Сравнительная цитогенетика эмбриобласта, трофобласта и внутриполостной жидкости бластоцисты человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Жигалина Дарья Ивановна

• Жигалина Дарья Ивановна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Жигалина Дарья Ивановна

Список сокращений......................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................17

1.1 Внеклеточная ДНК во внутриполостной жидкости бластоцисты....................17

1.2 Молекулярное кариотипирование внеклеточной ДНК из.................................21

внутриполостной жидкости бластоцисты.................................................................21

1.3 Хромосомный мозаицизм на стадии морулы и бластоцисты...........................30

1.3.1 Типы хромосомного мозацизма и механизмы их формирования.................36

1.3.2 Факторы, влияющие на формирование митотических анеуплоидий............46

1.3.3 Проблема хромосомного мозаицизма при проведении преимплантационного генетического скрининга............................................................................................51

1.3.4 Перенос эмбрионов с хромосомным мозаицизмом в циклах ЭКО...............52

1.3.5 Способы получения материала для проведения преимплантационного генетического тестирования.......................................................................................55

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................58

2.1 Материал................................................................................................................58

2.2 Полногеномная амплификация............................................................................67

2.2.1 Полногеномная амплификация со множественным замещением цепи........67

2.2.2 Полногеномная амплификация на основе полимеразной цепной реакции.. 70

2.3 Измерение концентрации двухцепочечной ДНК...............................................72

2.4 Сравнительная геномная гибридизация.............................................................72

2.4.1 Получение препаратов метафазных хромосом................................................74

2.4.2 Мечение тестируемой и контрольной ДНК.....................................................75

2.4.3 Постановка гибридизации.................................................................................76

2.4.4 Детекция гибридизационных сигналов............................................................78

2.5 Матричная сравнительная геномная гибридизация...........................................79

2.5.1 Энзиматическое мечение образцов ДНК.........................................................79

2.5.2 Очистка образцов ДНК после мечения............................................................80

2.5.3 Подготовка ДНК к гибридизации.....................................................................82

2.5.4 Гибридизация и отмывка...................................................................................82

2.6 Массовое параллельное секвенирование............................................................83

2.6.1 Измерение концентрации и разведение ДНК..................................................85

2.6.2 Тагментация ДНК...............................................................................................85

2.6.3 Амплификация тагментированной ДНК..........................................................87

2.6.4 Очистка продуктов ПЦР....................................................................................88

2.6.5 Нормализация ДНК-библиотек.........................................................................89

2.6.6 Пулирование ДНК-библиотек...........................................................................90

2.7 Статистический анализ.........................................................................................90

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ............................................................93

3.1 Полногеномная амплификация образцов ДНК из клеток эмбриобласта, трофэктодермы и из внутриполостной жидкости бластоцист................................93

3.2 Сравнение эффективности детекции анеуплоидий методами aCGH и MPS .. 96

3.3 Влияние хромосомных аномалий на морфологические характеристики бластоцист..................................................................................................................106

3.4 Спектр хромосомных аномалий в образцах внутриполостной жидкости, эмбриобласта и трофэктодермы................................................................................111

3.5 Оценка частоты и спектра реципрокных анеуплоидий....................................116

3.6 Хромосомный мозаицизм у эмбрионов человека на стадии бластоцисты.... 126

3.7 Сравнение молекулярных кариотипов эмбриобласта, трофэктодермы и молекулярного кариотипа, реконструированного по анализу внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости бластоцисты...............................................................135

3.8 Ограничения исследования................................................................................145

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................................147

ВЫВОДЫ...................................................................................................................154

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................156

Электронные ресурсы:..............................................................................................172

ПРИЛОЖЕНИЕ А Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток эмбриобласта и трофэктодермы 14 бластоцист с помощью метафазной CGH...............................................................173

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток эмбриобласта и трофэктодермы 15 бластоцист с помощью микроматричной CGH......................................................175

ПРИЛОЖЕНИЕ В Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток эмбриобласта и трофэктодермы 16 бластоцист с помощью метода MPS........................................................................177

Список сокращений

aCGH - (от англ. Array Comparative Genomic Hybridization) - сравнительная геномная гибридизация на микрочипах

CGH - (от англ. Comparative Genomic Hybridization) - сравнительная геномная гибридизация

dsDNA - (от англ. Double Stranded DNA) - двухцепочечная ДНК

EDB - (от англ. Extraction Enzyme Dilution Buffer) - буфер для ферментативной

экстракции

FISH - (от англ. Fluorescence In Situ Hybridization) - флуоресцентная in situ гибридизация

MPS - (от англ. Massive Parallel Sequencing) - массовое параллельное секвенирование

MDA - (от англ. Multiple Displacement Amplification) - амплификация со множественным замещением цепи

NGS - (от англ. Next-Generation Sequencing) - секвенирование следующего поколения

PBS - (от англ. Phosphate Buffered Saline) - фосфатный буфер

SSC - (от англ. Saline-Sodium Citrate) - раствор цитрата и хлорида натрия

внДНК - внеклеточная ДНК

ВКМ - внутренняя клеточная масса

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ИКСИ -интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида

ПГА - полногеномная амплификация

ПГД - преимплантационная генетическая диагностика

ПГС - преимплантационный генетический скрининг

ПГТ - преимплантационное генетическое тестирование

ТЭ - трофэктодерма

ЭБ - эмбриобласт

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная цитогенетика эмбриобласта, трофобласта и внутриполостной жидкости бластоцисты человека»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Развитие эмбрионов человека на преимплантационном этапе является сложным и динамичным процессом. В зиготе происходит объединение мужского и женского пронуклеусов и начинается серия быстрых клеточных делений дробления. На стадии 4-8 клеток активируется эмбриональный геном, благодаря чему в дальнейшем формируется морула, а затем бластоциста. На стадии бластоцисты становятся морфологически различимы трофэктодерма, которая представляет собой внешний слой клеток, и из которой в дальнейшем сформируется плацента и другие экстраэмбриональные ткани, и внутренняя клеточная масса (эмбриобласт), представленная небольшой группой клеток, из которых непосредственно развивается плод. На 5-6 день после оплодотворения бластоциста высвобождается из блестящей оболочки (zona pellucida) и имплантируется в матку, где и происходит ее дальнейшее развитие [Fragouli et al., 2013].

Изучение цитогенетики эмбрионального развития человека на преимплантационном этапе представляется актуальным с точки зрения фундаментальной биологии, а также имеет большое клиническое значение. Репродуктивные потери у человека являются крайне частым событием. Демографические исследования показали, что шансы произвести жизнеспособное потомство у женщины среднего репродуктивного возраста в пределах одного менструального цикла не превышают 25 % [Edmonds et al., 1982]. При этом около 15 % клинически распознаваемых беременностей спонтанно прерывается в течение первого триместра [Carr, 1983]. Одной из причин, вносящих значительный вклад в этиологию ранней эмбриональной гибели, являются хромосомные аномалии [Лебедев и др., 2003, 2013]. По разным оценкам, от 50 до 60 % спонтанных абортусов имеют анеуплоидии [Eiben et al., 1990; Menasha et al., 2005; Баранов, Кузнецова, 2007]. Однако были получены сведения о том, что частота анеуплоидий выше, а спектр хромосомных аномалий значительно разнообразнее на

преимплантационном этапе эмбрионального развития по сравнению с дальнейшими стадиями внутриутробного периода онтогенеза. Так, в одном из исследований числовые хромосомные аберрации были выявлены в 75 % ооцитов, у 83 % эмбрионов на стадии дробления и у 58 % эмбрионов на стадии бластоцисты [Fragouli et al., 2013]. Несмотря на то, что в настоящее время в литературе уже накоплены результаты цитогенетических исследований эмбрионов человека, ряд существующих методических ограничений не позволяет в полной мере изучить мутационные процессы, происходящие на самых ранних этапах развития. В большинстве предыдущих исследований кариотип морул и бластоцист был изучен с помощью метода FISH с использованием 5-12 флуоресцентных ДНК-зондов [Munne et al., 1998, 2002; Platteau et al., 2005; Mantzouratou et al., 2007; Northrop et al., 2010]. В то же время работы, в которых были использованы методы, позволяющие проанализировать весь хромосомный набор, чаще всего включают небольшие выборки эмбрионов [Voullaire et al., 2000; Wells and Delhanty, 2000].

Получение материала для цитогенетического анализа бластоцист проводится исключительно в рамках диагностических процедур вспомогательных репродуктивных технологий и остается серьезной проблемой, которая связана с методическими и биоэтическими ограничениями. Так, в значительной части исследований полученные результаты представляют собой данные анализа биоптатов трофэктодермы, состоящих всего из 5-10 клеток, что не позволяет получить полное представление о кариотипе эмбриона в целом и внутренней клеточной массы в частности. Анализ морул также нередко ограничивается всего одним или двумя бластомерами. Таким образом, требуют уточнения не только уже имеющиеся данные о частоте и спектре хромосомных аберраций у эмбрионов на преимплантационном этапе развития, но и сведения о распространении такого существенного цитогенетического феномена, как хромосомный мозаицизм.

Данные преимплантационного генетического скрининга (ПГС) и результаты молекулярно-цитогенетического анализа причин репродуктивных потерь указывают на то, что значительная часть регистрируемых числовых нарушений хромосом находится в мозаичном состоянии с нормальными клетками.

Хромосомный мозаицизм на преимплантационном этапе развития был описан с применением различных методов: стандартного цитогенетического исследования [Jamieson et al., 1994], FISH [Baart et al., 2006], CGH [Wells et al., 2000], aCGH [Gleicher et al., 2016], NGS [Orvieto et al., 2016]. С помощью интерфазного FISH-анализа и сравнительной геномной гибридизации (CGH) показано, что от 60 % до 90 % бластоцист имеют мозаичный кариотип [Bielanska et al., 2002; Avo Santos et al., 2010; Taylor et al., 2014]. Размеры аберрантного клона, вероятно, определяются стадией возникновения мутации, то есть чем раньше возникает аномалия, тем выше ее доля в клетках эмбриона. Последующее распределение аномальных клеток при дифференцировке тканей приводит к возникновению истинного или ограниченного тканевого мозаицизма [van Echten-Arends et al., 2011]. Несмотря на то, что явление хромосомного мозаицизма было описано достаточно давно, эта проблема остается актуальной и в настоящее время. В некоторых исследованиях указывается на то, что результаты, полученные на основании биопсии клеток трофэктодермы, можно, как правило, экстраполировать на клетки эмбриобласта, однако точной уверенности в этом нет [Evsikov, Verlinsky, 1998; Johnson et al., 2010]. Кроме того, однозначно не установлено влияние мозаицизма в эмбриобласте и трофэктодерме на вероятность имплантации эмбриона и рождения ребенка со сбалансированным набором хромосом. С помощью создания химер удалось продемонстрировать рождение жизнеспособных особей из мозаичных эмбрионов мыши [Bolton et al., 2016]. Аналогичные результаты были неожиданно получены и для человека после переноса эмбрионов с мозаичным кариотипом [Gleicher et al., 2015; Greco et al., 2015; Esfandiari et al., 2016; Lledo et al., 2017]. Вопрос относительно наличия механизмов коррекции эмбрионального кариотипа широко обсуждается в настоящее время [Bazrgar et al., 2013]. Вместе с тем, до сих пор остается неясным вклад различных цитогенетических механизмов, приводящих к формированию мозаичного кариотипа. Так, вследствие невозможности разграничения ошибок мейоза II от постзиготических митотических ошибок существующими молекулярно-генетическими методами, по-прежнему остается неоцененным соотношение механизмов коррекции анеуплоидной зиготы и de novo возникновения

хромосомных мутаций на постзиготических этапах развития. И тот, и другой механизм, так или иначе, ведут к возникновению мозаичной хромосомной конституции у эмбриона.

Хромосомный мозаицизм на преимплантационном этапе развития увеличивает вероятность диагностической ошибки и снижает шансы на успех процедуры ЭКО [Esfandiari et al., 2016]. Для ПГС ложноположительный результат может означать, что эмбрион будет исключен из переноса на основании результатов биопсии трофэктодермы, хотя эмбриобласт у него был эуплоидным, и эмбрион имел возможность развиться в плод с нормальным кариотипом. Таким образом, часть эуплоидных эмбрионов может быть исключена из-за результатов анализа трофэктодермы в циклах ПГС. Ложноотрицательный результат, в свою очередь, приведет к переносу эмбриона с аномальным кариотипом, в результате чего может произойти выкидыш, либо начнет развиваться плод с хромосомными аномалиями. Отчасти подобные результаты являются причиной того, что эффективность циклов ЭКО с ПГС редко превышает 70 %. Некоторые авторы считают, что существует вероятность того, что любые клетки, биопсированные из эмбриона, не могут в полной мере отражать истинный хромосомный статус плода [Bazrgar et al., 2013; Munne et al., 2016].

В 2013 году была опубликована первая работа, свидетельствующая о наличии во внутриполостной жидкости бластоцисты внеклеточной ДНК (внДНК) [Palini et al., 2013]. Авторам удалось провести полногеномную амплификацию этой фракции ДНК с последующей гибридизацией на микрочипах, а также выполнить тестирование моногенных мутаций с помощью ПЦР. Использование внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости бластоцисты, теоретически, может решить проблему изучения и диагностики хромосомного мозаицизма. Наиболее вероятно, что ее источником становятся эмбриональные клетки, повергшиеся апоптозу. Таким образом, анализ внутриполостной жидкости впервые дает возможность оценить частоту и разнообразие анеуплоидий в клетках, элиминировавших в процессе раннего развития эмбриона. Результаты первых, пока еще немногочисленных исследований, посвященных молекулярному

кариотипированию внеклеточной ДНК, оказались противоречивыми. В некоторых исследованиях сравнение молекулярных кариотипов полярных тел, бластомеров, клеток трофэктодермы, целой бластоцисты и внДНК показало высокую степень соответствия [Gianaroli et а1., 2014; Magli et а1., 2016; Kuznyetsov et а1., 2018]. Другие исследователи, наоборот, продемонстрировали отсутствие совпадения молекулярных кариотипов, либо их частичное соответствие [Рег1ое et а1., 2013; ТоЫег et а1., 2015].

Сопоставление результатов молекулярного кариотипирования ДНК из тканей бластоцисты и ДНК из внутриполостной жидкости может позволить проследить источник происхождения хромосомной аномалии, а также определить цитогенетические и онтогенетические механизмы ее возникновения. Выявление одной анеуплоидии одновременно как в эмбриобласте, так и в трофэктодерме может указывать на ее мейотическое происхождение и говорить о том, что она представлена во всех клетках или подавляющем большинстве клеток бластоцисты. В то же время обнаружение трисомных и моносомных по одной и той же паре гомологичных хромосом клеточных клонов при анализе разных компартментов бластоцисты будет свидетельствовать о вероятном постзиготическом происхождении данной хромосомной аберрации, которая сформировалась вследствие однократного события нерасхождения хромосом при митотическом делении клеток. Кроме того, сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ разных компартментов бластоцисты позволяет получить ответы на ряд фундаментальных и прикладных вопросов генетики развития. Какова частота и спектр летальных хромосомных мутаций на преимплантационных этапах развития? Какова частота хромосомного мозаицизма, в том числе межтканевого, в бластоцистах человека? Какие цитогенетические механизмы обусловливают формирование мозаичной хромосомной конституции у эмбриона, а какие способствуют элиминации клеток с хромосомными аномалиями и ведут к нормализации кариотипа? Существуют ли отличия в селекции анеуплоидных клеток в трофэктодерме и внутренней клеточной массе? В какой степени ДНК во внутриполостной жидкости бластоцисты отражает кариотип клеток эмбриона?

Какое влияние оказывает хромосомный мозаицизм в клетках бластоцисты на состав ДНК во внутриполостной жидкости? Как можно использовать бластоцентез для увеличения эффективности процедур ПГС? На анализ этих вопросов и направлено настоящее исследование.

Степень научной разработанности темы исследования:

В последние годы опубликована серия работ, посвященных молекулярно-цитогенетическому анализу внДНК из внутриполостной жидкости бластоцист человека [Рег1ое et а1., 2013; Gianaroli et а1., 2014; Wemer et а1., 2014; ТоЫег et а1., 2015; Magli е1 а!., 2016; Kuznyetsov et а!., 2018], в которых были представлены результаты сопоставления молекулярных кариотипов бластомеров, клеток трофэктодермы (ТЭ), целых бластоцист и внДНК. Однако ни в одном из них не было проведено сравнение молекулярных кариотипов, реконструированных по анализу внеклеточной ДНК внутриполостной жидкости бластоцисты и двух ее компартментов - трофэктодермы и эмбриобласта (ЭБ). Кроме того, результаты этих исследований крайне противоречивы.

Цель исследования:

Установить и сопоставить разнообразие числовых хромосомных мутаций в различных компартментах бластоцисты на преимплантационных этапах развития человека (в трофэктодерме, эмбриобласте и внеклеточной ДНК из полости бластоцеля) в условиях культивирования in vitro.

Задачи исследования:

1. Определить спектр и частоту числовых хромосомных аномалий в клетках трофэктодермы, эмбриобласта, и во внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости бластоцист человека.

2. Исследовать зависимость частоты числовых хромосомных аномалий в различных компартментах бластоцисты от возраста женщины, стадии развития и морфологических характеристик бластоцист.

3. Оценить соответствие хромосомных наборов клеток трофэктодермы, эмбриобласта и молекулярного кариотипа, реконструированного по анализу внеклеточной ДНК.

4. Установить частоту внутри- и межтканевого хромосомного мозаицизма на стадии бластоцисты.

5. Оценить частоту постзиготических ошибок сегрегации хромосом на основе идентификации реципрокных анеуплоидий.

6. Сравнить чувствительность и специфичность методов микроматричной сравнительной геномной гибридизации и массового параллельного секвенирования при анализе ДНК из внутриполостной жидкости бластоцисты, эмбриобласта и трофэктодермы.

Научная новизна

В ходе настоящего исследования впервые проведено сравнение молекулярных кариотипов клеток трофэктодермы, эмбриобласта и молекулярного кариотипа, реконструированного по анализу внеклеточной ДНК, содержащейся во внутриполостной жидкости бластоцисты. Полученные результаты

свидетельствуют о низкой степени соответствия молекулярных кариотипов исследованных компартментов бластоцист. Сравнительный анализ кариотипов различных компартментов бластоцисты продемонстрировал недооценку частоты хромосомного мозаицизма на стадии бластоцисты у эмбрионов человека. За счет выявления анеуплоидий, присутствующих исключительно во внутриполостной жидкости, был оценен спектр хромосомных аберраций, клетки с которыми наиболее вероятно элиминируются в ходе преимплантационного развития. Продемонстрировано наличие механизмов коррекции аномального эмбрионального кариотипа на стадии бластоцисты. Благодаря регистрации феномена реципрокных анеуплоидий (наличие в бластоцисте клеточных клонов с трисомией и с моносомией по одной и той же паре гомологичных хромосом) впервые получена минимальная оценка частоты митотических ошибок, ведущих к возникновению de novo числовых хромосомных аномалий в мозаичной форме. Впервые установлено, что не менее чем 32 % мозаичных форм числовых хромосомных аномалий возникает вследствие de novo митотических ошибок сегрегации хромосом на преимплантационных этапах развития.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные расширяют представления о спектре и частоте анеуплоидий, а также об уровне хромосомного мозаицизма в трофэктодерме и эмбриобласте бластоцист человека. Результаты работы указывают на возможность дифференциации механизма происхождения числовых хромосомных аберраций за счет регистрации феномена реципрокных анеуплоидий. Впервые показано, что внеклеточная ДНК из полости бластоцисты может быть использована как важный, дополнительный к стандартной биопсии трофэктодермы, источник информации о кариотипе эмбриона при проведении ПГС. Вместе с тем, использование внДНК в качестве единственного материала для проведения ПГС хромосомных аномалий не представляется возможным.

Методологическая основа диссертационного исследования

Научная идея исследования заключается в том, что разделение эмбриобласта и трофэктодермы бластоцист, забор их внутриполостной жидкости и молекулярное кариотипирование этих образцов позволяет получить уникальные данные о хромосомной конституции эмбрионов на стадии бластоцисты, ранее не представленные в литературе. Все бластоцисты были получены в ОАГУЗ «Областной перинатальный центр» (г. Томск) и ООО «Красноярский центр репродуктивной медицины» в случаях отказа пациентов от хранения бластоцист после завершения цикла ЭКО и подписания пациентами информированного согласия. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с Федеральным законом «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21.11.2011 № 323-ф3. Перед началом работы было получено разрешение комитета по биоэтике Биологического института Национального Исследовательского Томского Государственного Университета.

Для выявления анеуплоидий в бластоцистах был использован метод метафазной сравнительной геномной гибридизации (CGH), с помощью которого были получены молекулярные кариотипы 14 бластоцист, и метод микроматричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH), с помощью которого было проанализировано 15 бластоцист. Данные экспериментальные исследования были выполнены на базе Центра коллективного пользования научно-исследовательским оборудованием и экспериментальным биологическим материалом «Медицинская геномика» с использованием ресурсов биологической коллекции «Биобанк населения Северной Евразии» (НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ, г. Томск). Оценка уровня хромосомного мозаицизма была проведена с помощью метода массового параллельного секвенирования (MPS) на базе ЦКП «Медицинская геномика» НИИ Медицинской генетики Томского НИМЦ и на базе Университета Тарту (г. Тарту, Эстония).

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Молекулярный кариотип, реконструированный по анализу внеклеточной ДНК, демонстрирует низкую степень соответствия хромосомным наборам клеток трофэктодермы и эмбриобласта, составляющую 8 % и 9 %, соответственно. В то же время, соответствие хромосомных наборов клеток эмбриобласта и трофэктодермы достигает 41 %.

2. Формирование 32 % числовых хромосомных аберраций связано с de novo постзиготическими ошибками сегрегации хромосом в преимплантационном периоде развития человека, что подтверждается регистрацией феномена реципрокных анеуплоидий.

Степень достоверности результатов проведенных исследований

Высокая степень достоверности данных, полученных в ходе выполнения настоящей работы, обеспечивается использованием современных молекулярно-цитогенетических и эмбриологических методов исследования, а также статистической обработкой полученных результатов.

Личный вклад автора

Основные результаты настоящего исследования получены автором самостоятельно, либо в ходе совместной работы с коллегами из лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ и Университета Тарту (г. Тарту, Эстония). Изучение литературы по теме диссертации, экспериментальная работа, анализ, обобщение и статистическая обработка результатов, написание диссертации выполнены лично автором. Диссертант участвовал на всех этапах обсуждения полученных результатов и их опубликования.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертационной работы были представлены на региональной школе для врачей акушеров-гинекологов, педиатров «Профилактика и оптимизация пренатальной диагностики врожденных пороков развития» (Томск, 2015);

Международной научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы медицинской генетики» (Томск, 2016); VII Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология живых систем» (Москва-Звенигород, 2016); Международной конференции «Хромосомы и митоз» (Новосибирск, 2016); II Всероссийской конференции с международным участием «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, 2017); конференции молодых ученых «День открытых дверей Томского НИМЦ: встреча у кардиологов» (Томск, 2017); XI научной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2017); научном семинаре в Институте молекулярной и клеточной биологии Университета г. Тарту, Эстония (Тарту, 2017); Конгрессе молодых ученых «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины» (Томск, 2018).

Исследование выполнено при поддержке гранта РФФИ № 15-04-08265.

Публикации

По теме исследования опубликовано 22 работы, в том числе 8 статей в журналах Перечня ВАК РФ, из них 3 статьи в журналах, реферируемых в базе данных Web of Science, 1 статья в издании, входящем в базу данных Scopus, 4 статьи в журналах, индексируемых в базе данных РИНЦ. 16 публикаций - статьи в сборниках и тезисы конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и включает введение, основные главы (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты и обсуждение), выводы, список литературы и 3 приложения. Работа иллюстрирована 32 рисунками, 19 таблицами. Библиография включает 165 литературных источника, из них 10 источников отечественной и 155 источников зарубежной литературы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Внеклеточная ДНК во внутриполостной жидкости бластоцисты

В ходе преимплантационного этапа развития эмбрион в процессе кавитации переходит со стадии морулы к стадии бластоцисты. Отличительной чертой данной стадии является формирование эпителия трофэктодермы и полости, заполненной жидкостью. Формирование и последующее расширение этой полости важно для дальнейшей дифференциации эмбриобласта и выхода эмбриона из гликопротеиновой оболочки zona pellucida [Biggers et al., 1978]. Еще до начала кавитации наружный слой клеток морулы содержит зарождающуюся трофэктодерму и морфологически поляризован. Существует гипотеза, что такая поляризация является предпосылкой к началу кавитации [Wiley, 1988]. Трофэктодерма на преимплантационном этапе представляет собой транспортирующий эпителий. При ее дифференциации на молекулярном и клеточном уровнях происходят события, которые приводят к формированию эпителиальных связывающих комплексов [Collins, Fleming, 1995; Fleming et al., 2001]. Благодаря Е-кадгерину, расположенному на боковых поверхностях клеточных мембран, с помощью кальций-зависимых механизмов между клетками трофэктодермы формируются плотные соединения [Yurdakan et al., 2008; Stemmler, 2008]. В результате чего, в слое клеток трофэктодермы образуются апикальные и базолатеральные мембранные домены, которые облегчают перенос ионов Na+ и жидкости для образования бластоцеля [Watson, Barcroft, 2001]. Этот транспорт находится под контролем Na/К-АТФазы, которая локализована в базолатеральных мембранах трофэктодермы [Kidder, 2002]. Увеличение активности Na/К-АТФазы происходит одновременно с наступлением кавитации [Barcroft et al., 2004]. Векторный перенос ионов из среды в бластоцель генерирует осмотический градиент, благодаря которому жидкость проходит через этот эпителий [Manejwala et al., 1989]. Жидкость, которая поступает внутрь бластоцисты через аквапорины (AQP) накапливается и расширяет внутреннее пространство бластоцисты,

способствуя образованию полости - бластоцели [Barcroft et al., 2003]. Эти процессы происходят на 4-5 день после оплодотворения, после чего истончается блестящая оболочка Zona pellucida и бластоциста «вылупляется» из нее. В этот момент эмбрион может имплантироваться в матку.

Исследовательская группа под руководством Palini сообщила о том, что во внутриполостной жидкости бластоцисты присутсвует внеклеточная ДНК [Palini et al., 2013]. Наиболее вероятно, что источником этой ДНК становятся клетки эмбриона, подвергшиеся апоптозу или аутофагии. Программируемая клеточная гибель присутствует на преимплантационной стадии развития, в начале имплантации и при образовании плаценты [Parr et al., 1987; Welsh, Enders, 1993; Jurisicova et al., 1995]. Однако причины, по которым клетки подвергаются апоптозу, до сих пор окончательно не выяснены. Возможно, он задействован в клеточной дифференцировке в ходе ранних этапов онтогенеза, потому что в ходе апоптоза происходит ликвидация функционально неполноценных клеток [Hardy, 1999].

Существуют данные, указывающие на то, что клетки из эмбриобласта подвергаются апоптозу значительно чаще, чем клетки трофэктодермы (Рисунок 1). Болтон с соавторами проводили моделирование хромосомного мозаицизма на преимплантационном этапе развития с помощью создания химерных мышиных эмбрионов с различными пропорциями нормальных и анеуплоидных клеток [Bolton et al., 2016]. В работе было показано, что клетки в эмбриобласте (30,9 %) подвергались апоптозу намного чаще, чем в трофэктодерме (2,0 %). Кроме того, оказалось, что преимущественно из тканей исключаются именно анеуплоидные клетки. В эмбриобласте 41,4 % клеток аномального клона и 19,5 % клеток контрольного клона с нормальным кариотипом подверглись апоптозу. Для трофэктодермы эти показатели составили 3,3 % и 0,6 %. Авторы отмечают, что, поскольку наиболее часто элиминируются анеуплоидные клетки, то, вероятно, сестринские клетки с одинаковым кариотипом будут иметь общую судьбу в ходе преимплантационного развития. Данное предположение было подтверждено экспериментально. Частота пар сестринских бластомеров, подвергшихся апоптозу, оказалась статистически значимо выше, чем можно было бы ожидать при

случайной гибели клеток (13,3 % против 5,6 %, при p < 0,001). Более того, процент пар бластомеров, которые сохранились в бластоцисте, также был больше, чем при случайном апоптозе (66,0 % против 58,2 %, р < 0,01). Представленные данные свидетельствуют о том, что аномальные клетки активно исключаются из эмбриобласта химерных мозаичных эмбрионов с помощью апоптоза в ходе преимплантационного развития эмбриона. В другом исследовании на мышиных бластоцистах было продемонстрировано, что индекс клеток, подвергшихся апоптозу в эмбриобласте (10-20 %), выше, чем в трофэктодерме (3 %) [Hardy, 1997]. В мировой литературе представлены исследования, подтверждающие преимущественную клеточную гибель в эмбриобласте [Copp, 1978; Handyside и Hunter, 1986; Hardy и Handyside, 1996], и низкий уровень апоптоза в трофэктодерме у мышиных эмбрионов [Copp, 1978; Hardy и Handyside, 1996; Brison и Schultz, 1997].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Жигалина Дарья Ивановна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баранов В. С. Цитогенетика эмбрионального развития человека / В. С., Баранов, Т. В. Кузнецова // Изд-во: Н-Л. - 2007.

2. Корсак В. С. Регистр центров ВРТ России Отчет за 2010 год / В. С. Корсак, А. А. Смирнова, О. В. Шурыгина // География. - 2006. - Т. 13. - С. 7.

3. Кустаров В. Н. Влияние возраста на частоту наступления беременности в программе ЭКО / В. Н. Кустаров, К. Ю. Боярский // Проблемы репродукции. -1999. - Т. 1. - С. 46-49.

4. Лебедев И. Н. Молекулярно-цитогенетическая характеристика хромосомного дисбаланса в клетках спонтанных абортусов с низкой пролиферативной активностью in vitro / И. Н. Лебедев [и др.] // Генетика. - 2003. - Т. 39 - № 8. -С. 1111.

5. Лебедев И. Н., Назаренко С. А. Тканеспецифичный плацентарный мозаицизм по аутосомным трисомиям у спонтанных абортусов человека: механизмы формирования и фенотипические эффекты / И. Н. Лебедев, С. А. Назаренко // Генетика. - 2001. - Т. 37. - № 11. - С. 1459-1474.

6. Лебедев И. Н., Никитина Т. В. Цитогенетика нарушений эмбрионального развития человека. Под редакцией В.П. Пузырёва / И. Н.Лебедев, Т. В. Никитина // Изд-во: ООО "Печатная мануфактура" - 2013. - Т. 10. - С. 124.

7. Романова Н. В. Применение преимплантационной диагностики в комплексной оценке эмбриона для селективного переноса / Н. В. Романова [и др.] // Проблемы репродукции. - 2010. - Т. 6. - С. 75-78

8. Скрябин Н. А. Молекулярное кариотипирование внеклеточной ДНК из жидкости бластоцеля как основа неинвазивного преимплантационного генетического скрининга анеуплоидий / Н. А. Скрябин [и др.] // Генетика. -2015. - Т. 51 - № 11. - C. 1301-1307.

9. Шафеи Р. А. Хетчинг бластоцисты у человека / Р. А. Шафеи [и др.] // Онтогенез. - 2017. - Т. 48. - № 1. - С. 8-20.

10. Almeida P. A. The effect of temperature fluctuations on the cytoskeletal organisation and chromosomal constitution of the human oocyte / P. A. Almeida, V. N. Bolton // Zygote. - 1995. - V. 3. - № 4. - P. 357-365.

11. Ata B. Array CGH analysis shows that aneuploidy is not related to the number of embryos generated / B. Ata [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2012. - V. 24. - № 6. - P. 614-620.

12. Baart E. B. Preimplantation genetic screening reveals a high incidence of aneuploidy and mosaicism in embryos from young women undergoing IVF / E. B. Baart [et al.] // Hum. Reprod. - 2006. - № 21. - P. 223-233.

13. Balakier H. Spontaneous blastomere fusion after freezing and thawing of early human embryos leads to polyploidy and chromosomal mosaicism / H. Balakier [et al.] // Hum. Reprod. - 2000. - V. 15. - № 11. - P. 2404-2410.

14. Barbash-Hazan S. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential / S. Barbash-Hazan [et al.] // Fertil. Steril. - 2009. - V. 92. - № 3. - P. 890-896.

15. Barcroft L. C. Aquaporin proteins in murine trophectoderm mediate transepithelial water movements during cavitation / L. C. Barcroft [et al.] // Dev. Biol. - 2003. - V. 256. - № 2. - P. 342-354.

16. Barcroft L. C. Deletion of the Na/K-ATPase a1-subunit gene (Atp1a1) does not prevent cavitation of the preimplantation mouse embryo / L. C. Barcroft [et al.] // Mech. Dev. - 2004. - V. 121. - № 5. - P. 417-426.

17. Bazrgar M. Self-correction of chromosomal abnormalities in human preimplantation embryos and embryonic stem cells / M. Bazrgar [et al.] // Stem Cells and Development. - 2013. - V. 22. - № 17. - P. 2449-2456.

18. Bielanska M. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro, incidence, type, and relevance to embryo outcome / M. Bielanska, S. L. Tan, A. Ao // Hum. Reprod. - 2002. - V. 17. - № 2. - P. 413-419.

19. Biggers J. D. Inhibition of hatching of mouse blastocysts in vitro by prostaglandin antagonists / J. D. Biggers [et al.] // Biol. Reprod. - 1978. - V. 19. - № 3. - P. 519533.

20. Bolton H. Mouse model of chromosome mosaicism reveals lineage-specific depletion of aneuploid cells and normal developmental potential / H. Bolton [et al.] // Nature communications. - 2016. - V. 7. - P. 11165.

21. Braude P. Human gene expression first occurs between the four- and eight-cell stages of preimplantation development / P. Braude, V. Bolton, S. Moore // Nature - 1988.

- V. 332. - № 6163. - P. 459.

22. Brison D. R. Apoptosis during mouse blastocyst formation: evidence for a role for survival factors including TGF-a / D. R. Brison, R. M. Schultz // Biol. Reprod. -1997. - V. 56. - № 5. - P. 1088-1096.

23. Capalbo A. Detecting mosaicism in trophectoderm biopsies: current challenges and future possibilities / A. Capalbo [et al.] // Hum. Reprod. - 2017. - V. 32. - № 3. - P. 492-498.

24. Carr D. H. Cytogenetics of human reproductive wastage / D. H. Carr // Issues and Reviews in Teratology. - 1983. - V. 1. - P. 33-72.

25. Chang E. M. Use of the natural cycle and vitrification thawed blastocyst transfer results in better in vitro fertilization outcomes: cycle regimens of vitrification thawed blastocyst transfer / E. M. Chang [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. - 2011. - V. 28.

- № 4. - P. 369-374.

26. Chiang T. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes / T. Chiang [et al.] // Curr. Biol. - 2010. - V. 20. -№ 17. - P. 1522-1528.

27. Chow J. F. Array comparative genomic hybridization analyses of all blastomeres of a cohort of embryos from young IVF patients revealed significant contribution of mitotic errors to embryo mosaicism at the cleavage stage / J. F. Chow [et al.] // Reproductive Biology and Endocrinology - 2014. - V. 12. - № 1. - P. 105.

28. Cohen J. Removal of 2 cells from cleavage stage embryos is likely to reduce the efficacy of chromosomal tests that are used to enhance implantation rates / J. Cohen, D. Wells, S. Munne // Fertil. Steril. - 2007. - V. 87. - № 3. - P. 496-503.

29. Collins J. E. Epithelial differentiation in the mouse preimplantation embryo: making adhesive cell contacts for the first time / J. E. Collins, T. P. Fleming // Trends in biochemical sciences. - 1995. - V. 20. - № 8. - P. 307-312.

30. Coonen E. Anaphase lagging mainly explains chromosomal mosaicism in human preimplantation embryos / Coonen E. [et al.] // Hum. Reprod. - 2004. - V. 19. - №2 2.

- P. 316-324.

31. Copp A. J. Interaction between inner cell mass and trophectoderm of the mouse blastocyst I. A study of cellular proliferation // Development. - 1978. -V. 48. - № 1. - P. 109-125.

32. Cutting R. Elective single embryo transfer: guidelines for practice British Fertility Society and Association of Clinical Embryologists / R. Cutting [et al.] // Human Fertility. - 2008. - V. 11. - № 3. - P. 131-146.

33. D'Alessandro A. A mass spectrometry-based targeted metabolomics strategy of human blastocoele fluid: a promising tool in fertility research / A. D'Alessandro [et al.] // Mol. BioSyst. - 2012. - V. 8. - № 4. - P. 953-958.

34. Daphnis D. D. Analysis of the evolution of chromosome abnormalities in human embryos from Day 3 to 5 using CGH and FISH / D. D. Daphnis [et al.] // MHR-Basic Science of Reproductive Medicine. - 2008. - V. 14. - № 2. - P. 117-125.

35. Daphnis D. D. Detailed FISH analysis of day 5 human embryos reveals the mechanisms leading to mosaic aneuploidy / D. D. Daphnis [et al.] // Hum. Reprod.

- 2005. - V. 20. - № 1. - P. 129-137.

36. Delhanty J. D. A. Detection of aneuploidy and chromosomal mosaicism in human embryos during preimplantation sex determination by fluorescent in situ hybridisation (FISH) / J. D. A. Delhanty [et al.] // Hum. Mol. Genet. - 1993. - V. 2.

- № 8. - P. 1183-1185.

37. Delhanty J. D. A. Multicolour FISH detects frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal preimplantation embryos from fertile patients / J. D. A. Delhanty [et al.] // Hum. Genet. - 1997. - V. 99. - № 6. - P. 755-760.

38. Delhanty J. D. A. The origins of genetic variation between individual human oocytes and embryos: implications for infertility // Hum. Fertil. - 2013. - V. 16. - № 4. - P. 241-245.

39. Dutton F. L., Chovnick A. A method for recovering strand-specific probes from nick-translated DNA fragments //Analytical biochemistry. - 1984. - T. 140. - №. 1. - C. 121-128.

40. Edmonds D. K. Embryonic mortality in women / D. K. Edmonds [et al.] // Fertil. Steril. - 1982. - V. 38. - № 4. - P. 447-453

41. Eiben B. Cytogenetic analysis of 750 spontaneous abortions with the direct-preparation method of chorionic villi and its implications for studying genetic causes of pregnancy wastage / B. Eiben [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 1990. - V. 47. - P. 656-663.

42. Esfandiari N. Human embryo mosaicism: did we drop the ball on chromosomal testing? / N. Esfandiari, M. E. Bunnell, R. F. Casper // J. Assist. Reprod. Genet. -2016. - V. 33. - № 11. - P. 1439-1444.

43. Evsikov S. Mosaicism in the inner cell mass of human blastocysts / S. Evsikov, Y. Verlinsky // Hum. Reprod. - 1998. - V. 13. - № 11. - P. 3151-3155.

44. Feichtinger M. Increasing live birth rate by preimplantation genetic screening of pooled polar bodies using array comparative genomic hybridization / M. Feichtinger [et al.] // PLoS One. - 2015. - V. 10. - № 5. - P. e0128317.

45. Fleming T. P. Cell adhesion in the preimplantation mammalian embryo and its role in trophectoderm differentiation and blastocyst morphogenesis / T. P. Fleming, B. Sheth, I. Fesenko // Front. Biosci. - 2001. - V. 6. - № 1. - P. D1000-D1007.

46. Fragouli E. Analysis of implantation and ongoing pregnancy rates following the transfer of mosaic diploid-aneuploid blastocysts / E. Fragouli [et al.] // Hum. Genet. - 2017. - V. 136. - № 7. - P. 805-819.

47. Fragouli E. Comparative genomic hybridization analysis of human oocytes and polar bodies / E. Fragouli [et al.] // Hum. Reprod. - 2006. - V. 21. - № 9. - P. 2319-2328.

48. Fragouli E. Comprehensive chromosome screening of polar bodies and blastocysts from couples experiencing repeated implantation failure / E. Fragouli [et al.] // Fertil. Steril. - 2010. - V. 94. - P. 875-887.

49. Fragouli E. Comprehensive molecular cytogenetic analysis of the human blastocyst stage / E. Fragouli [et al.] // Hum. Reprod. - 2008. - V. 23. - № 11. - P. 2596-2608.

50. Fragouli E. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: scientific data and technical evaluation / E. Fragouli [et al.] // Hum. Reprod. - 2011. - V. 26 - № 2. - P. 480-490.

51. Fragouli E. The developmental potential of mosaic embryos / E. Fragouli [et al.] // Fertil. Steril. - 2015. - V. 104. - № 3. - P. e96.

52. Fragouli E. The origin and impact of embryonic aneuploidy / E. Fragouli [et al.] // Hum. Genet. - 2013. - V. 132. - P. 1001-1013.

53. Franasiak J. M. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening / J. M. Franasiak [et al.] // Fertil. Steril. -2014. - V. 101. - № 3. - P. 656-663. e1.

54. Garcia-Ferreyra J. High aneuploidy rates observed in embryos derived from donated oocytes are related to male aging and high percentages of sperm DNA fragmentation / J. Garcia-Ferreyra [et al.] // Clin. Med. Insights. Reprod. Health. -2015. - V. 9. -P. CMRH. S32769.

55. Gardner D. K. Culture and transfer of human blastocysts / D. K. Gardner, W. B. Schoolcraft // Current opinion in obstetrics & gynecology. - 1999. - V. 11. - № 3. -P. 307.

56. Gianaroli L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study / L. Gianaroli [et al.] // Fertil. Steril. - 2014. - V. 102. -№ 6. - P. 1692-1699. e6.

57. Gleicher N. Accuracy of preimplantation genetic screening (PGS) is compromised by degree of mosaicism of human embryos / N. Gleicher [et al.] // Reprod. Biol. Endocrinol. - 2016. - V. 14. - № 1. - P. 54.

58. Gleicher N. Is it time for a paradigm shift in understanding embryo selection? / N. Gleicher, V. A. Kushnir, D. H. Barad // Reprod. Biol. Endocrinol. - 2015. - V. 13. -№ 1. - P. 3.

59. Gleicher N. Is the hypothesis of preimplantation genetic screening (PGS) still supportable? A review / N. Gleicher, R. Orvieto // Journal of ovarian research. -2017. - V. 10. - № 1. - P. 21.

60. Golubovsky M. D. Postzygotic diploidization of triploids as a source of unusual cases of mosaicism, chimerism and twinning // Hum. Reprod. - 2003. - V. 18. -№ 2. - P. 236-242.

61. Gonzalez-Merino E. Incidence of chromosomal mosaicism in human embryos at different developmental stages analyzed by fluorescence in situ hybridization / E. Gonzalez-Merino [et al.] // Genet. Test. - 2003. - V. 7. - № 2. - P. 85-95.

62. Goodrich D. A randomized and blinded comparison of qPCR and NGS-based detection of aneuploidy in a cell line mixture model of blastocyst biopsy mosaicism / D. Goodrich [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. - 2016. - V. 33. - № 11. - P. 14731480.

63. Grati F. R. An evidence-based scoring system for prioritizing mosaic aneuploid embryos following preimplantation genetic screening / F. R. Grati [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2018. - V. 36. - № 4. - P. 442-449.

64. Greco E. Healthy babies after intrauterine transfer of mosaic aneuploid blastocysts / E. Greco, M. G. Minasi, F. Fiorentino // NEJM. - 2015. - V. 373. - № 21. - P. 20892090. doi: 10.1056/NEJMc1500421.

65. Gueye N. A. Uniparental disomy in the human blastocyst is exceedingly rare / N. A. Gueye [et al.] // Fertil. Steril. - 2014. - V. 101. - № 1. - P. 232-236.

66. Haddad G. Mosaic pregnancy after transfer of a "euploid" blastocyst screened by DNA microarray / G. Haddad [et al.] // Journal of ovarian research. - 2013. - V. 6. - № 1. - P. 70.

67. Handyside A. H. Cell division and death in the mouse blastocyst before implantation / A. H. Handyside, S. Hunter // Roux's archives of developmental biology. - 1986. -V. 195. - № 8. - P. 519-526.

68. Hardy K. Apoptosis in the human embryo // Reviews of Reproduction. - 1999. -V. 4. - № 3. - P. 125-134.

69. Hardy K. Binucleate blastomeres in preimplantation human embryos in vitro: failure of cytokinesis during early cleavage / K. Hardy, R. M. Winston, A. H. Handyside // J. Reprod. Fertil. - 1993. - V. 98. - № 2. - P. 549-558.

70. Hardy K. Cell death in the mammalian blastocyst // Molecular human reproduction.

- 1997. - V. 3. - № 10. - P. 919-925.

71. Hardy K. Metabolism and cell allocation during parthenogenetic preimplantation mouse development / K. Hardy, A. H. Handyside // Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research. - 1996. - V. 43. - № 3. - P. 313322.

72. Harton G. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for organization of a PGD centre for PGD/preimplantation genetic screening / G. Harton [et al.] // Hum. Reprod. - 2011. - V. 26. - № 1. - P. 14-24.

73. Hassold T. The origin of human aneuploidy: Where we have been, where we are going / T. Hassold, H. Hall, P. Hunt // Hum. Mol. Genet. - 2007. - V. 16. - № R2.

- P. R203-R208

74. Hassold T. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy / T. Hassold, P. Hunt // Nature Reviews Genetics. - 2001. - V. 2. - № 4. - P. 280.

75. Huang J. Yan Re-analysis of aneuploidy blastocysts with an inner cell mass and different regional trophectoderm cells / J. Yan Huang [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. - 2017. - V. 34. - № 4. - P. 487-493.

76. Jamieson M. E. The chromosome constitution of human preimplantation embryos fertilized in vitro / M. E. Jamieson, J. R. T. Coutts, J. M. Connor // Hum. Reprod. -1994. - V. 9. - № 4. - P. 709-715.

77. Jaroudi S. Expression profiling of DNA repair genes in human oocytes and blastocysts using microarrays / S. Jaroudi [et al.] // Hum. Reprod. - 2009. - V. 24. -№ 10. - P. 2649-2655.

78. Johnson D. S. Comprehensive analysis of karyotypic mosaicism between trophectoderm and inner cell mass / D. S. Johnson [et al.] // Mol. Hum. Reprod. -2010. - V. 16. - № 12. - P. 944-949.

79. Jones K. T. Meiosis in oocytes: Predisposition to aneuploidy and its increased incidence with age // Hum. Reprod. Update - 2008. - V. 14. - № 2. - P. 143-158.

80. Jurisicova A. Involvement of programmed cell death in preimplantation embryo demise / A. Jurisicova, S. Varmuza, R. F. Casper // Hum. Reprod. Update. - 1995. -V. 1. - № 6. - P. 558-566.

81. Katz-Jaffe M. G. Chromosome 21 mosaic human preimplantation embryos predominantly arise from diploid conceptions / M. G. Katz-Jaffe, A. O. Trounson, D. S. Cram // Fertil. Steril. - 2005. - V. 84. - № 3. - P. 634-643.

82. Katz-Jaffe M. G. Mitotic errors in chromosome 21 of human preimplantation embryos are associated with non-viability / M. G. Katz-Jaffe, A. O. Trounson, D. S. Cram // Mol. Hum. Reprod. - 2004. - V. 10. - № 2. - P. 143-147.

83. Kidder G. M. Trophectoderm development and function: the roles of Na+/K+-ATPase subunit isoforms // Canadian journal of physiology and pharmacology. -2002. - V. 80. - № 2. - P. 110-115.

84. Kroener L. The effect of timing of embryonic progression on chromosomal abnormality / L. Kroener [et al.] // Fertil. Steril. - 2012. - V. 98. - № 4. - P. 876880.

85. Kuliev A. Chromosomal abnormalities in a series of 6,733 human oocytes in preimplantation diagnosis for age-related aneuploidies / A. Kuliev [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2003. - V. 6. - № 1. - P. 54-59.

86. Kuliev A. Meiotic and mitotic nondisjunction: lessons from preimplantation genetic diagnosis / A. Kuliev, Y. Verlinsky // Hum. Reprod. Update. - 2004. - V. 10. - № 5.

- p. 401-407.

87. Kung A. Validation of next-generation sequencing for comprehensive chromosome screening of embryos / A. Kung [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2015. - V. 31.

- № 6. - P. 760-769.

88. Kuznyetsov V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach / V. Kuznyetsov [et al.] // PloS one. - 2018. - V. 13. - № 5. - P. e0197262.

89. Lebedev I. Mosaic aneuploidy in early fetal losses // Cytogenet. Genome Res. -2011. - V. 133. - № 2-4. - P. 169-183.

90. Lee E. The clinical effectiveness of preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy in all 24 chromosomes (PGD-A): systematic review / E. Lee [et al.] // Hum. Reprod.

- 2014. - V. 30. - № 2. - P. 473-483.

91. Li L. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis / L. Li, B. Baibakov, J. Dean // Dev. Cell. - 2008. - V. 15. - № 3. -P. 416-425.

92. Liu J. DNA microarray reveals that high proportions of human blastocysts from women of advanced maternal age are aneuploid and mosaic / J. Liu [et al.] // Biology of reproduction. - 2012. - V. 87. - № 6. - P. 148, 1-9

93. Lledo B. Implantation potential of mosaic embryos / Lledo B. [et al.] // Systems biology in reproductive medicine. - 2017. - V. 63. - № 3. - P. 206-208.

94. Los F. J. The development of cytogenetically normal, abnormal and mosaic embryos: a theoretical model / F. J. Los, D. Van Opstal, C. van den Berg // Hum. Reprod. Update. - 2004. - V. 10. - № 1. - P. 79-94.

95. Los F. J. Uniparental disomy with and without confined placental mosaicism: a model for trisomic zygote rescue / Los F. J. [et al.] // Prenat. Diagn. - 1998. - V. 18.

- № 7. - P. 659-668.

96. Macer M. L. Improved pregnancy rates following transfer of euploid embryos screened by next-generation sequencing compared to array comparative genomic hybridization / M. L. Macer [et al.] // Fertil. Steril. - 2017. - V. 107. - № 3. - P. e27-e28.

97. Magli M. C. Paternal contribution to aneuploidy in preimplantation embryos / M. C. Magli [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2009. - V. 18. - № 4. - P. 536-542.

98. Magli M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid? / M. C. Magli [et al.] // Fertil. Steril. -2016. - V. 105. - № 3. - P. 676-683. e5.

99. Mamas T. Detection of aneuploidy by array comparative genomic hybridization using cell lines to mimic a mosaic trophectoderm biopsy / T. Mamas [et al.] // Fertil. Steril. - 2012. - V. 97. - № 4. - P. 943-947.

100. Manejwala F. M. Blastocoel expansion in the preimplantation mouse embryo: role of extracellular sodium and chloride and possible apical routes of their entry / F. M. Manejwala, Jr E. J. Cragoe, R. M. Schultz // Developmental biology. - 1989. - V. 133. - № 1. - P. 210-220.

101. Mantikou E. Molecular origin of mitotic aneuploidies in preimplantation embryos / E. Mantikou [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. - 2012. - V. 1822. - № 12. - P. 1921-1930.

102. Mantzouratou A. Variable aneuploidy mechanisms in embryos from couples with poor reproductive histories undergoing preimplantation genetic screening A. Mantzouratou [et al.] // Hum. Reprod. - 2007. - V. 22. - № 7. - P. 1844-1853.

103. Mantzouratou, A. Aneuploidy in the human cleavage stage embryo / A. Mantzouratou, J. D. A. Delhanty // Cytogenetic and genome research. - 2011. -V. 133. - № 2-4. - P. 141-148.

104. McArthur S. J. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts / S. J. McArthur [et al.] // Fertil. Steril. - 2005. - V. 84. - № 6. - P. 1628-1636.

105. Menasha J. Incidence and spectrum of chromosome abnormalities in spontaneous abortions: new insights from 12 - year study / J. Menasha [et al.] // Genet. Med. -2005. - V. 7. - № 4. - P. 251-263.

106. Muller U. Second polar body incorporated into a blastomeres results in 46XX/69XXX mixoploidy / U. Muller [et al.] // Journal of Medical Genetics. - 1993. - V. 30. - № 7. - P. 597-600.

107. Munne S. Chromosome abnormalities in human embryos / S. Munne, J. Cohen // Hum. Reprod. Update. - 1998. - V. 4. - № 6. - P. 842-855.

108. Munne S. Chromosome mosaicism in cleavage-stage human embryos: evidence of a maternal age effect / S. Munne [et al.] // Reproduction BioMedicine Online. -2002. - V. 4. - № 3. -P. 223-232

109. Munné S. Detailed investigation into the cytogenetic constitution and pregnancy outcome of replacing mosaic blastocysts detected with the use of high-resolution next-generation sequencing / S. Munné [et al.] // Fertil. Steril. - 2017. - V. 108. - №2 1. - P. 62-71. e8.

110. Munné S. Mosaicism: ''survival of the fittest'' versus ''no embryo left behind'' / S. Munné, J. Grifo, D. Wells // Fertil. Steril. - 2016. - V. 105. - P. 1146-1149.

111. Munné S. Treatment-related chromosome abnormalities in human embryos / S. Munné [et al.] // Hum. Reprod. - 1997. - V. 12. - № 4. - P. 780-784.

112. Murray J. D. Polyploid cells in blastocysts and early fetuses from Australian Merino sheep / J. D. Murray [et al.] // Journal of reproduction and fertility. - 1986. - V. 78.

- № 2. - P. 439-446.

113. Ni J. Folate deficiency in human peripheral blood lymphocytes induces chromosome 8 aneuploidy but this effect is not modified by riboflavin / J. Ni [et al.] // Environ. Mol. Mutagen. - 2010. - V. 51. - № 1. - P. 15-22.

114. Ohsugi M. Maternally derived FILIA-MATER complex localizes asymmetrically in cleavage-stage mouse embryos / M. Ohsugi [et al.] // Development. -2008. - V. 135.

- № 2. - P. 259-269.

115. Orvieto R. Should preimplantation genetic screening be implemented to routine clinical practice? / R. Orvieto [et al.] // Gynecol. Endocrinol. - 2016. - V. 32. - №2 6.

- P. 506-508.

116. Ottolini C. S. Karyomapping identifies second polar body DNA persisting to the blastocyst stage: implications for embryo biopsy / C. S. Ottolini [et al.] // Reprod. Biomed. Online. - 2015. - V. 31. - № 6. - P. 776-782.

117. Palini S. Genomic DNA in human blastocoele fluid / S. Palini [et al.] // Reproductive Biomedicine Online. - 2013. - V. 26. - № 6. - P. 603-610.

118. Parr E. L. Apoptosis as the mode of uterine epithelial cell death during embryo implantation in mice and rats / E. L. Parr, H. N. Tung, M. B. Parr // Biol. Reprod. -1987. - V. 36. - № 1. - P. 211-225.

119. Pellestor F. Maternal aging and chromosomal abnormalities: new data drawn from in vitro unfertilized human oocytes / F. Pellestor [et al.] // Hum. Genet. - 2003. - V. 112. - № 2. - P. 195-203.

120. Perloe M. Validation of blastocoele fluid aspiration for preimplantation genetic screening using array comparative genomic hybridization (aCGH) / M. Perloe [et al.] // Fertil. Steril. - 2013. - V. 100. - № 3. - P. S208.

121. Platteau P. et al. Preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in women older than 37 years / P. Platteau [et al.] // Fertil. Steril. - 2005. - V. 84. - № 2. - P. 319-324.

122. Poli M. The blastocoel fluid as a source of DNA for preimplantation genetic diagnosis and screening / M. Poli [et al.] // Fertil. Steril. - 2013. - V. 100. - № 3. -P. S37.

123. Rius M. Comprehensive embryo analysis of advanced maternal age-related aneuploidies and mosaicism by short comparative genomic hybridization / M. Rius [et al.] // Fertil. Steril. - 2011. - V. 95 - № 1. - P. 413-416.

124. Rosenbusch B. Triploidy caused by endoreduplication in a human zygote obtained after in-vitro fertilization / B. Rosenbusch, M. Schneider, K. Sterzik // Hum. Reprod. - 1997. - V. 12. - № 5. - P. 1059-1061.

125. Rule K. N. Blastocoel cell-free DNA, a marker of embryonic quality / Rule K. N. [et al.] // Fertil. Steril. - 2017. - V. 108. - № 3. - P. e106.

126. Sachdev N. M. Diagnosis and clinical management of embryonic mosaicism / N. M. Sachdev [et al.] // Fertil. Steril. - 2017. - V. 107. - № 1. - P. 6-11.

127. Sandalinas M. Development ability of chromosomally abnormal human embryos to develop to the blastocyst stage / M. Sandalinas [et al.] // Hum. Reprod. - 2001. - V. 16. - № 9. - P. 1954-1958.

128. Santos M. A. The fate of the mosaic embryo: chromosomal constitution and development of Day 4, 5 and 8 human embryos / M. A. Santos [et al.] // Hum. Reprod. - 2010. - V. 25. - № 8. - P. 1916-1926.

129. Sarto G. E. Endomitosis in human trophoblast / G. E. Sarto, P. A. Stubblefield, E. Therman // Hum. Genet. - 1982. - V. 62. - № 3. - P. 228-232.

130. Sathananthan A. H. Centrioles in the beginning of human development / A. H. Sathananthan [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1991. - V. 88. - № 11. -P. 4806-4810.

131. Schoolcraft W. B. Blastocyst culture and transfer: analysis of results and parameters affecting outcome in two in vitro fertilization programs / W. B. Schoolcraft [et al.] // Fertil Steril. -1999. - V. 72. - № 4. - P. 604-609.

132. Spinella F. Extent of chromosomal mosaicism influences the clinical outcome of in vitro fertilization treatments / F. Spinella [et al.] // Fertil. Steril. - 2017. - V. 108. -№ 3. - P. e272.

133. Stemmler M. P. Cadherins in development and cancer // Mol. Biosyst. - 2008. - V. 4.

- № 8. - P. 835-850. doi: 10.1039/ b719215k.

134. Tarin, J. J. Human embryo biopsy on the 2nd day after insemination for preimplantation diagnosis: removal of a quarter of embryo retards cleavage, / J. J. Tarin [et al.] // Fertil. Steril. - 1992. - V. 58. - № 5. - P. 970-976.

135. Taylor T. H. Technique to 'Map'Chromosomal Mosaicism at the Blastocyst Stage / T. H. Taylor [et al.] // Cytogenetic and genome research. - 2016. - V. 149. - № 4. -P. 262-266.

136. Taylor T. H. The origin, mechanisms, incidence and clinical consequences of chromosomal mosaicism in humans / T. H. Taylor [et al.] // Human reproduction update. - 2014. - V. 20. - № 4. - P. 571-581.

137. Thomas N. S. Maternal sex chromosome non-disjunction: evidence for X chromosome-specific risk factors / N. S. Thomas [et al.] // Hum. Mol. Genet. - 2001.

- V. 10. - № 3. - P. 243-250.

138. Tobler K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. / K. J. Tobler [et al.] // Fertility and sterility. - 2015. - V. 104. - № 2. - P. 418-425.

139. Tobler K. J. Comparative Genomic Hybridization Microarray (aCGH) Analysis of DNA Isolated from the Blastocoel Fluid from 26 Blastocysts / K. J. Tobler [et al.] // Fertil. Steril. - 2014. - V. 101. - № 2. - P. e4.

140. Tong Z. B. Mater, a maternal effect gene required for early embryonic development in mice / Z. B. Tong [et al.] //Nature genetics. - 2000. - V. 26. - № 3. - P. 267.

141. Tortoriello D. V. Reanalysis of human blastocysts with different molecular genetic screening platforms reveals significant discordance in ploidy status / D. V. Tortoriello [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. - 2016. - V. 33. - № 11. - P. 14671471.

142. Traversa M. V. The genetic screening of preimplantation embryos by comparative genomic hybridisation / M. V. Traversa [et al.] // Reprod. Biol. - 2011. - V. 11. - № Suppl 3. - P. 51-60.

143. Treff N. R. Detection of segmental aneuploidy and mosaicism in the human preimplantation embryo: technical considerations and limitations / N. R. Treff, J. M. Franasiak // Fertil. Steril. - 2017. - V. 107. - № 1. - P. 27-31.

144. Treff N. R. Single-cell whole-genome amplification technique impacts the accuracy of SNP microarray-based genotyping and copy number analyses / Treff N. R. [et al.] // Molecular human reproduction. - 2010. - V. 17. - № 6. - P. 335-343.

145. Tsuiko O. Genome stability of bovine in vivo-conceived cleavage-stage embryos is higher compared to in vitro-produced embryos / Tsuiko O. [et al.] // Hum. Reprod.

- 2017. - V. 32. - № 11. - P. 2348-2357.

146. Tuerlings J. Evidence of a second gamete fusion after the first cleavage of the zygote in a 47, XX,+ 18/70, XXX,+ 18 mosaic. A remarkable diploid-triploid discrepancy after CVS / J. Tuerlings [et al.] // Prenatal diagnosis. - 1993. - V. 13. - № 4. - P. 301-306.

147. van Echten-Arends J. Chromosomal mosaicism in human preimplantation embryos: a systematic review / J. van Echten-Arends [et al.] // Hum. Reprod. Update. - 2011.

- V. 17. - № 5. - P. 620-627.

148. Vanneste E. Chromosome instability is common in human cleavage-stage embryos / E. Vanneste [et al.] // Nat. Med. - 2009. - V. 15. - № 5. - P. 577-583.

149. Vera-Rodriguez M. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development / M. Vera-Rodriguez [et al.] // Hum. Reprod. - 2018. - V. 33. - № 4. - P. 745-756.

150. Watson A. J. Regulation of blastocyst formation / A. J. Watson, L. C. Barcroft // Front Biosci. - 2001. - V. 6. - P. D708-D730.

151. Wells D. Comprehensive chromosomal analysis of human preimplantation embryos using whole genome amplification and single cell comparative genomic hybridization / D. Wells, J. D. Delhanty // Mol. Hum. Reprod. - 2000. - V. 6. - № 11.

- P. 1055-1062.

152. Welsh A. O. Chorioallontoic placenta formation in the rat. III. Granulated cells invade the uterine luminal epithelium at the time of epithelial cell death / A. O. Welsh, A. C. Enders // Biol. Reprod. - 1993. - V. 49. - № 1. - P. 38-57.

153. Werner M. D. The accuracy of blastocoel fluid comprehensive chromosomal screening (CCS) is dependent on amplification yield and sequencing depth when using nextgen sequencing / Werner M. D. [et al.] // Fertil. Steril. - 2014. - V. 102.

- № 3. - P. e308-e309.

154. Wilding M. Chaotic mosaicism in human preimplantation embryos is correlated with a low mitochondrial membrane potential / Wilding M. [et al.] // Fertil. Steril. - 2003.

- V. 79. - № 2. - P. 340-346.

155. Wiley L. M. Trophectoderm: the first epithelium to develop in the mammalian embryo // Scanning Microsc. - 1988. -V. 2. - № 1. - P. 417-426.

156. Xu J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization / J. Xu [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2016. - V. 113. - № 42. -P. 11907-11912.

157. Yang Z. Selection of euploid blastocysts for cryopreservation with array comparative genomic hybridization (aCGH) results in increased implantation rates in subsequent frozen and thawed embryo transfer cycles / Yang Z. [et al.] // Molecular cytogenetics.

- 2013. - V. 6. - № 1. - P. 32.

158. Yurdakan G. Expression of adhesion molecules in first trimester spontaneous abortions and their role in abortion pathogenesis / G. Yurdakan [et al.] // Acta obstetricia et gynecologica Scandinavica. - 2008. - V. 87. - № 7. - P. 775-782.

159. Zhang Y. Molecular analysis of DNA in blastocoele fluid using next-generation sequencing / Y Zhang [et al.] // Journal of assisted reproduction and genetics. - 2016. - V. 33. - № 5. - P. 637-645.

160. Zheng H. Application of next-generation sequencing for 24-chromosome aneuploidy screening of human preimplantation embryos / H. Zheng [et al.] // Molecular cytogenetics. - 2015. - V. 8. - № 1. - P. 38.

161. Zheng P. Role of Filia, a maternal effect gene, in maintaining euploidy during cleavage-stage mouse embryogenesis / P. Zheng, J. Dean // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - V. 106. - № 18. - P. 7473-7478.

162. Zhu D. Vitrified-warmed blastocyst transfer cycles yield higher pregnancy and implantation rates compared with fresh blastocyst transfer cycles—time for a new embryo transfer strategy? / Zhu D. [et al.] // Fertil. Steril. - 2011. - V. 95. - № 5. -P. 1691-1695.

163. Ziebe S. FISH analysis for chromosomes 13, 16, 18, 21, 22, X and Y in all blastomeres of IVF pre-embryos from 144 randomly selected donated human oocytes and impact on pre-embryo morphology / S. Ziebe [et al.] // Hum. Reprod. -2003. - V. 18. - № 12. - P. 2575-2581.

Электронные ресурсы:

164. Preimplantation Genetic Diagnosis International Society [Электронный ресурс] : PGDIS position statement on chromosome mosaicism and preimplantation aneuploidy testing at the blastocyst stage // PGDIS Newsletter. 2016. URL: http://www.pgdis.org/docs/newsletter_071816.html. (Дата обращения: 10.07.2018).

165. Руководство по использованию секвенатора MiSeq (Illumina, США) [Электронный ресурс] : MiSeq System Guide. URL: http://sapac.support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/miseq-system-guide-for-local-run-manager-15027617-04.pdf (Дата обращения: 29.07.2018).

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток эмбриобласта и трофэктодермы 14 бластоцист с помощью метафазной CGH

№ эмбриона Возраст матери Стадия развития Внутриполостная жидкость Эмбриобласт Трофэктодерма

1 30 3АА ish cgh dim(16,19) ish cgh епЬ(1,16,19,20,22),ё1т(4) ish cgh ё1т(19,22)

2 30 3АА ish cgh епЬ(4),ё1т(16,17,19,22) ish cgh епЬ(16,19,22) ish cgh enh(14,16),dim(Х)

3 29 3ВВ ish cgh &т(16,17,19) ish cgh епЬ(16,17,19,22) ish cgh dim(16,19)

4 31 3АА Отсутствие продукта ПГА ish cgh епЬ(17,19,22),ё1т(13) ish cgh enh(17),dim(12)

5 31 3ВВ ish cgh епЬ(4,Х),ё1т(7,16) ish cgh(1-22)x2,(XY)x1 ish cgh(1-22)x2,(XY)x1

6 30 3ВВ ish cgh(1-22)x2,(XY)x1 ish cgh enh(16),dim(22,Х) ish cgh епЬ(10,18),а1т(11,19)

7 25 3ВВ ish cgh(1-22)x2,(XY)x1 ish cgh епЬ(1,11,13),а1т(4,5,У) ish cgh dim(Y)

8 27 3ВВ ish cgh епЬ(17,19) ish cgh епЬ(3,Х),а1т(17,19,21) ish cgh епЬ(14,17,19,21),а1т(1,13)

9 31 3ВВ ish cgh(1-22)x2,(XY) х1 ish cgh епЬ(16,17,19,21) ish cgh enh(20,X),dim(15)

10 31 4АА ish cgh dim(16) ish cgh епЬ(16),ё1т(17,19,21) ish cgh enh(3,11,16), &т(17,19,21)

11 33 3АВ ish cgh епЬ(19,20,21),ё1т(4,6) ish cgh dim(19) ish cgh(1-22)x2,(X)x1

о

3

Продолжение ПРИЛОЖЕНИЯ А Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток эмбриобласта и трофэктодермы 14 бластоцист с помощью метафазной CGH

№ эмбриона Возраст матери Стадия развития Внутриполостная жидкость Эмбриобласт Трофэктодерма

11 33 3АВ ish cgh епЬ(19,20,21),а1т(4,6) ish cgh dim(19) ish с§Ь(1-22)Х2,(Х)Х1

12 37 4АА Отсутствие продукта ПГА ish cgh &т(19,20,21) ish cgh enh(1,4,19)

13 25 3ВВ ish cgh епЬ(19,21) ish cgh епЬ(4),а1т(17,19,21) ish cgh епЬ(16,18),а1т(8)

14 25 3ВВ ish cgh enh(19) Отсутствие продукта ПГА ish cgh епЬ(3,13),а1т(19)

о 4

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток эмбриобласта и трофэктодермы 15 бластоцист с помощью микроматричной CGH

№ эмбриона Возраст матери Стадия развития Внутриполостная жидкость Эмбриобласт Трофэктодерма

17 39 3ВВ агт(19р)х3,(9)х1 агг(9)х3 агг(9)х3

18 39 3-4ВВ агт(1)х3,(13)х1 arг(10q)х3,(13)х1 агг(13)х1

19 39 2 агт (2,5)х1,(4,16,Х)х0 агг(10^6)х3,(13,20,21)х1,(4)х0 агг(16)х4,(1,2,6)х3(3,9,17,19,20)х1, (10)х0

20 33 3-4АВ агт(3,6,8,17)х3,(2,7,10)х1 агг(1 -22)х2,(ХУ) х 1 агг(1 -22)х2,(ХУ) х 1

21 33 4ВВ агт(8,11,19,20,21)х3,(7)х1 агг(7)х1 агг(7)х1

22 37 4-5ВВ агт(16,17,19,20)х3, (3,10,12,13,15,22)х1,(9)х0 агг(1-22,Х)х2 агг(9)х3

23 37 4-5АА агт(2,3^11,19)х3 агг(1-22,Х)х2 агг(1-22,Х)х2

24 32 5ВВ агт(Х)х2 arr(10q)х1 arr(10q)х1

25 23 4ВВ агт(1-22,Х)х2 агг(1-22,Х)х2 агт(1-22,Х)х2

26 23 5ВВ агг(1-22,Х)х2 агг(1-22,Х)х2 агг(1-22,Х)х2

27 32 3ВВ агт(19)х3 агт(1-22,Х)х2 агг(1-22,Х)х2

28 32 4ВВ агг(1-22,Х)х2 агг(1-22,Х)х2 агг(1-22,Х)х2

о и*

Продолжение ПРИЛОЖЕНИЯ Б Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток эмбриобласта и трофэктодермы 15 бластоцист с помощью микроматричной CGH

№ эмбриона Возраст матери Стадия развития Внутриполостная жидкость Эмбриобласт Трофэктодерма

29 31 3ВВ Отсутствие продукта ПГА arr(5,15,16q,17q,20p)x3,(X)x0 агт^^^ХХ^^

30 31 2АВ Отсутствие продукта ПГА

31 34 3ВВ Отсутствие продукта ПГА агт^^^ХХ^^ аЦХ^,^^

о 6

ПРИЛОЖЕНИЕ В

Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток

эмбриобласта и трофэктодермы 16 бластоцист с помощью метода MPS

№ эмбриона Возраст матери Стадия развития Внутриполостная жидкость Эмбриобласт Трофэктодерма

MPS-I MPS-II MPS-I MPS-II MPS-I MPS-II

15 32 4BB Отсутствие продукта ПГА Seq(1-22,X)x2 Seq(1-22,X)x2

16 42 3BC Отсутствие продукта ПГА Seq(17)x1, (XY)x1 Seq(17)x1, (XY)x1

17 39 3BB Seq(9)x1,(X)x2 Seq(9)x1,(X)x2 Seq(9)x3, (X)x2 Seq(9)x3,(X)x2 Seq(9)x3, (X)x2 Seq(9)x3,(X)x2

18 39 3-4BB Seq(1)x3, (9q,13)x1, (X,Y)x1 Seq(1)x3, (9q,13)x1, (X,Y)x1 Seq(10q)x3, (13)x1, (X,Y)x1 Seq(10q)x3, (13)x1, (X,Y)x1 Seq(13)x1, (X,Y)x1 Seq(13)x1, (X,Y)x1

19 39 2- Seq(6)x3, (2,5,11,20)x1, (4,16,X,Y)x0 Seq(6)x3, (2,5,11,20)x1, (4,16,X,Y)x0 Seq(6,7,10q, 18)x3,(20)x1, (4)x0, (X,Y)x1 Seq(6,7,10q, 18)x3,(20)x1, (4)x0,(XY)x1 Seq(2,16)x4, (1,5,6,8)x3, (3,9,17,20)x1, (10)x0, (X,Y)x1 Seq(2,16)x4, (1,5,6,8)x3, (3,9,17,20)x1, (10)x0,(X,Y)x1

о

7

Продолжение ПРИЛОЖЕНИЯ В Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток эмбриобласта и трофэктодермы 16 бластоцист с помощью метода MPS

№ эмбриона Возраст матери Стадия развития Внутриполостная жидкость Эмбриобласт Трофэктодерма

MPS-I MPS-II MPS-I MPS-II MPS-I MPS-II

20 33 3-4AB Seq(3,6,8,13,17)x 3, (2,7,10)х1, (Х,У)х1 Seq(1-22)x2, (X,Y)x1 Seq(1-22)x2, (X,Y)x1

21 33 4BB Seq(8,11,18,20, 21)х3,(1,7)х1, (X,Y)x1 Seq(8,11,18,20, 21)х3,(1,7)х1, (Х,У)х1 Seq(7)x1, (X,Y)x1 Seq(7)x1, (X,Y)x1 Seq(7)x1, (X,Y)x1 Seq(7)x1, (X,Y)x1

22 37 4-5BB Seq(14,16,19)x3, (3,10,12,13,15, 22)х1,(9)х0, (X)x2 Seq(14,16,17,19, 20)х3, (3,10,12,13,15, 22)х1,(9)х0, (Х)х2 Seq(1-22,X)x2 Seq(1-22,X)x2 Seq(3,9,10,12, 13,15,22)x3, (20)x1,(X)x2 Seq(3,9,10,12, 13,15,22)x3, (20)x1,(X)x2

23 37 4-5AA Seq(2,3q,11, 19)х3, (9,10,12,13,21)х 1 ,(Х)х1 Seq(2,3q,11,19)x 3,(9,12,13)х 1, (X)x1 Seq(1-22,X)x2 Seq(1-22,X)x2

24 32 5BB Seq(X,Y)x0 Seq(10q)x1, (XY)x1 Seq(10q)x1, (XY)x1

о 8

Продолжение ПРИЛОЖЕНИЯ В Результаты молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК из внутриполостной жидкости, клеток эмбриобласта и трофэктодермы 16 бластоцист с помощью метода MPS

№ эмбриона Возраст матери Стадия развития Внутриполостная жидкость Эмбриобласт Трофэктодерма

MPS-I MPS-II MPS-I MPS-II MPS-I MPS-II

25 23 4BB Seq(1-22,X)x2 Seq(1-22,X)x2 Seq(1-22,X)x2

26 23 5BB Seq(1-22,X)x2 Seq(1-22,X)x2 Seq(1-22,X)x2

27 32 3BB Seq(16,18,19, 21)x3,(X)x2 Seq(1-22,X)x2 Seq(1-22,X)x2

28 32 4BB Отсутствие продукта ПГА Seq(1-22,X)x2 Seq(1-22,X)x2

29 31 3BB Отсутствие продукта ПГА Seq(5)x3, (X)x0 Seq(1-22)x2, (XY)x1

30 31 2AB Seq(1р,4q,6q, 13)x3,(Xq)x2, (1q,5q,9q)x1, (X)x1

о

9

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор глубоко признателен своему научному руководителю - д.б.н., профессору РАН И.Н. Лебедеву за всестороннюю помощь и поддержку на всех этапах выполнения диссертационной работы. Автор признателен к.м.н. Н.А. Скрябину (НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ) за помощь в организации экспериментальной части исследования и поддержку. Автор выражает искреннюю благодарность коллективу лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ за участие в обсуждении результатов, и за помощь в проведении исследования. Благодарю О.Р. Канбекову (ОГАУЗ «Областной перинатальный центр», г. Томск), А.В. Светлакова и В.Г. Артюхову (ООО «Красноярский центр репродуктивной медицины») за проведение эмбриологической части исследования и помощь в сборе материала. Автор выражает признательность А. Кш^, А. Salumets, О. Т§шко, Т. Jatsenko, К. Тееаги, А. Тго§т (г. Тарту, г. Таллин, Эстония) за раздел молекулярно-цитогенетического исследования по секвенированию образцов ДНК, внесших значительный вклад в диссертационную работу. Автор благодарен д.б.н., профессору В.Н. Стегнию и коллективу кафедры цитологии и генетики Биологического института НИ ТГУ за организацию учебного процесса в аспирантуре.