Использование циркулирующих ДНК и мРНК для неинвазивного пренатального определения пола, резус-фактора и диагностики синдрома Дауна у плода тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Благодатских, Екатерина Григорьевна

• Благодатских, Екатерина Григорьевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Благодатских, Екатерина Григорьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

Цели и задачи работы.

Научная новизна работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. НЕИНВАЗИВНАЯ ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА.

Плацента. Строение и функции.

Попытки и методы неинвазивной диагностики.

Клетки плода.

Эритробласты.

Трофобласты.

Циркулирующие нуклеиновые кислоты.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР).

Общие сведения.

ПЦР в реальном времени.

Анализ линейных разрушаемых проб (Та(зМак® анализ).

ПЦР с обратной транскрипцией.

Одностадийная ОТ-ПЦР.

Двухстадийная ОТ-ПЦР.

Цифровая ПЦР.

ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ.

Мини- и микросателлиты.

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Однонуклеотидный полиморфизм (ОНП).

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА СЦЕПЛЕННЫХ С ПОЛОМ

ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Гемофилия типов АиВ.

Синдром Мартина-Белл.

Дистрофия Дюшенна.

Методы пренатальной диагностики пола плода.

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА РЕЗУС-ФАКТОРА ПЛОДА.

Отрицательный резус-фактор. Клинические аспекты.

Гены группы Ян.

ПРИМЕНЕНИЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА ДАУНА.

Синдром Дауна. Клинические, генетические и социальные аспекты.

Внеклеточные плодные нуклеиновые кислоты в диагностике синдрома

Дауна. Попытки, подходы и методы.

Плацентарные мРНК. Попытки и методы. Выбор исследуемых генов и маркеров.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Образцы крови и плазмы крови.

Выделение геномной ДНК человека методом фенол-хлороформной экстракции.

Выделение циркулирующей ДНК из плазмы.

Выделение циркулирующей РЖ из плазмы.

Обратная транскрипция.

Параметры и компоненты ПЦР в реальном времени, а также ПЦР и ОТ

Пороговый цикл.

Олигонуклеотиды.

Условия ПЦР и последовательности праймеров.

Цифровая ПЦР.

Оценка эффективности проведения ПЦР.

Генотипирование полиморфных маркеров rs8130833, rs1155158 и rs

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ПРЕНАТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА ПЛОДА.

Цифровая ПЦР.

Амплификация участков ДНК, содержащих маркер DYS14 с целью определения половой принадлежности плода по образцам плазмы крови беременных женщин.

ПРЕНАТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ФАКТОРА ПЛОДА.

Определение предела обнаружения участков гена RHD в реакционной смеси.

Установление резус-фактора плода по образцам плазмы крови беременных женщин.

РАЗРАБОТКА ПОДХОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА ДАУНА У ПЛОДА ПО ОБРАЗЦАМ ПЛАЗМЫ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН.

Определение количества и качества выделенной РНК.

Исследование сохранности РНК в крови и плазме крови.

Отработка оптимального метода выделения циркулирующих мРНК.

Идентификация генетических маркеров, пригодных для проведения исследования.

Генотипирование полиморфных маркеров в генаXPLAC4, c21orf105 и DNMT3L.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование циркулирующих ДНК и мРНК для неинвазивного пренатального определения пола, резус-фактора и диагностики синдрома Дауна у плода»

Одним из направлений пренатальной диагностики является выявление социально значимых наследственных заболеваний человека. В их число входят преимущественно тяжёлые моногенные синдромы и хромосомные патологии, которые приводят к инвалидности с рождения ребёнка, и для которых оправдано прерывание беременности в случае обнаружения.

За последние годы показано, что только треть всех наследственных заболеваний имеет традиционный моногенный аутосомный тип наследования [1]. Характер наследования остальных не согласуется с законами Менделя, предполагающими одинаковое действие генов, полученных от обоих родителей. Сцепленные с полом заболевания, при которых мутантный ген находится на хромосомах X и У, влияют на качество жизни, зачастую они неизлечимы и приводят к смерти в раннем возрасте.

Иммунологическая несовместимость плода и матери по резус-фактору является основной причиной гемолитической болезни новорождённого. В некоторых случаях воздействие антигенов, проникающих через плаценту, приводит к гибели плода [2]. Резус-конфликт является главной причиной развития кривошеи, а белок ШгО — самым иммуногенным белковым антигеном группы крови у людей [2].

Хромосомная патология является причиной многих врождённых заболеваний, среди которых самым распространённым является синдром Дауна, вызванный полной или частичной трисомией по хромосоме 21. Тяжесть заболевания и риск конкретных клинических проявлений зависит от многих невыясненных факторов [3], но даже в лёгких формах синдром Дауна вызывает инвалидность с самого раннего возраста ребёнка.

Используемые в настоящее время для диагностики перечисленных заболеваний методы либо неточны, либо связаны с травмирующими инвазивными процедурами и риском прерывания беременности. Основные надежды в разработке безопасных и одновременно точных методов связывают с циркулирующими в крови беременной нуклеиновыми кислотами плода. С их использованием возможна диагностика генетических нарушений уже в первом триместре, когда прерывание беременности приносит наименьший вред матери.

Наша работа нацелена на разработку безопасных и достоверных методов установления пола и резус-фактора будущего ребёнка, а также подхода для неинвазивной пренатальной диагностики синдрома Дауна у плода.

Актуальность темы

Выяснение пола плода на ранних сроках беременности может предотвратить повторные случаи рождения больных детей в семьях с отягощённой наследственностью. В настоящее время для установления пола плода основным методом является ультразвуковая диагностика, однако на ранних сроках беременности этот метод позволяет судить о наличии заболевания только по косвенным ультразвуковым маркерам.

Для выявления резус-конфликта беременной и плода в настоящее время применяют целый комплекс дорогостоящих и длительных клинических исследований, включающий измерение уровней специфичных материнских антител к резус-фактору, а также ультразвуковое исследование для определения скорости артериального потока крови средней мозговой артерии.

С целью пренатальной диагностики хромосомных синдромов в клинической практике проводится цитогенетический анализ клеток различных тканей плода. Для проведения этого анализа требуется применение инвазивной диагностики, обладающей, наряду с высокой точностью, превышающей в среднем 99%, серьёзными недостатками, -риском инфицирования плода и нежелательного прерывания беременности.

Крайне важной является разработка неинвазивных и не требующих длительного времени генетических тестов, позволяющих диагностировать трисомию-21 у плода, а также устанавливать его пол и резус-фактор в первом — начале второго триместра беременности.

Цели и задачи работы

Целями данной работы были разработка систем для неинвазивного пренатального определения пола и резус-фактора плода по крови беременной женщины, а также разработка подхода для диагностики синдрома Дауна у плода.

Для определения пола и резус-фактора плода проводилось обнаружение циркулирующих ДНК участков генов DYS14 и RHD, соответственно. При разработке подхода для диагностики синдрома Дауна использовался описанный в литературе метод, основанный на генотипировании полиморфных маркеров в циркулирующих РНК хромосомы 21.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Определить соответствующие возможностям медицинских центров России условия выделения и длительного хранения образцов плазмы крови, а также циркулирующих ДНК и РНК.

2. Разработать пригодную для неинвазивной пренатальной диагностики систему определения ДНК, содержащую маркер DYS 14, расположенный внутри многокопийного гена Y-хромосомы, кодирующего белок TSPY1, используя в качестве материала циркулирующие ДНК из плазмы крови беременных.

3. Разработать систему для пренатального определения резус-фактора плода с помощью амплификации в реальном времени двух экзонов гена RHD, используя в качестве материала циркулирующие ДНК из плазмы крови беременных.

4. Выбрать гены хромосомы 21, которые, согласно литературным данным, преимущественно экспрессируются в плаценте.

Проанализировать их экспрессию с помощью ОТ—ПЦР из РНК плазмы крови беременных женщин и контрольных образцов мужчин.

5. С помощью генотипирования образцов беременной женщины, будущего отца ребёнка и плода по полиморфным маркерам в выбранных генах оценить долю плодной РНК каждого гена в плазме материнской крови. Оценить возможность применения этого метода для диагностики трисомии по хромосоме 21.

Научная новизна работы

• Созданы новые системы для безопасного неинвазивного определения пола и резус-фактора плода на ранних сроках беременности, обладающие большей чувствительностью по сравнению с описанными в литературе.

• Отработан оригинальный протокол хранения образцов плазмы, выделения и генетического анализа циркулирующих РНК с помощью ПЦР в реальном времени.

• Проведено комплексное исследование концентрации мРНК 3 генов хромосомы 21 в плазме крови беременных женщин и доли данных РНК, имеющих плодное происхождение.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Благодатских, Екатерина Григорьевна

Выводы

1. Определены условия длительного хранения образцов плазмы крови и выделения циркулирующих внеклеточных ДНК и РНК, соответствующие возможностям медицинских центров России.

2. В целях неинвазивного пренатального определения пола плода разработана новая система обнаружения ДНК, содержащей маркер DYS 14, расположенный внутри многокопийного гена хромосомы Y, кодирующего белок TSPY1 с помощью ПЦР в реальном времени. С использованием метода «цифровой ПЦР» показано, что разработанная система позволяет детектировать, как минимум, 2 копии хромосомы Y в реакционной смеси. Генотипирование 40 образцов плазмы крови беременных с установленным кариотипом плода (25 мальчиков и 15 девочек) показало, что чувствительность разработанной системы составляет 96%, а специфичность — 100%.

3. Разработана система для неинвазивного пренатального определения резус-фактора плода с помощью амплификации в реальном времени двух экзонов гена RHD. Анализ 28 образцов плазмы крови беременных с отрицательным резус-фактором с помощью разработанной системы показал, что чувствительность и специфичность разработанной системы составляет 100%.

4. В целях диагностики синдрома Дауна выбраны 3 гена хромосомы 21: PLAC4, c21orfl05 и DNMT3L. Подтверждена возможность амплификации фрагментов этих генов на матрице РНК плазмы крови с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Генотипирование полиморфных маркеров rs8130833, rs1155158 и rs7354779 в тройках образцов (геномная ДНК будущего отца, геномная ДНК беременной, кДНК плода) показало наличие в плазме крови беременной как РИСК с её генотипом, так и РНК с генотипом плода.

5. Генотипирование РНК плазмы крови беременных женщин показало возможность анализа генотипа плода, что делает данный метод пригодным для пренатальной диагностики. Для повышения достоверности диагностики синдрома Дауна необходимо привлечение информации о большем числе маркеров в других генах критического района синдрома Дауна хромосомы 2Ц22.3.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Благодатских, Екатерина Григорьевна, 2010 год

1. Дадали E.JL, Барышникова Н.В. 2006. Болезни с нетрадиционными типами наследования. Генетика. Москва: Академкнига; 468-500.

2. Neil D. Avent. 2008. RHD Genotyping from Maternal Plasma: Guidelines and Technical Challenges. Prenatal Diagnosis. 444, 185-201.

3. Roper R.J., Reeves R.H. 2006. Understanding the basis for Down syndrome phenotypes. PLoS Genet. 2 (3), e50.

4. Evans M.I., Wapner R.J. 2005. Invasive prenatal diagnostic procedures 2005. Semin. Perinatol. 29 (4), 215-218.

5. Dennis Lo Y.M., Chiu R.W.K. 2008. Noninvasive Prenatal Diagnosis of Fetal Chromosomal Aneuploidies by Maternal Plasma Nucleic Acid Analysis. Clin Chem. 54 (3), 461-466.

6. Malone F.D., Canick J.A., Ball R.H. et al. 2005. First-Trimester or Second-Trimester Screening, or Both, for Down's Syndrome. N Engl J Med. 353 (19), 2001-2011.

7. Учебное издание "Генетика". 2006. Москва: ИКЦ "Академкнига".

8. Driscoll D.A., Gross S. 2009. Prenatal Screening for Aneuploidy. N Engl J Med. 360 (24), 2556-2562.

9. Sood R., Zehnder J.L., Druzin M.L., Brown P.O. 2006. Gene expression patterns in human placenta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (14), 54785483.

10. Girardi G., Bulla R., Salmon J.E., Tedesco F. 2006. The complement system in the pathophysiology of pregnancy. Mol. Immunol. 43 (1-2), 68-77.

11. Murphy S., Rosli S., Acharya R. et al. 2010. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit 1E.6.

12. Marangon F.B., Alfonso E.C., Miller D. et al. 2004. Incidence of microbial infection after amniotic membrane transplantation. Cornea. 23 (3), 264-269.

13. Clayton A., Harris C.L., Court J., Mason M.D., Morgan B.P. 2003. Antigenpresenting cell exosomes are protected from complement-mediated lysis by expression of CD55 and CD59. Eur. J. Immunol. 33 (2), 522-531.

14. Manoogian S.J., Bisplinghoff J.A., McNally C. et al. 2008. Dynamic tensile properties of human placenta. J Biomech. 41 (16), 3436-3440.

15. Rachakatla R.S., Troyer D. 2009. Wharton's jelly stromal cells as potential delivery vehicles for cancer therapeutics. Future Oncol. 5 (8), 1237-1244.

16. Lapaire O., Holzgreve W., Oosterwijk J.C., Brinkhaus R., Bianchi D.W. 2007. Georg Schmorl on trophoblasts in the maternal circulation. Placenta. 28 (1), 1-5.

17. Litton C., Stone J., Eddleman K., Lee M. 2009. Noninvasive prenatal diagnosis: past, present, and future. Mt. Sinai J. Med. 76 (6), 521-528.

18. Lo Y.M., Corbetta N., Chamberlain P.F. et al. 1997. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 350 (9076), 485-487.

19. Poon L.L., Leung T.N., Lau T.K., Lo Y.M. 2000. Presence of fetal RNA in maternal plasma. Clin. Chem. 46 (11), 1832-1834.

20. Hahn S., Zhong X.Y., Holzgreve W. 2008. Recent progress in non-invasive prenatal diagnosis. Semin Fetal Neonatal Med. 13 (2), 57-62.

21. Bianchi D.W., Flint A.F., Pizzimenti M.F., Knoll J.H., Latt S.A. 1990. Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. Proc Natl Acad Sci US A. SI (9), 3279-3283.

22. Prieto B., Candenas M., Venta R., Ladenson J.H., Alvarez F.V. 2002. Isolation of fetal nucleated red blood cells from maternal blood in normal and aneuploid pregnancies. Clin. Chem. Lab. Med. 40 (7), 667-672.

23. Falcidia E., Parano E., Grillo A. et al. 2004. Fetal cells in maternal blood: a six-fold increase in women who have undergone amniocentesis and carry a fetus with Down syndrome: a multicenter study. Neuropediatrics. 35 (6),321.324.

24. Mavrou A., Kouvidi E., Antsaklis A. et al. 2007. Identification of nucleated red blood cells in maternal circulation: a second step in screening for fetal aneuploidies and pregnancy complications. Prenat. Diagn. 27 (2), 150-153.

25. Troeger C., Zhong X., Burgemeister R. et al. 1999. Approximately half of the erythroblasts in maternal blood are of fetal origin. Mol. Hum. Reprod. 5 (12), 1162-1165.

26. Huang R., Barber T.A., Schmidt M.A. et al. 2008. A microfluidics approach for the isolation of nucleated red blood cells (NRBCs) from the peripheral blood of pregnant women. Prenat. Diagn. 28 (10), 892-899.

27. Ishihara N., Matsuo H., Murakoshi H. et al. 2002. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either preeclampsia or intrauterine growth retardation. Am. J. Obstet. Gynecol. 186 (1), 158-166.

28. Alberry M.S., Soothill P.W. 2008. Non-invasive prenatal diagnosis: implications for antenatal diagnosis and management of high-risk pregnancies. Semin Fetal Neonatal Med. 13 (2), 84-90.

29. Rijnders R.J.P., Van Der Luijt R.B., Peters E.D.J, et al. 2003. Earliest gestational age for fetal sexing in cell-free maternal plasma. Prenat. Diagn. 23(13), 1042-1044.

30. Lo Y.M., Zhang J., Leung T.N. et al. 1999. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am. J. Hum. Genet. 64 (1), 218-224.

31. Alberry M., Maddocks D., Jones M. et al. 2007. Free fetal DNA in maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that the origin is the trophoblast. Prenat. Diagn. 27 (5), 415-418.

32. Lun F.M.F., Tsui N.B.Y., Chan K.C.A. et al. 2008. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (50), 19920-19925.

33. Lo Y.M., Leung T.N., Tein M.S. et al. 1999. Quantitative abnormalities offetal DNA in maternal serum in preeclampsia. Clin. Chem. 45 (2), 184-188.

34. Такмкович C.H., Власов B.B., Лактионов П.П. 2008. Циркулирующие ДНК крови и их использование в медицинской диагностике. Молекулярная биология. 42 (1), 12-23.

35. Lo Y.M.D. 2008. Fetal nucleic acids in maternal plasma. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1137, 140-143.

36. Rainer Т.Н., Lo Y.M., Chan L.Y. et al. 2001. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Ann. N. Y. Acad. Sci. 945, 211-220.

37. Jahr S., Hentze H., Englisch S. et al. 2001. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res. 61 (4), 1659-1665.

38. Dennis Lo Y.M., Chiu R.W.K. 2007. Prenatal diagnosis: progress through plasma nucleic acids. Nat. Rev. Genet. 8 (1), 71-77.

39. Ng E.K.O., Tsui N.B.Y., Lau Т.К. et al. 2003. mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (8), 4748-4753.

40. Lo Y.M.D., Tsui N.B.Y., Chiu R.W.K. et al. 2007. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat. Med. 13 (2), 218-223.

41. Costa J., Benachi A., Gautier E. 2002. New strategy for prenatal diagnosis of X-linked disorders. N. Engl. J. Med. 346 (19), 1502.

42. Grootkerk-Tax M.G.H.M., Soussan A.A., de Haas M., Maaskant-van Wijk P.A., van der Schoot C.E. 2006. Evaluation of prenatal RHD typing strategies on cell-free fetal DNA from maternal plasma. Transfusion. 46 (12), 2142-2148.

43. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семёнов П.А. 2009. ПЦР в реальном времени. Москва: БИНОМ.

44. Kleppe К., Ohtsuka Е., Kleppe R., Molineux I., Khorana H.G. 1971. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. J. Mol. Biol. 56 (2), 341-361.

45. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F. et al. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354.

46. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N.Y.). 10 (4), 413-417.

47. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. 1993. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N.Y.). 11 (9), 1026-1030.

48. VanGuilder H.D., Vrana K.E., Freeman W.M. 2008. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. BioTechniques. 44 (5), 619626.

49. Nolan Т., Hands R.E., Bustin S.A. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582.

50. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl AcadSci USA. 88 (16), 7276-7280.

51. Bustin S.A. 2002. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 29 (1), 23-39.

52. Ramachandran C., Melnick S.J. 1999. Multidrug resistance in human tumors—molecular diagnosis and clinical significance. Mol. Diagn. 4 (2), 8194.

53. Desjardin L.E., Perkins M.D., Wolski K. et al. 1999. Measurement ofsputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160 (1), 203-210.

54. Fairman J., Roche L., Pieslak I. et al. 1999. Quantitative RT-PCR to evaluate in vivo expression of multiple transgenes using a common intron. BioTechniques. 27 (3), 566-570, 572-574.

55. Ghossein R.A., Rosai J. 1996. Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells. Cancer. 78 (1), 10-16.

56. Benachi A., Costa J. 2007. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies. Lancet. 369 (9560), 440-442.

57. Morrison T.B., Weis J.J., Wittwer C.T. 1998. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. BioTechniques. 24 (6), 954-958, 960, 962.

58. Palmer S., Wiegand A.P., Maldarelli F. et al. 2003. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41 (10), 4531-4536.

59. Gentle A., Anastasopoulos F., McBrien N.A. 2001. High-resolution semiquantitative real-time PCR without the use of a standard curve. BioTechniques. 31 (3), 502, 504-506, 508.

60. Wong M.L., Medrano J.F. 2005. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39 (1), 75-85.

61. Vandesompele J., De Paepe A., Speleman F. 2002. Elimination of primer-dimer artifacts and genomic coamplification using a two-step SYBR green I real-time RT-PCR. Anal Biochem. 303 (1), 95-98.

62. Lo Y.M.D., Lun F.M.F., Chan K.C.A. et al. 2007. Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (32), 13116-13121.

63. Tong Y.K., Ding C., Chiu R.W. et al. 2006. Noninvasive Prenatal Detection of Fetal Trisomy 18 by Epigenetic Allelic Ratio Analysis in Maternal Plasma: Theoretical and Empirical Considerations. Clin Chem. 52 (12),2194-2202.

64. Old R.W., Crea F., Puszyk W., Hulten M.A. 2007. Candidate epigenetic biomarkers for non-invasive prenatal diagnosis of Down syndrome. Reprod. Biomed. Online. 15 (2), 227-235.

65. Warren L., Bryder D., Weissman I.L., Quake S.R. 2006. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (47), 17807-17812.

66. Diehl F., Li M., Dressman D. et al. 2005. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (45), 16368-16373.

67. Свердлов Е.Д. 2009. Очерки структурной молекулярной генетики. Москва: Наука; 1.

68. Jeffreys A.J., Allen M.J., Armour J.A. et al. 1995. Mutation processes at human minisatellites. Electrophoresis. 16 (9), 1577-1585.

69. Pennisi Е. 1998. A closer look at SNPs suggests difficulties. Science. 281 (5384), 1787-1789.

70. Crawford D.C., Akey D.T., Nickerson D.A. 2005. The patterns of natural variation in human genes. Annu Rev Genomics Hum Genet. 6, 287-312.

71. Hsu D.T. 2010. Cardiac manifestations of neuromuscular disorders in children. Paediatr Respir Rev. 11 (1), 35-38.

72. Dati E., Baldinotti F., Conidi M.E. et al. 2010. A Girl with Tomboy Behavior: Lesson from Misdiagnosis in a Baby with Ambiguous Genitalia. Sex Dev. 4(3), 150-154.

73. И.Ю. Барков, B.A. Бахарев, H.A. Каретникова. 1999. Пренатальное определение пола (обзор литературы). Проблемы репродукции. 1, 5-14.

74. Collins P., Baudo F., Huth-Kuhne A. et al. 2010. Consensus recommendations for the diagnosis and treatment of acquired hemophilia A. BMC Res Notes. 3(1), 161.

75. Aledort L.M. 2010. Optimizing the treatment of haemophilia B: laboratory and clinical perspectives. Haemophilia. 16 Suppl 6, 1-2.

76. Lo-Castro A., D'Agati E., Curatolo P. 2010. ADHD and genetic syndromes. Brain Dev. Электронная публикация.

77. Estigarribia В., Erwick Roberts J., Sideris J., Price J. 2010. Expressive morphosyntax in boys with Fragile X syndrome with and without autism spectrum disorder. Int J Lang Commun Disord. Электронная публикация.

78. Hill M.K., Archibald- A.D., Cohen J., Metcalfe S.A. 2010. A systematic review of population screening for fragile X syndrome. Genet Med. Электронная публикация.

79. Jordan B.R. 1991. Fragile X-linked mental retardation and the difficulties of reverse genetics. Bioessays. 13 (5), 243-251.

80. Vulliamy Т., Mason P., Luzzatto L. 1992. The molecular basis of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Trends Genet. 8 (4), 138-143.

81. Hsu D.T. 2010. Cardiac manifestations of neuromuscular disorders in children. Paediatr Respir Rev. 11 (1), 35-38.

82. Bushby K., Finkel R., Birnkrant D.J. et al. 2010. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 9 (1), 77-93.

83. Fayssoil A., Nardi O., Orlikowski D., Annane D. 2010. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Fail Rev. 15(1), 103-107.

84. Larsson A., Crang Svalenius E., Lundqvist A., Dykes A. 2010. Parents' experiences of an abnormal ultrasound examination vacillating between emotional confusion and sense of reality. Reprod Health. 7 (1), 10.

85. Nabhan A.F., Faris M.A. 2010. High feedback versus low feedback of prenatal ultrasound for reducing maternal anxiety and improving maternalhealth behaviour in pregnancy. Cochrane Database Syst Rev. 4, CD007208.

86. Whitworth M., Bricker L., Neilson J.P., Dowswell T. 2010. Ultrasound for fetal assessment in early pregnancy. Cochrane Database Syst Rev. 4, CD007058.

87. Ajayi G.O. 2009. Chorionic villus sampling: analysis of the first 350 singleton pregnancies by a single operator. Clin Exp Obstet Gynecol. 36 (4), 251-253.

88. Kong C.W., Leung T.N., Leung T.Y. et al. 2006. Risk factors for procedure-related fetal losses after mid-trimester genetic amniocentesis. Prenat. Diagn. 26(10), 925-930.

89. Willruth A., Vieten J., Berg C., Gembruch U., Geipel A. 2010. Decision Making and Attitudes towards Invasive Prenatal Diagnosis in the Early Second Trimester. Ultraschall Med. Электронная публикация.

90. Nakata N., Wang Y., Bhatt S. 2010. Trends in prenatal screening and diagnostic testing among women referred for advanced maternal age. Prenat Diagn. 30 (3), 198-206.

91. Sekido R. 2009. SRY: A transcriptional activator of mammalian testis determination. IntJBiochem Cell Biol. 42 (3), 417-420.

92. Zimmermann B.G., Maddocks D.G., Avent N.D. 2008. Quantification of circulatory fetal DNA in the plasma of pregnant women. Prenatal Diagnosis. Totowa, NJ, USA: Humana Press. 219-231.

93. Flegel W.A., von Zabern I., Wagner F.F. 2009. Six years' experience performing RHD genotyping to confirm D- red blood cell units in Germany for preventing anti-D immunizations. Transfusion. 49 (3), 465-471.

94. Avent N.D., Finning K.M., Martin P.G., Soothill P.W. 2000. Prenataldetermination of fetal blood group status. Vox Sang. 78 Suppl 2, 155-162.

95. Avent N.D. 1998. Antenatal genotyping of the blood groups of the fetus. Vox Sang. 74 Suppl 2, 365-374.

96. Avent N.D., Madgett T.E., Lee Z.E. et al. 2006. Molecular biology of Rh proteins and relevance to molecular medicine. Expert Rev Mol Med. 8 (13), 1-20.

97. Avent N.D., Reid M.E. 2000. The Rh blood group system: a review. Blood. 95 (2), 375-387.

98. Van Kim C.L., Colin Y., Cartron J. 2006. Rh proteins: key structural and functional components of the red cell membrane. Blood Rev. 20 (2), 93-110.

99. Wagner F.F., Flegel W.A. 2004. Review: the molecular basis of the Rh blood group phenotypes. Immunohematology. 20 (1), 23-36.

100. Daniels G. 2001. A century of human blood groups. Wien. Klin. Wochenschr. 113 (20-21), 781-786.

101. Daniels G., Finning K., Martin P., Summers J. 2006. Fetal blood group genotyping: present and future. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1075, 88-95.

102. Wagner F.F., Flegel W.A. 2000. RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood. 95 (12), 3662-3668.

103. Wagner F.F., Moulds J.M., Flegel W.A. 2005. Genetic mechanisms of Rhesus box variation. Transfusion. 45 (3), 338-344.

104. Matheson K.A., Denomme G.A. 2002. Novel 3'Rhesus box sequences confound RHD zygosity assignment. Transfusion. 42 (5), 645-650.

105. Faas B.H., Beckers E.A., Wildoer P. et al. 1997. Molecular background of VS and weak C expression in blacks. Transfusion. 37 (1), 38-44.

106. Ridgwell K., Spurr N.K., Laguda B. et al. 1992. Isolation of cDNA clones for a 50 kDa glycoprotein of the human erythrocyte membrane associated with Rh (rhesus) blood-group antigen expression. Biochem. J. 287 ( Pt 1), 223-228.

107. Tsui N., Chim S., Chiu R. et al. 2004. Systematic micro-array based identification of placental mRNA in maternal plasma: towards non-invasiveprenatal gene expression profiling. J Med Genet. 41 (6), 461—467.

108. Morris J.K., Wald N.J., Watt H.C. 1999. Fetal loss in Down syndrome pregnancies. Prenat. Diagn. 19 (2), 142-145.

109. Korenberg J.R., Chen X.N., Schipper R. et al. 1994. Down syndrome phenotypes: the consequences of chromosomal imbalance. Proc Natl Acad Sci USA. 91 (11), 4997-5001.

110. Baptista M.J., Fairbrother U.L., Howard C.M. et al. 2000. Heterotrisomy, a significant contributing factor to ventricular septal defect associated with Down syndrome? Hum. Genet. 107 (5), 476-482.

111. Pritchard M.A., Kola I. 1999. The "gene dosage effect" hypothesis versus the "amplified developmental instability" hypothesis in Down syndrome. J. Neural Transm. Suppl. 57, 293-303.

112. Kerstann K.F., Feingold E., Freeman S.B. et al. 2004. Linkage disequilibrium mapping in trisomic populations: analytical approaches and an application to congenital heart defects in Down syndrome. Genet. Epidemiol. 27 (3), 240-251.

113. Hultén M.A., Patel S.D., Tankimanova M. et al. 2008. On the origin of trisomy 21 Down syndrome. Mol Cytogenet. 1, 21.

114. Kooij L., Tymstra T., Berg P.V.D. 2009. The attitude of women toward current and future possibilities of diagnostic testing in maternal blood using fetal DNA. Prenat. Diagn. 29 (2), 164-168.

115. Chiu R.W.K., Lau T.K., Leung T.N. et al. 2002. Prenatal exclusion of beta thalassaemia major by examination of maternal plasma. Lancet. 360 (9338), 998-1000.

116. Li D., Liao C., Li J. et al. 2006. Prenatal diagnosis of beta-thaiassemia in Southern China. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 128 (1-2), 81-85.

117. Chiu R.W.K., Lau T.K., Cheung P.T. et al. 2002. Noninvasive prenatal exclusion of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasma analysis: a feasibility study. Clin. Chem. 48 (5), 778-780.

118. González-González M.C., García-Hoyos M., Trujillo M.J. et al. 2002.

119. Prenatal detection of a cystic fibrosis mutation in fetal DNA from maternal plasma. Prenat. Diagn. 22 (10), 946-948.

120. Dhallan R., Guo X., Emche S. et al. 2007. A non-invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternal blood: a preliminary study. Lancet. 369 (9560), 474-481.

121. Dhallan R., Au W., Mattagajasingh S. et al. 2004. Methods to Increase the Percentage of Free Fetal DNA Recovered From the Maternal Circulation. JAMA. 291 (9), 1114-1119.

122. Chung G.T., Chiu R.W., Chan K.A. et al. 2005. Lack of Dramatic Enrichment of Fetal DNA in Maternal Plasma by Formaldehyde Treatment. Clin Chem. 51 (3), 655-658.

123. Chan K.A., Zhang J., Hui A.B. et al. 2004. Size Distributions of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma. Clin Chem. 50 (1), 88-92.

124. Poon L.L., Leung T.N., Lau T.K., Chow K.C., Lo Y.D. 2002. Differential DNA Methylation between Fetus and Mother as a Strategy for Detecting Fetal DNA in Maternal Plasma. Clin Chem. 48 (1), 35-41.

125. Chim S.S.C., Tong Y.K., Chiu R.W.K. et al. 2005. Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14753-14758.

126. Chiu R.W., Chim S.S., Wong I.H. et al. 2007. Hypermethylation of RASSF1A in Human and Rhesus Placentas. Am J Pathol. 170 (3), 941-950.

127. Chan K.A., Ding C., Gerovassili A. et al. 2006. Hypermethylated RASSF1A in Maternal Plasma: A Universal Fetal DNA Marker that Improves the Reliability of Noninvasive Prenatal Diagnosis. Clin Chem. 52 (12), 2211 -2218.

128. Lui Y.Y., Chik K., Chiu R.W. et al. 2002. Predominant Hematopoietic

129. Origin of Cell-free DNA in Plasma and Serum after Sex-mismatched Bone Marrow Transplantation. Clin Chem. 48 (3), 421-427.

130. Grunau C., Clark S.J., Rosenthal A. 2001. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 29 (13), e65.

131. Heung M.M.S., Jin S., Tsui N.B.Y. et al. 2009. Placenta-Derived Fetal Specific mRNA Is More Readily Detectable in Maternal Plasma than in Whole Blood. PLoS ONE. 4 (6), e5858.

132. Go A.T., Visser A., Mulders M.A. et al. 2007. 44 Single-Nucleotide Polymorphisms Expressed by Placental RNA: Assessment for Use in Noninvasive Prenatal Diagnosis of Trisomy 21. Clin Chem. 53 (12), 22232224.

133. Oudejans C.B.M., Go A.T.J.J., Visser A. et al. 2003. Detection of chromosome 21-encoded mRNA of placental origin in maternal plasma. Clin. Chem. 49 (9), 1445-1449.

134. Go A.T.J.I., Visser A., Mulders M.A.M. et al. 2007. C210RF105, A chromosome 21-encoded mRNA, is not a discriminative marker gene for prediction of Down syndrome in maternal plasma. Prenat. Diagn. 27 (2), 146-149.

135. Go A.T.J.I., Visser A., Betsalel O.T. et al. 2008. Measurement of allelic-expression ratios in trisomy 21 placentas by quencher extension of heterozygous samples identified by partially denaturing HPLC. Clin. Chem. 54 (2), 437-440.

136. Suetake I., Shinozaki F., Miyagawa J., Takeshima H., Tajima S. 2004. DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction. J. Biol. Chem. 279 (26), 27816-27823.

137. Novakovic B., Wong N.C., Sibson M. et al. 2010. DNA methylationimediated down-regulation of DNA methyltransferase-1 (DNMT1) is1.coincident with, but not essential for, global hypomethylation in humanplacenta. J. Biol. Chem. 285 (13), 9583-9593.

138. Rodriguez-Osorio N., Wang H., Rupinski J., Bridges S.M., Memili E. 2010. Comparative functional genomics of mammalian DNA methyltransferases. Reprod Biomed Online. 20 (2), 243-255.

139. Seabright M. 1972. Human chromosome banding. Lancet. 1 (7757), 967.

140. Chomczynski P., Sacchi N. 2006. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585.

141. Zhong X.Y., Holzgreve W., Huang D.J. 2008. Isolation of cell-free RNA from maternal plasma. Methods Mol. Biol. 444, 269-273.

142. Heung M.M.S., Tsui N.B.Y., Leung T.Y. et al. 2009. Development of extraction protocols to improve the yield for fetal RNA in maternal plasma. Prenat. Diagn. 29 (3), 277-279.

143. Farina A., LeShane E.S., Lambert-Messerlian G.M. et al. 2003. Evaluation of Cell-free Fetal DNA as a Second-Trimester Maternal Serum Marker of Down Syndrome Pregnancy. Clin Chem. 49 (2), 239-242.