Анализ молекулярно-генетических изменений при различных типах рака яичников тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Ельчева, Ирина Александровна

• Ельчева, Ирина Александровна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ельчева, Ирина Александровна

Список основных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Введение.

1.2. Понятие о классификации опухолей яичников.

1.3. Строение и функции нормального яичника.

1.4. Эпителиальные опухоли яичников.

1.4.1 Особенности возникновения и развития эпителиальных опухолей яичников.

1.4.2. Некоторые факторы, ассоциированные с развитием эпителиальных опухолей яичников.

1.4.3. Цитогенетические исследования злокачественных эпителиальных опухолей яичников.

1.4.4.Молекулярно-генетические исследования эпителиальных опухолей яичников.

1.4.4.1. Онкогены.

1.4.4.2. Функциональная утрата гена-супрессора опухолевого роста, потеря гетерозиготности.

1.4.4.3. Частота ЬОН в различных хромосомных локусах при раке яичников.

1.4.4.4. Строение и функции гена-супрессора ВЯСА1.

1.4.4.5. Мутации гена-супрессора ВКСА1 при наследственных и спорадических формах рака яичников.

1.4.4.6. ВКСА2 - второй ген-супрессор, предполагаемый для наследственных форм рака молочной железы.

1.5.Карциносаркомы яичников.

1.5.1. Особенности возникновения и развития карциносарком.

1.5.2. Иммуногистохимическое исследование карциносарком яичников.

1.5.3 .Молекулярно-генетические исследования карциносарком различных локализаций.

I.6. Гранулезоклеточные опухоли яичников.

1.6.1. Особенности возникновения и развития гранулезоклеточных опухолей яичников.

1.6.2. Молекулярно-генетические исследования гранулезоклеточных опухолей яичников.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

П.1. Гистологические материалы.

П.2.Выделение ДНК из парафинизированных тканей.

П.З.Амплификация хромосомных локусов в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

П.4.Электорофорез продуктов ПЦР в агарозном геле.

П.5.Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле.

П.б.Перенос ДНК на нейлоновую мембрану.

П.7.Гибридизация меченных [ у Р] проб с иммобилизованными на нейлоновой мембране пробами ДНК.

Состав основных растворов.

Ш.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

III. 1 .Введение.

Ш.2.Эпителиальные опухоли яичников.

Ш.2.1.Серозные опухоли яичников.

Ш.2.1.1. Частота потери гетерозиготности в серозных опухолях яичников.

П1.2.1.2. Гистологическая и молекулярно-генетическая гетерогенность серозных опухолей яичников.

Ш.2.2.Муцинозные опухоли яичников.

Ш.2.2.1.Частота потери гетерозиготности в муцинозных опухолях яичников.

1П.2.2.2. Гистологическая и молекулярно-генетическая гетерогенность муцинозных опухолей яичников.

Ш.2.3. Эндометриоидные аденокарциномы яичников.

Ш.2.3.1.Частота потери гетерозиготности в эндометриоидных аденокарциномах яичников.

Ш.2.3.2. Гистологическая и молекулярно-генетическая гетерогенность эндометриоидных аденокарцином яичников.

111.2.4. Мезонефроидные аденокарциномы яичников.

III.2.4.1.Частота потери гетерозиготности в мезонефроидных аденокарциномах яичников.

Ш.2.4.2. Гистологическая и молекулярно-генетическая гетерогенность мезонефроидных аденокарцином яичников.

111.2.5. RER+ фенотип в эпителиальных опухолях яичников.

III. 3. Карциносаркомы яичников.

Ш.4. Гранулезоклеточные опухоли яичников.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ молекулярно-генетических изменений при различных типах рака яичников»

Определение геномных нарушений, детерминирующих развитие опухоли, степень её злокачественности, метастатический потенциал и скорость прогрессии, является приоритетной областью молекулярно-генетических исследований в современной онкологии. В настоящее время известно несколько классов генов, нарушения которых приводят к злокачественной трансформации клетки. Решающая роль в этом процессе отводится протоонкогенам и генам-супрессорам (антионкогенам). Протоонкогены и гены-супрессоры, по сути, нормальные клеточные гены с ключевыми функциями регуляции клеточного роста и дифференцировки. В норме протоонкогены стимулируют процессы, связанные с клеточным делением, а гены-супрессоры отвечают за его подавление. Суммарным эффектом активации онкогенов и инактивации генов-супрессоров является возрастающая пролиферативная активность клеток и нарушение их дифференцировки.

Одним из возможных механизмов инактивации гена-супрессора является утрата хромосомного локуса (делеция). Для детекции делеций, изучения известных и выявления потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста, в последние годы широко используется метод определения потери гетерозиготности (Loss of Heterozygosity - LOH) с использованием, в частности, микросателлитных маркеров. Микросателлитные, как правило САП повторы, с высокой частотой распределены по всему геному человека. Делении микросателлитных аллелей могут свидетельствовать о наличии более обширных нарушений, затрагивающих кодирующие области генов, регуляторные зоны, а также позволяют судить об общем уровне генетической нестабильности в клетке. Высокая (до 80-90%) частота потери гетерозиготности в изучаемом хромосомном локусе, как правило, свидетельствует о присутствии в этом районе гена-супрессора, специфичного для данной патологии.

Рак яичников - одно из наиболее распространенных и неблагоприятно текущих опухолевых заболеваний человека, лидирующее по числу смертных случаев среди опухолевых новообразований гинекологической сферы. Поэтому, молекулярно-генетические исследования эпителиальных опухолей яичников, составляющих около 90% от числа новообразований данной локализации, являются чрезвычайно актуальными.

В 1990 году, на длинном плече хромосомы 17 (локус 17ql2-21) был картирован ген-супрессор BRCA1 (Breast Cancer Associated), нарушения которого, как предполагается, связаны с развитием рака молочной железы и яичников. По некоторым данным, около 80% семей с повышенным риском возникновения рака молочной железы и яичников имеют конститутивные нарушения гена BRCA1 [6,7]. Частота потери гетерозиготности в области локализации BRCA1 (17ql2-21) в спорадических случаях рака яичников составляет, в среднем, 70% [8]. В настоящее время, ген BRCA1 является одним из наиболее изучаемых генов-супрессоров опухолевого роста, однако его функции, а также механизмы инактивации в опухолевых клетках до конца не ясны. Неизвестно, какую роль играют генетические нарушения (LOH) в области 17ql2-21 в возникновении и прогрессии различных гистологических вариантов эпителиальных новообразований яичников. Не исключено, что другие гены-супрессоры, важные для развития рака яичников, локализованы в данной области генома. Помимо длинного плеча хромосомы 17, потери микросателлитных аллелей в карциномах яичников также отмечены на хромосомах 1, 3, 6, 7, 11, 18, 22, X (см. лит. обзор). Некоторые из локусов перечисленных хромосом, несомненно, могут быть ассоциированы с развитием данной патологии.

Кроме эпителиальных опухолей яичников, которые с молекулярно-генетической точки зрения изучены достаточно хорошо, существуют редкие нозологические единицы. К ним относятся карциносаркомы и гранулезоклеточные опухоли яичников. О генетических нарушениях в этих опухолях яичников практически ничего не известно.

Карциносаркомы яичников - смешанные опухоли, включающие как эпителиальный так и мезенхимальный компоненты, представляют собой крайне интересный биологический объект для молекулярно-генетического исследования.

Гранулезоклеточные опухоли яичников (ГКО) относятся к гормонопродуцирующим опухолям и характеризуются значительно более благоприятным прогнозом по сравнению с карциномами яичников и карциносаркомами. Однако, ГКО имеют ряд особенностей клинического проявления, в частности, способность рецидивировать спустя 5-10 лет после удаления первичной опухоли.

Таким образом, молекулярно-генетические аспекты возникновения и развития злокачественных новообразований яичников различных гистологических типов требуют дальнейшего изучения. Анализ генетических изменений в опухолях яичников с учетом их гистогенеза, а также выявление генетических нарушений, ассоциированных с прогрессией опухолей представляется чрезвычайно актуальным.

Целью настоящего исследования является изучение потери гетерозиготности в некоторых областях генома клеток опухолей яичников различного гистогенеза и степени злокачественности.

Исследование проводилось по двум направлениям:

I) Анализ частоты потери гетерозиготности микросателлитных локусов в опухолях яичников разных гистологических типов и степени злокачественности.

II) Анализ молекулярно-генетической гетерогенности: распределение делеций микросателлитных локусов в различных фрагментах одной опухоли.

Для этого предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1.Создать банк ДНК, полученный из архивного материала (парафиновые блоки) опухолей яичников различного гистогенеза: а) эпителиальных опухолей (доброкачественных, пограничных и злокачественных); б) гранулезоклеточных опухолей яичников; с) карциносарком яичников;

2. Выделить ДНК из различных участков опухоли каждой пациентки и I соответствующих нормальных тканей для оценки внутриопухолевой гетерогенности.

3. Исследовать, с использованием микросателлитных маркеров, потерю гетерозиготности и микросателлитную нестабильность в зонах локализации некоторых известных и предполагаемых генов-супрессоров, возможно, ассоциированных с развитием и прогрессией рака яичников (хромосомные локусы: 1р32-36, 7я31, 11р15, 17д12-21, Щ21-3).

4. Сопоставить результаты молекулярно-генетического анализа с традиционными клиническими параметрами в каждой гистологической группе опухолей отдельно.

5. Провести сравнительный анализ результатов проведенного исследования в трех гистологических группах опухолей.

Научная новизна выполненной работы обусловлена впервые проведенным сравнительным анализом молекулярно-генетических изменений в опухолях яичников различного гистогенеза: эпителиальных новообразованиях, карциносаркомах и гранулезоклеточных опухолей яичников. Молекулярно-генетическое исследование карциносарком яичников, анализ нарушений в области гена-супрессора BRCA1 (Breast Cancer Associated), ассоциированного с развитием рака яичников и молочной железы, в гранулезоклеточных опухолях также проведено впервые.

Показано, что нарушения в области локализации гена-супрессора BRCA1 (17ql2-21) характерны только для: определенных гистологических типов новообразований яичников. Делении в локусе 17ql2-21 специфичны для большинства гистологических типов карцином, карциносарком и не характерны для гранулезоклеточных опухолей яичников.

Полученные нами результаты позволяют предположить, что неизвестные ранее, потенциальные гены-супрессоры находятся в локусах 7q31 и 18q21-3; нарушения на хромосоме 7 характерны для эпителиальных опухолей, а изменения на хромосоме 18, возможно, играют важную роль в развитии карциносарком.

Идентификация генетических изменений в нескольких образцах каждой опухоли, с использованием панели маркеров позволило сделать вывод о существовании внутриопухолевой молекулярно-генетической гетерогенности. Фрагменты каждой опухоли, представленные клетками различной или одинаковой морфологии и степени дифференцировки, характеризовались определённым спектром генетических изменений. Такие результаты позволяют судить о вкладе исследуемых изменений в прогрессию новообразований яичников.

В большинстве карцином яичников делеции в области BRCA1 наблюдались в менее дифференцированных фрагментах опухолей. Таким образом, было показано, что нарушения в области BRCA1 происходят уже после злокачественной трансформации и могут быть ассоциированы с прогрессией аденокарцином яичников.

При исследовании карциносарком яичников были обнаружены идентичные генетические изменения в обоих компонентах опухоли: в саркоматозном и у эпителиальном, на основании чего был сделан вывод о моноклональном возникновении данных новообразований. Наличие более узкого спектра генетических изменений в метастазах карциносарком по сравнению с обоими компонентами первичных опухолей, свидетельствует о том, что в этих случаях метастазирование, а значит злокачественная ^ трансформация и начальные этапы злокачественной прогрессии произошли до формирования фенотипически разнородных фрагментов опухолей. Последнее утверждение подтверждает "комбинационную" теорию развития карциносарком из мультипотентной стволовой клетки.

Таким образом, данные, полученные при изучении карциносарком яичников расширяют представления о возможных механизмах опухолеобразования, затрагивая вопрос о развитии новообразования из "опухолевого зачатка" представленного' недифференцированными, камбиальными структурами органа.

Результаты проведенного молекулярно-генетического анализа, свидетельствующие о разнице в частоте потери гетерозиготности в новообразованиях яичников различного гистогенеза, позволяют более полно охарактеризовать отдельные гистологические типы опухолей яичников с молекулярно-генетической точки зрения.

Проведенное исследование расширяет возможности дифференциальной диагностики рака яичников, т.к. потери микросателлитных аллелей в области гена-супрессора ВЯСА1 (17д12-21) являются специфичными генетическими изменениями для злокачественных эпителиальных опухолей яичников и могут быть использованы в качестве дополнительного теста при дифференциальной диагностике пограничных и злокачественных эпителиальных новообразований серозного, мезонефроидного и эндометриоидного типа.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1.Введение.

Трансформация фенотипически нормальных клеток в анаплазированные является следствием каскадного накопления в их геноме различных нарушений. Значительный / вклад в малигнизацию клетки вносят повреждения генов, регулирующих клеточную пролиферацию и дифференцировку.

Вследствие хромосомных перестроек, амплификаций, точечных мутаций или вирусной интеграции в геном происходит активация онкогенов. При делеции участка хромосомы или полной ее утрате, а так же в результате точечных мутаций инакгивируются антионкогены или гены-супрессоры опухоли. Онкогены и гены-супрессоры, по сути, нормальные клеточные гены с ключевыми функциями регуляции роста и дифференцировки клеток. Тогда как в норме протоонкогены стимулируют процессы, связанные с клеточным делением, гены-супрессоры отвечают за его подавление. Нарушения в пределах всего одной копии или аллеля протоонкогена достаточно для превращения его в онкоген с возросшей стимулирующей активностью. Таким образом, онкогены можно рассматривать как доминантные трансформирующие гены. Гены-супрессоры, напротив, проявляются рецессивным образом: инактивация обоих аллелей приводит к нарушению клеточной пролиферации и дифференцировки. Мутации антионкогенов, являются основой наследственной предрасположенности к раковому заболеванию, т.к. потеря функции одного из двух аллелей может быть терминальной. В настоящее время известно около 100 различных онкогенов и около 10 генов-супрессоров. В процессе злокачественной трансформации клетки происходят многочисленные повреждения как онкогенов, так и антионкогенов.

Третий класс генов, ассоциированных с процессами опухолеобразования, так называемые гены "мисмэтч" репарации, впервые были описаны в работах на Esherichia coli и грибах [9]. Предполагается, что ошибки репликации, происходящие вследствие недостатка или отсутствия продуктов этих генов, могут сказываться на экспрессии генов, регулирующих клеточный рост, в частности онкогенов и антионкогенов. Предрасположенность к опухолевым заболеваниям также может быть обусловлена наследуемыми нарушениями генов системы репарации ДНК. Несомненно, существуют дополнительные категории генов, участвующих в процессах неоплазии и прогрессии рака.

Динамика неоплазии и малигнизации описана следующей теорией [10]: любое воздействие, которое поражает клетку или группу клеток и их строму так, что они не могут продолжительное время реагировать соответственно силам, поддерживающим нормальное состояние ткани, органа и организма, может индуцировать развитие неоплазмы. Прогрессия индуцированной неопластической системы является результатом серии нарушений реципроктного взаимодействия между группой клеток и стромой. Эти изменения продуцируют самодезорганизирующую систему, прогрессирующую в неспособности отвечать восстанавливающим силам ткани и органа. Если рассматривать рак в аспекте его прогрессии, то можно выделить начальный этап неоплазии и последующие пять классов неопластических нарушений: 1) предшествующее состояние; 2) промежуточная стадия; 3) первичный рак; 4) метастазы; 5) метастазы от метастазов.

Структурные и функциональные нарушения тканей, относящиеся к предшествующей стадии, разделяют на несколько подклассов, один из которых включает диспластические изменения [1]. Ткани, претерпевшие предшествующие неоплазме изменения, характеризуются наличием интактной, хотя и несколько изменённой, базальной мембраны. До тех пор, пока она будет оставаться интактной, возможно сохранение некоторых форм нормальной тканевой организации.

Промежуточные изменения названы соответственно их проявлению -промежуточному между диспластическими нарушениями предшествующей стадии и первичным раком. Прототипом этого класса изменений служит внутриэпителиальный рак ( cr in situ ), где имеют место все диспластические нарушения, плюс полностью атипичные клетки паренхимы, утолщенная или измененная иным образом базальная мембрана. Изменения, происходящие на этой стадии, всё больше приближают фенотип клеток неоплазмы к злокачественному, но способность давать метастазы отсутствует.

Рак определяется способностью трансформированных клеток к неограниченному росту в различных тканевых компартментах. Гетерогенность является характерной чертой первичного рака: одни области ещё сохранили некоторую специфичность тканевой структуры (высокодифференцированный рак), другие участки состоят из клеток, гистологическая идентификация которых практически невозможна (низкодифференцированный рак). Способность первичного рака давать метастазы подразумевает разрушение базальной мембраны кластером метастатических клеток. Прогрессирующая агрессивность малигнизированных клеток выражается в последнем и обычно фатальном феномене рака - образовании метастазов второго и следующих порядков.

Концептуальные знания о молекулярно-генетических причинах рака, рассмотренные в контексте неопластического морфогенеза, позволяют охарактеризовать процессы опухолеобразования более полно. Совершенно очевидно, что каждая новая стадия развития опухоли, обусловлена критическими изменениями молекулярно генетического статуса клетки.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Ельчева, Ирина Александровна

V. выводы

1. Разные гистологические варианты эпителиальных опухолей яичников демонстрируют различный уровень генетической (аллельной) нестабильности. Мезонефроидные и серозные злокачественные опухоли яичников, в целом, характеризуются более высокой частотой потери гетерозиготности в пяти исследованных хромосомных локусах. Эндометриоидные опухоли яичников демонстрировали высокий уровень образования аллелей новой длины (25%), т.н. RER+ фенотип (Replication Error), что не характерно для других гистологических типов.

2. Показано, что генетические изменения в исследованных нами хромосомных локусах происходят на разных этапах развития эпителиальных новообразований яичников: потеря гетерозиготности в локусах 1р32-36 и 7q31 ассоциирована с ранними этапами формирования опухолей яичников, стадиями доброкачественного и пограничного роста. Генетические изменения в локусе 17q 12-21 ассоциированы с малигнизацией пограничных и/или прогрессией злокачественных опухолей яичников. Делеции в локусах 11р15 и 18q21-3, как правило, происходят на более поздних этапах прогрессии злокачественных эпителиальных новообразований яичников.

3. Высокая частота потери гетерозиготности (LOH-48.8%) в локусе 7q31 (маркер D7S522) в эпителиальных опухолях яичников свидетельствует о нахождении в этой области генома потенциального гена-супрессора, важного для развития новообразований яичников эпителиальной природы.

4. Наиболее делецируемым локусом для всех четырех типов карцином яичников является область локализации гена-супрессора BRCA1 (17ql2-21) (LOH-78.4%), ассоциированного с развитием рака яичников. Потери микросателлитных аллелей

118 на хромосоме 17, в области ВЯСА1 являются специфичными генетическими изменениями для злокачественных эпителиальных опухолей не муцинозного типа и могут быть использованы в качестве дополнительного теста при дифференциальной диагностике пограничных и злокачественных эпителиальных новообразований серозного, мезонефроидного и эндометриоидного типа.

5. Низкая, соответствующая "фоновой," частота потери гетерозиготности в зоне локализации ВЯСА1 в гранулезоклеточных опухолях указывает на неспецифичность нарушений этого гена при данной патологии.

6. Обнаружены идентичные нарушения микросателлитных локусов в эпителиальном и мезенхимальном компонентах карциносарком, что свидетельствует в пользу предположения о моноклональной природе карциносарком яичников. Показано, что в ряде случаев метастазирование карциносарком происходит до дифференцировки эпителиального и мезенхимального компонентов опухоли.

7. Уровень генетической нестабильности в локусе 18д21 значительно выше в карциносаркомах по сравнению с эпителиальными злокачественными опухолями яичников. Таким образом, в локусе ^21 возможно нахождение гена-супрессора, ассоциированного с развитием карциносарком яичников.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ельчева, Ирина Александровна, 2000 год

1. Краевский Н.А., Смольянникова А.В. Саркисова Д.С. Патологическая диагностика опухолей человека (руководство для врачей). // Москва "Медицина" 1993, т. 1, стр. 6275.

2. Хем А., Кормак Д. Гистология // Москва, Мир, 1983 т.5, стр. 126-136.

3. Глазунов М.Ф. "Опухоли яичников". //Ленинград, 1961.

4. Карселадзе А.И. "Морфология эпителиальных опухолей яичников"(вопросы морфологической семиотики, гисто- и морфогенеза). //Диссертация на соискание д.м.н. Москва 1989.

5. Краевский Н.А., Смольянникова А.В, Саркисова Д.С. Патологическая диагностика опухолей человека (руководство для врачей). // Москва "Медицина" 1993, т. 1, стр. 90-92.

6. Easton DF, Ford D, Bishop T, Crockford GP and the Breast Cancer Linkage Consortium. Genetic onset familial breast and ovarian cancer; results from 214 families. // Am J Hum Genet 1993; 52: 678-701.

7. Narod SA, Ford D, Devilee, et al An Evaluation of genetic Heterogeneity in 145 Beast -Ovarian cancer Families. (1995) // Am. J. Hum. Genet. 56: 254-264.

8. Foulkes W.D., Black D.M., Stamp G.W.H., Solomon E., Trowsdale J. Very frequent loss of heterozygosity throughout cromosome 17 in sporadic ovarian carcinoma. // Int.J.Cancer. 1993. V. 54. P. 220-225.

9. Arnold J. Levin The Genetic Origins of Neoplasma // JAMA, Februaryl5, 1995, Vol 273, No.7: 592.

10. Wallace H. Clark The Nature of Cancer: morfogénesis and progressive (Self)-disorganization in neoplastic development and progression. // Acta Oncológica 1995, Vol 34, No 1:3-21.

11. Chang H. Bridgewoter J, Gore M. Non-surgical aspects of ovarian cancer. // Lancet, 343, 335-527.

12. Shelling A.N., CookeI.E., Ganesan T.S. The genetic analysis of ovarian cancer. // British J of Cancer 1995, 72: 521-527.

13. Puis L.E., Powell D.E., De Priest P.D., Gallion H.H. Transition from benign to malignant epithelium in mucinous and serous ovarian cystadenocarcinoma. // Gynecol Oncol, 1992, 47:53-57.

14. Holly H. Gallion, Maura Pieretti, Paul D. DePriest and J.R. van Nagell The Molecular Basis of Ovarian Cancer. // CANCER Supplement 1995, November 15, Vol. 76, No.l0:1992-1997.

15. Lynch HT, et al Hereditaiy nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndromes I and II). // Cancer 1985, 15:938-8.

16. Godwin A.K., Testa J.K., Handel L.M. Spontaneous Transformation of rat ovarian surface epithelial cells: association with cytogenetic changes and implication for repeated ovulation in the etiology of ovarian cancer. // J. Natl Cancer Inst 84:592-601.

17. Tanja Pejovic Genetic Changes in Ovarian Cancer. II Ann Med 27: 73-78, 1995

18. Thompson FH., Liu Y., Emerson J., Weinstein R, Makar R., Trent JM. Simple numeric abnormales as primary karyotype changes in ovarian carcinoma. // Genes Chromosom Cancer 1994, 10:262-266.

19. Pejovic T., Hiem S., Mandahl N., et al. Chromosome aberration in 35 primary ovarian carcinomas. // Genes Chromosom Cancer 1992, 4: 58-68.

20. Jenkins RB., Barteit D Jr., Staldoerger P., et al Cytogenetic studies of epithelium ovarian carcinoma. // Cancer Genet Cytogenet 1993, 71: 76-86.

21. Sato T., Saito H., Morita R., Koi S, LeeJH., Nakamura Y. Allelotype of human ovarian cancer. // Cancer Res 1991, 51: 5118-5122.

22. Thompson FH., Emerson J., Alberts D., et al Clonal chromosome aberration in 54 cases of ovarian carcinoma. // Cancer Genet Cytogenet 1994, 73: 33-45.

23. Wang Peng J., Kao-Shau CS., Lee EC., et al. Specific chromosome defect associated with human small cell lung cancer: deletion of 3p(pl4-23). // Science 1982; 215: 181-182.

24. Kovacs G., Frish S. Clonal chromosome abnormalities in tumor cells from patients with sporadic renal cell carcinomas. // Cancer Res 1989, 49:651-659.

25. Ehlen T, Dubeau L. Loss of heterozygosity on chromosomal segments 3p, 6q and 1 lp in human ovarian carcinomas. // Oncogene 1990, 5:219-223.

26. Tanaka K., Boice CR, Testa JR. Chromosome aberrations in nine patients with ovarian cancer. // Cancer Genet Cytogenet 1989, 43: 1-14.

27. Trent JM., Samlon SE. Karyotypic analysis of human ovarian carcinoma cells cloned in short term agar culture. // Cancer Genet Cytogenet 1981, 3: 279-291.

28. Wake N., Hreshchyshyn MM., Piver SM., Matsui S., Sandberg AA. Specific cytogenetic changes in ovarian cancer involving chromosomes 6 and 14. // Cancer Res 1980, 40: 45128.

29. Foulkers WD, Ragoussis J, Stamp GWH, Allan GJ, Trowsdale J. Frequent loss of heterozygosity on chromosomes 6 in human ovarian carcinoma. // Br J Cancer 1992, 52: 5815-7.

30. Dutrillaux B, Gerbault-Seureau M, Zafrani B. Characterization of chromosomal anomalies in human breast cancer. A comparison of 30 paradiploid cases with few chromosome changes. // Cancer Genet Cytogenet 1990, 49: 203-217.

31. Sandors J, Mark J, Happonen R-P, Stenman G. Specificity of 6q- markers and other recurrent deviations in human malignant salivary gland tumors. // Anticancer Res 1988, 8: 637-44.

32. Lee JH, Kavanagh JJ, Wildrick DM, Wharton JT, Blick M. Loss of heterozygosity on chromosomes 6q, 11 and 17 in human ovarian carcinomas. // Cancer Res 1990, 50:27242728.

33. Viel A, Giannini F, Tumiotto L, Sopracordevole F, Visentin MC, Boicchi M. Chromosomal localization of two putative 1 lp oncosuppressor genes involved in human ovarian tumours. // Br J Cancer 1993, 66:1030-6.

34. Eccles DM, Gruber L, Stewart M, Steel CM, Leonard RC. Allele loss on chromosome lip associated with poor survival in ovarian cancer. // Dis Markers 1992, 10: 95-99.

35. Weinberg RA. Oncogenes, antioncogenes, and the molecular basis of multistep carcinogenesis. // Cancer Res 1989, 49:3713-21.

36. Bishop JM, The molecular themes in oncogenesis. // Cell 1991, 64: 235-48.

37. Slamon DJ, Clark GM, Mong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. // Science 1987, 235:177-82.

38. Berchuck A, Kamel A, Whitaker R, Rodrigues G et al Overexpression of HER-2/neu is associated with poor survival in advanced epithelial ovarian cancer. // Cancer Res 1990, 50:4087-91.

39. Haldane JS, Hird V, Hughes CM, Gullick WJ. c-erbB-2 oncogene expression in ovarian cancer. // J Pathol 1990, 162:231-7.

40. Neuman WL, Wasylyshyn ML, Lacoby R, et al Evidence for a common molecular pathogenesis in colorectal, gastric, and pancrieatic cancer. // Genes Chromosom Cancer 1991, 3:468-73.

41. Mok SCH, BellDA, KnappRC, Fishbaugh PM, Welch WR, Muto MG, et al. Mutation K-ras protooncogene in human ovarian epithelial tumors of borderline malignancy. // Cancer Res 1993, 53:1489-92.

42. Pieretty M, Powell DE, Gallion HH, Case EA, Conway PS, Turker MS. Genetic alterations on chromososme 17 distinguish different types of epithelial ovarian tumors. // Hum Pathol 1995,26:393-7.

43. Horan HP, Vitasi V, Thor A, Jhuchi N, Hlom J. Quantitation of Harvey ras p21 enhanced expression in human breast and colon carcinomas. II J Natl Cancer 1987, 79, 59-65.

44. Santos GF, Scott GK, Lee WMF, Liu F, Benz C. Estrogen-induced post-transcriptional modulation of c-myc protooncogene expression in human breast cancer cells. // J Biol Chem 1988, 263:9565-9568.

45. Baker W, Borst MP, Dixon D, Hatch KD, Shingleton HM, Miller D. c-myc amplification in ovarian tumours. // Gynecol Oncol 1990, 38:340-342.

46. Tashiro H, Miyazaki K, Okamura H, Iwai A, Fukumoto M. C-myc over-expression in human primary ovarian tumours: its relevance to tumour progression. // Int J Cancer 1992, 50: 828-833.

47. Rosen A., Sevelda P., Klein M., et al., First experience with FGF-3 (INT2) amplification in women with epithelial ovarian cancer. // Br J Cancer 1993, 67:1122-5.

48. Alfonso Bellacosa, Daniela de Feo et al, Molecular alteration of the AKT2 oncogene in ovarian and breast carcinomas. // IntJ of Cancer 1995 64:280-285.

49. Jayne A. Mattews and Lary Krirca. Analytical Strategies for the use of DNA Probes. (Review).// Analytical biochemistry 1988, 169: 1-25.

50. R.J. Osbora, V.Leech Polymerase chain reaction allelotyping of human ovarian cancer. // Br J Cancer 1994, 69:429-438.

51. Weitzel JN. Patel J, Smith DM, Goodman A, Safaii H, Ball HG Molecular genetic associated with ovarian cancer. // Gynecol Oncol 1994, Nov.55(2): 245-52.

52. Zenldusen J.C, J.N Weitzel, Harrison G Ball and Claudio J Conti. Allelic loss at 7q31.1 in human primary ovarian carcinomas suggests the existence of a tumor supressor gene. // Oncogene 1995 11, 359-363.

53. Kiechle-Schwarz M, Bauknecht T, Wienker T, Walz L, Pfleiderer A Loss of constitutional heterozygosity on chromosome lip in human ovarian cancer. Positive correlation with grade of differentiation. // Cancer 1993, Oct 15; 72 (8): 2423-32.

54. Schildkraut JM, Collins NK, Georgette A, Dent, Tucker AJ, Barret JC, et al Loss of heterozygosity on chromosome 17ql 1-21 in cancers of women who have both breast and ovarian cancer.// Am J Obstet Gynecol Vol 172, 3, 908-913.

55. Wertheim I, Tangir J, Muto MG, Welch, RS Berkowitz, WY Chen and SC Mok. Loss of heterozygosity of chromosome 17 in human borderline and invasive epithelial ovarian tumors. // Oncogene (1996) 12, 2147-2153.

56. Jacobs I, Lancaster J. The molecular genetics of sporadic and familial epithelial ovarian cancer. // Int Gynecol Cancer 1996, 6, 337-355.

57. Holl JM, Lee MK, Newman B, Morrow JE, Anderson LA, Huey B and King MC Linkage of early-onset familial breast cancer to cromosome 17q21. // Science 1990 250: 1684-1689.

58. Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, Futreal PA, Harshman K, Tavtigian S, Liu Q, Cochran C, Bennett LM, Ding W et al A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. // Science 1994 266, 66-71.

59. Smith TM. Lee Mk. Szabo CI. Jerome N. McEuen M. Taylor M. Hood L. King MC. Complete genomic sequence and analysis of 117 kb of human DNA containing the gene BRCA1. Genome Res. 1996 Nov; 6(11): 1029-49.

60. Coene E, Van Oostveldt P, Willems K, van Emmelo J, De Potter CR BRCA1 is localized in cytoplasmic tube-like invaginations in the nucleus. // Nat Genet 1997 Jun;16(2): 122-124.

61. Thakur S, Zhang HB, Peng Y, Le H, Carroll B, Ward T, Yao J, Farid LM, Ciuch FJ, Wilson RB and Weber BL.Localization of BRCA1 and a splice variant identifies the nuclear localization signal (1997). IIMol. Cell Biol., 17, 44-452.

62. YuLi Chai, Jian-qi, Ningsheng Shao, E Shyam P Reddy and Veena N Rao The second BRCT domain of BRCA1 proteins interacts with p53 and stimulates transcription from the p21wafi/cipi promoter u oncogene 1999 18:263-268.

63. Scully R, Anderson SF, Chao DM, Wei W, Ye RA, Livingston DM. BRCA1 is a component of the RNA polymerase II holoenzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1997) 94, 5605-5610.

64. Cui JQ, Shao N, Chai YL, Wang H, Reddy ESP, and Rao VN. BRCA1 splice variants BRCAla and BRCAlb associated with CBP coactivator. // Oncol. Reports, (1998b). 5, 591-595.

65. Marks JR, Huper G, Vaughn JP, Davis PL, Norris J, McDonnell DP, Wiseman RW, Futreal PA and Iglehart JD. BRCA1 expression is not directly responsive to estrogen. // Oncogene 1997 14:115-121.

66. Marquis ST, Rajan JV, Wyenshaw-Boris A, Xu J, Yin GY, Abel KJ, Weber BL and Chodosh LA. The developmental pattern of BRCA1 is required for embryonic cellular proliferation in the mouse. // Nature Genet., (1995) 11, 17-26.

67. Blackshear PE, Goldsworthy SM. Foley JF, Kimberly A McAllister, Bennett JM, Collins NK, Bunch DO, Brown P, Wiseman RW and Davis BJ. Brcal and Brca2 expression patterns in mitotic and meiotic cells of mice. // Oncogene 1998 16:61-68.

68. Zhang Hong-Tao, Zhang Xin, Zhao Hui-Zhen, Kajino Yuri, Weber B.L.Davis J.G, et al. Relationship of p215BRCA1 to tyrosine kinase signaling pathways and the cell cycle in normal and transformed cells. // Oncogene 1997, 14, 2863-2869.

69. Thompson ME, Jensen RA, Obermiller PS, Page DL, and Holt JT. Decreased expression of BRCA1 accelerates growth and is often present during sporadic breast cancer progression.(1995) // Nature Genet. 9, 444-450.

70. Holt JT, Thompson ME, Szabo C, Robinson-Benion C, Arteaga CL, King MC, Jensen RA. Growth regulation and tumour inhibition by BRCA1. // nature genetics 1996 March 12: 298-302.

71. Stattuck-Eiden D, McClure M, Simard J, Labrie F, Narod S, Couch ¥ et al a. Collaborative survey of 80 Mutations in the BRCA1 Breast and Ovarian Cancer Susceptibility Gene (1995) // JAMA, February 15, Vol 273, No.7: 535-541.

72. Zelada-Hedman M, Wasteson Arver B, Claro A, Chen J, Werelius B, Kok H,Sandelin K et al. A screening for BRCA1 mutations in breast and breast -ovarian cancer families from the Stockholm region. // Cancer Res 1997 Jun 15: 57(12): 2474-2477.

73. Struewing JP, Abeliovich D, Peretz T, Avishai N, Kaback MM, Collins FS, Brody LC. (1995) The carrier frequency of the BRCA1 185delAG mutation is approximately 1 percent in Ashkenazi Jewish individuals. // Nature Genetics vol 11, October 1995:198-200.

74. Knudson AG, Genetics in human cancer. // Ann.Rev. GenetA9&6, 20, 231-251.

75. Futreal PA, Liu Q, Shattuck-Eidens D, Cochran C, Harshman K, Tavtigian S, Bennett LM, Haugen-Strano A, Swensen J, Miki Y, et al BRCA1 mutations in primary breast and ovarian carcinomas. // Science 1994 Oct 7;266(5182):120-122.

76. Merajver S, Pham TM, Caduff RF, Chen M, Poy EL, Coonrey KA, Weber BL, Collins FS, Johnston C, Frank TS. Somatic mutations in the BRCA1 gene in sporadic ovarian tumours. // Nature Genetics (1995) vol 9, april 1995: 439-443.

77. Takahashi H, Chiu H, Bandera CA, Behbakht k, Liu PC, Couch FJ, Weber BL, LiVolsi VA, et al Mutation of the BRCA2 Gene in Ovarian carcinomas // CANCER RESEARCH 56, 2738-2741, June 15, 1996.

78. Struewing JP, Lerman C, kase RG, Giambarresi TR, Tucker MA. Anticipated Uptake and Impact of Genetic Testing in Hereditary Breast and Ovarian Cancer Families. // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention Vol. 4, 169-173, March 1995.

79. Chang J, Sharpe JC, A'Hern RP, Fisher C, Blake P, Shepherd J, Gore ME Carcinosarcoma of the ovary: incidence, pragnosis, treatment and survival of patients. // Ann Oncol 1995 Oct: 6(8): 755-758.

80. Gorstein F, Anderson TL, Malignant Mixed Mesodermal Tumirs: Carcinoma, Sarcoma, or Both. // Human Pathology, (1991) March, Vol 22, 3, 207-209.

81. George E, Manivel CJ, Dehner LP, et al Malignant mixed mullerian tumors: An immunohistochemical study of 47 cases, with histogenetic consideration and clinical correlation. I I Human Pathology, 22: 215-223, 1991.

82. Norris HP, Taylor HB: Postirradiation sarcomas of the uterus. // Obstet Gynecol 26: 689694, 1965.

83. Cunha GR, Bigsby RM, Cooke PS, et al: Stromal-epithelial interaction in adult organs. // Cell Differ 17: 137-148, 1985.

84. Montesano R, Saint Vincent L, Drevon C, et al Production of epithelial and mesenchymal tumors with rat liver cells transformed in vitro. // Int J Cancer 16: 550-558, 1975.

85. Fitchett JE, Hay ED: Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. // Dev Biol 131: 455-474, 1989.

86. Greenburg G, Hay ED: Cytoskeleton and thyroglobulin expression change during transformation of thyroid epithelium to mesenchyme-like cells. // Development 102: 605622, 1988.

87. Zuk A, Matlin KS, Hay ED: Type I collagen gel induced Madin-Darby canine kidney cells to become fusiform in shape and lose apical -basal polarity. // J Cell Biol 108: 903-919, 1989.

88. Hartman GC: Regeneration of the monkey uterius after surgical removal of the endometrium and accidental endometriosis. // West J Surg Obstet Gynecol 52: 87-98, 1944.

89. Padykula HA, Coles LG, Okulicz WC, et al The basalis of the primate endometrium: A Afunctional germinal compartment. // Biol Reprod 40: 681-690, 1989.

90. Costa MJ, Morris RJ, Wilson R, Judd R. Utility of immunohistochemistry in distinguishing ovarian sertoly-stromal cell tumors from carcinosarcomas. // Hum Pathol 1992 Jul; 23 (7): 787-97.

91. Costa MJ, Khan R, Judd R Carcinosarcoma ( MMMT) of the uterus and ovary. Correlation of clinical, pathologic, and immunohistochemical features in 29 cases. // Arch Pathol Lab Med 1991 Jun: 115(6) : 583-90.

92. Wada H, Enomoto T, Tsujimoto M, Nomuta T, Murata Y, Shroyer KR Carcinosarcoma of the breast: molecular-biological study for analysis of histogenesis. II Hum Pathol 1998 Nov; 29(11): 1324-8.

93. Hoist VA, Finkelstein S, Colby TV, Myers JL, Yousem SA. p53 and K-ras mutational genetyping in pulmanory carcinosarcoma, sprindle cell carcinoma, and pulmonary blastoma: implications for histogenesis. I I Am J Surg Pathol 1997 Jul: 21 (7): 801-11.

94. Zhuang Z, Lininger RA, Man YG, Albuquerque A, Merino MJ, Tavassoli FA Identical clonality of both components of mammary carcinosarcoma with differential loss of heterozygosity. II Mod Pathol 1997 Apr; 10(4): 354-62.

95. Robert H. Young. Ovarian Tumors Other Than Those of Surface Epithelial-Stromal Type (August 1991) II Human Pathol Vol. 22, No. 8.763-775.

96. Savage P, Constela D, Fisher C, Shepherd JH, barton DP, Blake P, Gore ME Granulosa cell tumors of the ovary: demographics, survival and management of advanced disease. // Clin Oncol (R Coll Radiol) 1998; 10(4): 242-5.

97. Biskind M.S. Biskind G.S. Development tumors in rat ovary after transplantation in to spleen. // Proc. Soc. Exper. Biol. a. med., 1944, 55,3,176-179.

98. Cooke I, O'Brien M, Charnock MF, Groome N and Ganesan TS. Inhibin as a marker for ovarian cancer. // British Journal of Cancer (1995) 71, 1046-1050.

99. Matzuk MM, Finegold MJ, Su J-GJ, Hsueh AJW, Bredley A: Alpha inhibin is a tumor suppressor gene with gonadal specificity in mice. // Nuture 360: 313-319, 1992.

100. Watson RH, Roy WJ, Davis M, Hitchcock A, Campbell IG. Loss of Heterozygosity at the a-Inhibin Locus on Chromosome 2q is Not a Feature of Human granulosa Cell Tumors.(1997) // Gynecologic Oncology 65, 387-390.

101. Fuller PJ, Verity K, Shen Y, Mamers P, Jobling T, Burger HG No evidence of a role for mutations or polymorphisms of the follicle-stimulating hormone receptor in ovarian granulosa cell tumors. I IJ Clin Endocrinol Metab 1998 Jan: 83(1): 274-279.

102. Max J. Coppes, Ying Ye, Raymond Rackley, Xiao-Ian Zhao, Gerrit Jan Liefers, Graham Casey and Brayan R.G. Williams. Analysis of WT1 in Granulosa Cell and Other Sex Cord-Stromal Tumors. // Cancer Research 53, 2712-2714, June 15, (1993).

103. Bieche I, Champeme MH, Matifas F, Cropp CS, Callahan R, Lidereau RTwo distinct regions involved in lp deletion in human primary breast cancer. // Cancer Res 1993 May 1;53(9): 1990-1994.

104. Bieche I, Champeme MH, Lidereau R et al. Loss and Gain of Distinct Regions of Chromosome lp in Primary Breast Cancer. // Clinical Cancer Reseach, 1, 123-127, 1995.

105. Edelson MI, SW Sherer, LC Tsui, WR Welch, DA Bell, RS Berkowitz and SC Mok. Identification of a 1300 kilobase deletion unit on chromosome 7q31.3 in invasive epithelial ovarian carcinomas. // Oncogene (1997) 14, 2979-2984.

106. Weitzel JH, Patel J, Smith DM, Goodman A, Safaii H, Ball HG. Molecular genetic changes associated with ovarian cancer. // Gynecol Oncol 1994 Nov; 55 (2): 245-52.

107. Eccles DM, Gruber L, Sterwart M, Steel CM, Leonard RC. Allele loss on chromosome lip is associated with poor survival in ovarian cancer. // Dis Markers 1992 Mar-Apr; 10(2): 95-9.

108. Lu KH, Weitzel JN, Kodali S, Welch WR, Berkowitz RS, Mok SC. A novel 4-cM minimally deleted region on chromosome 1 lpl5.1 associated with high grade nonmucinous epithelial ovarian carcinomas. // Cancer Res 1997 Feb 1; 57 (3): 387-90.

109. J. Papp, B Csokay, P Bosze, Z Zalay, J Toth, B Ponder and E Olah Allele loss from large region of chromosome 17 is common only in certain histological subtypes of ovarian carcinomas. // British Journal of Cancer (1996) 74, 1592-1597.

110. M. Pieretti, DE. Powell, HH. Gallion, EA. Case, PS. Conway and MS Turker. Genetic alterations on chrimosome 17 distinguish different types of epithelial ovarian tumors. // Human Pathology Vol. 26. No. 4 (April 1995) 393-397.

111. Tangir I.J., Muto MG, Berkowitz RS, Welch WR, DA Bell and Mok SC. A 400 kb novel deletion centromeric to the BRCA1 gene in sporadic epithelial ovarian cancer. // Cancer Research. 1996. V. 12. P. 735-740.

112. Heiland A, Borresen-Dale AL, Peltomaki P, Hektoen m, Kristensen GB, Nesland JM, de la Chapelle A, Lothe RA Microsatellite instability in cervical and endometrial carcinomas. // Int J Cancer 1997 Mar 4; 70(5): 499-501.

113. Semba S, Yokozaki H, Yasui W, Tahara E Frequent microsatellite instability and loss of heterozygosity in the region including BRCA1 (17q21) in young patients with gastric cancer. Hint J Oncol 1998 Jun; 12(6): 1245-51.

114. Burger MG, Baillie A, Drummond AE, Healy DL, Jobling T, Mamers P, Robertson DM, Susil B, Cahir N, Shen Y, Verity K, Fuller PJ, Groome NP, Findlay JK. Inhibin and ovarian cancer. // JReprod Immunol 1998 Aug; 39(1-2): 77-87.

115. Rio PG, Maurizis JC, Peffault de Latour M, Bignon YJ, Bernard-Gallon DJ Quantification of BRCA1 protein in sporadic breast carcinoma with or without loss of heterozygosity of the BRCA1 gene. // Int J Cancer 1999 Mar 15; 80(6) : 823-6.

116. Sourvinos G, Spandidos DA Decreased BRCA1 expression levels may arrest the cell cycle through activation of p53 checkpoint in human sporadic breast tumors. // Biochem Biophys Res Commun 1998 Apr 7; 245 (1) : 75-80.