Анализ структуры генов изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных на территории Российской Федерации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Варенцова, Алиса Алексеевна

• Варенцова, Алиса Алексеевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Варенцова, Алиса Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы исследования

1.2 Степень разработанности проблемы

1.3 Цели и задачи исследования

1.4 Научная новизна результатов исследований

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

1.6 Методология и методы исследования

1.7 Положения, выносимые на защиту

1.8 Личный вклад соискателя

1.9 Степень достоверности и апробация результатов работы

1.10 Публикации

1.11 Объем и структура диссертации

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Африканская чума свиней, эпизоотологическая ситуация

2.2 Разнообразие изолятов и штаммов вируса АЧС

2.3 Современная классификация изолятов и штаммов вируса АЧС

2.4 Структура вириона

2.5 Характеристика основных, структурных и диагностически значимых белков вируса АЧС

2.6 Характеристики изолятов и штаммов вируса АЧС

2.7 Основные направления разработки специфических средств профилактики АЧС

2.8 Клонотеки генов в изучении возбудителя АЧС

2.9 Заключение по обзору литературы

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы

3.2 Методы

4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Создание клонотеки генов вируса АЧС

4.1.1 Определение расположения и направления считывания ОРС генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L в полноразмерном геноме вируса АЧС штамма Грузия 2007/1

4.1.2 Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР

4.1.3 Клонирование генов вируса АЧС

4.1.4 Клонотека генов вируса АЧС изолята Krasnodar06/12

4.2 Использование клонотеки генов для создания продуцентов

4.2.1 Клонирование копии гена K177R в экспрессирующей плазмиде рЕТ32Ь(+)

4.2.2 Анализ экспрессии р22 в клетках E.coli

4.2.3 Анализ нуклеотидных последовательностей генов вируса АЧС

4.3 Изучение культурально-биологических свойств изолята Krasnodar 06/12 и адаптация его к репродукции в перевиваемых культурах клеток

4.3.1 Выделение вируса АЧС из патологического материала и первичный анализ свойств изолята Krasnodar 06/12

4.3.2 Изучение биологических свойств изолята Krasnodar 06/12

4.3.3 Патологоанатомические изменения у свиней, зараженных изолятом Krasnodar 06/12 вируса АЧС

4.3.4 Сравнительный анализ молекулярно-биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в 2007-2013 гг

4.3.5 Адаптация изолята Krasnodar 06/12 к репродукции в перевиваемых культурах клеток

4.3.6 Изучение биологических свойств вируса АЧС, изолята Krasnodar 2/13, адаптированного к росту в перевиваемой культуре клеток РК-15

4.4 Получение аттенуированного варианта вируса АЧС

4.4.1 Аттенуация изолята Krasnodar 2/13, адаптированного к росту в

перевиваемой культуре клеток PK-15

4.4.2 Изучение возможности использования адаптированного штамма для приготовления культурального антигена для постановки ТФ ИФА

4.4.3 Использование культурального антигена вируса АЧС для постановки РНИФ

4.5 Обсуждение результатов

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1 Выводы

5.2 Практические предложения

5.3 Перспективы дальнейшей разработки темы

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

9 ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ структуры генов изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных на территории Российской Федерации»

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы исследования

Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная болезнь домашних и диких свиней, характеризующаяся высокой контагиозностью и летальностью, сверхострой, острой, подострой до хронической и инаппарантной формами течения [1]. Вирус обладает высокой степенью патогенности (смертность приближается к 100%) и его распространение наносит огромные экономические потери, складывающиеся из затрат на проведение ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий, убоя всего поголовья на территории очага болезни и ограничений в международной торговле [40]. Вирус АЧС передается при прямом контакте больных и здоровых животных, клещами и механически.

Изменчивость вируса АЧС обуславливает наличие более 500 изолятов и штаммов, различающихся по своим биологическим свойствам. Поэтому вопрос группирования и классификации изолятов, в частности, генотипирования и сероиммунотиповой идентификации изолятов вируса, выделенных в очагах болезни, является главенствующим. На необходимость изучения и паспортизации полевых изолятов вируса АЧС неоднократно указывалось на совещаниях экспертов ФАО/ЕЕС и МЭБ по АЧС [35].

Детальный анализ структуры и функций отдельных генов позволяет выработать критерии, по которым будет проводиться группирование изолятов и штаммов. Исследования структуры генов, кодирующих поверхностные белки вируса АЧС, вызваны обоснованным предположением об изменении патогенности вируса, циркулирующего на территории РФ.

Особый интерес представляет изучение изменений поверхностных белков вируса АЧС, поскольку они обеспечивают процесс прикрепления вирионов к чувствительным клеткам и его интернализации. Белки,

изменения в которых приводят к снижению репродукции вируса АЧС, могут быть отнесены к трем группам: белки прикрепления и интернализации, белки, участвующие в морфогенезе вируса АЧС, и вирусспецифические ферменты [76].

Выявление различий в белках вышеуказанных групп позволит установить связь изменений вирулентности, происходящих в процессе репродукции вируса в различных чувствительных системах или у природных изолятов, с определенными изменениями фенотипа.

Для детального изучения структурных и функциональных особенностей вирусспецифических белков методами генной инженерии требуется создание клонотеки генов, которые могут быть использованы не только в качестве источника для получения нужного трансгена, но и как матрица для экспрессии рекомбинантного белка. Однажды созданная библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго.

Следовательно, работа по созданию клонотеки генов вируса АЧС и изучению их структурно-функциональных особенностей является актуальной.

1.2 Степень разработанности проблемы

При изучении основ патогенности и иммуногенности таких сложно организованных вирусов, как вирус АЧС, необходимо создание и использование модельных вирусов, адаптированных к репродукции в стандартных культуральных системах. Для изучения структуры и уникальных свойств возбудителя АЧС был получен изолят вируса АЧС BA71V, адаптированный к репродукции в перевиваемой культуре клеток Vero, который на настоящий момент является референтным штаммом для валидации диагностических тест-систем [80].

В исследованиях АЧС создание клонотек генов ее возбудителя позволило изучить роль клеточного иммунитета в устойчивости чувствительных животных к АЧС [127], определить структуру и функции генов различных изолятов и штаммов вируса АЧС.

Кроме того, создание клонотек иммунологически значимых генов является эффективным подходом в разработке современных диагностических средств и ДНК-вакцин.

В 2011 г. L.K. Dixon с соавторами разработали стратегию для получения ДНК-вакцины против АЧС на основе использования клонотеки генов возбудителя [75].

1.3 Цели и задачи исследования

Основной целью данной работы являлось изучение структурных особенностей генов, кодирующих иммунологически значимые белки вируса АЧС, выделенного на территории РФ, и конструирование библиотеки данных генов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

а) на основе анализа отечественной и зарубежной литературы изучить структурные особенности генов B646L (vp72), CP204L (vp30), KP177R (vp22), 061R (vpl2), EP402R (CD2v), CP530R (pp62), CP2475L (pp220) и E183L (vp54) вируса АЧС;

б) определить нуклеотидные последовательности генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L вируса АЧС изолятов, выделенных на территории РФ в 2007-2013 гг., и провести сравнительный анализ их структуры;

в) сконструировать библиотеку генов вируса АЧС изолята Krasnodar

06/12;

г) Изучить культурально-биологические свойства вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12;

д) провести адаптацию изолята Krasnodar 06/12 к перевиваемым культурам клеток и изучить культурально-биологические свойства адаптированных вариантов.

1.4 Научная новизна результатов исследований

Впервые в РФ создана клонотека генов CP204L, KP177R, Об 1R, EP402R, B646L, E183L и фрагментов генов CP530R, CP2475L вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, клонированных в составе векторной молекулы pJET 1.2/blunt.

Впервые опубликованы в базе данных GenBank нуклеотидные последовательности генов B646L (KJ195685), CP204L (KJ195684), KP177R (KJ380912), 061R с прилегающим к нему интергенным регионом (KJ380913), EP402R (KJ195682), E183L (KJ380910) и фрагментов генов ' CP530R (KJ380911), CP2475L (KJ195683) вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, а также нуклеотидные последовательности гена 061R с прилегающим к нему интергенным регионом изолятов Volgograd 2010 (JQ771680.1), Stavropol 2008 (JQ771679.1), Orenburg 2009 (JQ771678.1), Elbrus 2008 (JQ771677.1), Armenia 2007 (JQ771676.1) и гена K177R изолятов Stavropol 2008 (JQ771692.1), Rostov 2009 (JQ771691.1), Orenburg 2009 (JQ771690.1), Krasnodar 2008 (JQ771689.1), Elbrus 2008 (JQ771688.1), Armenia 2007 (JQ771687.1).

Получен аттенуированный вариант вирулентного изолята Krasnodar 06/12 вируса АЧС - штамм Krasnodar 2/13, с измененными биологическими свойствами (характер гемадсорбции, патогенность для свиней), прошедший 51 последовательный пассаж на перевиваемых культурах клеток.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Анализ структуры генов вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, подобранных для создания клонотеки генов, позволил установить 100%-ю гомологию нуклеотидных последовательностей полноразмерных генов 061R, KP177R, CP204L, E183L и B646L, а также фрагментов генов CP530R, CP2475L и ~9 8,2%-ю гомологию нуклеотидных последовательностей гена EP402R изолятов Krasnodar 06/12 и Грузия 2007/1.

Плазмидные конструкции, входящие в состав клонотеки генов вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, были использованы для определения

структуры отдельных генов и являются основой для создания альтернативных источников генетического материала, положительного контроля в ПЦР-диагностике, а также получения рекомбинантных вирусов и ДНК-вакцин.

Получен клон pET32b(+)/ASFVp22 в клетках Е. coli штамма BL21(DE3) pLysS, который является альтернативным продуцентом антигена вируса АЧС.

Полученный аттенуированный вариант вируса АЧС штамм Krasnodar 2/13, адаптированный к репродукции в перививаемых культурах клеток, используется в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для получения специфического антигена и постановки непрямой реакции ТФ ИФА и РНИФ с целью выявления антител к вирусу АЧС.

Разработаны «Методические указания по выявлению вируса африканской чумы свиней в пробах крови и патологических материалов, отобранных от павших или вынужденно убитых свиней, в реакции прямой иммунофлюоресценции (РПИФ)» и «Методические указания по изоляции вируса африканской чумы свиней в культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней», «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток лейкоцитов свиней» «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток костного мозга свиней», утвержденные в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 18 ноября 2013 г., 20 декабря 2013 г. 24 июня 2014 г. и 24 июня 2014 г. соответственно (приложения А, Б, В, Г).

1.6 Методология и методы исследования

Методология проведенных исследований включает стандартные процедуры с использованием различных материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование, анализ нуклеотидных последовательностей, создание рекомбинантных конструкций), вирусологические (вирусовыделение, культивирование вируса, постановка биопроб) и серологические (ТФ ИФА, РПИФ, РНИФ) методы исследований.

1.7 Положения, выносимые на защиту

а) нуклеотидные последовательности генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L вируса АЧС и их сравнительный анализ;

б) филогенетический анализ генов, кодирующих CD2v и vpl2 с интергенным регионом, позволяет распределить российские изоляты на субгруппы, соответствующие их ближайшему родству;

в) клонотека рекомбинантных клонов Е. coli, несущих гены B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L вируса АЧС;

г) адаптированный вариант вируса штамма Krasnodar 2/13 для получения специфического культурального антигена вируса АЧС.

1.8 Личный вклад соискателя

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ГНУ ВНИИВВиМ н.с. А.С. Казаковой, вед.н.с. О.В. Капустиной и ФГБУ «ВНИИЗЖ»: к.в.н. А.С. Першину, к.б.н. Н.Г. Зинякову, вед. биологу И.В. Шевченко за помощь в проведении отдельных этапов работы; д.б.н. Н.С. Мудрак, д.б.н., проф. С.С. Рыбакову, д.б.н., проф. К.Н. Груздеву за консультативную помощь; д.б.н.,

проф. [Дрыгину В.В.| за содействие в выполнении работы. Автор выражает признательность зав. реф. лаб. по АЧС, к.в.н. A.C. Иголкину.

1.9 Степень достоверности и апробация результатов работы Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2010-2012 гг.) и на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2013-1014 гг.), на международной научно-практической конференции (УГСХА, Ульяновск, 2011 г.), на научно-практической конферецнии (Новый Свет, Украина, 2012 г.), на конференции молодых ученых (ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир, 2012 г.), на 7-м международном конгрессе по вакцинам (г. Ситжес, Испания, 2013 г.), на семинаре Северных и Балтийских стран (г. Гданьск, Польша, 2013 г.),

на региональной молодёжной научной конференции (Владимирский филиал ФГОБУ ВПО Финансового университета при Правительстве РФ, г. Владимир, 2014 г.).

Достоверность результатов исследований подтверждена комиссионными испытаниями.

1.10 Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано девять научных работ, в том числе три статьи в зарубежных журналах и три статьи в изданиях по Перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

1.11 Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения; иллюстрирована 12 таблицами и 20 рисунками. Список использованной литературы включает 134 источника, из них 96 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Африканская чума свиней, эпизоотологическая ситуация

С 2007 года на территории Российской Федерации (РФ) регистрируют вспышки африканской чумы свиней (АЧС) и на протяжении семи лет страна является зоной стационарного неблагополучия по данному заболеванию. Число неблагополучных пунктов по АЧС среди домашних свиней и диких кабанов продолжет расти [30].

С 2007 года ареал распространения данной инфекции постоянно увеличивается, захватывая новые, ранее благополучные по АЧС, территории. По официальным данным информационно-аналитического центра (ИАЦ) Ветнадзора Россельхознадзора на 27.12.13 г., за 2013 год зарегистрировано 187 вспышек АЧС, из них среди домашних свиней - 78 вспышек, среди диких кабанов - 103 вспышки и шесть инфицированных объектов. Для сравнения, за 2012 год на территории РФ было зарегистрировано 121 вспышка АЧС, из них среди домашних свиней - 61 вспышка, среди диких кабанов - 45 вспышек и 15 инфицированных объектов. На май 2014 года остаются активными 83 очага вспышек АЧС, из них среди диких кабанов -82, среди домашних свиней - один.

На настоящий момент на территории Российской Федерации определены границы двух эндемичных по АЧС зон: «Северная» и «Южная» [38].

В «северную» эндемичную зону вошли Тверская, Новгородская, Смоленская, Ярославская, Московская, Тульская, Владимирская, Псковская, Ивановская, Калужская и Брянская области. На данной территории с апреля 2011 года по февраль 2014 года зарегистрировано всего 219 случаев, из них 58 - в популяции домашних свиней, 155 - в популяции диких свиней и шесть - инфицированных объектов.

В «Южную» эндемичную зону входят: Республики Чечня, Ингушетия, Дагестан, Карачаево-Черкесия, Сев. Осетия-Алания, Кабардино-Балкария,

Адыгея, Калмыкия; Ставропольский, Краснодарский края; Астраханская, Волгоградская, Ростовская, Саратовская, Тамбовская, Воронежская, Белгородская, Курская области. С ноября 2007 года по февраль 2014 года в этой зоне зафиксировано всего 389 случаев АЧС, из них 265 в популяции домашних свиней, 105 в популяции диких свиней и 19 инфицированных объектов.

Так же с июля 2008 года по февраль 2014 года регистрировали «выносимые» из эндемичных зон случаи АЧС. С июля 2008 по февраль 2014 годов зарегистрировано 11 случаев в популяции домашних свиней и пять инфицированных объектов.

По данным МЭБ, в 2012 году вспышка АЧС была зафиксирована в Украине, в 2013 году в Белоруссии, а в 2014 году в Литве (Рисунок 1). Так же первый случай африканской чумы свиней был установлен в Польше около деревни Шудзялово, расположенной в 900 м от польско-белорусской границы, где был обнаружен труп кабана, павшего от АЧС.

Эпизоотическая ситуация по АЧС на территории Российской Федерации, Беларуси, Украины и Литвы.

Данные МЭБ с 2007 по 2014 гг.

^^г*»-' Норвегия

*"•-—"-л

^ ,. I7*

- У

Вспышки АЧС:

* среди домашних

• среди диких кабанов

Рисунок I - Политическая карта Европейской части РФ, и стран, на территории которых регистрировали вспышки

АЧС

На территорию РФ был занесен возбудитель АЧС, имеющий определенные характеристики и культурально-биологические свойства, отнесенный при генотипировании ко II генотипу, а определение серотипа в реакции задержки гемадсорбции выявило его принадлежность к восьмому сероиммунотипу [5].

По данным Белянина С.А. с соавторами, изученные в ВНИИВВиМ изоляты вируса АЧС вызывали у свиней острую форму болезни, которая сопровождалась геморрагическим синдромом с характерными мультисистемными поражениями органов, стабильно высоким уровнем виремии и 100%-ной летальностью [9].

Эти данные свидетельствуют о высокой вирулентности изолятов возбудителя АЧС, изученных Российских изолятов, и способности их вызывать острое течение болезни у домашних и диких свиней [9].

2.2 Разнообразие изолятов и штаммов вируса АЧС

Африканская чума свиней является уникальной природно-очаговой болезнью с интересной эволюционной историей и наличием эффективных механизмов поддержания гетерогенности состава природных популяций [28].

Высокая степень изменчивости возбудителя является причиной существования множества популяций вируса АЧС, обладающих выраженной гетерогенностью по составу генома, физико-химическим свойствам, патогенности, скорости репродукции и способности индуцировать гемадсорбцию. В зарубежных сообщениях имеются отдельные факты об антигенной и серотиповой гетерогенности вируса АЧС [79, 107, 116].

На африканском континенте популяция вируса АЧС и макроорганизм хозяина представляет собой совместно эволюционирующую биологическую систему. Бородавочники и кистеухие свиньи за долгое время выработали механизмы, препятствующие возникновению острой формы АЧС. Их совместная эволюция привела к появлению апатогенных для африканских свиней вирусных вариантов. Появление новой чувствительной системы

(домашних свиней европейских пород) в Африке в начале XX века вызвало преобладание высоковирулентных изолятов АЧС [2].

Высокоэффективный адаптационный механизм вируса АЧС наиболее четко проявляется в гетерогенности состава вирусных популяций АЧС, способствующей выживаемости и приспособляемости к меняющимся условиям внешней среды. Полиморфизм - это фактор эволюции и сохранения видов во внешней среде [3].

Вирус АЧС - единственный ДНК-содержащий арбовирус. Поскольку ферменты вируса АЧС активны только под контролем собственных промоторов вируса, генетическая гетерогенность природных популяций является его облигатным свойством, так как вирус должен обладать способностью к репродукции и в организме чувствительных животных, и в организме переносчика - клещах рода Отикос1ого8. Известно, что у клещей данного рода вирус АЧС способен репродуцироваться в клетках толстого кишечника. За 50-летнюю историю интенсивного изучения вируса АЧС получено множество данных о существовании изолятов вируса АЧС, которые способны передаваться с помощью клещевого вектора и о изолятах, которые передаются только контактным путём [39, 86, 87, 93].

Высокая изменчивость вируса АЧС является его вторым неотъемлемым и необходимым свойством. Если первые вспышки АЧС в Испании, Португалии, Сардинии и Бразилии сопровождались практически 100%-ной гибелью заболевших животных, то в дальнейшем наблюдалось снижение вирулентности возбудителя и формы течения болезни изменялось от острой к хронической, а далее и к инаппарантной.

Исследования, проведенные в Португалии, показали, что именно с клещами связана длительная персистенция вируса в популяции домашних свиней. В провинции Алентехо, где в 1999 году произошла вспышка, из клещей ОтикойогоБ еггаИст было выделено шесть гемадсорбирующих и четыре негемадсорбирующих изолята вируса АЧС. Гемадсорбирующие изоляты вызывали острую форму АЧС, а свиньи, инфицированные

негемадсорбирующими изолятами, оказались полностью устойчивыми при контрольном заражении патогенным португальским изолятом [66].

Работами А. Ьекао с соавторами (2001 г.) при исследовании способности изолятов вируса АЧС индуцировать гемадсорбцию установлено, что вирусная популяция в крови свиней представлена в основном высокопатогенными вариантами, обладающими гемадсорбирующими свойствами, в то время как из материала 10% суспензии гомогената клещей удавалось выделить низковирулентные варианты, лишенные гемадсорбирующих свойств [129].

В доступной литературе приводятся данные, что в Испании эндемия латентно протекающей АЧС сформировалась, главным образом, за счет повсеместного применения в 1962 году в качестве «живой вакцины» аттенуированных вариантов вируса АЧС, у которых в результате многократных субпассажей на чувствительных животных произошла реверсия вирулентных свойств с возвратом к острому течению болезни [29].

Наличие в природных популяциях высокопатогенных и низкопатогенных вирусных вариантов снижают вирулентность популяции в целом. Снижение вирулентных свойств, при длительной персистенции вируса в дикой природе и высокой плотности популяции больных особей, является следствием саморегуляции паразитарной системы, к тому же возникновение низко чувствительных к вирусам особей животных обуславливает персистенцию в условиях, когда они являются единственным естественными природными резервуарами для вируса [3].

Следовательно, в природных популяциях вируса АЧС действуют общебиологические законы поддержания их существования и регуляции состава.

2.3 Современная классификация изолятов и штаммов вируса АЧС

На настоящий момент выделено и описано более 500 природных изолятов и несколько десятков искусственно модифицированных (аттенуированных) штаммов и вариантов вируса АЧС из различных

географических зон, часть из которых была изучена, типирована и паспортизирована. Самая большая коллекция природных изолятов находится в ГНУ ВНИИВВиМ, вторая по величине - принадлежит лаборатории Восточно-Африканской ветеринарной исследовательской организации в Мугуге, Кения и коллекция из более 80 изолятов хранится в Научно-ветеринарной лаборатории в Народной Республике Конго [35].

Исследования природных изолятов вируса АЧС проводятся в Пирбрайтской лаборатории Исследовательского института вирусов животных в Англии, в Исследовательском Центре болезней животных на острове Плам в США, в Национальном институте сельскохозяйственных исследований в Испании, в Центральной лаборатории ветеринарных исследований во Франции, в Институте ветеринарных исследований в Южной Африке, в Национальном институте ветеринарии в Португалии, а также в РФ - в ФГБУ «ВНИИЗЖ» и ГНУ ВНИИВВиМ.

Многолетние исследования показали, что природные изоляты и экспериментально полученные варианты вируса АЧС различаются по культуральным и биологическим свойствам, таким как вирулентность, скорость репродукции, способность к гемадсорбции, антигенные свойства и др. Так, например, во ВНИИВВиМ из гетерогенных по составу изолятов были выделены различающиеся по биологическим свойствам антигенные варианты вируса АЧС [24].

На основе многолетних исследований созданы классификации изолятов и штаммов вируса АЧС по патогенности (высоковирулентные, слабовирулентные и авирулентные с летальностью 90-100%, 50-80% и 0%, соответственно), по характеру цитопатического действия в первичных культурах клеток (JIC и ККМС), с проявлением способности к гемадсорбции или ее отсутствием (гемадсорбирующие или негемадсорбирующие изоляты) [35].

В 1960 году W. Malmquist и D. Hay показали, что заражение вирусом АЧС культуры клеток лейкоцитов свиньи или культуры клеток костного

мозга свиней вызывает адсорбцию эритроцитов на поверхности зараженных клеток, подобно феномену гемадсорбции, описанному J. Vogel и А. Shelokov (1957 г.) с вирусом гриппа. В 1963 году W. Malmquist с соавторами в своей работе показали, что некоторые вирусспецифические сыворотки обладают способностью задерживать появление гемадсорбции при репродукции определенных изолятов и штаммов вируса АЧС, эта реакция получила название реакция задержки или торможения гемадсорбции (РЗГАд или РТГАд). На основании результатов перекрестных иммунологических тестов и РЗГАд с шестью восточно-африканскими изолятами экспериментально доказали существование различных антигенных типов вируса АЧС. На основании полученных результатов была создана первая серотиповая классификация штаммов и изолятов вируса АЧС [97].

Дальнейшие исследования позволили выявить с помощью РЗГАд и иммунопробы до семи антигенно различных групп вируса АЧС. Однако, расширение сероиммунотиповой классификации сдерживалось из-за необходимости получения типоспецифических сывороток и антигенов [73, 86, 107].

В работах Вишнякова И.Ф., Митина H.H., Балышева В.М., Черятникова JI.JI. и др. в ВНИИВВиМ была доказана серотиповая специфичность РЗГАд и серотипоспецифичный характер иммунного ответа. Кроме того, процесс получения вирусспецифических сывороток облегчил открытие вирулицидного действия фосфонуксусной кислоты на вирус АЧС [37]. Проведенные исследования позволили вышеуказанным авторам разработать сероиммунологическую классификацию природных изолятов и лабораторных вариантов вируса АЧС, в которой изученные изоляты вируса АЧС были разделены на пять серогрупп (серотипов). В основе классификации были результаты комплексной оценки изолятов (штаммов, вариантов) вируса АЧС по антигенным свойствам в РЗГАд с типоспецифическими сыворотками и в иммунобиологическом тесте на привитых животных с дальнейшим заражением их референс-штаммами и испытуемыми изолятами. Открытие

серотипоспецифичности иммунного ответа при АЧС позволило разработать основные подходы к созданию аттенуированных комплексных вакцин против данного заболевания [27, 35, 36].

В 1999 году Балышевым В.М. с соавторами данная классификация была усовершенствована и дополнена. На настоящий момент изоляты вируса АЧС с четко выраженными свойствами объединены в восемь самостоятельных сероиммунологических типов, в девятую группу включены изоляты, серотиповая принадлежность которых не коррелирует с результатами иммунологической пробы и десятая группа, в которую входят новые нетипированные изоляты вируса АЧС [11].

Также для классификации изолятов использовали антигенный анализ с помощью моноклональных антител. Letchworth и Whyard выявили различия между изолятами Уганда-61 и Лиссабон-60 в радиоиммунопреципитации по полипептидам с молекулярной массой 33, 36, 63, 88 кД. [35].

Одним из современных подходов к группированию вируса АЧС является изучение структуры и свойств отдельных генов, кодирующих иммунологически значимые белки. Определение сходства и различия в их структуре позволяет сгруппировать их и выявить взаимосвязь изменений фенотипических признаков с генотипом.

Так, в результате анализа, проведенного С. Gallardo с соавторами (2011 г.), изоляты, выделенные при вспышках в Уганде, по генам, кодирующим vp72 и vp54, были отнесены к генотипу IX, который включает в себя изоляты, вызывавшие вспышки АЧС в Кении в 2006 и 2007 годах и Уганде в 2003 году. Чтобы определить более точно происхождение вирусных изолятов, авторы провели типирование с помощью анализа тетрамерных аминокислотных повторов в центральном вариабельном регионе (ЦВР) гена B602L [84]. Нуклеотидные последовательности изолятов из Уганды и изолятов, выделенных при вспышках в Кении в 2007 году, были идентичны на 100%. Причем, их идентичность была выше, чем у вируса, полученного с

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Варенцова, Алиса Алексеевна, 2014 год

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бакулов, И. А. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней / И.А. Бакулов, В.В. Макаров // Вестн. с.-х. науки. - 1990. - № 3. - С. 46-55.

2. Бакулов, И.А. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней / И.А. Бакулов, В.В. Макаров // Вестн. с.-х. науки. - 1990. - № 12. - С. 122-128.

3. Беляков, В.Д. Проблема саморегуляции паразитарных систем и механизм развития эпидемического процесса / В.Д. Беляков // Вестн. АМН СССР. - 1983. - № 5. - С.3-8.

4. Белянин, A.C. Характеристика полевых высоковирулентных и низковирулентных изолятов вируса АЧС / A.C. Белянин // Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: материалы Междунар. науч.-практ. конф. - Ульяновск, 2011. - С. 56-60.

5. Биологические свойства вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации / В.М. Балышев, В.В. Куриннов, С.Ж. Цыбанов [и др.] // Ветеринария. - 2010. - № 7. - С. 25-28.

6. Биотехнология [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.biotechnolog.ru/ge/ge8_l.htm (проверено 22.04.2014).

7. Варенцова, A.A. Клонирование и сравнительный анализ последовательности гена 061R (р12) изолятов вируса африканской чумы свиней, циркулирующего на территории Российской Федерации [Электронный ресурс] / A.A. Варенцова, A.C. Казакова, H.H. Власова // Адаптационные стратегии живых систем: Междисциплинарная научная конференция: тез. докл. - Киев, 2012. - С. 19-20. - Режим доступа: http://www.as2012.science-

center.net/Files/BookAdaStrat2012%20ContrastColor.pdf. (проверено

17.12.2013).

8. Варенцова, A.A. Сравнительный анализ свойств изолятов вируса африканской чумы свиней / A.A. Варенцова, С.Г. Ремыга, B.JI. Гаврилова [и др.] // Ветеринария. - 2013. - № 12. - С. 27-32.

9. Вирулентность изолятов вируса АЧС / С.А. Белянин, А.П. Васильев, Д.В. Колбасов [и др.] // Ветеринария Кубани. - 2011. - № 5. - С. 9-11.

10. Гайдышев, И. Анализ и обработка данных: специальный справочник / И. Гайдышев. - СПб: Питер, 2001. - 750 с.

11. География АЧС и типовая гетерогенность возбудителя болезни / В.М. Балышев, A.B. Книзе, С.Ж. Цыбанов [и др.] // Проблемы инфекц. и инваз. болезней в животноводстве на соврем, этапе. - М., 1999. - С. 92-93.

12. Елсукова, A.A. Генотипирование изолятов вируса африканской чумы свиней: дис. ... канд. биол. наук: 03.01.02 / Елсукова Александра Андреевна. - Покров, 2010. - 129 с.

13. Использование перевиваемых линий клеток для размножения штамма «Катанга-350» вируса АЧС / В.И. Репин, Ю.И. Петров, A.B. Киселев [и др.] // Актуальные проблемы вет. вирусологии: материалы науч.-практ. конф. «Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики» / ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С. 139-140.

14. Казакова, A.C. Конструирование продуцентов рекомбинантных белков р72, рЗО и р54 вируса африканской чумы свиней: дис. ... канд. биол. наук: 03.02.02 / Казакова Анна Сергеевна. - Покров, 2013. - 125 с.

15. Казакова, A.C. Сравнительный анализ последовательности гена, кодирующего гликопротеин р54, вируса африканской чумы свиней / A.C. Казакова // Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: материалы Междунар. науч.-практ. конф. / УГСХА. -Ульяновск, 2011. - С. 100-103.

16. Козлова, Д.И. Современные проблемы африканской чумы свиней / Д.И. Козлова, В.А. Бесхлебнов. - М.: ВНИИТЭИСХ, 1980. - 60 с.

17. Культивирование вируса африканской чумы свиней в перевиваемой культуре клеток А4С2 / Е.Ю. Прудникова, В.М. Балышев, Т.В. Гольберг, В.И.

Балышева // Актуальные проблемы инфекц. патологии в вет. медицине: материалы П-й конф. молодых ученых / ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2012. - С. 143-149.

18. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высшая школа, 1990. -

351 с.

19. Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре костного мозга свиней / А. А. Варенцова, И. Ю. Жуков, В. Л. Гаврилова [и др.]; ФГБУ "ВНИИЗЖ". -Владимир, 2014. - 21 с.

20. Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток лейкоцитов свиней / A.A. Варенцова, И.Ю. Жуков, В.Л. Гаврилова [и др.]; ФГБУ "ВНИИЗЖ". -Владимир, 2014.-21 с.

21. Методические указания по выявлению вируса африканской чумы свиней в пробах крови и патологических материалов, отобранных от павших или вынужденно убитых свиней, в реакции прямой иммунофлюоресценции (РПИФ) / В.Л. Гаврилова, A.A. Варенцова, И.Ю. Жуков [и др.]; ФГБУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2013. - 18 с.

22. Методические указания по изоляции вируса африканской чумы свиней в культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней / A.A. Варенцова, И.Ю. Жуков, С.Г. Ремыга [и др.]; ФГБУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2013. - 14 с.

23. Моноспецифическая сыворотка к рекомбинантному белку рЗО для изучения африканской чумы свиней (АЧС) [Электронный ресурс] / A.C. Казакова, A.A. Варенцова, A.C. Першин, С.А. Белянин, Т.Э. Южук, В.М. Лыска, С.П. Живодеров, H.H. Власова // Научный журнал КубГАУ. - 2011. -№71(07). - С. 1-15. - Режим доступа: http://ei.kubagro.ru/201 l/07/pdf/45.pdf (проверено 25.07.2013).

24. Моргунов, Ю.П. Изучение иммунобиологических свойств вируса африканской чумы свиней 5-го типа: выделение, типизация и определение

референс-штамма / Ю.П. Моргунов, Ю.И. Петров // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2010. - № 4. - С. 104-112.

25. Першин, A.C. Совершенствование способа получения моноклональных антител к структурному белку рЗО вируса африканской чумы свиней с использованием рекомбинантных конструкций: дис. ... канд. вет. наук: 06.02.02 / Першин Андрей Сергеевич. - Покров, 2013. - 119 с.

26. Популяционная структура вируса африканской чумы свиней по признаку количественной гемадсорбции // В.В. Макаров, И.Ф. Вишняков, H.A. Власов, A.M. Серова // Вопр. вирусологии. - 1991. - № 4. - С. 321-324.

27. Принципы классификации изолятов вируса африканской чумы свиней / И.Ф. Вишняков, A.B. Киселёв, Ю.И. Петров [и др.] // Актуальные проблемы вирусологии: тез. докл. науч. конф. / Ин-т микробиологии и вирусологии Нац. академии наук. - п. Гвардейский, 1994. - С. 25-26.

28. Природная очаговость африканской чумы свиней / В.В. Макаров, Ф.И. Василевич, Б.В. Боев, О.И. Сухарев. - М.: ЗооВетКнига, 2014 - 66 с.

29. Проблемы разработки вакцины при африканской чуме свиней / И.Ф. Вишняков, Ю.И. Петров, A.B. Киселев, JI.JI. Черятников // Актуальные вопр. ветеринарной вирусологии: материалы науч.-практ. конф. «Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики» / ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С. 144-146.

30. Прогноз по африканской чуме свиней в Российской Федерации на 2014 г. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/as£fpublications/predict2014.pdf (проверено 01.03.2014).

31. Прудникова, Е.Ю. Адаптация вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации, к перевиваемым культурам клеток и изучение его биологических свойств: автореф. дис. ... канд. ветеринарных наук: 06.02.02 / Прудникова Елена Юрьевна. - Покров, 2013. - 27 с.

32. Селянинов, О.В. Сравнительный анализ геномов двух штаммов вируса АЧС с различными иммунобиологическими свойствами / О.В. Селянинов, B.C. Перзашкевич, В.М. Балышев // Диагностика, профилактика

и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: материалы Междунар. науч.-практ. конф. / ВНИИВВиМ. - Покров, 1998. - С. 60-61.

33. Селянинов, Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов / Ю.О. Селянинов, В.М. Балышев, С.Ж. Цыбанов // Вестн. РАСХН. - 2000. - № 5. - С. 75-76.

34. Середа, А.Д. Антигенное разнообразие вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, В.И. Балышев // Вопр. вирусологии. - 2011. - № 4. - С. 38-42.

35. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней / И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров [и др.] // Актуальные вопр. ветеринарной вирусологии: материалы науч.-практ. конф. «Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики» / ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С. 141-143.

36. Схема классификации вируса АЧС / Н.И. Митин, В.М. Балышев, И.В. Федорищев [и др.] // Материалы науч. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1986.-Т. 1.-С. 69-73.

37. Экспресс-метод получения типоспецифических референс-сывороток при АЧС / В.М. Балышев, H.A. Лагуткин, М.В. Салина [и др.] // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: материалы Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 1998. - С. 64-65.

38. Эпизоотическая ситуация по АЧС в эндемичных зонах на территории Российской Федерации [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/asf/2014/03-14/07.pdf (проверено 01.03.2014).

39. A conserved African swine fever virus right variable region gene, II IL, is non-essential for growth in vitro and virulence in domestic swine / S.B. Kleiboeker, G.F. Kutish, J.G. Neilan [et al.] // J. Gen. Virol. - 1998. - Vol. 79, № 5. — P. 1189-1195.

40. African swine fever eradication: the Spanish model / M. Arias, J.M. Sanchez-Vizcaino, A. Morilla [et al.] // Trends in Emerging Viral Infections of Swine. / ed. A. Morilla, K. Jin, J. Zimmerman. -1st ed. - Ames, Iowa, USA, 2002. -P. 133-139.

41. African swine fever virus IAP-like protein induces the activation of nuclear factor kappa B / C.I. Rodriguez, M.L. Nogal, A.L. Carrascosa [et al.] // J. Virol. - 2002. - Vol. 76, № 8. - P. 3936-3942.

42. African swine fever virus isolate, Georgia, 2007 / R.J. Rowlands, V. Michaud, L. Heath [et al.] // Emerging Infectious Diseases. - 2008. - Vol. 14, № 12.-P. 1870-1874.

43. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes affect host interferon response // C.L. Afonso, M.E. Piccone, K.M. Zaffuto [et al.] // J. Virol. - 2004. -Vol. 78, № 4. - P. 1858-1864.

44. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes are novel macrophage host range determinants / L. Zsak, Z. Lu, T. G. Burrage [et al.] // J. Virology. -2001. - Vol. 75, № 7. - P. 3066-3076.

45. African swine fever virus multigene family 360 genes affect virus replication and generalization of infection in Ornithodoros porcinus ticks / T.G. Burrage, Z. Lu, J.G. Neilan [et al.] // J. Virol. - 2004. - Vol. 78, № 5. - P. 24452453.

46. African swine fever virus protein p54 interacts with the microtubular motor complex through direct binding to light-chain dynein / C. Alonso, J. Miskin, B. Hernaez [et al.] // J. Virol. - 2001. - Vol. 75, № 20. - P. 9819-9827.

47. African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems / L.K. Dixon, C.C. Abrams, G. Bowick [et al.] // Vet. Immunol. Immunopathol. - 2004. - Vol. 100. - P. 117-134.

48. African swine fever virus replication and genomics / L.K. Dixon, D.A.G. Chapman, C.L. Netherton, C. Upton // Virus Res. - 2013. - Vol. 173, № 1. - P. 314.

49. African swine fever virus structural protein p72 contains a conformational neutralizing epitope / M.V. Borca, P. Irusta, C. Carrillo [et al.] // Virology. - 1994. - Vol. 201, № 2. - P. 413-418.

50. African swine fever virus structural protein p54 is essential for the recruitment of envelope precursors to assembly sites / J.M. Rodriguez, R. Garcia-Escudero, M.L. Salas, G. Andres // J. Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 4299-4313.

51. African swine fever viruses with two different genotypes, both of which occur in domestic pigs, are associated with ticks and adult warthogs, respectively, at a single geographical site / C. Gallardo, E. Okoth, V. Pelayo [et al] // J. Gen. Virol. - 2011. - Vol. 92. - P. 432-444.

52. Alu-VCK approach to isolating Notl-Linking clones from the 3pl4-p21 region frequently deleted in renal cell carcinoma / E.R. Zabarovsky, V.I. Kashuba, E.S. Pokrovskaya [et al.] // Genomics. - 1993. - Vol. 16, № 3. - P. 713-719.

53. Amino acid sequence and structural properties of protein pi2, an African swine fever virus attachment protein / A. Alcami, A. Angulo, G. Lopez-Otin [et al.] // J. Virol. - 1992. - Vol. 66. - P. 3860-3868.

54. An African swine fever virus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption / M.V. Borca, G.K. Kutish, C.L. Afonso [et al.] // Virology. - 1994b. - Vol. 199. - P. 463-468.

55. An African swine fever virus gene with similarity to the proto-oncogene bcl-2 and the Epstein-Barr virus gene BHRF1 / J.G. Neilan, Z. Lu, C.L. Afonso [et al.] // J. Virol. - 1993. - Vol. 67. - P. 4391-4394.

56. Analysis of genome organization and rearrangements by pulsed field gradient gel electrophoresis / C.L. Smith, P.W. Warburton, A. Gaal, C.R. Cantor // Genetic Engeneering / ed. J.K. Setlow, A. Hollanender. - 1986. - Vol. 8. - P. 4570.

57. Andres, G. Characterization of two African swine fever virus 220-kDa proteins: a precursor of the major structural protein pi50 and an oligomer of phosphoprotein p32 / G. Andres, C. Simon-Mateo, E. Vinuela // Virology. - 1993. -Vol. 194.-P. 284-293.

58. Angulo, A. Comparison of the sequence of the gene encoding African swine fever virus attachment protein pl2 from field virus isolates and viruses passaged in cell culture / A. Angulo, E. Vinuela, A. Alcami // J. Virol. - 1992. -Vol. 66. - P. 3869-3872.

59. Antigenic and immunogenic properties of a chimera of two immunodominant African swine fever virus proteins / M.G. Barderas, F. Rodriguez, P. Gomez-Puertas [et al.] // Arch. Virol. - 2001. - Vol. 146, № 9. - P. 1681-1691.

60. BioEdit sequence alignment editor [version 6.0.7] [Электронный ресурс] / Т. Hall // Ibis Therapeutics. - Carlsbad, CA, USA, 2004. - Режим доступа: http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html (проверено 25.11.2013).

61. Camacho, A. Protein p22 of African swine fever virus: an early structural protein that is incorporated into the membrane of infected cells / A. Camacho, E. Vinuela // Virology. - 1991. - Vol. 181. - P. 251-257.

62. Carvalho, Z.G. African swine fever virus gene expression in infected Vero cells / Z.G. Carvalho, C. Rodrigues-Pousada // J. Gen. Virol. - 1986. - Vol. 67.-P. 1343-1350.

63. Characterization and molecular basis of heterogeneity of the African swine fever virus envelope protein p54 / F. Rodriguez, C. Alcaraz, A. Eiras [et al.] // J. Virol. - 1994. - Vol. 68. - P. 7244-7252.

64. Characterization of African swine fever virus caucasus isolate in European wild boars / C. Gabriel, S. Blome, A. Malogolovkin [et al.] // Emerging Infectious Diseases. - 2011. - Vol. 17, № 12. - P. 2342-2345.

65. Characterisation of p30 a highly antigenic membrane and secreted protein of African swine fever virus / C.L. Afonso, C. Alcaraz, A. Brun [et al.] // Virology. - 1992. - Vol. 189, № 1. - P.368-373.

66. Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal / F.S. Boinas, G.H. Hutchings, L.K. Dixon, P.J. Wilkinson / J. Gen. Virol. - 2004. - Vol. 85.-P. 2177-2187.

67. Cliquet, F. Elimination of terrestrial rabies in Western European countries / F. Cliquet, M. Aubert // Developments in Biologicals. - 2004. - Vol. 119.-P. 185-204.

68. Collins, F.S. Directional cloning of DNA fragments at a large distance from an initial probe: a circularization method /F.S. Collins, S.M. Weissman // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1984. - Vol. 81. - P. 6812-6816.

69. Comparative sequence analysis of genes encoding outer proteins of African swine fever virus isolates from different regions of Russian Federation and Armenia / N.N. Vlasova, A.S. Kazakova, A.A. Varentsova [et al.] // Intern. J. Virol, and Molecular Biology. - 2012. - Vol. 1, № 1. - P. 1-11.

70. Comparison of the genome sequences of nonpathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates / D.A.G. Chapman, V. Tcherepanov, C. Upton, L.K. Dixon // J. Gen. Virol. - 2008. - Vol. 89. - P. 397-408.

71. Construction and use of human chromosome jumping libraries from Notl-digested DNA 353 / A. Poustka, T.M. Pohl, D.P. Barlow [et al.] // Nature (London). - 1987. - Vol. 325. - P. 353-355.

72. Construction of a general human chromosome jumping library, with Application to Cystic Fibrosis / F.S. Collins, M.L. Drumm, J.L. Cole [et al.] // Science. - 1987. -Vol. 235, - P. 1046-1049.

73. De Tray, D.E. African swine fever - interim report / D.E. De Tray // Bull. Epiz. Dis. Afr. - 1960. - Vol. 8. - P. 217-223.

74. Deletion of virulence associated genes from attenuated African swine fever virus isolate OURT88/3 decreases its ability to protect against challenge with virulentvirus / C.C. Abrams, L. Goatley, E. Fishbourne [et al.] // Virology. - 2013. -Vol. 443.-P. 99-105.

75. Dixon, L.K. Current approaches for African swine fever virus vaccine development [Электронный ресурс] / L.K. Dixon // African Swine Fever Diagnostics, Surveillance, Epidemiology and Control: Workshop, Nairobi, Kenya, 20-21 July 2011. - Режим доступа: http://www.slideshare.net/ILRI/current-

approaches-for-african-swine-fever-virus-vaccine-development (проверено

22.03.2014).

76. Dixon, L.K. The structure and function of the African swine fever genome / L.K. Dixon // Rev. Sci. Techn. Off. Int. Epiz. - 1986. - Vol. 5, № 2. - P. 469-475.

77. DNA vaccination partially protects against African swine fever virus lethal challenge in the absence of antibodies [Электронный ресурс] / J.M. Argilaguet, E. Pérez-Martín, M. Nofrarias [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7, № 9. - P. e40942. - Режим доступа: www.plosone.org (проверено 29.09.13).

78. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes / C. Gallardo, D.M. Mwaengo, J.M. Macharía [et al.] // Virus Genes. - 2009. - Vol. 38, № 1. - P. 85-95.

79. Epitopic diversity of African swine fever virus / I.C. Pan, T.C. Whyard, W.R. Hess [et al.] // J. Virus Res. - 1988. - Vol. 9. - P. 93-106.

80. European Union reference laboratory for African swine fever (ASF) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://asf-referencelab.info/asf (проверено 03.06.2014).

81. Family Asfarviridae. / L.K. Dixon, J.V. Costa, J.M. Escribano [et al.] // Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses: Seventh Rep. Intern. Comm. on Taxonomy of Viruses. - San Diego, 2000. - P. 159-165.

82. General morphology and capsid fine structure of african swine fever virus particles / J.L. Carrascosa, J.M. Carazo, A.L. Carrascosa [et al.] // Virology. -1984.-Vol. 132.-P. 160-172.

83. Genomic analysis in the Georgia 2007/1 isolate of African swine fever virus / D.A.G. Chapman, A.C. Darby, M. Da Silva [et al.] // Emerging Infectious Diseases.-2011.-Vol. 17.-P. 599-605.

84. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterization / A.D. Bastos, M.L. Penrith, C. Cruciere [et al.] // Arch. Virol. -2003. - Vol. 148, № 4. - P. 693-706.

85. Genotyping of African swine fever virus (ASFV) isolates associated with disease outbreaks in Uganda in 2007 / C. Gallardo, A.R. Ademun, R. Nieto [et al.] // African J. Biotechnology. - 2011. - Vol. 10, № 17. - P. 3488-3497.

86. Greig, A. Studies on African swine fever / A. Greig // Thesis for the Diploma of Fellowship of the Royal College of Veterinary Surgeous. - 1980.

87. Greig, A. The localization of African swine fever virus in the tick Ornithodoros moubata porcinus / A. Greig // Arch. Gesamte Virusforsch. - 1972. -Bd. 39. - S. 240-247.

88. Hamdy, F.M. Enzime-linked immunosorbent assay for the diagnosis of African swine fever / F.M. Hamdy, A.H. Dardiri // Vet. Rec. - 1979. - Vol. 105. -P. 445-446.

89. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of african swine fever virus in clinical samples / M. Aguero, J. Fernandez, L. Romero [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41, № 9. - P. 4431-4434.

90. Identification of an african swine fever virus gene with similarity to a myeloid differentiation primary response gene and a neurovirulence-associated gene of herpes simplex virus / M.D. Sussman, Z. Lu, G. Kutish [et al.] // J. Virol. -1992. - Vol. 66. - P. 5586-5589.

91. Inducible gene expression from African swine fever virus recombinants: analysis of the major capsid protein p72 / R.G. Escudero, G. Andres, F. Almazan, E. Vinuela // J. Virol. - 1998. - Vol. 72, №4. - P. 3185-3195.

92. Intracellular virus DNA distribution and the acquisition of the nucleoprotein core during African swine fever virus particle assembly: ultrastructural in situ hybridisation and DNase-gold labeling / S.M. Brookes, A.D. Hyatt, T. Wise, R.M. Parkhouse // Virology. - 1998a. - Vol. 249. - P. 175-188.

93. Kleiboeker, S.B. Pathogenesis of african swine fever virus in Ornithodoros ticks / S.B. Kleiboeker, G.A. Scoles // Anim. Health Res. Rev. -2001.-Vol. 2.-P. 121-128.

94. Lamarche, B.J. Error-Prone DNA Repair in the African Swine Fever Virus Characterization of Six Abasic Site Processing Activi and Evidence for A Mutagenic Function: Dis. - Ohio, 2005.

95. Large scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine / B. Brochier, M.P. Kieny, F. Costy [et al.] //Nature. - 1991. - Vol. 354. -P. 520-522.

96. Localization of the African swine fever virus attachment protein pl2 in the virus particle by immunoelectron microscopy / A.L. Carrascosa, I. Sastre, P. Gonzalez [et al.] // Virology. - 1993. - Vol. 193. - P. 460-465.

97. Malmquist, W.A. Haemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures / W.A. Malmquist, D. Hay // Amer. J. Vet. Res. - 1960. - Vol. 21. - P. 104-108.

98. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods / K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson [et al.] // Molecular Biology and Evolution. - 2011. -Vol. 28.-P. 2731-2739.

99. Menon, R. Shared molecular and functional frameworks among five complex human disorders: a comparative study on interactomes linked to susceptibility genes [Электронный ресурс] / R. Menon, C. Farina // PLoS One. -

2011. - Vol. 6, № 4. - P. el8660. - Режим доступа: www.plosone.org (проверено 29.10.2013).

100. Molecular characterization of African swine fever virus isolates originating from outbreaks in the Russian Federation between 2007 and 2011 / A. Malogolovkin, A. Yelsukova, C. Gallardo [et al.] // Veterinary Microbiology. -

2012.-Vol. 158.-P. 415-419.

101. Molecular epidemiology of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome regions / R.J. Nix, C. Gallardo, G. Hutchings [et al.] // Arch. Virol. - 2006. - Vol. 151. - P. 2475-2494.

102. Moura-Nunes, J.F. Ultrastructural study of African swine fever virus replication in cultures of swine bone marrow cells / J.F. Moura-Nunes, J.D. Vigario, A.M. Terrinha // Arch. Virol. - 1975. - Vol. 49. - P. 59-66.

103. Neutralizing antibodies to different proteins of African swine fever vims inhibit both virus attachment and internalization / P. Gomez-Puertas, F. Rodriguez, J.M. Oviedo [et al.] // J. Virol. - 1996. - Vol. 70. - P. 5689-5694.

104. Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteins p30, p54, and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection / J.G. Neilan, L. Zsak, Z. Lu [et al.] // Virology. - 2004. - Vol. 319. - P. 337-342.

th

105. Novagen pET System Manual [Электронный ресурс]. - 11 Ed. -Режим доступа: http://www.emdmillipore.com/chemdat/en CA/Merck-US-Site/USD/ViewProductDocuments-File?ProductSKU=EMD BIO-71867&DocumentType=USP&DocumentId=::/emd/biosciences/userprotocols/en-US/TB055.pdf&DocumentSource-GDS (проверено 12.10.2013).

106. Nucleotide sequence of bacteriophage phi XI74 DNA. / F. Sanger, G.M. Air, B.G. Barrell [et al.] // Nature. - 1977. - Vol. 265, № 5596. - P. 687-695.

107. Plowright, W. African swine fever: a retrospective view // Rev. Sci. Techn. Off. Int. Epiz. - 1986. - Vol. 5. - № 2. - P. 455-468.

108. Polhemus, N.W. Statistical Analysis Using STATGRAPHICS Plus. Volume 2: Quality Control and Experimental Design/ N.W. Polhemus// Englewood Cliffs. -NJ.: Statistical Graphics Corporation. - 1999.

109. Powell, P.P. An I kappa В homolog encoded by African swine fever virus provides a novel mechanism for downregulation of proinflammatory cytokine responses in host macrophages / P.P. Powell, L.K. Dixon, R.M. Parkhouse // J. Virol. - 1996. - Vol. 70, № 12. - P. 8527-8533.

110. Prados, F.J. Sequence and characterization of the major early phosphoprotein p32 of african swine fever virus / F.J. Prados, E. Vinuela, A. Alcami // J. Virol. - 1993. - Vol. 67. - P. 2475-2485.

111. Protection of European domestic pigs from virulent African isolates of African swine fever virus by experimental immunisation / K. King, D.A.G. Chapman, J.M. Argilaguet [et al.] // Vaccine. - 2011. - Vol. 29. - P. 4593-4600.

112. Rapid and biologically safe diagnosis of African swine fever virus infection by using polymerase chain reaction / Y. Steiger, M. Ackermann, C. Mettraux [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1992. - Vol. 30, № 1. - P. 1-8.

113. Redasoft Visual Cloning 3.0 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.redasoft.com (проверено 22.11.2013).

114. Repression of African swine fever virus polyprotein pp220-encoding gene leads to the assembly of icosahedral core-less particles // G. Andrés, R.G. Escudero, M.L. Salas, J.M. Rodriguez // J. Virol. - 2002. - Vol. 76, № 6. - P. 2654-2666.

115. Rodriguez, J.M. African swine fever virus-induced polypeptides in porcine alveolar macrophages and in Vero cells: two-dimensional gel analysis / J.M. Rodriguez, M.L. Salas, J.F. Santaren // Proteomics. - 2001. - Vol. 1, № 11. -P. 1447-1456.

116. Ruiz-Gonzalvo, F. Immunological responses of pigs to partially attenuated ASF and their resistance to virulent homologous and heterologous viruses / F. Ruiz-Gonzalvo, M.E. Carnero, V. Bruyel // FAO/CEC Expert Consultation in ASF Research / ed. P.J. Wilkinson. - Rome, 1981. - P. 206-216.

117. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. - 2nd ed. / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. -N.Y.: Cold Spring Harbor, 1989.

118. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitirs / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1977. - Vol. 74. - P. 5463-5467.

119. Standardization of pathological investigations in the framework of experimental ASFV infections / I. Galindo-Cardiel, M. Ballester, D. Solanes [et al.]//J. Virus Res.-2013.-P. 11.

120. STATGRAPHICS® Centurion XV User Manual. [Электронный ресурс]. - Режим доступа:

http://gendocs.ru/v31715/%D0%BF%D 1 %80%D0%BE%D0%B3%D 1%80%D0% B0%D0%BC%D0%BC%D0%B0_- statgraphics centurion xv (проверено

12.09.2013).

121. Statistics for Experimenters: Design, Innovation and Discovery - 2nd ed. / ed. J. Wiley, G.E.P. Box, W.G. Hunter, J.S. Hunter. - N.Y., 2005.

122. Strategies for mapping and clonning macroregions of mammalian genomes / C.L. Smith, S.K. Lawrance, G.A. Gillespie [et al.] // Methods Enzymol. -1987.-Vol. 151.-P. 461-489.

123. Suarez, C. African swine fever polyprotein pp62 is essential for core development / C. Suarez, M.L. Salas, J.M. Rodriguez // J. Virol. - 2010. - Vol. 84. -P. 176-187.

124. Terminal and internal inverted repetitions in african swine fever virus DNA / J.M. Sogo, J.M. Almendral, A. Talavera [et al.] // Virology. - 1984. - Vol. 133.-P. 271-275.

125. The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune response / P. Gomez-Puertas, F. Rodriguez, J.M. Oviedo [et al.] // Virology. - 1998. - Vol. 243. - P. 461-471.

126. The CD2v protein enhances African swine fever virus replication in the tick vector, Ornithodoros erraticus / R. J. Rowlands, M.M. Duarte, F. Boinas [et al.] // J. Virol. - 2009. - Vol. 393. - P. 319-328.

127. The cellular immune recognition of proteins expressed by an African swine fever virus random genomic library / J.S. Jenson, A. Childerstone, H. Takamatsu [et al.] // J. Immunol. Methods. -2000. - Vol. 242, № 1-2. - P. 33-42.

128. The CD2v protein of African swine fever virus interacts with the actin-binding adaptor protein SH3P7 / P.C. Kay-Jackson, L.C. Goatley, L. Cox [et al.] // J. Gen. Virol. - 2004. - Vol. 85. - P. 119-130.

129. The non-haemadsorbing African swine fever virus isolate ASFV/NH/P68 provides a model for defining the protective anti-virus immune

response / A. Leitao, C. Cartaxeiro, R. Coelho [et al.] // J. Gen. Virol. - 2001. -Vol. 82.-P. 513-523.

130. Vitasek, J. A review of rabies elimination in Europe / J. Vitasek // Vet. Med. Czech. -2004. - Vol. 49, №5. - P. 171-185.

131. Vlasova, N.N. African swine fever virus pathogenesis and vaccine development: challenges and possible approaches / N.N. Vlasova, A.N. Vlasova // Fevers: Types, Treatments and Health Risks. -N.Y., 2013. - Chap. 1. - P. 3-26.

132. Vlasova, N.N. Perspective of using the recombinant DNA-technology to control the spread of the African swine fever / N.N. Vlasova, V.M. Balyshev, A.S. Kazakova // 4th Vaccine and ISV Annual Global Congress Procedia in Vaccinology. - 2011. - P. 92-99.

133. Zhu, Y. DNA sequence analysis of chromosome 21 not i linking clones / Y. Zhu, C.R. Cantor, C.L. Smith // Genomics. - 1993. - Vol. 18. - P. 199-205.

134. Zsak, L. Regulation of apoptosis in african swine fever virus-infected macrophages / L. Zsak, J.G. Neilan // Scientific World J. - 2002. -№ 2 (5). - P. 1186-1195.

8. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Рисунки:

1. Политическая карта Европейской части РФ, и стран, на территории которых регистрировали вспышки АЧС (с. 14).

2. схема структуры вириона АЧС (с. 22).

3. Схема стратегии разработки вакцины на основе использования клонотеки генов вируса АЧС (с. 42).

4. Схема полноразмерного генома вируса АЧС штамма Грузия 2007/1 с расположением ОРС генов B646L, CP204L, KP177R, 061R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L (с. 56).

5. Схема рекомбинантных плазмид pJET1.2/blunt, несущих гены EP402R и 061R вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 (с. 62).

6. Схема рекомбинантных плазмид pJET1.2/blunt, несущих гены KP177R и CP204L вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 (с. 63).

7. Схема рекомбинантных плазмид pJET1.2/blunt, несущих ген E183L и фрагмент гена CP530R вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 (с. 64).

8. Схема рекомбинантных плазмид pJET1.2/blunt, несущих ген B646L и фрагмент гена CP2475L вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 (с. 65).

9. Электрофореграммы проверки рекомбинантной плазмиды pET32b(+)/ASFVp22 на наличие встройки нуклеотидной последовательности гена K177R вируса АЧС (с. 67).

10. Профиль гидрофильности/гидрофобности vp22 по алгоритму Норр и Woods (с. 69).

11. Профиль гидрофильности/гидрофобности CD2v по алгоритму Норр и Woods (с. 73).

12. Дендрограмма, построенная на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей EP402R (CD2v) изолятов и штаммов вируса АЧС, выделенных на территории РФ, а также Европы и Африки (с. 74).

13. Дендрограмма, построенная на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей 061R (vpl2) штаммов вируса АЧС, выделенных на территории РФ, Африки, Европы, Грузии и Армении (79 е.).

14. Профиль гидрофильности vpl2 по алгоритму Норр и Woods (с. 80).

15. Культура клеток АМС до и после инокуляции изолятом Krasnodar 06/12 вируса АЧС (с. 83).

16. Температурные показатели свиней при заражении вирусом АЧС, изолятом Krasnodar 06/12 в дозе 1000 ГАдЕ/гол (с. 84).

17. Дендрограмма, построенная по методу «ближайших соседей», на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей полноразмерного гена E183L (р54) различных штаммов вируса АЧС (с. 87).

18. Температурные показатели свиней при заражении адаптированным к репродукции в РК-15 вирусом АЧС, в дозе 1000 ГАдЕ/гол (с. 92).

19. изменение характера гемадсорбции в процессе адаптации варианта изолята Krasnodar 06/12 вируса АЧС и деструктивные изменения в культуре клеток CV-1, вызванные репродукцией адаптированного варианта вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, прошедшего в данной культуре клеток 25 последовательных пассажей (с. 95).

20. Выявление антигена в препаратах культуры клеток CV-1, инфицированной адаптированным к репродукции в данной культуре клеток вариантом вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 с использованием ФИТЦ-конъюгата моноклональных антител к vp72 (с. 96).

Таблицы:

1. Характеристики изолятов и штаммов вируса АЧС (с. 32).

2. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для амплификации генов вируса АЧС (с. 46).

3. Режим амплификации полноразмерной копии генов KP177R, EP402R, 061R с интергенным регионом и фрагментов генов CP2475L, CP530R (с. 58).

4. Выявление антител к вирусу АЧС методом непрямого ТФ ИФА с использованием рекомбинантного и референс-антигена (с. 70).

5. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 061R различных штаммов и изолятов вируса АЧС (с. 77).

6. Результаты вирусвыделения и изучения репродукции изолята Krasnodar 06/12 вируса АЧС в культуре клеток АМС (с. 83).

7. Уровень виремии у свиней, инфицированных изолятом Krasnodar 06/12 вируса АЧС, при анализе в культуре клеток АМС (с. 85).

8. Молекулярно-биологические свойства российских изолятов (с. 89).

9. Результаты репродукции изолята Krasnodar 06/12 вируса АЧС в культуре клеток CV-1 (с. 94).

10. Определение рабочего разведения специфического антигена полученного из культуры клеток CV-1, инокулированной вируссодержащим материалом 51-го последовательного пассажа на перевиваемых культурах клеток (с. 99).

11. Оценка специфичности полученного культурального антигена вируса АЧС (с. 100).

12. Таблица результатов постановки ТФ ИФА и РНИФ на выявление антител к вирусу АЧС в референтных и экспериментальных сыворотках (с. 103).

137