Анализ гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией и в популяциях Республики Казахстан тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Оразгалиева, Мадина Гиниятовна

• Оразгалиева, Мадина Гиниятовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Оразгалиева, Мадина Гиниятовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Частота и распространенность фенилкетонурии в популяциях мира.

1.2 Возможные механизмы распространения фенилкетонурии.

1.3 Молекулярные основы фенилкетонурии.

1.3.1 Метаболизм фенилаланина в организме человека и структура белка фенилаланингидроксилазы.

1.3.2 Ген фенилаланингидроксилазы человека.

1.3.3. Мутации гена фенилаланингидроксилазы.

1.3.4. Полиморфные локусы гена РАН.

1.3.5. Распространение мутаций гена фенилаланингидроксилазы в популяциях мира и их ассоциация с ПДРФ-гаплотипами.

1.4. Клиническая характеристика фенилкетонурии.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материал для исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК.

2.2.2. Рестрикционный анализ.

2.2.3. SSCP-анализ.

2.2.4. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Распространенность фенилкетонурии в Республике Казахстан.

3.2. Исследование мутаций в гене фенилаланингидроксилазы.

3.3. Анализ полиморфных локусов Mspl(a), Pvull(a), VNTR и STR гена РАН в популяциях Казахстана.

3.3.1.Анализ распределения частот и генотипов Mspl(a) полиморфных аллелей гена РАН в популяциях Казахстана.

3.3.2. Анализ распределения частот и генотипов Pvull(a) полиморфных аллелей гена фенилаланингидроксилазы в популяциях Казахстана

3.3.3. Изучение полиморфизма VNTR аллелей и генотипов гена фенилаланингидроксилазы в популяциях Казахстана.

3.3.4. Изучение полиморфизма STR аллелей и генотипов гена фенилаланингидроксилазы в популяциях Казахстана.

3.3.5. Генетические расстояния и кластерный анализ популяций Казахстана по данным о полиморфизме VNTR и STR аллелей гена фенилаланингидроксилазы

3.3.6. Анализ частот гаплотипов полиморфных Mspl(a), PvuII(a), VNTR и STR локусов гена фенилаланингидроксилазы в этнических группах русских и казахов из Казахстана.

3.4. Изучение распределения частот аллелей и гаплотипов полиморфных локусов VNTR, Mspl(a), STR и PvitW(a) гена фенилаланингидроксилазы в семьях с ФКУ из Казахстана

3.4.1. Анализ распределения частот аллелей полиморфных локусов VNTR, Mspl(a), STR и Pvull(a) на нормальных и мутантных хромосомах

3.4.2.Анализ распределения частот гаплотипов гена фенилаланингидроксилазы на нормальных и мутантных хромосомах в семьях с ФКУ.

3.4.3. Анализ ассоциации различных гаплотипов с мутациями гена фенилаланингидроксилазы.

3.5. Алгоритм молекулярно-генетической диагностики фенилкетонурии в Республике Казахстан.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией и в популяциях Республики Казахстан»

Изучение молекулярных основ моногенных наследственных болезней человека и их распространение в различных регионах мира является актуальной проблемой медицинской генетики и генетики человека. Фенилкетонурия (ФКУ) - это одно из наиболее распространенных тяжелых аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленное наследственным дефектом фермента фенилаланингидроксилазы (РАН). Вследствие накопления и токсического действия фенилаланина и его производных на ткани и, прежде всего, клетки головного мозга, заболевание характеризуется высокой степенью слабоумия и тяжелыми психическими расстройствами, развивающимися у больных при отсутствии бесфенилаланиновой диеты с первых дней жизни.

С введением в практику здравоохранения различных стран мира массового обследования на ФКУ стало возможным изучить частоту и популяцион-но-генетические аспекты данного наследственного заболевания. Частота ФКУ среди новорожденных по данным массового скрининга в различных странах составляет в среднем 1:10000, однако значительно варьирует в зависимости от популяции: от 1:2600 до 1:120000 новорожденных [Aoki К., Wada Y., 1988, Woo et al., 1992, Zschocke J., 2003].

В связи с наличием межпопуляционных и внутрипопуляционных [Woo et al.,. 1992, Zschocke J., 2003] различий в структуре и частоте ФКУ для эффективной профилактики и лечения данного заболевания представляется необходимым его генетико-эпидемиологическое изучение в Республике Казахстан.

Классическая фенилкетонурия наследуется аутосомно - рецессивно и вызвана мутациями в гене фенилаланингидроксилазы {РАН), локализующегося на длинном плече 12 хромосомы в области q22-q24 [Lidsky et al., 1985]. Кодирующая белок последовательность (кДНК) включает около 90 кб и состоит из 13 экзонов. Большинство изменений в гене РАН, вызывающих заболевание, являются однонуклеотидными заменами, включая миссенс (64%), сплайсинг (13%) и нонсенс (6 %) мутации и нейтральные полиморфизмы (6%). Почти 20 миссенс-мутаций затрагивают высокомутагенные CpG ди~ нуклеотиды. Остальные мутации возникают в результате делеций или инсер-ций различных типов. В настоящее время в гене РАН выявлено более 490 различных мутаций, частота и встречаемость которых характеризуется высокой гетерогенностью и существенными межпопуляционными различиями [http://www.pahdb/mcgill.ca]. Наиболее распространенной (мажорной) мутацией гена РАН в европейских популяциях является миссенс-мутация R408W, генетический дефект которой связан с заменой С (цитозина) на Т (тимин) в 12 экзоне, ведущей к замене аргинина на триптофан в 408-положении белка РАН.

Различные популяции мира имеют выраженную генетическую гетерогенность по частоте и характеру мутаций гена РАН [Rey et al., 1988; Scriver et al., 1995; Okano et al., 1990, 1998, Eisensmith et al., 1992, Takarada Y, 2003; Аничкина A.A., 2003], что находит отражение в особенностях клинического течения, диагностики и лечения фенилкетонурии. Поэтому в каждой конкретной популяции необходимо изучать частоту и спектр мутаций гена РАН для наиболее эффективной организации медико-генетической службы и ранней диагностики и профилактики этого тяжелого наследственного заболевания [Горбунова, Баранов, 1997, Хуснутдинова, 2005].

В интронах гена РАН локализованы более 10 ПДРФ-локусов и высокополиморфные мини- и микросателлитные повторы (VNTR и STR), гаплотипы по которым отличаются высокой степенью гетерозиготности и выраженным неравновесием по сцеплению с определенными мутациями гена РАН [Eisensmith et al., 1992, 1995, Tighe О., 2003]. Все это делает анализ полиморфных локусов гена высокоинформативным для проведения пренатальной диагностики и скрининга ФКУ в большинстве популяций. В то же время необходимо отметить, что популяционное разнообразие частоты встречаемости полиморфных локусов гена РАН предполагает обязательное предварительное популяционно-генетическое изучение особенностей полиморфизма используемых локусов в выборке здоровых индивидов - жителей исследуемого региона с учетом их этнической принадлежности.

Цель исследования: изучение мутаций и анализ полиморфных локусов в гене фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией, в семьях высокого риска и в популяциях Республики Казахстан. Задачи:

1. Изучить распространенность фенилкетонурии в Республике Казахстан по данным ретроспективного анализа и массового неонатального скрининга.

2. Исследовать спектр мутаций в гене фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией из Республики Казахстан.

3. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов VNTR, Mspl(a), STR и PvwII(a) локусов гена фенилаланингидроксилазы в популяциях Казахстана.

4. Проанализировать распределение частот гаплотипов по локусам VNTR, Mspl(a), STR и PvwII(a) гена фенилаланингидроксилазы в неотягощенных ФКУ семьях.

5. Провести сравнительный анализ распределения частот аллелей и гаплотипов полиморфных ДНК-локусов VNTR, Mspl(a), STR и Pvull(a) на нормальных и мутантных хромосомах, оценить степень ассоциации мутаций гена фенилаланингидроксилазы с определенными аллелями и гаплотипами в семьях больных фенилкетонурией из РК.

6. Разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики фенилкетонурии в Республике Казахстан.

Научная новизна: Впервые определена распространенность фенилкетонурии в различных этнических группах, проживающих в Казахстане, по данным ретроспективного анализа и массового неонатального скрининга. Впервые для популяций русских и казахов из Республики Казахстан проанализированы частоты и спектр наиболее распространенных диагностически значимых мутаций гена РАН. Впервые проведено изучение распределения частот аллелей и гаплотипов полиморфных локусов VNTR, Msp\(a), STR и Pvull(a) гена фенилаланингидроксилазы и определена степень их ассоциации с мутациями гена РАН у больных ФКУ казахской и русской этнической принадлежности, проживающих в Казахстане, что позволило определить информативность и диагностическую ценность данных полиморфных локусов для косвенной ДНК-диагностики фенилкетонурии в РК.

Научно-практическая значимость: Полученные нами данные о распространенности ФКУ могут быть использованы для оценки генетического груза в Республике Казахстан. По результатам молекулярно-генетического анализа определена информативность отягощенных по ФКУ семей для пре-натальной диагностики, сформирован контингент пациентов, нуждающихся в ее проведении. На основании результатов исследования спектра мутаций, частот аллелей и гаплотипов полиморфных ДНК-локусов VNTR, Mspl(a), STR и Pvull(a) гена РАН разработан алгоритм пре- и постнатальной диагностики и профилактики ФКУ в Республике Казахстан.

Положения, выносимые на защиту:

1. Частота и распространенность ФКУ в этнических группах русских и казахов.

2. Идентификация и частота 4 мутаций в гене РАН у больных ФКУ из Республики Казахстан.

3. Достоверные различия по распределению частот аллелей и генотипов полиморфных локусов Mspl(a), VNTR и STR гена РАН в популяциях русских и казахов между собой и с популяциями Европы и Азии.

4. Достоверные различия по распределению частот аллелей и гаплотипов полиморфных локусов VNTR, Mspl(a), STR и Pvull(a) гена РАН между нормальными и мутантными хромосомами в семьях больных фенилкетонурией из Казахстана.

5. Ассоциация обнаруженных мутаций гена РАН с определенными гаплоти-пами по полиморфным локусам VNTR, Mspl(a), STR и Pvull(a) reuse РАН.

6. Информативность прямой и косвенной ДНК-диагностики для семей с ФКУ из Республики Казахстан.

7. Разработка алгоритма молекулярно-генетической диагностики фенилкетонубии в Республике Казахстан.

Автор выражает глубокую признательность заведующей лабораторией молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН, доктору биологических наук, профессору Хуснутдиновой Эльзе Камилевне за предоставленную возможность проведения научного исследования, ценные советы и. моральную поддержку при обсуждении и подготовке диссертации. Автор благодарит Ахметову Биту Леоновну, научного сотрудника лаборатории, за неоценимую помощь и поддержку при выполнении работы, в написании диссертации, подготовке доклада и презентации, а также весь коллектив лаборатории молекулярной генетики человека за творческую атмосферу научного поиска.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Оразгалиева, Мадина Гиниятовна

ВЫВОДЫ

1. Частота ФКУ по данным массового скрининга новорожденных г. Алматы составляет 1:6980. Впервые определена распространенность заболевания в основных этнических группах Казахстана: 1,56 на 100 ООО населения для русских и 0,69 на 100 000 для казахов.

2. В гене фенилаланингидроксилазы у больных ФКУ из Республики Казахстан идентифицировано 4 мутации - R408W (0,33), R261Q (0,10), IVS10nt546 (0,05) и IVS12ntl (0,05), из них у больных ФКУ казахской этнической принадлежности - R408W {0,20), R261Q (0,20) и IVS12ntl (0,10), что свидетельствует об отличиях в спектре и частотах мутаций гена РАН в популяции казахов от изученных ранее популяций мира.

3. Установлены статистически значимые различия по распределению частот аллелей полиморфных ДНК-локусов Mspl(a), VNTR и STR гена фенилаланингидроксилазы этнических групп русских и казахов из Республики Казахстан между собой, а также с популяциями Европы и Азии.

4. Обнаружены достоверные различия по распределению частот аллелей и гаплотипов полиморфных ДНК-локусов VNTR, Mspl(a), STR и Pvull(a) гена РАН между нормальными и мутантными хромосомами в семьях больных фенилкетонурией из Республики Казахстан.

5. Выявлена ассоциация мутации R408W гена фенилаланингидроксилазы с гаплотипом VNTR*3/MspI(a)*a/STR*236/PvuII(a)*A2 (Ast=0,53).

6. Показано, что информативность прямой ДНК-диагностики для семей с ФКУ из Республики Казахстан составляет 52,5%, косвенной диагностики с помощью полиморфных локусов Mspl(a), VNTR, STR и Pvull(a) гена РАН - 87,5%, их совместная информативность составляет 100%, что свидетельствует о целесообразности использования данной молекулярно-генетической системы для ДНК-диагностики фенилкетонурии в Казахстане.

7. Разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики фенилкетонурии в Республике Казахстан.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С целью определения распространенности фенилкетонурии в Республике Казахстан были проанализированны данные массового неонатального скрининга в г. Алматы, проводившегося с 1989 по 1996 годы. Частота ФКУ по данным массового скрининга новорожденных по г. Алматы составила 1:6980, за эти годы в среднем 80-90% новорожденных было охвачено скринингом.

В свою очередь, учитывая численность этнических групп г. Алматы по данным переписи населения 1999 г. и этническую принадлежность выявленных в г. Алматы больных ФКУ, распространенность болезни в этнических группах составляет: у русских - 1,56, у казахов - 0,69 на 100 000 населения. Этнический состав выявленных семей составляет: 65% - русские, 25% - казахи, и по 5% - азербайджанцы и уйгуры. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что фенилкетонурия распространена в популяциях РК неравномерно и более часто встречается в этнической группе русских.

Для выявления спектра мутаций гена РАН нами были использованы методы ПДРФ-анализа, SSCP-анализа с последующим секвенированием на автоматическом секвенаторе. Эти методы позволили выявить на 0,525 поврежденных хромосом четыре различные мутации. Наиболее распространенная мутация R408W обнаружена на 13 из 40 мутантных хромосом, что составляет 0,325 от общего количества мутаций и существенно ниже, чем' в популяциях России и Европы [Максимова, 1974, Kalaydjieva et al., 1991, Eisensmith et al., 1992, O'Neill et al., 1994, Tyfield et al., 1997, Барановская, 1995, Ахметова, 2003]. Мутация R261Q, которая является самой распространенной после мутации R408W, была определена на 4 из 40 мутантных хромосом (0,100). Мутации IVS12ntl и IVS10nt546, обнаружены на 2 хромосомах каждая (0,05). На мутантных хромосомах у больных казахской этнической принадлежности с одинаковой частотой 0,200 выявлены мутации R408W и R261Q, и с частотой 0,100 - мутация IVS12ntl. Распределение частот мутаций у русских отличалось: самой распространенной была мутация R408W(0,420), частота мутаций

R261Q и IVS10nt546 составила по 0,077, более редкой была мутация IVS12ntl (0,038). Большинство больных оказались компаунд-гетерозиготами, несущими на одной хромосоме наиболее распространенную мутацию R408W,, а на другой либо одну из обнаруженных мутаций, либо какую-то неизвестную мутацию. Кроме этого, выявлен нейтральный полиморфизм V245V с частотой 0,200 в 7 экзоне гена РАН, описанный ранее, который не приводит к изменению функций белка РАН. Наиболее распространенная в других популяциях мутация R408W также оказалась самой частой и для нашей выборки больных, ее частота (0,325) оказалась сходной со среднеевропейской (0,324) [Zschocke J., 2003], однако значительно ниже средней для российских популяций (0,614) [Степанова А.А., 2005]. Мутации R408W и R261Q гена РАН в здоровой выборке казахов (контроль - 100 неродственных индивидов) не обнаружены, что свидетельствует о низкой частоте гетерозиготного носитель-ства этих мутаций в популяции казахов.

Анализируя наши данные, можно сделать вывод, что информативность использованного нами набора реактивов PCU-8 производства ООО "Центр молекулярной генетики", г.Москва, для определения мутаций в гене РАН (0,525) ниже, чем для российских популяций, для которых она составляла 0,798 [Степанова А.А., 2005]. В целом, популяция Республики Казахстан по спектру мутаций гена фенилаланингидроксилазы отличается от других популяций мира, что косвенно подтверждается большим количеством неиденти-фицированных мутаций.

Нами был проведен анализ характера распределения частот аллелей, генотипов и гаплотипов полиморфных ДНК-локусов VNTR, Mspl(a), STR и Pvull(a) гена РАН в семьях с ФКУ и в двух основных этнических группах Казахстана - казахов и русских.

Наиболее распространенным генотипом в популяции казахов оказался MspI(a)*A/*a (0,580), а в популяции русских - генотип Mspl(a)*a/*a (0,380). По распределению частот Mspl(a) генотипов выборка русских достоверно отличалась от казахов (%2= 15,888, р= 0,000). Распределение частот генотипов локуса Mspl(a) в популяции казахов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга, тогда как в популяции русских наблюдалось отклонение от равновесия (р<0,01), связанное, по всей видимости, со стохастическими процессами в популяции. Анализ распределения частот Mspl(a) аллелей гена РАН показал преобладание аллеля Mspl(a)*A в популяции казахов, и, напротив, аллеля Mspl(a)*a у русских.

Сравнительный анализ распределения частот Mspl(a) аллелей гена РАН между популяциями Казахстана выявил достоверное различие по данному параметру между казахами и русскими (%2 =4,500, при р=0,044). Сравнительный анализ собственных результатов с литературными данными показал отсутствие разницы в распределении частот Mspl(a) аллелей гена РАН в популяции русских с другими европейскими популяциями (%2 =0,180, р=0,774) и статистически значимое различие с популяциями Азии (%2 =48,870, р<0,001). Популяция казахов достоверно отличалось и от популяций Европы

2 2 (X = 6,490, р=0,017), и, еще в большей степени, от популяций Азии (%

25,970, р<0,001). Фактическая гетерозиготность для локуса Mspl(a) гена РАН оказалась выше в казахской популяции (0,570), чем в русской популяции (0,360), что, очевидно, связано с недостатком гетерозигот в данной этнической группе. Это согласуется с данными полученными для популяций Волго-Уральского региона, где фактическая гетерозиготность у башкир составляла 0,500, а в популяции татар и русских соответственно 0,360 и 0,362.

Анализ характера распределения частот аллелей, генотипов и гаплотипов полиморфного ДНК-локуса Pvull(a) показал, что наиболее частым в обеих исследованных выборках оказался генотип PvuII(a)*Al/*A2. Распределение частот генотипов Pvull(a) гена РАН в выборке казахов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга, а в выборке русских наблюдалось отклонение (р<0,05), связанное, по-видимому, со стохастическими процессами в популяции. По локусу Pvull(a) гена РАН между популяциями казахов и русских достоверных отличий не обнаружено (% =0,188, р=0,771). Для казахской популяции выявлены достоверные различия по частотам аллелей с популяциями Европы (х2=4,367, р=0,054) и Азии (х2=11,523, р=0,001), и отсутствие достоверной разницы с популяциями Волго-Уральского региона (X =3,388, р=0,081). Для популяции русских, напротив, не выявлено достоверных различий с популяциями Европы (х2=2,757, р=0,127), но обнаружены достоверные различия с популяциями Волго-Уральского региона (х2=5,153, р=0,033). Обе исследованные выборки достоверно отличались по распределению частот аллелей данного локуса от популяций Азии (р<0,05). Значение фактической гетерозиготности для локуса Pvull(a) гена РАН в популяции русских оказалось выше (0,610), чем в казахской популяции (0,570).

Распределение частот VNTR аллелей гена РАН в популяциях изученного региона соответствовало бимодальному, с двумя пиками: первый - в 380 п.о. (VNTR *3), второй - в 530 п.о (VNTR*8), причем, у казахов более выражен пик в 380 п.о. (0,450), а у русских - пик в 530 п.о.(0,410 ). Согласно данным литературы, аллель VNTR*3 с более высокой частотой встречался в азиатских популяциях, тогда как частота аллеля VNTR*8 была выше в европейских популяциях [Eisensmith et al, 1994; Барановская, 1996]. Возможно, что первый пик в 380 п.о. (VNTR*3) в изучаемых популяциях свидетельствует о влиянии монголоидного компонента на формирование генофонда народов данного региона, а второй пик в 530 п.о. (VNTR*8) служит одним из убедительных доказательств наличия существенной доли европеоидного компонента у изученных популяций.

Сравнительный анализ с литературными данными позволил установить статистически значимые различия по распределению частот VNTR аллелей гена РАН между обеими изученными выборками и популяциями Китая (р<0,01), Азии - узбеками (р<0,05) и некоторыми популяциями Волго-Уральского региона - марийцами и удмуртами (р<0,001) [Eisensmith et al, 1994; Барановская, 1996; Ахметова B.JI, 2000; Салимова, 2004]. Кроме того, выявлены достоверные отличия для популяции казахов с популяциями Европы, мордвы и карачаевцами (р<0,05), а для популяции русских с коми (р<0,05) [Eisensmith et al.,1994; Ахметова В.JI., 2000; Салимова, 2004].

Значение фактической гетерозиготности для локуса VNTR гена РАН, ус-ф тановленное в популяции русских (0,780), оказалось выше, чем в популяции казахов (0,660). В среднем коэффициент фактической гетерозиготности по локусу VNTR в изученных популяциях РК составил 0,720. Показатели наблюдаемой гетерозиготности по локусу VNTR гена РАН в исследовавнных популяциях РК практически совпали с данными по внутрипопуляционному разнообразию Волго-Уральского региона (0,713), близки к европейской популяции (0,630) и значительно отличаются от популяции Китая (0,330).

В результате изучения 577?-полиморфизма гена РАН в казахской и русской популяциях у 261 обследованных было обнаружено 28 генотипов, из ф них 27 генотипов для выборки казахов, 18 генотипов для выборки русских. В результате изучения STR полиморфизма гена РАН в казахской и русской популяциях оказалось, что наиболее частым для казахов оказался STR-генотип *244/*248, (0,144), для русских - STR*240/*244 (0,150). В исследованных популяциях было установлено соответствие характера распределения частот STR генотипов гена РАН равновесию Харди-Вайнберга. Выборка казахов достоверно отличалась от выборки русских из Казахстана по распределению частот STR генотипов гена РАН (% =51,590, р=0,001).

Распределение частот STR аллелей для казахской популяций можно охарактеризовать как одномодальное с пиком в 244 п.о. (0,310). Для русских ф этот аллель оказался на втором месте по частоте (0,250), тогда как на первом месте определен аллель *240 (0,300). На втором месте у казахов был аллель *248 (частота 0,220), который наиболее часто выявлялся, по данным литературы, у тюрко-язычных народов ВУР (от 0,130 у чувашей до 0,180 у башкир), в то время как для русских этот аллель оказался на 5 месте (0,090) [Ахметова, 2001]. Сравнительный анализ распределения частот STR аллелей гена РАН ф показал наличие достоверных различий между изученными популяциями

2 > РК (X -15,500, р=0,027), а также между выборкой казахов, с одной сто

1рш,нш,кш:1шрщй]цщ жниаййдшга--сс дщвр-шй (р<0,05)

Goltsov et al., 1994; Барановская, 1996; Ахметова B.JL, 2001]. Для популяции русских статистически значимые отличия по распределению частот STR аллелей гена РАН выявлены с чувашами, марийцами, удмуртами и китайцами р<0,05) [Goltsov et al., 1994; Барановская, 1996; Ахметова B.JL, 2001].

Коэффициент фактической гетерозиготности, в среднем, составил 0,790, совпадая с таковым в популяциях Волго-Уральского региона (0,790), приближаясь к значению фактической гетерозиготности в популяциях Европы (0,800) и несколько превышая его значение в популяции Азии (0,730). Таким образом, высокие показатели гетерозиготности, а также установленная дифференциация популяций Казахстана по распределению частот VNTR и STR аллелей гена РАН, позволяют считать данные полиморфные ДНК-локусы высокоинформативными генетическими маркерами, пригодными для характеристики генетической структуры популяций и проведения косвенной ДНК диагностики.

Анализ генетических расстояний по данным о полиморфизме исследованных ДНК-локусов гена РАН показал генетическую близость тюрко-язычных (башкиры и казахи) народов, а также существование генетической дифференциации популяций русских РБ и РК, что указывает на необходимость популяционно-генетических исследования популяций Казахстана, а также подтверждает возможность использования полиморфных локусов гена РАН для характеристики генетического положения народов изучаемого региона среди популяций мира.

Основываясь на сравнительном анализе распределения частот аллелей изученных локусов гена РАН в популяциях Казахстана, можно отметить, что в целом популяции данного региона занимают промежуточное положение между популяциями Европы и Китая. Эти результаты согласуются с полученными ранее данными о промежуточном положении генофонда народов данного региона между европеоидами и монголоидами [Бермишева, 2002; Абдуллаева, 2004; Березина, 2004].

Проведенный сравнительный анализ распределения частот гаплотипов VNTR-Mspl (a) -STR-Pvull (а) между казахской и русской этническими группами (30 казахских и 30 русских семей), проживающими в Казахстане, не показал достоверных различий между изученными выборками.

Таким образом, проведенный анализ полиморфизма ДНК-локусов гена РАН в этнических группах Казахстана - русских и казахов (здоровые индивиды) выявил межэтнические различия изученных групп по распределению частот аллелей изученных локусов гена РАН между собой и с популяциями Европы и Азии и не обнаружил достоверных различий в распределении частот гаплотипов между данными группами.'

Изучение аллельного полиморфизма ДНК-локусов Mspl(a), Pvull(a), VNTR и STR гена РАН у пациентов с ФКУ из Казахстана и членов их семей выявило достоверные различия в распределении частот аллелей между нормальными и мутантными хромосомами: для локуса Mspl(a) и Pvull(a) %2=18,470 и 6,450, соответственно, при р<0,05, для локусов STR и VNTR -х2=12,500 и 13,820, соответственно, при р<0,05. При сравнительном анализе были выявлены статистически достоверные различия в распределении частот VNTR аллелей между мутантными хромосомами у больных из Казахстана, с одной стороны, и Европы и Китая, с другой (% =29,520 и 27,060 соответственно, при р<0,01). Не обнаружено достоверных различий в распределении частот VNTR аллелей на ФКУ-хромосомах больных из Казахстана с больными из Республики Башкортостан (х2=3,550, р=0,328). Распределение частот Mspl(a) аллелей на изученных хромосомах достоверно не отличался от такового (х2=1,490 р=0,278) в европейских популяциях (Daiger et al., 1989а), однако найдены существенные различия между мутантными хромосомами больных ФКУ из Казахстана и из Азии (х2=97,180, при р<0,01) а также из Республики Башкортостан (х2=8,000, при р=0,004). Как показал сравнительный анализ распределения частот STR аллелей гена РАН, между изученными нами мутантными хромосомами и мутантными хромосомами европейского и китайского происхождения существовали статистически достоверные различия (%2=36,530 и 70,610, соответственно, при р<0,01) (Eisensmith et al., 1994). Достоверные различия обнаружены и для ФКУ-хромосом больных из Казахстана по частотам распределения STR аллелей с больными ФКУ из РБ (X =37,680 р=0,000). Существенных различий по распределению частот Pvull(a) аллелей на мутантных хромосомах между изученной группой больных из Казахстана и аналогичными хромосомами у больных ФКУ Европы, Азии и Республики Башкортостан не выявлено (х2=1,700; 1,140; 0,160, соответственно, при р>0,05).

Нами были исследованы частоты гаплотипов VNTR-Mspl(a)-STR-Pvull(a) на нормальных и мутантных хромосомах в семьях с ФКУ из Казахстана. Различия в распределении частот гаплотипов на нормальных хромосомах от такового на мутантных хромосомах оказались статистически достоверными (х =113,270, р<0,01). Установлено выраженное неравновесие по сцеплению мутаций гена РАН с аллелем VNTR *3 - ASt =0,25, Mspl(a) *а - ASt =0,3, и с гаплотипом VNTR*3/MspI(a)*a/*236/*A2 - ASt=0,39. Для того, чтобы выяснить, какой вклад в определенную нами величину неравновесия по сцеплению между локусами изученных маркеров и геном заболевания вносит наиболее частая мутация R408W, был определен стандартный коэффициент неравновесия по сцеплению в группе мутантных хромосом, несущих эту мутацию. Были выявлены следующие значения Ast по всем локусам: среднее для аллеля VNTR*3 - 0,40 и для аллеля STR *236 - 0,32, максимальное для аллеля Mspl(a)*a - 0,63, и низкое для аллеля Pviill(a)*A2 - 0,17. Также выявлена ассоциация хромосом, несущих мутацию R408W, с гаплотипом VNTR*3/Mspl(a) *a/STR*236/Pvull(a) *A2, (ПДРФ-гаплотип 2), Ast=0,53. В популяциях северо-западной Европы мутация R408W показала высокое неравновесие по сцеплению с гаплотипом 1 (аллель *а по локусу Msp\(a), аллель *А2 по локусу Pvull (а), аллелем VNTR *8 и аллелем STR*244), а в Восточноевропейских странах, включая республики СНГ и Прибалтики, мутация

R408W оказалась строго ассоциированной с гаплотипом 2 (аллель *а по ло-кусу Mspl(a), аллель *А2 по локусу Pvull(a), аллелем VNTR *3 и аллелями STR*232-248). В нашей выборке больных ФКУ обнаружена ассоциация мутации R408W с гаплотипом 2, по всей видимости, означающая Балто-Славянское происхождение хромосом с этой мутацией у больных ФКУ из Казахстана [Tyfield et al, 1997, Eisensmith et al, 1992, Барановская, 1996].

По полученным данным, для семей с ФКУ из Казахстана информативность PW77?-CHCTeMbi для косвенной диагностики болезни составила 45,85%, 677?-системы - 75%, Mspl(я)-системы - 50%, PvMlIfaj-системы - 45,8%. Общая информативность всех четырех изученных полиморфных локусов для семей с ФКУ составила 87,5%, из которых 75% приходится на полную информативность и 25% на частичную. Высокая информативность исследованных ДНК-локусов в сочетании с достаточно простыми методами их идентификации свидетельствуют о том, что данные полиморфные локусы могут быть использованы для установления гетерозиготного носительства у здоровых сибсов в семьях высокого риска и пренатальной диагностики ФКУ в Казахстане.

Проведенное нами молекулярно-генетическое обследование 20 семей с фенилкетонурией, проживающих в Республике Казахстан, показало, что ДНК-диагностика прямым методом оказалась полностью информативной для 35% изученных семей, частично информативной для 35%, проживающих в РК, а для 30% - абсолютно неинформативной. Общая информативность прямого метода составила 52,5%. В связи с этим в таких семьях была проведена косвенная ДНК-диагностика заболевания с использованием внутригенных ДНК-локусов и составленных по ним гаплотипам. Во всех семьях при использовании прямого и косвенного подходов молекулярной диагностики были определены носители мутантных хромосом.

Таким образом, общая информативность выявленных мутаций гена РАН для больных ФКУ из Казахстана составила 52,5%, а для полиморфных локусов Mspl(a), VNTR, STR и Pvull(a) гена РАН - 87,5%. Информативность прямой и косвенной ДНК-диагностики для больных ФКУ из Республики Казахстан при совместном применении оказалась 100%, что свидетельствует о целесообразности использования данной молекулярно-генетической системы для установления гетерозиготного носительства мутаций у здоровых сибсов в семьях высокого риска и ДНК-диагностики фенилкетонурии в Казахстане.

Проведенное исследование гаплотипов и мутаций в гене РАН дало возможность разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики ФКУ в Казахстане, выявить в исследованных семьях носителей мутантных хромосом. В общем плане молекулярно-генетических исследований, результаты данной работы расширили представление о структурно-функциональной организации генома человека и могут послужить теоретической и методической основой для точной диагностики моногенной наследственной патологии - фенилкетонурии.

138

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Оразгалиева, Мадина Гиниятовна, 2005 год

1. Абдуллаева A.M. Популяционно-генетическая структура и генетическая дифференциация сельских популяций Казахстана // Автореф. дисс.канд. мед. наук. Москва. - 2004

2. Аничкина А.А., Гаврилюк А.П, Тверская С.М., Поляков А.В. Анализ наиболее часто встречающихся мутаций в гене фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией. // Медицинская генетика. 2003. Т.2, №4. С. 175181

3. Ахметова В.Л. Молекулярно-генетический анализ гена фенилаланингидроксилазы у народов Волго-Уральского региона // Автореф. дисс.канд. биол. наук. Москва, 2001

4. Ахметова В.Л., Викторова Т.В., Мурзабаева С.Ш., Магжанов Р.В., Хуснут-динова Э.К. Анализ мутаций гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией из Башкортостана. //Медицинская генетика. 2003. № 4. С. 182-187.

5. Байков А.Д., Копылова Н.В., Митькина В.Б. Опыт организации неонатального скрининга в России // Материалы Республ. совещания "Принципы организации и методические основы профилактики инвалидизирующих наследственных болезней". Москва, 1996,- С41

6. Барановская С.С., Шевцов С.П., Максимова С.П. с соав. Спектр мутационных повреждений гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией г. Санкт-Петербурга // Докл. Акад. Наук. 1995. - Т. 340. - № 5. - С. 709711.

7. Барановская С.С. Молекулярно-генетический анализ фенилкетонурии в Санкт-Петербурге. //Автореф. дисс.канд. биол. наук. Санкт-Петербург. -1996.

8. Березина Г.М. «Генетико-демографические процессы в сельских популяциях Казахстана и их генетическая дифференциация по митохондриальной ДНК» Автореф. дисс.докт. мед. наук. Москва. - 2005.

9. Бермишева М., Тамбетс Р., Виллемс Р., Хуснутдинова Э.К. Разнообразие гаплотипов митохондриальной ДНК у народов Волго-Уральского региона России. Мол. Биол., 2002, т.36, №6, с. 905-915

10. Ю.Гавршцок А. П. Полиморфизм ДНК области 12q24.1, сцепленный с геном фенилаланингидроксилазы, в популяции Республики Молдова // Автореф. дисс. докт. биол. наук. Кишинев. - 2004

11. П.Гинзбург В.В. Антропологический состав населения Средней Азии и Казахстана. Народы Средней Азии и Казахстана. Москва, 1962. - Т. 1. - 489 с.

12. Гинтер Е.К. Популяционная география наследственных болезней //Перспективы медицинской генетики,- М.: Медицина, 1982.- С. 162-186.

13. Гнатейко О.З., Скочий П.Г., Гельнер Н.В. и др. Выявлен наследственных заболеваний у детей раннего возраста в западных областях Украины// Всей научн.-практ. конф. по дет. неврологии и психиатрии: Тез. докл.- Вильнюс, 1989.-С. 28-29.

14. И.Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Санкт-Петербург, 1997.

15. ДНК-диагностика и профилактика наследственной патологии в Республике Башкортостан // Под ред. Хуснутдиновой Э.К. Уфа. Китап. 2005. 204 с.

16. Дуб ленников О.Б., Виноградов А.З. Реализация программы массового скрининга беременных и новорожденных юга Кузбасса/ЯТервый (третий) Российский съезд мед. ген.: Тез.докл.- Москва, 1994.- С. 158-159 .

17. Животовский JI.A. Популяционная биометрия. М.: Наука, 1991, 272 с

18. Исмагулов О. Серологические взаимоотношения между народами Средней Азии и Казахстана // Вестник АНКазССР, 1970, №3, С. 29-35.

19. Исмагулов О., Петриковец Н.И. Распределение групп крови систем АВО, MN и Rh0 (D) среди некоторых народов Средней Азии и Казахстана // Труды XII Международного конгресса по переливанию крови М., Медицина, 1972, С.367-368.

20. Казанцева JI.3. Терапия и профилактика наследственных нарушений обмена веществ у детей (в условиях генетического центра) //Тезисы 2 Всесоюз. Съезда мед. Генетиков. Алма-Ата. - 1990. - С. 176.

21. Кон P.M. , Рот К.С. Ранняя диагностика болезней обмена веществ: Пер. с англ.- М.: Медицина, 1986.- 636 с.

22. Коршунова Т.Ю., Ахметова B.JL, Кутуев И.А., Хусаинова Р.И., Хуснутди-нова Э.К. Изучение VNTR-полиморфизма генов РАН, eNOS и делеции гена CCR5 у народов Северного Кавказа //Генетика. 2004. Т.40 №3. С.321-326.

23. Кузьмин А.Н., Хальчицкий С.Е., Шварц Е.Н., Цукерман Г.Л. Определение мутаций гена фенилаланингидроксилазы и пренатальная диагностика ФКУ в популяции СССР. // Всесоюз. конф. «Геном человека». Переславь-Залесский. - 1990. - С. 162.

24. Лаврова JI.B., Матулевич С.А., Шумливая Е.О. Опыт массового скрининга.и лечения фенилкетонурии // Первый (третий) Российский съезд мед. ген.: Тез. докл.-Москва, 1994.-С. 174-175.

25. Лаптев А.В., Честков В.В., Щелкина Ю.В., Кулиев A.M. Характеристика ФАГ эмбрионов человека в норме и при ФКУ // 2 Всесоюз. съезд мед. генетиков.: Тез. Докл. Алма-Ата. - 1990. - С. 245.

26. Лебедев Б.В., Блюмина М.Г. Фенилкетонурия у детей. Москва: "Медицина", 1972.

27. Магжанов Р.В., Мурзабаева С.Ш., Хуснутдинова Э.К., Викторова Т.В. Фенилкетонурия в республике Башкортостан: эпидемиологические и моле-кулярно-генетические аспекты // Здравоохранение Башкортостана. 1994. -№4.-С. 35-41.

28. Максимова С.П. Выявление и лечение ФКУ у детей в условиях работы городского медико-генетического отделения // Автореф. дисс. канд. мед. наук. -Москва. 1974. - 16 с.

29. Мошинецкий А.Ю., Козлова Н.Г., Шапельская Г.Г. Основные аспекты и результаты работы медико-генетической консультации (Хабаровск). Первый: Российский съезд мед. ген. : Тез. докл.- Москва, 1994,- С. 183-184.

30. Мурзабаева С.Ш. Фенилкетонурия в республике Башкортостан // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва. - 1996.

31. Народы Средней Азии и Казахстана в 2-х т. Под ред. С.П.Толстова и др. -М, Изд-во АН СССР, 1962. 2 т. - 612с.

32. Пилосов Р.А., Романова О.Г. Скрининг врожденной и наследственной патологии в Таджикской ССР // Тезисы докл. Всесоюз. научно-практ. конф. -Харьков.- 1990.-С. 57-58.

33. Салимова А. Анализ полиморфизма ДНК ядерного и митохондриального геномов в популяциях Средней Азии. // Автореф. дисс. канд. биол. наук.-Уфа, 2004.

34. Скрябин Б.В., Хальчицкий С.Е., Кузьмин А.И., Шварц Е.И. Определение мутационных повреждений в гене ФАГ среди больных в Латвии. // 2 Всесоюз. съезд мед. ген.: Тез. докл. Алма-Ата. - 1990. - С. 401.

35. Смагулова Ф., Масленников А., Морозов И., Китайник Г. Мутации в структуре экзона 7 гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией Новосибирской области //Генетика человека. 2000. - т. 36. - №6. - с. 849-852.

36. Степанец А.П. Массовый и селективный скрининг наследственных болезней обмена /Я съезд мед. ген. УССР.- Львов, 1988.- С.117.

37. Степанова А.А. Исследование молекулярно-генетической природы фенилкетонурии в выборках российских больных.// Автореф. дисс. канд. мед. наук.-Москва, 2005.- С. 23.

38. Цукерман Г.Л. Генетическая эпидемиология фенилкетонурии в Белорусской ССР // Автореф. дисс. канд. мед. наук.-Москва,1986.- С. 27.

39. Чарикова Е.В. Изучение спектра точечных мутаций в гене ФАГ у больных фенилкетонурией в Москве и Московской области. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. 1995. - Москва.

40. Чистик Ф.Д., Жильцова И.В., Веропотвелян П.Н. и др. Опыт организации региональной профилактики фенилкетонурии // 2 Всес.съезд мед.ген.- Алма-Ата, 1990.-С.480.

41. Шипицына Г.И., Кузьмин А.Н., Руньковская Н.Г., Калинин В.Н. Популя-ционно-генетический анализ распространенности полиморфных сайтов рестрикции в локусе гена ФАГ. // 2 Всесоюз. съезд мед. ген., Алма-Ата. 1990. -С. 497-498.

42. Abadie V., Lyonnet S., Melle D. Molekular basis of phenylketonuria in France. // Dev. Brain Dys. 1993. -V. 6. - P. 120-126.

43. Abita J. P. Blandin-Savoja F., Rey F. Phenylalanine hydroxylase. Evidence that the enzyme phrom human liver might not be a phosphoprotein. // Biochemystry. -1983.-V. 7.-P. 727-737.

44. Aoki K. Long term follow-up of patients with inborn errors of metabolism detected by the newborn screening program in Japan. //Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2003. V.34. - Suppl 3. p. 19-23.

45. Aoki K., Wada Y. Outcome of the patients detected by newborn screening in Japan. // Acta Paediatr. 1988. - V. 30. - P. 429-434.

46. Avigad S, Cohen В. E, Bauer S. A single origin of phenylketonuria in Yemenite. // Jews Nature. 1990. - V. 344. - P. 168-170.

47. Baric I, Mardesic D. Sarnavoka V. et al. Haplotype distribution and mutations at the PAH locus in Croatia. // Hum. Genet. 1992. - V. 90. - P. 155-157.

48. Berry H, Umbarger B, Livingston B. Exrection of phenylalanine by normal children and by patients with phenylketonuria. // J. Pediat. 1963. - V. 63. - P. 954.

49. Berthelon M, Caillaud C, Rey F. et al. Spectrum of phenylketonuria mutations in Western Europe and North Africa, and their relation to polymorphic DNA haplotypes at the the phenylalanine hydroxylase locus. // Hum. Genet. 1991. - V. 86.-P. 355-358.

50. Bowcock A.M., Ruis-Linares A, Tomfohrde J. et al. Hight resolution of human evolutionary trees with polymorphic minisatellites // Nature. 1994. V. 368. P. Ш 455-457.

51. Caillaud С., Vilarino L., Vilarino A. et al. Linkage disequilibrium between phenylketonuria and RFLP haplotype 1 at the phenylalanine hydroxylase locus in Portugal. //Hum. Genet. 1992. -V. 89. - P. 69-72.

52. Carter K.C., Byck S., Waters P. J. et al. Mutation at the phenylalanine hydroxylase gene (PAH) and its use to document population genetic variation: the Quebec experience. // Europ. J. Hum. Genet. 1998.- V. 6. - P. 61-70.

53. Chakraborty R. , Lidsky A.S., Daiger S.P. et al. Polymorphic DNA haplotypes at the phenylalanine hydroxylase locus and their relationship with phenylketonuria // Hum. Genet. 1987.- V. 76. - P. 40-46.

54. Chao, H.-K.; Hsiao, K.-J.; Su, T.-S. A silent mutation induces exon skipping in the phenylalanine hydroxylase gene in phenylketonuria.//Hum. Genet. -2001.-V.108. -p.14-19.

55. Charicova E., Khalchitskii S., Antoshechkin A., Schwartz E. Distribution of some point mutations in the phenylalanine hydroxylase gene of phenylketonuria patients from the Moscow region // Hum. Hered. 1993. - V. 43. - P. 244-249.

56. Chen, K.-J.; Chao, H.-K.; Hsaio, K.-J.; Su, T.-S. Identification and characterization of a novel liver-specific enhancer of the human phenylalanine hydroxylase gene.//Hum. Genet. 2002.- V.l 10. - p.235-243

57. Chien YH, Chiang SC, Huang A, Chou SP, Tseng SS, Huang YT, Hwu WL. Mutation spectrum in Taiwanese patients with phenylalanine hydroxylase deficiency and a founder effect for the R241C mutation.// Hum Mutat. 2004. -V.23(2). -p.206.

58. Daiger St.P., Chakraborty R., Reed L. et al. Polymorphic DNA haplotypes at the penylalanine hydroxilase (PAH) locus in European families with phenylketonuria (PKU) // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 45. N 2. P. 310-318.

59. Daiger S.P., Reed L., Huang S-S. et al. Polymorphic DNA haplotypes at the phenylalanine hydroxilase (PAH) locus in Asian families with phenylketonuria (PKU) // Am. J. Hum. Genet. 1989. - V. 45. - P. 319-324.

60. Davis M.D., Parniak M. A., Kaufman S., Kempner E. The role of phenylalanine in structure-function relationships of phenylalanine hydroxylase revealed by radiation target analysis. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.491-495

61. Deka R., Chakraborty R., Ferrell R.E. A population genetic study of six VNTR loci in three ethnical defined populations // Genomics. 1991. V. 11. P. 83-92.

62. Desviat L. R., Perez В., Ugarte M. Phenylketonuria in Spain: RFLP haplotypes and linked mutations. // Hum. Genet. 1993. - V. 92. - P. 254-258.

63. DiLella A. G., Kwok S. C., Ledley F. D. et al. Molecular structure and polymorphic map of the human phenylalanine hydroxylase gene. // Biochemistry.1986.-V. 25.-P. 743-749.

64. Dilella A.G., Marvit J., Lidsky A.S. et al. Tight linkage between a splacing mutation and a specific DNA haplotype in phenylketonuria // Nature. 1986. V. 322. P. 799- 803.

65. DiLella A. G., Marvit J., Brayton K. et al. An amino-acid substitution involved in phenylketonuria is in linkage disequilibrium with DNA haplotype 2. // Nature.1987.-V. 327.-P. 333-336.

66. Dworniczak В., Aulehla-Scholz C., Kalaydjieva L. et al. Aberrant splicing of phenylalanine hydroxylase mRNA: the major cause for phenylketonuria in parts of southern Europe. // Genomics. 1991. - V. 11. - P. 242-246.

67. Dworniczak В., Grudda К., Stumper J. et al. Phenylalanine hydroxylase gene: novel missense mutation in exon 7 causing severe phenylketonuria. // Genomics.1991.-V. 9.-P. 193-199.

68. Dworniczak В., Kalaydjieva L., Aulehla-Scholz C. et al. Recurrent nonsense mutation in exon 7 of the phenylalanine hydroxylase gene. // Hum. Genet. 1991. -V. 87.-P. 731-733.

69. Dworniczak В., Kalaydjieva L., Pankoke S. et al. Analysis of exon 7 of the human phenylalanine hydroxylase gene: a mutation hot spot? // Hum. Mutat.1992.-V. l.-P. 138-146.

70. Eiken H. G., Knappskog P. M., Boman H. et al. Relative frequency, heterogeneity and geographic clustering of PKU mutations in Norway. // Europ. J. Hum. Genet. 1996. - V. 4. - P. 205-213.

71. Eisensmith R.C., Olcano Y., Dasovich M. et al. Multiple origins for phenylketonuria in Europe // Am. J. Hum. Genet. 1992. V. 51. N 6. P.1355-1365.

72. Eisensmith R.C., Goltsov A.A. A simple, rapid and highly informative PCR-based procedure for prenatal diagnosis and carrir screening of phenylketonuria // Prenatal diagnosis. 1994. - V. 14. - P. 1113-1118.

73. Eisensmith R.C., Woo S. L. Molekular Genetics of phenylketonuria: from molekular anthropology to gene therapy. // Advances in Genetics. 1995. - V. 32. -P. 199-265.

74. Erlandsen H., Stevens R. The structural basis of phenylketonuria //Mol. Gen. and Metabol. 1999. - V. 68. - P. 103-125.

75. Flatmark Т., Knappskog P., Martinez A. Molecular characterization of disease related mutant fosms of human phenylalanine hydroxylase and tyrosine hydroxylase / London: Blackwell Science. 1997. - P. 503-508.

76. Foiling A. The original detection of phenylketonuria // Phenylketonuria and some other errors of amino acid metabolism. Biochemistry. Genetics. Diagnosis. Therapy (Eds., Bickel R, Hundson P., Woolf L.J.)-Stutdart,1971.- P. 1-3.

77. Forbers S., Hogg J., Buchanan F. et al. Microsatellite evolution in congenett mammals: domestic and bighorn sheep //Mol. Biol. Evol. 1995. - V. 12. - P. 1106-1113.

78. Щ 90.Francois В., Vandevyver C, Verelst P. et al. Heterogeneity of phenylketonuriain Belgium at the genotype-phenotype level // Inherit. Metab. Disease.-1994-Vol.17.-№3.-P. 369-370.

79. Gable M., Williams M., Stephenson A., et al. Comparative Multiplex Dosage Analysis Detects Whole Exon Deletions at the Phenylalanine Hydroxylase Locus// Hum Mutat V.21. - p. 379-386

80. Giannattasio S, Dianzani I, Lattanzio P, Spada M, Romano V, Cali F, Andria G, Ponzone A, Marra E, Piazza A. Genetic heterogeneity in five Italian regions: analysis of PAH mutations and minihaplotypes. // Hum Hered.- 2001. V.52(3). -p. 154-9.

81. Goldstein, D. В., A. Ruiz Linares, L.L. Cavalli-Sfprza and M.W.Feldman. An evolution of genetic distances for use with microsatellite loci // Genetics, 1995b, 139:463-471.

82. Goltsov A.A., Eisensmith R.C., Konecki D.S. et al. Association between mutations and VNTR in the human phenylalanine hydroxylase gene // Am. J. Hum. Genet. 1992. V. 51. N3. P. 627-636.

83. Goltsov A.A., Eisensmith R.C., Koneski D. S. et al. Linkage disequilibrium between mutations and VNTR in the human phenylalanine hydroxylase gene. // Am.J. Hum. Genet. 1992. - V. 51. - P. 627-636.

84. Goltsov A.A., Eisensmith R.C., Naughton E.R. et al. A single polymorphic STR system in the human phenylalanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screening for phenylketonuria. // Hum. Mol. Genet. 1993.• V.2.-P. 577-581.

85. Grenett H.E., Ledley F.D., Reed L.L., Woo S.L.C. Full-length cDNA for rabbit tryptophan hydroxylase: Functional domains and evolution of aromatic amino acid hydroxylases. // Proc. Natl. Acad, Sci, USA. 1987, V.4. P.5530-5534.

86. Guldberg P., Lou H. C., Henriksen K. F. et al. A novel missense mutation in the phenylalanine hydroxylase gene of a homozygous Pakistani patient with non-PKU hyperphenylalaninemia. // Hum. Molec. Genet. 1993. - V. 2. - P. 10611062.

87. Guttler F., Ledley F. D., Lidsky A. S. et al. Correlation between polymorphic DNA haplotypes at phenylalanine hydroxylase locus and clinical phenotypes of phenylketonuria. // J. Pediat. 1987. - V. 110. - P. 68-71.

88. Hoang L, Byck S, Prevost et al. PAH mutation analysis Consortium Database: a database for disease-producing and other allelic variation at the human PAH locus // Nucl. Acids Res. 1999. -V. 24. - №1. - P. 127-131.

89. Jervis G.A. The clinical picture. //Springfield. 1963. - P. 52, 96, 101.

90. John S. W. M, Scriver C. R, Laframboise R. et al. In vitro and in vivo correlations for I65T and M1V mutations at the phenylalanine hydroxylase locus. //ф Hum. Mutat. 1992. - V. 1. - P. 147-153.

91. Kalaydjieva L., Dworniczalc В., Kucinslcas V. et al. Geographical distribution 0 gradients of the major PKU mutations and the linked haplotypes. 11 Hum. Genet.1991.-V. 86.-P. 411-413.

92. Kamaryt J., Mrslcos A., Podhradslca D., Kolcova V., Cahalslca В., Duczynslca N., Borzymowslca J. PKU locus:Genetic linkage with human amylase (Amy) loci and assignment to linkage group I. // Hum. Genet. 1978. V.43. P.205-210.

93. Kasnauslciene J., Giannattasio S., Lattansio P. et al. The molecular basis of phenillcetonuria in Lituania // Human mutation. 2003. - V. 21. - P. 398.

94. Kaufman S. A new cofactor required for the enzymatic conversion of phenylalanine to tyrosine.// J. Biol. Chem. 1958a. V.230. P.93 3-939.

95. Щ 122.Kaufman S. Phenylalanine hydroxylation cofactor in phenylketonuria.// Science.1958b. V.128. P. 1506-1508.

96. Kaufman S. Studies on the mechanism of the enzymatic conversion of phenylalanine to tyrosine. // J. Biol. Chem. 1959. V.234. P.2677-2682.

97. Kaufman S, The structure of the phenylalanine-hydroxylation cofactor.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. V.50. P. 1085-1093.

98. Kaufman S., Berlow S., Summer G. 1С, Milstein S., Schulman J. D., Orloff S„ Spielberg S., Pueschel S. Hyperphenylalaninemia due to a deficiency of biopterin. A variant form of phenylketonuria. //N. Engl. J. Med. 1978. V.299, P.673-679.

99. Kidd J., Pakstis A., Zhao H. et al Haplotypes and linkage disequilibrium at the phenylalanine hydroxylase locus, PAH, in a global representation of populations //

100. Am. J. Hum. Genet. 2000. -V.66. - P. 1882-1899

101. Kimura M., Weiss G.H. The stepping-stone model of population structure and decrease of genetic correlation with distance // Genetics. 1964. V. 49. P. 561-567.

102. Kimura Т., Ikeda H., Alcaba K. et al. Mutation analysis of phenylketonuria in Yamagata prefecture, Japan // Pediatrics International. 2001. - V. 43. - P. 1

103. Kleiman S., Vanagaite L., Bernstein J. et al. Phenylketonuria: variable phe-notypic outcomes of the R261Q mutation and maternal PKU in the offspring of a healthy homozygote. // J. Med. Genet. 1992. - V. 30. - P. 284-288,

104. Kuzmin A.I., Eisensmith R.C., Goltsov A.A., Sergeeva N.A., Schwartz E.I., Woo S.L.C. Complete spectrum of PAH mutations in Tataria: presence cf Slavic, Turkic and Scandinavian mutations. // Europ J Hum Genet. 1995. V.3. P.246-255.

105. Kwok S. С. M., Ledley F. D., DiLella A. G. et al. Nucleotide sequence of a full-length complementary DNA clone and amino acid sequence of human phenylalanine hydroxylase. // Biochemistry. 1985.- V. 24. - P. 556-561.

106. Latter, B.D.H. Selection in finite populations with multiple alleles. Ill Genetic divergence with centripetal selection and mutation // Genetics, 1972, 70: 475-490.

107. Lazarus R.A., Benkovic S J., Kaufman S. Phenylalanine hydroxylase stimulator protein is a 4a~carbino! amine dehydratase. '// J. Biol. Chem. 1983. V.258. V. 1096010962.

108. Ledley F. D., Grenett H. E., DiLella A. G. et al. Gene transfer and expression of human phenylalanine hydroxylase. // Science. 1985. - V. 228. - P. 77-79.

109. Lichter-Konecki U., Konecki D. S., DiLella A. G. et al. Phenylalanine hydroxylase deficiency caused by a single base substitution in an exon of the human phenylalanine hydroxylase gene. // Biochemistry. 1988.- V. 27. -P. 2881-2885.

110. Lidsky AS., Guttler F., Woo S.L.C. Prenatal diagnosis of classical phenylketonuria by DNA analysis.// Lancet 1985a. V. 1 P. 1549-551.

111. Lidsky AS, Law M.L., Morse H.G., Kao F.T., Woo S.L.C. Regional mapping of the phenylalanine hydroxylase gene and the phenylkelonuria locus in the human genome. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1985.- V. 82. - P. 6221-6225.

112. Li J, Eisensmith R. C., Wang Т., Lo W.H.Y, Huang S.Z., Zeng Y. Т., Yuan L.F., Liu, S.R, Woo S.L.C. Identification of three novel missense PKU mutations among Chinese. // Genomics. 1992. V,13. P.894-895

113. Mardesic D., Gjuric G., Jancikovic J. et al. Screening for phenylketonuria in Yugoslavia (SR Croatia) 1979-1984. // J. Inherit. Metabol. Disease. 1986. - V. 9. - P. 234-236.

114. Marvit J., DiLella A. G., Brayton K. et al. GT to AT transition at a splice donor site causes skipping of the preceding exon in phenylketonuria. // Nucleic Acids Res. -1987. V.15. - P. 5613-5628.

115. Meijer H., Jongbloed R.J., Hekking M., Spaapen J.M., Geraedts P.M. RFLP haplotyping and mutation analysis of the phenylalanine hydroxylase gene in Dutch phenylketonuria families. //. Hum Genet 1993. V.92. P588-592.

116. Miller SA., Dyckes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. //Nucl Asids Res. 1988. V. 16. P. 1215

117. Mitoma C. Studies on partially purified phenylalanine hydroxylase. // Arch. Bioch. 1956. -V. 60. - P. 476.

118. Moller N., Meek S., Bigelow M. et al. The kidney is an important site for in vivo phenylalanine-to-tyrosine conversion in adult humans: A metabolic role of the kidney // Proc. Nat. Acad. Sci USA. 2000-V. 97 (3). - P. 1242-1246.

119. Morales G, Requena С, M., Jimenez-Ruiz A., Lopez M.C., Ugarte M., Alonso C. Sequence and expression of the Drosophila phenylalanine hydroxylase mR.NA. // Gene. 1990. V.93. P.213-219.

120. Nechiporenko MV, Lalivshits LA. Analysis of mutations in the phenylalanine hydroxylase gene in Ukrainian families at high risk for phenylketonuria. // Tsitol Genet. 2000.-V.34(6).-p.59-63.

121. Nei, M. Genetic distance between populations // Amer. Nat., 1972, 106:283291.

122. Nei, M. The theory and estimation of genetics distance, pp. 45-54 in Genetic Structure of Populations / edited by N.E.Morton , 1973, University Press of Hawaii, Honolulu.

123. Nicolini H., Cruz C., Camarena B. et al. Molecular analysis of the phenylalanine hydroxylase gene in Mexican phenylketonuric patients.// Arch Med Res. -1995.-V. 26. -№1.-P. 53-60.

124. Okano Y., Isshiki G., Hase Y. Et al. Molecular basis and population genetics of PKU in Orientals: Abstr. 36th Annu. Meet. Jap. Soc. Hum. Genet. 1991 // Jap. J. Hum. Gen. 1991.-V.37.-№1.-P. 93.

125. Okano Y., Eisensmith R. C., Dasovich M. et al. A prevalent missense mutation in Northern Europe associated with hyperphenylalaninaemia. // Europ. J. Pe-diat. 1991. - V. 150. - P. 347-352.

126. Okano Y., Wang Т., Eisensmith R. C. et al. Phenylketonuria missense mutations in the Mediterranean. // Genomics. 1991. -V. 9. - P. 96-103.

127. Okano Y., Hase Y., Lee D.H. et al. Frequency and distribution of phenylketonuria mutations in Orientals // Hum. Mutat. 1992. V. 1. N 3. P. 216-220.

128. Okano Y., Asada M., Kang Y. Molecular characterization of phenylketonuria in Japanese patients. //Hum. Genet. 1998. V.103. P.613-618.

129. Ozalp I., Coskun Т., Ceyhan M. Et al. Incidence of phenylketonuria and hy-perphenylalaninemia in a sample of the Turkish newborn population. // J. Inherit. Metab. Disease. 1986. - V. 9. - № 2. - P. 237-239.

130. Ozalp I., Coskun Т., Tokatli A. Newborn PKU screening in Turkey: at present and organization for future. // Turk. J Pediatr. 2001. - V.43(2). - P.97-101.

131. Paul T.D., Brandt I.K., Elsas, L.J., Jackson C.E., Nance C.S., Nance W.E. Linkage analysis using heterozygote detection in phenylketonuria.// Clin Genet. 1979a. V. 16. P.217-232.

132. Pey AL, Desviat LR, Gamez A, Ugarte M, Perez B. Phenylketonuria: geno-type-phenotype correlations based on expression analysis of structural and functional mutations in PAH. // Hum Mutat. 2003. - V.21(4). - p.370-8.

133. Pronina N., Giannattasio S, Lattanzio P. et al. The Molecular Basis of Phenylketonuria in Latvia. // Hum Mutat. 2003. - V. 21. - P.398-399.

134. Rey F, Berthelon M, Caillaud C. et al. Clinical and molecular heterogeneity of phenylalanine hydroxylase deficiencies in France. // Am. J. Hum. Genet. -1988.-V. 43.-P. 914-921.

135. Rivera I, Leandro P, Lichter-Konecki U. et al Population genetics of hyper-phenylalaninaemia resulting from phenylalanine hydroxylase deficiency in Portugal. // J Med Genet. 1998. V. 35. - № 4. - P. 301-400.

136. Robson K.J.H., Chandra T, MacGillivray R.T.A, Woo S.L.C. Polysome im-munoprecipitation of phenylalanine hydroxylase mRNA from rat liver and cloning of its cDNA. //Proc, Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V.79. P4701-4705.

137. Roff D.A, Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA: % and problem of small samples // Mol. Biol. Evol, 1989. V.6. P. 539-545.

138. Romeo G, Menozzi P, Ferlini A. et al. Incidence of classic PKU in Italy .estimated from consanguineous marriages and from neonatal screening. // Clin. Genet. 1983. V. 24. - P. 339-345.

139. Rosenblatt D, Scriver C.R. Heterogeneity in genetic control of phenylalanine metabolism in man. //Nature. 1968. V.2.18. P.677-679.

140. Roy M.S., Geffen E, Ostrander E. And Wayne R. Patterns of differentiation and hybridization in North American wolflike canids, revealed by analysis of mi-crosatellite loci //Mol. Biol. Evol. 1994. - V. 11. - P. 553-570.

141. Santana da Silva LC, Carvalho TS, da Silva FB, et al. Molecular characterization of phenylketonuria in South Brazil.// Mol Genet Metab. 2003. - V.79(l). -p. 17-24.

142. Scriver C.R, Kaufman S, Woo S.L.C. Mendelianhyperphenylalanineinia. // Annu. Rev. Genet. 1988. V.22. P.301-321.

143. Scriver C.R. A database for geography and evidence for selection, drift, migration and reccurent mutation at the PAH locus in human populations. // Abst. Human Genome Variation in Europe: DNA Markers, Barselona, 9-10 November1995.-P. 38.

144. Scriver C., Kaufman S., Eisensmith R., Woo S. The hyprtphenylalaninemias. In the metabolic and Molecular Bases of Inherited disease, 7 th ed. /New York: McGraw-Hill. 1995. - P. 1015-1075.

145. Scriver C, Waters P, Sarkissian C, Ryan S, Prevost L, Cote D, Novak J, Teebi S, Nowaclci P. 2000. PAHdb: a locus-specific knowledgebase. Hum Mutat. V.15. -p. 99-104.

146. Smith S.C., Kemp В. E., McAdam W. J., et al. Two apparent molecular weight forms of human and monkey phenylalanine hydroxylase are due to phosphorylation //J. Biol. Chem. 1984. V.259. P. 11284-11289

147. Sneath P and Solcai R. Numerical Taxonomy // W.HFreeman, San Francisco. 1973.

148. Sullivan S.E., Lydslcy A.S., Brayton K. et al. Phenylalanine hydroxylase deletion mutant from a patient with classical PKU //(Abstract) Am J. Hum. Genet. -1985.-V. 37.- P. 177

149. Svensson E., Andersson В., Hagenfeldt L. Two mutations within the coding sequence of the phenylalanine hydroxylase gene. // Hum. Genet. 1990.- V. 85.• P. 300-304.

150. Svensson E., von Dobeln U., Hagenfeldt L. Polymorphic DNA haplotypes at the phenylalanine hydroxylase locus and their relation to phenotype in Swedish phenylketonuria families. // Hum. Genet. 1991. - V. 87. - № 1. - P. 11-17.

151. Svensson E., Eisensmith R. C., Dworniczalc, B. et al. Two missense mutations causing mild hyperphenylalaninemia associated with DNA haplotype 12. // Hum. Mutat. 1992. - V. 1. - P. 129-137.

152. Szabo L., Somogyi Csilla, Mate Mechtild. Experience based on 800000 newborn screening tests of the Budapest Phenylketonuria Centre // Acta paediat.hung.-1985.-Vol.26.-№ 2.-P.l 13-125

153. Takarada Y., Kagawa S, Okano Y. Rapid single-base mismatch detection in genotyping for phenylketonuria. // Molecular Biotechnology. 2003. - V.24. - P. 233-242

154. Thalhammer O., Pollak A. Neugeborenen-Screening auf angeborene Stoffwechselanomalien // MTA.-1986.-Vol .-№ 8.-P. 593-596.

155. Tighe O., Dunican D., O'Neill C. Genetic diversity within the R408W phenylketonuria mutation lineages in Europe // Hum. Mutation. 2003. - V. 21. -P. 387-393.

156. Traiger-Synodinos J., Kanavakis E., Kalogerakou M. et al. Preliminary mutation analysis in the phenylalanine hydroxylase gene in Creek PKU and HP A patients //(Abstract) Hum. Gen. 1994. - V. 94. - P. 573-575.

157. Tsai T.-F., Hsiao K.-J., Su T.-S. Phenylketonuria mutation in Chinese haplotype 44 identical with haplotype 2 mutation in northern-Eiropean Caucasian. // Hum. Genet. 1990. V.84. P.409

158. Tsukerman G., Kirillova I., Gusina N. et al. Population control of Genetics deseases in Belarus: Status and development. // Brasilian Jour. Of Genet. 1996. -V. 19.-№2.-P. 75-77.

159. Tyfield L. A., Stephenson A., Cockburn F. et al. Sequence variation at the phenylalanine hydroxylase gene in the British Isles. // Am. J. Hum. Genet.- 1997. -V. 60.-P. 388-396.

160. Vallian S, Barahimi E, Moeini H. Phenylketonuria in Iranian population: a study in institutions for mentally retarded in Isfahan.// Mutat Res.- 2003. -V.526(1-2). -p.45-52.

161. Veale A.M.O. Screening for phenylketonuria : Neonatal Screen. Inborn Errors Metab., Berlin e.a.,1980;-P.7-18.

162. Weber J., Wong C. Mutation of human short tandem repeats //Hum. Mol. Genet. 1993. - V. 2. - P. 1123-1128.

163. Wedemeyer N., Dwomiczak В., Horst. PCR detection of the Mspl (Aa) RFLP at the human phenylalanine hydroxylase (PAH) locus.// Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 1959.

164. Woo S.L.C. Collation of RFLP haplotypes at the human phenylalanine hydroxylase (PAH) locus // Am. J. Hum. Genet. 1988. V. 43. P. 781-783.

165. Woo S.L.C. Molekular genetics of PKU and gene therapy for hepatic deficiencies // Europ. Soc. Hum. Genet., 24 Annu. Meet., May 27-31, 1992. Copenhagen, P. 155-156.

166. Woo S.L.C., Lidsky A.S., Guttler F. et al. Cloned human phenylalanine hy-droxilase gene permits prenatal diagnosis and carrier detection of classical phenylketonuria//Nature. 1993. V. 306. P. 151-155.

167. Woolf L. I. The heterozygote advantage in phenylketonuria // (Letter) Am. J. Hum. Genet. 1986. V. 38. - P. 773-775.

168. Zaffanello M, Maffeis C, Zamboni G. Multiple positive results during a neonatal screening program: a retrospective analysis of incidence, clinical implications and outcomes. J Perinat Med. 2005. V.33(3). - p.246-51.

169. Zekanowski C, Jurkowska M, Bal J. Association between minihaplotypes and mutations at the PAH locus in Polish hyperphenylalaninemic patients.// Hum He-red.- 2001. V.51(1-2). - p. 117-20.

170. Zschocke J., Hoffmann G. Phenylketonuria mutations in Germany // Hum. Gen.- 1999.-V. 104.-P. 390-398.

171. Zschocke J, Preusse A, Sarnavka V. et al. The molecular basis of phenylalanine hydroxylase deficiency in Croatia.// Hum Mutat.- 2003.- V.21(4). P. 399.

172. Zschocke J., Hoffmann G. Phenylketonuria mutations in Europe // Hum. Mutation.-2003.-V. 21.-P. 345-356.

173. Zygulska M., Eigel A. Aulehla-Scholz C. Molecular analysis of PKU haplo-types in the population of southern Poland. // Hum. Genet. 1991. - V. 86. - P. 292-301.