г/г; Ks - константа Михаэлиса, г/дм3; Ki - обратное значение константы ингибирования г/дм3; q - экспоненциальный коэффициент; G, M, N, X- концентрация глюкозы, мальтозы, мальтотриозы и биомассы соответственно, моль/м3; ¡1-3 - удельные скорости поглощения глюкозы, мальтозы и мальтотриозы соответственно, 1/ч; ui - максимальная скорость реакции, 1/ч; Ki - константа Михаэлиса, моль/м3; K i - константа ингибирования i-го сахара, моль/м3; i = G, M, N; ¡uo, Kio, K\o - фактор частоты соответствующей константы; fix = (Yxgц +yxmц2 + т^з ), Yxi - коэффициент выхода, моль биомассы/моль i-го сахара; Kx - эмпирическая константа ингибирования роста дрожжей, моль/м3; Xo - начальная концентрация дрожжей, моль/м3; E - концентрация этанола, моль/м3; T- температура, °С; р - плотность сусла, кг/м3; Cp - удельная теплоемкость сусла, кг/(моль*К); AHi - энтальпия образования i-го сахара, Дж/моль; d = 1- e~'ltd - задержка потребления аминокислоты первого рода; т - время, ч; Td - константа времени первого рода, ч; Yjx - коэффициент выхода, моль j-ой аминокислоты/моль биомассы; j = L, I, V; OHj - спирт, полученный из оксикислоты, которая соответствует аминокислоте AAj.

ГЛАВА 1 АНАЛИЗ ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРОИЗВОДСТВА НАПИТКОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЕЯЕТТЛМОМУСЕЗ

1.1 Таксономия и морфология ЕгвПапотуевБ

Дрожжи рода Bтettanomyces известны с 1904 г. как микроорганизмы, обнаруженные при дображивании пива, и с тех пор были выделены в большинстве напитков брожения, таких как пиво, вино или сидр и при производстве спирта [1-5].

Bтettanomyces считается анаморфом рода Dekkeтa. Наиболее известными видами Bтettanomyces являются: bтuxellensis, ШеутеШш, апота!ш, abstinens, сШшепи.

Морфология этих дрожжей может меняться в зависимости от условий среды. Форма клеток эллипсоидная, стрельчатая, цилиндрическая, удлиненная, размеры клеток меньше, чем у Sacchaтomyces, но они легко различимы в оптическом микроскопе, бывают изолированными, парными или формируют малые цепи и псевдомицелий [6, 7]. Клетки размножаются мультиполярным почкованием, в стадии размножения образуют аски, содержащие от 1 до 4 аскоспор. Рост клеток достаточно медленный, с выделением в среду большого количества уксусной кислоты [8].

В условиях стресса клетки дрожжей Bтettanomyces становятся мелкими и могут проникать через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм, в этой форме они считаются жизнеспособными, но не культивируемыми, т. е. способны возобновить нормальный рост только после обогащения среды питательными компонентами [9-11].

Физиологические и метаболические аспекты жизнедеятельности

дрожжевых культур

В зависимости от рассматриваемого вида и условий культивирования у дрожжей рода Bтettanomyces присутствует ферментативный или окислительный тип метаболизма. Первый этап преобразования глюкозы, известный как

гликолиз, проходит в цитозоле и является общим для ферментации и дыхания. Он включает в себя серию из десяти реакций, каждая катализируется определенным ферментом. Гликолиз приводит к образованию двух молекул пирувата, которые активируют дыхательный или ферментативный путь метаболизма [2, 12].

Для объяснения выявленных закономерностей метаболизма клеток дрожжей Bтettanomyces разграничивают следующие этапы биохимического процесса: с одной стороны, дыхание клетки активируется только в аэробной среде (при наличии кислорода). Данный путь формируется из трех основных стадий: производство АТФ; регенерация кофактора N^0+ и формирование промежуточных углеродных радикалов для клеточного биосинтеза. Процесс дыхания заключается в преобразовании пирувата с помощью пируват дегидро-геназы в ацетил-КоА, который вступает в цикл Кребса (процесс происходит в митохондриях клетки) с последующей активацией дыхательной цепи [13].

Теоретический аэробный баланс процесса дыхания можно представить в виде уравнения в общем виде:

ОДА + 6O6 + 38Пи + 38АДФ ^ 6С02 + 6Н20 + 38АТФ + 688 ккал

Ферментативный метаболизм инициируется в дрожжевой клетке в анаэробных условиях. Пировиноградная кислота, выработанная в конце процесса гликолиза, декарбоксилируется в ацетальдегид, затем в этанол благодаря NADH+, при окислении образуется глицеральдегид-3-фосфат. Данные превращения сопряжены и связаны окислительно-восстановительным механизмом.

Теоретический анаэробный баланс представлен в общем виде уравнением: ОДА + 2Пи + 2АДФ ^ 2С2Н5ОН + 2С02 + 2АТФ + 56 ккал

Анаэробный путь гликолиза по сравнению с аэробным показывает достаточно низкое энергопотребление (2 АТФ/на молекулу глюкозы), поскольку в данном случае энергия расходуется только на фосфорилирование на уровне субстрата и дыхательной цепи.

Теоретический выход этанола составляет 0,51 г на 1 г потребленной клеткой глюкозы. Однако состав, синтез клеточной инфраструктуры и образование вторичных соединений (уксусная кислота, синтез резервных веществ) ограничивают это количество до 80-90 % от теоретической величины. В этих условиях прирост биомассы составляет около 0,10 г./г глюкозы [14, 15].

Скорость полиферментативного процесса спиртового брожения с участием Bтettanomyces в начале цикла не высока, однако наблюдается повышение выхода этилового спирта: дрожжи могут продуцировать до 13 % об. этанола в среде без возникновения ингибирующего воздействия на клетку [16-19].

Требования к составу среды для дрожжегенерирования

Жизнедеятельность дрожжей Sacchaтomyces и Bтettanomyces определяется ростом биомассы, развитием, размножением клеток, формированием определенного обмена веществ, приспосабливаемостью к внешним условиям. Для размножения дрожжевых клеток важен состав питательной среды, в которой находятся различные компоненты, необходимые для развития клеток, что является определяющим для скорости размножения клеток дрожжей и количества образующейся биомассы. Растворенные в среде компоненты, в зависимости от концентрации в среде и их природы, будут иметь различную степень влияния на активацию или ингибирование роста клеток. Оптимальный состав питательной среды полностью обеспечивает возможность индуцированного биосинтеза ферментов, которые, в свою очередь, через промежуточные продукты обмена оказывают влияние на образование конститутивных ферментов, поэтому важно рассматривать характеристики Bтettanomyces в сравнении с дрожжами семейства сахаромицетов (Sacchaтomycetaceae) [20, 21].

Диссимиляция углеродсодержащих соединений

Углеродные соединения представляют собой источник ассимилируемого углерода и энергии для микроорганизмов, в основном, это сбраживаемые углеводы. Дрожжи рода Bтettanomyces способны сбраживать глюкозу, сахарозу,

мальтозы, трегалозу, целлобиозу, лактозу [22, 23]. С другой стороны, Saccharomyces не обладают такими широкими возможностями сбраживания, в т. ч. углеводов с пятью атомами углерода в молекуле, таких как ксилоза или арабиноза [19]. Оба вида дрожжей могут продуцировать этанол, молочную кислоту, янтарную кислоту.

Усвоение глюкозы из питательной среды с участием Saccharomyces и Brettanomyces anomalus начинается с её переноса в клетку путём облегчённой диффузии с участием конститутивного фермента-переносчика гексозоперме-азы, локализованного в цитоплазматической мембране [24]. Конститутивные ферменты присутствуют в клетке независимо от наличия субстрата. Молекула глюкозы присоединяется к активному центру молекулы гексозопермеазы, после чего пермеаза совершает «кувырок» в цитоплазматической мембране, перенося молекулу глюкозы в цитоплазму, где она отсоединяется от активного центра гексозопермеазы и сразу же фосфорилируется до глюкозо-6-фосфата с участием АТФ и фермента фосфогексакиназы.

Среди углеводов, потребляемых Brettanomyces, целлобиоза имеет важный промышленный интерес. Так, использование этих дрожжей позволит проводить одновременно осахаривание и ферментацию на субстрате из целлобиозы. Известно, что ß-глюкозидаза является ферментом гидролиза цел-лобиозы [3, 25]. В этой связи использование Brettanomyces clausenii и custersii является предпочтительным.

Дрожжи Brettanomyces способны развиваться на средах, содержащих этанол как единственный источник углерода, предварительно преобразовав его в ацетаты. Дрожжи могут также использовать и уксусную кислоту в качестве единственного источника углерода с содержанием в среде до 3 % об. для значений рН от 3 до 6 [26, 27].

Азотистый обмен дрожжевой клетки Азот вступает в реакции формирования молекул аминокислот, нуклео-тидов, витаминов и коферментов, необходимых для протекания

многочисленных синтетических реакций. Исследования, проведенные в работе по Sacchaтomyces ellipsoideus показали [28], что чем выше содержание клеток дрожжей, богатых азотом, тем выше интенсивность процесса брожения, дыхательная деятельность клетки при этом снижается.

Дрожжевые клетки синтезируют аминокислоты, входящие в состав их белка, непосредственно за счет неорганических и органических форм азота среды. Дрожжи Bтettanomyces bтuxellensis и inteтmedius способны потреблять нитраты, в отличие от родов Sacchaтomyces, Kluveтomyces, Pichia и пр., для которых единственным источником усвояемого неорганического азота является ионы аммония [14, 19]. В ферментативных системах Bтettanomyces апотаЫ8 присутствуют редуктазы, обеспечивающие превращения нитратов и нитритов. Однако ингибитором активности этих ферментов может служить повышенное содержание в среде ионов аммония, что способствует использованию только органических источников азота [23]. Как правило, сульфат аммония и диамми-ачные фосфаты являются наиболее часто используемыми солями, которые выступают в качестве источника азота, так как они одновременно переносят в клетку необходимую серу и фосфор [29]. Наконец, использование и усвоение азота аммония и аминного азота варьируется в зависимости от используемых дрожжей и зависит от многих факторов, а именно, аэрации, концентрации углеродного субстрата, а также собственной концентрации источника азота. Исследования, проведенные [30] о потребностях в питании Bтettanomyces bтuxellensis, показали, что сульфат аммония оказывает значительное влияние на потребление глюкозы, накопление биомассы и выход этанола. В экспериментальных условиях авторы наблюдали сдерживающий эффект роста дрожжей при превышении содержания сульфата аммония в среде на 2 г/дм3.

Усвоение фосфора, микроэлементов, витаминов

Фосфорсодержащие соединения необходимы для роста дрожжей и процессов брожения. Роль фосфора заключается в сохранении целостности клеточной стенки, участии в синтезе липидов и углеводов. Потребляемый дрожжами

фосфор участвует в синтезе нуклеиновых кислот, играет важную роль в энергетическом обмене клеток. Содержание фосфатов в среде не является ограничивающим фактором для развития B. bruxellensis. Вероятно, этот ион содержится в достаточном количестве в «естественной» среде брожения или в дрожжевом экстракте в синтетических средах [6, 31].

Микроэлементы имеют важное значение для дрожжевой клетки, так как они выступают в качестве кофакторов различных ферментов, участвующих в метаболизме. Они необходимы в очень малых количествах, их избыток приводит к нарушению морфологии, клеточной физиологии и темпов роста. По отношению к стимуляторам роста дрожжи рода Brettanomyces считаются ауксо-автотрофами, так как было показано, что они способны расти при полном отсутствии витаминов [14]. Согласно литературным данным наличие витаминов в среде для Saccharomyces является необходимым: например, в среде, ограниченной в тиамине и биотине, конечное количество биомассы очень низкое (10 % от нормальной популяции), усвоение углеводов происходит с низкой скоростью [16].

Катаболические механизмы для освобождения энергии в биохимических

процессах

Активация метаболических путей клеток дрожжей зависит от генетических механизмов клетки и физико-химических факторов среды, таких как: pH, температура, кислород, наличие ингибирующих соединений, а также концентрации субстрата: концентрация глюкозы и уровень аэрации в среде играют важную роль. Существуют различные механизмы регуляции биохимических процессов в клетках дрожжей Saccharomyces, Brettanomyces: эффект Пастера, эффект Кребтри и эффект Кастера [32-35].

Энергетический обмен в клетках дрожжей при жизнедеятельности в аэробных и анаэробных условиях впервые рассматривал Пастер: он обнаружил ингибирование процесса брожения аэрацией. При низких концентрациях

углеводов в среде аэрация вызывает увеличение количества образующейся биомассы, снижение выхода спирта и потребления углеводов [14, 19]. Для объяснения метаболического поведения предложена гипотеза: «... ингибирование брожения путем аэрации может быть объяснено конкуренцией ферментов катализатора дыхания и пирувата брожения». Когда два фермента конкурируют за один и тот же субстрат, константа сродства фермента обратно пропорциональна скорости ферментативной реакции и является решающим параметром для ориентации метаболического потока для любого из путей. В частности, пи-руватдекарбоксилаза отвечает за расщепление пирувата до ацетальдегида имеет более низкое сродство к нему, чем комплекс пируватдегидрогеназы митохондрий, отвечающих за его окисление. Другим примером является уровень ацетальдегида. Константа сродства ацетальдегиддегидрогеназы (6 мкМ) в 100 раз ниже, чем у алкогольдегидрогеназы (0,61 мкМ), ацетальдегид окисляется до ацетата (уксусная кислота) [36]. Данный катаболический эффект присутствует в биохимических фазах энергетического обмена дрожжей рода Saccharomyces, в Brettanomyces - отсутствует.

Кребтри обнаружил, что выращивание дрожжевых клеток в аэрируемой среде с избытком глюкозы является благоприятным для процесса спиртового брожения [14]. Это явление объясняется дефицитом дыхательной способности клеток и тем, что они вынуждены накапливать пируват путем ферментативного метаболизма для дальнейшей жизнедеятельности [17]. Дрожжи считаются «Кребтри положительными», если при высокой концентрации глюкозы в среде наблюдается образование этанола. С другой стороны, дрожжи, которые, участвуют в аэробном метаболизме (дыхании) даже при сравнительно высокой концентрации углеводов в среде, называют «Кребтри отрицательными». Дрожжи рода Saccharomyces и Brettanomyces считаются Кребтри положительными [3638].

Эффект более быстрого сбраживания глюкозы в аэробных, чем в анаэробных условиях происходит у некоторых дрожжевых культур, особенно

дрожжей рода Bтettanomyces. Эффект Кастера является результатом избыточного образования NADH в связи с образованием уксусной кислоты, которая вызывает окислительно-восстановительный дисбаланс (КЛО+/ КЛОН) и неспособность клеток к продуцированию глицерина [36]. Это явление объясняют следующим образом: в присутствии кислорода клетка может легче реоксиди-ровать свои коферменты в дыхательной цепи, что позволяет увеличить глико-литический приток. Отмечают, что дрожжи Sacchaтomyces не подвержены влиянию эффекта Кастера, что приводит к активации спиртового брожения при отсутствии кислорода (имеет место эффект Пастера) [38].

1.2 Влияние параметров среды на регуляцию обмена дрожжевых клеток

На интенсивность роста микробной биомассы влияют состав среды и физико-химические факторы (температура, водородный показатель, уровень аэрации). В частности, биохимические и биологические особенности клеток, которые могут изменяться под воздействием факторов, определяют способность дрожжей к флокуляции, обеспечению необходимой интенсивности накопления биомассы и бродильной активности [39, 40].

Влияние температуры на жизнедеятельность дрожжей

Одним из наиболее доступных способов регуляции метаболизма дрожжей является температура. При низких температурах активность микробных клеток может быть полностью блокирована, повышение температуры увеличивает скорость роста биомассы. Однако, за пределами определенного температурного интервала возникает необратимый автолиз клеток с денатурацией белков-ферментов, строительных белков, с повреждением транспортных систем, мембран клетки. Таким образом, даже если некоторые конститутивные и индуцируемые ферменты активируются при высоких температурах, клетка может быть повреждена. В случае применения низких температур клеточные мембраны теряют текучесть, скорость ферментативных реакций замедляется [19].

Изменение температуры вызывает различия в механизмах и интенсивности образования вторичных и побочных продуктов спиртового брожения, таких как глицерин, уксусная кислота, янтарная кислота и др.

Исследование [41] о влиянии температуры на жизнедеятельность Sacchaтomyces ceтevisiae в процессе спиртового брожения показало увеличение продолжительности лаг-фазы при низких температурах (15 °С), однако популяция оставалась жизнеспособной на протяжении всего процесса. С другой стороны, при высокой температуре (35 °С) процесс сбраживания проходил с большей интенсивностью, однако, наблюдали снижение количества жизнеспособных клеток. Авторы фиксировали увеличение биосинтеза вторичных продуктов брожения при высокой температуре, при более низких температурах - более высокий выход этанола. В целом, оптимальная температура для развития большинства дрожжевых культур составляет от 25 до 30 °

Влияние водородного показателя на развитие микроорганизмов

Развитие микроорганизмов во многом зависит от такого фактора внешней среды как концентрация ионов водорода или рН. Цитоплазматическая мембрана дрожжевой клетки сравнительно малопроницаема для водородных и гидроксильных ионов, поэтому их концентрация в цитоплазме остаётся практически постоянной, что существенно для постоянного уровня обеспечения жизненно важных функций клетки. Показатель определяет метаболическую активность клеток, оказывает влияние на растворимость питательных веществ и проницаемость клеточных мембран [42, 43].

В отличие от температуры внутренний рН клетки отличается от значения рН в среде: для дрожжей Sacchaтomyces ceтevisiae и Bтettanomyces оптимальное значение находится в зоне 4,8-6,0. Это различие между внутренним и внешним рН может быть результатом непроницаемости плазматической мембраны клетки для протонов. Межклеточная и межклеточная концентрация ионов водорода является несбалансированной, возможно возникновение

градиента концентрации ионов через мембрану, который в сочетании с электрическим потенциалом мембраны определяет движущую силу протонов и обеспечивает управление мембранными реакциями [44, 45].

рН клетки оказывает важное влияние на активность клеток и межклеточных систем, синтез белка, транспортные механизмы, ферментативную активность и экскрецию метаболитов во время брожения. рН среды может повлиять на скорость, с которой молекулы транспортируются внутрь клетки, экстремальные значения рН могут привести к повреждению клеточных мембран.

Важно изучение изменения значений рН при использовании дрожжей Brettanomyces в производстве пива, поскольку дрожжи продуцируют в процессе жизнедеятельности [27]ж.

Воздействие кислорода на биохимическую активность дрожжей

Один из важнейших факторов воздействия на биохимическую активность пивных дрожжей - перераспределение осуществляемых ими окислительно-восстановительных реакций.

Кислород, растворенный в среде, рассматривают как важнейший компонент для дрожжевых клеток, который оказывает влияние на рост биомассы, жизнеспособность клеток, на скорость ферментативного катализа превращений питательных веществ среды. Повышенное количество кислорода на определенных этапах жизнедеятельности дрожжевой клетки приводит к нежелательному увеличению окислительно-восстановительного потенциала, чрезмерному накоплению биомассы на этапе сбраживания, к снижению флоку-ляционной способности клеток, повышенному образованию продуктов метаболизма, что отрицательно сказывается на продолжительности процесса созревания пива, вкусе и аромате, уровне коллоидной и биологической стойкости напитка [46, 47].

Кислород является необходимым для биосинтеза ненасыщенных жирных кислот и стеринов - компонентов, в частности, защищающих дрожжи

от ингибирующего воздействия этанола. Для спиртового брожения с помощью Saccharomyces cerevisiae необходимо обеспечить низкий уровень аэрации и высокую степень сбраживания в присутствии повышенных концентраций этанола [39].

Режим аэрации в среде при дрожжегенерировании должен быть непрерывным, однако, когда концентрация дрожжей в среде станет значительной, подачу кислорода в среду ограничивают. Концентрация растворенного кислорода в среде - один из основных факторов, контролирующих способность дрожжей развиваться при окислительном фосфорилировании сахаров [48, 49].

Кислород играет ключевую роль в процессе ферментации углеводов с помощью дрожжевых клеток. Известно, что в случае сбраживания глюкозы дрожжами Saccharomyces cerevisiae небольшие количества растворенного кислорода в среде позволяют увеличить выход этанола в сравнении с анаэробными условиями [50-52]. Род Brettanomyces также известен как чувствительный к наличию кислорода в среде [53]. В работе [54] показано, что клетки Brettanomyces claussenii ферментируют глюкозу с большей скоростью в аэробных условиях, чем при отсутствии кислорода.

Кислород стимулирует рост биомассы и спиртовое брожение с помощью Brettanomyces, в отличие от Saccharomyces cerevisiae. В анаэробных условиях потребление глюкозы дрожжами Brettanomyces осуществляется только после продолжительной лаг-фазы наряду с низкой скоростью роста; выход этанола и уксусной кислоты является более низким, чем в аэробных условиях [25].

Wijsman и др. изучали влияние кислорода в процессе жизнедеятельности Brettanomyces intermedius. Наблюдали три этапа развития культуры в аэробной среде. На первом этапе Brettanomyces развиваются путем потребления глюкозы и выработки равного количества этанола и уксусной кислоты. На втором этапе дрожжи преобразуют этанол в уксусную кислоту без роста биомассы, затем Brettanomyces потребляют уксусную кислоту и наблюдается возобновление роста клеточной биомассы [55].

Несколько авторов отмечают, что спиртовое брожение с применением Brettanomyces можно стимулировать подачей кислорода. Этот эффект противоречит данным для Saccharomyces cerevisiae, данное явление указано как «отрицательный эффект Пастера» - «эффект Кастера» (торможение спиртового брожения во время наступления анаэробиоза) [37, 5б].

Лишь несколько лет спустя явление было объяснено Carrascosa и др. Авторы отметили, что переход от аэробных к анаэробным условиям привело к прекращению активности брожения и роста Brettanomyces, что объясняется нарушением окислительно-восстановительного баланса в клетке с появлением возможности дрожжей вырабатывать уксусную кислоту. Действительно, синтез уксусной кислоты требует наличия кофактора NAD+, незаменимого для протекания гликолиза. Однако, редукция никотинамида может быть осуществлена только путем спиртового брожения в условиях аэрации. Таким образом, при переходе от аэробиоза к анаэробиозу происходит накопление NADH2, в результате чего происходит остановка гликолиза на уровне комплекса глицеральдегид-3—фосфат дегидрогеназы (NAD—зависимый фермент). Однако, это блокирование является временным, потому что после фазы задержки, брожение возобновляется, но с гораздо меньшей скоростью, чем в аэробных условиях [38, 55].

Влияние продуктов брожения на жизнедеятельность дрожжей

Влияние этанола

Этанол является основным продуктом спиртового брожения, его действие негативно сказывается на развитии и жизнеспособности клеток. Этиловый спирт замедляет размножение дрожжей при концентрации 2 %. Для Saccharomyces концентрация спирта, при которой прекращается накопление биомассы, находится в диапазоне от 70 до ll0 г/дм3 в зависимости от вида и штамма [19, 57].

С повышением температуры брожения до 30-40 Т возрастает скорость роста клеток, чувствительных к выработке этанола. Увеличение интенсивности

аэрации снижает скорость продуцирования этанола и уменьшает его влияние на рост и размножение клеток: ингибирующее влияние этанола снижается в аэробных условиях по сравнению с анаэробными. Питательная среда также должна содержать липиды и витамины, которые будут влиять на толерантность клеток дрожжей к этанолу [58-62].

На сегодняшний день механизмы ингибирования этанола до конца не выяснены. Исследователи объясняют феномен ингибирования наличием этанола-активных участков в митохондриях и цитоплазматических мембранах клеток. Молекулы этанола проникают внутрь цитоплазматических мембран для связывания с молекулами фосфолипидов и жирных кислот путем замены молекул воды, что приводит к изменению текучести, проницаемости мембраны и уничтожению клетки [63].

Влияние уксусной кислоты

Уксусная кислота является одним из вторичных продуктов спиртового брожения, концентрация которого обычно не велика (в пиве от 20 до 150 мг/дм3). Тем не менее, она может продуцироваться некоторыми микроорганизмами (в частности, дрожжами Brettanomyces) в более значительных количествах.

Исследователи установили, что уксусная кислота в диапазоне концентрации 0,5-9,0 г/дм3 может повлиять на морфологию дрожжей Saccharomyces и привести к изменению формы клеток [57]. Позже было доказано, что уксусная кислота является ингибитором роста Saccharomyces. Ингибирование было более выраженным при дрожжегенерировании, чем на стадии брожения этанола и не зависело от величины pH среды. Механизм воздействия уксусной кислоты на системы дрожжевой клетки состоит в окислении цитоплазмы и модификации некоторых ферментов гликолиза [64].

Loureiro и др. установили, что при совместном действии этанола и уксусной кислоты внутренний рН клетки не зависит от концентрации уксусной кислоты и внешнего рН в среде. С уменьшением внутреннего pH скорость

брожения уменьшается и стремится к нулю при рН 4,8. При концентрации этанола более 8 %, ингибирование наступает при внутреннем рН 5,5 [65].

Уксусная кислота, полученная в ходе ферментации дрожжей Brettanomyces, участвует в синтезе эфиров, таких, например, как этиловый эфир уксусной кислоты. Показано, что при анаэробной ферментации Brettanomyces производит достаточное количество жирных кислот для снижения рН среды до значения до 4,0, которые также участвуют в реакциях этерификации [66].

1.3 Практическое применение дрожжей Brettanomyces

Brettanomyces в пищевой промышленности

Дрожжи, принадлежащие к роду Brettanomyces, признаны контаминан-тами для вина [67, 68]. В виноделии микроорганизмы появляются после окончания процесса сбраживания сусла и ответственны за неприятные оттенки в аромате [69, 70]. В промышленном производстве этанола Brettanomyces известны из-за их способности к ферментации сбраживаемых углеводов с образованием уксусной кислоты [3]. Увеличение концентрации уксусной кислоты в среде может оказывать отрицательное влияние на жизнедеятельность Saccharomyces cerevisiae и, таким образом, уменьшает способность производственной микрофлоры к продуцированию этанола [19] и, следовательно, приводит к снижению выхода спирта.

Наиболее известны случаи появления Brettanomyces в процессах спонтанного спиртового брожения, безалкогольных напитках, молочных продуктах, заквасках и при производстве оливок [3, 11]. Эти области производства характеризуются различными сочетаниями «производственных стрессов» для дрожжей: высокими концентрациями этанола, низким pH, отсутствием лег-коферментируемых источников азота и углерода, низким содержанием кислорода и др. [19, 11]

Однако в некоторых технологиях напитков, таких как бельгийский стиль пива ламбик (lambic) или американский эль кулшип (coolship), присутствие

Brettanomyces является необходимым для создания вкусоароматических свойств напитка, в то время как такие профили аромата в вине категорически недопустимы [71, 72]. Кроме того, отмечают частое непреднамеренное присутствие Brettanomyces на заводах по производству биоэтанола, при этом некоторые из этих штаммов могут превосходить по эффективности производственные [45, 73].

Brettanomyces в пивоварении

В то время как подавляющее большинство стилей пива сбраживается чистыми культурами дрожжей S. cerevisiae (элевые) или S. carlsbergensis (низовые), многие сорта напитка являются продуктами спонтанного брожения [74-76]. Наиболее известными спонтанно сбраживаемыми стилями пива являются ламбик и гёз (gueuze), исторически производимые в окрестностях Брюсселя (Бельгия).

Пиво в стиле ламбик характеризуется длительной продолжительностью брожения, сложным вкусом со специфическими тонами, ассоциирующимися с богатой бактериальной и грибковой микрофлорой. Микробиом при таком брожении сложен - симбиоз нескольких видов дрожжей и бактерий, меняющихся со временем [75, 77].

В настоящее время, используя современные методы исследования: секве-нирование [74], денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДДГЭ) [78], масс-спектрометрирование [79] установлено, что микробная популяция некоторых сортов пива состоит в основном из дрожжей и бактерий (лактобактерии и педиококки) [10, 80, 81]. В то время как спиртовое брожение большей части сортов пива осуществляется дрожжами S. cerevisiae. На заключительной стадии главного брожения, когда большая часть углеводов сусла сброжена, дрожжи S. cerevisiae постепенно прекращают процесс сбраживания, тогда как Brettanomyces могут осуществлять воздействие на пиво в течение 48 месяцев [74, 82].

Brettanomyces являются наиболее распространенным родом дрожжей, который остается в напитке до конца дображивания и созревания. В течение этапа созревания наблюдается метаболическая активность ферментативного комплекса дрожжей: эстеразы, ß-глюкозидазы, а-глюкозидазы, что является причиной изменений в сенсорном профиле напитка и -получения неповторимого вкуса [3, 11, 66, 83-85].

Вкусо-ароматические компоненты напитков при применении

дрожжей Brettanomyces

Применение Brettanomyces оказывает сильное влияние на ароматические характеристики продуктов брожения. Существует различные термины для описания ароматики Brettanomyces, в том числе гвоздичный, пряный, мышиный, скотного двора, дымчатый, пластиковый, фенольный, медицинский, бинтов, металлический, печенья, яблочный, цветочный, тропических фруктов, цитрусовый и / или пряный [86, 87], но их более удобно объединить в термин «аро-матика Brettanomyces».

Летучие фенольные соединения отвечают за основные ароматические профили, связанные с Brettanomyces [5, 88, 89]. Существует шесть основных соединений, отвечающих за фенольную ароматику: 4--этилгваякол, 4--этил-фенол, 4--этилкатехол и их предшественники 4--винилгваякол, 4--винилфе-нол и 4--винилкатехол.

Известно, что 4-этилгваякол, 4-этилфенол способствуют появлению нежелательного оттенка аромата- в некачественных- винах [90] (лекарственный, бинтов), однако при этом они же являются необходимыми в создании сенсорных характеристик (гвоздичный или пряный аромат) пива ламбик, американского эля кулшип, бельгийских кислых элей, что связано с различной концентрацией и соотношением этих компонентов в напитке [70, 91, 92].

Эфиры образуют важную группу ароматических соединений, ответственных за проявление фруктовых и цветочных оттенков в аромате напитков [93]. Доля эфиров в пиве ламбик, как правило, характеризуется низким содержанием изоамилацетата, высокой концентрацией этилкаприлата и

этиллактата, значительным количеством этилкапрата в сравнении с пивом, произведенным с использованием традиционных дрожжей S. cerevisiae и S. pastorianus [94]. Исследования подтвердили, что эстеразы присутствующие в Brettanomyces, отвечают за образование этиловых эфиров, таких как этилаце-тат и этиллактат, наряду с гидролизом эфиров уксусной кислоты, например, изоамилацетата и фенилацетата [82, 95]. Различие между концентрацией ацетата и этилового эфира связана с гидролизом эфиров уксусной кислоты эсте-разами дрожжей Brettanomyces.

Пропагация Brettanomyces

Разведение стартовой культуры Brettanomyces можно проводить с использованием аналогичных методов размножения элевых дрожжей, но каждый этап роста является более продолжительным. Предлагается разведение культуры сначала до 50 см3, затем до 150 см3 при подготовке 20 дм3 объема, далее -по объему пропагатора. Возможно применение неохмеленного пивного сусла (средняя плотность 9-12 % мас.) с добавлением питательных компонентов. В среднем процесс приготовления засевных дрожжей (стартовой закваски) длится от семи до восьми суток при 28 °C и непрерывной аэрации для достижения максимального выхода клеток Brettanomyces [96-98].

Если целью является получение пива с кисловатым оттенком за счет наличия уксусной кислоты, можно использовать весь объем стартовой закваски. Чтобы уменьшить количество уксусной кислоты в готовом пиве, необходимо после дрожжегенерирования декантировать засевные дрожжи, прежде чем задавать в пиво. Внесение закваски и распределение Brettanomyces в слое пива займет больше времени, чем для других видов пивных дрожжей, потому что клетки Brettanomyces имеют меньший размер и не обладают высокой степенью флокуляции. Чтобы компенсировать более медленный темп роста, рекомендуется задавать Brettanomyces в количестве, которое обычно применяется для пива низового брожения, что примерно в два раза больше стандартной задачи для элей (в расчете на объем сусла) [99-102].

Заключение к литературному обзору

В последние десятилетия интерес к использованию нетрадиционных видов дрожжей для процессов брожения несколько ограничен. Однако информация, обобщенная в обзоре, подчеркивает потенциал Brettanomyces для промышленного использования. Так, Brettanomyces часто превосходят S. cerevisiae по применению в специфических условиях - низкое содержание азотного питания, низкий pH и высокий уровень этанола, а в условиях ограниченного содержания углеводов и кислорода часто показывают более эффективный рост, чем S. cerevisiae [100, 103]. Широкое применение Brettanomyces нашли в спонтанно сбраживаемых напитках, таких как пиво ламбик, где необходимо получение своеобразного сенсорного профиля.

Анализ литературных данных, технической и патентной информации позволяет сделать вывод о том, что актуальным и перспективным направлением исследований является создание новых технологий и рецептур пива с применением дрожжей Brettanomyces [104-106].

Основные свойства пивных дрожжей, необходимые для применения в технологии пива [14, 19, 107-109] - стабильное образование вкусо-ароматиче-ских продуктов метаболизма, высокая интенсивность брожения, эффективное брожение (максимальный уровень этанола, высокая скорость роста при пропа-гации, минимальное нарастание биомассы на этапе сбраживания; устойчивость к ингибирующим факторам (осмотическое давление, этиловый спирт, накопление СО2; необходимые флокуляционные или седиментационные свойства в конце брожения, высокий уровень жизнеспособности клеток, высокий уровень генетической стабильности при последующих ферментациях [110-113].

Для обоснования этапов биотехнологии пива с применением дрожжей Brettanomyces, выявления особенностей производства, формирования ассортимента пивоваренной продукции необходимо провести исследование влияния интенсивности аэрации среды на процесс накопления биомассы дрожжей Brettanomyces, изучить условия продуцирования уксусной кислоты и

биосинтеза этанола различными видами дрожжей Brettanomyces в процессе выращивания биомассы; оптимизировать режимы процесса культивирования дрожжей Brettanomyces в цеховой стадии; исследовать кинетику утилизации углеводов в среде с математическим описанием процесса спиртового брожения дрожжами Brettanomyces.

Для совершенствования аппаратурного оформления процесса дрожжеге-нерирования следует обосновать модифицированный способ пропагации дрожжей Brettanomyces для применения в условиях пивопроизводства с разработкой проектов технической документации, апробацией технологии в опытно-производственных условиях, расчетом экономической эффективности предложенных технологических решений.

ГЛАВА 2 ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Схема экспериментальных исследований

Экспериментальные исследования и обработка результатов проводились в лабораториях кафедр технологии бродильных и сахаристых производств, биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВО «ВГУИТ», в условиях лабораторно-производственной базы ООО «П.И.Н.Т.А КРАФТ», в лабораториях Центра коллективного пользования, отделе стандартизации и метрологии ФГБОУ ВО «ВГУИТ»; с применением сырья и материалов компании Fermentis (Lesaffre for beverages).

Последовательность проведения этапов экспериментальных исследований и взаимосвязь объектов исследований приведены на рисунке

На первом этапе осуществляли формулирование цели и задач исследования, патентно-информационный поиск, выбор объектов исследований. На втором этапе исследовали процесс пропагации дрожжей Brettanomyces, на третьем этапе изучали условия продуцирования уксусной кислоты дрожжами Brettanomyces. На четвертом этапе осуществляли математическое описание кинетики утилизации глюкозы и процесса спиртового брожения пивного сусла дрожжами Brettanomyces. На заключительном этапе разработан способ пропа-гации дрожжей Brettanomyces, представлены рецептуры и технология производства пива с применением дрожжей Brettanomyces. Провели оценку экономической эффективности, разработку проектов технической документации, апробацию технологии в опытно-производственных условиях и анализ качественных показателей готовой продукции.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнология пива с применением дрожжей Brettanomyces: особенности производства и новый ассортимент продукции»

Цель работы

научное обоснование преимуществ и условий производства сортов пива на основе идентификации физиолого-биохимических особенностей дрожжей ВгеШпопп'сеъ

Задачи исследования

1. провести исследование влияния интенсивности аэрации среды на процесс накопления биомассы дрожжей ВгеПапотусеъ, изменение концентрации этанола и уксусной кислоты в среде при культивировании;

2. изучить условия продуцирования уксусной кислоты и биосинтеза этанола различными видами дрожжей ВгеШпотусеъ в процессе выращивания биомассы;

3. с помощью методов математического моделирования оптимизировать режимы процесса культивирования дрожжей ВгеПапотусеъ в цеховой стадии;

4. исследовать и математически описать кинетику утилизации углеводов в среде, разработать математическую модель процесса спиртового брожения дрожжами ВгеПапотусек,

5. предложить и обосновать модифицированный способ пропагации дрожжей ВгеПапотусеъ для применения в условиях пивопроизводства;

6. разработать проекты технической документации, провести апробацию технологии в опытно-производственных условиях, рассчитать экономическую эффективность технологических решений.

Теоретические исследования

/X

Экспериментальные исследования

Промышленная апробация

Рисунок 2.1- Схема экспериментальных исследований

2.2 Характеристика объектов исследований

Исследования проводили с дрожжами, предоставленными компанией Fermentis (Lesaffre for beverages): B. bruxellensis (Y966), B. intermedius (Y962), B. custerianus (Y3266), B. clausenii (5151-PC).

Для приготовления образцов пива применяли дрожжи B. bruxellensis, используемые в пивоварении (табл. 2.1).

Таблица 2.1 - Характеристика жидких пивных дрожжей WYeast5112,

Brettanomyces Bruxellensis*

Наименования показателя Характеристика

Спиртоустойчивость 12 % об.

Способность к флокуляции средняя

Степень сбраживания 80 %

Дозировка 5 мл/дм3

Диапазон температур брожения 15-24 °C

* - данные с сайта производителя https://wyeastlab.com

Данный штамм формирует в пиве классический аромат и полноценный вкусо-ароматический профиль, присущий аутентичным сортам пива Lambic, Gueze, Fruit Lambic, Flanders Red Ale Brett Beer, Wild speciality beer, обычно используется в сочетании с S. œrevisiae (табл. 2.2).

Таблица 2.2 - Характеристика сухих пивных дрожжей Safale S33-, S. œrevisiae*

Наименования показателя Характеристика

Спиртоустойчивость 12 % об.

Способность к флокуляции средняя

Степень сбраживания 86 %

Дозировка 0,55 г/дм3

Диапазон температур брожения 12-25 °C

* - данные с сайта производителя https://fermentis.com

Универсальные элевые дрожжи с нейтральным ароматическим профилем, рекомендованы для производства элей и пива типа «траппистское». Обладают средней седиментационной способностью: при их переводе во взвешенное состояние образуют мелкую пыль, не формируя при этом флокул в объёме пива.

Согласно рецептурам пива применяли следующее сырье:

Солод светлый, карамельный по ГОСТ 29294-2014 «Солод пивоваренный. Технические условия»; вода по СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения», подготовленная для процесса пивоварения; хмель по ГОСТ 21947.

Опытно-производственную апробацию проводили в условиях лаборатории и производства ООО «П.И.Н.Т.А КРАФТ».

2.2 Методы исследования

В соответствии со схемой эксперимента исследовали комплекс физико-химических, микробиологических показателей образцов с использованием стандартных и оригинальных методов, позволяющих получить информацию о составе и свойствах объектов исследований в соответствии с Инструкцией са-нитарно-микробиологического контроля пивоваренного и безалкогольного производства ИК-10-04-06-140-87; с рабочими инструкциями - методиками Analytica Microbiologica-EBC [114, 115]; Справочником работника лаборатории пивоваренного предприятия (Ермолаева Г. А., 2004), ГОСТ Р 51446-99 «Общие правила микробиологических исследований».

Микроскопирование препаратов дрожжей осуществляли с помощью микроскопа «Микромед-3». Содержание аминокислот контролировали с помощью аминоанализатора LC-20 Prominence (МВИ М 04 - 38 2009); эфиров, альдегидов, высших спиртов - методом газовой хроматографии (Хромос ГХ-1000); ди-ацетила - спектрофотометрическим методом (Analytec-EBC Method 9.24.1).

Питательные среды

Инокулят готовили на среде, состоящей из агар-агара, глюкозы и дрожжевого экстракта (2, 2 и 1 %) при 4 °C. Для инокулирования использовали питательную среду, на основе 5 % глюкозы, 0,2 % (NH^SCU, 0,5 % KH2PO4, 0,04 % MgSO4-7H2O и 0,1 % дрожжевого экстракта. Активную кислотность среды поддерживали на уровне pH 4,0 с помощью 10 % ортофосфорной кислоты.

Культивирование микроорганизмов

Эксперименты проводили в ферментере (патент на полезную модель RU 2018 131 772 и «Установка для пропагации чистой культуры дрожжей» (объем 15 дм3, рабочая температура 30 °С, скорость вращения мешалки 250 об/мин), подключенном к контроллеру для регистрации значений рН и калиброванному ротаметру расхода воздуха. Питательную среду объемом 10 дм3 стерилизовали в течение 60 мин при 120 °С. Добавляли инокулят до достижения 3х106 жизнеспособных клеток/см3. Процесс ферментации проводили при следующих параметрах: температура - 26, 30, 34 °С; скорость вращения мешалки - 250, 350, 450 об/мин; расход воздуха для аэрации среды - 100, 200, 300, 350 дм3/ч.

Концентрацию биомассы микроорганизмов контролировали с помощью измерений оптической плотности дрожжевой суспензии при 620 нм на спектрофотометре с определением массы клеток после высушивания, количество мертвых клеток в среде - по стандартной методике ГОСТ Р 51446-99 «Общие правила микробиологических исследований».

Определение количества клеток дрожжей путем прямого подсчета

в счетных камерах

Метод прямого подсчета проводили в камере Горяева по инструкции Ап-а1уйса М1сгоЬю1о§1са-ЕВС.

Камеру заполняли исследуемой суспензией микроорганизмов с помощью пипетки или капилляра и помещали на столик микроскопа. Подсчитывали число клеток в 10 больших или 20 малых квадратах сетки, следуя по диагонали. Учитывали клетки как в квадрате сетки, так и пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. Подсчет повторяли 3-5 раз, каждый раз заново заполняя камеру.

Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляли по формуле:

w «103 ^^

M = (2.1)

hS

где M- количество клеток в 1 мл суспензии; а - среднее количество клеток в квадрате сетки; h - высота камеры, мм; S- площадь квадрата сетки, мм2; 103 -коэффициент перевода [см3] в [мм3]; п - коэффициент разведения исследуемой суспензии.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Концентрации глюкозы, этанола, глицерина и уксусной кислоты определяли методом ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием [116]. В качестве подвижной фазы применяли серную кислоту (0.005 М), расход 0.4 см3/мин. Рассчитывали площадь поверхности обнаруженных пиков. Для каждого компонента подготовлены калибровочные кривые в диапазоне концентраций 020 г/дм3. Экспериментальная погрешность составила менее 3 %. Определение концентрации уксусной кислоты в анализируемых образцах проводили на жидкостном хроматографе марки Agilent серии 1220 Infinity LC, оснащенном колонкой Zorbax. Пробоподготовку осуществляли центрифугированием 1 мл культуральной жидкости при 14000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость фильтровали и помещали в пробирки. Хроматографию проводили при температуре 25° C изократическим элюированием фосфатным буфером (10 mM, pH 3,0) и ацетонитрилом в объемном соотношении 95:5 при расходе элюента 1 мл/мин. Вводимый объем пробы 50 мкл. Длина волны 210 нм.

Для построения калибровочного графика готовили стандартные растворы уксусной кислоты путем последовательных разведений стандартного раствора подвижной фазой. Подвижную фазу готовили путем растворения 1,36 г KH2PO4 в 980 мл деионизированной воды. pH 3,0 доводили добавлением к раствору H3PO4. Объем доводили до 1000 мл деионизированной водой, чтобы приготовить 10 mM раствор. Раствор элюента получали смешением 2,5 мл ацетонитрила и 47,5 мл 10 mM фосфатного буфера (pH 3,0).

Определение концентрации уксусной кислоты потенциометрическим титрованием

Определение концентрации уксусной кислоты также проводили потен-циометрическим титрованием анализируемой пробы 1 % раствором №ОИ в изопропаноле [117].

В колбу вместимостью 50 мл вносили 25 мл изопропанола и 1 мл анализируемой пробы, погружали в полученную смесь электроды рИ-метра.

При постоянном перемешивании титровали смесь 1 % раствором щелочи с регистрацией потенциала индикаторного электрода относительно электрода сравнения в зависимости от количества прибавленного титранта, титрование продолжали после достижения предполагаемой точки эквивалентности. Конечной точке титрования соответствовало максимальное значение изменения потенциала (ДЕ) к приращению объема прибавленного титранта (ДУ).

Конечную точку титрования находили графически методом касательных по кривой зависимости потенциала индикаторного электрода от количества прибавленного титранта, или расчетным методом по максимальному значению ДЕ/ДУ, или по точке разрыва (смене знака) второй производной Д(ДЕ/ДУ).

Выход уксусной кислоты и степень потребления углеводов вычисляли по формулам:

.ч Уксусная кислота (г) __

wш (% ) =-^-Ц-Г100 %, (2.2)

потребленные углеводы (г)

, ч ( Остаточное сод-е углеводов \пп0/

Степень потребления углеводов (% )= 1--100%, (2.3)

^ Начальное сод-е углеводов )

Оценка качества пива

По органолептическим показателям образцы пива соответствовали требованиям ГОСТ 31711-2012 (таблица 2.3) [118-121].

Органолептическая оценка

Органолептическую оценку образцов проводили дегустационной комиссией в соответствии с ГОСТ 30060-93 Пиво. Методы определения органолеп-тических показателей и объема продукции по 25-балльной шкале (табл. 2.4).

Таблица 2.3 Показатели качества пива

Тип пива

Наименование показателя Фильтрованное пиво Нефильтрованное пиво (осветленное и неосветленное)

светлое темное светлое темное

Прозрачная пенящаяся жидкость без осадка и посторонних включений, не свойственных пиву. В процессе хранения допускается появление частиц белково-дубильных соединений. Для пшеничного пива допускается опалесценция от слабой до сильной Непрозрачная или прозрачная с опалесценцией пенящаяся

Прозрачность жидкость без посторонних включений, не свойственных пиву. В процессе хранения допускается появление частиц белково-дубильных соединений.

Допускается дрожжевой осадок

Аромат Чистый, сброженный солодовый, с хмелевым ароматом, без посторонних запахов Сброженный солодовый, с хмелевым ароматом, допускается дрожжевой оттенок, без посторонних запахов

Чистый, сброженный, Сброженный солодовый,

солодовый, с хмелевой Полный солодовый с выраженным привкусом карамельного с хмелевой горечью, Солодовый

горечью, без допускается с выраженным

посторонних дрожжевой привкусом

Вкус привкусов. В пшеничном пиве присутствуют привкус. В пшеничном пиве присутствуют карамельного или жженого солода, без посторонних

или жженого солода, без посторонних привкусов

пряно- пряно- привкусов

ароматичные ароматичные

тона во вкусе тона во вкусе

и аромате и аромате

В пиве с экстрактивностью начального сусла 15 % и выше присутствует

винный привкус

По содержанию токсичных элементов, радионуклидов, ^-нитрозаминов

и микробиологическим показателям образцы пива соответствовали установленным гигиеническим нормативам к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов (СанПин 2.3.2.1078-01).

Показатели безопасности для образцов пива указаны в таблицах 2.5 и 2.6. (ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции").

Таблица 2.4 Шкала органолептической оценки пива

Показатели качества пива Оценка, баллы

Отлично Хорошо Удовлетвор. Неудовлетвор.

Прозрачность 3 2 1 0 (снимается с дегустации)

Цвет 3 2 1 0

Вкус 5 4 3 2

Хмелевая горечь 5 4 3 2

Аромат 4 3 2 1

Пенообразование 5 4 3 2

Высота пены, мм 40 30 20 менее 20

Пеностойкость, мин. 4 3 2 менее 2

Итого баллов 22-25 19-21 13-18 12 и ниже

Таблица 2.5 Показатели безопасности образцов пива

Показатели Допустимые уровни мг/кг, не более

Токсичные элементы:

Свинец 0,3

Мышьяк 0,2

Кадмий 0,03

Ртуть 0,05

Нитрозамины: сумма НДМА и НДЭА 0,003

Радионуклиды:

цезий-137 (Бк/л) 70

Стронций-90 (Бк/л) 100

Таблица 2.6 Микробиологические показатели пива

Объем

или масса

Индекс, группа продуктов КМАФАиМ, КОЕ/100 см, продукта (см, г) в котором Дрожжи и плесени Патогенные, в том числе

не более не допускаются БГКП колиформы сальмонеллы

Пиво разливное - 1,0 25 -

Пиво непастеризованное - 3,0 25 -

в кегах - 3,0 25 -

в бутылках - 10,0 25 -

Пиво пастеризованное и обеспложенное 500 10,0 25 40

Физико-химические методы определения показателей пива

Содержание этилового спирта и содержание сухих веществ в начальном сусле контролировали по (ГОСТ 12787-81). Определение кислотности пива проводили в соответствии с ГОСТ 12788-87 «Пиво. Методы определения кислотности» методом прямого титрования пробы с фенолфталеином. Метод основан на титровании всех находящихся в пиве кислот и кислотных солей раствором гидроксида натрия до слабо-розовой окраски. Определение цвета пива инструментальным методом проводили по ГОСТ 12789-87 «Пиво. Методы определения цвета». Метод основан на визуальном сравнении цвета пива с цветом 0,1 моль/дм3 раствора йода различной концентрации в 100 см3 воды.

Метод определения диоксида углерода (ГОСТ Р 51154-98 «Пиво. Методы определения двуокиси углерода и стойкости») в пиве основан на измерении давления в газовом пространстве над пивом в укупоренной стеклянной бутылке, бутылке из полиэтилентерефталата на расчете массовой доли диоксида углерода в зависимости от измеренного давления и температуры.

Метод определения стойкости пива основан на визуальном наблюдении за появлением помутнения или осадка в бутылке. Для этого две бутылки пива в день розлива ставили в термостатируемый шкаф с температурой 20 ±2 °С и через каждые 24 ч наблюдали визуально за появлением помутнений или осадка. Стойкость пива определяли по времени появления помутнения по всему объему пива в бутылке и хлопьевидного осадка, дающего помутнения при осторожном переворачивании бутылки вниз горлом. Стойкость пива выражали в сутках со дня розлива [122-124].

По физико-химическим показателям образцы пива соответствовали требованиям ГОСТ 31711-2012 «Пиво. Общие технические условия».

2.1.1 Методы математической обработки результатов

Для статистической оценки исследований применяли специальное ПО -Design Expert, v. 11.1.0, Stat-Ease Inc. [125] и функции MS Excel.

Экспериментальные данные обрабатывали вероятностными методами математической статистики - дисперсионным и корреляционным анализом.

Полный факторный эксперимент и его обработка

При планировании по схеме полного факторного эксперимента (ПФЭ) составляли все возможные комбинации факторов для выбранного числа уровней [125].

Дисперсию воспроизводимости, значимость коэффициентов определяли по критерию Стьюдента, адекватность регрессионного уравнения - по критерию Фишера.

Ротатабельный центральный композиционный план и его обработка

В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические значения и их стандартные отклонения, вычисленные по трем независимым опытам. Статистическая обработка результатов исследования выполнена при достоверности p < 0,05 с помощью методов математической статистики и программного обеспечения MS Excel.

Для статистической оценки влияния параметров культивирования на количество уксусной кислоты в среде (ПО Design Expert, v. 11.1.0, Stat-Ease Inc.) применяли полный факторный эксперимент 32.

При соблюдении некоторых условий центральные композиционные планы приобретают свойства ротатабельности [125]. Матрица РЦКП не ортогональна, коэффициенты при этом скоррелированы между собой и свободным членом. Коэффициенты уравнения множественной регрессии определяли методом наименьших квадратов и оценивали с разными дисперсиями. Значимость коэффициентов определяли по критерию Стьюдента, а адекватность регрессионных уравнений - по критерию Фишера.

ГЛАВА 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ BRETTANOMYCES

3.1 Исследование влияния интенсивности аэрации на жизнедеятельность дрожжей Brettanomyces bruxellensis

Оценивали влияние расхода кислорода во время аэрации на метаболизм В. Ъгихв11вт18 для максимальной скорости роста клеток, что позволило вывести стехиометрическое уравнение в общем виде для количественной характеристики метаболизма ВгвШпотусв8 в условиях накопления клеточной биомассы.

Влияние кислорода на процесс накопления биомассы и продуктов ферментации

Для исследования влияния концентрации кислорода на рост клеточной биомассы и активность В. ЪгихеИетгз выращивание культуры проводили в аэробных условиях (расход воздуха 300 дм3/ч), а также в анаэробных условиях (растворенный 02 присутствует только в начале процесса ферментации). Использовали питательную среду на основе 5 % глюкозы, 0,2 % (КБ4)2804, 0,5 % КН2РО4, 0,04 % Ыв804-7И20 и 0,1 % дрожжевого экстракта.

На рис. 3.1 показана динамика изменения концентраций биомассы, потребления глюкозы и количества уксусной кислоты для указанных параметров процесса. Конечная концентрация биомассы В. ЪгихеИетгз увеличилась с 3.76 г/дм3 (анаэробные условия) до 5,16 г/дм3 (аэрация 300 дм3/ч). При аэрации среды наблюдали более интенсивный рост биомассы по сравнению с анаэробными условиями. В данных условиях наблюдали лаг-фазу продолжительностью около 12 ч. Следует отметить, что в анаэробных условиях полностью происходило усвоение глюкозы, в то время как при аэрации 300 дм3/ч потребление глюкозы было частичным (количество глюкозы в среде по окончании процесса 24 г/дм3). Высокую концентрацию уксусной кислоты (9,4 г/дм3) наблюдали только в аэробных условиях; минимальное количество уксусной кислоты синтезировалось в анаэробных условиях (0,025 г/дм3) (на рисунке не показано).

Рисунок 3.1 - Влияние кислорода на процесс накопления биомассы и продуктов ферментации

Поскольку наблюдали значимые различия между неаэрированными и аэрированными культурами, проводили эксперименты с различной величиной подачи воздушного потока в ферментер (в диапазоне 30-300 дм3/ч). На рис. 3.2 показано влияние различных условий аэрации на рост B. bruxellensis.

По концентрационным зависимостям количества биомассы от продолжительности процесса (рис. 3.2) выявили оптимальный уровень аэрации для роста культуры в рассматриваемых условиях. Для получения максимальной концентрации биомассы (8,5 г/дм3) наиболее благоприятна величина расхода воздуха 60 дм3/ч. За пределами данного уровня аэрации количество клеточной биомассы снижается до значения около 5 г/дм3 при расходе воздуха 300 дм3/ч.

о ä s

с S

1С

ö

с

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

□ 30 дм3/ч

■ 60 дм3/ч

■ 90 дм3/ч

0 0.01 0.01 0.01

& 1

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0.13 1.1 1.46 2.51 3.93 5.16 5.77 5.96 6.03 6.08

0.01 0.55 1.2 1.8 2.35 4.55 6.51 7.71 8.53 8.51

0.09 0.92 1.91 4.06 4.47 5.89 7.37 7.73 7.83 7.88

О

о

Ü с s

1С

ö £

U

с

И 120 дм3/ч □ 180 дм3/ч ■ 300 дмз/ч

0 0.03 0.03 0.01

10 0.09 0.09 0.03

20 0.75 0.83 0.43

30 1.93 2.22 0.48

№

40

3.86 2.8 1.28

50 4.31 3.73 2.66 Время, ч

S

60 5.43 6.46 3.84

70 6.49 6.69 4.42

80 6.75 6.74 5.21

90 7.06 6.88 5.18

100 6.73 6.92 5.2

Рисунок 3.2 - Изменение концентрации биомассы B. bruxellensis во времени при различной величине аэрации

В таблице 3.1 представлены результаты, касающиеся выхода этанола и уксусной кислоты и потребления глюкозы, полученные для исследуемых уровней аэрации. Утилизация субстрата происходила в полной мере при расходе воздуха от 0 до 120 дм3/ч (в этом случае максимальная концентрация уксусной кислоты составляла 4,5 г/дм3 в завершающей стадии процесса). При режиме аэрации 180 дм3/ч около 7 % глюкозы не используется, а при 300 дм3/ч - потребление снижается до 53 %. Кроме того, в указанных условиях наблюдали наименьшие значения рН 2,4 и 2,3 соответственно (рис. 3.3).

Таблица 3.1 - Изменение концентрации субстрата и продуктов реакции при

различных режимах аэрации

Параметр Расход воздуха, дм3/ч

0 30 60 90 120 180 300

Концентрация уксусной к-ты, г/дм3 - 2 ± 0,09 3 ± 0,1 4 ± 0,04 5 ± 0,06 7 ± 0,25 11 ± 0,06

Концентрация этанола, г/дм3 24 ± 0,22 23,5 ± 0,11 24 ± 0,29 18 ± 0,21 17,5 ± 0,38 11,5 ± 0,26 2,5 ± 0,55

Потребление глюкозы, % 100 100 100 100 100 94 ± 0,71 53 ± 0,2

4.5

!х

3.5

2.5

1.5

0.5 0

0 10 20 30 40 50

Н30 дм3/ч 4.1 4.07 3.9 3.53 3.38 3.08

■ 60 дм3/ч 4.1 4.05 3.86 3.41 3.28 2.83

□ 90 дм3/ч 4.1 4.03 3.87 3.52 3.22 2.95

60 2.82 2.66 2.74

70 2.73 2.58 2.65

80 2.7 2.59 2.6

90 2.68 2.6 2.6

X а

5

4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1

0.5 0

□ 120 дм3/ч

□ 180 дм3/ч ■ 300 дмз/ч

0

4.1 4.1 4.1

10 3.61 3.99 3.95

20 3.35 3.76 3.76

30 3.05

3.63

3.64

40 2.76

3.22

3.23

50 2.69 2.7 2.61

60 2.61 2.5 2.51

70 2.56 2.44 2.44

80 2.54 2.44 2.34

90 2.55 2.44 2.32

Время, ч

4

3

2

1

Рисунок 3.3 - Изменение рН среды при различных режимах аэрации

Отметили ингибирующее влияние кислорода воздуха на утилизацию субстрата дрожжевыми клетками B. bruxellensis, которое наблюдали при увеличении расхода воздуха (180 и 300 дм3/ч), в обоих случаях концентрация уксусной кислоты, вырабатываемой в процессе брожения, находилась на самом высоком уровне (7 и 10 г/дм3 соответственно). Информация об ингибирующем действии уксусной кислоты подтверждает её воздействие на клетку на цитоплазматиче-ском уровне, где присутствуют ферменты, участвующие в гликолизе [15].

По мере снижения выхода этанола и увеличения выхода уксусной кислоты при изменении условий аэрации рассчитывали стехиометрические коэффициенты для каждого из условий в зависимости от поглощения кислорода. Общее стехиометрическое уравнение записывали в виде:

Глюкоза + b O2 ^ a Биомасса + c CO2 + d Этанол + e Уксусная к-та В таблице 3.2 показаны коэффициенты регрессии при различных условиях аэрации. Выход уксусной кислоты и этанола изменялся пропорционально поглощению кислорода. Концентрация уксусной кислоты увеличилась с поглощением кислорода, в то время как выход этанола - уменьшился (рис. 3.4).

Таблица 3.2 - Значения коэффициентов линейной регрессии

Аэрация, дм3/ч Кислород (b) Этанол (d) Уксусная к-та (e)

0 0 0.60 0

30 0.04 0.57 0.02

60 0.08 0.56 0.03

90 0.09 0.47 0.11

120 0.12 0.45 0.14

180 0.25 0.40 0.20

300 0.70 0.16 0.43

Общее уравнение для потребляемой глюкозы дрожжами B. bruxellensis было получено эмпирическим путем: Глюкоза + b O2 ^ a Биомасса + с CO2 + (-0.56b2 + 1.569b - 0.01) Этанол +

+ (0.55b2 + 1.01 + 0.60) Уксусная к-та

0.7

Этанол(ф 0. 0. 56 / ▲

) 0.4

Л £ °.3

* 0.2 - £ £ 0.1 - И

0#«

0 0.1

у = -0.56х2 + 1.01х -0.01 Я2 = 0.97

у = 0.55x2 - 1.01x + 0.60 Я2 = 0.96

0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Кислород (Ь)

• Уксусная к-та (е) А Этанол (<!)

Рисунок 3.4 - Изменение концентрации уксусной кислоты и этанола при поглощении кислорода

Полученные коэффициенты стехиометрического уравнения позволяют рассчитать количество этанола и уксусной кислоты в зависимости от расхода воздуха при аэрации.

Выводы

Оптимальный выход биомассы дрожжей В. ЪтихвИетгз достигнут при расходе воздуха 60 дм3/ч. В условиях интенсивной аэрации (свыше 180 дм3/ч) полная утилизация субстрата невозможна, а повышенное количество уксусной кислоты будет способствовать ингибированию процесса ферментации глюкозы и снижению выхода этанола. Дрожжи В. ЪтихвИетгз способны синтезировать большое количество уксусной кислоты при увеличении содержания растворенного кислорода в среде [126].

Стехиометрическое уравнение позволяет рассчитать количественное изменение продуктов в зависимости от режима аэрации и может найти применение в области проектирование аппаратов для пропагации чистой культуры дрожжей В. ЪтихвИетгз.

3.2 Условия продуцирования уксусной кислоты дрожжами Brettanomyces

Проводили оценку количества уксусной кислоты при продуцировании четырьмя различными штаммами Brettanomyces, выбор штамма с точки зрения применения в пивоварении и изучение влияния условий культивирования дрожжей (температуры, аэрации и перемешивания) на выход уксусной кислоты.

Синтез уксусной кислоты дрожжами Brettanomyces

Для изучения эффективности процесса продуцирования уксусной кислоты дрожжами Brettanomyces в среде, содержащей глюкозу, проводили ряд экспериментов в аэробных условиях: расход воздуха 150 дм3/ч, температура 30 °С; скорость вращения мешалки 250 об/мин (рис. 3.5). Использовали питательную среду на основе 5 % глюкозы, 0,2 % (МВ^С^, 0,5 % КН2РО4, 0,04 % М£8О4-7Н2О и 0,1 % дрожжевого экстракта. Конечная концентрация уксусной кислоты была различной в зависимости от применяемого вида: от 1,41 г/дм3 для B. clausenii до 8,4 г/дм3 для B. intermedius. В случае участия B. intermedius и B. bruxellensis количество уксусной кислоты увеличилось - концентрация в среде оказалась в четыре раза выше, чем в экспериментах, проводимых с участием B. clausenii и B. сш1ешапш.

По результатам экспериментов рассчитывали удельную скорость роста микроорганизмов, выход уксусной кислоты, величины удельного и объемного выхода уксусной кислоты:

1п xp - 1п xp0 . Y _ р. Y _ Y V _ ХР (3 4)

t ' 1 _ 5' Ур _ t ' К _ t ' где ^ - удельная скорость роста, ч-1; хр0 - начальная концентрация продукта, г/дм3; хр - концентрация продукта в момент времени t (ч), г/дм3; У - выход продукта, г/г. р - образованный продукт, г. 5 - потребленный субстрат, г. Ур - удельный выход продукта в единицу времени, г/(г*ч); V - объемный выход продукта в единицу времени, г/(дм3*ч).

0 35 70 105 140 175

Время, ч

ПВгихеПетгз ЬС1аизепп OIntermedius ж Custersianus

Рисунок 3.5 - Динамика изменения содержания уксусной кислоты в среде

В таблице 3.3 приведены кинетические параметры процесса культивирования для каждого штамма дрожжей. Так, В. custersianus и В. с1ашепи показали самую высокую удельную скорость роста (0,18 и 0,33 ч-1, соответственно), но при этом наблюдали более низкое накопление уксусной кислоты (0,06 г/г) по сравнению с двумя другими штаммами (0,16 и 0,14 г/г).

Результаты для В. Ъruxellensis и В. intermedius показали, что эти штаммы имели самый высокий удельный (0,21 и 0,43 г/(г*ч)) и объемный выход уксусной кислоты (0,05 и 0,06 г/(дм3*ч)). На основании этого В. Ъruxellensis можно рассматривать как наиболее эффективный штамм для биологического подкис-ления среды.

Таблица 3.3 - Значения параметров культивирования уксусной кислоты, полученных для различных штаммов дрожжей Brettanomyces

Штамм Окончание культивирования, ч Удельная скорость роста, ¡и, ч-1 Выход уксусной к-ты, У, г/г Удельный выход уксусной к-ты, Ур, г/(г*ч) Объемный выход уксусной к-ты, V, г/(дм3хч)

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Юрицын Илья Александрович, 2019 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Lentz, M. The Impact of Simple Phenolic Compounds on Beer Aroma and Flavor [Текст] / M. Lentz // Fermentation. - 2018. - Т. 4. - № 1. - C. 20.

2. ПЦР-анализ и его перспективы использования в микробиологии виноделия [Текст] / В.А. Загоруйко, И.Ф. Ткачев, М.Г. Ткаченко [и др.] // Виноградарство и виноделие. - 2008. - № 38. - C. 72-74.

3. Дрожжи рода Brettanomyces. Характеристики и особенности метаболизма [Текст] / О.И. Пономарева, В.А. Иванова, И.П. Прохорчик, Т.В. Меледина // Пиво и напитки. - 2017. - № 1. - C. 38-42.

4. Phowchinda, O. Effects of acetic acid on growth and fermentative activity of Saccharomyces cerevisiae [Текст] / O. Phowchinda, M.L. Dlia-Dupuy, P. Strehaiano // Biotechnology Letters. - 1995. - Т. 17. - № 2. - C. 237-242.

5. The origin of ethylphenols in wines [Текст] / P. Chatonnet, D. Dubourdie, J.-n. Boidron, M. Pons // Journal of the science of food and agriculture. - 1992. - Т. 60.

- № 2. - C. 165-178.

6. Screening and evaluation of the glucoside hydrolase activity in Saccharomyces and Brettanomyces brewing yeasts [Text] / L. Daenen, D. Saison, F. Sterckx [et al.] // Journal of applied microbiology. - 2008. - Т. 104. - № 2. - P.478-488.

7. Phylogeny of the Yeast Genera Hanseniaspora (Anamorph Kloeckera), Dek-kera (Anamorph Brettanomyces), and Eeniella as Inferred from Partial 26S Riboso-mal DNA Nucleotide Sequences [Текст] / T. Boekhout, C.P. Kurtzman, K. O'Donnell, M.T. Smith // International Journal of Systematic Bacteriology. - 1994.

- Т. 44. - № 4. - C. 781-786.

8. Permyakova, L.V. Improvement of Brewer's Yeast Viability by Adjusting Wort Composition [Текст] / L.V. Permyakova, V.A. Pomozova, L.V. Antipova // Foods and Raw materials. - 2017. - № 2. - C. 94-104.

9. Delaherche, A. Detection and quantification of Brettanomyces bruxellensis and 'ropy'Pediococcus damnosus strains in wine by real-time polymerase chain reaction

[Текст] / A. Delaherche, O. Claisse, A. Lonvaud-Funel // Journal of applied microbiology. - 2004. - Т. 97. - № 5. - C. 910-915.

10. Вавилова, О.И. Экспресс-метод обнаружения и идентификации дрожжей Brettanomyces в пробах воздуха, отобранных в производственных цехах винного завода, на основе пептидонуклеинового анализа [Текст] / О.И. Вавилова // Экологическая безопасность в АПК. Реферативный журнал. - 2005. - № 3. - C. 810.

11. Джафаров, М.М. Штаммы Brettanomyces intermedius, выделенные из спонтанных кисломолочных продуктов [Текст] / М.М. Джафаров // Молочная промышленность. - 2012. - № 6. - C. 58-59.

12. Lentz, M. Analysis of Growth Inhibition and Metabolism of Hydroxycinnamic Acids by Brewing and Spoilage Strains of Brettanomyces Yeast [Text] / M. Lentz, C. Harris // Foods (Basel, Switzerland). - 2015. - Т. 4. - № 4. - P.581-593.

13. Genetic analysis of the metabolic pathways responsible for aroma metabolite production by Saccharomyces cerevisiae [Text] / G. Styger, D. Jacobson, B.A. Prior, F.F. Bauer // Applied microbiology and biotechnology. - 2013. - Т. 97. - № 10.

- P.4429-4442.

14. Boulton, C. Brewing yeast and fermentation [Текст] / C. Boulton, D. Quain.

- Oxford: Blackwell Science, 2001 - 659 c.

15. Lea, A.G.H. Fermented beverage production [Текст] / A.G.H. Lea, J.R. Pig-gott. - New York, London: Kluwer Academic/Plenum, 2003 - 437 c.

16. Peynaud, E. Sur les brettanomyces isols de raisins et de vins [Текст] / E. Pey-naud, S. Domercq // Archiv fr Mikrobiologie. - 1956. - Т. 24. - № 3. - C. 266-280.

17. Abbott, D.A. Growth rates of Dekkera/Brettanomyces yeasts hinder their ability to compete with Saccharomyces cerevisiae in batch corn mash fermentations [Text] / D.A. Abbott, S.H. Hynes, W.M. Ingledew // Applied microbiology and biotechnology. - 2005. - Т. 66. - № 6. - P.641-647.

18. Evaluation of the glycoside hydrolase activity of a Brettanomyces strain on glycosides from sour cherry (Prunus cerasus L.) used in the production of special fruit

beers [Text] / L. Daenen, F. Sterckx, F.R. Delvaux [et al.] // FEMS yeast research.

- 2008. - Т. 8. - № 7. - P.1103-1114.

19. Прист, Ф.Д. Микробиология пива [Текст] / Ф.Д. Прист, Й. Кэмпбелл: пер. с англ. под общ. ред. Т.В. Мелединой и Тыну Сойдла. - СПб: Профессия, 2005

- 368 с.

20. Аннемюллер, Г. Дрожжи в пивоварении [Текст] / Г. Аннемюллер: Г. Ан-немюллер, П. Литц; пер. с англ. под науч. ред. С.Г. Давыденко. - СПб. : Профессия, 2016 - 428 с.

21. Меледина, Т.В. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae : физиология, химический состав, метаболизм [Текст] / Т.В. Меледина, С.Г. Давыденко: СПб.: ун-т ИТМО, 2015 - 88 с.

22. van der Walt, J.P. Brettanomyces custersianus nov. spec [Текст] / J.P. van der Walt // Antonie van Leeuwenhoek. - 1961. - Т. 27. - № 1. - C. 332-336.

23. Smith, M.T. Dekkera anomala sp. nov., the teleomorph of Brettanomyces anomalus, recovered from spoiled soft drinks [Text] / M.T. Smith, A.M. van Grinsven // Antonie van Leeuwenhoek. - 1984. - Т. 50. - № 2. - P. 143-148.

24. Production of sensory compounds by means of the yeast Dekkera bruxellensis in different nitrogen sources with the prospect of producing cacha?a [Text] / D. Castro Parente, E.E. Vidal, F.C.B. Leite [et al.] // Yeast (Chichester, England). - 2015.

- Т. 32. - № 1. - P.77-87.

25. Fermentation of cellodextrins by different yeast strains [Text] / P. Gonde, B. Blondin, M. Leclerc [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 1984.

- Т. 48. - № 2. - P.265-269.

26. Physiological profiles relevant for novel alcoholic beverage design among dek-kera bruxellensis strains from different provenances [Текст] / L. Kranjc, N. Cadez, M. Sergan [и др.] // Journal of the Institute of Brewing. - 2016. - Т. 122. - № 3. - C. 536-542.

27. Guido, L. The impact of the physiological condition of the pitching yeast on beer flavour stability [Текст] / L. Guido // Food chemistry. - 2004. - Т. 87. - № 2.

- C. 187-193.

28. Screening of new strains of Saccharomycodes ludwigii and Zygosaccharomy-ces rouxii to produce low-alcohol beer [Текст] / G. de Francesco, B. Turchetti, V. Sileoni [и др.] // Journal of the Institute of Brewing. - 2015. - Т. 121. - № 1. - C. 113-121.

29. Palmqvist, E. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II [Текст] / E. Palmqvist, B. Hahn-Hagerdal // Bioresource technology. - 2000. - Т. 74. - № 1. - C. 25-33.

30. Overview of Dekkera bruxellensis behaviour in an ethanol-rich environment using untargeted and targeted metabolomic approaches [Текст] / L. Conterno, E. Aprea, P. Franceschi [и др.] // Food Research International. - 2013. - Т. 51. - № 2.

- C. 670-678.

31. Bioflavoring by non-conventional yeasts in sequential beer fermentations [Text] / S. Holt, V. Mukherjee, B. Lievens [et al.] // Food microbiology. - 2018.

- Т. 72. - P.55-66.

32. Пермякова, Л.В. Применение смеси кислот цикла Кребса в сверхнизких концентрациях для активации культуры пивных дрожжей [Текст] / Л.В. Пермякова, В.А. Помозова, А.Л. Верещагин // Пиво и напитки. - 2018. - № 1. - C. 2024.

33. Исследование внутриклеточного ионного состава биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae [Текст] / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова [и др.] // Российская сельскохозяйственная наука. - 2017. - C. 51-54.

34. Влияние ионного состава воды на метаболизм дрожжей [Текст] / Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Л.В. Римарева [и др.] // Хранение и переработка сель-хозсырья. - 2017. - C. 27-31.

35. Баки, И. Сокультивирование в производстве напитков [Текст] / И. Баки, У. Шталь, Й. Бадер // Мир пива. - 2014. - № 2. - C. 233-237.

36. Glucose Transport in Crabtree-positive and Crabtree-negative Yeasts [Текст] / H. van Urk, E. Postma, W.A. Scheffers, J.P. van Dijken // Microbiology (Reading, England). - 1989. - Т. 135. - № 9. - C. 2399-2406.

37. Dijken, J.P. Redox balances in the metabolism of sugars by yeasts [Текст] / J.P. Dijken, W.A. Scheffers // FEMS microbiology letters. - 1986. - Т. 32. - № 3-4.

- C. 199-224.

38. Metabolism of acetaldehyde and custers effect in the yeast [Text] / J.M. Carrascosa, M.D. Viguera, I. Núñez de Castro, W.A. Scheffers // Antonie van Leeuwen-hoek. - 1981. - Т. 47. - № 3. - P.209-215.

39. Пермякова, Л.В. Исследование различных способов снижения потребности дрожжей в кислороде [Текст] / Л.В. Пермякова // Техника и технология пищевых производств. - 2015. - № 3. - C. 42-50.

40. Ермолаева, Г.А. Справочник работника лаборатории пивоваренного предприятия [Текст] / Г.А. Ермолаева: Спб.: Профессия, 2004 - 536 c.

41. Torija, M. Effects of fermentation temperature on the strain population of Sac-charomyces cerevisiae [Текст] / M. Torija // International journal of food microbiology. - 2003. - Т. 80. - № 1. - C. 47-53.

42. Карпенко, Д.В. Влияние нанопрепаратов на развитие дрожжевых популяций [Текст] / Д.В. Карпенко, А.О. Комолова, А.А. Хоменко // Пиво и напитки.

- 2017. - № 1. - C. 14-17.

43. Карпенко, Д.В. Влияние наночастиц цинка на пивные дрожжи [Текст] / Д.В. Карпенко, Е.О. Райнина, Н.А. Химачева // Пиво и напитки. - 2015. - № 6.

- C. 22-24.

44. Grbin, P.R. Physiology and metabolism of Dekkera/Brettanomyces yeast in relation to mousy taint production [Текст] / Grbin Paul R.- 186 c.

45. Physiological requirements for growth and competitiveness of Dekkera brux-ellensis under oxygen-limited or anaerobic conditions [Text] / J. Blomqvist, V.S. Nogué, M. Gorwa-Grauslund, V. Passoth // Yeast (Chichester, England). - 2012.

- Т. 29. - № 7. - P.265-274.

46. Бемфорт, Ч. Новое в пивоварении [Текст] / Ч. Бемфорт: Спб.: Профессия, 2007 - 520 c.

47. Гернет, М.В. Перспективы расширения ассортимента напитков брожения для пивоваренных заводов малой мощности [Текст] / М.В. Гернет // Пиво и напитки. - 2017. - C. 14-17.

48. Пермякова, Л.В. Исследование влияния среды хранения на физиолого-биохимические и технологические показатели пивных дрожжей [Текст] / Л.В. Пермякова // Ползуновский вестник. - 2018. - № 1. - C. 54-58.

49. Уде, К. Ферментационные свойства дрожжей низового брожения при высокоплотном пивоварении [Текст] / К. Уде // Мир пива. - 2016. - № 1. - C. 2630.

50. The yeast Saccharomyces cerevisiae- the main character in beer brewing [Text] / E.J. Lodolo, J.L.F. Kock, B.C. Axcell, M. Brooks // FEMS yeast research. - 2008.

- Т. 8. - № 7. - P.1018-1036.

51. Кунце, В. Технология солода и пива: пер. с нем. [Текст] / В. Кунце.

- СПб.: Изд-во «Профессия», 2009 - 912 c.

52. Меледина, Т.В. Сырье и вспомогательные материалы в пивоварении [Текст] / Т.В. Меледина. - СПб.: Изд-во Профессия, 2003 - 304 c.

53. Юрицын, И.А. Перспективы применения высокосбраживающих рас пивных дрожжей с пропагацией чистой культуры [Текст] / И.А. Юрицын, И.В. Новикова, О.Ю. Мальцева // Актуальные вопросы нутрициологии; биотехнологии и безопасности пищи: Материалы Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием, 2017. - C. 237-240.

54. Scheffers, W.A. Stimulation of fermentation in yeasts by acetoin and oxygen [Text] / W.A. Scheffers // Nature. - 1966. - Т. 210. - № 5035. - P.533-534.

55. Inhibition of fermentation and growth in batch cultures of the yeast Brettano-myces intermedius upon a shift from aerobic to anaerobic conditions (Custers effect) [Текст] / M.R. Wijsman, J.P. van Dijken, B.H.A. van Kleeff, W.A. Scheffers // An-tonie van Leeuwenhoek. - 1984. - Т. 50. - № 2. - C. 183-192.

56. Custers, M.T.J. Onderzoekingen over het gistgeslacht Brettanomyces [Текст] / M.T.J. Custers. - Delft: W.D. Meinema, 1940 - 178 c.

57. Maiorella, B. By-product inhibition effects on ethanolic fermentation bySac-charomyces cerevisiae [Текст] / B. Maiorella, H.W. Blanch, C.R. Wilke // Biotechnology and Bioengineering. - 1983. - Т. 25. - № 1. - C. 103-121.

58. Оценка интенсивности биосинтетических процессов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae при культивировании на средах с добавлением порошкообразного гречишногосолодового экстракта [Текст] / И.В. Новикова, В.Н. Ка-лаев, Г.В. Агафонов [и др.] // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2015. - № 2. - C. 73-79.

59. Сергеева, И.Ю. Особенности системы менеджмента безопасности в производстве стойких к помутнениям напитков [Текст] / И.Ю. Сергеева, Л.В. Пер-мякова // Техника и технология пищевых производств. - 2016. - № 3. - C. 146154.

60. Харрис, М.О. Вопросы идентификации зернового состава пива [Текст] / М.О. Харрис, М.Н. Елисеев // Пиво и напитки. - 2018. - № 2. - C. 46-51.

61. Агафонов, Г.В. Современные проблемы санитарной обработки и дезинфекции систем пивоварения [Текст] / Г.В. Агафонов, И.В. Новикова, А.Е. Чу-сова // Гигиена и санитария. - 2015. - № 9. - C. 67-71.

62. Study of P-glucan content influence on turbidity beer formation [Текст] / M.N. Eliseev, O.M. Alekseeva, M.V. Gernet, I.N. Gribkova // Research Journal of Pharmaceutical Biological and Chemical Sciences. - 2019. - C. 1303-1308.

63. Yeast population dynamics of industrial fuel-ethanol fermentation process assessed by PCR-fingerprinting [Текст] / E.A.d. Silva-Filho, S.K.B.d. Santos, A.d.M. Resende [и др.] // Antonie van Leeuwenhoek. - 2005. - Т. 88. - № 1. - C. 13-23.

64. Factors affecting the production of 4-ethylphenol by the yeast Dekkera brux-ellensis in enological conditions [Текст] / L. Dias, S. Pereira-da-Silva, M. Tavares [и др.] // Food microbiology. - 2003. - Т. 20. - № 4. - C. 377-384.

65. Evaluation of the inhibitory effect of dimethyl dicarbonate (DMDC) against wine microorganisms [Text] / A. Costa, A. Barata, M. Malfeito-Ferreira, V. Loureiro // Food microbiology. - 2008. - Т. 25. - № 2. - P.422-427.

66. Hydroxycinnamic acid ethyl esters as precursors to ethylphenols in wine [Text] / J.L. Hixson, N.R. Sleep, D.L. Capone [et al.] // Journal of agricultural and food chemistry. - 2012. - Т. 60. - № 9. - P.2293-2298.

67. Обнаружение и идентификация штаммов дрожжей Brettanomyces [Текст] / В.А. Загоруйко, И.Ф. Ткачев, Т.К. Скорикова [и др.] // Магарач. Виноградарство и виноделие. - 2007. - № 3. - C. 20-23.

68. von Cosmos, N. Use of Nutritional Requirements for Brettanomyces bruxellen-sis to Limit Infections in Wine [Текст] / N. von Cosmos, C. Edwards // Fermentation.

- 2016. - Т. 2. - № 4. - C. 17.

69. The wine and beer yeast Dekkera bruxellensis [Text] / A.J. Schifferdecker, S. Dashko, O.P. Ishchuk, J. Piskur // Yeast (Chichester, England). - 2014. - Т. 31. - № 9. - P.323-332.

70. Survey of enzyme activity responsible for phenolic off-flavour production by Dekkera and Brettanomyces yeast [Текст] / V. Harris, C.M. Ford, V. Jiranek, P.R. Grbin // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2009. - Т. 81. - № 6. - C. 1117-1127.

71. Shantha Kumara, H.M.S. Identification of lambic superattenuating micro-organisms by the use of selective antibiotics [Текст] / H.M.S. Shantha Kumara, H. Ver-achtert // Journal of the Institute of Brewing. - 1991. - Т. 97. - C. 181-185.

72. Wedral, D. The challenge of Brettanomyces in wine [Текст] / D. Wedral, R. Shewfelt, J. Frank // LWT - Food Science and Technology. - 2010. - Т. 43. - № 10.

- C. 1474-1479.

73. Oxygen-limited cellobiose fermentation and the characterization of the cellobi-ase of an industrial Dekkera/Brettanomyces bruxellensis strain [Текст] / A.L. Reis, R. de Fatima Rodrigues Souza, R.R. Baptista Torres [и др.] // SpringerPlus. - 2014.

- Т. 3. - № 1. - C. 38.

74. Bokulich, N.A. Brewhouse-resident microbiota are responsible for multi-stage fermentation of American coolship ale [Text] / N.A. Bokulich, C.W. Bamforth, D.A. Mills // PloS one. - 2012. - Т. 7. - № 4. - e35507.

75. The microbial diversity of traditional spontaneously fermented lambic beer [Text] / F. Spitaels, A.D. Wieme, M. Janssens [et al.] // PloS one. - 2014. - Т. 9. - № 4. - e95384.

76. Влияние способа приготовления на показатели пива специального [Текст] / А.Е. Чусова, Т.И. Романюк, Н.В. Зуева, И.А. Юрицын: Инновационные технологии в пищевой промышленности: наука, образование и производство // Международная научно-техническая конференция (заочная). Под общей редакцией Пономарева А.Н., Мельниковой Е.И., 2013. - C. 451-453.

77. The microbial diversity of an industrially produced lambic beer shares members of a traditionally produced one and reveals a core microbiota for lambic beer fermentation [Text] / F. Spitaels, A.D. Wieme, M. Janssens [et al.] // Food microbiology. - 2015. - Т. 49. - P.23-32.

78. Steensels, J. Taming wild yeast: potential of conventional and nonconventional yeasts in industrial fermentations [Text] / J. Steensels, K.J. Verstrepen // Annual review of microbiology. - 2014. - Т. 68. - P.61-80.

79. Improving industrial yeast strains: exploiting natural and artificial diversity [Text] / J. Steensels, T. Snoek, E. Meersman [et al.] // FEMS microbiology reviews. - 2014. - Т. 38. - № 5. - P.947-995.

80. Идентификация дрожжей вида Brettanomyces bruxellensis с помощью специфических праймеров [Текст] / В.А. Загоруйко, И.В. Черноусова, Т.К. Скори-кова [и др.] // Виноградарство и виноделие. - 2009. - № 39. - C. 57-60.

81. Кузьмина, Т.Д. Изучение микрофлоры дестабилизированных белых вин. (Болгария) [Текст] / Т.Д. Кузьмина // Пищевая и перерабатывающая промышленность. Реферативный журнал. - 1999. - № 1. - C. 151.

82. Microbiological aspects of spontaneous wort fermentation in the production of lambic and gueuze [Текст] / D. van Oevelen, M. Spaepen, P. Timmermans, H. Ver-achtert // Journal of the Institute of Brewing. - 1977. - Т. 83. - C. 356-360.

83. Данина, М.М. Использование дрожжей р. Brettanomyces в технологии пива [Текст] / М.М. Данина, О.Б. Иванченко // Вестник МАХ. - 2015. - № 4.

- 27-31.

84. Verachtert, H. Properties of belgian acid beers and their microflora. I. The production of gueuze and related refreshing acid beers [Текст] / H. Verachtert, A. De-bourg. - C. 37-41.

85. Новикова, И.В. Обзор: дрожжи рода Brettanomyces в технологии пива [Текст] / И.В. Новикова, И.А. Юрицын, А.С. Муравьев // Вестник ВГУИТ.

- 2019. - Т. 80. - № 4. - C. 145-150.

86. Impact of Australian Dekkera bruxellensis strains grown under oxygen-limited conditions on model wine composition and aroma [Text] / C.D. Curtin, G. Langhans, P.A. Henschke, P.R. Grbin // Food microbiology. - 2013. - Т. 36. - № 2. - P.241-247.

87. Implications of Lactobacillus collinoides and Brettanomyces/Dekkera anomala in phenolic off-flavour defects of ciders [Text] / N. Buron, M. Coton, P. Legendre [et al.] // International journal of food microbiology. - 2012. - Т. 153. - № 1-2. - P.159-165.

88. Purification and characterization of hydroxycinnamate decarboxylase from Brettanomyces anomalus [Текст] / D.A.N. Edlin, A. Narbad, M.J. Gasson [и др.] // Enzyme and Microbial Technology. - 1998. - Т. 22. - № 4. - C. 232-239.

89. Brettanomyces Bruxellensis, Essential Contributor in Spontaneous Beer Fermentations Providing Novel Opportunities for the Brewing Industry [Текст] / S. Crauwels, J. Steensels, G. Aerts [и др.] // BrewingScience. - 2015. - Т. 68. - C. 110121.

90. Теречик, Л.Ф. Влияние летучих ароматических фенольных соединений на сенсорные качества и букет виноградных вин; влияние хранения в дубовых

бочках. (ФРГ) [Текст] / Л.Ф. Теречик // Пищевая и перерабатывающая промышленность. Реферативный журнал. - 2002. - № 1. - C. 200.

91. Formation of 4-vinyl and 4-ethyl derivatives from hydroxycinnamic acids [Текст] / N. Vanbeneden, F. Gils, F. Delvaux, F.R. Delvaux // Food chemistry.

- 2008. - Т. 107. - № 1. - C. 221-230.

92. Oelofse, A. Molecular identification of Brettanomyces bruxellensis strains isolated from red wines and volatile phenol production [Text] / A. Oelofse, A. Lonvaud-Funel, M. Du Toit // Food microbiology. - 2009. - Т. 26. - № 4. - P.377-385.

93. Flavor-active esters: adding fruitiness to beer [Text] / K.J. Verstrepen, G. Der-delinckx, J.-P. Dufour [et al.] // Journal of bioscience and bioengineering. - 2003.

- Т. 96. - № 2. - P. 110-118.

94. Gonzalez, R. Yeast respiration of sugars by non-Saccharomyces yeast species [Текст] / R. Gonzalez, M. Quiros, P. Morales // Trends in Food Science & Technology. - 2013. - Т. 29. - № 1. - C. 55-61.

95. Spaepen, M. Fatty acids and esters produced during the spontaneous fermentation of lambic and gueuze [Текст] / M. Spaepen, D. van Oevelen, H. Verachtert // Journal of the Institute of Brewing. - 1978. - Т. 84. - C. 278-282.

96. Tonsmeire, M. American sour beers [Текст] / M. Tonsmeire. - Boulder Colorado: Brewers Publications, 2014 - 398 c.

97. № 2342424 RU МПК кл.7 C12C11/00, C12N1/18 Периодический способ размножения чистой культуры дрожжей для пивоваренного производства и установка для его осуществления [Текст] / Ч.М. Кайтуков, заявитель и патентообладатель Кайтуков Ч.М. - № 2007120516/13; заявл. 04.06.2007; опубл. 27.12.2008. - 13 c.

98. Кайтуков, Ч.М. Развитие систем пропагации пивных дрожжей / автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук [Текст] / Кайтуков Ч. М. - М., 2007 - 24 c.

99. Калужина, О.Ю. Изучение способа активации спиртовых дрожжей [Текст] / О.Ю. Калужина // Пиво и напитки. - 2017. - № 1. - C. 30-32.

100. Влияние параметров процесса культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae в простой периодической культуре на выход биомассы и биосинтез некоторых клеточных компонентов [Текст] / Т.В. Меледина, В.А. Иванова, Ра-зан Х., Головинская, О. В. [и др.] // Вестник ВГУИТ. - 2018. - № 2. - С. 175181.

101. Накопление метаболитов дрожжами Saccharomyces cerevisiae 1039 при культивировании на зерновом сусле [Текст] / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова [и др.] // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2016. - № 5.

- С. 23-27.

102. Исследование ионного состава питательной среды в процессе генерации спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae с осмофильными свойствами [Текст] / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова [и др.] // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2016. - С. 41-44.

103. Ли, Э.Д.Г. Спиртные напитки: особенности брожения и производства [Текст] / Э.Д.Г. Ли: Ли, Э.Дж.Г., Пигготт, Дж.Р.; пер. с англ. под общ. ред. А.Л. Панасюка - СПб. : Профессия, 2006 - 534 с.

104. Гернет, М.В. Исследование влияния состава сырья на качество и безопасность готового пива. Часть I. Влияние состава зернового и сахаросодержащего сырья на образование летучих компонентов в пиве [Текст] / М.В. Гернет, К.В. Кобелев, И.Н. Грибкова // Пиво и напитки. - 2015. - С. 32-37.

105. Исследование влияния состава исходного сырья на качество и безопасность готового пива. Часть III. Влияние состава зернового и сахарсодержащего сырья на содержание органических кислот и углеводов в пиве [Текст] / М.В. Гернет, К.В. Кобелев, И.Н. Грибкова, А.В. Данилян // Пиво и напитки. - 2015.

- С. 46-51.

106. Исследование влияния состава сырья на качество и безопасность готового пива. Часть II. Влияние состава зернового и сахаросодержащего сырья на содержание азотистых веществ и глицерина в пиве [Текст] / М.В. Гернет, К.В. Кобелев, И.Н. Грибкова, А.В. Данилян // Пиво и напитки. - 2015. - С. 34-38.

107. Ермолаева, r.A. Технология и оборудование производства пива и безалкогольных напитков [Текст] / r.A. Ермолаева, РА. Колчева. - М.: Aкадемия, 2000 - 416 c.

108. Smart, K. Brewing yeast fermentation performance [Текст] I K. Smart. - Oxford UK, Malden MA: Blackwell Science, 2003 - ill. (some col.) ;

109. White, C. Yeast [Текст] I C. White, J. Zainasheff. - Boulder CO: Brewers Publications, 2010 - xix, 304.

110. Федоренко, Б.Н. Инновационное технологическое оборудование для крафтового пивоварения [Текст] / Б.Н. Федоренко, Ф. Трэнкл // Пиво и напитки. - 2017. - № 1. - C. 22-24.

111. Гирдс, Я.Х. Классификация пивоваренных дрожжей масс-спектромет-рией М^ЛДИ [Текст] / Я.Х. Гирдс, Д. Хармс // Мир пива. - 2015. - № 4. - C. 156-162.

112. Карпенко, Д.В. Влияние нанопрепаратов на развитие популяций пивных дрожжей рода Saccharomyces [Текст] / Д.В. Карпенко, М.В. Гернет // Микробиология. - 2017. - C. 593-599.

113. Исследование влияния состава сырья на качество и безопасность готового пива. Часть IV. Влияние состава зернового и сахаросодержащего сырья на содержание аминокислот в пиве [Текст] / К.В. Кобелев, М.В. Гернет, И.Н. Гриб-кова, И.В. Лазарева // Пиво и напитки. - 2015. - C. 40-44.

114. Ермолаева, ГА. Справочник работника лаборатории пивоваренного предприятия [Текст] / ГА. Ермолаева: Спб.: Профессия, 2004 - 536 c.

115. Иванченко, О.Б. Санитария и гигиена на пивоваренном производстве [Текст] / О.Б. Иванченко, Т.В. Меледина: СПб. : Гиорд, 2011 - 200 c.

116. ГОСТ 33409-2015 Продукция алкогольная и соковая. Определение содержания углеводов и глицерина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. - М.: Стандартинформ- 11 c.

117. Васильев, В.П. Aналитическая химия. В 2 кн. Кн. 2. Физико-химические методы анализа [Текст] / В.П. Васильев. - М.: Дрофа, 2002 - 384 c.

118. Моргунова Е.М., Н.Ю.С. Исследование бродильной активности пивоваренных дрожжей [Текст] / Н.Ю.С. Моргунова Е.М. // Scientific works Volume LX «Food science engineering and technology». - 2013. - C. 337-340.

119. Нарцисс, Л. Краткий курс пивоварения [Текст] / Л. Нарцисс: Л. Нарцисс, Б. Вернер; пер. с нем. яз. А.А. Куреленкова. - 7 е изд., перераб. и доп. СПб. : Профессия, 2007 - 640 с.

120. Бак, В. Практическое руководство по технологии пивоварения : [справочное пособие] : пер. с нем [Текст] / В. Бак: В. Бак; науч. ред. перевода Г. Ермолаева. - 2 е изд. Бремен, 2013 - 427 с.

121. Гернет, М.В. Состояние и перспектива производства специальных сортов пива [Текст] / М.В. Гернет, И.Л. Рисухина // Пиво и напитки. - 2009. - № 2. - C. 8-10.

122. Третьяк, Л.Н. Технология производства пива с заданными свойствами [Текст] / Л.Н. Третьяк: СПб. : Профессия, 2016 - 463 с.

123. Швилль-Миданер, А. Технология процессов в пивоварении [Текст] / А. Швилль-Миданер: Бремен: Медиен трансфер, 2016 - 297 с.

124. Шустер, Л.Н. Пивоварение в 3 т. Т. 2 : Технология приготовления сусла [Текст] / Л.Н. Шустер: пер. с нем. В.А. Калашников, А.М. Калашникова; под ред. С.А. Анисимова. - 7 е изд., перераб. и доп. - М. : Элевар, 2001 - 368 с.

125. Грачев, Ю.П. Математические методы планирования экспериментов [Текст] / Ю.П. Грачев, Ю.М. Плаксин: ДеЛи принт М, 2005 - 296 с.

126. Юрицын, И.А. Исследование влияния расхода кислорода на метаболизм B. bruxellensis [Текст] / И.А. Юрицын, И.В. Новикова: Продовольственная безопасность: научное, кадровое и информационное обеспечение / сборник научных статей и докладов: ООО Ритм, 2018. - C. 384-391.

127. Новикова, И.В. Условия продуцирования уксусной кислоты дрожжами Brettanomyces [Текст] / И.В. Новикова, И.А. Юрицын, А.С. Муравьев // Вестник МГТУ. - 2018. - Т. 21. - № 3. - C. 387-394.

128. Тишин, В.Б. О выборе математических моделей кинетики культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях дефицита кислорода [Текст] / В.Б. Тишин, Т.В. Меледина, О.В. Головинская // Вестник ВГУИТ. - 2015. - C. 32-37.

129. Перспективы применения пропагатора в технологии напитков [Текст] / И.А. Юрицын, И.В. Новикова, А.В. Коростелев [и др.] // Инновационные решения при производстве продуктов питания из растительного сырья: Сборник научных статей и докладов II Международной научно-практической конференции (заочной), 2016. - C. 224-228.

130. Thomas, K.C. Initiation of anaerobic growth of Saccharomyces cerevisiae by amino acids or nucleic acid bases [Текст] / K.C. Thomas, S.H. Hynes, W.M. In-gledew // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. - 1998. - Т. 21. - № 4-5. - C. 247-253.

131. Аннемюллер, Г. Дрожжи в пивоварении [Текст] / Г. Аннемюллер, Ман-гер, Г. - Й., П. Литц; пер. с англ. под науч. ред. С.Г. Давыденко. - СПб. : Профессия, 2016. - 428 с.

132. Меледина, Т.В. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Морфология, химический состав, метаболизм - Учебное пособие [Текст] / Т.В. Меледина, С.Г. Давыденко: Санкт-Петербург, 2015 - 90 c.

133. Меледина Т.В., Давыденко С.Г. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae : физиология, химический состав, метаболизм. - СПб.: ун-т ИТМО, 2015. - 88 с.

134. Kuznetcova, K.A. Propagation time impact of on the parameters of high gravity barley mash fermentation [Текст] / K.A. Kuznetcova, N.V. Barakova, M.A. Na-chetova // Processes and Food Production Equipment. - 2016. - C. 40-48.

135. Полезная модель № 188087 Ru МПК кл.7 C12M 1/04 (2006.01) Установка для пропагации чистой культуры дрожжей [Текст] / И.А. Юрицын, И.В. Новикова, А.С. Муравьев, заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВО "ВГУИТ" - № 2018131772; заявл. 05.09.2018; опубл. 28.03.2019. - 7 c.

136. Юрицын, И.А. Продуцирование уксусной кислоты дрожжами Brettanomyces [Текст] / И.А. Юрицын: VIII Международная научно-техническая конференция «Новое в технологии и технике функциональных продуктов питания на основе медико-биологических воззрений»: сборник статей Между-нар. науч.-техн. конф. - Воронеж: ВГУИТ, 2019. - С. 431-435.

137. Новикова, И.В. Исследование влияния интенсивности аэрации на жизнедеятельность дрожжей Brettanomyces bruxellensis [Текст] / И.В. Новикова, И.А. Юрицын, А.С. Муравьев // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2019. - Т. 9. - № 1. - С. 102-108.

138. Разработка математической модели для анализа процесса пропагации дрожжей Brettanomyces bruxellensis [Текст] / И.А. Юрицын, И.В. Новикова, А.С. Муравьев, Г.В. Агафонов: Современные проблемы техники и технологии пищевых производств: Материалы XX международной научно-практической конференции. - Барнаул: Изд-во АлтГТУ, 2019. - С. 42-46.

139. Программа для ЭВМ № 2018664178 RU Программа для расчета характеристик процесса ферментации пива [Текст] / И.В. Новикова, И.А. Юрицын, А.С. Муравьев, заявитель и патентообладатель ФГБОУ ВО "ВГУИТ" - № 2018660752; заявл. 05.10.2018; опубл. 12.11.2018.

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ А Листинг программы расчета процесса брожения в среде Matlab

«Решение модели» файл diff solve.m

DOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

^Решение дифференциальных уравнений, построение графиков

%Начальные концентрации

Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-&

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%conc=[Glucose;Maltose;Maltotriose;Biomass;Ethanol;Temperature;Leucine;

OIsoLeucine;Valin;Isobutyl;Isoamyl;Pentanol;Propanol;Ethylacetate;

OEhtylcaproate;Isoamylacetate;Diacetyl;Acetaldehyde]

Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-&

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

tspan=[0 250];

conc=[65;210;35;135;0;8;1.4;0.5;2.2;0;0;0;0;0;0;0;0;0]; [t,x]=ode15s(@fermentation,tspan,conc);

о

O

O Размеры рисунков

width = 4; % ширина

height = 4; % высота

alw = 0.75; % толщина линий

fsz = 11; % высота шрифта

lw = 1.5; % ширина линий

msz = 2; % маркер

%Параметры графиков

OOOOOOOOOOOOOOOOOOO

close all;

set(0,'defaultLineLineWidth',lw); set(0,'defaultLineMarkerSize',msz); set(0,'defaultLineLineWidth',lw); set(0,'defaultLineMarkerSize',msz); defpos = get(0,'defaultFigurePosition');

set(0,'defaultFigurePosition', [defpos(1) defpos(2) width*100, height*100]);

set(0,'defaultFigureInvertHardcopy,,,on');

set(0,'defaultFigurePaperUnits,,,centimeters');

defsize = get(gcf, 'PaperSize');

left = (defsize(1)- width)/2;

bottom = (defsize(2)- height)/2;

defsize = [left, bottom, width, height];

set(0, 'defaultFigurePaperPosition', defsize);

•¡Модель роста

figure(1); clf;

plot(t,x(:,1),,-,,t,x(:,2),,--,,t,x(:,3),,:,);

legend('глюкоза', 'мальтоза', 'мальтотриоза', 'Location', 'NorthEast'); х1аЬе1('Время, ч') у1аЬе1('Концентрация, моль/мА3'); grid on

print -depsc fig1.eps;

о

O

figure(2); clf; plot(t,x(:,4),'-'); х1аЬе1('Время, ч') у1аЬе1('Концентрация, моль/мА3'); yyaxis right

plot(t,x(:,5),'--'); у1аЬе1('Концентрация, моль/мА3'); legend('биомасса', 'этанол', 'Location' grid on

print -depsc fig2.eps;

'East')

•¡Модель питания

figure(3); clf;

plot(t,x(:,7),'-',t,x(:,8),'--',t,x(:,9),':');

xlabel('Время, ч')

у1аЬе1('Концентрация, моль/мА3');

yyaxis right

plot(t,x(:,6),'-.');

ylabel('Температура, C');

legend('лейцин', 'изолейцин', 'валин', 'температура' grid on

print -depsc fig3.eps;

'Location', 'East');

^Формирование сивушных масел

figure(4); clf;

plot(t,x(:,10),'-',t,x(:,11),'--',t,x(:,12),':',t,x(:,13), legend('изобутанол', 'изопентанол', 'пентанол', 'пропанол' East');

х1аЬе1('Время, ч') у1аЬе1('Концентрация, моль/мА3'); grid on

print -depsc fig4.eps;

'Location',

'south-

')

%Формирование эфиров

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

figure(5); clf; plot(t,x(:,15),'—',t,x(:,16) х1аЬе1('Время, ч') у1аЬе1('Концентрация, моль/мА3'); yyaxis right plot(t,x(:,14),'-'); у1аЬе1('Концентрация, моль/мА3');

legend('этилкапроат', 'амилацетат', 'этилацетат' grid on

print -depsc fig5.eps;

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

%Формирование Диацетила и Ацетальдегида

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

figure (6); clf;

plot(t,x(:,17), '--');

х1аЬе1('Время, ч')

у1аЬе1('Концентрация, моль/мА3');

yyaxis right

plot(t,x(:,18), ':');

у1аЬе1('Концентрация, моль/мА3');

'Location', 'southEast')

legend('диацетил' grid on

print -depsc fig6.eps;

ацетальдегид'

'Location', 'NorthEast')

«Дифференциальные уравнения» файл fermentation.m

Шодель брожения (рост дрожжей, формирование ароматических соединений)

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% function fermentaion = brew(t,x,conc)

Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-

%%%%%%%%%%%%%

%Модель роста

Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-

%%%%%%%%%%%%%

Glucose = x(1); %Глюкоза Maltose = x(2); %Мальтоза Maltotriose = x(3); %Мальтотриоза Biomass = x(4); %Биомасса Ethanol = x(5); %Этанол

Temperature = x(6); %Температура

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

%Питательная модель

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

Leucine = x(7); %Лейцин Isoleucine = x(8); %Изойлецин

Valin = x(9); %Валин

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

%Ароматическая модель

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

%%%%%%%%%%%%%%%% %Сивушные масла

о %

Isobutyl = x(10); %Изобутанол Isoamylacetate = x(11); %Изопентанол Pentanol = x(12); %Пентанол

Propanol = x(13); %Пропанол

%%%%%%%%

%ЭФиры

о %

Ethylacetate = x(14); %Этилацетат Ethylcaproate = x(15); %Этилкапроат

Isoamylacetate = x(16); %Изоамилацетат

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

%Диацетил и Ацетальдегид

о %

Diacetyl = x(17); %Диацетил

Acetaldehyde = x(18); %Ацетальдегид

%%%%%%%%%%%%%%%%%%

%Загрузка Входных параметров

%%%%%%%%%%%%%%%%%%

param;

о

%------------------------------------------------------------------

%%%%%%%%%%%%%

%Модель роста

%%%%%%%%%%%%%

%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%

%Функции температуры

%

muGlucose=lnmuGlucose0*exp(-EmuGlucose/(R*(Temperature+273.15))); muMaltose=lnmuMaltose0*exp(-EmuMaltose/(R*(Temperature+273.15))); muMaltotriose=lnmuMaltotriose0*exp(-EmuMaltotriose/(R*(Temperature+273.15)));

о %

KGlucose=lnKGlucose0*exp(-EGlucose/(R*(Temperature+273.15))); KMaltose=lnKMaltose0*exp(-EMaltose/(R*(Temperature+273.15)));

KMaltotriose=lnKMaltotriose0*exp(-EMaltotriose/(R*(Temperature+273.15)));

%

KsGlucose=KsGlucose0*exp(-EKsGlucose/(R*(Temperature+273.15))); KsMaltose=KsMaltose0*exp(-EKsMaltose/(R*(Temperature+273.15)));

о %

muGlucose1=muGlucose*Glucose/(KGlucose+Glucose);

muMaltose2=(muMaltose*Maltose/(KMaltose+Maltose))*(KsGlucose/(KsGlucose+Glu-cose));

muMaltotriose3=(muMaltotriose*Maltotriose/(KMaltotriose+Maltotriose))*(KsGlu-

cose/(KsGlucose+Glucose))*(KsMaltose/(KsMaltose+Maltose));

muBiomass=(YeildBiomassGlucose*muGlucose1+YeildBiomassMaltose*muMalt-

ose2+YeildBiomassMaltotriose*muMaltotriose3)*KBiomass/(KBiomass+(Biomass-Bio-

mass0)A2);

Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%Дифферинцальные уравнения

о

O

dGlucosedt = -muGlucose1*Biomass; dMaltosedt = -muMaltose2*Biomass; dMaltotriosedt = -muMaltotriose3*Biomass; dBiomassdt = muBiomass*Biomass;

dEthanoldt = (YeildEthanolGlucose*muGlucose1+YeildEthanolMaltose*muMalt-

ose2+YeildEthanolMaltotriose*muMaltotriose3)*Biomass;

O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-Q-O-O-O-

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%Температурный профиль

о

O

dTemperaturedt=(1/(rho*Cp))*(-Biomass*(deltaHGlucose*muGlucose1+deltaHMalt-ose*muMaltose2+deltaHMaltotriose*muMaltotriose3));

O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-Q-O-O-O-

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%Питательная модель

o

O

time = 1-exp(-t/tdelay); %временная задержка

о

O

KLeucine=lnKLeucine0*exp(-KLeucine/(R*(Temperature+273.15))); KValin=lnKValin0*exp(-KValin/(R*(Temperature+273.15)));

O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-Q-O-O-O-

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%Дифференциальные уравнения

о

O

dLeucinedt = -YeildLeucineBiomass*dBiomassdt*(Leucine/(KLeucine+Leucine))*time; dIsoLeucinedt = -YeildIsoLeucineBiomass*dBiomassdt*(Isoleucine/(KIsoLeu-

cine+Isoleucine))*time;

dValindt = -YeildValinBiomass*dBiomassdt*(Valin/(KValin+Valin))*time;

O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-Q-O-O-O-

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%Ароматическая модель

Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-Q-

OOOOOOOOOOOOOOOO

%Сивушные масла

о

O

muLeucine = -(1/Biomass)*dLeucinedt; muIsoLeucine = -(1/Biomass)*dIsoLeucinedt; muValin = -(1/Biomass)*dValindt;

O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-Q-O-O-O-

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%Дифференциальные уравнения

о

O

dIsobutyldt = YeildIsobutyl*muValin*Biomass; dIsoamyldt = YeildIsoamyl*muLeucine*Biomass; dPentanoldt = YeildPentanol*muIsoLeucine*Biomass; dPropanoldt = YeildPropanol*(muValin+muIsoLeucine)*Biomass;

O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-Q-O-O-O-

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%Эфиры

о

O

muIsoLeucineA = (1/Biomass)*dIsoamyldt; %допущение

O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-Q-O-O-O-

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%Дифференциальные уравнения

о

O

dEAdt = YeildEthylacetate*(muGlucose1+muMaltose2+muMaltotriose3)*Biomass; dECdt = YeildEthylcaproate*muBiomass*Biomass; dIAcdt = YeildIsoamylacetate*muIsoLeucineA*Biomass;

O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-O-Q-O-O-O-

OOOOOOOOOOOOOOOOOOOO

%Диацетил и Ацетальдегид

оооооооооооооооооооо

%Функции температуры

KDiacetyl=lnKDiacetyl0*exp(-EDiacetyl/(R*(Temperature+273.15)));

KAcetaldehyde=lnKAcetaldehyde0*exp(-EAcetaldehyde/(R*(Temperature+273.15)));

&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&

ооооооооооооооооооооооооооо

оДифференциальные уравнения

о о

dDiacetyldt = YeildDiacetyl*muBiomass*Biomass - KDiacetyl*Diacetyl*Biomass; dAcetaldehydedt = YeildAcetaldehyde*(muGlucose1+muMaltose2+muMaltotriose3)*Bio-mass - KAcetaldehyde*Acetaldehyde*Biomass;

¡¡Возврат аргументов функции

fermentaion=[dGlucosedt;dMaltosedt;dMaltotriosedt;dBiomassdt;dEthanoldt;dTem-

peraturedt;dLeucinedt;dIsoLeucinedt;dValindt;dIsobutyldt;dIsoamyldt;dPenta-

noldt;dPropanoldt;dEAdt;dECdt;dIAcdt;dDiacetyldt;dAcetaldehydedt];

о о

«Исходные параметры» файл param.m

^Параметры

YeildBiomassGlucose=0.134; YeildBiomassMaltose=0.268; YeildBiomassMaltotriose=0.402;

ооооооооооооооооооооооооооооооооооо

%Параметры зависящие от температуры

^ = 1*10А6; % Дж/(ч СА2 мА3)

Tset = 12; оо С

umin = 0; оо Дж/(ч СА2 мА3)

umax = 4 0000;

Л = 0.188; о мА2

^ = 0.1; о мА3

о о