Анализ данных высокопроизводительного секвенирования для неинвазивного пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Шубина Екатерина

• Шубина Екатерина
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Шубина Екатерина

Список сокращений....................................................................................5

Введение.....................................................................................................6

Актуальность проблемы.....................................................................................................................6

Цели и задачи работы..........................................................................................................................6

Научная новизна и практическая значимость...................................................................................7

Положения, выносимые на защиту....................................................................................................8

Апробация результатов.......................................................................................................................8

Внедрение результатов исследования в практику............................................................................9

Публикации..........................................................................................................................................9

Список работ, опубликованных в перечне изданий, рекомендованных ВАК.............................9

Список работ, опубликованных в виде тезисов конференций..................................................10

Структура и объем работы...............................................................................................................11

Глава 1. Обзор литературы.......................................................................12

Прямые методы определения анеуплоидий плода.........................................................................13

Инвазивный забор материала для исследования.......................................................................13

Использование циркулирующих клеток плода в кровотоке матери........................................14

Непрямые методы скрининга анеуплоидий....................................................................................15

Скрининг второго триместра.....................................................................................................15

Скрининг первого триместра......................................................................................................16

Использование внеклеточной ДНК для определения наличия анеуплоидий..............................18

Цифровая ПЦР..............................................................................................................................19

Полногеномное секвенирование...................................................................................................20

Таргетное секвенирование...........................................................................................................25

Алгоритмы анализа данных, используемые при полногеномном секвенировании внеклеточной

ДНК.................................................................................................................................................................26

Методы GC-коррекции.....................................................................................................................30

Локальная линейная регрессия (LOESS)......................................................................................30

Весовые коэффициенты для отдельныхридов..........................................................................31

Весовые коэффициенты для фрагментов фиксированной длины...........................................31

Биологические ограничение НИПС.................................................................................................31

Клинические испытания и применение неинвазивного пренатального скрининга....................34

Определение риска наличия анеуплоидий по половым хромосомам..........................................36

Определение риска наличия редких анеуплоидий.........................................................................37

Доступные решения для НИПС.......................................................................................................38

2

Глава 2. Материалы и методы исследования..........................................39

Материалы..........................................................................................................................................39

Характеристика пациенток...............................................................................................................40

Ретроспективная группа.............................................................................................................40

Проспективная группа..................................................................................................................40

Забор крови и отделение плазмы.....................................................................................................41

Выделение свободноциркулирующей ДНК....................................................................................41

Проведение ПЦР................................................................................................................................42

Приготовление библиотек для секвенирования.............................................................................42

Библиотеки для секвенирования свободноциркулирующая ДНК..............................................42

Библиотеки для таргетного секвенирования однонуклеотидных полиморфизмов...............43

Первичная обработка данных секвенирования..............................................................................44

Определение хромосомного статуса плода и матери.....................................................................49

Использование программных пакетов для анализа данных..........................................................49

Глава 3 Результаты и выводы...................................................................49

Определение наличия анеуплоидий................................................................................................49

Выбор метода определения наличия анеуплоидий по покрытию внутри образца.....................51

Фильтрация ПЦР дупликатов...........................................................................................................53

Фильтрация неуникальных участков генома..................................................................................56

Фильтрация по качеству выравнивания..........................................................................................58

ОС-коррекция....................................................................................................................................61

Локальная линейная регрессия :...................................................................................................63

Локальная линейная регрессия с использованием весовой функции.........................................63

Весовые коэффициенты...............................................................................................................63

Результаты сравнения различных способов ОС-коррекции.....................................................64

Определение оптимального размера фрагмента в разбиении генома..........................................69

Определение предела детекции и и минимально необходимого для анализа количества

прочтений........................................................................................................................................................70

Результаты валидации.......................................................................................................................78

Определение материнского и плодового происхождения анеуплоидий......................................81

Разработка способа определения доли плодовой ДНК..................................................................88

Выбор однонуклеотидных полиморфизмов................................................................................89

Оценка частоты встречаемости полиморфизмов в российской популяции..........................89

Определение доли плодовой ДНК.................................................................................................96

Заключение........................................................................................................................................98

Выводы.............................................................................................................................................100

Список литературы.................................................................................101

Список сокращений

ХА - хромосомные анеуплоидии

НИПС - неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг

НИПТ - неинвазивный пренатальный тест

NGS - next generation sequencing

УЗИ - ультразвуковое исследование

ТВП - толщина воротникового пространства

PPV - positive predictive value (положительная предиктивная оценка) NPV - negative predictive value (отрицательная предиктивная оценка) ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота AFP - а-фетопротеин

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека PAPP-A - Pregnancy Associated Plasma Protein-A ПЦР - полимеразная цепная реакция ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота FISH -fluorescent in situ hybridization п.н. - пары нуклеотидов

qf-PCR - quantitative fluorescence polymerase chain reaction МОМ - Multiples of the normal Median

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ данных высокопроизводительного секвенирования для неинвазивного пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий.»

Актуальность проблемы

Хромосомные аномалии являются частой причиной перинатальной смертности и детской инвалидности. Они являются причиной до 30% неразвивающихся беременностей и выкидышей. У новорожденных ХА встречаются с частотой до 1:300. Наиболее частыми анеуплоидиями являются трисомии по 21 и 18 хромосомам. Риск наличия у плода хромосомных нарушений существенно возрастает с возрастом матери.

В настоящее время в России для своевременного обнаружения ХА плода проводится комбинированный скрининг, который основывается на результатах УЗИ обследования и биохимических показателях в 1 триместре беременности, что позволяет сформировать группу риска. Скрининг основан на косвенных маркерах и имеет ограничение по чувствительности и специфичности, поскольку колебания биохимических показателей зависят не только от хромосомного статуса плода, но и от гормонального фона беременной женщины. Наличие анеуплоидии подтверждается примерно в 1 из 8 случаев высокого риска по данным скрининга. Для установки хромосомного статуса плода требуется проведение подтверждающей диагностики с забором материала инвазивными методами (биопсия хориона, амниоцентез или кордоцентез), что может привести к потере беременности в 0,5-2% случаев и противопоказано для женщин с угрожающим выкидышем.

Таким образом, разработка неинвазивных методов оценки генетического статуса плода, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью представляет научный и практический интерес.

Цели и задачи работы

Цель работы заключалась в разработке метода анализа данных высокопроизводительного секвенирования внеклеточной ДНК плазмы крови,

позволяющее детектировать анеуплоидии плода по крови беременной женщины. Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

• Разработать алгоритм анализа данных высокопроизводительного секвенирования, позволяющий определять риск наличия анеуплоидии у плода на основании особенностей покрытия хромосом.

• Выбрать статистические критерии для определения анеуплоидий.

• Подобрать оптимальные параметры для каждого из этапов анализа данных.

• Провести валидацию метода на выборке образцов с известным хромосомным статусом плода.

• Определить особенности применения метода для различных клинических ситуаций.

• Разработать способ оценки доли плодовой ДНК вне зависимости от пола плода.

• Разработать способ определения происхождения анеуплоидных клеток (материнское или плодовое)

Научная новизна и практическая значимость

Разработан алгоритм анализа данных высокопроизводительного секвенирования для определения хромосомного статуса плода по внеклеточной ДНК плазмы крови беременных женщин. Проведена валидация метода на контрольной выборке из 266 образцов с известным хромосомным статусом плода. И проспективное исследование на выборке из 640 образцов, для которых известны исходы беременности. Определены технические (доля плодовой ДНК) и биологические (материнские анеуплоидии, состояния после трансплантации, мозаицизм плода и плаценты) ограничения метода.

Впервые предложен алгоритм определения риска наличия анеуплоидий с одновременным использованием 2-х статистических критериев, позволяющий увеличить точность скрининга.

Впервые разработана методика определения источника анеуплоидных клеток - мать или плод, позволяющая избежать ложноположительных результатов, связанных с особенностями кариотипа матери.

Разработана панель однонуклеотидных полимозфизмов для определения доли плодовой ДНК вне зависимости от пола плода с использованием таргетного секвенирования с учетом частоты встречаемости в российской популяции.

В рамках апробации получен первичный опыт практического применения неинвазивного пренатального ДНК-скрининга в Научном центре Акушерства Гинекологии и Перинатологии имени академика В.И.Кулакова.

Положения, выносимые на защиту

Разработан алгоритм анализа данных высокопроизводительного секвенирования, позволяющий определять наличие анеуплоидий у плода по плазме крови беременной женщины. Он валидирован на выборке из 906 образцов, показаны чувствительность 98% и специфичность 99%.

Предложен метод определения происхождения анеуплоидных клеток (материнское или плодовое), который позволяет значительно снизить количество ложноположительных результатов.

Разработан метод оценки доли плодовой ДНК вне зависимости от пола плода, основанный на таргетном секвенировании панели однонуклеотидных полиморфизмов с высокой степенью гетерозиготности.

Апробация результатов

Результаты работы были представлены на 2 российских и 3 международных конференциях.

Внедрение результатов исследования в практику

На основании проведенных исследований разработаны стандартные операционные процедуры и лабораторный регламент. Разработано программное обеспечение «НИПС» для автоматического проведения анализа данных.

Результаты исследования внедрены и используются в практической работе отдела клинической и молекулярной генетики в Научном центре Акушерства Гинекологии и Перинатологии имени академика В.И.Кулакова. Опубликованы методические рекомендации по применению НИПС, утвержденные обществом акушеров гинекологов.

Получен патент:

Тест-система для определения доли плодовой ДНК в плазме крови беременной женщины с помощью методов высокопроизводительного секвенирования (заявка на патент RU2636618C1)

Подана заявка на патент:

Способ определения источника анеуплоидных клеток по крови беременной женщины (заявка на патент RU2016152686A)

Публикации

По материалам работы было опубликовано 7 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК, 5 тезисов докладов в сборниках трудов конференций, 1 монография.

NGS высокопроизводительное секвенирование/ Д.В. Ребриков, Д.О. Коростин, Е.С. Шубина, В.В. Ильинский// - 2014 - БИНОМ - 232с.

Список работ, опубликованных в перечне изданий, рекомендованных ВАК.

Shubina J, Trofimov DY, Barkov IY, et al. In silico size-selection is effective in reducing false positive NIPS cases of Monosomy X that are due to maternal mosaic Monosomy X. Prenatal Diagnosis. 2017. https://doi.org/10.1002/pd.5178

Неинвазивный пренатальный днк-тест в качестве скрининговой методики у женщин различных групп риска: взгляд на проблему. Тетруашвили Н.К., Ким

Л.В., Парсаданян Н.Г., Федорова Н.И., Барков И.Ю., Шубина Е.С., Трофимов Д.Ю. Акушерство и гинекология. 2016. № 8. С. 24-28.

Новые подходы к проведению пренатального скрининга хромосомной патологии: днк-скрининг по крови матери. Сухих Г.Т., Трофимов Д.Ю., Барков И.Ю., Донников А.Е., Шубина Е.С., Коростин Д.О., Екимов А.Н., Гольцов А.Ю., Бахарев В.А., Каретникова Н.А., Боровиков П.И., Тетруашвили Н.К., Ким Л.В., Гата А.С., Павлович С.В., Скрябин К.Г., Прохорчук Е.Б., Мазур А.М., Пантюх К.С. //Акушерство и гинекология. 2016. № 8. С. 72-78.

Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий плода, основанная на секвенировании внеклеточной днк крови беременной женщины. Пантюх К.С., Шубина Е.С. // Акушерство и гинекология. 2015. № 8. С. 5-11.

Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) в группе женщин высокого риска. Г.Т. Сухих, Н.А. Каретникова, Е.Е. Баранова, Е.С. Шубина, Д.О. Коростин, А.Н. Екимов, Н.Г. Парсаданян, А.И. Гус, В.А. Бахарев, Д.Ю. Трофимов, С.М. Воеводин, Н.К. Тетруашвили // Акушерство и гинекология.-2015. - №4.- С.4-10.

Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплодий методом секвенирования внеклеточной ДНК. Современный взгляд на проблему / Н.К. Тетруашвили, Н.Г. Парсаданян, Н.И. Федорова, Д.Ю. Трофимов, Е.С. Шубина // Акушерство и гинекология.- 2014. - №10.- С.4-7.

Свободная эмбриональная ДНК в прогнозировании исхода беременности при акушерской патологии / Н.Г. Парсаданян, Е.С. Шубина, Д.Ю. Трофимов, Н.К. Тетруашвили // Акушерство и гинекология.- 2014. - № 6.- С.10-13.

Список работ, опубликованных в виде тезисов конференций

Е. Шубина, И.Ю. Барков, Л.В. Ким и др.: Неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг анеуплоидий (НИПС) по крови матери: особенности и ограничения метода. NGS в медицинской генетике, Суздаль 26-28 апреля 2017.

Jekaterina Shubina, Ilya Barkov; Lyudmila Kim; et al. Maternal Aneuploidy as a Cause of False Positive Noninvasive Prenatal DNA Screening Results. Prenatal Molecular Diagnostics Europe, Lisbon 10-14 April 2017

Dmitry Trofimov; Ilya Barkov; Jekaterina Shubina; et al. False Negative Trisomy 21 Noninvasive Prenatal Screening Result Due to Fetal Mosaicism. Prenatal Molecular Diagnostics Europe, Lisbon 10-14 April 2017

J.S. Shubina, I.Y Barkov, A.Y.Golcov, I.S.Mukosey, T.Jankevic, D.Yu.Trofimov: Fetal fraction estimation for noninvasive prenatal screening (NIPS). Cjntroversies in preconception, preimplantation and prenatal genetic diagnosis, Barcelona 22-24 September 2016.

Коростин Д., Шубина Е., Каретникова Н.А., Трофимов Д.: «Неинвазивная пренатальная диагностика (NIPT) на базе платформы Ion Proton» Геномное секвенирование 2014, 15 мая 2014

E.S. Shubina, D.O. Korostin, D. Yu. Trofimov, N.A. Karetnikova, V.A Bakhrev, G.T. Sukhikh: «First results for noninvasive prenatal testing using Ion Proton Sequencer in Research Center of Obstetrics Gynecology and Perinatology, Moscow, Russia.» Prenatal Molecular Diagnostics Europe, Lisbon 12-13 May 2014

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, одной главы обзора литературы, одной главы с описанием материалов и методов, одной главы результатов и обсуждения экспериментов, выводов, списка цитируемой литературы, в который входит 107 источников. Работа изложена на 114 страницах содержит 25 рисунков и 16 таблиц.

Глава 1. Обзор литературы

Изменение количества хромосом не кратное гаплоидному набору организма называется анеуплоидией. Синдромы Дауна, Эдвардса, Патау и Клайнфельтера вызываются наличием лишних 21, 18, 13 и X хромосомы соответственно. Синдром Тернера связан с наличием всего 1 X хромосомы [92].

Причины возникновения синдрома Дауна и других синдромов, связанных с изменением нормального количества хромосом, были обнаружены более 55 лет назад [47]. В исследованиях 60-70х годов было показано, что анеуплоидии среди живых детей встречаются в 0,3% случаев, а среди мертворожденных в 4%. Среди прервавшихся в 1 триместре беременностей количество анеуплоидий достигает 35%. По разным оценкам доля анеуплоидных зигот составляет от 5 до 30%, а в случае женщин старше 35-40 лет она может достигать 50%. Большинство беременностей с анеуплоидиями прерываются самопроизвольно на ранних сроках, таким образом, анеуплоидии являются одной из основных причин прерывания беременности [41][62].

Причины возникновения анеуплоидий до конца непонятны и скорее всего носят комплексный характер. В подавляющем большинстве случаев лишняя хромосома оказывается материнского происхождения. Известно, что вероятность возникновения анеуплоидий плода возрастает с возрастом женщины [41, 62]. Зависимость частоты встречаемости трисомий от возраста женщины приведена на рисунке 1 [46]. Доля беременностей с трисомией значительно возрастает после 35 лет. Поскольку во всем мире женщины все чаще откладывают рождение детей на более позднее время проблема становится все более актуальной.

А

О

<15 18 22 26 30 34 38 >42 Ма1егпа1 аде

Рисунок 1. Зависимость частоты встречаемости трисомий от возраста матери [46].

Прямые методы определения анеуплоидий плода.

Инвазивный забор материала для исследования

Для определения наличия анеуплоидий пренатально разработаны инвазивные методы, позволяющие получить материал плода.

Амниоцентез, обычно выполняется между 16 и 28 неделями беременности. С помощью иглы, под контролем УЗИ трансабдоминально аспирируется около 20 мл амниотической жидкости. При проведении амниоцентеза риск прерывания беременности около 1%, однако он возрастает, если проводить процеруру на более ранних сроках.

Биопсия хориона, то есть забор клеток развивающейся плаценты обычно проводится на сроке 10-12 недель под контролем УЗИ. Процедура может

проводится как трансабдоминально, так и трансвагинально. Ранние сроки проведения позволяют проводить диагностику уже в 1 триместре беременности, однако недостатком процедуры является то, что для анализа используются клетки плаценты, хромосомный набор которых в редких случаях может отличаться от хромосомного набора плода.

Кордоцентез - забор пуповинной крови плода, проводится с 16 недели беременности. Игла вводится под контролем УЗИ в пупочную вену. Процедура несет в себе риск контаминации материнской кровью, поэтому проводится дополнительный анализ содержания гемоглобина в крови. Кордоцентез более сложная процедура, чем амниоцентез, однако риск прерывания беременности, связанный с проведением процедуры ниже.

Во всех случаях безопасность инвазивных процедур зависит от опыта специалистов, которые их проводят.

Наличие анеуплоидий вне зависимости от метода забора материала может определятся с помощью классического кариотипирования, FISH, qf-PCR и молекулярного кариотипирования на микрочипах. «Золотым стандартом» является классическое кариотипирование, однако молекулярно-генетические методы позволяют получить результат быстрее, что важно при наличии анеуплоидий и необходимости принятия решения о прерывании беременности [42][32].

Примерно до 1990х годов проведение инвазивной процедуры было единственным доступным методом определить наличие анеуплоидий и предлагалось женщинам с старше 35 лет. С использованием такого подхода можно было выявить до 30% случаев синдрома Дауна. При этом около 5% всех беременных женщин должны были пройти инвазивную процедуру [84].

Использование циркулирующих клеток плода в кровотоке матери.

В 1969 году было показано наличие лимфоцитов с X и Y хромосомой в периферической крови женщин, вынашивающих плод мужского пола. С тех пор разработаны различные методики оценки их количества, способы определения и

14

отбора. И предпринимаются попытки использования клеток плода для диагностики наследственных заболеваний и хромосомных аномалий [12]. По разным оценкам клетки плода встречаются в кровотоке матери с частотой 10-410-8 [25]. С учетом такой редкой встречаемости изоляция клеток плода и их использование в диагностических целях оказывается сложной задачей [61] и до настоящего времени этот метод не получил широкого распространения.

Непрямые методы скрининга анеуплоидий

Скрининг второго триместра

В середине 1980х годов был проведен ряд исследований с целью определения показателей биохимических маркеров ассоциированных с наличием анеуплоидий [84]. В 1984 году было показано, что в группах беременностей с трисомиями по 18 и 21 хромосомам наблюдается низкий уровень а-фетопротеина (AFP) [1]. В 1987 году Bogart и др. обнаружили, что общий уровень бета-ХГЧ повышен для беременностей с трисомией по 21 хромосоме и понижен для беременностей с трисомией по 18 хромосоме [14]. Годом позже Canick и др показал, что с трисомией по 21 хромосоме ассоциирован пониженный уровень свободного эстриола [17]. На основании этих данных был предложен метод оценки вероятности наличия хромосомных патологий у плода с учетом априорного риска, связанного с возрастом беременной женщины и уровнями трех биохимических маркеров, на основании распределения их значений в беременностях с нормальными плодами и с хромосомными патологиями. Такая схема анализа риска анеуплоидий известна как "тройной тест". В середине 1990х годов к этим маркерам был добавлен ингибин-А и был получен "четверной тест" [5].

Одной из сложностей оценки уровней биохимических маркеров для скрининга анеуплоидий является сильная зависимость их уровней от срока беременности. Таким образом возникает необходимость в каждом случае пересчитывать интервалы референсных значений. Кроме того, абсолютные

значения измеряемых параметров могут сильно зависеть от используемых наборов для анализа и отличаться от лаборатории к лаборатории. Для преодоления этих недостатков метода было предложено выражать измеренные уровни биохимических маркеров в МОМ (Multiples of the normal Median) отношении измеренного значения к медиане для нормальных беременностей того же срока выполненных с использованием тех же реактивов [27].

Скрининг второго триместра в основном применяется для анеуплоидий по 21 и 18 хромосомам, поскольку беременности с трисомией по 13 хромосоме практически не отличаются от нормальных. При использовании для скрининга 3-х биохимических маркеров можно выявить около 67% беременностей с синдромом Дауна при доле ложноположительных результатов 5% (доля ложноположительных результатов (false positive rate FPR) отношение количества ложноположительных результатов (FP) к сумме ложноположительных (FP) и истинно отрицательных (TN) результатов FPR=FP/(FP+TN)). Добавление четвертого маркера «четверной тест» позволяет повысить выявляемость до 72% при той же доле ложноположительных результатов. Выявляемость для трисомии по 18 хромосоме ниже и составляет около 60% [84].

Помимо биохимического скрининга для оценки риска наличия анеуплоидий предлагается УЗ-скрининг маркеров анеуплоидий, однако четких критериев для оценки рисков не предложено [84].

В России массовый биохимический скрининг с целью выявления анеуплоидий во 2 триместре беременности осуществляется на сроке 15-17 недель в соответствии с приказом Минздрава от 28.12.2000 №457 «О совершенствовании пренатальной диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у детей».

Скрининг первого триместра

В последние 15 лет скрининговые процедуры стараются перенести на более ранний срок в первый триместр беременности. Это дает женщинам больше времени на принятие решения и в случае желания женщины прервать

16

беременность, позволяет использовать более безопасные процедуры прерывания.

Скрининг первого триместра, так же известный как комбинированный тест, включает в себя измерение с помощью ультразвукового исследования толщины воротникового пространства (ТВП) и биохимические маркеры в сыворотке крови: уровни свободного бета-ХГЧ и белка плазмы-А ассоциированного с беременностью (Pregnancy Associated Plasma Protein-A; PAPP-A). Риски наличия анеуплоидий рассчитываются с учетом срока беременности, определенного на основании величины копчико-теменного размера плода и возраста беременной женщины [8] [17].

Толщина воротникового пространства, наиболее селективный маркер для определения трисомии по 21 хромосоме в первом триместре беременности. В отличие от измерения уровней биохимических маркеров, измерение ТВП в значительной мере зависит от квалификации специалиста, который проводит процедуру. Помимо трисомии по 21 хромосоме ТВП, является информативным маркером для определения трисомий по 18 и 13 хромосоме, а также моносомии X. Кроме того, увеличение толщины воротникового пространства ассоциировано с рядом других нарушений у плода и осложнений беременности.

Поскольку между биохимическими маркерами сыворотки и ТВП нет корреляции их совместное использование позволяет значительно повысить точность скрининга. По данным проспективных и ретроспективных исследований комбинированный тест позволяет выявить около 90% случаев трисомии по 21 хромосоме при доле ложноположительных результатов 5% и меньше и позволяет выявить до 90% других анеуплоидий [84][85].

Скрининг первого триместра в настоящее время является стандартом во многих странах. В России внедрение скрининга первого триместра регламентируется Постановлением Правительства Российской Федерации от 31.12.2009 №1159.

Использование внеклеточной ДНК для определения наличия анеуплоидий.

В 1997 году Ло и соавт. показали наличие в плазме крови матери внеклеточной ДНК плода. С помощью ПЦР они амплифицировали участок ДНК специфичный для Y хромосомы из плазмы крови женщины вынашивающей плод мужского пола [56]. Было показано, что внеклеточная ДНК сильно фрагментирована, ее длина менее 200 п.н. [18] и выводится из кровотока матери почти сразу после родов [55]. Концентрация внеклеточной ДНК плода может зависеть от различных факторов и обычно растет при увеличении срока гестации [9, 11, 77, 97, 98]. Основной сложностью при анализе плодовой ДНК из кровотока матери является наличие большого количества фоновой материнской ДНК. Доля плодовой ДНК после 11 недели беременности составляет примерно 5-15% от всей внеклеточной ДНК в плазме крови.

До открытия свободноциркулирующей плодовой ДНК предпринимались попытки выделять клетки плода из кровотока матери. Концентрация клеток плода составляет примерно 1/10 000-1/100 000, что значительно ниже чем концентрация плодовой ДНК среди всей внеклеточной ДНК [39]. Кроме того, показано, что клетки плода могут сохранятся в кровотоке матери в течение долгого времени после родов, а их выделение отдельная, крайне сложная задача.

Идентифицировать плодовую ДНК среди всей внеклеточной ДНК так же не просто. Можно использовать последовательности специфичные для Y, в случае с плодом мужского пола. Эпигенетические маркеры или однонуклеотидные полиморфизмы, которых нет у матери [65], [26]. Но для определения изменения количества копий хромосом в большинстве подходов разделение материнской и плодовой ДНК и не требуется.

Определение наличия анеуплоидий плода по свободноциркулирующей ДНК в плазме крови беременной женщины получило название неинвазивного пренатального теста или скрининга (НИПТ/НИПС).

Цифровая ПЦР

Первые попытки использовать внеклеточную ДНК для определения хромосомного статуса плода были предприняты еще в 2007 году с использованием цифровой ПЦР (Digital PCR) [35], [57].

Метод цифровой полимеразной цепной реакции основан на разведении образца, разделении его на большое количество частей, предполагая, что распределение молекул при этом подчиняется распределению Пуассона, до такой степени, чтобы на каждую аликвоту приходилось 0 или 1 молекула днк, и проведении ПЦР отдельно для каждой части образца. Подсчет количества ДНК в образце проводится путем подсчета количества «положительных» реакций. Таким образом, данный метод не зависит от эффективности ПЦР и позволяет очень точно подсчитать количество молекул в образце [96]. Современные технологии позволяют одновременно проводить несколько тысяч реакций [88].

Для определения наличия трисомии по 21 хромосоме с помощью цифровой ПЦР возможно использовать различные подходы:

Измерение соотношения представленности полиморфных SNP, находящихся на 21 хромосоме [57]. Полученное соотношение сравнивают с теоретическим, после чего, анализируется вероятность такого соотношения для плода с нормальным генотипом и с трисомией. Применимость метода зависит от генотипа матери.

Сравнение представленности неполиморфных локусов находящихся на 21 хромосоме и какой-либо другой хромосоме [35, 57]. В этом случае удается избежать ограничений, связанных с генотипом матери.

Использование эпигенетических маркеров, позволяющих отличить плодовую свободноциркулирующую ДНК от ДНК матери [91], [90].

Кроме того, возможна комбинация различных подходов для увеличения точности метода [93]. Основным ограничением метода является необходимость увеличения количества реакций при снижении концентрации плодовой ДНК и

соответствующее увеличение минимально необходимого объема образца [4], [5], [11].

В настоящее время в литературе представлены только «proof of concept» исследования показывающие принципиальную возможность использования цифровой ПЦР для неинвазивного пренатального скрининга.

Полногеномное секвенирование

С появлением и удешевлением методов высокопроизводительного секвенирования большинство исследовательских групп переключилось на разработку методов, основанных на применении высокопроизводительного секвенирования. В отличие от цифровой ПЦР секвенирование не требует априорных знаний об исследуемых последовательностях и позволяет использовать информацию от всех последовательностей ДНК, находящихся в плазме. Первым из использованных методов скрининга анеуплоидий, является прямой подход, основанный на секвенировании всей внеклеточной ДНК плазмы крови беременной женщины с последующим биоинформационным анализом данных [24], [33].

Общая схема, иллюстрирующая этот подход приведена на рисунке 2. Он основан на подсчете секвенированных фрагментов (ридов), которые можно однозначно отнести к одной из хромосом. И сравнении доли фрагментов приходящихся на каждую из хромосом с теми же данными для референсного набора хромосом [37]. При доле плодовой ДНК среди всей ДНК 5%, при трисомии мы увидим увеличение покрытия соответствующей хромосомы на 2.5%. Разбросы доли фрагментов, приходящихся на каждую хромосому для референсных образцов, зависят от хромосомы и ее GC состава (рисунок 3). У 13, 18 и 21 хромосом, для которых наиболее часто наблюдаются трисомии, наблюдается относительно небольшой разброс в значениях покрытия, что позволяет использовать такой подход для определения частых анеуплоидий [33].

Рисунок 2. Определение анеуплоидий с помощью секвенированных фрагментов свободной ДНК из плазмы [37]

подсчета

Рисунок 3. Разбросы доли фрагментов приходящихся на каждую хромосому [33].

Вне зависимости от используемой платформы для секвенирования приготовление библиотек для последующего секвенирования включает в себя этап лигирования адаптеров, предварительного разрушения ДНК не требуется, поскольку свободноциркулирующая ДНК в плазме уже находится в сильно фрагментированном состоянии [18], [24], [34]. Последующую амплификацию ДНК для достижения необходимого для секвенирования количества материала, обычно изначального количества ДНК оказывается недостаточно. И клональную амплификацию ДНК на микросферах/твердой подложке, для получения достаточного сигнала от каждой молекулы [79]. Опубликованы работы, показывающие применимость основных платформ высокопроизводительного секвенирования для неинвазивного пренатального скрининга [24], [33], [105], [53].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шубина Екатерина, 2018 год

Список литературы

1. Merkatz I.R. An association between low maternal serum a-fetoprotein and fetal chromosomal abnormalities / I. R. Merkatz, H. M. Nitowsky, J. N. Macri, W. E. Johnson // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2016. - Т. 148 - № 7- 886-894с.

2. Bayindir B. Noninvasive prenatal testing using a novel analysis pipeline to screen for all autosomal fetal aneuploidies improves pregnancy management / B. Bayindir, L. Dehaspe, N. Brison, P. Brady, S. Ardui, M. Kammoun, L. Van der Veken, K. Lichtenbelt, K. Van den Bogaert, J. Van Houdt, H. Peeters, H. Van Esch, T. de Ravel, E. Legius, K. Devriendt, J. R. Vermeesch // Eur J Hum Genet - 2015.

3. ACOG Cell- free DNA Screening for Fetal Aneuploidy: Committee opinion No. 640 / ACOG // Obs. Gynecol - 2015. - Т. 126 - № 3- e31-37c.

4. Agarwal A. Commercial landscape of noninvasive prenatal testing in the United States / A. Agarwal, L. C. Sayres, M. K. Cho, R. Cook-Deegan, S. Chandrasekharan // Prenat. Diagn. - 2013. - Т. 33 - № 6- 521-531с.

5. Aitken D.A. Dimeric inhibin A as a marker for Down's syndrome in early pregnancy. / D. A. Aitken, E. M. Wallace, J. A. Crossley, I. A. Swanston, Y. van Pareren, M. van Maarle, N. P. Groome, J. N. Macri, J. M. Connor // N. Engl. J. Med. - 1996. - Т. 334 - № 19- 1231-6с.

6. Alberry M. Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that the origin is the trophoblast. / M. Alberry, D. Maddocks, M. Jones, M. Abdel Hadi, S. Abdel-Fattah, N. Avent, P. W. Soothill // Prenat. Diagn. - 2007. -Т. 27 - № 5- 415-8с.

7. Amant F. Presymptomatic Identification of Cancers in Pregnant Women During Noninvasive Prenatal Testing / F. Amant, M. Verheecke, I. Wlodarska, L. Dehaspe, P. Brady, N. Brison, K. Van Den Bogaert, D. Dierickx, V. Vandecaveye, T. Tousseyn, P. Moerman, A. Vanderstichele, I. Vergote, P. Neven, P. Berteloot, K. Putseys, L. Danneels, P. Vandenberghe, E. Legius, J. R. Vermeesch // JAMA Oncol. -2015. - 1-6с.

8. American College of Obstetricians and Gynecologists Noninvasive Prenatal 101

Testing for Fetal Aneuploidy: Committee Opinion No. 545 / American College of Obstetricians and Gynecologists // Obs. Gynecol. - 2012. - T. 120- 1532-1534c.

9. Ashoor G. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13 weeks' gestation: effect of maternal and fetal factors. / G. Ashoor, L. Poon, A. Syngelaki, B. Mosimann, K. H. Nicolaides // Fetal Diagn. Ther. - 2012. - T. 31 - № 4- 237-43c.

10. Balbeur S. Trisomy rescue mechanism: the case of concomitant mosaic trisomy 14 and maternal uniparental disomy 14 in a 15-year-old girl. / S. Balbeur, B. Grisart, B. Parmentier, D. Sartenaer, P.-E. Leonard, U. Ullmann, S. Boulanger, L. Leroy, P. Ngendahayo, C. Lungu-Silviu, P. Lysy, I. Maystadt // Clin. case reports -2016. - T. 4 - № 3- 265-271 c.

11. Barrett A.N. Implementing prenatal diagnosis based on cell-free fetal DNA: accurate identification of factors affecting fetal DNA yield. / A. N. Barrett, B. G. Zimmermann, D. Wang, A. Holloway, L. S. Chitty // PLoS One - 2011. - T. 6 - № 10- e25202c.

12. Beaudet A.L. Using fetal cells for prenatal diagnosis: History and recent progress / A. L. Beaudet // Am. J. Med. Genet. Part C Semin. Med. Genet. - 2016. -T. 172 - № 2- 123-127c.

13. Benjamini Y. Summarizing and correcting the GC content bias in high-throughput sequencing / Y. Benjamini, T. P. Speed // Nucleic Acids Res. - 2012. - T. 40 - № 10- e72-e72c.

14. Bogart M.H. Abnormal maternal serum chorionic gonadotropin levels in pregnancies with fetal chromosome abnormalities / M. H. Bogart, M. R. Pandian, O. W. Jones // Prenat. Diagn. - 1987. - T. 7 - № 9- 623-630c.

15. Brady P. Clinical Implementation of NIPT - Technical and Biological Challenges / P. Brady, N. Brison, K. Van Den Bogaert, T. de Ravel, H. Peeters, H. Van Esch, K. Devriendt, E. Legius, J. Robert Vermeesch // Clin. Genet. - 2015. - n/a-n/ac.

16. Bruns D.A. Twenty-five additional cases of trisomy 9 mosaic: Birth information, medical conditions, and developmental status / D. A. Bruns, E. Campbell // Am. J. Med. Genet. Part A - 2015. - T. 167 - № 5- 997-1007c.

17. Canick J.A. Low second trimester maternal serum unconjugated oestriol in pregnancies with Down's syndrome. / J. A. Canick, G. J. Knight, G. E. Palomaki, J. E. Haddow, H. S. Cuckle, N. J. Wald // Br. J. Obstet. Gynaecol. - 1988. - T. 95 - № 4-330-3c.

18. Chan K.C.A. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma. / K. C. A. Chan, J. Zhang, A. B. Y. Hui, N. Wong, T. K. Lau, T. N. Leung, K.W. Lo, D. W. S. Huang, Y. M. D. Lo // Clin. Chem. - 2004. - T. 50 - № 1- 88-92c.

19. Chareonsirisuthigul T. Intrauterine growth retardation fetus with trisomy 16 mosaicism. / T. Chareonsirisuthigul, S. Worawichawong, R. Parinayok, P. Promsonthi, B. Rerkamnuaychoke // Case Rep. Genet. - 2014. - T. 2014- 739513c.

20. Chen C.P. Prenatal diagnosis and molecular cytogenetic characterization of low-level mosaic trisomy 12 at amniocentesis associated with a favorable pregnancy outcome / C. P. Chen, C. J. Lin, S. R. Chern, P. S. Wu, Y. N. Chen, S. W. Chen, C. W. Pan, C. W. Yang, W. Wang // Taiwan. J. Obstet. Gynecol. - 2017. - T. 56 - № 2- 238-242c.

21. Chen C.P. Mosaic trisomy 17 at amniocentesis: Prenatal diagnosis, molecular genetic analysis, and literature review / C. P. Chen, L. K. Wang, S. R. Chern, Y. N. Chen, S. W. Chen, P. S. Wu, D. D. Town, C. W. Pan, C. W. Yang, W. Wang // Taiwan. J. Obstet. Gynecol. - 2016. - T. 55 - № 5- 712-717c.

22. Cheng H.-H. Confined placental mosaicism of double trisomies 9 and 21: discrepancy among noninvasive prenatal testing, chorionic villus sampling, and postnatal confirmation. / H.-H. Cheng, G.-C. Ma, C.-C. Tsai, W.-J. Wu, K.-C. Lan, T.Y. Hsu, C.-W. Yang, M. Chen // Ultrasound Obstet. Gynecol. - 2015.

23. Cheung M.S. Systematic bias in high-throughput sequencing data and its correction by BEADS / M. S. Cheung, T. A. Down, I. Latorre, J. Ahringer // Nucleic Acids Res. - 2011. - T. 39 - № 15.

24. Chiu R.W.K. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. / R. W. K. Chiu, K. C. A. Chan, Y. Gao, V. Y. M. Lau, W. Zheng, T. Y. Leung, C. H.

F. Foo, B. Xie, N. B. Y. Tsui, F. M. F. Lun, B. C. Y. Zee, T. K. Lau, C. R. Cantor, Y. M. D. Lo // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2008. - T. 105 - № 51- 20458-20463c.

25. Choolani M. The promise of fetal cells in maternal blood / M. Choolani, A. P. Mahyuddin, S. Hahn // Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. - 2012. - T. 26 - №№ 5- 655-667c.

26. Chu T. A novel approach toward the challenge of accurately quantifying fetal DNA in maternal plasma. / T. Chu, K. Bunce, W. A. Hogge, D. G. Peters // Prenat. Diagn. - 2010. - T. 30 - № 12-13- 1226-9c.

27. Cuckle H. Age-standardisation when target setting and auditing performance of Down syndrome screening programmes / H. Cuckle, D. Aitken, S. Goodburn, B. Senior, K. Spencer, S. Standing // Prenat. Diagn. - 2004. - T. 24 - № 11- 851-856c.

28. Curnow K.J. Detection of triploid, molar, and vanishing twin pregnancies by a single-nucleotide polymorphism-based noninvasive prenatal test / K. J. Curnow, L. Wilkins-Haug, A. Ryan, E. Kirkizlar, M. Stosic, M. P. Hall, S. Sigurjonsson, Z. Demko, M. Rabinowitz, S. J. Gross // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2015. - T. 212 - № 1- 79.e1-79.e9c.

29. Dar P. Clinical experience and follow-up with large scale single-nucleotide polymorphism-based non-invasive prenatal aneuploidy testing. / P. Dar, K. J. Curnow, S. J. Gross, M. P. Hall, M. Stosic, Z. Demko, B. Zimmermann, M. Hill, S. Sigurjonsson, A. Ryan, M. Banjevic, P. L. Kolacki, S. W. Koch, C. M. Strom, M. Rabinowitz, P. Benn // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2014. - T. 211 - № 5- 527.e1-527.e17c.

30. Dar P. Clinical experience and follow-up with large scale single-nucleotide polymorphism-based non-invasive prenatal aneuploidy testing. / P. Dar, K. J. Curnow, S. J. Gross, M. P. Hall, M. Stosic, Z. Demko, B. Zimmermann, M. Hill, S. Sigurjonsson, A. Ryan, M. Banjevic, P. L. Kolacki, S. W. Koch, C. M. Strom, M. Rabinowitz, P. Benn // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2014.

31. Dohm J.C. Substantial biases in ultra-short read data sets from high-throughput DNA sequencing / J. C. Dohm, C. Lottaz, T. Borodina, H. Himmelbauer //

Nucleic Acids Res. - 2008. - T. 36 - № 16.

32. Evans M.I. Invasive Prenatal Diagnostic Procedures 2005 / M. I. Evans, R. J. Wapner // Semin. Perinatol. - 2005. - T. 29 - № 4- 215-218c.

33. Fan H.C. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. / H. C. Fan, Y. J. Blumenfeld, U. Chitkara, L. Hudgins, S. R. Quake // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2008. - T. 105 - № 42- 16266-16271c.

34. Fan H.C. Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA by paired-end sequencing. / H. C. Fan, Y. J. Blumenfeld, U. Chitkara, L. Hudgins, S. R. Quake // Clin. Chem. - 2010. - T. 56 - № 8- 1279-86c.

35. Fan H.C. Detection of aneuploidy with digital polymerase chain reaction / H. C. Fan, S. R. Quake // Anal. Chem. - 2007. - T. 79 - № 19- 7576-7579c.

36. Fan H.C. Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy from maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics / H. C. Fan, S. R. Quake // PLoS One - 2010. - T. 5 - № 5.

37. Foo C.H.F. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. / C. H. F. Foo, B. Xie, N. B. Y. Tsui, F. M. F. Lun, B. C. Y. Zee, T. K. Lau, C. R. Cantor, Y. M. D. Lo, R. W. K. Chiu, K. C. A. Chan, Y. Gao, V. Y. M. Lau, W. Zheng, T. Y. Leung // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2008. - T. 105 - № 51- 20458-63c.

38. Grati F. Chromosomal Mosaicism in Human Feto-Placental Development: Implications for Prenatal Diagnosis / F. Grati // J. Clin. Med. - 2014. - T. 3 - № 3-809-837c.

39. Hamada H. Fetal nucleated cells in maternal peripheral blood: frequency and relationship to gestational age. / H. Hamada, T. Arinami, T. Kubo, H. Hamaguchi, H. Iwasaki // Hum. Genet. - 1993. - T. 91 - № 5- 427-32c.

40. Hartwig T.S. Discordant Non-Invasive Prenatal Testing (NIPT) - a systematic review / T. S. Hartwig, L. Ambye, S. Sorensen, F. S. Jorgensen // Prenat. Diagn. - 2017.

41. Hassold T. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. 105

/ T. Hassold, P. Hunt // Nat. Rev. Genet. - 2001. - T. 2 - № 4- 280-91 c.

42. Hixson L. An Overview on Prenatal Screening for Chromosomal Aberrations. / L. Hixson, S. Goel, P. Schuber, V. Faltas, J. Lee, A. Narayakkadan, H. Leung, J. Osborne // J. Lab. Autom. - 2015. - 2211068214564595-c.

43. Hochstenbach R. Unexplained False Negative Results in Noninvasive Prenatal Testing: Two Cases Involving Trisomies 13 and 18 / R. Hochstenbach, G. C. M. L. Page-Christiaens, a. C. C. van Oppen, K. D. Lichtenbelt, J. J. T. van Harssel, T. Brouwer, G. T. R. Manten, P. van Zon, M. Elferink, K. Kusters, O. Akkermans, J. K. Ploos van Amstel, G. H. Schuring-Blom // Case Rep. Genet. - 2015. - T. 2015- 1-7c.

44. Horn R. Opening Pandora's box?: ethical issues in prenatal whole genome and exome sequencing / R. Horn, M. Parker // Prenat. Diagn. - 2017. - 1-6c.

45. Hudecova I. Digital PCR analysis of circulating nucleic acids / I. Hudecova // Clin. Biochem. - 2015.

46. Hunt P. Female meiosis: Coming unglued with age / P. Hunt, T. Hassold // Curr. Biol. - 2010. - T. 20 - № 17- R699-R702c.

47. JACOBS P.A. The somatic chromosomes in mongolism. / P. A. JACOBS, A. G. BAIKIE, W. M. COURT BROWN, J. A. STRONG // Lancet (London, England)

- 1959. - T. 1 - № 7075- 710c.

48. Jiang F. Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies / F. Jiang, J. Ren, F. Chen, Y. Zhou, J. Xie, S. Dan, Y. Su, J. Xie, B. Yin, W. Su, H. Zhang, W. Wang, X. Chai, L. Lin, H. Guo, Q. Li, P. Li, Y. Yuan, X. Pan, Y. Li, L. Liu, H. Chen, Z. Xuan, S. Chen, C. Zhang, H. Zhang, Z. Tian, Z. Zhang, H. Jiang, L. Zhao, W. Zheng, S. Li, Y. Li, J. Wang, J. Wang, X. Zhang // BMC Med. Genomics - 2012.

- T. 5 - № 1- 57c.

49. Juneau K. Microarray-Based Cell-Free DNA Analysis Improves Noninvasive Prenatal Testing. / K. Juneau, P. E. Bogard, S. Huang, M. Mohseni, E. T. Wang, P. Ryvkin, C. Kingsley, C. a Struble, A. Oliphant, J. M. Zahn // Fetal Diagn. Ther. - 2014. - 1-5c.

50. Kim S. An adaptive detection method for fetal chromosomal aneuploidy using cell-free DNA from 447 Korean women / S. Kim, H. Jung, S. H. Han, W. Grody // BMC Med. Genomics - 2016. - T. 9 - № 1- 61c.

51. Li H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. / H. Li, B. Handsaker, A. Wysoker, T. Fennell, J. Ruan, N. Homer, G. Marth, G. Abecasis, R. Durbin // Bioinformatics - 2009. - T. 25 - № 16- 2078-9c.

52. Liang D. Non-invasive prenatal testing of fetal whole chromosome aneuploidy by massively parallel sequencing. / D. Liang, W. Lv, H. Wang, L. Xu, J. Liu, H. Li, L. Hu, Y. Peng, L. Wu // Prenat. Diagn. - 2013. - T. 33 - № 5- 409-15c.

53. Liao C. Noninvasive prenatal diagnosis of common aneuploidies by semiconductor sequencing. / C. Liao, A. Yin, C. Peng, F. Fu, J. Yang, R. Li, Y. Chen, D. Luo, Y. Zhang, Y. Ou, J. Li, J. Wu, M. Mai, R. Hou, F. Wu, H. Luo, D. Li, H. Liu, X. Zhang, K. Zhang // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2014. - T. 111 - № 20- 7415-20c.

54. Lo K.K. RAPIDR: an analysis package for non-invasive prenatal testing of aneuploidy / K. K. Lo, C. Boustred, L. S. Chitty, V. Plagnol - 2014. - T. 30 - № 20-2965-2967c.

55. Lo Y.M. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. / Y. M. Lo, J. Zhang, T. N. Leung, T. K. Lau, a M. Chang, N. M. Hjelm // Am. J. Hum. Genet. -1999. - T. 64 - № 1- 218-24c.

56. Lo Y.M.D. Early report Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum / Y. M. D. Lo, N. Corbetta, P. F. Chamberlain, V. Rai, I. L. Sargent, C. W. G. Redman - 1997. - T. 350- 485-487c.

57. Lo Y.M.D. Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy. / Y. M. D. Lo, F. M. F. Lun, K. C. A. Chan, N. B. Y. Tsui, K. C. Chong, T. K. Lau, T. Y. Leung, B. C. Y. Zee, C. R. Cantor, R. W. K. Chiu // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2007. - T. 104 - № 32- 13116-13121c.

58. Ma J. Birth of a child with trisomy 9 mosaicism syndrome associated with paternal isodisomy 9: case of a positive noninvasive prenatal test result unconfirmed

by invasive prenatal diagnosis / J. Ma, D. S. Cram, J. Zhang, L. Shang, H. Yang, H. Pan // Mol. Cytogenet. - 2015. - T. 8 - № 1- 44c.

59. McNamara C.J. Maternal source of false-positive fetal sex chromosome aneuploidy in noninvasive prenatal testing. / C. J. McNamara, L. A. Limone, T. Westover, R. C. Miller // Obstet. Gynecol. - 2015. - T. 125 - № 2- 390-2c.

60. Minarik G. Utilization of Benchtop Next Generation Sequencing Platforms Ion Torrent PGM and MiSeq in Noninvasive Prenatal Testing for Chromosome 21 Trisomy and Testing of Impact of In Silico and Physical Size Selection on Its Analytical Performance / G. Minarik, G. Repiska, M. Hyblova, E. Nagyova, K. Soltys, J. Budis, F. Duris, R. Sysak, M. Gerykova Bujalkova, B. Vlkova-Izrael, O. Biro, B. Nagy, T. Szemes // PLoS One - 2015. - T. 10 - № 12- e0144811c.

61. Molecular P. Isolation and molecular characterization of individual circulating fetal cells for non-invasive prenatal diagnosis / P. Molecular, D. Europe -2014.

62. Nagaoka S.I. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. / S. I. Nagaoka, T. J. Hassold, P. A. Hunt // Nat. Rev. Genet. - 2012. - T. 13 - № 7- 493-504c.

63. Nicolaides K.H. Assessment of Fetal Sex Chromosome Aneuploidy Using Directed Cell-Free DNA Analysis / K. H. Nicolaides, T. J. Musci, C. A. Struble, A. Syngelaki, M. M. Gil // Fetal Diagn. Ther. - 2014. - T. 35 - № 1- 1-6c.

64. Norton M.E. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. / M. E. Norton, H. Brar, J. Weiss, A. Karimi, L. C. Laurent, A. B. Caughey, M. H. Rodriguez, J. Williams, M. E. Mitchell, C. D. Adair, H. Lee, B. Jacobsson, M. W. Tomlinson, D. Oepkes, D. Hollemon, A. B. Sparks, A. Oliphant, K. Song // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2012. - T. 207 - № 2- 137.e1-8c.

65. Nygren A.O.H. Quantification of fetal DNA by use of methylation-based DNA discrimination. / A. O. H. Nygren, J. Dean, T. J. Jensen, S. Kruse, W. Kwong, D. van den Boom, M. Ehrich // Clin. Chem. - 2010. - T. 56 - № 10- 1627-35c.

66. Osborne C.M. Discordant noninvasive prenatal testing results in a patient subsequently diagnosed with metastatic disease / C. M. Osborne, E. Hardisty, P. Devers, K. Kaiser-Rogers, M. a. Hayden, W. Goodnight, N. L. Vora // Prenat. Diagn. - 2013. - Т. 33 - № 6- 609-611 с.

67. Palomaki G.E. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study. / G. E. Palomaki, C. Deciu, E. M. Kloza, G. M. Lambert-Messerlian, J. E. Haddow, L. M. Neveux, M. Ehrich, D. van den Boom, A. T. Bombard, W. W. Grody, S. F. Nelson, J. a Canick // Genet. Med. - 2012. - Т. 14 - № 3- 296-305с.

68. Palomaki G.E. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. / G. E. Palomaki, E. M. Kloza, G. M. Lambert-Messerlian, J. E. Haddow, L. M. Neveux, M. Ehrich, D. van den Boom, A. T. Bombard, C. Deciu, W. W. Grody, S. F. Nelson, J. a Canick // Genet. Med. -2011. - Т. 13 - № 11- 913-20с.

69. Pettit K.E. The utilization of circulating cell-free fetal DNA testing and decrease in invasive diagnostic procedures: an institutional experience. / K. E. Pettit, A. D. Hull, L. Korty, M. C. Jones, D. H. Pretorius // J. Perinatol. - 2014. - Т. 34 - № 10- 750-3с.

70. Porreco R.P. Noninvasive prenatal screening for fetal trisomies 21, 18, 13 and the common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using massively parallel genomic sequencing of DNA / R. P. Porreco, T. J. Garite, K. Maurel, B. Marusiak, M. Ehrich, D. van den Boom, C. Deciu, A. Bombard // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2014. - Т. 211 - № 4- 365.e1-365.e12c.

71. Reiss R.E. Sex Chromosome Aneuploidy Detection by Non-Invasive Prenatal Testing: Helpful or Hazardous? / R. E. Reiss, M. Discenza, J. Foster, L. Dobson, L. Wilkins-Haug // Prenat. Diagn. - 2017.

72. Reittinger A.M. A prenatal diagnosis of mosaic trisomy 5 reveals a postnatal complete uniparental disomy of chromosome 5 with multiple congenital anomalies / A. M. Reittinger, B. M. Helm, D. J. Boles, I. K. Gadi, S. A. Schrier Vergano // Am. J.

Med. Genet. Part A - 2017. - T. 173 - № 9- 2528-2533c.

73. Rink B.D. Screening for fetal aneuploidy / B. D. Rink, M. E. Norton // Semin. Perinatol. - 2016. - T. 40 - № 1- 35-43c.

74. Russell L.M. X chromosome loss and ageing / L. M. Russell, P. Strike, C. E. Browne, P. A. Jacobs // Cytogenet. Genome Res. - 2007. - T. 116 - № 3- 181-185c.

75. Samango-Sprouse C. SNP-based non-invasive prenatal testing detects sex chromosome aneuploidies with high accuracy. / C. Samango-Sprouse, M. Banjevic, A. Ryan, S. Sigurjonsson, B. Zimmermann, M. Hill, M. P. Hall, M. Westemeyer, J. Saucier, Z. Demko, M. Rabinowitz // Prenat. Diagn. - 2013. - T. 33 - № 7- 643-9c.

76. Samango-Sprouse C. Incidence of X and Y chromosomal aneuploidy in a large child bearing population / C. Samango-Sprouse, E. Kirkizlar, M. P. Hall, P. Lawson, Z. Demko, S. M. Zneimer, K. J. Curnow, S. Gross, A. Gropman // PLoS One - 2016. - T. 11 - № 8- 1-11c.

77. Schlütter J.M. The cell-free fetal DNA fraction in maternal blood decreases after physical activity. / J. M. Schlütter, L. Hatt, C. Bach, I. Kirkegaard, S. Kolvraa, N. Uldbjerg // Prenat. Diagn. - 2014. - T. 34 - № 4- 341-4c.

78. Sehnert A.J. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. / A. J. Sehnert, B. Rhees, D. Comstock, E. de Feo, G. Heilek, J. Burke, R. P. Rava // Clin. Chem. - 2011. - T. 57 - № 7- 1042-9c.

79. Shendure J. Next-generation DNA sequencing. / J. Shendure, H. Ji // Nat. Biotechnol. - 2008. - T. 26 - № 10- 1135-45c.

80. Snyder M.W. Copy-Number Variation and False Positive Prenatal Aneuploidy Screening Results / M. W. Snyder, L. E. Simmons, J. O. Kitzman, B. P. Coe, J. M. Henson, R. M. Daza, E. E. Eichler, J. Shendure, H. S. Gammill // N. Engl. J. Med. - 2015. - T. 372 - № 17- 1639-1645c.

81. Sparks A.B. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cellfree DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18. / A. B. Sparks, C. a Struble, E. T. Wang, K. Song, A. Oliphant // Am. J. Obstet. Gynecol.

- 2012. - T. 206 - № 4- 319.e1-9c.

82. Sparks A.B. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. / A. B. Sparks, E. T. Wang, C. a Struble, W. Barrett, R. Stokowski, C. McBride, J. Zahn, K. Lee, N. Shen, J. Doshi, M. Sun, J. Garrison, J. Sandler, D. Hollemon, P. Pattee, A. Tomita-mitchell, M. Mitchell, J. Stuelpnagel, K. Song, A. Oliphant // Prenat. Diagn. - 2012. - T. 32 - № 1- 3-9c.

83. Sparks T.N. Mosaic trisomy 16: what are the obstetric and long-term childhood outcomes? / T. N. Sparks, K. Thao, M. E. Norton // Genet. Med. - 2017. -T. 19 - № 10- 1164-1170c.

84. Spencer K. Screening for Down syndrome. / K. Spencer // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 2014. - T. 74(suppl 2 - № October - 41-7c.

85. Spencer K. A screening program for trisomy 21 at 10-14 weeks using fetal nuchal translucency, maternal serum free ??-human chorionic gonadotropin and pregnancy-associated plasma protein-A / K. Spencer, V. Souter, N. Tul, R. Snijders, K. H. Nicolaides // Ultrasound Obstet. Gynecol. - 1999. - T. 13 - № 4- 231-237c.

86. Stokowski R. Clinical performance of non-invasive prenatal testing (NIPT) using targeted cell-free DNA analysis in maternal plasma with microarrays or next generation sequencing (NGS) is consistent across multiple controlled clinical studies / R. Stokowski, E. Wang, K. White, A. Batey, B. Jacobsson, H. Brar, M. Balanarasimha, D. Hollemon, A. Sparks, K. Nicolaides, T. J. Musci // Prenat. Diagn. - 2015. - T. 35 -№ 12- 1243-1246c.

87. Straver R. WISECONDOR: detection of fetal aberrations from shallow sequencing maternal plasma based on a within-sample comparison scheme. / R. Straver, E. a Sistermans, H. Holstege, A. Visser, C. B. M. Oudejans, M. J. T. Reinders // Nucleic Acids Res. - 2014. - T. 42 - № 5- e31c.

88. Sun K. The impact of digital DNA counting technologies on noninvasive prenatal testing / K. Sun, P. Jiang, K. A. Chan // Expert Rev. Mol. Diagn. - 2015. - T. 15 - № 10- 1261-1268c.

89. Teo S.M. Statistical challenges associated with detecting copy number

variations with next-generation sequencing. / S. M. Teo, Y. Pawitan, C. S. Ku, K. S. Chia, A. Salim // Bioinformatics - 2012. - T. 28 - № 21- 2711-8c.

90. Tong Y.K. Epigenetic-genetic chromosome dosage approach for fetal trisomy 21 detection using an autosomal genetic reference marker. / Y. K. Tong, R. W. K. Chiu, R. Akolekar, T. Y. Leung, T. K. Lau, K. H. Nicolaides, Y. M. D. Lo // PLoS One - 2010. - T. 5 - № 12- e15244c.

91. Tong Y.K. Noninvasive prenatal detection of trisomy 21 by an epigenetic-genetic chromosome-dosage approach / Y. K. Tong, S. Jin, R. W. K. Chiu, C. Ding, K.

C. A. Chan, T. Y. Leung, L. Yu, T. K. Lau, Y. M. D. Lo // Clin. Chem. - 2010. - T. 56 - № 1- 90-98c.

92. Torres E.M. Aneuploidy: Cells Losing Their Balance / E. M. Torres, B. R. Williams, A. Amon // Genetics - 2008. - T. 746- № June- 737-746c.

93. Tsui N.B.Y. Synergy of total PLAC4 RNA concentration and measurement of the RNA single-nucleotide polymorphism allelic ratio for the noninvasive prenatal detection of trisomy 21. / N. B. Y. Tsui, R. Akolekar, R. W. K. Chiu, K. C. K. Chow, T. Y. Leung, T. K. Lau, K. H. Nicolaides, Y. M. D. Lo // Clin. Chem. - 2010. - T. 56 - № 1- 73-81 c.

94. Tsui N.B.Y. High Resolution Size Analysis of Fetal DNA in the Urine of Pregnant Women by Paired-End Massively Parallel Sequencing / N. B. Y. Tsui, P. Jiang, K. C. K. Chow, X. Su, T. Y. Leung, H. Sun, K. C. A. Chan, R. W. K. Chiu, Y. M. D. Lo // PLoS One - 2012. - T. 7 - № 10- e48319c.

95. Utermann B. Pre- and Postnatal Findings in Trisomy 17 Mosaicism / B. Utermann, M. Riegel, D. Leistritz, T. Karall, J. Wisser, L. Meisner, C. Fauth, R. Baldinger, J. Johnson, M. Erdel, M. Taralczak, R. M. Pauli, A. Baumer, A. Schinzel,

D. Kotzot - 2006. - T. 1636- 1628-1636c.

96. Vogelstein B. Digital PCR / B. Vogelstein, K. W. Kinzler // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1999. - T. 96 - № 16- 9236-9241c.

97. Vora N.L. A multifactorial relationship exists between total circulating cellfree DNA levels and maternal BMI. / N. L. Vora, K. L. Johnson, S. Basu, P. M.

Catalano, S. Hauguel-De Mouzon, D. W. Bianchi // Prenat. Diagn. - 2012. - T. 32 -№ 9- 912-4c.

98. Wang E. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell-free DNA in maternal plasma. / E. Wang, A. Batey, C. Struble, T. Musci, K. Song, A. Oliphant // Prenat. Diagn. - 2013. - T. 33 - № 7- 662-6c.

99. Wang S. Maternal X chromosome copy number variations are associated with discordant fetal sex chromosome aneuploidies detected by noninvasive prenatal testing / S. Wang, S. Huang, L. Ma, L. Liang, J. Zhang, J. Zhang, D. S. Cram // Clin. Chim. Acta - 2015. - T. 444- 113-116c.

100. Wang Y. Maternal mosaicism is a significant contributor to discordant sex chromosomal aneuploidies associated with noninvasive prenatal testing / Y. Wang, Y. Chen, F. Tian, J. Zhang, Z. Song, Y. Wu, X. Han, W. Hu, D. Ma, D. Cram, W. Cheng // Clin. Chem. - 2014. - T. 60 - № 1- 251-259c.

101. Wolstenholme J. Confined placental mosaicism for trisomies 2, 3, 7, 8, 9, 16, and 22: Their incidence, likely origins, and mechanisms for cell lineage compartmentalization / J. Wolstenholme // Prenat. Diagn. - 1996. - T. 16 - № 6- 511-524c.

102. Yang J. A case of placental trisomy 18 mosaicism causing a false negative NIPT result / J. Yang, Y. Qi, F. Guo, Y. Hou, H. Peng, D. Wang, H. OY, A. Yin // Mol. Cytogenet. - 2017. - T. 10 - № 1- 40c.

103. Yin A.-H. Noninvasive detection of fetal subchromosomal abnormalities by semiconductor sequencing of maternal plasma DNA. / A.-H. Yin, C.-F. Peng, X. Zhao, B. A. Caughey, J.-X. Yang, J. Liu, W.-W. Huang, C. Liu, D.-H. Luo, H.-L. Liu, Y.-Y. Chen, J. Wu, R. Hou, M. Zhang, M. Ai, L. Zheng, R. Q. Xue, M.-Q. Mai, F.-F. Guo, Y.-M. Qi, D.-M. Wang, M. Krawczyk, D. Zhang, Y.-N. Wang, Q.-F. Huang, M. Karin, K. Zhang // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2015. - 2-7c.

104. Yu S.C.Y. Size-based molecular diagnostics using plasma DNA for noninvasive prenatal testing. / S. C. Y. Yu, K. C. A. Chan, Y. W. L. Zheng, P. Jiang, G. J. W. Liao, H. Sun, R. Akolekar, T. Y. Leung, A. T. J. I. Go, J. M. G. van Vugt, R.

Minekawa, C. B. M. Oudejans, K. H. Nicolaides, R. W. K. Chiu, Y. M. D. Lo // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2014. - T. 111 - № 23- 8583-8c.

105. Yuan Y. Feasibility study of semiconductor sequencing for noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy. / Y. Yuan, F. Jiang, S. Hua, B. Du, Y. Hao, L. Ye, J. Liu, K. Feng, X. Huang, X. Yi, W. Wang, L. Yang, F. Mu, C. Liu, Y. Liang // Clin. Chem. - 2013. - T. 59 - № 5- 846-9c.

106. Zhang B. Noninvasive prenatal screening for fetal common sex chromosome aneuploidies from maternal blood / B. Zhang, B.-Y. Lu, B. Yu, F.-X. Zheng, Q. Zhou, Y.-P. Chen, X.-Q. Zhang // J. Int. Med. Res. - 2017. - T. 45 - № 2-621-630c.

107. Zimmermann B. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. / B. Zimmermann, M. Hill, G. Gemelos, Z. Demko, M. Banjevic, J. Baner, A. Ryan, S. Sigurjonsson, N. Chopra, M. Dodd, B. Levy, M. Rabinowitz // Prenat. Diagn. - 2012. - T. 32 - № 13-1233-41c.