Характеристика биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации в 2017-2020 гг. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Шотин Андрей Романович

• Шотин Андрей Романович
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Шотин Андрей Романович

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Краткая историческая справка

1.2 Морфология вируса АЧС

1.3 Классификация изолятов и штаммов вируса АЧС

1.4 Устойчивость вируса АЧС

1.5 Распространение и клинико-анатомическое проявление

1.6 Диагностика АЧС

1.7 Заключение по обзору литературы

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Материалы

2.1.2 Методы исследований

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Определение серопревалентности АЧС на территории РФ

3.1.1 Изучение влияния условий хранения сывороток крови свиней на выявление антител к вирусу АЧС методом ИФА

3.1.2 Отработка и оптимизация условий постановки ИПМ

3.1.3 Использование альтернативных методов отбора проб и диагностики АЧС

3.1.3.1 Оценка возможности использования фильтровальной бумаги для отбора проб крови

3.1.3.2 Оценка возможности использования зонд-тампонов для отбора проб крови

3.1.4 Сравнительное испытание серологического экспресс-теста на АЧС «GDX70-2 Herdscreen ASF Antibody»

3.1.5 Использование ИПМ в диагностической и исследовательской работе

3.2 Изучение биологических свойств изолятов вируса АЧС

3.2.1 Биологические свойства изолятов in vitro

3.2.2 Биологические свойства изолятов in vivo

3.2.2.1 Изолят «ASFV/Kaliningrad 17/WB-13869»

3.2.2.2 Изолят «ASFV/Primorsky 19/WB-6723»

3.2.2.3 Изолят «ASFV/Tatarstan 20/WB-12276»

3.2.2.4 Сравнительный анализ биологических свойств изолятов

3.2.3 Анализ молекулярно-генетических свойств исследуемых изолятов вируса АЧС

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

4.1 Итоги исследований

4.2 Практические предложения

4.3 Перспективы дальнейшей разработки

5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации в 2017-2020 гг.»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Вспышки африканской чумы свиней (АЧС), с высокой частотой возникающие в различных странах мира оказывают влияние на развитие отрасли свиноводства и наносят значительные убытки, складывающиеся из недополученной прибыли, расходов на ликвидацию и профилактику болезни, а в ряде государств могут поставить под угрозу продовольственную безопасность населения.

По состоянию на февраль 2022 год возбудитель АЧС присутствует на Африканском, Европейском и Азиатском континентах, Малайском архипелаге, странах Океании и Карибского бассейна. Стабильно появляются новые неблагополучные страны, так в течение 2021-2022 гг. зарегистрированы первые, в современной эпизоотии, случаи болезни в Доминиканской республике, Гаити, Малайзии, Северной Македонии, в Италии за пределами острова Сардиния, а также в Германии среди домашних свиней, где до недавнего времени случаи болезни регистрировались исключительно среди диких кабанов [25, 88].

За 15 лет циркуляции АЧС в России, учеными выделено и изучено множество изолятов вируса, полученных из различных регионов страны от домашних и диких свиней, которые различаются по своим биологическим свойствам. На настоящий момент известны как высоковирулентные, так и со сниженной вирулентностью варианты вируса, вызывающие в т.ч. бессимптомную форму течения болезни [14, 15, 27, 33, 48, 51, 75, 79]. Исходя из чего, можно предположить о наличии различий в их генетических кодах.

До настоящего времени в мире не разработан коммерчески доступный вакцинный препарат, эффективно и безопасно профилактирующий АЧС. В связи с этим, на сегодняшний день, единственным способом борьбы с инфекцией является проведение комплекса профилактических мероприятий, направленных на повышение уровня биозащищенности хозяйств, ранняя диагностика с использованием современных и высокоточных методов, проведение бескровного убоя инфицированных и находящихся в зоне риска животных с введением строгих ограничительных (карантина) мероприятий [25, 119].

В целях контроля и борьбы с АЧС в Российской Федерации (РФ) используются высокочувствительные и специфичные методы лабораторной диагностики. Однако, поступающие сообщения о появлении ослабленных вариантов вируса АЧС и увеличения числа случаев бессимптомного и хронического течения, требуют постоянной коррекции применяемых стратегий диагностики и борьбы, в т.ч., разработки и внедрения новых техник отбора и исследования проб [79, 94].

С учетом вышеизложенного, базисом в искоренении АЧС является -разработка программы надзора, направленной на раннее обнаружение инфекции, определение превалентности инфекции на неблагополучных территориях, сбору доказательств благополучия других территорий [161]. Для реализации упомянутых целей необходимо проведение всестороннего изучения актуальных вариантов циркулирующего возбудителя с учетом особенностей его репродукции в культуре клеток и характера течения болезни у различных видов восприимчивых животных. Последнее свидетельствует об актуальности исследований по изучению биологических свойств современных изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ.

Степень разработанности проблемы. В РФ эпизоотия АЧС вызвана вирусом II генотипа, которая началась в 2007 году в приграничных с Грузией районах Чеченской Республики и продолжается по настоящее время практически на всей территории страны. По состоянию на 12.04.2022 г. Россией официально нотифицированы во Всемирную организацию здравоохранения животных (МЭБ) 2104 вспышки инфекции (в т.ч. 1260 среди свиней и 844 в популяции кабанов) [63].

За период 2007-2018 гг. изучен ряд отечественных полевых изолятов вируса АЧС, выделенных при вспышках инфекции из материалов от домашних свиней и диких кабанов. Так, в работах Балышева В.М., Болговой М.В., Власова М.Е., Ремыги С.Г. описаны изоляты, вызывающие от сверхострой до подострой форм течения болезни, обладающие 100% летальностью для зараженных животных, гибель которых наступала на 3-17 дни после заражения (д.п.з.) [12, 14, 15, 19, 33, 51]. В то же время, в работах Першина А.С., Варенцовой А.А., Шевченко И.В.,

Жукова И.Ю., Черных О.Ю. помимо высоковирулентных, описаны изоляты с пониженной вирулентностью, демонстрирующие летальность на уровне 50% (изолят «Lipetsk 12/16»), а период падежа животных после заражения изучаемыми изолятами регистрировался в более широких пределах (5-30 д.п.з.) [27, 48, 70, 75, 79].

Об аналогичных результатах исследований сообщается рядом зарубежных авторов, которые выявляли в 2014-2018 гг. помимо высоковирулентных изолятов, варианты вируса со сниженной вирулентностью, вызывающие течение болезни от острого до бессимптомного [92, 94, 100, 106, 107, 116, 126, 152]. При этом особого внимания заслуживают сообщения об обнаружении негемадсорбирующих вариантов «Lv17/WB/Rie1» (Латвия, 2017 г.) [92] и «HeB/Q3/20 и HLJ/HRB1/20» (Китайская Народная Республика (КНР), 2020 г.) [107], а также вариантов вируса, принадлежащих к I генотипу («HeN/ZZ-P1/21» и «SD/DY-I/21» (КНР), 2021 г.) [126], в приграничных к РФ странах.

Об обнаружении специфических антител к вирусу АЧС сообщалось в первых уведомлениях, направленных в МЭБ из Армении и Грузии в 2007-2008 гг. На территории России антитела детектировали в образцах, положительных на геном и/или вирус АЧС, от свиней (личные подсобные хозяйства (ЛПХ), крестьянские фермерские хозяйства (КФХ), свинокомплексы (СК)) и кабанов (павшие и отстрелянные) с 2008 по 2014 гг. при первичных и вторичных вспышках инфекции. Анализ лабораторных исследований на АЧС в РФ за период 2011-2017 гг. выявил, что из 173 тыс. исследований, проведенных в рамках федерального эпизоотического мониторинга (ЭМ), методом иммуноферментного анализа (ИФА) (обнаружение антител к вирусу АЧС) - только в 31 (0,018%) пробе обнаружены антитела к возбудителю (в т.ч. 28 проб из одного СК) [1, 16, 76, 101, 104]. В то же время, согласно данным из открытых источников, в некоторых странах Восточной Европы (Эстония, Латвия и Литва) начиная с конца 2015 г. отмечается динамика увеличения числа обнаружения серопозитивных животных, особенно в популяции дикого кабана. Стоит отметить, что в ряде случаев положительные результаты по обнаружению антител к вирусу АЧС получены при проведении серологического

исследования образцов, в которых не удавалось обнаружить геном возбудителя (при использовании метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)) [9, 110, 111, 128].

Сообщения об изолятах вируса АЧС, обладающих более низкой вирулентностью, обнаруженных, как на территории РФ, так и сопредельных стран позволяют предположить формирование энзоотичной ситуации, что усложняет раннюю диагностику болезни, создает дополнительные сложности для борьбы с инфекцией, а также требуют проведение дальнейших работ по изучению новых изолятов, что неоднократно подчеркивали многие авторы [16, 79, 94, 104].

В ряде исследовательских лабораторий с целью изучения путей распространения, выявления геномных маркеров и обнаружения генов, ответственных за изменение биологических свойств вирусов (в т.ч. вирулентность и антигенность), проводится полногеномное секвенирование изучаемых/полевых изолятов вируса АЧС. Так, в международной базе данных GenBank опубликовано порядка 140 полных геномных последовательностей полевых изолятов возбудителя АЧС, из которых только шесть из РФ [122].

Это указывает на актуальность проведения исследований по всестороннему изучению биологических свойств современных изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации.

Цели и задачи. Целью работы являлось изучение и анализ биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных в РФ в период 2017-2020 гг., а также выявление особенностей клинического течения болезни.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить серопревалентность АЧС на территории РФ в популяциях домашних и диких свиней с учетом использования альтернативных методов отбора проб и их исследования;

2. Охарактеризовать биологические свойства изолятов вируса АЧС, выделенных в ряде регионов РФ, в т.ч. методом постановки биопробы на естественно восприимчивых животных;

3. Провести молекулярно-генетический анализ изолятов вируса АЧС (охарактеризованных согласно п. 2).

Научная новизна результатов. Подтверждено наличие серопозитивных кабанов и домашних свиней на территории ряда регионов РФ. При этом в части проб от кабанов, отобранных на территории Владимирской области, не выявлялся геном и вирус АЧС.

Получен патент (в соавторстве) на «Аттенуированный штамм «ASFV/CV60/2020» вируса АЧС семейства Asfarviridae, рода Asfivirus для изучения иммунологических реакций, молекулярно-генетического анализа, генетической модификации и создания прототипа вакцины против АЧС» (Приложение 1).

Охарактеризованы и проведен сравнительный анализ трех изолятов вируса АЧС, выделенных от диких кабанов на территории Приморского края, Калининградской области и Р. Татарстан. Установлены отличия в особенностях течения болезни (длительность инкубационного периода, сроки проявления болезни и наступления гибели свиней, клинические признаки и патологоанатомические изменения при некропсии их трупов) и накоплении вируса в разных органах животных, подвергнутых заражению различными изолятами вируса АЧС.

Определены и опубликованы в базе данных «GenBank» полногеномные последовательности изолятов «ASFV/Kaliningrad 17/WB-13869» и «ASFV/Primorsky 19/WB-6723» под номерами #OM799941 и #MW306191. Определены нуклеотидные последовательности участков генома изолята «Tatarstan 20-WB/12276» (O174L, K145R, MGF 505-5R, I267L, B646L, EP402R, межгенная область (IGR, intergenic region) I73R / I329L и центральная вариабельная область (CVR) гена B602L.

Филогенетический анализ изученных изолятов вируса АЧС (на основе семи маркерных участков генома) позволил разделить их на две генетические группы (группа №1 - изолят из Калининградской области; группа №2 - изоляты из Р. Татарстан и Приморского края).

Теоретическая и практическая значимость исследования. Полученные полногеномные последовательности отечественных изолятов вируса АЧС

«ASFV/Kaliningrad 17/WB-13869» и «ASFV/Primorsky 19/WB-6723» и нуклеотидные последовательности фрагментов наиболее значимых генов изолята «Tatarstan 20-WB/12276», будут использованы в дальнейшей работе по изучению молекулярно-биологических свойств новых вариантов вируса АЧС.

Разработаны «Методические рекомендации по отбору, хранению и транспортировке проб биоматериала от дикого кабана для исследований на африканскую чуму свиней» (утверждены Ученым Советом ФГБУ «ВНИИЗЖ», протокол № 07 от 27.05.2021 г.) (Приложение 2), «Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу африканской чумы свиней иммунопероксидазным методом» (утверждены Ученым Советом ФГБУ «ВНИИЗЖ», протокол № 09 от 19 ноября 2020 г.) (Приложение 3), «Методические рекомендации по проведению эпизоотологического обследования при африканской чуме свиней» (утверждены Ученым Советом ФГБУ «ВНИИЗЖ», протокол № 05 от 14 июня 2022 г.) (Приложение 4).

Подтверждена возможность использования фильтровальной бумаги и зонд-тампонов в диагностике специфических антител к вирусу АЧС в твердофазном ИФА (ТФ-ИФА), иммуноблоттинге (ИБ) и ИПМ.

Подтверждена эффективность использования методов

иммунохроматографического анализа (ИХА) и ИПМ. Показана возможность использования данных методов при исследовании образцов (помимо сыворотки крови) тканей животного на наличие специфических антител к вирусу АЧС.

Данные, полученные при изучении серопревалентности АЧС на территории РФ, демонстрируют необходимость проведения корректировки применяемых подходов к осуществлению диагностики болезни.

Результаты работы могут быть использованы при разработке программ и стратегий надзора и контроля за АЧС, как в отдельных субъектах, так и на всей территории РФ.

Методология и методы исследования. В работе использовали вирусологические (вирусовыделение, накопление и титрование вируса), биологические (постановка биопроб), препаративные (очистка вируса),

серологические (ИБ, ТФ-ИФА, ИПМ, ИХА) и молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, филогенетический анализ) методы. Исследования выполнены на базе референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2018-2021 гг.

Положения выносимые на защиту:

а) использование альтернативных проб биологического материала и комплексный метод исследования позволяют выявить большее число инфицированных вирусом АЧС животных;

б) на территории РФ присутствуют серопозитивные, в т.ч. переболевшие АЧС животные;

в) установлено различие биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в 2017-2020 гг.;

г) определены и опубликованы в базе данных GenBank полногеномные последовательности вируса АЧС изолятов «ASFV/Primorsky 19/WB-6723» (под номером #MW306191.1) и «ASFV/Kaliningrad 17/WB-13869» (#OM799941). Определены нуклеотидные последовательности участков генома изолята «Tatarstan 20-WB/12276» (O174L, K145R, MGF 505-5R, I267L, B646L, EP402R, IGR I73R / I329L и CVR гена B602L;

д) использование генетических маркеров O174L, K145R, MGF 505-5R, I267L, B646L, EP402R, CVR и IGR I73R / I329L позволяет разделить изученные изоляты на две генетические группы (группа №1 - изолят из Калининградской области; группа №2 - изоляты из Р. Татарстан и Приморского края).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ»: д.б.н. Н.Н. Власовой, кандидатам ветеринарных А.С. Першину и биологических наук И.В. Шевченко, А. Мазлум, Е.В. Ароновой, А.А. Елсуковой и Н.Г. Зинякову за помощь в проведении отдельных этапов работы, д.б.н., проф. К.Н. Груздеву и к.в.н. А.А. Шевцову за консультативную помощь и содействие в выполнении отдельных этапов работы, а также сотрудникам информационно-аналитического центра (ИАЦ) Россельхознадзора.

Степень достоверности и апробации результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2018-2021 гг.); Научно-технического совета Россельхознадзора (2018-2021 гг.); отчетных мероприятиях в рамках реализации Комплексного плана фундаментальных научных исследований по теме «Разработка вакцины против африканской чумы свиней, в том числе для перорального применения для диких кабанов» (2021-2022 г.); на Международной научно-практической конференции «Ветеринарно-санитарная безопасность продовольствия - основа здоровья человека» (20.05.2021 г.); Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика 2021» (2021 г.); Международной конференции «Online Workshop on Laboratory Diagnosis and Control of ASF and CSF» (08-09.06.2021 г.), а также на VI Международной научной конференции «Достижения ученых в ветеринарную практику», посвященной 60 -летию аспирантуры ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2022 г.). Достоверность проведенных исследований подтверждена результатами комиссионных испытаний.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано восемь научных статей, три из которых - в рецензируемых научных изданиях, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, и четыре статьи - в международных журналах, цитируемых в системах Web of Science и Scopus.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, заключение, приложения; иллюстрирована 33 таблицами и 32 рисунками. Список использованной литературы включает 168 источников, из них 90 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Краткая историческая справка

Африканская чума свиней (болезнь Монтгомери, восточно-африканская лихорадка, Pestis africana suum) - контагиозная септическая болезнь домашних, в том числе декоративных, свиней и диких кабанов всех возрастов и пород [7, 9]. Резервуарами вируса являются бородавочники, кустарниковые, дикие свиньи и клещи рода Ornithodoros [9, 53, 112].

Возбудитель АЧС - арбовирус, содержащий двухцепочечную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и отнесенный к отдельному семейству Asfarviridae, вызывающий у свиней болезнь в формах от сверхострой до бессимптомной [37, 129]. В первичных очагах на неэндемичных территориях клинически преобладающей является острая форма болезни, характеризующаяся коротким инкубационным (2-6 суток) и клиническим (1-5 суток) периодами со смертностью среди восприимчивых животных близкой к 100% [33, 39].

В соответствии с международной классификацией болезнь включена в список МЭБ в категорию «болезни и инфекции свиней», подлежащие обязательной декларации [7, 161]. Характеризуется как наиболее важная трансграничная инфекция с катастрофическим потенциалом, одна из самых серьезных проблем эпизоотологии ввиду чрезвычайно большого прямого ущерба, способности к возникновению и эпизоотическому распространению в самых неожиданных регионах мира и отсутствия зарегистрированных средств специфической профилактики и лечения [9, 25, 53].

Первые случаи АЧС впервые отмечены в Южной Африке в 1903 году, а в 1921 году болезнь подробна описана Монтгомери. В середине прошлого века, зафиксировано первое глобальное распространение инфекции с африканского континента в страны Европы, Южной и Центральной Америки, а в 1977 году и в Советский Союз. Однако, в результате предпринятых со стороны правительств беспрецедентных мер вспышки, эпизоотии/энзоотии АЧС в этих регионах были ликвидированы (искл. эндемичные районы Африки и о. Сардиния (Италия)). В

начале 2007 года болезнь официально зарегистрирована в Грузии, с последующим распространением, что кардинальным образом изменило эпизоотическую ситуацию в Европе и мире [7, 11, 40].

Глобальная ситуация по АЧС продолжает ухудшаться, так на данный момент болезнью поражено более 50 стран. Эпизоотия в Российской Федерации до недавнего времени имела тренд на снижение количества вспышек, однако на данный момент общая ситуация остается критичной и напряженной с вовлечением новых регионов и возвращения болезни на благополучные территории [25, 58, 115].

1.2 Морфология вируса АЧС

Вирус АЧС относится к группе крупных ядерно-цитоплазматических ДНК-содержащих вирусов, семейству Asfarviridae, род Л^фу^ыъ. Является единственным ДНК-содержащим вирусом, для которого надежно установлена его арбовирусная природа [9, 129, 168].

Вирионы вируса АЧС представляют собой икосаэдрические частицы с диаметром от 175 до 215 нанометров (нм), в которых можно выделить сердцевину, состоящую из геном-содержащего нуклеоида и его плотной белковой оболочки, внутреннею липидную оболочку, капсид икосаэдрической формы и наружный слой (супрекапсид), представленный липопротеидной оболочкой, приобретаемой при выходе вируса из клетки (Рисунок 1) [129, 153].

Рисунок 1. Структура и белковый состав вируса АЧС [157]

Нуклеоид представляет собой электролюминесцентную структуру с диаметром 70-100 нм, содержащую вирусный геном, образованный одной молекулой двухцепочечной ДНК (дДНК) размером 165-191 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) (в зависимости от изолята), исключая концевые инвертированные повторяющиеся последовательности и нуклеопротеины, такие, как ДНК-связывающий белок p10 и белок pA104R [125, 167].

Предполагается, что нуклеоид содержит транскрипционные механизмы для синтеза и модификации ранних рибонуклеиновых кислот (РНК), которые включают в себя субъединичную РНК-полимеразу, поли-А-полимеразу, кэпирующие ферменты и ранние транскрипционные факторы [36, 129, 153]. Размер центральной консервативной области генома составляет ~125 т.п.н. и варьирует в пределах 1,5% (в зависимости от изолята), в отличие от двух граничащих высоко вариабельных областей на концах молекулы ДНК [125, 167].

Геном вируса АЧС имеет 151-167 открытых рамок считывания (ОРС), которые считываются с обеих цепей ДНК. Нуклеоид окружен оболочкой, которая

представляет собой слой белка толщиной около 30 нм, и определяется, как независимая часть сердцевины вируса. Эта оболочка в основном состоит из продуктов переработки полипротеинов рр220 и рр62, которая катализируется цистеиновой протеазой, кодируемой геном S273R. Оболочка нуклеотида образуется при последовательном протеолитическом расщеплении, что приводит к образованию шести основных компонентов оболочки ядра: белков р150, р37, р34 и р14, полученные из полипротеина рр220 и белков р35 и р15, продуктов рр62, которые в совокупности составляют 32% от общей массы вириона [153]. Внутренняя оболочка вируса представленна липидным бислоем, который образован из эндоплазматического ретикулума и имеет схожую ширину, близкую к 5 нм. Внутренняя оболочка состоит из мембранных белков p54 (j13L), p17 даП7Ъ), p12 и рЕ248К [129, 153, 163].

Капсид вируса АЧС состоит из капсомеров и наружной оболочки, имеет икосаэдрическую форму размером 170-190 нм. Число триангуляции капсида оценено от 189 до 217, что свидетельствует о наличии в нем 1892-2172 капсомеров. Каждый капсомер имеет форму гексагональных призм длиной 13 нм, шириной 5-6 нм с отверстиями в центре. Расстояние между капсомерами составляет от 7,4 до 8,1 нм. Основным компонентом капсида является белок р72, кодируемый геном B646L, который составляет около одной трети массы белка вирусной частицы и позволяет разделить все известные в настоящее время изоляты и штаммы вируса АЧС на 24 генотипа [130, 149]. Другими компонентами являются белки pE120R и P49 (pB438L) [129, 153].

Вирион вируса имеет внешнюю оболочку с диаметром 175-215 нм, происходящую из клеточной плазматической мембраны и приобретаемую в процессе выхода из клетки почкованием. Для данной оболочки характерными протеинами являются белки CD2v (EP402R), P24 (pKP177R) и рР2 (рОбЖ) [129, 153].

В целом, вирион вируса АЧС содержит 54 структурных белка с молекулярным весом от 10 до 150 кДа, включая ряд ферментов необходимых для ранней транскрипции, такие как РНК-полимераза, ро1у(А)-полимераза,

гуанилтрансфераза и протеинкеназа. Так же вирионы содержат липиды (в том числе гликолипиды и фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитол) и углеводы (гликозилированный белок pEP402R, и гликолипиды) [64, 108, 129].

1.3 Классификация изолятов и штаммов вируса АЧС

Изоляты вируса АЧС, выделенные в различных географических зонах мира, а также полученные экспериментально, различаются по биологическим (высоковирулентные, слабовирулентные и авирулентные), культуральным (гемадсорбирующие и не гемадсорбирующие) и антигенным свойствам [26].

В свою очередь гемадсорбирующие изоляты вируса можно разделить по числу прикрепившихся эритроцитов к зараженным клеткам, которое коррелирует с вирулентностью вируса. Так гемадсорбцию можно разделить на плотную (41 -80 эритроцитов на клетку), промежуточную (21-40 эритроцитов) и рыхлую (1-20 эритроцитов). При этом стоит учесть, что для каждого изолята характерна своя гетерогенность и специфичность при которых в поле зрения микроскопа могут встречаться разные виды гемадсорбции [52, 65].

На основании реакции задержки гемадсорбции (РЗГА) штаммы вируса АЧС делятся на восемь серотипов. В то же время, негемадсорбирующие изоляты не могут быть классифицированы в РЗГА, в связи с чем они относятся к группе нетипированных изолятов [26, 98].

Однако широкое признание получила классификация по генотипированию, основанная на анализе 478-нуклеотидного фрагмента С-концевой области гена B646L, который кодирует капсидный мажорный белок вируса АЧС р72 и тетрамерных аминокислотных повторов в центральном вариабельном регионе гена B602L, на основании которого идентифицировано 24 генотипа вируса [9, 74, 86, 123, 130, 134].

Ввиду широкого распространения болезни внутри стран и регионов, возникла потребность в разделении близкородственных изолятов, что достигается с помощью использования других, менее консервативных вирусных генов (напр.

^86^ I196L, C84L, O174L, Ю45^ MGF 505-5R, ¡267Ъ), CVR гена B602L и межгенных областей (напр. Г73М329^ I78R/I215L, MGF-505 9R/10R) [17, 38, 85, 109, 133, 136, 140, 141, 142, 148, 165].

Однако, анализ стандартно выбираемых фрагментов генома, таких как B602L, B646L или E183L, изолятов, принадлежащих к II генотипу вируса АЧС, не дает достаточно информации для филогенетической кластеризации близкородственных изолятов, в то время как полногеномное секвенирование дает возможность идентифицировать известные, так и выявлять новые геномные маркеры. Так, на основе выявления вставки одного или двух тандемных повторов из 10 пар оснований в межгенную область между генами I73R и I329L (IGR), удалось разделить изоляты II генотипа на четыре группы [149]. В референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» впервые в мире идентифицирована дополнительная 17-нуклеотидная вставка TRS в межгенной области MGF-505-9R / MGF-505-10R (MGF-2). Анализ этой области, в свою очередь, позволил разделить изоляты II генотипа на 3 дополнительных кластера [160].

Несмотря на относительно высокую скорость накопления замен в геноме вируса АЧС по сравнению с другими ДНК содержащими вирусами, число известных геномных молекулярных маркеров для изолятов II генотипа всё ещё недостаточно для детальной субкластеризации [149].

Проведение полногеномного секвенирования изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ и других стран, позволяет выявить специфические генетические маркеры возбудителя, которые используется с целью группирования вирусов между собой, и является дополнительным методом в определении вероятных путей распространения болезни [17].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шотин Андрей Романович, 2023 год

дата место источник

1 ASFV/Kaliningrad 17/WB-13869 07.11.2017 г. Калининградская область, Багратионовский район, п. Красноармейское Трубчатая кость от павшего кабана

2 ASFV/Primorsky 19/WB-6723 06.08.2019 г. Территориальное отделение "Широкое" Службы Пограничного управления Приморского края, Пограничный муниципальный район, Приморский край Трубчатая кость от павшего кабана

3 ASFV/Tatarstan 20/WB-12276 17.12.2020 г. Квартал №110, Заинское лесничество, Кармалинское охотхозяйство, Заинский район, Республика Татарстан Селезенка от отстрелянного дикого кабана

Так же в работе использованы штаммы: - «ASFV/60CV/2020», депонированный в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» (регистрационный номер № 334 - деп / 20-122 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ») и зарегистрированный в Государственном реестре изобретений (патент №2760399, дата регистрации 24.11.2021 г.) (Приложение 1).

Культуры клеток. В работе использовали первичные культуры клеток (КК) селезенки свиней (СС) и КМС, и перевиваемую КК почки африканской зеленой мартышки Cercopithecus aethiops - «CV-1» (CV) [20, 41, 42].

Эритроциты свиней. В работе использовали 20% суспензию эритроцитов в физиологическом растворе.

Биологический материал. В работе использовали референтные сыворотки крови от свиней: положительная, слабо-положительная и отрицательная к вирусу

АЧС, предоставленные CISA-INIA (г. Мадрид, Испания) Европейского Союза (ЕС); специфическая сыворотка VIII серотипа, полученная к референс-штамму «Arm 07»; сыворотки крови и биологический материал от домашних свиней и кабанов, а также продукция свиноводства и изделия свиного происхождения, позитивные и негативные по отношению наличия возбудителя АЧС и специфических антител к нему, полученные при экспериментальном заражении свиней и в рамках эпизоотологического мониторинга; в качестве положительного контроля использована гипериммунная сыворотка крови от свиньи № 0995, пережившей двукратное последовательное заражения вирулентными изолятами вируса АЧС [60]; в качестве отрицательного контроля для постановки ТФ-ИФА использовали нормальные сыворотки крови свиней из хозяйств, благополучных по АЧС; сыворотки, содержащие антитела к гетерологичным вирусным инфекциям свиней: гриппа свиней типа А подтипа H1N1, парвовирусной инфекции свиней (ПВИС), репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС), болезни Ауески (БА) и к вирусу классической чумы свиней (КЧС).

Животные. Для получения первичных культур клеток использовали клинически здоровых поросят не старше 2-4 недельного возраста, живой массой до 4-10 кг, полученных из хозяйств, благополучных по АЧС и другим инфекционным болезням. Для проведения серии экспериментов (биопроб) использовали отрицательных по обнаружению генома и специфических антител к вирусу АЧС свиней крупной белой породы в возрасте двух месяцев, массой 15-20 кг.

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы. Использовали химические реактивы фирм «Sigma», «AppliChem», «Life Technologies», «Thermo Fisher Scientific», питательные среды, антибиотики, фетальную сыворотку КРС (Sigma, НуС1оп и PAN BIOTECH, США и PAA, Австрия), а также FS FetalClon II (^Clone, США), питательную среду 45 DMEM-F12 (Thermo Fisher Scientific), Taq-ДНК-полимераза (Thermo Fisher Scientific), протеин А (Sigma-Aldrich, Германия), шарики из нержавеющей стали с диаметром 3 и 5 мм (QIAGEN, США), фильтровальная бумага (Whatman® № 3), зонд-тампон с вискозным наконечником (Ningbo Greetmede Medical Instruments CO., LTD, Китай), культуральные 96-

луночные планшеты (Corning® CellBIND®, США), ДНК-аза I (20000ед, Thermo Fisher Scientific), РНК-аза A (20мг/мл, Thermo Fisher Scientific), Protease from Streptomyces griseus (3.5ед/мг, Sigma), Proteinase K (600 ед/мл, Thermo Fisher Scientific), SDS (Thermo Fisher Scientific), NaCl 5M (Thermo Fisher Scientific), NaAc 3M, pH 5.5 (Invitrogen), Фенол-Хлороформ 1:5 (Sigma).

Наборы реактивов.

Серологический экспресс-тест на АЧС «GDX70-2 Herdscreen ASF Antibody» (Global DX, Великобритания) [66].

Блокирующий иммуноферментный анализ для выявления антител к вирусу Африканской чумы свиней (АЧС) в сыворотке свиней «INgezim PPA Compac» (Ingenasa, Испания) [95].

Тест-система для выявления антител к вирусу африканской чумы свиней (АЧС) в сыворотке и плазме крови, мясном соке и образцах крови, нанесенных на бумажные фильтры, непрямым иммуноферментным методом ELISA «ID Screen, African Swine Fever Indirect, Screening Test» (IDvet, Франция) [72].

Тест-система «АЧС» для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва) [30].

Комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-B» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва) [34].

«Тест-система для выявления генома вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») [29].

Наборы реагентов для подготовки библиотеки ДНК Nextera XT и проведения секвенирования MiSeq v2 (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).

Набор реагентов для экстракции ДНК из геля «Wizard SV Gel and RCR Cleanup System» (Promega, США).

Оборудование. Инвертированный микроскоп Olympus CX 41 (Япония); pH-метр «PB-11» (Satorius, Германия); СО2-инкубатор (Nuaire, США); ламинарный бокс (Labconco, США); фотометр микропланшетный MuItiskan FC (ThermoFisher

Scientific Inc., США); RT-PCR амплификатор Rotor-Gene Q (Corbett Research, Германия); ультрацентрифуга (Bechman Coulter, США); спектрофотометр Biospectrometer (Eppendorf, Германия); центрифуга Sigma 3-18 KS (Sigma Laborzentrifugen GmbH, Германия); водяная баня (Россия); бытовой холодильник (от 2° до 8°С), (Indesit, Россия); лабораторный холодильник ХЛ-340 (POZIS, Россия); термошейкер PST-60HL-4 (BioSan, Латвия); низкотемпературный холодильник (минус 700С) (Nuaire, США); пипетки автоматические с регулируемым объемом (от 0,1 до 1000 см3) (Eppendorf, Германия); гомогенизатор TissueLyser II (QIAGEN, США); электрофорезная вертикальная камера Protean II xi Cell, 16х16 см, 15 лунок, 1,0 мм, 1 гель, заливочный столик, Bio-Rad или «Mini-PROTEAN® Tetra Cell and Mini Trans-Blot® Module», Bio-Rad; система для блоттинга Trans-Blot Turbo, электроблоттинг, на две кассеты, Bio-Rad; источник питания Power Pac Universal, 10-500 В, 10-2500 мА, 1-500 Вт, 4 выхода, настольный секвенатор MiSeq (Illumina, США).

Web-ресурсы. Для анализа нуклеотидных последовательностей генома штаммов и изолятов вируса АЧС использовали ресурсы международных баз данных NCBI, EMBL.

Последовательности генов. 70 последовательностей генов изолятов вируса АЧС из РФ и других стран получены из базы данных GenBank, а также в ходе исследовательских работ в референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» и представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Последовательности генов изолятов вируса АЧС, использованные

при проведении филогенетического ^ анализа

№ Название изолята (№ в GenBank)* Страна Источник** Последовательность

1 2 3 4 5

1 ASFV Georgia 2007/1 (FR682468.2) Республика Грузия Дикий кабан п.г.

2 Arm07 (JX857522.1) Республика Армения Домашняя свинья CVR

3 Az08B (JX857530.1) Азербайджанская Республика Домашняя свинья CVR

4 Az08D (JX857529.1) Азербайджанская Республика Домашняя свинья CVR

1 2 3 4 5

5 Abk07 (JX857523.1) Республика Грузия Домашняя свинья CVR

6 Russia Odintsovo/WB 2014 (KP843857) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

7 Russia Leningrad 19/WB-789 2019 Российская Федерация Дикий кабан п.г.

8 Russia Ulyanovsk 19/WB-5699 2019 (MW306192) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

9 Russia Kabardino-Balkaria 19/WB-964 2019 (MT459800) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

10 Russia Amur/WB-6905 2019 (MW306190) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

11 Russia Zabaykali 20/WB-5314 2020 (MZ325862) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

12 Russia Kaliningrad 18/WB-12523 2018 (OM966714) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

13 Russia Kaliningrad 18/WB-12524 2018 (OM966715) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

14 Russia Kaliningrad 18/WB-9735 2018 (OM966716) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

15 Russia Kaliningrad 18/WB-9763 2018 (OM966717) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

16 Russia Kaliningrad 18/WB-9766 2018 (OM966718) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

17 Russia Kaliningrad 18/WB-12516 2018 (0M966720) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

18 Russia Kaliningrad 18/WB-9734 2018 (OM966721) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

19 Russia Kaliningrad 19/WB-10168 2019 (OM966719) Российская Федерация Дикий кабан п.г.

20 Crimea Martins 01/16-DP (0N098024.1) Российская Федерация Домашняя свинья CVR

21 Dagestan09 (JX857531.1) Российская Федерация Дикий кабан CVR

22 Vladimi-Sobinka 15-WB (0N098027.1) Российская Федерация Дикий кабан CVR

23 Vladimir-Shihobalovo 13-WB (0N098030.1) Российская Федерация Дикий кабан CVR

24 Tver-Kashino 13-WB (0N098028.1) Российская Федерация Дикий кабан CVR

25 Tver-Karamzino 13-WB (0N098029.1) Российская Федерация Дикий кабан CVR

26 Moscow-Anino 13-WB (0N098026.1) Российская Федерация Дикий кабан CVR

27 Arkhangelsk 16-DP (0N098020.1) Российская Федерация Домашняя свинья CVR

1 2 3 4 5

28 Krasnodar2016 (KY372398.1) Российская Федерация Домашняя свинья CVR

29 Vladimir-Gorokhovets 17-WB/325 (ON098021.1) Российская Федерация Дикий кабан CVR

30 Krasnodar 07/15 (ON098023) Российская Федерация Домашняя свинья CVR

31 Arkhangelsk 2021-DP/7672 Российская Федерация Домашняя свинья CVR

32 StPet09 (JX857534.1) Российская Федерация Домашняя свинья CVR

33 Pol15 Podlaskie Poland 2015 (MH681419) Республика Польша Дикий кабан п.г.

34 Pol16 20186 o7 Poland 2016 (MG939583) Республика Польша Домашняя свинья п.г.

35 Pol16 20538 o9 Poland 2016 (MG939584) Республика Польша Домашняя свинья п.г.

36 Pol16 20540 o10 Poland 2016 (MG939585) Республика Польша Домашняя свинья п.г.

37 Pol16 29413 o23 Poland 2016 (MG939586) Республика Польша Домашняя свинья п.г.

38 Pol17 03029 C201 Poland 2017 (MG939587) Республика Польша Дикий кабан п.г.

39 Pol17 04461 C210 Poland 2017 (MG939588) Республика Польша Дикий кабан п.г.

40 Pol17 05838 C220 Poland 2017 (MG939589) Республика Польша Дикий кабан п.г.

41 Pol17 31177 O81 Poland 2017 (MT847622) Республика Польша Домашняя свинья п.г.

42 Pol17 55892 C754 Poland 2017 (MT847620) Республика Польша Дикий кабан п.г.

43 Pol18 28298 O111 Poland 2018 (MT847621) Республика Польша Домашняя свинья п.г.

44 Pol19 53050 C1959 Poland 2019 (MT847623) Республика Польша Дикий кабан п.г.

45 Est15/WB-Tartu37 (MT647534.1) Эстонская Республика Дикий кабан CVR

46 Est17/WB/Parnu20 (MT647564.1) Эстонская Республика Дикий кабан CVR

47 Lithuania LT14-1490 2014 (MK628478) Литовская Республика Дикий кабан п.г.

48 Ukraine Kyiv/131 2016 (MN194591) Украина Домашняя свинья п.г.

49 CzechRepublic 2017 (LR722600) Чешская Республика Дикий кабан п.г.

50 Moldova 2017 (LR722599) Республика Молдова Домашняя свинья п.г.

1 2 3 4 5

51 Hungary HU 2018 (MN715134) Венгрия Дикий кабан п.г.

52 Belgium 2018 (LR536725) Королевство Бельгия Дикий кабан п.г.

53 Belgium Etalle wb 2018 (MK543947) Королевство Бельгия Дикий кабан п.г.

54 Germany 2020 (LR899193) Федеративная Республика Германия Дикий кабан п.г.

55 China CN/2019/InnerMongolia-AES01 2019 (MK940252) Китайская Народная Республика Дикий кабан п.г.

56 China Pig/HLJ 2018 (MK333180) Китайская Народная Республика Домашняя свинья п.г.

57 China GZ201801 2018 (MT496893) Китайская Народная Республика Домашняя свинья п.г.

58 China DB/LN 2018 (MK333181) Китайская Народная Республика Домашняя свинья п.г.

59 China AnhuiXCGQ 2018 (MK128995) Китайская Народная Республика Домашняя свинья п.г.

60 China wbBS01 2018 (MK645909) Китайская Народная Республика Дикий кабан п.г.

61 China pig/CAS19 2019 (MN172368) Китайская Народная Республика Домашняя свинья п.г.

62 China CADC/HN09 2019 (MZ614662) Китайская Народная Республика Домашняя свинья п.г.

63 China Wuhan-1 2019 (MN393476) Китайская Народная Республика Домашняя свинья п.г.

64 China Wuhan-2 2019 (MN393477) Китайская Народная Республика Домашняя свинья п.г.

65 China Pig-HRB1 2020 (MW656282) Китайская Народная Республика Домашняя свинья п.г.

66 Vietnam NgheAn 2019 (MT180393) Социалистиче ская Республика Вьетнам Домашняя свинья п.г.

67 Vietnam VN/QP 2019 (MT882025) Социалистиче ская Республика Вьетнам Домашняя свинья п.г.

68 Vietnam 05L1/HaNam 2020 (MW465755) Социалистиче ская Республика Вьетнам Домашняя свинья п.г.

69 Timor-Leste T-L-1 2019 (MW396979) Демократическая Республика Восточный Тимор Домашняя свинья п.г.

70 India IND/AR/SD-61/2020 (OL692744) Республика Индия Домашняя свинья п.г.

Примечание: «*» - при наличии; «**» - от кого выделен изолят; п.г. - полногеномная последовательность

2.1.2 Методы исследований

Постановка биопроб на свиньях. Определение инфекционной активности и биологических свойств вируса АЧС проводили путем заражения естественно восприимчивых животных - свиней крупной белой породы массой 15-20 кг, в возрасте двух месяцев. Животные завезены из благополучных по АЧС хозяйств Владимирской и Московской областей. При поступлении, животных выдерживали в карантине в течение семи дней, проводили их клинический осмотр, термометрию тела и отбор проб крови. Одновременно образцы от животных исследовали методами молекулярно-генетическим методом (ПЦР-РВ) и серологическими (ТФ-ИФА и/или ИПМ) для подтверждения их негативного статуса по АЧС. Для кормления животных использовали готовые комбикорма для ремонтного молодняка свиней. Постановку биопробы проводили в виварии ФГБУ «ВНИИЗЖ» в боксе II класса биобезопасности, согласно «Методическим рекомендациям по постановке биопробы с заражением свиней вирусом африканской чумы свиней» [45]. Животных заражали вируссодержащим материалом в дозе 10 ГАдЕ50/гол объемом 2 см3 посредством внутримышечного введения в верхнюю треть шеи со стороны спины. Часть животных оставляли совместно с инфицированными для изучения контактной передачи.

Оценку клинических признаков и патологоанатомических изменений проводили согласно «Методическим указаниям по оценке клинических признаков и патологоанатомических изменений при экспериментальном заражении вирусом африканской чумы свиней» [47].

Отбор проб от животных. Отбор проб от живых животных проводили с интервалом через 2-5 дней, от павших - в день регистрации падежа. Образцы направляли на серологические (ТФ-ИФА и ИПМ), молекулярно-биологические (ПЦР-РВ) и вирусологические (вирусовыделение) исследования. Пробы представляли собой кровь, лимфоузлы (подчелюстные, брыжеечные и паховые), селезенка, печень, легкие, почки, мышечная и суставная ткани. Кровь отбирали в пробирки с активатором свёртывания с последующим разделением на сгусток и сыворотку.

Серологические методы. Обнаружение специфических антител к вирусу АЧС в пробах выявляли методами:

а) ТФ-ИФА с использованием коммерческих тест-систем «INgezim PPA Compac» [95] и «ID Screen, African Swine Fever Indirect, Screening Test» согласно инструкциям производителя [72];

б) ИБ согласно «Методическим рекомендациям по выявлению антител к вирусу африканской чумы свиней методом иммуноблоттинга» (р-к ФГБУ «ВНИИЗЖ») [44] и стандартной операционной процедуре МЭБ [102];

в) иммунохроматографическим с помощью серологического экспресс-теста на АЧС «GDX70-2 Herdscreen ASF Antibody» согласно инструкции производителя [66];

г) иммунопероксидазным в соответствии с методикой описанной в стандартной операционной процедуре МЭБ [103] с собственными модификациями и/или согласно разработанным «Методическим рекомендациям по выявлению антител к вирусу африканской чумы свиней иммунопероксидазным методом» [43].

Обнаружение генома вируса АЧС. Наличие генома возбудителя в пробах выявляли методом ПЦР-РВ с использованием тест-систем «АЧС» для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции [30] и «Тест-системы для выявления генома вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [29] согласно прилагаемым инструкциям, и согласно «Методическим указаниям по выявлению генома вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» (р-к ФГБУ «ВНИИЗЖ») [46].

Приготовление культур клеток. Первичные культуры клеток свиней получали согласно ГОСТ 28573-90 и методическим рекомендациям ФГБУ «ВНИИЗЖ» [21, 41, 42].

Культивирование вируса. Для накопления вируса АЧС с целью последующего выделения вирусной ДНК и определения ее нуклеотидной последовательности выполняли пассирование вируса на КК КМС [41].

Выделение вируса АЧС проводили согласно «Методическим рекомендациям по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток костного мозга свиней» или «Методическим рекомендациям по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток селезенки свиней». Для заражения культуры клеток использовали 10% суспензию измельчённой селезёнки в физиологическом растворе [41, 42].

Определение титра вируса АЧС проводили по способу, описанному de Leon (2013) и соавт. [99] и согласно методу, описанному Мазлум А. и соавт. (2018) и др. [50].

Секвенирование.

Полногеномное секвенирование. Геномную последовательность ДНК (гДНК) изолятов вируса АЧС экстрагировали фенол-хлороформным методом, как описано Szpara и соавт. в 2011 г. с некоторыми изменениями [159]. Так, каждый вирус выращивали на культуре клеток СС в шести колбах Т-25 в течение трех дней, после появления гемадсорбции клетки собирали центрифугированием при 3000 х g в течение 30 минут при 4°C. Полученный осадок ресуспендировали в холодном отфильтрованном фосфатно-буферном растворе (ФБР) (Sigma, Merck, Дармштадт, Германия) и замораживали при минус 70°C с повторным циклом замораживания и оттаивания при минус 70°C и 37°C для лизирования клеток. Клеточный детрит удаляли центрифугированием при 3000g в течение 10 мин при 4°C, а супернатант переносили в новую пробирку. Супернатант обрабатывали 0,25 ед. / мкл ДН^е1 (Евроген, Москва, Российская Федерация) и 20 мкг / мл РНК-азы А (Евроген) и инкубировали в течение одного часа при 37°C с последующим добавлением протеазы из Streptomyces griseus (Sigma) до конечной концентрации 10 Ед/мл. Смесь центрифугировали на 30% сахарозе при 15 890g в течение 30 мин при 4°C, а осадок ресуспендировали в 300 мкл ФБР. Вирусный капсид лизировали добавлением NaCl (конечная концентрация 1M), 200 мкг/мл протеиназы K (Sigma) и раствора додецилсульфата натрия (SDS) (конечная концентрация 1%) и инкубировали в течение 1 ч при 56°C, затем дважды экстрагировали фенол-хлороформом. После центрифугирования при 7000g в течение 3 мин собирали

верхний слой и к 200 мкл полученного раствора добавляли 10 мкл 3M NaAc (pH 5,5) и 2 объема ледяного (100%) этанола. Смесь осторожно переворачивали и инкубировали при минус 70°C в течение трех часов с последующим центрифугированием при 12000g в течение 30 мин при 4°C. Осадок гДНК промывали 70% этанолом и ресуспендировали в 50 мкл буфера ТЕ. Библиотеку секвенирования создавали для каждого образца с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК Nextera XT (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Секвенирование нового поколения (NGS) выполняли с использованием набора реагентов MiSeq v2 с 2*250 п.н. парном секвенировании на настольном секвенаторе MiSeq (Illumina, США). Для каждого образца получили от 1 652 460 до 2 220 188 считываний. Затем определяли качество считываний, а также удаляли считывания низкого качества с помощью CLC Genomics Workbench v9 (Qiagen, www.clcbio.com). Для сборки, сопоставляли изучаемый геном с эталонным геномом штамма «ASFV / Georgia 2007/1» (FR682468.2) с использованием CLC Genomics Workbench v9. Обрезанные риды дополнительно сопоставляли с соответствующими вновь собранными вирусными геномами со средней глубиной охвата 45 раз с использованием CLC Genomics Workbench v9.

Открытые рамки считывания (ORF) предсказаны с использованием программного обеспечения GATU.

Секвенирование по Ф. Сенгеру. Выделение изолятов вируса АЧС проводили методом 3 последовательных пассажей на первичной культуре клеток КМС с учетом репродукции возбудителя в РГАд. Накопление ампликонов проводили методом ПЦР с электрофоретической детекцией в 1 %-ном агарозном геле. Экстракцию ДНК из геля проводили с использованием набора «Wizard SV Gel and RCR Clean-up System» (Promega, США). После чего проводили секвенирование фрагментов генов по методу Ф. Сенгера.

Филогенетический анализ и анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Последовательности генов использовали для генерации выравнивания, обнаружения SNP и определения филогенетического родства изолятов.

Выравнивание последовательностей и обнаружение SNP выполняли с использованием CLC Genomics Workbench v.9.

Филогенетический анализ последовательностей генов выполняли путем создания дерева максимального правдоподобия с 1000 итерациями начальной загрузки в рамках общей модели обратимой во времени (GTR, G + I = 4) в Mega X [137, 166].

Эпизоотологические данные. Данные об эпизоотической ситуации получали из официальных источников (МЭБ, ИАЦ ФГБУ «ВНИИЗЖ»). Информация об опыте и анализе эпизоотической ситуации в других странах и регионах России получена из открытых источников.

Статистическая обработка результатов включала расчеты средних арифметических значений и доверительного интервала (ДИ) (по способу Вальда с коррекцией по Агрести-Коуллу [155]). Вычисления эволюционных дистанций проводили c помощью программ MEGA 5.05., обработку результатов, и построение графиков с использованием пакетов прикладных программ Statistica (http://statsoft.ru/), GraphPad Prism 8.0. (https://www.graphpad.com/) и Microsoft Excel (https://www.microsoft.com/ru-ru/) [10, 68, 73, 155].

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Определение серопревалентности АЧС на территории РФ

На первом этапе изучения серопревалентности необходимо изучить возможность проведения исследований тех или иных образцов доступными методами.

3.1.1 Изучение влияния условий хранения сывороток крови свиней на выявление антител к вирусу АЧС методом ИФА

В референтной лаборатории по АЧС проводятся масштабные исследования проб сыворотки крови в рамках ЭМ АЧС с помощью коммерческой тест-системы «INgezim PPA Compac» (Ingenasa, Испания) обладающий специфичностью от 98 до 100%. Однако, для части проб возможно получение ложных результатов, что может быть связано с низким качеством образцов сывороток крови, направляемых на исследования [93]. С целью объяснения возможных причин получаемых результатов и проверки возможности исследования проб сыворотки крови при их хранении в различных условиях и промежутках времени проведена работа по изучению влияния условий хранения сывороток крови свиней на выявление антител к вирусу АЧС методом ИФА.

Подбор образцов для исследования и моделирование условий хранения. В опыте использовали 10 серопозитивных сывороток крови, полученных на 25-26-е сутки после экспериментального заражения свиней вирусом АЧС штамм «ВНИИЗЖ/АЧС-VERO (40)», и 10 серонегативных сывороток, полученных из крови клинически здоровых домашних свиней (СК, Московская обл.). Образцы не имели признаков гемолиза и были получены в соответствии с «Правилами взятия патологического материала, крови, кормов и пересылки их для лабораторного исследования» [99].

Экспериментальные образцы разделили на четыре части и хранили при следующих температурных режимах: хранение при минус 20°С; хранение при 4°С; хранение при комнатной температуре (от 20 до 25°С); многократный цикл

заморозки - оттаивания (ежедневная заморозка при минус 20°С в течение 23 ч с последующим оттаиванием при комнатной температуре в течение часа).

Анализ осуществляли в день начала эксперимента (нулевой день), на 5, 15, 29 и 53-й дни после начала опыта.

Следуя обобщенным рекомендациям по хранению проб сывороток крови для лабораторной диагностики, эталонными значениями считали результаты, полученные при исследовании сывороток, хранящихся в замороженном виде в течение эксперимента.

Проведение исследований экспериментальных образцов и анализ результатов. Результаты исследования образцов представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты исследования проб сыворотки крови методом ТФ-ИФА

Условие хранения Статус сыворотки № сыворотки Среднее значение коэффициента ингибиции (%), (П=2) Результат +/-

0 5 15 29 53

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 17,0 26,4 23,7 22,7 28,9 -

2 16,3 25,1 25,2 20,3 35,4 -

<и ч 3 23,2 20,8 18,2 21,2 22,3 -

Л К и 4 21,6 23,5 21,4 22,8 26,1 -

к ё 5 22,7 26,1 23,3 22,9 27,3 -

1-4 <и К 6 25,5 24,0 28,0 24,1 31,6 -

О Л 7 20,3 22,3 21,1 20,1 19,1 -

и 8 20,5 22,8 23,8 19,7 22,6 -

Цикл заморозка/ оттаивание 9 17,3 20,6 18,1 16,1 20,5 -

10 23,3 23,5 26,5 21,2 32,0 -

11 94,1 88,1 90,5 92,0 90,6 +

12 100,6 96,4 98,0 97,3 96,0 +

<и 3 13 97,1 91,1 92,8 92,7 91,4 +

К и 14 98,3 90,6 91,0 91,8 90,2 +

к £ 15 88,1 93,7 95,0 94,9 92,3 +

СО О и 16 98,3 93,8 93,9 95,0 91,8 +

О Л 17 86,7 85,4 83,8 87,2 85,5 +

и 18 97,0 94,5 94,7 96,8 93,5 +

19 94,8 91,6 94,7 93,5 89,9 +

20 99,8 98,6 99,1 99,3 95,5 +

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 17,0 20,8 19,9 18,8 25,4 -

2 16,3 20,3 21,3 22,7 26,0 -

<и ч 3 23,2 24,0 22,2 24,2 29,4 -

л К ра 4 21,6 20,9 23,2 20,3 33,8 -

0 5 22,7 16,5 20,0 19,8 7,1 -

1-4 <и К 6 25,5 19,5 20,0 21,8 24,4 -

О л 7 20,3 21,1 22,2 23,4 28,7 -

и 8 20,5 20,0 24,4 22,9 35,4 -

Хранение 9 17,3 10,2 11,4 15,8 15,9 -

10 23,3 20,0 25,4 20,1 28,7 -

при минус 20,0°С 11 94,1 89,2 90,9 91,8 89,2 +

12 100,6 96,2 96,2 97,6 94,9 +

<и 3 13 97,1 89,9 91,2 91,7 89,7 +

К ра 14 98,3 89,8 90,5 92,6 90,9 +

В К 15 88,1 93,3 94,2 95,3 92,6 +

СО О и 16 98,3 94,3 95,3 95,8 93,2 +

о л 17 86,7 82,9 80,5 83,0 81,9 +

и 18 97,0 91,2 90,5 92,8 91,3 +

19 94,8 91,6 93,8 94,9 93,1 +

20 99,8 98,2 97,4 98,4 95,3 +

1 17,0 19,8 20,1 10,5 26,6 -

2 16,3 19,9 19,1 11,2 29,8 -

<и ч 3 23,2 12,3 21,2 15,8 16,5 -

Л К ра 4 21,6 19,3 22,3 13,0 23,5 -

К ё 5 22,7 20,2 20,8 11,2 27,4 -

1-н <и К 6 25,5 16,5 19,7 13,4 26,9 -

О л 7 20,3 19,6 20,4 15,7 16,2 -

и 8 20,5 20,5 20,1 14,1 26,1 -

9 17,3 17,0 11,1 4,3 23,6 -

Хранение 10 23,3 17,0 21,5 13,5 25,9 -

при 4,0°С 11 94,1 87,3 89,0 89,3 87,2 +

12 100,6 93,3 95,9 96,8 94,3 +

<и 3 13 97,1 93,5 93,4 90,3 92,0 +

К ра 14 98,3 90,2 90,2 88,6 88,1 +

К н К 15 88,1 93,7 95,0 95,6 92,4 +

СО О и 16 98,3 92,5 95,3 93,8 91,3 +

о л 17 86,7 84,2 81,7 80,3 83,7 +

и 18 97,0 93,1 93,4 94,4 92,8 +

19 94,8 93,1 93,0 94,9 90,8 +

20 99,8 96,2 96,8 97,9 93,5 +

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 17,0 13,1 17,0 19,8 11,2 -

2 16,3 18,8 20,9 20,6 13,0 -

<и ч 3 23,2 19,3 14,0 17,0 19,1 -

Л К и 4 21,6 18,6 19,9 22,1 20,8 -

0 5 22,7 16,6 22,0 21,9 10,2 -

1-4 <и к 6 25,5 19,4 18,1 16,6 15,4 -

о Л 7 20,3 18,7 20,9 17,7 18,9 -

и 8 20,5 18,9 20,3 21,1 19,2 -

9 17,3 10,2 17,2 17,3 6,3 -

Хранение 10 23,3 17,3 22,0 18,0 18,8 -

при 20,0°С 11 94,1 89,1 89,1 90,5 87,5 +

12 100,6 97,9 97,7 98,7 92,6 +

<и 3 13 97,1 91,3 91,2 94,6 88,1 +

К и 14 98,3 88,3 88,4 90,9 85,9 +

в к 15 88,1 95,4 95,2 95,5 92,4 +

СО О и 16 98,3 95,2 95,5 95,8 92,3 +

О Л 17 86,7 81,0 83,4 85,5 79,2 +

и 18 97,0 92,3 95,3 95,7 90,8 +

19 94,8 92,6 93,5 93,7 91,7 +

20 99,8 96,9 97,8 98,7 94,0 +

Примечание: «+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат

Полученные данные демонстрировали, что при изменении коэффициента ингибиции в течение эксперимента статус сывороток в ТФ-ИФА оставался неизменным. Вариация значений могла зависеть от технических условий реализации метода (температура, влажность, длительность хранения набора и т. д.).

Динамика изменения коэффициентов ингибиции серонегативных и серопозитивных образцов отражена на рисунке 7.

Рисунок 7. Динамика изменения коэффициентов ингибиции серонегативных и серопозитивных образцов. Линиями при коэффициентах ингибиции 40 и 50% отмечены границы отрицательного и положительного результатов

Из представленных на рисунке 7 данных, касающихся отрицательных сывороток крови, видно, что:

- среднее значение коэффициента ингибиции в начале эксперимента составило 20,8%;

- для сывороток, хранящихся при минус 20°С, среднее значение коэффициента ингибиции составляло 21,5%, минимальное - 7,1% (53-й день), максимальное -35,4% (53-й день);

- для сывороток, подвергнутых циклу заморозки - оттаивания, среднее значение коэффициента ингибиции составляло 22,8%, минимальное - 16,1% (29-й день), максимальное - 35,4% (53-й день);

- для сывороток, хранящихся при 4°С, среднее значение коэффициента ингибиции составляло 19%, минимальное - 4,3% (29-й день), максимальное - 29,8% (53-й день);

- для сывороток, хранящихся при 20°С, среднее значение составляло 18,3%, минимальное - 6,3% (53-й день), максимальное - 25,5% (нулевой день).

Изменение разницы коэффициентов ингибиции относительно эталонных образцов для отрицательных сывороток крови представлено на рисунке 8.

День

Режим / день 0 5 15 29 53

-•- минус 20°С 0 0 0 0 0

- заморозка/оттаивание 0 4,2 1,9 0,1 0,5

4°С 0 -1,1 -1,4 -8,7 -1,2

-¥- 20°С 0 -2,2 -1,8 -1,8 -10,2

Рисунок 8. Изменение коэффициентов ингибиции серонегативных сывороток крови относительно значений эталонных образцов (хранение при минус 20°С)

Установили, что на протяжении всего исследования коэффициент ингибиции серонегативных сывороток крови, подвергнутых циклу заморозки - оттаивания был выше эталонных значений, но не превышал 4,2%, а в среднем отличался на 1,7%; данный показатель сывороток, хранившихся при 4°С, был ниже эталонных значений, но не превышал 8,7%, а в среднем отличался на 3,1%; коэффициент ингибиции сывороток, хранившихся при 20°С, был ниже эталонных значений, но не превышал 10,2%, а в среднем отличался на 4%.

Исходя из данных, полученных при исследовании серопозитивных сывороток крови свиней (Рисунок 7), видно, что:

- начальное значение коэффициента ингибиции составляло в среднем 95,5%;

- для сывороток, хранящихся при минус 20°С, среднее значение данного показателя составляло 92,8%, минимальное - 80,5% (15-й день), максимальное - 100,6% (нулевой день);

- для сывороток, подвергнутых циклу заморозки - оттаивания, среднее значение коэффициента ингибиции составляло 93,4%, минимальное - 83,8% (15-й день), максимальное - 100,6% (нулевой день);

- для сывороток, хранящихся при 4°С, среднее значение коэффициента ингибиции составляло 92,5%, минимальное - 80,3% (29-й день), максимальное - 100,6% (нулевой день);

- для сывороток, хранящихся при 20°С среднее значение коэффициента ингибиции составляло 92,7%, минимальное - 79,2% (53-й день), максимальное - 100,6% (нулевой день).

Разница коэффициентов ингибиции положительных образцов относительно

сывороток крови, хранящихся при минус 20°С, отражена на рисунке 9. 2.0 -,

День

Режим / день 0 5 15 29 53

минус 20°С 0 0 0 0 0

-■- заморозка/оттаивание 0 0,7 1,3 0,7 0,5

4°С 0 0 0,3 -1,2 -0,6

20°С 0 0,3 0,7 0,6 -1,8

Рисунок 9. Изменение коэффициентов ингибиции серопозитивных сывороток крови относительно эталонных образцов (хранение при минус 20°С)

Как видно из рисунка 9, коэффициент ингибиции серопозитивных сывороток крови, подвергнутых циклу заморозки - оттаивания, на протяжении всего периода исследования был выше эталонных значений, но не превышал 1,3%, а в среднем отличался на 0,8%.

Коэффициент ингибиции сывороток крови, хранившихся при 4°С, в течение 15 дней был выше эталонного значения (максимально - на 0,3%), затем ниже его (максимально - на 1,2%), а в среднем отличался на 0,4%.

Коэффициент ингибиции сывороток крови, хранившихся при 20°С, до 29-го дня был выше значения эталонных образцов (максимально - на 0,7%), а затем ниже на 1,8%, а в среднем отличался на 0,1%.

В группе серопозитивных сывороток крови, хранящихся при 4°С, коэффициент ингибиции для отдельных образцов в течение исследования варьировал в пределах от 4,3 до 23,6%. Однако статус образцов на протяжении всего эксперимента не менялся.

В ходе проведенного моделирования различных режимов хранения экспериментальных сывороток крови свиней, положительных и отрицательных по наличию антител к вирусу АЧС, получены данные об отсутствии изменения их серологического статуса с течением времени.

Несмотря на варьирование показателей коэффициентов ингибиции отрицательных и положительных образцов на протяжении исследуемого периода по отношению к эталонным значениям, в ТФ ИФА получали качественный результат, что говорит об отсутствии или незначительном влиянии использованных условий хранения на результаты исследования. Полученные данные согласуются с результатами других авторов, проводивших аналогичные исследования по выявлению антител к другим возбудителям инфекций. Так, в работах E.J. Neumann и K.N. Bonistalli сывороточные антитела оказались значительно более устойчивыми, чем считалось ранее, а значения оптической плотности были стабильны даже в условиях грубого нарушения температурного режима хранения [96, 143].

Однако методология, примененная в данном исследовании, имеет некоторые ограничения. В работе использовалась тест-система только одного производителя, титр антител в сыворотках не определялся, а также не исследовались слабоположительные пробы.

Следовательно, для определения причины получения ложных результатов необходимо проведение дальнейших исследований и изучение сохранности образцов сывороток крови для исследования на АЧС, учитывая, что биологические образцы, получаемые от животных, не однородны по своему составу, особенно в случае присутствия патогенной микрофлоры.

Таким образом, сыворотки крови домашних свиней, отобранные в соответствии с действующими правилами, возможно хранить в вышеперечисленных условиях до 53 дней (срок наблюдения) при условии их последующего исследования соответствующим набором. Это позволит снизить требования к срокам доставки проб в лабораторию при невозможности их заморозки. Также, в случае необходимости проведения дополнительных исследований, появляется возможность многократного исследования одного и того же образца в течение длительного срока хранения.

Однако, пока не изучено влияние условий хранения на статус сывороток крови при исследовании на АЧС с помощью других наборов и методов (ИБ, ИПМ, ИХА, ИФА с использованием комплексного антигена и др.), общая рекомендация остается прежней - доставлять в лабораторию образцы для исследований в максимально короткие сроки.

3.1.2 Отработка и оптимизация условий постановки ИПМ

Как было сказано выше, лучшим методом для выявления специфических антител к вирусу АЧС, который позволяет исследовать широкий круг видов биологического материала с высокими показателями чувствительности и специфичности, является ИПМ. Таким образом, с целью повышения качества лабораторных исследований было необходимо провести отработку условий постановки ИПМ, которая включала:

- определение оптимального метода получения микропланшетов с инфицированной вирусом АЧС культурой клеток (время инкубации, состав фиксирующего раствора);

- подбор оптимальных параметров постановки реакции (условия блокирования и промывки микропланшетов, время инкубации);

- подбор и определение условий хранения (температурный режим и срок хранения);

- оценку эффективности разработанной методики.

Получение микропланшетов с культурой клеток инфицированной вирусом АЧС. Монослой культуры клеток почки зеленой африканской мартышки (СУ-1) выращенной на 96-луночном планшете инфицировали адаптированным к росту на СУ-1 вирусом АЧС (штамм «АБЕУ/60СУ/2020») (титр вируса не ниже 5,0 ГАдЕ50/см3) и инкубировали при 37,0±2,0°С и 5% СО2 в течение 24, 48 и 72 часов с целью определения оптимального времени инкубации.

Использование планшетов с разными режимами инкубации, при постановке ИПМ с контрольной положительной сывороткой, показало слабое специфическое окрашивание единичных клеток при инкубации в течение 24 ч и интенсивное большинства клеток при 48 ч и 72 ч, соответственно. Однако, при 72-часовом режиме отмечали дезагрегацию части монослоя.

При подборе оптимальных параметров фиксации зараженной КК, использовали растворы ацетона и этилового спирта в концентрациях 20% на 80%, 30% на 70% и 40% на 60%, соответственно, которые добавляли в лунки микропланшета и выдерживали в течение 10±1 мин каждый.

При просмотре полученных фиксированных препаратов установили, что лучший результат получен при использовании раствора, содержащего 30% ацетона и 70% этилового спирта.

Удаляли ацетон и добавляли по 0,1 см3/лунку ФБР, выдерживали на шейкере-инкубаторе в течение 20±2 минут при комнатной температуре (18,0-25,0°С). Содержимое сливали, а затем отмывали по 0,1 см3/лунку ФБР.

Таким образом, в результате экспериментов подобраны оптимальные условия подготовки микропланшетов: выращивание монослоя культуры и её заражение

адаптированным вариантов вируса АЧС с инкубацией 37,0±2,0°С и 5% СО2 в течение 48 часов, фиксация раствором, содержащим 30% ацетона и 70% этилового спирта, остановка реакции 0,1 см3/лунку ФБР в течение 20±2 минут при комнатной температуре (18,0-25,0°С) и повторная отмывка 0,1 см3/лунку ФБР.

Подбор оптимальных условий постановки реакции. При использовании микропланшетов, подвергнутых длительному хранению, их выдерживали для размораживания в течение 30±1 минут при комнатной температуре (18,0-25,0°С). Свежеприготовленные планшеты использовали без предварительной выдержки.

С целью определить оптимальное разведения блокирующего раствора использовали 2%, 5% и 8% растворы обезжиренного сухого молока в ФБР с содержанием 0,05% Твин-20 (Блокирующий раствор). Использование 2% концентрации молока привело к появлению неспецифического окрашивания. Однако при использовании 5% и 8% концентраций существенной разницы в окрашивании лунок тест-планшетов не обнаружено, в связи с чем к использованию выбрана 5% концентрация.

Добавляли блокирующий раствор по 0,1 см3/лунку и инкубировали в течение одного часа при 37,0±2,0°С на шейкере инкубаторе.

Одновременно с этим, разводили исследуемые образцы в соотношении 1:40 (для исследования 5% тканевых гомогенатов делали разведения 1:5, 1:10 и 1:20) в блокирующем растворе с добавлением фетальной сыворотки крови эмбрионов коров (ФС) (до конечной концентрации 2%) и без. Планшеты инкубировали в течение одного часа при 37,0±2,0°С в шейкере инкубаторе.

Инкубация образцов в блокирующем растворе без фетальной сыворотки приводило к неспецифичному окрашиванию клеток, в т.ч. при исследовании отрицательных контрольный сывороток) (Рисунок 10).

Рисунок 10. Неспецифичное окрашивание цитоплазмы инфицированных клеток (увеличение x400)

Примечание: стрелками указано неспецифическое окрашивание инфицированных клеток

В тоже время, использование раствора с ФС позволило избежать неспецифической картины в получаемых результатах.

Затем, определяли оптимальное время инкубации тест-планшетов с исследуемыми образцами. Сливали блокирующий раствор из микропланшета с фиксированной культурой клеток и добавляли (переносили) исследуемые образцы в объеме 0,1 см3 и инкубировали в течение 30, 45 и 60 минут при 37,0±2,0°С в шейкере инкубаторе. Полученные результаты показали, что оптимальным временем явилась инкубация в течение 45 минут, при инкубации в течение 30 минут происходило снижение детектируемого титра антител, а при 60 минутах различия по сравнению с 45 минутами не выявлялись.

Для определения оптимального протокола промывки микропланшетов проводили промывку, добавляя по 0,1 см3/лунку ФБР и выдерживания 5±1 минут при 37,0±2,0°С в шейкере инкубаторе и повторяли операцию 2, 3 и 4 раза. При снятии результатов обнаружили, что использование двукратной промывки приводит к неспецифическому окрашиванию лунок тест-планшетов, а трех и четырехкратная показывают сравнимый результат. С целью экономии времени и реагентов выбрано использование трехкратной операции промывки.

Добавляли по 0,1 см3/лунку раствора протеина А разведённого до

концентрации 1:5000 в блокирующем растворе и инкубировали 45±1 минут при 37,0±2,0°С в шейкере инкубаторе.

Осуществляли процедуру промывки по вышеописанному протоколу.

Готовили субстратный раствор на основе 3-аминоэтил-9-карбазола (АЕС), который готовили непосредственно перед применением путём смешивания 0,3 см3 раствора АЕС с 5,0 см3 ацетатного буфера и 0,005 см3 30%-перекиси водорода (из расчёта на один 96 луночный микропланшет) и добавляли в объеме 0,05 см3/лунку и инкубировали 10-15 минут при температуре 18,0-25,0°С.

Для подбора оптимального протокола отмывки проводили одно- и дву- и трехкратную отмывку лунок добавляя по 0,1 см3 ФБР в каждую, последний объем раствора оставляли в планшете. Использование однократной отмывки приводило к окрашиванию раствора, что мешает «снятию» результатов. Дву- и трёхкратная отмывка устраняет недостаток окрашивания раствора в лунках, в связи с чем нами выбран протокол двукратной отмывки.

Учёт результатов. В положительных образцах наблюдали красное окрашивание цитоплазмы инфицированных клеток в результате образования иммунных комплексов антиген-антитело и их взаимодействия с коньюгатом и субстратным раствором (Рисунок 11).

Рисунок 11. Окрашивание цитоплазмы инфицированных клеток (А - цветная и Б -черно-белая фотографии) (увеличение х400)

Примечание: стрелками указана окрашенная цитоплазма инфицированных клеток в результате образования иммунных комплексов антиген-антитело и их взаимодействия с вторичными коньюгированными антителами и субстратным раствором

В отрицательных образцах красное окрашивание цитоплазмы инфицированных клеток не наблюдали (Рисунок 12).

Рисунок 12. Отсутствие окрашивания в отрицательных образцах (увеличение х400) Примечание - стрелками указаны инфицированные вирусом АЧС клетки (отсутствие окрашивания)

Реакция считалась достоверной только в случае наличия специфического окрашивания положительных контрольных образцов и при его отсутствии у отрицательных контрольных образцов.

Установили, что при проведении ИПМ оптимально использовать следующие параметры: с целью блокирования свободных сайтов сорбции - инкубация планшетов в течение 60 мин с блокирующим раствором, содержащим 0,05% Твин-20 и 5% молока сухого обезжиренного в ФБР; инкубация тестируемых образцов в разведение 1:40 (для исследования 5% тканевых гомогенатов делают разведения 1:5, 1:10 и 1:20) в течение 60 минут в блокирующем растворе, содержащем 2% ФС; инкубация подготовленных образцов в течение 45 минут при 37,0°С; трехкратная промывка лунок после инкубации сывороток и конъюгата протеина А в разведении - 1:5000 в тест-планшетах; инкубация микропланшетов в течение 10-15 минут при 18-25 °С с субстратным раствором; двукратная отмывка для остановки реакции.

Подбор и определение условий хранения. С целью оценки сохранности тест-планшетов их помещали на хранение при различных температурных режимах (минус 18,0°С, минус 40,0°С и минус 80,0°С). Проводили их исследования на 0-й, 30-й, 90-й, 180-й дни, через один и полтора года после изготовления. При титровании контрольных образцов с помощью микропланшетов, хранившихся до

одного года включительно получили сопоставимые результаты обнаруженных титров. Исследование микропланшетов через полтора года после изготовления показало снижение выявленных титров на один порядок. Следовательно, допускается хранение планшетов при температуре от минус 18,0°С до минус 80,0°С не более одного года.

Таким образом, оптимальными условиями хранения изготовленных тест-планшетов является их хранение при температуре от минус 18,0°С до минус 80,0°С в течение не более 1 года.

Оценка эффективности разработанной методики. Оценку эффективности проведения ИПМ диагностики провели с помощью исследования сывороток крови, полученных от двух инфицированных на разные д.п.з. животных и сравнения полученных результатов с коммерческим ТФ-ИФА «ГNgezim РРА Сотрас», а также образцов, полученных для участия в МСИ референтных лабораторий по АЧС ЕС (из-ль CISA-INIA, Испания).

При сравнении результатов исследования сывороток крови от экспериментально зараженных животных в ИПМ и в ТФ-ИФА отметили, что метод ИПМ позволяет выявлять специфические антитела к вирусу АЧС в более ранние сроки (начиная с седьмого д.п.з.), чем их же исследование в ТФ-ИФА (Таблица 5).

Таблица 5 - Сравнение динамики выявления специфических антител у

инфицированных АЧС животных в ИПМ и ТФ-ИФА

п=3

Свинья №3, инфицированная изолятом вируса АЧС «Одинцово 02/14»

д.п.з. 3 7 9 12 15 18 21

ИПМ - + + + + + +

ТФ-ИФА - - + + + + +

Свинья №8, инфицированная изолятом вируса АЧС «Одинцово 02/14»

д.п.з. 3 7 9 12 15 18 21

ИПМ - - + + + + +

ТФ-ИФА - - - + + + +

Примечание: символами «+» и «-» отмечены положительные и отрицательные результаты, соответственно

Результаты, полученные при исследовании образцов МСИ (из-ль СКА-ШЬЛ, Испания), полностью совпали с их приписанными значениями.

Таким образом, установили, что разработанный метод позволяет определить наличие специфических антител в образцах сыворотки крови инфицированных животных на более ранние д.п.з., чем «INgezim РРА Сотрас», а также позволил получить сопоставимые результаты с референтной лабораторией по АЧС ЕС проб МСИ.

Определение основных валидационных характеристик ИПМ.

Валидность (достоверность) результатов разработанного ИПМ (по выявлению специфических антител к вирусу АЧС) оценивали по показателям: относительная чувствительность и специфичность, положительная и отрицательная прогностические значимости, сходимость и воспроизводимость результатов.

Чувствительность и специфичность оценивали по количеству истинно положительных и истинно отрицательных результатов исследования (при использовании разработанного ИПМ) проб сывороток крови, содержащих или не содержащих антитела к вирусу АЧС (по данным ИБ) (Таблица 6). Таблица 6 - Определение чувствительности и специфичности ИПМ в сравнении с

ИБ

п=3

ИПМ ^^^^^^ Положительные Отрицательные Всего

Положительные 123 4 127

Отрицательные 0 321 321

Всего 123 325 448

Чувствительность 100% (при 95% ДИ - от 97.05% до 100%)

Специфичность 96,85% (96,92% - 99,76%)

Из результатов, представленных в таблице 6, видно, что из 123 положительных, по данным ИБ, сывороток крови все из них определены как положительные ИПМ (диагностическая чувствительность ИПМ в сравнении с ИБ составила 100% (при 95% ДИ - от 97.05% до 100%)). Из 325 отрицательных в ИБ

сывороток крови четыре из них определены как положительные ИПМ (диагностическая специфичность метода составила 96,85% (96,92% - 99,76%)). При этом, учитывая то, что сыворотки отрицательные в ИБ и положительные в ИПМ, получены от инфицированных АЧС животных, специфичность ИПМ при оценке истинно положительных значений должна быть выше метода ИБ. Позитивная прогностическая значимость составила - 96,85%, в то время как отрицательная - 100%.

Оценку показателя сходимости проводили при анализе результатов, полученных одним специалистом в течение одного рабочего дня при исследовании одного положительного образца (на наличие специфических антител к вирусу АЧС) в десяти повторностях (Таблица 7).

Таблица 7 - Определение сходимости ИПМ при выявлении специфических

антител к вирусу АЧС

Проба Результат

№ повторности

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ПК (+) + + + + + + + + + +

Примечание: «+» - положительный результат (обнаружены специфических антител к вирусу АЧС)

Из данных таблицы 7 видно, что при исследовании одного образца в 10 повторностях ИПМ - во всех выявлены специфические антитела к вирусу АЧС.

Оценку воспроизводимости результатов измерений проводили посредством исследования 10 положительных и 10 отрицательных контрольных образцов двумя специалистами в течение двух дней с использованием одной и той же серии реагентов и реактивов в десяти повторностях. При анализе результатов исследования вышеназванных образцов отметили их 100%-ое соответствие приписанным значениям.

Таким образом, установили, что разработанный ИПМ позволяет с высокой достоверностью определять наличие специфических антител к вирусу АЧС в образцах сыворотки крови. Сходимость и воспроизводимость результатов реакции

позволяет использовать данный метод для диагностических и научных исследований.

Комиссионные испытания метода. В рамках проведения комиссионных испытаний исследовали заведомо положительные и отрицательные в ТФ-ИФА (с исп. тест-системы «INgezim РРА Сотрас») образцы сыворотки крови свиней. Результаты опыта представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Результаты исследований проб сывороток крови свиней ИПМ

п=3

№ пробы Характеристика образцов Результат в ТФ-ИФА Результат в ИПМ Совпадение результатов, +/-

1 Референтная положительная сыворотка МЭБ (изг. СКА-ШЬА) полож. полож. +

2 Сыворотка после экспериментального заражения вирусом АЧС изолят «Одинцово», поросёнок №3, 21 д.п.з. полож. полож. +

3 Сыворотка после экспериментального заражения вирусом АЧС изолят «Одинцово», поросёнок №8, 21 д.п.з. полож. полож. +

4 Сыворотка после экспериментального заражения вирусом АЧС изолят Антоново, 64 д.п.з. полож. полож. +

5 Референтная отрицательная сыворотка МЭБ (изг. СКА-ШЬА) отриц. отриц. +

6 Сыворотка специфическая к БА отриц. отриц. +

7 Сыворотка специфическая к ГС отриц. отриц. +

8 Сыворотка специфическая к КЧС отриц. отриц. +

9 Сыворотка специфическая к РРСС отриц. отриц. +

10 Сыворотка специфическая к ПВИС отриц. отриц. +

Из указанных в таблице 8 данных следует, что разработанный ИПМ позволяет выявлять специфические антитела в образцах сыворотки крови, содержащих антитела к вирусу АЧС, и отрицательные результаты с серонегативными сыворотками крови (в т.ч. содержащими антитела к гетерологичным вирусным инфекциям свиней).

Таким образом, в ходе комиссионных испытаний все образцы сыворотки крови были правильно идентифицированы, результаты разработанного ИПМ коррелировали с результатами ТФ-ИФА. Разработанные методические рекомендации были утверждены Ученым Советом ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол №2 09 от 19 ноября 2020 г.) (Приложение 3).

3.1.3 Использование альтернативных методов отбора проб и диагностики

АЧС

Для проведения эффективных мероприятий по контролю за АЧС необходимо предусмотреть использование неинвазивного отбора проб, большего разнообразия используемых видов образцов и оперативной высокочувствительной и специфичной их диагностики. С целью решения поставленных задач возможно использование альтернативных методов, как исследования (напр. ИХА), так и отбора (напр. зонд-тампоны и фильтровальную бумагу (ФБ)) образцов биологического материала от домашних и диких свиней, и/или продукции свиноводства.

3.1.3.1 Оценка возможности использования фильтровальной бумаги для

отбора проб крови

Оценку возможности использования ФБ для отбора проб крови проводили во время проведения биопробы на диких кабанах и домашних свиньях. Положительные образцы получали от животных, заражённых изолятами вируса АЧС «Шихобалово 10/13», «Антоново 07/14» и «Собинка 07/15». Образцы крови отбирали при взятии крови из грудного сосудистого сплетения (с помощью вакуумной пробирки и игл для взятия крови), скарификации ушных вен и во время патологоанатомического вскрытия, используя несвернувшуюся кровь, вытекающую при рассечении сосудов в процессе частичной эвисцерации (посредством промокания фильтровальной бумагой крови). От домашних свиней отбирали парные пробы крови в пробирки с активатором свёртывания и на фильтровальную бумагу.

ФБ подсушивали при комнатной температуре в условиях вивария и помещали в отдельные пакеты с застёжкой. Для пропитывания 1,0 см2 ФБ требовалось около 0,5 см3 крови. Иммуноферментный анализ проводили через три дня после отбора проб с использованием тест-системы «INgezim РРА Сотрас» и последующем подтверждением в ИБ <^ОР/С^АМ^/Ш/1».

Исследовали различные методы использования ФБ. В первом случае ФБ помещали в буфер для образца в объёме 5,0 см3 на 5,0 см2 площади ФБ, что является сопоставимым с соотношением, прописанным в инструкции к набору для сыворотки, и выдерживали при комнатной температуре в течении пяти минут для элюции. Полученный элюат вносили в объёме 0,1 см3 на лунку в качестве исследуемых образцов.

Во втором случае ФБ, помещённую в буфер для образца, выдерживали три минуты в гомогенизаторе при активном перемешивании. Перед внесением в лунки микропланшета элюат центрифугировали для осаждения форменных элементов крови и частиц ФБ в течение трех минут при 1000 g.

В третьем случае из сухой ФБ вырезали окружности диаметром ~3 мм и помещали в лунки микропланшета с внесённым буфером. По данным Помеловой и др., в течение одного часа из диска диаметром ~3 мм помещённого в лунку сенсибилизированного микропланшета экстрагируется более 90% антител [71].

Для достоверного сравнения методов с использованием ФБ и классического, с использованием сыворотки, необходимо сравнивать парные пробы крови, нанесённой на ФБ, и сыворотки, полученной от живых животных. Однако в нашем опыте из-за высокой вирулентности вируса, приводящей к быстрой гибели, у животных не успевали выработаться антитела. В пробах крови, отобранных за два или три дня до гибели (6-12 сутки после заражения, согласно графику отбора проб один раз в три дня), антител в сыворотке обнаружить не удалось. Поэтому исследования крови, нанесённой на ФБ во время вскрытия, проводили в ТФ-ИФА и сравнивали с результатами ИБ, так как данный метод является высокоспецифичным и высокочувствительным.

При сравнении результатов ТФ-ИФА для сыворотки крови, полученной от зараженных домашних свиней и для крови, отобранной на ФБ при скарификации ушных вен, чувствительность последнего составила 88,9% (при 95% ДИ - от 65,3% до 98,6%, специфичность - 90,6% (79,3% - 96,9%).

Использование вырезанных по диаметру лунок кругов фильтровальной бумаги для помещения непосредственно в лунку микропланшета с буфером показало низкую чувствительность в данном наборе. Вероятно, этот метод можно рекомендовать только для использования в системах, допускающих высокое разведение образцов либо использующих усилители окрашивания. Метод без центрифугирования показал большое количество ложноположительных результатов. Лучшую чувствительность и специфичность показал метод с гомогенизацией и центрифугированием образца (результаты представлены в таблице 9).

Таблица 9 - Сравнение чувствительности и специфичности ТФ-ИФА и ИБ при

исследовании сыворотки и крови, нанесенной на ФБ

п=3

ТФ-ИФА ИБ

Образец Сыворотка крови

крови на ФБ Пол. Отр. Всего Пол. Отр. Всего

Пол. 16 5 21 3 1 4

Отр. 2 48 50 0 4 4

Всего 18 53 71 3 5 8

При рассмотрении результатов, представленных в таблице 9 видно, что использование ФБ приводит к появлению, как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. При сравнении использования ФБ в методах иммуноблоттинга и ТФ-ИФА установили, один ложноположительный результат, полученный в ТФ-ИФА.

Результаты эксперимента согласуются с результатами полученными S. В1оте и соавт. [87] при исследовании образцов на фильтровальной бумаге. В указанной работе также наблюдалось незначительное снижение чувствительности. При этом

авторы заключили, что метод отбора крови на ФБ является подходящим методом для сбора и хранения образцов крови. В текущих условиях, когда практически не проводится исследования на обнаружение антител к вирусу АЧС в образцах от дикого кабана, применение методов упрощающих процедуру отбора проб от диких животных, даже с учётом некоторого снижения чувствительности, позволит собирать ценную информацию о динамике распространения АЧС, поэтому нами была апробирована возможность выявления антител с использованием более чувствительного иммунопероксидазного метода.

3.1.3.2 Оценка возможности использования зонд-тампонов для отбора проб

крови

Для сравнения способов отбора крови использовали ИПМ и ТФ-ИФА. Пробы отбирали параллельно. Образцы представляли собой кровь, нанесенную на зонд-тампоны, взятую при скарификации ушных вен и сыворотку крови от животных, заражённых вирусом АЧС (изолят «АЧС/ВНИИЗЖ/^-1/60») на 10 и 31 д.п.з.

Рабочую часть зонд-тампона срезали и помещали в пробирки типа эппендорф, с последующим добавлением 1,0 см3 ФБР и выдерживали в течение пяти минут при 20-25°С для элюции. Сыворотку крови исследовали в ТФ-ИФА и ИПМ, полученный элюат только в ИПМ. Результаты исследований представлены в таблице 10.

Таблица 10 - Сравнение результатов при использовании сыворотки в ИФА,

тампон-зондов и сыворотки в ИПМ

п=3

Д.п.з. ИФА (сыворотка крови) ИПМ (тампон-зонды) ИПМ (сыворотка крови)

31 + 1:20 1:320

31 + 1:1280 1:20480

31 + 1:1280 1:10240

31 + 1:80 1:5160

31 + 1:160 1:40960