Усовершенствование методов получения антигена вируса африканской чумы свиней для серологических исследований тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Шарыпова Дарья Викторовна

• Шарыпова Дарья Викторовна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Шарыпова Дарья Викторовна

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Историческая справка

2.2. Эпизоотология африканской чумы свиней и эпизоотическая ситуация в РФ

2.3 Структура вириона

2.4 Свойства и функции основных диагностически значимых белков вируса АЧС

2.5 Культивирование вируса АЧС

2.6 Серологические методы диагностики АЧС

2.7 Экспресс-диагностика при АЧС

2.8 Заключение по обзору литературы

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы

3.2 Методы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Изучение репродукционных свойств вируса АЧС изолята «Одинцово 02/14» в первичных культурах клеток

4.2 Адаптация вируса АЧС к перевиваемой культуре клеток и изучение его культурально-биологических свойств

4.2.1 Обоснование подбора изолята для адаптации вируса

4.2.2 Обоснование подбора культуры клеток. Адаптация вируса

4.3 Изучение биологических свойств адаптированного штамма вируса

4.4 Получение типоспецифической гипериммунной сыворотки крови

4.5 Определение сероиммунотиповой принадлежности штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1»

4.6 Определение генетической принадлежности штамма

«АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» при нуклеотидном секвенировании

2

4.7 Получение антигена на основе вируса АЧС штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1»

4.8 Использование культурального антигена для постановки иммуноблоттинга. Отработка и оптимизация условий постановки реакции

4.8.1 Определение рабочего разведения цитоплазматического растворимого вирусного антигена

4.8.2 Подбор режима и условий проведения электрофореза

4.8.3 Определение режима электропереноса белков на нитроцеллюлозную мембрану

4.8.4 Подбор оптимальных параметров постановки реакции иммуноблоттинга

4.9 Отработка условий изготовления иммунострипов

4.10 Определение основных валидационных характеристик метода

иммуноблоттинга

4.11. Комиссионные испытания метода

4.12 Использование штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» и полученного на его основе культурального антигена вируса АЧС для серологических тестов

4.12.1 Реакция непрямой иммунофлуоресценции

4.12.2 Иммунопероксидазный монослойный анализ

4.12.3 Реакция агглютинации латекса

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1 Выводы

5.2 Практические предложения

5.3 Перспективы дальнейшей разработки темы

6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

8. ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Усовершенствование методов получения антигена вируса африканской чумы свиней для серологических исследований»

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы. В рамках глобального развития животноводства ключевую роль в качестве источника животного белка играет свиноводческий сектор. Благодаря быстрому росту свиней, эффективной конверсии корма, быстрому обороту и плодовитости, свинина стала важнейшим пищевым продуктом на мировом рынке. По данным ФАО свинина является наиболее потребляемым видом мяса наземных животных. На долю ее потребления в мире приходится свыше 37 процентов.

В настоящее время особо остро обозначена проблема распространения в мире, и, в частности, на территории Российской Федерации (РФ) такой опасной болезни животных, как африканская чума свиней (АЧС). Текущая эпизоотическая обстановка по АЧС в РФ может квалифицироваться как критическая.

Африканская чума свиней - вирусная болезнь, поражающая диких кабанов и домашних свиней всех пород и возрастов. Болезнь может протекать сверхостро, остро, подостро, а также в хронической и инаппарантной формах. Уровень смертности при АЧС может достигать 100%.

Значительный экономический ущерб, складывающийся из прямых потерь, строгих ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий и ограничений в международной торговле АЧС наносит свиноводству и сельскому хозяйству страны, в целом [65]. Так как эффективных мер специфической профилактики при АЧС на настоящий момент не разработано, то наиболее эффективными и результативными способами контроля за распространением болезни являются ранняя диагностика, стемпинг-аут в очагах инфекции, строгое соблюдение ветеринарно-санитарных правил и введение карантина на неблагополучных по АЧС территориях. [21, 22, 61, 109].

В России вспышки АЧС регистрируют на протяжении уже более 10

лет. Заболевание получило значительное распространение во многих

4

регионах страны. Значимым фактором, синэргизирующим становление этой болезни, является природноочаговый потенциал АЧС, в том числе в связи с высокой восприимчивостью диких европейских кабанов. Возникновение в 2007 г. и распространение АЧС на территории Евразии (Кавказский регион, включая ЮФО РФ) в домашнем свиноводстве с вовлечением в эпизоотический процесс диких европейских свиней обусловило особое значение последних как потенциальный природный резервуар инфекции.

Экспансия АЧС с поражением популяций как домашних, так и диких свиней, закрепление эндемичности в регионах и случаи выявления серопозитивности к вирусу АЧС у диких кабанов могут свидетельствовать об изменениях свойств возбудителя. Особенность вируса АЧС заключается в том, что переболевшие свиньи, как правило, пожизненно остаются вирусоносителями, появление антител к вирусу детектируется рано и может сохраняться на протяжении длительного времени [7].

Ввиду отсутствия эффективных вакцин, наличие специфических антител к данному вирусу в сыворотке крови животного однозначно указывает на его инфицирование [45], а животные-вирусоносители могут являться источником инфекции. По наличию проб, содержащих антитела к вирусу АЧС, можно судить о количестве хронических и субклинических случаев болезни.

Таким образом, ввиду возможности длительной персистенции вируса в организме свиней без проявления клинических признаков болезни, выявление антител к вирусу АЧС имеет большое эпизоотологическое значение. У отдельных изолятов, выделенных на территориях России (с 2012 г.), Польши (с 2014 г.), Прибалтики (с 2014 г.) отмечено изменение биологических и генетических свойств, что дает основание полагать о возможности качественного сдвига патогенности вируса в сторону снижения вирулентности [78, 93, 131].

Благодаря высокой чувствительности и специфичности,

серологические методы являются базисом лабораторной диагностики АЧС и

5

обязательно используются в программах контроля за рапространением и ликвидации болезни. Их широкое применение связано с высокой технологичностью, простотой постановки, сравнительно низкой стоимостью анализа. Кроме того, для проведения серологических исследований не требуется специальных условий и дорогостоящего оборудования. Принципиально важной задачей в этом направлении является получение высокоспецифичных антигенов, стандартизированных по своим диагностическим свойствам, а также простых и технологичных в получении.

При исследовании образцов сывороток крови на наличие антител к вирусу АЧС иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблоттинг (ИБ) обладают высокой чувствительностью и специфичностью. В то же время, существенным недостатком ИФА является получение ложноположительных и сомнительных результатов, преимущественно из-за несоблюдения условий хранения сывороток, поэтому для подтверждения результата ИФА в сомнительных случаях, МЭБ рекомендует использовать ИБ [45].

Методы ТФ ИФА и ИБ, рекомендованные МЭБ, проводятся на основе цитоплазматического растворимого антигена, который получают из инфицированной вирусом АЧС линии клеток почки обезьяны. Испытания показали, что чувствительность и специфичность данного антигена достигает максимальных значений [45], благодаря максимально близкому составу и наибольшему охвату вирусспецифических белков, содержащихся в препарате антигена. Это требование относится и к референс-методам, таким как ИБ, используемым для подтверждения положительных и сомнительных результатов, так как необходимо выявлять антитела к как можно большему спектру специфических протеинов вируса.

На сегодняшний день не разработано отечественных наборов и тест-систем на основе культурального антигена, рекомендованного МЭБ для применения в серологической диагностике АЧС.

Кроме того, актуальной является задача и по разработке и

усовершенствованию методов экспресс-диагностики, которые позволяли бы

6

получать результаты реакции в достаточно сжатые сроки с применением минимального оснащения и затрат.

Ввиду вышеизложенного, работа по усовершенствованию методов получения антигена вируса африканской чумы свиней для разработки отечественных диагностических наборов и проведения серологических исследований является актуальной.

1.2. Степень разработанности проблемы

В последние годы в странах ЕС отмечен существенный рост выявления серопревалентности среди диких кабанов. Так, при исследовании изолята LT14 / 1490 ASF, вызвавшего первую вспышку АЧС в Литве у дикого кабана в январе 2014 года, в ходе экспериментального заражения наряду с обнаружением ДНК вируса АЧС в крови животных, детектировалось также наличие антител у 33% свиней [87].

При изучении вспышек болезни среди диких кабанов в Эстонии, в северо-восточном районе страны было отмечено локальное ослабление вирулентности циркулирующего вируса, приведшее к уменьшению летальности и проявлению сероконверсии. При воспроизведении болезни с использованием выделенного в лабораторных условиях изолята, установлены случаи выживания животных и обнаружения высокого уровня антител в их организме [81, 68].

Для скрининговой серологической диагностики на сегодняшний день разработаны и широко используются различные коммерческие наборы и тест-системы, такие как конкурентный ТФ ИФА INGEZIM PPA COMPAC (1.1.PPA.K3) (INGENAZA, Испания) на основе белка vp72 вируса АЧС и моноклональных антител, полученных к тому же вирусному белку; тест-система ELISA ID-VET (ID-VET, Франция), которая основана на использовании сразу трех рекомбинантных протеинов вируса: р30, р72 и р62; непрямой вариант ТФ ИФА SVANOVIR® ASFV-Ab assay (Boehringer Ingelheim Svanova, Швеция), на основе рекомбинантного антигена р30 и др.

Для постановки иммуноблоттинга в ряде лабораторий применяют рекомендованный МЭБ коммерческий набор ASF-OIE-IB, выпускаемый Европейской референс-лабораторией по АЧС (ЕШЬ-АЗБ) (С18А-Ш1А, Мадрид, Испания), иммунострипы в котором изготавливаются с использованием полуочищенного цитоплазматического растворимого вирусного антигена АЧС.

В 2018 г. в «ФИЦВиМ» проведены испытания и выпущены 5 экспериментальных серий «Тест-системы для серодиагностики африканской чумы свиней методом иммуноблоттинга» на основе рекомбинантного р30.

Отечественных тест-систем на основе комплекса специфических белков вируса АЧС до настоящего времени не разработано. Кроме того, в связи с отсутствием возможности получения стандартизированного вируссодержащего сырья, неоправданно мало внимания, в целом, уделяется применению культурального вирусного антигена для серодиагностики АЧС.

1.3 Цели и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось усовершенствование методов получения высокоспецифичного антигена вируса АЧС, основанных на разработке технологических подходов при его накоплении и очистке, а также изучение возможности использования его в диагностических серологических тестах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) подобрать изолят вируса АЧС и провести его адаптацию к перевиваемой культуре клеток, изучить культурально-биологические свойства адаптированного штамма;

2) подобрать и оптимизировать условия получения культурального антигена вируса АЧС на основе полученного адаптированного штамма вируса;

3) отработать условия изготовления иммунострипов с использованием культурального антигена и разработать методику постановки

иммуноблоттинга для выявления антител к вирусу АЧС, провести оценку чувствительности и специфичности метода;

4) применить адаптированный штамм вируса АЧС и антиген, полученный на его основе, для постановки серологических реакций: непрямой иммунофлуоресценции, иммунопероксидазный монослойный анализ и латекс-агглютинация.

1.4. Научная новизна результатов.

В ходе работы адаптирован к росту в перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышки СУ-1 штамм «8 №2 Одинцово 02/14» вируса африканской чумы свиней. Изучены основные культуральные и биологические свойства вируса полученного штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1».

В результате проведения биологической пробы на поросятах определены основные биологические свойства адаптированного штамма вируса «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1». В ходе исследований установлено, что адаптация вируса посредством последовательных пассажей в культуре клеток СУ-1 привела к снижению летальности для экспериментальных животных до 37,5 %.

Получен и депонирован в КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» адаптированный штамм вируса АЧС - «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1», с измененными биологическими свойствами (характер гемадсорбции, вирулентность для свиней), прошедший 26 последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток СУ-1.

На основе использования вышеуказанного штамма подобраны и оптимизированы условия и методика получения специфического вирусного антигена для использования его в серологических реакциях.

Разработана методика по выявлению антител к вирусу африканской чумы свиней методом иммуноблоттинга на основе культурального цитоплазматического антигена.

Использование штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» для наработки и

очистки культурального антигена позволило подобрать и оптимизировать

9

условия постановки следующих диагностических реакций для выявления антител к вирусу АЧС: реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), реакция латекс-агглютинации (РЛА) и иммунопероксидазный монослойный анализ (ИПМА), которые не имеют аналогов на территории РФ.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Получен патент № 2675535 - 2018 на изобретение «Штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/СУ-1» вируса африканской чумы свиней, со сниженной вирулентностью для свиней, для вирусологических, диагностических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований».

Полученный штамм вируса АЧС «АЧС/ВНИИЗЖ/СУ-1», адаптированный к репродукции в перививаемой культуре клеток СУ-1, используется в ФГБУ «ВНИИЗЖ» при получении специфического антигена для изготовления антигенсодержащих иммунострипов для иммуноблоттинга с целью выявления антител к вирусу АЧС, а также для постановки других серологических реакций.

Типоспецифическая сыворотка, полученная с использованием штамма «АЧС/ВНИИЗЖ/СУ-1», используется в качестве положительного контроля в диагностических наборах и тест-системах.

Разработаны «Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу африканской чумы свиней методом иммуноблоттинга», утвержденные в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 28 декабря 2017 г. и «Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток селезенки свиней», утвержденные в ФГБУ "ВНИИЗЖ" 15.03.2019 г.

1.6. Методология и методы исследований.

В работе использовали вирусологические (вирусовыделение,

культивирование вируса, титрование вируса, постановка биопроб),

препаративные методы (очистка вируса и получение антигена),

серологические (РПИФ, РНИФ, ИБ, ИПТ, ТФ ИФА), а также молекулярно-

биологические (ПЦР в режиме реального времени, секвенирование) методы

10

исследований. Исследования в рамках диссертационной работы выполнены на базе референтной лаборатории по африканской чуме свиней Федерального государственного бюджетного учреждения ФГБУ «ВНИИЗЖ».

1.7. Положения, выносимые на защиту

- полученный и депонированный в Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» адаптированный к репликации в перевиваемой культуре клеток CV-1 штамм вируса АЧС -«АЧС/ВНИИЗЖ/CV-l» со сниженной летальностью для свиней, пригоден для получения антигена и типоспецифической гипериммунной сыворотки для диагностических исследований;

- отработанные условия и подобранный технологический режим для получения культурального вирусного антигена АЧС позволяют наработать стандартный анитигенсодержащий препарат в максимальных количествах;

- отработанные условия постановки реакции иммуноблоттинга и изготовления иммунострипов, а также разработанная методика иммуноблоттинга пригодны для обнаружения антител к вирусу АЧС в сыворотках крови свиней;

- штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-l» и антиген, изготовленный с его применением, пригодны и эффективны при использовании в диагностических методах, таких как латекс-агглютинация, иммунопероксидазный тест и реакция непрямой иммунофлуоресценции.

1.8. Личный вклад соискателя. Благодарности

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность за активное содействие и помощь в проведении отдельных этапов работы сотрудникам референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ»: д.б.н Власовой Н.Н., к.в.н. Першину А.С., к.б.н. Жукову И.Ю., к.б.н. Шевченко И.В., а также за консультативную помощь д.б.н., профессору Груздеву К.Н.

1.9. Степень достоверности и апробации результатов.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и методической комиссии ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2016-2018 гг.), на заседаниях Научно-технического совета Россельхознадзора (2016-2018 гг.), на IV Международной научной конференции «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2016 г.), IX Международном ветеринарном конгрессе (г. Светлогорск, 2019 г.), VI Глобальном свиноводческом форуме (г. Ухань, Китай, 2019 г.)

Достоверность проведенных исследований подтверждена результатами комиссионных испытаний и патентом на изобретение.

1.10. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 5 статей - в рецензируемых изданиях перечня ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций и патент на изобретение.

1.11. Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения; иллюстрирована 13 таблицами и 27 рисунками. Список использованной литературы включает 143 источника, из них 102 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Историческая справка

С 1909 по 1912 гг. на территории Кении Р. Монтгомери наблюдал многочисленные вспышки смертельной инфекции среди домашних свиней. В 1921 г. он впервые доказал вирусную природу африканской чумы свиней и подробно описал данное заболевание. В дальнейшем вспышки АЧС регистрировались во многих странах южной и восточной Африки. При этом болезнь наблюдалась чаще у домашних животных, имевших контакт с дикими африканскими свиньями [111].

Впервые за пределами Африканского континента, заболевание было диагностировано в Португалии в апреле 1957 г., вблизи города Лиссабон, куда вирус, предположительно, был занесён из Анголы с отходами пищевых продуктов. После принятия координальных мер по искоренению, болезнь была ликвидирована в июне 1958 г., но, в апреле 1960 г. в Португалии вновь были зарегистрированы очаги АЧС. В мае этого же года первые случаи АЧС были зафиксированы в Испании на территориях, граничащих с Португалией. Эти страны оставались неблагополучными по АЧС на протяжении более 30 лет и только в 1995 г., после реализации масштабной программы по искоренению АЧС, были объявлены свободными по данному заболеванию. Однако в 1999 г. в Португалии была вновь диагностирована эта инфекция [65].

Во второй половине XX века с Пиренейского полуострова болезнь распространилась во Францию (1964, 1967, 1974 гг.), Мальту (1978 г.), Италию (1967 г.). В Италии (вблизи города Рим) заболевание впервые было отмечено в марте 1967 г. и ликвидировано к 1969 г., но в марте 1978 г. вспышки АЧС были зафиксированы на острове Сардиния, и по настоящий момент данная территория является эндемичной по АЧС. Затем отдельные вспышки заболевания были зафиксированы в Бельгии (1985 г.) Нидерландах (1986 г.). Во всех указанных странах вспышки инфекции удалось ликвидировать [139,142].

В 70-ых годах прошлого столетия эпизоотии АЧС регистрировались в странах Центральной и Южной Америки: Бразилии (1978- 1979 гг.), Доминиканской Республике (1978-1980 гг.), на Гаити (1978-1980 гг.). и Кубе (1971 г., 1980 г.) [108].

После 30-летнего перерыва, в 1994 г. в Кении вновь были зарегистрированы вспышки АЧС. Далее вирус попал в южную часть Мозамбика [14], и начиная с 1996 г. АЧС широко распространилась в Западной Африке: Кот-д'Ивуаре (1996 г.), Бенине и Того (1997 г.), Нигерии (1997 г.), Гане (1999 г.) [48, 58,105].

В 1998 г. впервые вспышки АЧС были выявлены на острове Мадагаскар [20].

В ряде африканских стран (Ангола, Демократическая Республика Конго, Уганда, Замбия, Малави и Мозамбик), а также в Республике Кабо-Верде, на островах Мадагаскар и Сардиния АЧС является эндемическим заболеванием среди домашних и диких свиней. В Западной Африке к этому списку относятся также Сенегал, Гамбия, Камерун, Гвинея-Бисау, что обусловлено вовлечением в эпизоотический процесс диких свиней-вирусоносителей и аргасовых клещей рода Ornithodoros [47].

В России вирус АЧС впервые был выделен из патологического материала павшего дикого кабана, обнаруженного в ноябре 2007 г. в Шатойском районе Чеченской республики. Возбудитель был занесен с территории сопредельной, неблагополучной по АЧС, Грузии. В 2008-2010 гг. вспышки заболевания выявлялись, главным образом, в Северо-Кавказском и Южном федеральных округах РФ. Начиная с 2011г. центр эпизоотии в РФ переместился в Центральный Федеральный округ (Тверская, Московская, Тульская, Орловская, Ярославская области). Вспышки АЧС среди кабанов отмечались в Северо-Западном (Псковская область и Республика Карелия) и Приволжском (Саратовская область) округах [6].

2.2. Эпизоотология африканской чумы свиней и эпизоотическая ситуация в РФ

Известно, что к вирусу АЧС восприимчивы практически все виды свиней всех половозрастных групп. В дикой фауне Африканского континента заболевание регистрируется у диких африканских бородавочников (РИасосковгш africanus) и кустарниковых свиней (Ро1атоскоегш \arvatus)., у которых болезнь протекает в субклинической форме. Вирус АЧС в их организме способен бессимптомно персистировать на протяжении длительного времени не вызывая гибели животных и проявления клинических признаков болезни. На территории Африки, популяция вируса АЧС и макроорганизм хозяина (дикие африканские свиньи) представляют собой совместно эволюционирующую биологическую систему. Таким образом, можно говорить о том, что дикие свиньи Африки являются естественным резервуаром этого вируса [44, 67].

Кроме того, резервуаром и вектором распространения АЧС могут служить аргасовые клещи рода Ornithodoros. Вирус в организм клещей попадает вследствие кровососания у зараженных животных, и после размножения в их организме передается здоровым свиньям при последующем укусе. Внутри популяции клещей вирус также передается трансстадийно, трансовариально и половым путём [30, 49]. В результате исследований, проведенных в Португалии, установлено, что именно с клещами связана длительная персистенция вируса в популяции домашних свиней. В 1999 году, во время вспышки в одной из провинций Португалии, из клещей Ornithodoros erraticus было выделено десять изолятов вируса АЧС, шесть из которых - гемадсорбирующие и четыре - негемадсорбирующие. При этом, гемадсорбирующие изоляты вызывали острую форму течения у свиней, в то время как животные, инфицированные негемадсорбирующими изолятами, оказались устойчивыми при контрольном заражении высоковирулентным португальским изолятом вируса АЧС [77].

В неблагополучных странах АЧС протекает в форме эпизоотий, для неё характерна стационарность, которая обусловлена длительным вирусоносительством и высокой устойчивостью вируса к воздействию факторов внешней среды [1].

Источником инфекции являются больные и переболевшие животные, из организма которых вирус выделяется со всеми секретами и экскретами. В максимальных концентрациях вирус обнаруживается в крови больных свиней [16].

В естественных условиях заражение происходит при совместном содержании здоровых свиней с инфицированными, главным образом, алиментарным путем. Факторами передачи возбудителя АЧС являются различные инфицированные объекты внешней среды, такие как транспорт, предметы ухода, корма, вода, навоз и др. Особую опасность представляют продукты убоя зараженных животных и образующиеся при их переработке пищевые и боенские отходы, которые, зачастую, в необработанном виде скармливают свиньям [2]. Ввиду значительной резистентности вируса АЧС к воздействию факторов внешней среды, купирование новых вспышек и контроль над распространением инфекции для ветеринарных служб остаются затруднительными.

Начиная с 2007 года и по настоящий момент ситуация по АЧС в

Российской Федерации остается напряженной. Болезнь получила

значительное распространение во многих регионах страны. Вместе с тем,

ареал распространения инфекции с каждым годом увеличивается, болезнь

регистрируется на ранее благополучных по АЧС территориях. В 2015-2016

годах АЧС была выявлена в ранее благополучных Рязанской, Липецкой,

Пензенской, Вологодской областях, Республиках Чувашия и Татарстан.

Также заболевание вновь зафиксировано в Кабардино-Балкарской

Республике, где его не выявляли с 2010 г. Всего за 2015-2016 гг.

зарегистрировано 383 очага АЧС: 267 среди домашних свиней и 116 в

популяции диких кабанов [38, 39]. Стоит отметить, что при этом участились

16

случаи выявления АЧС на крупных свиноводческих комплексах (IV компартмент), в частности, на репродукторах, откуда инфекция распространилась на другие площадки, а так же на мясоперерабатывающие предприятия [39].

В 2017 году зона распространения инфекции существенно расширилась. Заболевание было зарегистрировано на территории Сибирского и Уральского федеральных округов, что свидетельствует о выраженной опасности африканской чумы свиней как трансграничного заболевания. Так, АЧС впервые была зарегистрирована на территории ранее благополучных Самарской, Иркутской, Омской, Челябинской, Калининградской, Тюменской, Курганской областей, Красноярского края и Ямало-Ненецкого автономного округа [40].

В течение 2018 года было зарегистрировано 112 вспышек АЧС в 18-ти субъектах РФ. По официальным данным, всего с 2007 по 2018 гг. в Российской Федерации выявлено (рисунок 1): 1386 очагов АЧС, в т.ч. 833 в популяции домашних свиней (из которых 101 - на свиноводческих предприятиях) и 553 в дикой фауне [41].

Рисунок 1 - эпизоотическая ситуация по АЧС в Российской Федерации [41]

2.3 Структура вириона

Возбудитель АЧС - уникальный, крупный, оболочечный нуклео-цитоплазматический ДНК-содержащий арбовирус, который является единственным представителем семейства Asfarviridae [88].

Вирион возбудителя АЧС имеет икосаэдрическую форму, его диаметр составляет ~200 нм. В центре вириона находится нуклеопротеиновый кор -центральный нуклеоид, содержащий геном вируса, покрытый плотным белковым слоем ядерной оболочки. Кор защищен тремя оболочками: внутренняя липидная оболочка, капсид икосаэдрической формы и наружный слой вириона (суперкапсид), представленный липопротеидной оболочкой, приобретаемой при выходе вируса из клетки.[112, 126]

Геном вируса АЧС - двухцепочечная ДНК, его размер варьирует от 165 до 193 т.п.о. и кодирует 150-167 открытых рамок считывания (ОРС) [82, 99, 123, 128].

Рисунок 2 - Структура вириона вируса АЧС [64, 90]

Примечания: СК - суперкапсид, К - капсид, ВО - внутренняя липидная оболочка, ЯО - ядерная оболочка, Н - нуклеоид.

2.4 Свойства и функции основных диагностически значимых белков вируса АЧС

Ввиду малоуспешных попыток создания эффективных и безопасных средств специфической профилактики, за прошедшее пятидесятилетие проведены фундаментальные исследования структуры, свойств и функций генома и многочисленных белков вируса АЧС, механизмов его высокой генетической и антигенной вариабельности, «ускользания» от иммунной системы хозяина [137].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шарыпова Дарья Викторовна, 2019 год

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Африканская чума свиней // Инфекционная патология животных: в 2-х т. / гл. ред. А.Я. Самуйленко [и др.]. - М., 2006. - Т.1. - С. 807-817.

2. Бакулов, И.А. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней / И.А. Бакулов, В.В. Макаров // Вестн. с.-х. наук. - 1990. - № 12. - С. 122128.

3. Бровкина, А.Н. Разработка метода и тест-системы выявления бактерий рода Salmonella на основе латекс-агглютинации / А.Н. Бровкина // Науч. журн. КубГАУ. - 2011. - №72 (08). - С. 1-9.

4. Варенцова, А.А. Анализ структуры генов изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных на территории Российской Федерации: дис. ... канд. биол. наук: 03.02.02 / Варенцова Алиса Алексеевна. - Владимир, 2014. - 140 с.

5. ГОСТ 28573-90. Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы. - М.: Стандартинформ, 2005. - 10 с.

6. Дежкин, А.В. Мониторинг популяций дикого кабана в связи с распространением африканской чумы свиней (АЧС) в России / А.В. Дежкин, О.А. Пантелеева, П.М. Павлов // Материалы II Междунар., VII Всеросс. научно-практ. конф., ФГБОУ ВО РГАЗУ «Состояние среды обитания и фауна охотничьих животных России и сопредельных территорий». - Балашиха, 2016. -С. 136-141.

7. Диагностика африканской чумы свиней в Российской Федерации / Т.В. Гребенникова, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер [и др.] // Вопр. вирусологии. -2013. - № 1. - С. 64-79.

8. Диагностика африканской чумы свиней. 1. Реакция гемадсорбции и задержки гемадсорбции при АЧС / И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, A.II. Курносов [и др.] // Вопр. вет. вирусологии и эпизоотологии: материалы науч. конф. / ВНИИВиМ. - Покров, 1992. - Ч. 1. - С. 57-62.

9. Дубровская, О.А. Разработка и испытания тест-системы для серодиагностики африканской чумы свиней методом иммуноблоттинга: дисс. .

канд. биол. наук: 03.02.02. / Дубровская Ольга Александровна. - Вольгинский, 2017. - 127 с.

10. Жуков, И.Ю. Биологические свойства изолятов вируса африканской чумы свиней и особенности течения болезни при экспериментальном заражении: дисс. ... канд. биол. наук: 03.02.02 / Жуков Иван Юрьевич. - Владимир, 2018. -145 с.

11. Использование перевиваемых линий клеток для размножения штамма «Катанга - 350» вируса АЧС / В.И. Репин, Ю.И. Петров, A.B. Киселев [и др.] //Актуальные вопр. веет. вирусологии: материалы научно - практ. конф. / ВНИИВВиМ «Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики». - Покров, 1995. - С. 139-140.

12. Использование перививаемых линий клеток для размножения штамма «Катанга-350» вируса АЧС / В.И. Репин, Ю.И. Петров, А.В. Киселев [и др.] // Актуальные вопр. вет. вирусологии: материалы научно-практ. конф. / ВНИИВВиМ: «Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики». - Покров, 1995. - С. 139-140.

13. Казакова, А.С. Конструирование продуцентов рекомбинантных белков р72, р30 и р54 вируса африканской чумы свиней: дисс. ... канд. биол. наук: 03.02.02 / Казакова Анна Сергеевна. - Покров, 2013. - 125 с.

14. Каламина, Т.В. Персистенция вируса АЧС в культуре клеток ПСГК / Т.В. Каламина, В.И. Жестерев // Вопр. вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - Ч.1. - С. 36-37.

15. Калантаенко, Ю.Ф. Выращивание вируса африканской чумы свиней в культуре перевиваемых клеток: дис. ...канд. вет. наук: 16.00.03 / Калантаенко Юрий Федорович. - Покров, 1982. - 155 с.

16. Коваленко, Я.Р. Африканская чума свиней / Я.Р. Коваленко. - М.: Колос, 1972. - 200 с.

17. Коваленко, Я.Р. Опыты по адаптации вируса африканской чумы свиней / Я.Р. Коваленко, М.А. Сидоров, Л.Г. Бурба // Докл. ВАСХНИЛ. - 1966. - № 2. -С. 36-39.

18. Колонцов, А.А. Локализация мажорных полипептидов вируса АЧС и вирусассоциированных ферментов в структуре вирионов / А.А. Колонцов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1995. - № 3. - С. 3438.

19. Культивирование вируса африканской чумы свиней в перививаемой культуре клеток А4С2 / Е.Ю. Прудникова, В.М. Балышев, Т.В. Гольберг, В.И. Балышева // Актуальные пробл. инфекц. патологии в вет. медицине: материалы 11-ой конф. молодых ученых, 16-17 мая 2012 / ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. - Покров, 2012. - С.143-149.

20. Курченко, Г.А. Оценка эпизоотической ситуации в отношении африканской чумы свиней и организация возможных мер борьбы и надзора за распространением болезни в регионе оз. Алаотра, Мадагаскар (Мадагаскар, Франция) // РЖ Ветеринария. - 2007. - № 3. - С. 803-805.

21. Макаров, В.В. Африканская чума свиней / В.В. Макаров. - М.: РУДН, 2011. - 268 с.

22. Макаров, В.В. Вирус африканской чумы свиней / В.В. Макаров // Вет. практика. - 2011. - № 3. - С. 10-16.

23. Методические рекомендации по наработке ДНК вируса африканской чумы свиней в первичной культуре клеток макрофагов свиньи для последующего пиросеквенирования / И.В. Шевченко, А.А. Варенцова, А.А. Елсукова [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2015. - 13 с.

24. Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток костного мозга свиней / А.А. Варенцова И.Ю. Жуков, В.Л. Гаврилова [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2014. - 17 с.

25. Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса

африканской чумы свиней в культуре клеток лейкоцитов свиней / А.А.

105

Варенцова, И.Ю. Жуков, В.Л. Гаврилова [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». -Владимир, 2014. - 21 с.

26. Методические указания по выявлению вируса африканской чумы свиней в пробах крови и патологических материалов, отобранных от павших или вынужденно убитых свиней, в реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) / В.Л. Гаврилова, А.А. Варенцова, И.Ю. Жуков [и др.]; ФГБУ «ВНИИЗЖ». -Владимир, 2013. - 18 с.

27. Популяционная структура вируса африканской чумы свиней по признаку количественной гемадсорбции / В.В. Макаров, И.Ф. Вишняков, Н.А. Власов, А.М. Серова // Вопр. вирусологии. - 1991. - № 4. - С. 321-324.

28. Прудникова, Е.Ю. Адаптация вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации, к перевиваемым культурам клеток и изучение его биологических свойств: автореф. дисс. ... канд. ветеринарных наук: 06.02.02 / Прудникова Елена Юрьевна. - Покров, 2013. - 27 с.

29. Разработка иммуноферментных методов диагностики африканской сумы свиней / В.В. Цибезо, Ю.О. Терехова, М.В. Баландина [и др.] // Ветеринария Кубани. - 2012. - № 1. - С. 20-23.

30. Роль иксодофауны в эпизоотологии африканской чумы свиней / Ф.А. Бадаев, Э.В. Рудобельский, В.И. Никишин [и др.] // Вопр. вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ. -Покров, 1992. - Ч. 1. - С. 45-46.

31. Середа, А.Д. Белки вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, Д.В. Колбасов // Науч. журн. КубГАУ. - 2012. - № 3. - С. 1-17.

32. Середа, А.Д. Физико-химический полиморфизм вирусной популяции и дефектные интерферирующие частицы вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, Н.А. Власов, В.В. Макаров // Вестн. Россельхозакадемии. - 1997. - № 5. - С. 67-70.

33. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса

африканской чумы свиней / И.Ф. Вишняков Н.И. Митин, Ю.И. Петров [и др.] //

Актуальные вопр. вет. вирусологии: материалы научно-практ. конф./

106

ВНИИВВиМ «Классическая чума свиней - неотложные проблемы науки и практики». - Покров, 1995. - С. 141-143.

34. Станишевский, Я.М. Полимерные дисперсные системы медико-биологического назначения: дисс. канд. биол. наук: 03.0023 / Станишевский Ярослав Михайлович. - М., 2001. -1 51 с.

35. Чайка, Н.А. Реакция агглютинации латекса / Н.А. Чайка // Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / под. ред. Т.В. Перадзе, П.М. Халонена. - М: Медицина, 1981. - С. 121-143.

36. Черятников, Л.Л. Получение аттенуированных вариантов из различных изолятов вируса африканской чумы свиней и их сравнительная оценка / Л.Л. Черятников, Ю.И. Петров, Н.И. Митин // Вопр. вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф. - Покров, 1992. - Ч. 1. -С. 56.

37. Шевченко, И.В. Биологические свойства и анализ полных геномов российских изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенных в 2013-2014 гг.: дисс. ... канд. биол. наук: 03.02.02 / Шевченко Иван Вячеславович. -Владимир, 2017. - 145 с.

38. Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации 2015 г. [Электронный ресурс]. / Официальный сайт Россельхознадзора. - Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/2015/files/iac2015.pdf

39. Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации 2016 г. [Электронный ресурс]. / Официальный сайт Россельхознадзора. - Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/rf/2016/iac2016.pdf

40. Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации 2017 г. [Электронный ресурс]. / Официальный сайт Россельхознадзора. - Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/rf/2018/report_2_quater.pdf

41. Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации 2018 г. [Электронный ресурс]. / Официальный сайт Россельхознадзора. - Режим доступа: http://fsvps.ru/fsvps-docs/ru/iac/rf/2018/iac2018.pdf

42. A reliable enzyme linked immunosorbent assay for African swine fever using the major structural protein as antigenic reagent / E. Tabares, M. Fernandez, E. Salvador-Temprano [et al.] // Arch. Virol. - 1981. - Vol. 70, N 3. - P. 297-300.

43. A sensitive dot immunobinding assay for serodiagnosis of African swine fever virus with application in field conditions / M.J. Pastor, M. Arias, C. Alcaraz, [et al.] // J. Vet. Diagn. Invest. - 1992. - N 4. - Р. 254-257.

44. African swine fever virus infection of the bush pig (Potamochoerus porcus) and ils significance in the epidemiology of the disease / E.C. Anderson, G.H. Hutchings, N. Mukarati [et al.] // Vet. Microbiol. - 1998. - Vol. 62, N 1. - P. 1- 15.

45. African swine fever // Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals,birds and bees). - Paris, 2012. - Vol. 2, Chapter 2.8.1. - P. 1067-1079.

46. African swine fever // Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals / OIE. - Paris, France, 2008. - Chapter 2.8.1. - Режим доступа: http://www.oie.int/doc/ged/D7709.PDF

47. African swine fever in Mozambique: review, risk factors and considerations for control / M.L. Penrith, C. Lopes Pereira, M.M. Lopes da Silva [et al.] // Vet. Res. -2007. - Vol. 74. - P. 149-160.

48. African swine fever virus DNA in soft ticks, Senegal / L. Vial, B. Wieland, F. Jori [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 13. - P. 1928-1931.

49. African swine fever virus infection in the argasid host, Ornithodoros porcinus porcinus / S.B. Kleiboeker, T.G. Burrage, G.A. Scoles [et al.] // J. Virol. -1998. -Vol. 72. - P. 1711-1724.

50. African swine fever virus polyproteins pp220 and pp62 assemble into the core shell / G. Andrés, A. Alejo, J. Salas, M.L. Salas // J. Virol. - 2002. - Vol. 76, N 24. - P.12473-12482.

51. African swine fever virus protein p54 interacts with the microtubular motor complex through direct binding to light-chain dynein / C. Alonso, J. Miskin, B. Hernaez [et al.] // J. Virol. - 2001. - Vol.75, N 20. - Р. 9819-9827.

52. African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems / K.L. Dixon, C.C. Abrams, G. Bowick [et al.] // Vet. Immunol. Immunopathol. -2004. - Vol. 100. - P. 117-134.

53. African swine fever virus serodiagnosis: A general review with a focus on the analyses of African serum samples / C. Cubillosa, S. Gomez-Sebastianb, N. Morenoa [et al.] // Virus Res. - 2013. - Vol. 173. - P.159-167.

54. African swine fever virus structural protein p54 is essential for the recruitment of envelope precursors to assembly sites / J.M. Rodriguez, R. Garcia-Escudero, M.L. Salas, G. Andres // J. Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 4299-4313.

55. African swine fever virus structural protein p72 contains a conformational neutralizing epitope / M.V. Borca, P. Irusta, C. Carrillo [et al.] // Virology. - 1994. -Vol. 201, N 2. - P. 413-418.

56. African swine fever: comparison of four serotests on porcine serums in Spain / I.C. Pan, R. Trautman, W.R. Hess [et al.] // Amer. J. Vet. Res. - 1974. - Vol. 35, N 6. - P. 787-790.

57. Amino acid sequence and structural properties of protein p12, an African swine fever virus attachment protein / A. Alcami, A. Angulo, G. Lopez-Otin [et al.] // J. Virol. - 1992. - Vol.66. - P. 3860-3868.

58. An outbreak African swine fever in Nigeria: virus isolation and molecular characterization of the VP2 gene of a first isolate from west Africa / S.O. Odemuyiwa, I.A. Adebayo, W. Ammerlaan [et al.] // Virus Genes. - 2000. - Vol. 20, N 2. - P. 139142.

59. Andres, G. Characterization of two African swine fever virus 220-kDa proteins: a precursor of the major structural protein p150 and an oligomer of phosphoprotein p32 / G. Andres, C. Simon-Mateo, E. Vinuela // Virology. - 1993. -Vol.194. - P. 284-293.

60. Angulo, A. Comparison of the sequence of the gene encoding African swine fever virus attachment protein p12 from field virus isolates and viruses passaged in cell culture / A. Angulo, E. Vinuela, A. Alcami // J. Virol. - 1992. - Vol. 66. - P. 38693872.

61. Animal Viruses Molecular Biology / ed. T.C. Mettenleiter, F. Sobrino. -Norfolk, UK: Caister AP, 2008. - 531 p.

62. Antigenic properties and diagnostic potential of African swine fever virus protein pp62 expressed in insect cells / C. Gallardo, E. Blanco, J.M. Rodriguez [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44, N 3. - P. 950-956.

63. Antigenic relationships among strains of African swine fever virus / J.D. Vigario, A.M. Terrinha, J. Moura, J.F. Nunes // Arch. Ges. Virusforsch. - 1974. - Vol. 45, N 3. - P. 272-277.

64. Approaches and perspectives for development of African swine fever virus vaccines / M. Arias, A. De la Torre, L. Dixon [et al.] // Vaccines. - 2017. - Vol. 5, N 4. - P. 35.

65. Arias, M. African swine fewer eradication: the spanish model / M. Arias, J.M. Sanchez-Vizcaino // Trends in Emerging Viral Infections of Swine. 1st edn. / ed. A. Morilla, K. Jin, J. Zimmerman. - Ames (Iowa, USA), 2002. - P. 133-139.

66. Arias, M. Persistence of African swine fever antibody reactivity on ELISA and immunoblotting assays / M Arias, J.M. Escribano, J.M. Sánchez-Vizcaíno // Vet. Rec. - 1993. - Vol. 133, N 8. - P. 189-190.

67. Assessent of interactions between African swine fever virus, bushpigs (Potamochoerus larvatus), Ornithodoros ticks and domestic pigs in north-western Madagascar / J. Ravaomanana, F. Jori, L. Vial [et al.] // Transbound. Emerg. Dis. -2011. - Vol. 58. - P. 247-254.

68. Biological characterization of African swine fever virus genotype II strains from north-eastern Estonia in European wild boar / I. Nurmoja, A. Petrov, C. Breidenstein [et al.] // Transbound. Emerg. Dis. - 2017. - Vol. 64, N 6. - P. 20342041.

69. Botija, C.S. Diagnosis of African swine fever by immunofluorescence / C.S. Botija // Bull. Off. Intern. Epiz. - 1970. - Vol. 73, N 11. - P. 1025-1044.

70. Botija, S. Modification of the African swine fever virus by passage in cell cultures / S. Botija // Bull. Off. Intern. Epiz. - 1963. - Vol. 60. - P. 901-919.

71. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford //Anal. Biochem. - 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

72. Breese, S.S. Electron microscope observations of ASFV in tissue culture cells / S.S Breese, C.J. De Boer // Virology. - 1966. - Vol. 28. - P. 420-428.

73. Camacho, A. Protein p22 of African swine fever virus: an early structural protein that is incorporated into the membrane of infected cells / A. Camacho, E. Vinuela // Virology. - 1991. - Vol.181. - P. 251-257.

74. Carrascosa, A.L. Production and titration of African swine fever virus in porcine alveolar macrophages / A.L. Carrascosa, J.F. Santaren, E. Vinuela // J. Virol. Methods. - 1982. - Vol. 3. - P. 303-310.

75. Casai, I. Porcine leukocyte cellular sunsinive to African swine fever virus in vitro / I. Casai, L. Enjuanes, E. Vinuela // J. Virol. - 1984. - Vol. 52, N 1. - P. 37 - 46.

76. Characterisation of p30 a highly antigenic membrane and secreted protein of african swine fever virus / C.L. Afonso, C. Alcaraz, A. Brun [et al.] // Virology. -1992. - Vol. 189, N 1. - P. 368-373.

77. Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal / F.S. Boinas, G.H. Hutchings, L.K. Dixon, P.J. Wilkinson / J. Gen. Virol. - 2004. - Vol. 85. - P. 2177-2187.

78. Comparative analysis of clinical and biological characteristics of African swine fever virus isolates from 2013 year Russian Federation / N.N. Vlasova, A.A Varentsova, I.V. Shevchenko [et al.] // Brit. Microbiol. Res. J. - 2015. - Vol. 5, N 3. -P. 203-215.

79. Comparison of a radioimmunoprecipitation assay to immunoblotting and ELISA for detection of antibody to African swine fever virus / C. Alcaraz, M.De Diego, M.J. Pastor, J.M. Escribano // J. Vet. Diagnostic Investigation. - 1990. -Vol 2, N 3. - P. 191-196.

80. Detection of African swine fever virus antibodies by immunoblotting assay / M.J. Pastor, M.D. Laviada, J.M. Sanchez-Vizcaino, J.M. Escribano // Canad. J. Vet. Res. - 1989. - Vol. 53, N 1. - P. 105-107.

81. Development of African swine fever epidemic among wild boar in Estonia -two different areas in the epidemiological focus / I. Nurmoja, K. Schulz, C. Staubach [et al.] // Sci. Rep. - 2017. - P. 1-12.

82. Enjuanes, L. Isolation and properties of the DNA of African swine fever (ASF) virus / L. Enjuanes, A.L. Carrascosa, E. Vinuela // J. Gen. Virol. - 1976. - Vol. 32. - P. 479-492.

83. Escribano, J.M. Antibodies to bovine serum albumin in swine sera: implications for false-positive reactions in the serodiagnosis of African swine fever / J.M. Escribano, M.J.Pastor, J.M. Sanchez-Vizcaino // Amer. J. Vet. Res. - 1989. -Vol. 50. - P. 1118-1122.

84. Escribano, J.M. Proteins specified by African swine fever virus V. Identification of immediate early, early and late proteins / J.M. Escribano, E. Tabares // Arch. Virol. - 1987. - Vol. 92. - P. 221-238.

85. Esteves, A. Two-dimensional analysis of African swine fever virus proteins and proteins induced in infected cells / A. Esteves, M.I. Marques, J.V. Costa // Virology. - 1986. - Vol. 152, N 1. - P. 192-206.

86. Experimental African swine fever: apoptosis of lymphocytes and virus replication in other cells / J.C. Gomes-Villamandos, J. Hervas, A. Mendez [et al.] // J. Gen. Virol. - 1995. - Vol. 76. - P. 2399-2405.

87. Experimental infection of domestic pigs with African swine fever virus Lithuania 2014 genotype II Field isolate / C. Gallardo, A. Soler, R. Nieto [et al.] // Transbound. Emerg. Dis. - 2014. - N 2. - P. 300-304.

88. Family Asfarviridae / L.K. Dixon, J.V. Costa, J.M. Escribano [et al.] // Virus Taxonomy: Seventh Rep. Intern. Comm. on Taxonomy of Viruses / ed. M.H.V. Van Regenmortel, C.M. Fauquet, D.H.L. Bishop [et al.]. - San Diego, 2000. - P.159-165.

89. Ferris, D.H. A simplified method for detection African swine fever antibodies by immunoelectroosmophoresis / D.H. Ferris, D.A. Gregg, A.H. Dardiri // Bull. Pan Amer. Health Organization. - 1980. - Vol. 14, N 3. - P. 229-237.

90. Freitas,T.R.P. Molecular studies on African swine fever virus from Brazilian isolates / T.R.P. Freitas, T.M.P. Lyra // Arq. Inst. Biol. - 2018. - Vol. 85. - P. 1-8.

91. General morphology and capsid fine structure of African swine fever virus particles / J.L. Carrascosa, J.M. Carazo, A.L. Carrascosa [et al.] // Virology. - 1984. -Vol.132. - Р. 160-172.

92. Genetic characterization of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973-1999) / C.I. Boshoff, A.D. Bastos, L.J. Grber [ et al.] // Vet. Microbiol. - 2007. - Vol. 121. - P. 45-55.

93. Genetic variation among African swine fever genotype ii viruses, Eastern and Central Europe / C.Gallardo, J. Fernández-Pinero, V. Pelayo [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2014. - Vol. 20, N 9. - P. 1544-1547.

94. Hechemy, K. Latex particle assays in laboratory medicine. Part I and Part II / K. Hechemy, E. Michaelson // Laboratory Management. - 1984. - N 40. - Р. 26-34.

95. Highly specific confirmatory western blot test of African swine fever virus antibody detection using the recombinant virus protein p54 / C.I. Alcaraz, F. Rodriguez, J.M. Oviedo [et al.] // J. Virol. Methods. - 1995. - Vol. 52. - Р. 111-119.

96. Immunoblotting OIE for Serological Diagnosis of African Swine Fever (SOP/CISA/ASF/IB/1/2008) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://asf-referencelab.info/asf/images/files/SOPs/SOP- AFSIB12008.pdf.

97. In vivo study of hemadsorption in African swine fever virus infected cells / M.A. Sierra, J.C. Gomez-Villamandos, L. Carrasco [et al.] // J. Vet. Pathol. - 1991. -Vol. 8. - P. 178-181.

98. Inducible gene expression from African swine fever virus recombinants: analysis of the major capsid protein p72 / R.G. Escudero, G. Andres, F. Almazan, E. Vinuela // J. Virol. - 1998. - Vol. 72, N 4. - P. 3185-3195.

99. Intracellular virus DNA distribution and the acquisition of the

nucleoprotein core during African swine fever virus particle assembly:

113

ultrastructural in situ hybridisation and DNase-gold labelling / S.M. Brookes, A.D. Hyatt, T. Wise, R.M.E. Parkhouse // Virology. - 1998. - Vol. 249, N 1. - P. 175-188.

100. Isolation of a non - haemadsorbing, non - cytopathic stain of African swine fever virus in Madagascar / M. Gonzague, F. Roget, A. Bastos [et al.] // Epidemiol. Infect. - 2001. - Vol. 126. - P. 453-459.

101. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose / J. Kyhse-Andersen // J. Biochem. Biophys. Methods. - 1984. - Vol.10, N 3/4. - P. 203-209.

102. Laboratory diagnosis and disease occurrence in the current african swine fever eradication program in Spain 1989-1991 / S. Bech-Nielsen, M.L. Arias, J. Panadero [et al.] // Prevent. Vet. Med. - 1993. - Vol. 17. - P. 225-234.

103. Laemmle, U.K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P.680-685.

104. Localization of the African swine fever virus attachment protein p12 in the virus particle by immunoelectron microscopy / A.L. Carrascosa, I. Sastre, P. Gonzalez [et al.] // Virology. - 1993. - Vol. 193. - P. 460-465.

105. Lubisi, B.A. Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa: M. Sci. Dissertation / B.A. Lubisi / University of Pretoria, 2005. - P. 27-83.

106. Malmquist, W.A. Hemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures / W.A. Malmquist, D. Hay // Amer. J. Vet. Res. - 1960. - Vol. 21. - P. 104-108.

107. Malmquist, W.A. Propagation, modification and hemadsorption of African swine fever virus in cell cultures / W.A. Malmquist // Amer. J. Vet. Res. - 1962. -Vol. 23. - P. 241-247.

108. Medus, C.A. Additional characteristics of diseases caused by the African swine fever viruses isolated from Brazil and Dominican Republic / C.A. Medus, A.H. Dardiri // Proc. Ann. Meet. U.S. Anim. Health Assoc. - 1979. - Vol. 82. - P. 227-239.

109. Molecular characterization of African swine fever virus isolates originating

from outbreaks in the Russian Federation between 2007 and 2011 / A. Malogolovkin,

114

A. Yelsukova, C. Gallardo [et al.] // Vet. Microbiol. - 2012. - Vol. 158, N 3. - P. 415419.

110. Molecular characterization of African swine fever virus isolates originating from outbreaks in the Russian Federation between 2007 and 2011 / A. Malogolovkin, A. Yelsukova, C. Gallardo [et al.] // Vet. Microbiol. - 2012. - Vol. 158. - P. 415-419.

111. Montgomery, R.F. On a form of swine fever occurring in British East Africa (Kenya Colony) / R.F. Montgomery // Comparative Pathol. - 1921. - Vol. 34. -P. 159-191.

112. Moura-Nunes, J.F. Ultrastructural study of African swine fever virus replication in cultures of swine bone marrow cells / J.F. Moura-Nunes, J.D. Vigario, A.M. Terrinha // Arch. Virol. - 1975. - Vol. 49. - P. 59-66.

113. Neutralizing antibodies to different proteins of African swine fever virus inhibit both virus attachment and internalization / P. Gomez-Puertas, F. Rodriguez, J.M. Oviedo [et al.] // J. Virol. - 1996. - Vol.70. - P. 5689-5694.

114. Pan, I.C. African swine fever: application of immunoelectroosmophoresis for the detection of antibody / I.C. Pan, C.J. De Boer, W.R. Hess // Canad. J. Comparative Medicine. - 1972. - Vol. 36. - P. 309-316.

115. Petuska, N. Quelques aspects morfogennesis des suites de la vaccination contre la PPA (virose L) an Portugal / N. Petuska // Bull. Off. Intern. Epiz. - 1965. -Vol. 63. - P. 199-237.

116. Pini, A. Isolation and segregation of non-hemadsorbing strains of African swine fever virus / A. Pini // Vet. Res. - 1976. - Vol. 99. - P. 479-480.

117. Pini, A. Isolation of non-hemadsorbing strain of african swine fever virus from a natural outbreak of the disease / A. Pini, G. Wegenear // Vet. Rec. - 1974. -Vol. 94. - P.2.

118. Prados, F.J. Sequence and characterization of the major early phosphoprotein p32 of african swine fever virus / F.J. Prados, E. Vinuela, A. Alcami // J. Virol. - 1993. - Vol. 67. - P. 2475-2485.

119. Propagation and modification of African swine fever virus in cell cultures / W.R. Hess, B.F. Cox, W.P. Heuschele, S.S. Stone // Amer. J. Vet. Res. - 1965. -Vol. 26. - P. 141-146.

120. Proteins specified by African swine fever virus. analysis of proteins in infected cells and antigenic properties / E. Tabares, M.A. Marcotegui, M. Fernández, C. Sánchez-Botija // Arch. Virol. - 1980. - Vol. 66. - P. 119-132.

121. Proteolytic processing in African swine fever virus: evidence for a new structural polyprotein, pp62 / C. Simon-Mateo, G. Andres, F. Almazan, E. Vinuela // J. Virol. - 1997. - Vol. 71, N 8. - P. 5799-5804.

122. Purifcation and properties of African swine fever virus / A. L. Carrascosa, M. del Val, J.F. Santaren [et al.] // J. Virol. - 1985. - Vol. 54. - P. 337-344.

123. Restriction site map of African swine fever virus DNA / J.M. Almendral, R. Blasco, V. Ley [et al.] // Virology. - 1984. - Vol. 133. - P. 258-270.

124. Rodriguez, J.M. African swine fever virus-induced polypeptides in porcine alveolar macrophages and in Vero cells: two-dimensional gel analysis / J.M. Rodriguez, M.L. Salas, J.F. Santaren // Proteomics. - 2001. - Vol. 1. - N 11. - P. 1447-1456.

125. Salas, M. Asfrican swine fever (Asfarviridae) / M. Salas // Encyclopedia of Virology / ed. R.G.W. Allan Granoff. - London, 1999. - P.1997.

126. Salas, M.L. African swine fever virus morphogenesis / M.L. Salas, G. Andres // Virus Res. - 2013. - Vol. 173, N 1. - P. 29-41.

127. Sánchez-Vizcaíno Rodrguez, J.M. Detección precoz y planes de contingencia para peste porcina Africana / J.M. Sánchez-Vizcaíno Rodrguez // OIE. Conf. - 2010. - P. 1 59-168.

128. Sanchez-Vizcaino, J.M. African swine fever: an epidemiological update / J.M. Sanchez-Vizcaino, L. Mur, B. Martinez-Lopez // Transbound. Emerg. Dis. -2012. - Vol. 59, Suppl. 1. - P. 27-35.

129. Standar operating procedure to obtain the african swine fever virus (asfv)

cytoplasmic soluble antigen / European Union Reference Laboratory for ASF, (EURL-

ASF) Centro de Investigación en Sanidad Animal CISA-INIA, Madrid, Spain. -

116

Режим доступа: http://asf-referencelab.info/asf/images/files/SOP%202018/SOP-ASF-ASF-Ag- 1_REV2018.pdf

130. Suarez, C. African swine fever polyprotein pp62 is essential for core development / C. Suarez, M.L. Salas, J.M. Rodriguez // J. Virol. - 2010. - Vol. 84. -P. 176-187.

131. Tandem repeat insertion in African swine fever virus / K.V. Goller, A.S. Malogolovkin, S. Katorkin [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2015. - Vol. 21, N 4. - P. 731-732.

132. The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune response / P. Gomez-Puertas, F. Rodriguez, J.M. Oviedo [et al.] // Virology. - 1998. - Vol. 243. - P. 461-471.

133. The progressive adaptation of a Georgian isolate of African swine fever virus to Vero cells leads to a gradual attenuation of virulence in swine corresponding to major modifications of the viral genome / P.W. Krug, L.G. Holinka, V. O'Donnell [et al.] // J. Virol. - 2015. - Vol. 89, N 4. - P. 2324-2332.

134. The structural protein p54 is essential for African swine fever virus viability / F. Rodriguez, V. Ley, P. Gomez-Puertas [et al.] // Virus Res. - 1996. - Vol. 40. - P. 161-167.

135. Transcriptional mapping of a late gene coding for the p12 attachment protein of african swine fever virus / F. Almazan, J.M. Rodriguez, A. Angulo [et al.] // J. Virol. - 1993. - Vol.67. - Р. 553-556.

136. Trautman, R. Sedimentation coefficient of African swine fever virus / R. Trautman, I.C. Pan, W.R Hess // Amer. J. Vet. Res. - 1980. - Vol. 41, N 11. - P. 1874-1878.

137. Tulman, E.R. African swine fever virus / E.R. Tulman, G.A. Delhon, B.K. Ku // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2009. - N 328. - P. 43-87.

138. Urzainqui, A. Proteins synthesized in African swine fever virus-infected

cells analyzed by two-dimensional gel electrophoresis / A. Urzainqui, E. Tabares, L.

Carrasco // Virology. - 1987. - Vol. 160. - P. 286-291.

117

139. Vinuela, E. African swine fever virus / E. Vinuela // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1985. - Vol. 116. - P. 151-170.

140. Vlasova, N.N. African swine fever virus pathogenesis and vaccine development: challenges and possible approaches / N.N. Vlasova, A.N. Vlasova // Fevers: Types, Treatments and Health Risks. Charter I. - N.Y., 2013. - P. 3-26.

141. Wardley, R.C. The growth of African swine fever virus in pig monocytes and macrophages / R.C. Wardley, P.J. Wilkinson // J. Gen. Virol. - 1977. - Vol. 38. -P. 183-186.

142. Wilkinson, P.J. African swine fever (Malta/78) in pigs / P.J. Wilkinson, R.C. Wardley, S.M. Williams // Comparative Pathol. - 1981. - Vol. 91. - P. 277-285.

143. Yu, M. Strong sequence conservation of african swine fever virus p72 protein provides the molecular basis for its antigenic stability / M. Yu, C.J. Morrissy, H.A. Westbury // Arch. Virol. - 1996. - Vol.141

8. ПРИЛОЖЕНИЯ

Федеральная служба ни всн-рннарном) и фитисяннтарному нал юру (РОССЕЛЬХОЗНАДЗОР)

федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

Решоияльияя референтная ляборяюрна МЭБ по ящуру Центр МЭБ по сотрудничеству ■ области лап нолика а контроля ¿ыс!Н€Й жииот них для стран Вое 1 он но» Европы, Центральной Аш нЭякаакал-я. Референт ный центр ФАО по яшуру лля сгр«и Центральной Азии и Зяпядиои Нарлир

ПАСПОРТ

1. Регистрационный номер, авторское наименование штамма Штамм вируса африканской чумы свиней (АЧС) (African swine fever virus) -АЧС/ВНИИЗЖ/CV-l (Д)

2. Наименование организации, где был получен игтамм Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

3. Почтовый адрес заявителя 600901, г. Владимир, мкр. Юрьсвец. ФГБУ «ВНИИЗЖ»

4. Место и время выделения штамма Выделен в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

5. Адаптация, способ получения Адаптирован в течение 26 последовательных пассажей на KKCV-1

6. Авторы штамма Власова H.H.. Жуков И.Ю., Шарыпова Д В. и др.

7. Основание для депонирования Штамм для приготовления антигена и проведения НИР по изучению АЧС

8. Название вируса в соответствии с правилами номенклату ры и положение в современной системе классификации Семейство: Asfarviridae Род: Asfivirus Вид: African swine fever virus, генотип П. серотип Н Штамм А ЧС/ВНИИЗЖ'СУ-1

9. Область использования штамма Контрольный штамм вируса АЧС при исследованиях с методом прямого заражения свиней

Характеристика вируса

10. Тип и структу ра ну клеиновой кислоты 2-спиральная ДНК

11. Молекулярная масса нуклеиновой кислоты 107-125 МД

12. Масса вириона 8,4*10"" г

13. Морфология вириона, тип симметрии капеида Белковая оболочка капсида из 1892-2172 капсомеров, форма/симметрия - икосаэдр, оболочка. У вирионов несколько слоев - внешняя липопротеидная оболочка • «клеточная», приобретаемая при выходе из клетки почкованием, капсид, внутренняя липопротеидная оболочка и сердцевина - нуклеоид

14. Размер вириона 175 -220 нм

15. Химический состав вириона ДНК, заключенная в многослойную белковую оболочку

16. Физико-химические свойства вириона Мол. масса 500*106 Д. Вирион состоит из более, чем 50 структурных белков. Вирионная ДНК размером ~ 165190 т.п.о. * инфекционная

17. Устойчивость к действию внешних факторов и химических веществ Вирус чу вствителен к формальдегиду, УФЛ, высокой температуре, неустойчив при обработке эфиром, хлороформом и др. органическими растворителям, наиболее стабилен при рН 5,0 - 8,6

18. Кудкгурещ.ныс признаки Накапливается в первичных культурах клеток КК KMC, КЛС, АМС, КС, ТС, ЛУ, СП в'титре 6,75 lg ГАдЕ^см3, титр вируса 26 пассажа в CV-1 - 6.0 lg ГАдЕщ/см3

19. Патэгеимоепг \ Летальность для домашних свиней достигает 37,5%

' '20 Мелпшпч п«ред»ни. источник инфекции. гкирафи кское /¿с п|хх хранение Передается алиментарным, контактным (через инфицированные объекты) и воздушно-капельным пут£м. Источник инфекции - больное животное

^ аиигиеятнедав, Ц Вирулентен для естественно восприимчивых животиых