Разработка тест-системы на основе метода количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции и диагностического алгоритма для пренатальной диагностики наиболее распространенных анеуплоидий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.10, кандидат наук Тарасенко Ольга Александровна

• Тарасенко Ольга Александровна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Тарасенко Ольга Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Генетические факторы пороков развития новорожденных

1.2 Наиболее распространенные хромосомные аномалии новорожденных

1.3 Пренатальная диагностика

1.3.1 Непрямые методы пренатальной диагностики

1.3.2 Прямые методы пренатальной диагностики

1.4 Методы исследования плодного материала

1.4.1 Цитогенетические методы

1.4.2 Молекулярно-цитогенетические методы

1.4.3 Молекулярно-генетические методы

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Обследуемые группы

2.2 Материалы исследования

2.3 Методы исследования

2.3.1 Выделение ДНК

2.3.2 Проведение мультиплексной ПЦР

2.3.3 Капиллярный электрофорез

2.4 Статистическая обработка данных

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Клинические характеристики исследуемых групп

3.2 Создание тест-системы для проведения пренатального исследования наиболее распространенных анеуплоидий методом КФ-ПЦР

3.2.1 Выбор БТЯ-маркеров

3.2.2 Выбор нуклеотидных последовательностей, длин ПЦР-продуктов и последовательностей праймеров

3.2.3 Локализация и гетерозиготность БТЯ-маркеров

3.2.4 Дополнительные маркеры анализируемых хромосом

3.2.5 Особенности диагностики анеуплоидии хромосомы Х

3.3 Сравнительный анализ результатов исследований плодного материала методом количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции в исследуемых группах

3.3.1 Анализ результатов исследований плодного материала беременных женщин,

направленных на амниоцентез (группе «А»)

3.3.2 Анализ результатов пренатального исследования методом КФ-ПЦР в группе «К» (беременных, направленных на диагностический кордоцентез)

3.3.3 Сравнительный анализ частоты выявленной хромосомной патологии в исследуемых группах

3.3.4 Субмикроскопические дупликации

3.4 Алгоритм проведения пренатального исследования из клеток амниотической

жидкости методом КФ-ПЦР

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-системы на основе метода количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции и диагностического алгоритма для пренатальной диагностики наиболее распространенных анеуплоидий»

Актуальность темы исследования

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), «частота пороков развития среди всех новорожденных составляет 2,5-3%, среди которых, 1% приходится на долю генных болезней, 0,5% - на долю хромосомных болезней и 1,5-2% составляют врожденные пороки развития (ВПР), обусловленные сочетанием неблагоприятных экзогенных и эндогенных факторов. В РФ ежегодно на каждую тысячу рождается от 40 до 50 детей с врожденными и наследственными заболеваниями» [6].

В связи с этим приобретает особое значение профилактика врожденных и наследственных заболеваний плода. В настоящее время принято, что «золотым стандартом» пренатальной диагностики хромосомных болезней является кариотипирование плода, которое позволяет обнаружить числовые и структурные нарушения во всех 23 парах хромосом. Данный метод практически невозможно использовать в качестве скринингового в силу высоких требований к качеству исследуемого материала, полученных метафазных препаратов и квалификации специалистов [28]. Применение молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических технологий существенно расширило возможности быстрой детекции анеуплоидий и идентификации тонких структурных аномалий у плода. Данные подходы включают следующие технологии: флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), сравнительная геномная гибридизация на ДНК-микрочипах (array CGH), количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция - КФ-ПЦР (Quantitative Fluorescence PCR - QF-PCR), количественная лигазная реакция (Multiplex Ligation Probe Amplification - MLPA), количественная ПЦР в реальном времени (real time qPCR) [28]. В течение последних десятилетий количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция активно внедряется в практику центров по пренатальной диагностике как быстрый метод определения основных хромосомных анеуплоидий - 13, 18, 21, а также числовых нарушений половых хромосом. Трисомии 21, 18, 13, моносомия Х и другие анеуплоидии гоносом составляют до 95% всех

хромосомных аномалий, поэтому КФ-ПЦР используют для проведения пренатальной детекции наиболее часто встречающихся хромосомных патологий плода. Принцип метода основан на анализе высокополиморфных коротких тандемных повторов (STR-маркеров), определенных для каждой хромосомы, и позволяет проводить молекулярный анализ анеуплоидий на некультивируемых эмбриональных клетках.

Преимущества данного метода были подтверждены многими исследованиями, в которых он определен как быстрый, высокочувствительный и специфичный способ детекции основных хромосомных аномалий. Однако в отечественной литературе работы, посвященные применению указанного метода и оценке качества выявления хромосомной патологии плода, единичны.

Изложенные выше данные позволили сформулировать цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования

Разработать тест-систему на основе метода количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции и диагностический алгоритм для пренатального выявления анеуплоидии 21, 18, 13, Х и У хромосом.

Задачи исследования

1. Разработать систему праймеров (STR-маркеров) для проведения пренатального выявления количественных нарушений хромосом 21, 13, 18, Х и Y на основе метода КФ-ПЦР;

2. Определить гетерозиготность (информативность) выбранных STR-маркеров в исследуемых образцах ДНК плодов;

3. Оценить частоту хромосомной патологии плода в группах женщин с различными показаниями для проведения пренатальных исследований;

4. Сравнить точность выявления наиболее распространенных анеуплоидий плода методом КФ-ПЦР с кариотипированием;

5. На основе метода КФ-ПЦР разработать алгоритм проведения пренатальной детекции анеуплоидии плода.

Научная новизна исследования

Разработана, апробирована и внедрена в практику тест-система на основе метода КФ-ПЦР для пренатальной детекции анеуплоидии хромосом 21, 13, 18, Х и У, составляющих до 95% всех хромосомных болезней;

Предложена оптимальная комбинация БТЯ-маркеров, позволяющая наиболее эффективно провести пренатальное исследование у жительниц СевероЗападного региона РФ;

Определена гетерозиготность используемой системы STR-маркеров, характерная для выборки состоящей из пренатальных образцов женщин СевероЗападного региона России;

Впервые определены частоты субмикроскопических дупликаций для STR-маркеров и показано достоверное повышение их частоты в выборке СевероЗападного региона России по сравнению с выборками западной Европы;

В случае идентификации у плода субмикроскопической дупликации впервые предложена тактика проведения пренатального исследования;

Впервые предложен алгоритм проведения пренатального определения анеуплоидии 21, 18, 13, Х и У хромосом с использованием метода КФ-ПЦР.

Теоретическая и практическая значимость работы

Определена гетерозиготность (информативность) STR-маркеров, входящих в тест-систему для выявления наиболее частых анеуплоидий, характерная для выборки Северо-Западного региона России.

Создана оптимальная комбинация STR-маркеров, позволяющая наиболее эффективно провести пренатальное исследование у жительниц СевероЗападного региона РФ.

В процессе исследований методом КФ-ПЦР выявлены субмикроскопические дупликации STR-маркеров D21S1437, D13S634, D13S742, D18S391, D18S535, P39, X22. и определена их частота в плодном материале жительниц СевероЗападного региона России.

Тест-система на основе метода КФ-ПЦР для пренатальной детекции анеуплоидии хромосом 21, 13, 18, Х и Y, внедрена в практику ФГБУ

«Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова», ФГБНУ НИИАГиР им. Д. О. Отта.

Широко используется разработанный алгоритм пренатального выявления наиболее распространенных анеуплоидий методом КФ-ПЦР.

Методология и методы исследования

Научная работа проводилась с соблюдением всех правил научных исследований и основывалась на принципах биоэтики. Теоретическая и методологическая основа работы состояла в поиске и анализе фундаментальных и прикладных исследований по подбору информативных STR-маркеров. Для реализации цели и задач научной работы и обоснования основных положений, выносимых на защиту, были использованы анализ литературы, лабораторные методы исследования, статистическая обработка данных и обобщение полученных результатов.

Выполнен сбор и систематизация материалов исследования, проведен статистический анализ данных, позволяющий сделать обоснованные выводы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная тест-система STR-маркеров высокоинформативна и пригодна для выявления количественных нарушений 21, 18, 13, Х и Y хромосом плода с использованием метода КФ-ПЦР;

2. Метод КФ-ПЦР не уступает кариотипированию по точности определения анеуплоидии 21, 18, 13, Х и Y хромосом.

3. В плодном материале беременных Северо-Западного региона России методом КФ-ПЦР выявлены субмикроскопические дупликации STR-маркеров, частота которых достоверно превышает таковую в аналогичной выборке Западной Европы.

Степень достоверности результатов

Степень достоверности диссертационного исследования основана на полном соответствии с запланированным дизайном, достаточном количеством образцов (1600 образцов ДНК, выделенной из клеток амниотической жидкости, плодов беременных женщин), использовании современных лабораторных методик.

Применяемые методы статистического анализа полностью соответствуют поставленным задачам. Полученные результаты исследования отвечают современным взглядам на изучаемую проблему и согласуются с отечественными и зарубежными публикациями по данной тематике.

Личный вклад соискателя

Автором проанализированы современные данные литературы по теме диссертации, сформулированы цели и задачи работы, выбраны подходы, отвечающие реализации поставленных задач;

-проведен выбор и определена информативность БТЯ-маркеров, на основе которых создана тест-система для определения наиболее распространенных анеуплоидий;

-выполнена обработка клинических данных, на основе которых сформированы группы женщин, которым проводили исследование плодного материала методом КФ-ПЦР;

-проведено 1600 исследований плодного материала и выявлено 68 анеуплоидий плодов;

-выявлены субмикроскопические дупликации и определена их частота;

-осуществлена статистическая обработка полученных данных и их описание.

Автором самостоятельно написан текст диссертации и автореферата. Обработка клинических данных, проведение анализов, получение, интерпретация и обобщение результатов исследований, представленных в диссертации, выполнены автором лично.

Апробация работы и внедрение результатов в практику.

Полученные результаты исследования для выявления наиболее распространенной патологии плода внедрены в клиническую практику

- лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней ФГБНУ «НИИАГиР им. Д.О.Отта»

- ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургского государственного педиатрического медицинского университета» МЗ РФ

- Северо-Западного пренатального генетического центра ООО «ЦМП МЕДИКА» г. Санкт-Петербург.

- Диагностического центра здоровья матери и плода. г. Санкт-Петербург.

Результаты работы были представлены в качестве докладов на

- VIII Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 18-20 марта, 2014);

- VII Съезде российского общества медицинских генетиков (19-23 мая 2015, Санкт-Петербург);

- III Национальном конгрессе «Дискуссионные вопросы современного акушерства» (28-30 мая 2015, Санкт-Петербург).

Диссертация апробирована на научных межлабораторных семинарах лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О.Отта» и НТС ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова».

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 11 научных работ (4 научные статьи и 7 тезисов, опубликованные, в том числе в зарубежных сборниках). Из которых 3 научные статьи в изданиях, определенных ВАК для опубликования основных научных результатов диссертации.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 1 29 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Библиографический указатель включает 125 источников, из них 94 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 26 таблицами, 34 рисунками и 3 приложениями.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Генетические факторы пороков развития новорожденных

Известно, что с различными пороками развития на свет появляются до 2,5% новорожденных. При этом до 1% - вследствие различных генетических причин, а остальные 1,5-2%% - в результате неблагоприятных внешних (экзогенных) факторов - тератогенов. К экзогенным причинам врожденных пороков развития относятся биологические, такие как всевозможные инфекционные и вирусные заболевания; физические - радионуклиды и ионизирующее излучение; химические - различные наркотические вещества, а также гормональные и противоопухолевые препараты. [3,21]

По литературным данным, общий «генетический груз популяции», выраженный в различных генетических пороках развития, проявляется более чем у 5% населения Земли. До 3-3,5% составляют болезни с «выраженным наследственным компонентом», такие как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет и др. 0,5% «генетического груза приходится на различные хромосомные перестройки и анеуплоидии и, примерно 1% составляют генные мутации.

Снизить риск рождения ребенка с наследственным заболеванием, а, следовательно, снизить «общий груз патологической наследственности» в настоящее время позволяют пренатальные исследования [7, 8, 17, 6].

Лидирующую позицию в структуре всей наследственной патологии человека занимают хромосомные болезни, частота которых по данным цитогенетических исследований достигает до 0,6-1,0% среди новорожденных детей, а в материале спонтанных абортусов частота хромосомной патологии достигает 70%, поскольку большая часть хромосомных аномалий несовместима не только с живорождением, но и ранним эмбриогенезом. Такие эмбрионы гибнут вскоре после имплантации (ранние выкидыши). Однако, существуют варианты числовых аномалий хромосом, совместимые с постнатальным развитием - «живорождением», которые и приводят к хромосомным заболеваниям [11].

Геномные повреждения на ранних стадиях дробления зиготы, в процессе оплодотворения или при созревании гамет являются основной причиной возникновения хромосомных аномалий. Выделяют три группы хромосомных патологий:

1) связанные с нарушением плоидности;

2) с нарушением числа хромосом (анеуплоидии);

3) с изменением структуры хромосом [5, 16].

Хромосомные аномалии, связанные с нарушением плоидности, представлены триплоидией и тетраплоидией. Как правило, они встречаются у неразвивающихся эмбрионов. Однако, были зафиксированы редкие случаи рождения детей-триплоидов с тяжелыми, несовместимыми с нормальной жизнедеятельностью, множественными врожденными пороками развития [2].

Хромосомные патологии, связанные с нарушением числа хромосом, представлены либо трисомией (в случаях, когда в кариотипе представлены три гомологичные хромосомы), либо моносомией (в кариотипе представлена только одна из двух гомологичных хромосом). Моносомия у живорожденных встречается только в случае синдрома Шерешевского-Тернера (моносомия по хромосоме X). Моносомии по другим хромосомам (аутосомам и хромосоме У) редко встречается даже в материале спонтанных абортусов. Они погибают на самых ранних этапах внутриутробного развития [10].

Трисомии у живорожденных встречаются по хромосомам 8, 9, 13, 14, 18, 21 22 и Х. Трисомии по хромосомам 1, 5, 6, 11 и 19 даже в материале неразвивающихся эмбрионов встречаются крайне редко, что является свидетельством высокой морфогенетической значимости этих хромосом [6].

С нарушением структуры хромосом связаны синдромы частичных моно-или трисомий. Они, как правило, являются следствием хромосомных перестроек в половых клетках родителей. Такие перестройки приводят к потере или избытку фрагментов хромосом у плода и, соответственно, несбалансированности кариотипа. Наиболее часто встречающихся частичные анеуплоидии формируют определенные, четко диагностируемые клинические

синдромы. Фенотипически их проявления более вариабельны, чем в случае целых моно- и трисомий. Это связано с тем, что в каждом отдельном случае размеры фрагментов хромосом, вовлеченных в перестройку, и, следовательно, их генный состав, различны. [1, 19, 20, 22, 24, 27, 12, 88, 107].

1.2 Наиболее распространенные хромосомные аномалии новорожденных

К наиболее распространенным хромосомным аномалиям новорожденных относятся трисомии 21, 18, 13 хромосом и анеуплоидии половых хромосом и составляют, по литературным данным, до 95% хромосомных аномалий, совместимых с живорождением [13].

Наиболее часто встречающимся хромосомным синдромом является трисомия хромосомы 21 - Синдром Дауна (СД). Впервые его описал английский врач Л.Даун в 1866 году. СД в популяции встречается с частотой 1 на 600-700 новорожденных. Вероятность рождения ребенка с синдромом Дауна увеличивается с возрастом матери, по этой причине беременным женщинам старше 35 лет рекомендовано проводить инвазивную пренатальную диагностику. До 95% случаев синдрома Дауна представляют собой «целую трисомию 21», в 2% случаев это мозаичные формы синдрома, а в 3% -робертсоновские транслокации, которые в половине случаев наследуются, а в половине случаев возникают de novo. Участок хромосомы 21 - q22 называют «горячим регионом», отвечающим за формирование фенотипических признаков синдрома Дауна, таким как плоское лицо, широко расставленные глаза, эпикант, короткий нос, монголоидный разрез глаз. Для данного синдрома характерна умственная отсталость средней степени тяжести, а также пороки сердца и ЖКТ [10, 6, 16] (Табл.1).

Трисомия по хромосоме 18 - Синдром Эдвардса также относится к группе наиболее часто встречающихся анеуплоидий. Частота рождения детей с синдромом Эдвардса составляет 1 на 6500 новорожденных. Он впервые был описан в 1960 году.

Цитогенетически данный синдром преимущественно представлен целой трисомией хромосомы 18 (мутация гамет, чаще наследуемая по материнской

линии), но также встречаются и мозаичные формы. Очень редко наблюдаются транслокации. За формирование основных фенотипических признаков отвечает участок д11 хромосомы 18. Дети с синдромом Эдвардса отличаются значительной задержкой психомоторного развития, тяжелыми пороками развития как внешних, так и внутреннихорганов, при рождении имеют малую массу тела и погибают, в основном, в возрасте до 1 года. [10, 13, 6, 16] (Табл.1).

Трисомия по хромосоме 13 - Синдром Патау, был впервые описан в 1960 году. В популяции такие дети рождаются с частотой 1 на 7800 новорожденных. Цитогенетически синдром Патау представлен различными вариантами: целой трисомией хромосомы 13, дополнительной кольцевой хромосомой 13, транслокационными вариантами синдрома (робертсоновские транслокации), мозаичными формами, а также изохромосомами.

К фенотипическим проявления синдрома Патау относятся крайне тяжелые пороки развития как внешних, так и внутренних органов: микроцефалия, микрогения, расщелина неба и верхней губы, полидактилия, пороки сердца, почек, кишечника. Им свойственна глубокая идиотия и в основном, такие дети погибают в возрасте до 1 года, чаще в первые 2-3 месяца жизни [10, 13, 6, 16] (Табл.1).

Числовые нарушения половых хромосом.

Синдром Кляйнфельтера - был впервые описан в 1942 году. В популяции частота рождения таких мальчиков составляет 1 на 1000. Цитогенетически возможны различные варианты синдрома: 47,XXY; 48,ХХУУ; 48,ХХХУ; 49,XXXXY, а также мозаичные формы. Синдрому Кляйнфельтера соответствуют признаки: гинекомастия, высокий рост, оволосение по женскому типу, гипогонадизм, гипогенитализм, бесплодие. После 40 лет больные страдают ожирением. Однако, снижение интеллекта отмечается только в некоторых случаях [10, 13, 6, 16].

Синдром полисомии хромосомы-Х. В популяции частота рождения таких девочек составляет 1 на 1000 новорожденных. Цитогенетически возможны различные формы полисомии хромосомы Х: 47,ХХХ, 48,ХХХХ и 49,ХХХХХ.

У женщин с кариотипом 47,ХХХ в основном нормальное развитие, интеллект -в пределах нормы. У них возможны некоторые гинекологические болезни, однако они могут иметь потомство. Степень отклонений от нормы возрастает по мере увеличения в кариотипе числа хромосомы X. [10, 13, 6, 16] (Табл.1).

Синдром полисомии хромосомы-У. В популяции частота рождения таких мальчиков составляет 1 на 1000. Цитогенетически выявляются полные и мозаичные формы. Индивидуумы с таким синдромом склонны к агрессии, насилию, гомосексуализму. Они высокого роста, могут иметь нормальное потомство, по умственному и физическому развитию большинство из них не отличается от здоровых. [10, 13, 6, 16] (Табл.1).

Единственная форма моносомии, встречающаяся у человека - моносомия хромосомы Х (Синдром Шерешевского-Тернера). Популяционная частота составляет 1 на 3000 новорожденных. Моносомия по целой хромосоме X составляет до 50% случаев, наряду с этим встречаются кольцевые хромосомы Х, делеции длинного и короткого плеча хромосомы Х, хромосомы изо-Х. Также для этого синдрома характерны варианты мозаицизма 45,X/46,XY при которых фенотипические проявления могут варьировать от типичного синдрома Шерешевского-Тернера, до мужского фенотипа.

Клинические признаки синдрома Шерешевского-Тернера: короткая шея, крыловидные кожные шейные складки, низкая линия роста волос, нанизм, отеки кистей и стоп новорожденных. У больных выявляются врожденные пороки сердца и почек, первичная аменорея, бесплодие, снижение зрения и слуха. Однако интеллектуальное развитие в пределах нормы [10, 13, 6, 16] (Табл.1).

Структурные аномалии хромосом - различные виды делеций, дупликаций, инверсий, инсерций, транслокаций хромосом, которые затрагивают как целые хромосомы (анеуплоидии), так и микроскопические сегменты хромосом, при этом перестройки внутри генов характеризуются как генные мутации, и зачастую являются причиной развития моногенных заболеваний. Разнообразие синдромов, обусловленных структурными

нарушениями хромосом, очень велико. Клинические проявления таких болезней зависят от размера сегмента хромосомы, участвующего в перестройке. Это, как правило, неизлечимые болезни, единственным методом профилактики которых является пренатальная диагностика [10, 16]. (Таблица 1)

Таблица 1- Наиболее распространенные хромосомные аномалии.

Тип аномалии Частота Клинические проявления

Трисомия 1:600/ -врожденные пороки сердца и ЖКТ

хромосомы 21 700 -умственная отсталость средней степени тяжести

(синдром Дауна)

Трисомия 1:6500 -аномалии развития конечностей -врожденные

хромосомы 18 пороки сердечно-сосудистой системы, кишечника,

(синдром почек, крипторхизм

Эдвардса) -задержка развития, идиотия и имбецильность -погибают в возрасте до 1 года

Трисомия 1:7800 -МВПР

хромосомы 13 -глубокая идиотия, умирают в возрасте до 1 года,

(синдром Патау) чаще в первые 2-3 месяца жизни

Синдром 1:1000 -цитогенетические варианты могут быть различны

Кляйнфельтера 47,ХХУ; 48,ХХУУ; 48,ХХХУ; 49,ХХХХУ. -отмечены как полные, так и мозаичные формы

Полисомия 1:1000 -выявляются формы 47,ХХХ, 48,ХХХХ и

хромосомы Х 49,ХХХХХ. С увеличением числа хромосомы X нарастает степень отклонений от нормы -интеллект - в пределах нижней границы нормы

Полисомия 1:1000 -цитогенетически отмечены полные и мозаичные

хромосомы У формы -склонность к агрессии, асоциальному поведению

Моносомия 1:3000 -встречаются мозаичные формы

хромосомы Х -делеции длинного и короткого плеча хромосомы

(синдром X, изо-Х, а также кольцевые хромосомы X

Шерешевского- -интеллектуальное развитие в пределах нормы

Тернера)

Структурные -различные варианты делеций, инсерций,

аномалии дупликаций, инверсий и транслокаций

хромосом -тяжелый синдромальный характер поражения

1.3 Пренатальная диагностика

Пренатальная диагностика (ПД), как направление медицинской генетики, возникла в 70-е годы ХХ в.. В основе ее лежат как клинические науки (акушерство, гинекология, перинатология, неонаталогия), так и фундаментальные науки (биохимия, молекулярная биология, генетика, цитогенетика и эмбриология). Пренатальная диагностика призвана решать такие задачи, как профилактика, выявление, а в перспективе и лечение врожденных и наследственных заболеваний (ВНЗ) на ранних стадиях развития. На практике это комплекс диагностических методов и врачебных мероприятий, которые направлены на выявление и предупреждение нарушений внутриутробного развития человека.

Пренатальная диагностика включает непрямые (обследование беременной женщины) и прямые (непосредственное обследование плода) методы

исследования (Рис.1).

Рисунок 1 - Методы оценки состояния плода.

1.3.1 Непрямые методы пренатальной диагностики

Непрямые методы пренатальной диагностики служат для формирования так называемых «групп риска» беременных с повышенным риском рождения больного ребенка. К основным показаниям для направления беременных на ПД во всем мире относятся:

-возраст беременной 35 лет и старше;

-у женщины от предыдущей беременности ребенок/плод имел врожденные пороки развития;

-в анамнезе у беременной женщины не менее двух самопроизвольных выкидышей на ранних сроках;

-носительство хромосомных перестроек в семье;

-в семье или у ближайших родственников ранее диагностированы моногенные заболевания;

-применение перед и на ранних сроках беременности некоторых лекарственных препаратов;

-перенесенные вирусные инфекции (гепатит, краснуха, токсоплазмоз и др.); -если кто-нибудь из супругов подвергался ионизирующему облучению до зачатия [4].

Биохимический скрининг.

Биохимический скрининг пороков развития плода - наиболее распространенный непрямой метод пренатальной диагностики. Началом биохимического скрининга считается публикация первых данных об ассоциации уровня альфа-фетопротеина (АФП) в сыворотке крови беременной с наличием анэнцефалии у плода. [51, 49]. В 1984 году была опубликована работа, в которой показано снижение содержания АФП в крови матери при синдроме Дауна у плода [76]. Позже были обнаружены и другие эмбриональные сывороточные маркеры, концентрация которых в крови беременной изменялась при наличии у плода синдрома Дауна [92]. Наиболее существенные отклонения от нормы во 2-м триместре выявлены для

хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и неконъюгированного эстриола (НЭ) [43, 91,125].

Все эти белки продуцируются клетками плаценты или самого плода и поступают в кровоток матери, то есть являются эмбрионспецифичными. Их концентрация в сыворотке крови меняется в зависимости от состояния плода и срока беременности. Однако ни один из маркеров трисомии 21 у плода не может служить единственным критерием. Наиболее эффективной моделью биохимического скрининга в 15-18 недель беременности является применение двух или трех сывороточных маркеров с учетом возрастного риска женщины. Исследование сыворотки крови беременных с целью выявления синдрома Дауна у плода нашло практическое применение в ряде медицинских центров Европы с 1992 года. Чувствительность тройного теста, согласно данным зарубежных исследователей, варьирует от 62 до 68% [74, 109].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тарасенко Ольга Александровна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Айала Ф. Современная генетика. / Айала Ф., Кайгер Д.: Пер. с англ. -М.:Мир,1987.

2. Баранов В.С. Цитогенетика эмбрионального развития человека: Научно-практические аспекты./ В.С. Баранов, Т.В. Кузнецова - СПб.: Издательство Н.-Л, 2007.

3. Баранов В.С. Ранняя диагностика наследственных болезней в России: Соврем. состояние и перспективы // Междунар. мед. обзоры. 1994. Т. 2, № 4. С. 236-243.

4. Баранов В.С. Современные алгоритмы пренатальной диагностики наследственных болезней: методические рекомендации./ Баранов В.С., Айламазян Э.К. СПб.: Издательство Н-Л, 2013. - 116с.

5. Беркоу Р. Руководство по медицине. Диагностика и терапия. В 2-х т. Т.1,Т.2,/Пер. с англ. Под ред. Р.Беркоу, Э Флетчера. - М.:Мир,1997.

6. Бочков Н. П. Клиническая генетика: учебник/ Н. П. Бочков, В. П. Пузырев, С. А. Смирнихина ; под ред. Н. П. Бочкова. — 4-е изд., доп. и пере- раб. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 592 с. : ил.

7. Бочков Н. П. Медицинская генетика. /Н. П. Бочков, А. Ю. Асанов, Н.А. Жученко [и др.] Под ред. Н.П. Бочкова. 2-е изд. -М.: «Академия», 2003. -192 с.

8. Бочков Н.П. Наследственность и мутагены внешней среды. / Бочков Н.П., Чеботарёв А.Н. // М.: Медицина. 1989. - 272 с.

9. В. С. Баранов. Современные алгоритмы пренатальной диагностики наследственных болезней: методические рекомендации / В. С. Баранов, Т. В. Кузнецова, Т. Э. Иващенко [и др.]; под ред. В. С. Баранова и Э. К. Айламазяна. - СПб.; Изд-во Н-Л, 2009. 116 с.:ил.

10. Вахарловский В.Г. Генетика в практике педиатра. / Вахарловский В.Г., Романенко О. П., Горбунова В. Н. // СПб.: «Феникс»,2009 - 288 с. с ил.

11. Вельтищев Ю.Е. Наследственная патология человека. / Вельтищев Ю.Е., Бочков Н.П. // М.: АМН, 1992. Т.1 (277с.), Т II (246с).

12. Генетика человека по Фогелю и Мотулски. Проблемы и подходы / ред. М. Р. Спейчер, С.Е.Антонаракис, А. Г. Мотулски; пер. с англ. А. Ш. Латыпов [и др.]; научн. ред. В. С. Баранов, ред. Т. К. Кащеева. Т. В. Кузнецова. - 4-е издание. - СПб.:Изд-во Н-Л, 2013. - 1056 с.

13. Генетика. Учебник для вузов/Под ред. академика РАМН В.И.Иванова. -М.:ИКЦ «Академкнига», 2006. - С.418-428.

14. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1998, - 459с.

15. Демин Г.С. Особенности пренатальной диагностики хромосомных болезней с помощью метода количественной флюоресцентной ПЦР. / Демин Г.С., Иващенко Т.Э., Федорова И.Д. [и др.] // Медицинская Генетика - 2008 - Т. 7, - №5, - С. 20-25.

16. Джонс. К. Наследственные синдромы по Дэвиду Смиту. Атлас-справочник/ М.: Практика, 2011. - С. 1002

17. Жученко, А. А. Генетика: учебник / А. А Жученко, Ю. Л. Гужов, В. А. Пухальский. - М.: Колос, 2004.

18. Иващенко Т.Э. Особенности диагностики анеуплоидии хромосомы Х./ Т. Э. Иващенко, О. А. Тарасенко, Ю. А. Насыхова [и др.] //Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике./ Под ред. чл.-корр. РАЕН А. Б. Масленникова. -вып. 23.- Новосибирск: Академиздат, 2015.130 с.

19. Козлова С.И., Наследственные синдромы и медико-генетичесное консультирование. / Козлова С.И., Демикова Н.С., Семанова Е., Блинникова О.Е. - Атлас-справочник / Изд. 2-е дополн. - М.: Практика, 1996. - 416 стр., 392 ил.

20. Мариничева Г. С. Умственная отсталость при наследственных болезнях. / Мариничева Г. С., Гаврилов В. И. - М.: Медицина, 1988.

21. Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней / Под ред. акад. РАМН, проф. Э.К.Айламазяна, чл. корр. РАМН, проф. В.С.Баранова. - 2-е изд. - М.: МЕДпрессинформ, 2007. - 416 с. : ил.

22. Профилактика наследственных болезней./ Под ред. Н. П. Бочкова. - М.: ВОНЦ, 1987.

23. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA./ М.: Медиа Сфера, 2002,

24. Симпсон Д. Генетика в акушерстве и гинекологии./ Симпсон Д., Голбус М., Мартин Э., Сарто Г. Пер. с англ. - М.: Медицина, 1985.

25. Тарантул В.З. Геном человека: Энциклопедия, написанная четырьмя буквами. // - М.: Языки славянской культуры, 2003. - 392 с.: ил.

26. Тарасенко О.А. Пренатальная диагностика наиболее распространенных хромосомных аномалий методом QF-PCR в Санкт-Петербурге. / Тарасенко О.А., Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., [и др.] //«Медицинская генетика» 2012 г, т.11, №4(118), с.42-49.

27. Тератология человека. Изд. 2-е / Под ред. Г. И. Лазюка. - М.: Медицина, 1991.

28. Тимошевский В. А. Технологии молекулярного кариотипирования в практике быстрой пренатальной диагностики клинически значимых анеуплоидий. / Тимошевский В.А., Лебедев И.Н. // Медицинская генетика №8, 2010г., - 13-22.

29. Ткаченко О.А. Иммунохимические исследования системы специфических белков плаценты человека. / Ткаченко О.А. Петрунин Д.Д. // Вест.РАМН.-1995. - Т.3. - С.40 - 44.

30. Шилова Н.В. Интерфазная флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) в диагностике числовых хромосомных аберраций. / Шилова Н.В., Золотухина Т.В. // Мед генетика 2007; 6: 10: 53-58.

31. Adinolf M., Pertl B., Sherlock J. Rapid detection of aneuploidies by microsatellite and the quantitative fluorescent polymerase chain reaction // Prenat Diagn. - 1997. - Vol. 17, N. 13. - P. 1299-1311.,

32. Adinolfi M., Sherlock J. Prenatal detection of chromosome disorders by QF-PCR // Lancet. - 2001. - Vol. 358, N. 9287. - P. 1030-1031.

33. Antenatal detection of hereditary disorders, by Henry L. Nadler, MD, Pediatrics, 1968;42:912-918. /1998 Jul;102(1 Pt 2):247-8.

34. Badenas C. Assessment of QF-PCR as the First Approach in Prenatal diagnosis.//Celia Badenas, Laia Rodriques-Pevenga, Carme Morales et.al.// J. Mol. Diagn. 2010 now, 12(6):828-834.

35. Bernard P.S. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping/ Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. //Analytycal Biochemistry.-1999. - № 273.- p. 221-228.

36. Bianchi D.W. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum / Bianchi D.W., Zickwolf G.K., Weil G.J. // Proc. Natl. Acad. Sci.USA - 1996 - V. 93 - P. 705-708.

37. Caine A. Prenatal detection of Down'ssyndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, and 21 by FISH or PCR without a full karyotype: A cytogenetic risk assessment./ Caine A., Maltby A.E., Parkin C.A. et al. // Lancet 2005; 366: 123—128.

38. Chen E.Z. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing/ Chen E.Z., Chiu R.W., Sun H. et al. // PLoS One - 2011 - V.6 - N.7 - E.21791.

39. Chitty L.S. Fetal nuchal translucency scan and early prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities by rapid aneuploidy screening: Observational study/ Chitty L.S., Kagan K.O., Molina F.S. et al.//. BMJ 2006; 332: 452—455

40. Chiu R. W. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma/ Chiu R. W., Chan K.C., Gao Y et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2008. - Vol. 105. - P. 20458-20463.

41. Chiu R.W. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study/ Chiu R.W., Akolekar R., Zheng YW., et.al. // BMJ - 2011 - V. 11- P.342

42. Choolani M. FastFISH: technique for ultrarapid fluorescence in situ hybridization on uncultured amniocytes yielding results within 2 h of amniocentesis./ Choolani M., Ho S.S., Razvi K. et al. // Mol Hum Reprod 2007; 1: 6: 355—359.

43. Christiansen M. Human placental lactogen is a first trimester maternal serum marker of Down's syndrome / Christiansen M., Norgaard-Pedersen B. // Clin.Genet. - 2005. Vol.68. - P.35 - 39.

44. Cirigliano V. Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR. Assessment on 18000 consecutive clinical samples./ V.Cirigliano, G.Voglino, M.P.Canadas et.al //Molecular Human Reproduction Vol.10,No.11 pp.839-846, 2004.

45. Cirigliano V. Clinical application of multiplex quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) for the rapid prenatal detection of common chromosome aneuploidies/ Cirigliano V., Ejarque M., Canadas M.P. et al. // Mol Hum Reprod. - 2001. - Vol. 7, N. 10. - P. 1001-1006.].

46. Cirigliano V. Assessment of new markers for the rapid detection of aneuploidies by quantitative fluorescent PCR (QF-PCR)/ Cirigliano V., Lewin P., Szpiro-Tapies S. et al. // Ann Hum Genet. - 2001. - Vol. 65, N. 5. - P. 421-427.

47. Cirigliano V. Rapid detection of chromosomes X and Y aneuploidies by quantitative fluorescent PCR/ Cirigliano V., Sherlock J., Conway G. et al. // Prenat Diagn. - 1999. - Vol. 19, N. 12. - P. 1099-1103.

48. Cirigliano V. X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies./ Cirigliano V, Ejarque M, Fuster C, Adinolfi M (2002) // Mol Hum Reprod 8: 1042-1045.

49. Cuckle H.S. Appropriate biochemical parameters in first-trimester screening for Down's syndrome / Cuckle H.S., van Lith J.M. //Prenat.Diagn. - 1999. -Vol.19. - P.505 - 512.

50. Cuckle H.S. Estimating a woman's risk of having a pregnancy associated with Down's syndrome using her age and serum AFP level / Cuckle H.S., Wald N., Thompson S.G,//Br.J.Obstet.Gynaecol. - 1987. - Vol.94. - P.387 - 402.

51. Cuckle H.S. Time for total shift to first - trimester screening for Down's syndrome//Lancet. - 2001. - Vol.358. - P.1658 - 1659.

52. Daniel A. Identification of marker chromosomes in thirteen patients using FISH probing./ Daniel A., Malafiej P., Preece K. et al. // Am J Med Genet 1994; 53: 8—18.

53. Donaghue C. Detection of mosaicism for primary trisomies in prenatal samples by QF-PCR and karyotype analysis/ Donaghue C., Mann K., Docherty Z., Ogilvie C.M.// Prenat Diagn 2005; 25: 65—72.

54. Dudarevicz L. Molecular methods for rapid detection of aneuploidy/ Dudarevicz L., Holzgreve W., Jeziorovska A. [et al.] // J. Appl. Genet. - 2005. - Vol. 46. -P. 207-215.

55. Ehrich M. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting/ Ehrich M., Deciu C., Zwiefelhofer T. [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2011 - V.204 - N.3 - P. 1-11

56. Eiben B. A prospective comparative study on fluorescence in situ hybridization (FISH) of uncultured amniocytes and standard karyotype analysis./ Eiben B., Trawicki W., Hammans W. et al. // Prenat Diagn 1998; 18: 9: 901—906.

57. Elisavet A Papageorgiou. Fetal-specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21./ Elisavet A Papageorgiou, Alex Karagrigoriou, Evdokia Tsaliki1, [et al.] // Prenatal Diagnosis 2012, 32, 9961001

58. Eun Hae Cho. Validation of QF-PCR in a Korean population./ Eun Hae Cho, Bo Yan a park, Yu Sun Kang et.al. //Prenatal Diagnosis 2009; 29: 213-216.

59. Evdokia Tsaliki MeDIP real-time qPCR of maternal peripheral blood reliably identifies trisomy 21 / Evdokia Tsaliki, Elisavet A. Papageorgiou, Christiana Spyrou1, et.al.// Prenatal Diagnosis 2012, 32, 996-1001.

60. Fowler J. C. S. Satellite DNA and Higher-Primate Phylogeny/J. C. S. Fowler, J. D. Skinner, L. A. Burgoyne, and R. D. Drinkwater //School of Biological Sciences, Flinders University of South Australia

61. Friedman J.M. Oligonucleotide microarray analysis of genomic imbalance in children with mental retardation./ Friedman J.M., Baross A., Delaney A.D. et al. // Am J Hum Genet 2006; 79: 500—513.

62. Glenn E. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study / Glenn E. Palomaki, Cosmin Desiu, Edward W. Cloza [et al.] // Genetics in Medicine. - 2012. - Mar; 14(3): 296-305.

63. Guzel A. I. Rapid Detection of Fetal Aneuploidies by Quantitative Fluorescent-Polymerase Chain Reaction for Prenatal Diagnosis in the Turkish Population/ A I Guzel, M B Yilmaz, et al. // Balkan J Med Genet. Jun 2012; 15(1); 11-17

64. Habib Nasiri Investigation of QF-PCR Application for Rapid Prenatal Diagnosis of Chromosomal Aneuploidies in Iranian Population./ Habib Nasiri, Mohammad-Reza Noori-Dalooi, et.al. // Iran J Pediatr. 2011 Mar; 21(1): 15-20.

65. Hahnemann J. M. Accuracy of cytogenetic findings on chorionic villus sampling (CVS): diagnostic consequences of CVS mosaicism and non-mosaic discrepancyin centres contributing to EUCROMIC 1986-1992/ Hahnemann J. M., Vejerslev L. O. // Prenat. Diagn. - 1997. - Vol. 17. - P. 801-820.

66. Hegde M.R. Microarray-based mutation detection in the dystrophin gene. / Hegde M.R., Chin E.L., Mulle J.G. et al. // Hum Mutat 2008; 29: 9: 1091— 1099.

67. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-p. 986-994.

68. Henricues C. U. Decreased alpha-fetoprotein in amniotic fluid and maternal serum in diabetic pregnancy / Henricues C.U., Damm P., Tabor A. [et.al.] // Obstetr.Gynecol. - 1993. - Vol.82. - P.960 - 964.

69. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions// Biotechnology.-1993.-№ 11.- 1026-1030.

70. Iafrate A.J. Detection of large-scale variation in the human genome./ Iafrate A.J., Feuk L., Rivera M.N. et al. // Nat Genet 2004; 36: 949—951.

71. Ioannis Papoulidis Dual testing with QF-PCR and kariotype analysis for prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities. Evaluation of 13500 cases with consideration of using QF-PCR as a stand-alone test according to referral indications./ Ioannis Papoulidis, Elisavet Siomou, Alexandros Sofiriadis, et.al. // Prenatal Diagnosis 2012, 32, 680-685.

72. Jasinska A, Krzyzosiak WJ. Repetitive sequences that shape the human transcriptome. FEBS Lett. 2004 Jun 1;567(1):136-41.

73. Jeffreys AJ Individual-specific 'fingerprints' of human DNA./ Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL.//Nature. 1985 Jul 4-10;316(6023):76-9.

74. Jorgensen P.I. Low urinary oestriol excretion during pregnancy in women giving birth to infants with Down's syndrome / Jorgensen P.I., Trolle D. // Lancet. -1972. - Vol.2. - P.782.

75. Kong X, Rapid Diagnosis of Aneuploidy Using Segmental Duplication Quantitative Fluorescent PCR./ Kong X, Li L, Sun L, Fu K, Long J, Weng X, et al. (2014) // PLoS ONE 9(3) e88932.

76. Kornman L.H. Nuchal translucency cannot be used as a screening test for chromosomal abnormalities in the first trimester of pregnancy in a routine ultrasound practice / Kornman L.H., Morssink L.P., Beekhuis J.R. [et al.]// Prenat.Diagn.- 1996. - Vol.16,№9. - P.797 - 805.

77. Lander. Initial sequencing and analysis of the human genome./ Lander et al., // Nature. - 2001. Feb. 15;409(6822):860-921.

78. Leung W.C., Lao T.T. Rapid aneuploidy testing, traditional karyotyping, or both? Lancet 2005; 366: 97—98.

79. Lev D., Daniely M., Zudik A. et al. Automatic scanning of interphase FISH for prenatal diagnosis in uncultured amniocytes. Genet Test 2005; 9: 1: 41—47.

80. Liehr T., Ziegler M. Rapid prenatal diagnostics in the interphase nucleus: procedure and cut off rates. J Histochem Cytochem 005; 53: 3: 289—291.

81. Liu J.Z. Detection of alpha-thalassemia in China by using multiplex ligation-dependent probe amplification. Hemoglobin/ Liu J.Z., Han H., Schouten J.P. et al. 2008; 32: 6: 561—571.

82. Lo Y.M. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum/ Lo Y.M., Corbetta N., Chamberlain P.F. et al. // Lancet - 1997 - V. 350 - P. 485-487.

83. Lo YM. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis/ Lo Y.M., Tein M.S., Lau T.K., et.al. // Am J Hum Genet. - 1998 - V.62 - N.4 - P.768-75.

84. Macaya G. The major components of the mouse and human genomes: Preparation, basic properties and compositional heterogeneity. / Macaya G., Bernardi G., Bernardi G. // Eur. J. Biochem. 1981;111:227-233.

85. Mann K. Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis/ Mann K., Fox S.P., Abbs S.J. et al. // Lancet. -2001. - Vol. 358, N. 9287. - P. 1057-1061.

86. Mansfield E.S. Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms/ Hum Mol Genet 1993; 2: 43—50.

87. Maymon R. Predicting the result of additional second - trimester markers from a woman's first - trimester marker profile: a new concept in Down syndrome screening / Maymon R., Cuckle H., Jones R. [et.al.] // Prenat. Diagn. - 2005. -Vol.25,№12. - P.1102 - 1106.

88. McKusick V.A. Mendelian Inheritance in Man / McKusick V.A. // 11-th ed. Vol. 1, 2. - Johns Hopkins Univ. Press, 1994.

89. Meyne J.1. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates/ Meyne J1, Ratliff RL, Moyzis RK - Proc Nat/ Acad Sci U S A -Sep;86(18):7049-53.

90. Moon-Hee Lee Rapid Prenatal Diagnosis of Down Syndrome Using Quantitative Fluorescent PCR in Uncultured Amniocytes / Moon-Hee Lee, Hyun-Mee Ryu, Do-Jin Kim et.al. //J Korean Med Sci. 2004 Jun; 19(3): 341344.

91. Muller F. Prospective maternal serum human chorionic gonadotropine screening for the risk of fetal chromosomal anomalies and the subsequent fetal and

neonatal death // Muller F., Aegerter P., Boue A. // Prenat Diagn. - 1993. Vol.13. - P.29 - 43.

92. Nicolaides K.H. Nuchal translucency and other first-trimester sonographic markers of chromosomal abnormalities/ Nicolaides K.H. // Am.J.Obstetr.Gynecol. - 2004. - Vol.191. - P.45 - 67.

93. Ogilvie C.M. The future of prenatal diagnosis: Rapid testing or full karyotype? An audit of chromosome abnormalities and pregnancy outcomes for women referred for Down's Syndrome testing./ Ogilvie C.M., Lashwood A., Chitty L. et al. // BJOG 2005; 112: 1369—1375.

94. Palomaki G. E. Using multiples of the median to normalize serum protein measurements / Palomaki G.E., Neveux L.M. // Clin. Chem. Lab. Med. - 2001. - Vol.39 - P.1137 - 1145.

95. Pergament E. The clinical application of interphase FISH in prenatal diagnosis./ Pergament E., Chen P.X., Thangavelu M., Fiddler M// Prenat Diagn 2000; 20: 215—220.

96. Pertl B. Rapid molecular method for prenatal detection of Down's syndrome./ Pertl B., Yau S.C., Sherlock J. et al. // Lancet 1994; 343: 1197—1198.

97. Picchiassi E. Identification of universal mRNA markers for noninvasive prenatal screening of trisomies/ Picchiassi E., Coata G., Centra M., Pennacchi L., Bini V., Di Renzo G.C. // Prenat Diagn. - 2010 -V.30 - N.8 - P.764-770.

98. Prosser, J. Sequence relationships of three human satellite DNAs./ Prosser, J., M. Frommer, C. Paul, and P. C. Vlincent. 1986. // J. Mol. Biol. 187:145-155.

99. Rossa W. K. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma/ Rossa W. K. Chiu [et al.] // Proceedings of the National Academy of Science U S A. -2008 - Dec 23; 105(51): 20458-20463.

100. Schmidt W. Detection of aneuploidy in chomosomes X, Y, 13, 18 and 21 by QF-PCR in 662 selected pregnancies at risk./ Schmidt W., Jendermy J., Hecher K. et al. // Mol Hum Reprod 2000; 6: 9: 855 -860.

101. Schouten J.P. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids/ Schouten J.P., McElgunn C.J., Waaijer R. et al. // Res 2002; 30: 57,

102. Sellner L. N., Taylor G. R. MLPA and MAPH: new techniques for detection of gene deletions // Hum. Mutat.. - 2004. - Vol. 23. - P. 413-419.

103. Shaffer L.G. Molecular cytogenetic and rapid aneuploidy detection methods in prenatal diagnosis. / Shaffer L.G., Bui T.-H. //Am J Med Genet Part C Semin Med Genet 2007; 145: 87—98.

104. Shereen H. Atef Prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using QF-PCR: the egyptian study/ Shereen H. Atef, Sawsan S. Hafez, Nermein H. Mahmoud, and Sanaa M. Helmy. // J Prenat Med. 2011 Oct-Dec; 5(4): 83-89.

105. Singer M.F., SINEs and LINEs: Highly repeated short and long interspersed sequences in mammalian genomes. 1982,Cell 28: 433-434.

106. Slater H.R. Rapid, high throughput prenatal detection of aneuploidy using a novel quantitative method (MLPA)./ Slater H.R., Bruno D.L., Ren H. et al. // J Med Genet 2003; 40: 907—912.

107. Smith D.W. Recognizable patterns of human malformation. Genetic, embryologic and clinical aspects. 4th/Ed. Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1988.

108. Spencer K. Prediction of pre-eclampsia by uterine artery Doppler ultrasonography and maternal serum pregnancy-associated plasma protein-A, free P-human chorionic gonadotropin, activin A and ingibin A at 22+0 to 24+6 weeks' gestation / Spencer K., Yu C.K., Savvidou M. [et.al.] // Ultrasound Obstet. Gynecol. - 2006b. - Vol.27, №6. - P.658 - 663.

109. Spencer K. Screening for trisomy 21 in twin pregnancies in the first trimester: does chorionicity impact on maternal serum free P-hCG or PAPP-A levels? // Prenat.Diagn. - 2001. - Vol.21. - P.715 - 717.

110. Stallings W.C. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes. / Stallings WC, Abdel-Meguid S. S., Lim L., et.al. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Jun 1;88(11): 5046-50.

111. Steele M. W. Chromosome analysis of human amniotic-fluid cells./ Steele M. W., Breg W. R. //Lancet. - 1966. Feb 19;1(7434):383-5.

112. Stumm M. Interphase M-FISH applications using commercial probes in prenatal and PGD diagnostics./ Stumm M., Wegner R.D., Bloechle M. [et.al.]. // Cytogenet Genome Res 2006; 114: 3—4: 296—301.

113. Sykes P.J. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. / Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley A.A. // BioTechniques.-1995.-№ 13.- p.444-449.

114. Thein A.T. An assessment of the use of interphase FISH with chromosome specific probes as an alternative to cytogenetics in prenatal diagnosis. / Thein A.T., Abdel-Fattah S.A., Kyle P.M., Soothill P.W.// Prenat Diagn 2000; 20: 275—280.

115. Tong Y.K. Epigenetic-genetic chromosome dosage approach for fetal trisomy 21 detection using an autosomal genetic reference marker. / Tong YK., Chiu R.W., Akolekar R. [et. al.]// PLoS One - 2010 - V.20 - E.15244.

116. Tong Y.K. Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18 by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma: Theoretical and empirical considerations/ Tong Y.K., Ding C., Chiu R.W. et.al. // Clin Chem. - 2006 -V.52 -N.12 - P.2194-2202. ;

117. Tyagi S. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. / Tyagi S., Kramer F.R. // Nat Biotechnol.-1996.-№ 14.- p.303-308.

118. Verlinsky Y. Preimplantation Diagnosis of Genetic Diseases. Wiley-Liss / Verlinsky Y., Kuliev A., 1993. 155 p.

119. Weber J.L. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction./ Weber J L, May P E. //Am J Hum Genet - 1989 Mar;44(3):388-96.

120. Weise A., Liehr T. Fluorescence in situ hybridization for prenatal screening of chromosomal aneuploidies. Expert Rev Mol Diagn 2008; 8: 4: 355—357.

121. Xingmei Xie Establishment of a 10-Plex Quantitative Fluorescent-PCR Assay for Rapid Diagnosis of Sex Chromosome Aneuploidies. / Xingmei Xie, Qiaoyi

Liang // PLoS One. 2014; 9(9): e106307. Published online 2014 Sep 10. doi: 10.1371/journal.pone.0106307

122. Yurov Y. B. Application of cloned satellite DNA sequences to molecular-cytogenetic analysis of constitutive heterochromatin heteromorphisms in man/. Yurov Y. B., Mitkevich S. P., Alexandrov I. A.// Hum. Genet., 76: 157-164 (1987).

123. Ioannis Papoulidis. Dual testing with QF-PCR and karyotype analysis for prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities. Evaluation of 13500 cases with consideration of using QF-PCR as a stand-alone test according to referral indications./ Ioannis Papoulidis, Elisavet Siomou, Alexandros Sotiriadis, George Efstathiou, Anastasia Psara et.al.//Prenatal Diagnosis 2012, 32, 680-685

124. Медицинские лабораторные технологии. Руководство по клинической лабораторной диагностике. / под ред. А. И. Карпищенко, - 3-е изд., перераб. и доп. - Т.2 - М.ГЭОТАР-Медиа. 2013. - 792 с,:ил.

125. Пренатальный биохимический скрининг. Система, принципы, клинико-диагностические критерии, алгоритмы. / Кащеева Т. К. /Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Санкт-Петербург 2009.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АЖ - амниотическая жидкость;

АФП - альфафетопротеин;

вкДНК - внеклеточная ДНК;

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт;

КАЖ - клетки амниотической жидкости;

КФ-ПЦР - количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция;

МВПР - множественные врожденные пороки развития;

МЛПА - количественная мультиплексная лигазная реакция (MLPA);

ПД - пренатальная диагностика;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени (real time qPCR);

СГГ - сравнительная геномная гибридизация(аггау CGH);

ТВП - толщина воротникового пространства;

УЗИ - ультразвуковое исследование;

ХГЧ - хорионический гонадотропин;

ß-ХГЧ - свободная ß-субъединица ХГЧ;

FISH - флуоресцентная гибридизация (in situ);

РАРР-А - плацентарный ассоциированный с беременностью белок А; STR - короткие тандемные повторы (short tandem repeats).

122

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Интерфейс программы «О^о у.6.31», используемой при подборе праймеров для маркера 02181437. Показан этап анализа по выявлению наличия/отсутствия возможности образования димеров между праймерами.

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

Флуорохромы, используемые для мечения праймеров.

^рбоксифлуоресцеин (FAM)

5'-Hexachloro-Fluorescein (HEX)

Тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA)

Kарбокси-Х-родамин (ROX)

ПРИЛОЖЕНИЕ В

Электрофореграммы мультиплексных ПЦР, иллюстрирующие различные патологии, которые были выявлены при проведении исследований.

Электрофореграмма мультиплексной КФ-ПЦР образца с трисомией по хромосоме 21 (синдромом Дауна). Маркеры 02181437 и 02181411 представлены тремя аллелями с соотношениями высот пиков 1:1:1. Маркер 021811 представлен двумя аллелями с соотношением высот пиков 2:1. Маркер 0218226 представлен двумя аллелями с соотношением высот пиков 1:2.

Электрофореграмма результата мультиплексной КФ-ПЦР образца с трисомией по хромосоме 18 (синдромом Эдвардса). Маркеры 0188386 и 0188535 представлены тремя аллелями с соотношением высот пиков 1:1:1. Маркер 0188391 представлен двумя аллелями с соотношением высот пиков 2:1. Маркер 0188380 представлен двумя аллелями с соотношением высот пиков 1:2

Электрофореграмма мультиплексной КФ-ПЦР образца с триплоидией. Маркеры 02181437, 02181411, 0188391, 0138634, 0138742 представлены тремя аллелями с соотношением высот пиков 1:1:1. Маркеры 021811, 0188386 представлены двумя аллелями с соотношением высот пиков 2:1. Маркеры 0188535, 0218226, 0138628 представлены двумя аллелями с соотношением высот пиков 1:2. Маркер 0188380 гомозиготен и неинформативен.

АМХУ

Р39 ХНРКТ

| Х22 Е)Х8981 1 ........... >1 Ч»Ч11П11 А ..........................................................—......... 1.1 ,,^.11

Электрофореграмма мультиплексной КФ-ПЦР образца с триплоидией. Маркер ХИРЯТ представлен тремя аллелями с соотношением высот пиков 1:1:1. Маркеры Р39, Х22, 0X8981 представлены двумя аллелями с соотношением высот пиков 1:2.

Электрофореграмма мультиплексной КФ-ПЦР образца с числовым нарушением половых хромосом (синдромом Кляйнфельтера). Соотношение высот пиков ЛМХУ 2:1, маркеры Р39, 0X8981, ХИРЯТ гетерозиготны с соотношением высот пиков 1:1. Маркер Х22 гомозиготен и неинформативен.

Электрофореграмма мультиплексной КФ-ПЦР образца с числовым нарушением половых хромосом (трипло Х). Маркер ЛМХУ представлен одним аллелем ЛМХУ Х(106 п.н.). Маркеры ХИРЯТ, Х22 представлены двумя аллелями с соотношением высот пиков 1:2, маркер 0Х8981 представлен двумя аллелями с соотношением высот пиков 2:1, маркер Р39 гомозиготен неинформативен.

Электрофореграмма мультиплексной КФ-ПЦР образца с вероятным числовым нарушением половых хромосом (Вероятность моносомии Х- 99,8% (см. табл. 12)). Маркер ЛМХУ представлен одним аллелем ЛМХУ Х(106 п.н.). Маркеры ХИРЯТ, Х22, 0Х8981, Р39 гомозиготны.