Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат медицинских наук Кекеева, Татьяна Владимировна

• Кекеева, Татьяна Владимировна
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Кекеева, Татьяна Владимировна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И ■ 1 >

1.1: Этиология и патофизиология рака предстательной железы.

1.2. Прогностические факторы рака предстательной железы.

1.3. Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы.

1.3.1. Хромосомные перестройки.

1.3.2. Потеря гетерозиготности и микросателлитная нестабильность.

1.3.3. Аномальное метилирование.

1.3.4. Обнаружение опухольспецифичной ДНК в биологических жидкостях.

1.4. Опухолевое микроокружение.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клинический материал.

2.2. Забор крови, операционного и биопсийного материала.

2.3. Лазерная микродиссекция.

2.4. Выделение геномной ДНК.

2.5. Выделение РНК.

2.6. Синтез кДНК.

2.7. Полимеразно-цепная реакция для определения химерных генов.

2. 8. Рестрикционный анализ.

2. 9. Метил-чувствительная ПЦР (МЧ-ПЦР).

2. 10. Обработка ДНК бисульфитом натрия.

2. 11. Секвенирование.

2.12. Микросателлитный анализ.

2. 13. Электрофорез в ПААГ.

2. 14. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра.

2. 15. Программное обеспечение.

2.16. Статистическая обработка данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ хромосомных перестроек TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV1.

3.1.1. Анализ хромосомных перестроек в образцах ДГПЖ.

3.1.2. Анализ хромосомных перестроек в образцах РПЖ.

3.1.3. Клинические ассоциации перестройки TMPRSS2/ERG4.

3.2.Анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности.

3.2.1. Анализ ПГ/МН в биоптатах РПЖ.

3.2.2. Анализ ПГ/МН в микродиссекционных образцах РПЖ.

3.2.3. Анализ ПГ/МН в микродиссекционных образцах ПИН.

3.2.4. Ассоциации частот ПГ/МН с клиническими параметрами.

3.3. Анализ аномального метилирования.

3.3.1. Метилирование генов в микродиссекционных образцах.

3.3.2. Метилирование генов в биопсийных и послеоперационных образцах.

3.3.3. Ассоциации частот метилирования исследуемых генов в образцах биоптатов с клиническими параметрами.

3.4. Анализ аномального метилирования в плазме крови пациентов с РПЖ.

3.5. Анализ частоты генетических и эпигенетических нарушений в строме РПЖ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетические изменения при раке предстательной железы»

Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. Смертность от РПЖ среди прочих онкологических заболеваний занимает третье место у мужчин после рака легкого и толстой кишки. Хотя пренеопластические изменения (простатические интраэпителиальные неоплазии, ПИН) могут быть обнаружены даже у 20-летних мужчин, а для 50-летних они обычны, клинически выявляемый РПЖ редко диагностируется раньше 60-70 летнего возраста.

В настоящий момент основным диагностическим критерием РПЖ является патологоанатомическое исследование. Молекулярно-генетические же маркеры в клинической практике применяются в исключительных случаях или находятся в стадии научных разработок. В опухолевых тканях обнаруживается большое количество структурных перестроек, прежде всего транслокаций и делеций, количество которых заметно нарастает по мере прогрессирования злокачественного роста. Среди таких нарушений наибольшего внимания заслуживают хромосомные перестройки, приводящие к образованию химерных генов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 с последующей гиперэкспрессией химерных онкогенов. Гомозиготные и гетерозиготные делеции, являются одними их самых частых генетических патологий РПЖ. Также одним из наиболее значимых механизмов канцерогенеза РПЖ является аномальное метилирование CpG-островков генов-супрессоров опухолевого роста. Учитывая, что молекулярные изменения являются наиболее ранними в канцерогенезе, применение подобных маркеров в клинике могло бы расширить возможности ранней диагностики и увеличить ее прогностический потенциал. Таким образом, приоритетным направлением в диагностике РПЖ является поиск и характеристика новых молекулярно-генетических маркеров с достаточной чувствительностью и специфичностью для применения в клинической практике.

За последнее десятилетие интенсивного изучения опухолевого микроокружения получено большое число убедительных данных, свидетельствующих о критической роли стромы в канцерогенезе. Опухолевая прогрессия зависит не только от молекулярных изменений эпителиальных клеток, но и от многочисленных изменений смежной стромы, обеспечивающей необходимое окружение для пролиферации, миграции, инвазии опухолевого эпителия в процессе неопластического роста. Изменения, происходящие в строме, включают изменения в профиле экспрессии ростовых факторов, цитокинов, преобразования в цитоскелете фибробластов и экстрацеллюлярном матриксе. Показано, что микроокружение способно стимулировать опухолевый рост эпителия, но и сама строма подвергается значительной модификации: изменению профиля экспрессии белков и различным генетическим перестройкам. Молекулярные повреждения генома стромальных клеток, такие как гиперметилирование генов-супрессоров, изменение длины теломер, потеря гетерозиготности (ПГ) и микросателлитная нестабильность (МЫ) на различных хромосомах, мутации, имеют свой особенный профиль и не повторяют генетическую патологию опухолевого эпителия. Однако сведения об эпигенетических и генетических нарушениях в строме, ассоциированной с опухолевым эпителием, появились совсем недавно и требуют более детального изучения для идентификации новых маркеров, терапевтических мишеней и понимания механизмов возникновения опухоли в целом.

Настоящее исследование посвящено изучению генетических и эпигенетических нарушений в опухоли и ее микроокружении, а также оценке диагностической значимости этих нарушений как потенциальных маркеров РПЖ.

Цель работы — изучение молекулярно-генетических изменений, происходящих на разных этапах канцерогенеза РПЖ в ткани опухоли, в опухолевом эпителии и смежной с ним строме.

Задачи исследования.

1. Определить частоту химерных онкогенов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 в ткани РПЖ и оценить их диагностическую значимость.

2. Оценить частоту ПГ/МН локусов 8р22, 13ql4 и 16q23 в опухолевом эпителии и смежной строме РПЖ, а также при предраковых состояниях ПИН.

3. Охарактеризовать частоту метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 в опухолевом эпителии и его стромальном микроокружении. Провести сравнение частот метилирования изученных генов в микродиссекционных и биопсийных образцах предстательной железы.

4. Провести сравнительный анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом эпителии и строме.

5. Выявить возможные ассоциации между изученными генетическими и эпигенетическими изменениями и клиническими параметрами РПЖ.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования изучены генетические и эпигенетические изменения РПЖ на материале опухолевых, неопластических и гиперпластических желез с применением метода лазерной микродиссекции. Впервые охарактеризованы молекулярно-генетические изменения стромального опухолевого микроокруження. Определено, что в строме РПЖ частоты молекулярных повреждений не уступают таковым в опухолевом эпителии. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны. Частота ПГ/МН на ранних этапах канцерогенеза в строме намного превышает таковую в эпителии.

Впервые на российской выборке охарактеризована частота химерных перестроек TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 и показана специфичность этих нарушений для РПЖ.

Практическая значимость.

Одной из наиболее важных практических задач ДНК-диагностики в онкологии является создание эффективных и экономичных диагностических протоколов, основанных на молекулярно-биологических технологиях, внедрение которых позволит повысить результативность лечения РПЖ. В работе показано, что образование химерного гена TMPRSS2/ERG4 является частым, опухоль-ассоциированным событием при РПЖ. Достоверное различие по частотам образования химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 обнаружено также в группах пациентов РПЖ с поражением одной и обеих долей ПЖ, т.е. между стадиями Т2а и Т2Ь, а также в группах пациентов, проходивших гормональное лечение и не проходивших. Экспрессия данного транскрипта коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ и маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогенчувствительности опухолевых клеток. Преимуществом данного метода является возможность работать с образцами опухоли без выполнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РПЖ.

В результате исследования обнаружены статистически достоверные ассоциации аллельных потерь в эпителии локуса 16q23 со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. Для локуса 13ql4 обнаружены достоверные корреляции со стадией процесса. Для гена GSTP1 обнаружено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН и пациентов с опухолевым процессом. Метилирование гена N33 не было обнаружено в предраковых состояниях, тогда как частота метилирования этого гена в аденокарциноме составила 22%. Обнаруженные молекулярные изменения могут использоваться как молекулярные маркеры РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому.

Полученные результаты могут служить для разработки диагностического протокола, основанного на анализе молекулярно-генетических нарушений, что позволит проводить скрининг и бороться с онкопатологией на самых ранних этапах ее возникновения, проводить мониторинг заболевания в периоды ремиссий, определять риск метастазирования в период лечения и определять тактику терапии в случае инактивации определенных генов-рецепторов.

Апробация работы.

Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005-2008 г.г., на конференции Российского общества медицинских генетиков в 2005 г., на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2006-2007 г., на I и II онкоурологических конгрессах в 2006-2007 г.

Работа удостоена золотой медали Российской академии медицинских наук на V Конференции молодых ученых России с международным участием в 2008 году. Работа заняла 1 место в конкурсе на лучший научный и инновационный проект студентов и молодых ученых российских и зарубежных вузов (в рамках Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова) в номинации «медицинская наука» в 2007 г.

По теме диссертации опубликовано 8 статей, 7 тезисов и 2 медицинских технологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспрессия TMPRSS2/ERG4 является частым, специфическим для РПЖ, событием и может быть использована как маркер РПЖ, а также маркер оценки ответа опухоли на гормональную терапию.

2. Высокая частота ПГ/МН по исследуемым локусам и метилирования изученных генов характерна как для эпителия РПЖ, так и для смежной с ним стромы. На ранних этапах канцерогенеза аллельные нарушения в строме преобладают над таковыми в эпителии.

3. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны.

4. Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготности локуса 16q23 и метилирование генов GSTP1 и N33 ассоциированы с прогресией РПЖ и могут использоваться в качестве диагностических маркеров.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Кекеева, Татьяна Владимировна

выводы.

1. Проведен анализ экспрессии химерных транскриптов TMPRSS2/ERG4, TMPRSS2/ETVI и TMPRSS2/ETV4 в образцах РПЖ. Частота перестройки TMPRSS2/ERG4 составила 50%, химерных генов TMPRSS2/ETV1 и TMPRSS2/ETV4 в нашей выборке пациентов с РПЖ не обнаружено.

2. Проведен анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 8р22, 13ql4 и 16q23 па 51 микродиссекционном образце ткани РПЖ, а также па 25 микродиссекционных образцах ПИН в опухолевом эпителии и смежной строме. Обнаружена высокая частота ПГ/МН по исследуемым локусам в эпителии аденокарциномы и смежной с ним строме. В образцах ПИН частота молекулярных повреждений в опухоли и строме была достоверно ниже, чем в образцах РПЖ, кроме локуса 13ql4.

3. Проведен анализ метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 в микродиссекционных образцах ткани РПЖ, определена высокая частота метилирования изученных генов как для малигнизированного эпителия, так и для близлежащей соединительнотканной стромы. В железах с ПИН высокой- степени частоты метилирования изученных генов близки к таковым в железах аденокарциномы. Сравнительный анализ метилирования в микродиссекционных и биопсийных образцах свидетельствует о необходимости микродиссекционного исследования при молекулярном анализе данного типа опухоли.

4. Проведен сравнительный анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом эпителии и строме. Определено, что в строме РПЖ частоты молекулярных повреждений не уступают таковым в опухолевом эпителии. Спектр и частота молекулярных повреждений, выявленных в железах аденокарциномы и стромальном компоненте РПЖ, не идентичны. Частота ПГ/МН на ранних этапах канцерогенеза в строме достоверно превышает таковую в эпителии.

5. Наличие химерного гена TMPRSS2/ERG4 ассоциировано с прогрессией РПЖ. Обнаружены статистически достоверные ассоциации аллельных потерь в эпителии локуса 16q23 со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. Определены достоверные корреляции со стадией РПЖ для локуса 13ql4. Для метилирования генов GSTP1 и N33 было найдено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН и пациентов с опухолевым процессом. Выявленные молекулярные изменения могут использоваться как молекулярные маркеры РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе изучено метилирование CpG-островков промоторных областей гена GSTP, р1б, HIC1 и N33 на материале опухолевых, неопластических и гиперпластических желез, а также их стромального микроокружения при раке предстательной железы. Обнаружен высокий процент метилирования как для опухолевых желез, так и для близлежащей соединительнотканной стромы. Эпигенетические изменения в етроме, вероятно, являются частью процесса взаимодействия опухоли и стромального микроокружения и являются еще одним свидетельством важной роли опухолевого микроокружения в процессах развития и прогрессии опухолей. Изменение метилирования генов, найденное в близлежащей ткани, показывает, что взаимодействие опухоли и ее окружения происходит на различных функциональных уровнях, в том числе и на эпигенетическом. Наше исследование подтверждает необходимость микродиссекционпого исследования при молекулярном анализе РПЖ, недооценка гетерогенности рака предстательной железы может приводить при анализе к появлению ложноотрицательных результатов. Проведен микросателлитный анализ хромосомных районов 8р22, 13ql4 и 16q23 в неопластических и стромальных клетках при раке предстательной железы и предраковых изменениях.

Результаты нашей работы свидетельствуют, что в строме РПЖ происходят многочисленные мутационные события, которые по частоте не уступают таковым в опухолевом эпителии. Изучение процессов взаимовлияния между опухолевыми и стромальными клетками является одним из направлений, необходимых для понимания механизмов канцерогенеза. Несомненно, что дальнейшее изучение этой проблемы откроет новые возможности в подходах к молекулярной диагностике и лечению рака предстательной железы.

Поиск и характеристика молекулярных маркеров ранней диагностики и прогноза развития опухолевого процесса на сегодняшний день являются наиболее актуальными проблемами онкологии. Определенные молекулярные маркеры или их сочетание позволяют определить прогноз развития заболевания, подобрать оптимальную тактику лечения и разработать новые терапевтические средства. Одной из наиболее важных практических задач ДНК-диагностики в онкологии является создание эффективных и экономичных диагностических протоколов, основанных на молекулярно-биологических технологиях, внедрение которых позволит повысить результативность лечения рака. В нашей работе показано, что образование химерного гена TMPRSS2/ERG4 является частым, опухоль-ассоциированным событием при РПЖ. Достоверные ассоциации наличия химерной перестройки найдены в группах больных с поражением одной доли и двух долей ПЖ, а также в группах пациентов, проходивших гормональное лечение и не проходивших. Экспрессия данного транскрипта коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ и маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогенчувствительности опухолевых клеток. Преимуществом данного метода является возможность работать с образцами опухоли без выполнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РПЖ.

Результаты нашей работы свидетельствуют о невысокой частоте метилирования генов-супрессоров в плазме крови пациентов с РПЖ, что, к сожалению, не позволяет нам рекомендовать использовать их как маркеры РПЖ.

В результате данного исследования мы обнаружили статистически достоверные ассоциации аллельных потерь в эпителии локуса 16q23 со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфоузлах. Для локуса 13ql4 также найдены достоверные корреляции со стадией процесса. Для гена GSTP1 было найдено статистически достоверное отличие между группами пациентов с ПИН и пациентов с опухолевым процессом. Метилирование гена N33 не было обнаружено в предраковых состояниях, тогда как частота метилирования этого гена в аденокарциноме составила 22%. Найденные молекулярные изменения могут использоваться как молекулярные маркеры РПЖ в дополнение к применяемым диагностическим методам — гистологическому и биохимическому.

Приведенные данные позволяют начать разработку диагностического протокола, основанного на анализе молекулярно-генетических нарушений. Аиализ метилирования генов GSTP1 и N33 в биоптатах пациентов с предраковыми состояниями позволяет выявить группу риска возникновения РПЖ. Микросателлитный анализ локусов 16q23 и 13q 14 может сориентировать в прогнозе уже развившегося РПЖ, определяет пациентов с высоким риском метастазирования. Экспрессия химерной перестройки TMPRSS2/ERG4 может служить маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию. В перспективе дальнейшая разработка стандартного набора ДНК-маркеров позволит эффективно проводить скрининг и бороться с онкопатологией на самых ранних этапах ее возникновения, проводить мониторинг заболевания в периоды ремиссий, определять микрометастазы в период лечения и определять тактику терапии в случае инактивации определенных генов-рецепторов.

В заключение подчеркнем, что активно развивающиеся сейчас молекулярно-генетические исследования в онкологии в ближайшем будущем позволят существенно изменить и расширить область применения генодиагностики при РПЖ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Кекеева, Татьяна Владимировна, 2008 год

1. Залетаев Д., Немцова М., Стрельников В. и др. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях // 2004. Молекуляр. биология. 38,213-223.

2. Кекеева Т., Жевлова А., Подистов Ю. и др. Аномальное метилирование генов-супрессоров опухолевого роста и микросателлитная нестабильность в предраковых состояниях шейки матки // 2006. Молекуляр. биология. 40, 224-230.

3. Кекеева Т., Попова О., Шегай П. и др. Анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности в стромальных и эпитедиальных клетках рака предстательной железы // 2007. Молекуляр. биология. 41, 79-85.

4. Кекеева Т., Попова О., Шегай П. и др. Аномальное метилирование генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 в эпителии и стромальных клетках рака предстательной железы // 2007. Молекуляр. биология. 41, 79-85.

5. Хансон К., Имянитов Е. Эпидемиология и биология рака предстательной железы // 2001. Практическая онкология. 2, 3-7.

6. Abate-Shen С., Shen М. Molecular genetic of prostate cancer // 2000. Genes and development. 14, 2410-2434.

7. Abdulcadir S., Magee J., Peters T. et al. Conditional loss of Nkx3.1 in adult mice induces prostatic intraepithelial neoplasia. // 2002. Mol Cell Biol. 22, 1495-1503

8. Afar D., Vivanco I., Hubert R. et al. Catalytic cleavage of the androgen-regulated TMPRSS2 protease results in its secretion by prostate and prostate cancer epithelia // 2001. Cancer Res. 61, 1686-1692.

9. Anker P., Mulcahy H., Chen X. Q. and Stroun M. Detection of circulating tumour

10. Arbieva Z., Banerjee K., Kim S. et al. High-resolution physical map and transcript identification of prostate cancer deletion interval on 8p22 // 2000. Genome Res. 10, 244-257.

11. Barcellos-Hoff M., Ravani S. Irradiated mammary gland stroma promotes the expression of tumorigenic potential by unirradiated epithelial cells // 2000. Cancer Res. 60, 1254-1260.

12. Barclay W., Woodruff R., Hall M. and Cramer S. A system for studying epithelial-stromal interactions reveals distinct inductive abilities of stromal cells from benign prostatic hyperplasia and prostate cancer // 2005. Endocrinology. 146, 13-18.

13. Bastian P., Palapattu G., Lin X. et al. Preoperative serum DNA GSTP1 CpG island hypermethylation and the risk of early prostate-specific antigen recurrence following radical prostatectomy // 2005. Clin. Cancer Res. 11, 4037-4043.

14. Bastian P., Yegnasubramanian S., G. Papalattu et al. Molecular biomarker in prostate cancer : the role of CpG island hypermethylation // 2004. Eur Urol. 46, 698-708.

15. Baylin S., Herman J., Graff J. et al. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia// 1998. Adv. Cancer. Res. 72, 141-196.

16. Bearzartto A., Conte D., Frattini M. et al. PI б hypermethylation detected by fluorescent methylation-specific PCR in plasmas from non-smal cell lung cancer // 2002. Clin. Cancer Res. 8, 3782-3787.

17. Bethel C., Faith D., Li X. et al. Decreased NKX3.1 protein expression in focal prostatic atrophy, prostatic intraepithelial neoplasia, and adenocarcinoma: association with gleason score and chromosome 8p deletion // 2006. Cancer Res. 66,10683-10690.

18. Bhowmick N., Neilson E., Moses H. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression // 2004. Nature. 432, 332-337.

19. Bian Y., Knobloch Т., Sadim M. et al. Somatic acquisition of TGFBR1*6A by epithelial and stromal cells during head and neck and colon cancer development // 2007. Hum Mol Genet. In print.

20. Braakhuis В., Tabor M., Kummer A. et al. A genetic explanation of Slaughter's concept of field cancerization: evidence and clinical implications // 2003. Cancer Res. 63,1727-1730

21. Buchanan G., Greenberg N., Scher H. et al. Collocation of androgen receptor gene mutations in prostate cancer // 2001. Clin Cancer Res. 7, 1273-1281.

22. Chandran U., Dhir R., Michalopoulos G. et al. Differences in gene expression in prostate cancer, normal appearing prostate tissue adjacent to cancer and prostate tissue from cancer free organ donors // 2005. BMC Cancer. 5, 45

23. Christiansen J. and Rajasekaran A. Reassessing epithelial to mesenchymal transition as a prerequisite for carcinoma invasion and metastasis // 2006. Cancer Res. 66, 83198326.

24. Chung L., Baseman A., Assikis V. and Zhau H. Molecular insights into prostate cancer progression: the missing link of tumor microenvironment // 2005. J. Urol. 173, 10-20.

25. Costello J., Plass C. Methylation matters // 2001. J. Med. Genet. 38, 285-303.

26. Dakubo G., Jakupciak J., Birch-Machin M. and Parr R. Clinical implications and utility of field cancerization // 2007. Cancer Cell Int. 7, 2.

27. Demichelis F., Fall K., Perner S. at al. TMPRSS2/ERG gene fusion associated with lethal prostate cancer // 2007. Oncogene. 26, 4596-4549.

28. Anker P., Mulcahy H., Chen X. and Stroun M. Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients // 1999. Cancer Metastasis Rev. 18, 6573.

29. Feinberg A.P., Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts // 1988. Nature. 301, 89-92.

30. Fidler I. Critical determinants of metastasis // 2002. Semin Cancer Biol. 12, 89-96

31. Florl A., Steinhoff C., Muller M. et al. Coordinate hypermethylation at specific genes in prostate carcinoma precedes LINE-1 hypomethylation // 2004. Br J Cancer. 91, 985-994

32. Fordyce C., Heaphy C., Joste N. et al. Association between cancer-survival and telomere DNA content in prostate tumors // 2005. J Urol. 173, 610-614.

33. Frank W., Xu M., Zhang M. et al. Microenvironmental genomic alterations and clinicopathological behavior in head and neck squamous cell carcinoma targets for therapeutic and preventive intervention // 2007. JAMA. 297, 187-195.

34. Fromont G., Vallancien G., Validire P. et al. BCAR1 expression in prostate cancer: association with 16q23 LOH status, tumor progression and EGFR/KAI1 staining // 2007. Prostate. 67, 268-273.

35. Fukino K., Shen L., Matsumoto S. et al. Combined total genome loss of heterozygosity scan of breast cancer stroma and epithelium reveals multiplicity of stromal targets // 2004. Cancer Res. 64, 7231-7236.

36. Fukino К., Shen L., Patocs A. et al. Genomic instability within tumor stroma and clinicopathological characteristics of sporadic primary invasive breast carcinoma // 2007. JAMA. 297, 2103-2111.

37. Gocke C., Benko F., Kopreski M., McGarrity T. p53 and APC mutations are detectable in the plasma and serum of patients with colorectal cancer (CRC) or adenomas // 2000. Ann N Y Acad Sci. 906, 44-50.

38. Gocke C., Kopreski M., Benko F. et al. Serum BCL2/IGH DNA in follicular lymphoma patients: a minimal residual disease marker // 2000. Leuk Lymphoma. 39, 165-172.

39. Goessl C., Krausc H., Muller M. et al. Fluorescent methylation-specific polymerase chain reaction for DNA-based detection of prostate cancer in bodily fluids // 2000. Cancer Res. 60, 5941-5945.

40. Goessl C., Muller M. and Miller K. Methylation-specific PCR (MSP) for detection of tumour DNA in the blood plasma and serum of patients with prostate cancer // 2000. Prostate Cancer and Prostatic Diseases. 3, 1.

41. Grover A., Tangrea M., Woodson K. et al. Tumor-associated endothelial cells display GSTP1 and RARb2 promoter methylation in human prostate cancer // 2006. Journal of Translational Medicine. 4, 13

42. Hammond M., Fitzgibbons P., Compton C. et al. College of american pathologists conference XXXV: solid tumors prognostic factors which, how and so what? // 2000. Arch Pathol Lab Med. 124, 958-965.

43. Hanson J., Gillespie J., Grover A. at al. Gene promoter methylation in prostate tumor associated stromal cells // 2006. J. Natl. Cancer Inst. 98, 255-261.

44. Harden S., Sanderson H., Goodman S. et al. Quantitative GSTP1 methylation and the detection of prostate adenocarcinoma in the sextant biopsies // 2003. J Natl Cancer Inst. 95, 1634-1637.

45. Harkonen P., Kyllonen A., Nordling S., Vihko P. Loss of heterozygosity in chromosomal region 16q24.3 associated with progression of prostate cancer // 2005. Prostate. 62, 267-274.

46. Hessels D., Rittenhouse H., Schalken. Molecular diagnostics in prostate cancer // 2005. EAU update series. 3, 200-213.

47. Hessels D., Smit F., Verhaegh G. et al. Detection of TMPRSS2-ERG fusion transcripts and prostate cancer antigen 3 in urinary sediments may improve diagnosis of prostate cancer // 2007. Clin Cancer Res. 13, 5103-5108.

48. Ни M., Yao J., Cai L. et al. Distinct epigenetic changes in the stromal cells of breast cancers // 2005. Nature Genet. 37, 899-905.

49. Huang S., Van Arsdall M., Tedjarati S. et al. Contribution of stromal metalloproteinase-9 to angiogenesis and growth of human ovarian carcinoma in mice // 2002. J Natl Cancer Inst. 94, 1134.

50. Iljin K., Wolf M., Edgren H., Gupta S. et al. TMPRSS2 fusions with oncogenic ETS factors in prostate cancer involve unbalanced genomic rearrangements and are associated with HDAC1 and epigenetic reprogramming. Cancer Res 2006; 66, 1024210246

51. Jarrard D., Bova G., Ewing C. et al. Deletional, mutational, and methylation analyses of CDKN2 (pl6/MTSl) in primary and metastatic prostate cancer. Genes Chromosomes Cancer. 1997 ;19, 90-96

52. Jemal A., Sieuel R., Ward E. et al. Cancer statistics // С A Cancer J. Clin. 2006. - V. 45. - P. 6-30.

53. Jeronimo C., Henrique R., Hoque M. et al. A quantitative promoter methylation profile of prostate cancer // Clin. Cancer Res. 2004. - V. 10. - P. 8472-8478.

54. Jeronimo C., Henrique R., Hoque M. et al. A quantitative RARbeta2 hypermethylation: a promising prostate cancer marker // Clin. Cancer Res. 2004. -V. 10.-P. 4010-4014.

55. Jeronimo C., Usadel H., Henrique R. et al. Quantitation of GSTPI Methylation in nonneoplastic prostatic tissue and organ-confined prostate adenocarcinoma // J. Natl. Cancer Inst. -2001,-V. 93.-P. 1747-1752.

56. Jeronimo С., Usadel H., Henrique R. et al. Quantitative GSTP1 hypermethylation in bodily fluids of patients with prostate cancer // Urology. — 2002. V. 60. - P. 11311135.

57. Johansson A., Jones J., Pietras K., et al. 2007 A stroma targeted therapy enhances castration effects in a transplantable rat prostate cancer model. Prostate 67, 1664-1676

58. Jones P.A., Leard P. Cancer epigenetics comes of age // Nat. Genet. — 1999. V. 21. — P. 163-167.

59. Joshua A., Vukovic В., Braude I. et al. Telomere attrittion in isolated high-grade prostatic intraepithelial neoplasia and surrounding stroma is predictive of prostate cancer//Neoplasia. -2007,- V. 9. -P. 81-89.

60. Kelly W., Richon V., O'Connor O. et al. 2003 Phase I clinical trial of histone deacetylase inhibitor: suberoylanilide hydroxamic acid administered intravenously. Clin Cancer Res 9, 3578-3588

61. Kinoshita H., Shi Y., Sandefur C. et al. Methylation of the androgen receptor minimal promoter silences transcription in human prostate cancer. Cancer Res 2000 60, 36233630

62. Knobloch R., Konrad L., Barth P. et al. Genetic pathways and new progression markers for prostate cancer suggested by microsatellite allelotyping // Clin. Cancer Res.-2004,-V. 10.-P. 1064-1073.

63. Konishi N., Nakamura M., Kishi M. et al. Genetic mapping of allelic loss on chromosome 6q within heterogeneous prostate carcinoma // Cancer Sci. 2003. — V. 94.-P. 764-768.

64. Kurose K., Gilley K., Matsumoto S. et al. Frequent somatic mutations in PTEN and TP53 are mutually exclusive in the stroma of breast carcinomas // Nature Genet. -2002.-V. 32.- P. 355-357.

65. Kurose K., Hoshaw-Woodard S., Adeyinka A. et al. Genetic model of multi-step breast cancerogenesis involving the epithelium and stroma: clues to tumour-microenvironment interactions // Hum Mol Genet. 2001. - V. 10. - P. 1907-1913.

66. Laxman В., Tomlins S., Mehra R. et al. Noninvasive detection of TMPRSS2:ERG fusion transcripts in the urine of men with prostate cancer. Neoplasia. 2006 8:885888

67. Lee S., Lee H., Kim J. et al. Abberant CpG island hypermethylation along multistep hepatocarcinogenesis // American J. Pathol. 2003. - V. 163. - P. 1371-1378.

68. Li L., Carroll P., Dahiya R. Epigenetic changes in prostate cancer: implication for diagnosis and treatment // J. Natl. Cancer Inst. 2005. - V. 97. - P. 103-115.

69. Lodygin D., Epanchintsev A., Menssen A. et al. Functional epigenomics identifies genes frequently silenced in prostate cancer // Cancer Res. 2005. - V. 65. - P. 42184227.

70. Loffek S., Zigrino P., Mauch C. Tumor-stroma interactions: their role in the control of tumor cell invasion and metastasis // JDDG. 2006. - V. 6. - P. 496-501.

71. Macintosh C., Stower M., Reid N. and Maitland N. Precise Microdissection of Human Prostate Cancers Reveals Genotypic Heterogeneity // Cancer Res. — 1998. V. 58. — P. 23-28.

72. Maffini M., Soto A., Calabro J., Ucci A. and Sonnenschein C. The stroma as a crucial target in rat mammary gland carcinogenesis // J. Cell Sci. 2004. - V. 117. - P. 1495502.

73. Massague J., Blain S. and Roger S. TGFB signaling in growth control, cancer and heritable disorders. 2000 Cell, 103, 295-309

74. Matsuyama II., Pan Y., Oba K. et al. Deletions on chromosome 8p22 may predict disease progression as well as pathological staging in prostate cancer // Clin. Cancer Res.-2001.-V. 7.-P. 3139-3143.

75. Matsuyama H., Pan Y., Yoshihiro S. et al. Clinical significance of chromosome 8p, lOq, and 16q deletions in prostate cancer. Prostate. 2003 54:103-111

76. McCarthy R., Zhang S., Bostwick D. et al. Molecular genetic evidence for different clonal origins of epithelial and stromal components of phyllodes tumor of the prostate //Am J Pathol. 2004.-V. 165.-P. 1395-1400.

77. Mehra R., Tomlins S., Shen R. et al. Comprehensive assessment of TMPRSS2 and ETS family gene aberrations in clinically localized prostate cancer. Mod Pathol. 2007 20, 538-544.

78. Melamed J., Einhorn J. and Ittmann M. Allelic loss on chromosome 13q in human prostate carcinoma// Clin. Cancer Res. 1997. - V. 3. - P. 1867-1872.

79. Mertz K., Setlur S., Dhanasekaran S. et al. Molecular characterization of TMPRSS2-ERG gene fusion in the NCI-H660 prostate cancer cell line: a new perspective for an old model. Neoplasia. Vol. 9, 2007, pp. 200 206

80. Minamoto Т., Mai M., Ronai Z. K-ras mutation: early detection in molecular diagnosis and risk assessment of colorectal, pancreas and lung cancers—a review // Cancer Detect Prev. 2000. - V. 24. - P. 1-12.

81. Mitelman F. Recurrent chromosomc aberrations in cancer. Mutation Res 2000 462, 247-253

82. Moinfar F., Man Y., Arnould L. et al. Concurrent and independent genetic alterations in the stromal and epithelial cclls of mammary carcinoma: implications for tumorigenesism // Cancer Res. 2000. - V. 60. - P. 2562-2566.

83. Molecular Oncology of prostate cancer. 2007 Eds: Ross J., Foster C. Jones and Bartlett publishers, pp.295-310

84. Mosquera J., Perner S., Demichelis F. et al. Morphological features of TMPRSS2-ERG gene fusion prostate cancer. 2007 J Pathol 212, 91-101

85. Oikawa Т., Yamada T. Molacular biology of Ets family of transcriptions factors. Gene 2003 303, 11-34

86. Olumi A., Grossfeld G., Hayward S. et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostate epithelium // Cancer Res. 1999. — V. 59.-P. 5002-5011.

87. Papadopoulou E., Davilas E., Sotiriou V. et al. Cell-free DNA and RNA in plasma as a new molecular marker for prostate and breast cancer. Ann N Y Acad Sci. 2006 1075:235-243

88. Parr R., Dakubo G., Crandall K. et al. Somatic mitochondrial DNA mutations in prostate cancer and normal appearing adjacent glands in comparison to age-matched prostate samples without malignant histology. J Mol Diagn 2006 8, 312-319

89. Paterson R., Ulbright Т., MacLennan G. et al. Molecular genetic alterations in the laser-capture-microdissected stroma adjacent to bladder carcinoma // Cancer. — 2003. -V. 98. P. 1830-1836.

90. Perner S., Demichelis F., Beroukhim R. et al. TMPRSS2:ERG fusion-associated deletions provide insight into the heterogeneity of prostate cancer. Cancer Res 2006; 66, 8337-8341

91. Perry A., Foley R., Woodson K. and Lawler M. The emerging roles of DNA methylation in the clinical management of prostate cancer // Endocrine-Related Cancer. 2006. - V. 13. - P. 357-377.

92. Persad S., Attwell S., Gray V. et al. Inhibition of ILK suppresses activation of protein kinase B/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2000 97, 3207-3212

93. Petrovics G., Liu a., Shaheduzzaman S. et al. Frequent overexpression of ETS-related gene-1 (ERG1) in prostate cancer transcriptome. Oncogene . 2005. 24, 3847-3852

94. Rodriguez-Canales J., Hanson J., Tangrea M. et al. 2007 Identification of a unique epigenetic sub-microenvironment in prostate cancer. J Pathol. 211. 410-419

95. Ross J., Jennings Т., Nazeer T. et al. 2003 Prognostic factors in prostate cancer. Am J Clin Pathol 120, 85-100

96. Roupret M., Hupertan V., Yates D. et al. Molecular detection of localized prostate cancer using quantitative methylation-specific PCR on urinary cells obtained following prostate massage // Clin. Cancer Res. 2007. - V. 13. - P. 1720-1725.

97. Rowley J. Chromosome translocations: dangerous liaisons revisited. Nat Rev Cancer 2001. 1,245-250

98. Sambrook J., Fritsh E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. // 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY

99. Sasanaki M., Tanaka Y., Perinchery G. et al. Methylation and inactivation of estrogen, progesterone and androgen receptors in prostate cancer. J Natl Cancer Inst 2002 94, 384-390

100. Schulz W., Hatina J. Epigenetics of prostate cancer: beyond DNA methylation. 2006 J Cell Mol Med 10, 100-125

101. Schwarzenbach H., Chun F., Lange I. et al. Detection of tumor-specific DNA in blood and bone marrow plasma from patients with prostate cancer. Int J Cancer. 2007 120:1465-1471.

102. Shiraishi H., Mikami Т., Yoshida T. Early genetic instability of both epithelial and stromal cells in esophageal squamous cell carcinomas, contrasted with Barrett's adenocarcinomas. 2006J Gastroenterol. 41:1186-1196.

103. Shulz W., Elo J., Florl A. et al. Genomewide DNA hypomethylation is associatedwith alterations on chromosome 8 in prostate carcinoma. Genes Chromosome Cancer. 35, 58-65. 2002

104. Singal R., Ginder G. DNA methylation // Blood. 1999. - V. 93. - P. 40594070.

105. Soto A., Sonnenschein C. et al. 2005 Emergentism as a default: cancer as a problem of tissue organization. J Biosci 30, 103-118

106. Stanbrough M. et al. Increased expression of genes converting adrenal androgens to testosterone in androgen independent prostate cancer. 2006 Cancer Res 66,2815-2825

107. Strohmeyer D., Berger A., Moore D. et al. Genetic aberrations in prostate carcinoma detected by comparative genomic hybridization and microsatellite analysis: association with progression and angiogenesis. Prostate 2004 59, 43-58

108. Taback В., Fujiwara Y., Wang H. et al. Prognostic significance of circulating microsatellite markers in the plasma of melanoma patients // Cancer Res. 2001. — V. 61. - P. 5723-5726.

109. Taback В., Giuliano A., Hansen N. and Hoon D. Microsatellite alterations detected in the serum of early stage breast cancer patients // Ann N Y Acad Sci. — 2001.-V. 945.-P. 22-30.

110. Tabor M., Brakenhoff R., Ruijter-Schippers H. et al. 2002 Multiple head and neck tumors frequently originate from a single preneoplastic lesions. Am J Pathol. 161, 1051-1060.

111. Tokumaru Y., Harden S., Sun D. et al. Optimal use of a panel of methylation markers with GSTPI Hypermethylation in the diagnosis of prostate adenocarcinoma // Clin. Cancer Res. -2004.-V. 10. P. 5518-5522.

112. Tomlins S., Laxman В., Dhanasekaran S. et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 2007. 448, 595-599

113. Tomlins S., Mehra R., Rhodes D. et al. Integrative molecular concept modeling of prostate cancer progression. 2007 Nat Genetics 39, 41-51

114. Tomlins S., Mehra R., Rhodes D. et al. TMPRSS2:ETV4 gene fusions define a third molecular subtype of prostate cancer. Cancer Res 2006 66,

115. Tomlins S., Rhodes D., Perner S. et al. Reccurent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer // Science. 2005. - V. 310. - P. 644-648.

116. Toning N., Borre M., Serensen K. et al. Genome-wide analysis of allelic imbalance in prostate cancer using the Affymetrix 50K SNP mapping array. Br J Cancer. 2007 96:499-506.

117. Ushijima Т., Okochi-Takada E. Abberant methylations in cancer cells: where do they come from? // Cancer Sci. 2005. - V. 96. - P. 206-211.

118. Valeri A., Fromont G., Sakr W. et al. High frequency of allelic losses in high-grade prostate cancer is associated with biochemical progression after radical prostatectomy. Urol Oncol 2005 23, 87-92

119. Vanpoucke G., Orr В., Grace O. et al. Transcriptional profiling of inductive mesenchyme to identify molecules involved in prostate development and disease.

120. Wang J., Cai Y„ Ren C. and Ittmann M. Expression of variant TMPRSS2/ERG fusion messenger RNAs is associated with aggressive prostate cancer Cancer Res 2006 66, 8347-8351

121. Wang X., Fan M., Sun Z. et al. The TP53 and RPS6 alterations at the invasive tumor front, center and stroma of oral squamous cell carcinoma. 2007 Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 42:140-143

122. Watanabe M., Nakayama Т., Shiraishi T. et al. Comparative studies of prostate cancer in Japan versus United States // Urol. Oncol. 2000. - V. 5. - P. 274-283.

123. Winnes M., Lissbrant E., Damber J., Stenman G. Molecular genctic analyses of the TMPRSS2-ERG and TMPRSS2-ETV1 gene fusions in 50 cases of prostate cancer. Oncol Rep. 2007 17,1033-1036.

124. Wong I., Lo Y., Johnson P. Epigenetic tumor markers in plasma and serum: biology and applications to molecular diagnosis and disease monitoring // Ann N Y Acad Sci. 2001. - V. 945. - P. 36-50.

125. Yang F., Tuxhorn J., Ressler S. et al. 2005 Stromal expression of connective tissue growth factor promotes angiogenesis and prostate cancer tumorigenesis. Cancer Res. 65, 8887-8895

126. Yegnasubramanian S., Kowalski J., Gonzalgo M. et al. Hypermethylation of CpG islands in primary and metastatic human prostate cancer // Cancer Res. 2004. -V. 64.-P. 1975-1986.

127. Yoo N., Lee J. and Lee S. Absence of fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes. APMIS. 115, 252-253 2007

128. Zhang J., Liu L., Pfeifer G. Methylation of the retinoic response gene TIG1 in prostate cancer correlates with methylation of the retinoic acid receptor beta gene. Oncogene. 23, 2241-2249 2004

129. Toning N., Borre ML S0rensen K. et al. Genome-wide analysis of allelic imbalance in prostate cancer using the Affymetrix 50K SNP mapping array // 2007. Br J Cancer. 96. 499-506.

130. Tuhkancn H., Anttila M., Kosma V. et al. Genetic alterations in the peritumoral stromal cells of malignant and borderline epithelial ovarian tumors as indicated by allelic imbalance on chromosome 3p // 2004. Int J Cancer. 109, 247-252.

131. Ushijima Т., Okochi-Takada E. Abberant methylations in cancer cells: where Jo they come from? // 2005. Cancer Sci. 96, 206-211.

132. Valcri A. Fromont G., Sakr W. et al. High frequency of allelic losses in high-grade prostate cancer is associated with biochemical progression after radical prostatectomy // 2005. Urol Oncol. 23, 87-92.

133. Vanpouckc G„ Orr В., Grace O. et al. Transcriptional profiling of inductive mesenchyme to identify molecules involved in prostate development and disease // 2007. Genome Biol. 8, R213.

134. Wang J., Cai Y., Ren C. and Ittmann M. Expression о Г variant TMPRSS2/ERG fusion messenger RNAs is associated with aggressive prostate cancer // 2006. Cancer Res. 66, 8347-8351.

135. Wang X., Fan M., Sun Z. et al. The TP53 and RPS6 alterations at the invasive tumor front, center and stroma of oral squamous cell carcinoma // 2007. Zhonghua Ком Qiang Yi Xuc ZaZhi. 42. 140-143.

136. Watanabe M., Nakayama Т., Shiraishi T. et al. Comparative studies of prostate cancer in Japan versus United States // 2000. Urol. Oncol. 5, 274-283.

137. Weber F., Xu Y., Zhang L. et al. Microenvironmental genomic alterations and clinicopathological behavior in head and ncck squamous cell carcinoma // 2007. JAMA. 297. 187-195.

138. Wernert N. Locherbach C. Wellmann A. ct al. Presence of genetic alterations in microdissected stroma of human colon and brecist cancers // 2001. Anticancer Res. 21, 2259-2264.

139. Whines M. Lissbrant E., Damber J., Stcnman G. Molecular genctic analyses of the TMPRSS2-ERG and TMPRSS2-ETV1 gene fusions in 50 cases of prostate cancer //2007. Oncol Rep. 17, 1033-1036.

140. Wong ., Lo Y., Johnson P. Epigcnetic tumor markers in plasma and serum: biology and applications to molecular diagnosis and disease monitoring // 2001. Ann N Y Acad Sci. 945, 36-50.

141. Yang F., Tuxhorn J. Ressler S. et al. Stromal expression of connective tissue growth factor promotes angiogenesis and prostate cancer Tumorigencsis // 2005. Canccr Res. 65, 8887-8895.

142. Yegnasubramanian S., Kowalski J. Gonzalgo M. et al. Hypermethvlation of CpG islands in primary and metastatic human prostate cancer // 2004. Cancer Res. 64, 1975-1986.

143. Yoo N. Lee J. and Lee S. Absence of fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes // 2007. APMIS. 115,252-253.

144. Zhang J., Liu L., Pfcifer G. Methylation of the retinoic response gene TIG1 in prostate cancer con-elates with methylation of the retinoic acid receptor beta gene // 2004. Oncogene. 23. 2241-2249.

145. Zhu X. Leav I., Leung Y., et al. Dynamic regulation of estrogen receptor beta expression by DNA methylation during prostate cancer development and metastasis /7 2004. Am J Pathol. 164, 2003-2012.

146. Zochbaucr-Muller S., Fong K., Virmuni A. ct al. Abberant promoter melhylation of multiple genes in non-small cell lung cancers // 2001. Cancer Res. 61, 249-255.

147. Zou H., Yu В., Wang Z. et al. Detection of abberant pl6 methylation in the scrum of colorectal cancer patients // 2002. Clin. Cancer Res. 8, 188-191.