Зависимость морфофизиологических показателей от условий выращивания Stevia rebaudiana Bertoni in vitro и in vivо тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат наук Шульгина Алла Андреевна

• Шульгина Алла Андреевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Шульгина Алла Андреевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Stevia rebaudiana Bertoni - перспективный объект исследований

1.2 Изучение стевии в культуре in vitro и in vivo

1.3 Влияние факторов физической природы на морфогенетический потенциал растений

1.3.1 Когерентный свет

1.3.2 Светодиодное освещение

1.3.3 Применение светодиодов в культуре in vitro

1.4 Технология адаптации растений к условиям ex vitro

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объект исследований

2.2 Методы исследований

2.2.1 Влияние факторов гормональной природы на морфогенез Stevia rebaudiana Bertoni in vitro

2.2.2 Влияние факторов физической природы на морфофизиологические показатели Stevia rebaudiana Bertoni in vitro

и in vivo

2.2.3 Совместное влияние факторов физической и гормональной природы на морфофизиологические показатели растений Stevia в условиях in vitro

2.3 Адаптация клонированных растений к условиям ex vitro

2.3.1 Классический способ

2.3.2 Адаптация в мини-парнике

2.3.3 Адаптация в условиях аэропоники

2.3.4 Химические и физические «изоляторы»

2.4 Проведение биометрических и физиологических исследований

2.4.1 Физиологические исследования

2.4.2 Фенотипический анализ растений

2.4.3 Количественное определение пигментов

2.4.4 Качественное и полуколичественное определение дитерпеновых гликозидов методом ТСХ

2.4.5 Количественное определение стевиозида методом ВЭЖХ

2.5 Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1 Влияние регуляторов роста на морфогенетический потенциал растений стевии in vitro

3.2 Влияние факторов физической природы на морфофизиологические показатели Stevia rebaudiana Bertoni in vitro и in vivo

3.2.1 Влияние красно-синего светодиодного освещения на морфофизиологические показатели растений стевии in vitro

3.2.2 Влияние монохромного света на морфофизиологические показатели растений стевии in vitro

3.2.3 Влияние когерентного света на морфофизиологические показатели растений стевии in vitro

3.3 Совместное влияние факторов физической и гормональной природы

на морфогенез растений Stevia в условиях in vitro

3.3.1 Монохромный свет в сочетании с регуляторами роста в условиях in vitro

3.3.2 Когерентный свет в сочетании с регуляторами роста в условиях

in vitro

3.4 Влияние монохромного света на биометрические показатели растений стевии в условиях in vivo

3.5 Влияние разных спектров светодиодного освещения на биохимические показатели растений стевии ex vitro

3.5.1 Качественное и полуколичественное определение дитерпеновых гликозидов методом ТСХ

3.5.2 Количественное определение стевиозида методом ВЭЖХ

3.5.3 Количественное определение фотосинтетических пигментов

3.5.4 Фенотипический анализ

3.6 Адаптация растений к условиям ex vitro

3.6.1 Адаптация в мини-парнике

3.6.2 Адаптация в условиях аэропоники

3.6.3 Химические и физические изоляторы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Зависимость морфофизиологических показателей от условий выращивания Stevia rebaudiana Bertoni in vitro и in vivо»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. В настоящее время интерес к вторичным метаболитам высших растений всё больше возрастает, также и к их биологически-активным веществам (БАВ). Дитерпеноиды представляют собой большой класс природных соединений обмена высших растений.

Многие дитерпеноиды являются ценными веществами (регуляторы роста растений, инсектициды, антибиотики, средства, ингибирующие опухолеобразование и т. п.), потому исследование их метаболизма имеет значимость, в том числе и практическую.

Дитерпеновый гликозид стевиозид (13-гидрокси-энт-каур-16-ен-19-овая кислота), содержится в листьях стевии (Stevia rebaudiana Bertoni, Asteraceae). В чистом виде он является белым кристаллическим порошком без запаха с сильным сладким вкусом (слаще сахарозы примерно в 300 раз), устойчив к высокой температуре (Brandie, Starratt, Gijzen, 1998).

Дитерпеновые гликозиды чрезвычайно перспективны в роли сахарозаменителей для людей, которые страдают от нарушений углеводного обмена и в особенности, для больных диабетом, так как они обладают гипогликемическими свойствами (Tateo, 1999). Благодаря этому, стевиозид используют в роли сахарозаменителей для людей, страдающих сахарным диабетом. ДГ не приводят к повышению уровня сахара в крови даже в концентрации, в 10-15 раз превышающей ее среднесуточное потребление. В настоящее время стевиозид широко используется в качестве низкокалорийного заменителя сахара и подсластителя в Японии, Китае и Южной Корее. Токсикологическими исследованиями была подтверждена его безопасность (Brandie, Starratt, Gijzen, 1998).

Культура изолированных клеток и тканей является универсальной моделью, для изучения закономерностей морфогенеза исследуемых растений in vitro. Кроме того, в культуре in vitro можно управлять биосинтетическим потенциалом и получать щтаммы супер-продуценты. Это имеет отношение и к культуре стевии, источника перспективного целевого соединения -

стевиозида. Однако, исследования по изучению влияния физических (инновационных облучателей на основе светоиспускающих диодов (СД), когерентного света) и химических (регуляторы роста, биологически активные вещества) факторов на клеточную культуру стевии in vitro ранее не проводились.

Цель исследований - изучить влияние факторов различной природы на морфофизиологические показатели растений стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro и in vivo.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• изучить влияние гормонального состава питательной среды на морфогенетический потенциал растений Stevia в условиях in vitro;

• изучить зависимость морфогенеза растений Stevia от факторов физической природы (когерентного света, монохромного света) в условиях in vitro и in vivo;

• изучить синергизм факторов физической и гормональной природы на морфофизиологические показатели растений Stevia в условиях in vitro;

• поиск альтернативных способов и технологий для адаптации растений Stevia к условиям ex vitro.

Научная новизна исследования. Впервые проведены комплексные исследования по влиянию факторов физической и химической природы на морфофизиологический потенциал растений стевии (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro и in vivo. Установлено, что гормональный состав питательной среды и спектральный состав света оказывает существенное влияние на процессы морфогенеза. Экспериментально доказано, что на этапе микроразмножения стевии целесообразно применять питательную среду МС с добавлением препарата Эпин и ауксина ИУК в концентрациях 0,1 и 0,5 мг/л, соответственно, что позволяет получать коэффициент размножения 15. На этапе укоренения целесообразно добавлять в питательную среду препарата «Циркон» в концентрации 0,5 мг/л, что приводит к укореняемости микропобегов в 85% случаев.

Установлены взаимодействия факторов различной природы на морфофизиологические параметры стевии. Показано, что облучение микрорастений стевии in vitro когерентным светом и культивирование их на питательной среде, содержащей препарат Эпин 0,1 мг/л в сочетании с ИУК 0,5 мг/л приводит к увеличению в 2 раза коэффициента размножения, оказывает стимулирующее влияние на формирование адвентивных побегов и листьев. Так же показан стимулирующий эффект красного монохромного света в сочетании с применением БАП и ИУК в концентрациях 1,0 мг/л и 0,5 мг/л, соответственно на коэффициент размножения и биомассу растений.

Впервые для растений-регенерантов стевии проведены исследования по их адаптации в условиях аэропонной установки. Экспериментально доказано, что применение аэропонной установки, способствует снижению появления контаминаций (с 30% до 10%) и увеличению на 25% приживаемость растений к условиям ex vitro по сравнению с классическими с приемами адаптации.

Разработан и предложен новый способ адаптации клонированных растений стевии - «Адаптация в пробирке». Применение данной технологии позволит исключить этап доращивания растений перед их пересадкой в почвенный субстрат.

Теоретическая и практическая значимость работы. Предложенная технология культивирования стевии в условиях in vitro может быть применена в исследованиях по изучению биосинтетического потенциала культивируемых клеток и тканей данного растения. Разработанные методы адаптации растений Stevia rebaudiana к условиям ex vitro могут позволить получать более качественный растительный материал и снизить потери на этапе адаптации. Данная технология может быть применена не только к данному научному объекту, но и к растениям других таксономических групп. Полученные результаты можно использовать в учебном процессе при проведении лекционных и лабораторно-практических работ по дисциплинам: «Физиология растений», «Сельскохозяйственная биотехнология»,

«Прикладная биотехнология», «Культура клеток и тканей растений» для студентов, обучающихся по направлениям «Биотехнология» и «Агрономия». Положения, выносимые на защиту.

1) Зависимость морфофизиологических показателей растения Stevia rebaudiana Bertoni от гормонального состава среды in vitro.

2) Действие различных источников света (светодиодные лампы разного спектра, лазерной установки) на морфогенетические показатели Stevia rebaudiana в условиях in vitro и in vivo.

3) Эффективность разных методики адаптации стерильных растений к условиям ex vitro.

Методология и методы исследования. Диссертационная работа выполнена с использованием классических и современных методов культуры тканей и клеток, микроскопии и деструктивных методов фенотипического анализа растений. Подробно методология и методы исследования отражены в разделе «Материалы и методы».

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 4 - в иностранных сборниках статей и тезисов.

Степень достоверности и апробация результатов работы. Материалы диссертации были представлены на: Международной научно-практической конференции «Молодые ученые и фармация XXI века» (ФГБНУ ВИЛАР, Москва, 16 декабря 2016 г.); региональной конференции «Агробиотехнологии» (РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева, Москва, 26 апреля 2017 г.); пленарном заседании международной научной конференции Молодых учёных и специалистов, посвящённой 100-летию И. С. Шатилова (РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева, Москва, 6 июня 2017 г.); Международном симпозиуме «The 3rd International Symposium on EuroAsian Biodiversity» (БГУ, Минск, Белоруссия, 7 июля 2017 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Эколого-генетические резервы селекции, семеноводства и размножения растений» (НБС, Ялта, 3-

9 сентября 2017 г.); Международной научно-практической конференции «Молодые ученые и фармация XXI века» (ФГБНУ ВИЛАР, Москва, 15 декабря 2017 г.); Региональной конференции «Агробиотехнологии» (РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева, Москва, 26 апреля 2018 г.); Международном конгрессе «Plant Biology Europe 2018» (Университет Копенгаген, Дания, 18-21 июня 2018 г.) - постерный доклад; Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии в области генетики, селекции, семеноводства и размножения растений» (НБС, Ялта, 38 сентября 2018 г.); Всероссийской научной конференции «Молодая фармация - потенциал будущего» (СПХФУ, Санкт-Петербург; 22-23 апреля

2019 г.); Международной научной конференции Молодых учёных и специалистов, посвящённая 150-летию А. В. Леонтовича (РГАУ-МСХА, Москва, 3-6 июня 2019 г.); Международной научно-практической конференции «Биологические и экологические основы селекции, семеноводства и размножения растений» (НБС, Ялта, 2-7 сентября 2019 г.); IX Съезде Общества Физиологов Растений России «Физиология растений -основа создания растений будущего» (Казань; 19-21 сентября 2019 г.); Международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвящённой 160-летию В. А Михельсона. Секция Генетика, селекция и биотехнология. (РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева, Москва, 9-11 июня

2020 г.).

Личный вклад автора. Диссертационная работа является результатом исследований, проведённых лично автором на кафедре биотехнологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева. Автор принимал участие во всех этапах работы: разработка программы исследования, выборе методов исследования, проведение экспериментов, обработка и анализ полученных данных, подготовка публикаций.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность научному руководителю - доктору биологических наук, профессору Калашниковой Елене Анатольевне, за поддержку и помощь при проведении исследований и

выполнении научной работы.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, материала и методов исследований, экспериментальной части (главы 3 и 4), выводов, а также списка цитируемой литературы, который содержит 161 источник, из которых 55 на иностранном языке. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 58 рисунков.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Stevia rebaudiana ВеНош - перспективный объект исследований

1.1.1 Морфофизиологическе особенности Stevia rebaudiana ВеГюш

Систематическая принадлежность стевии:

Царство Растения Р1а^ае

Отдел Покрытосеменные Angiosperms

Класс Двудольные Dicotyledones

Порядок Астроцветные Asterales

Семейство Астровые Asteraceae

Род Стевия Stevia

Вид Стевия медовая Stevia rebaudiana ВеГюш

Стевия - многолетний травянистый кустарник, растение-эндемик, родом из Южной Бразилии и Парагвая.

В природе стевия достигает высоты 60-80 см. Представляет собой небольшой, сильно разветвленный куст (Вгате^, 1982). Она произрастает в условиях тропического климата Латинской Америки, где часто выпадают осадки в летние месяцы. Из-за этого растения приспособилось к постоянному потреблению влаги в течение вегетации, и при выращивании в областях с небольшим количеством осадков урожай существенно снижается. Высота кустов зависит от климатических условий сезона и почвенной влажности и составляет от 45 до 90-100 см. Растения первого года развития имеют один главный стебель с боковыми стеблями. Простые листья имеют парное расположение, на стебле - попарно противоположное. Листья мелкие, многочисленные, простые сидячие, с очень короткими черенками (Carakostas, 2008). В пазухе каждого листочка находится почка, которая дает начало пазушному стеблю. Большие листья размещаются на основном стебле в нижней его части. В верхней части стеблей листья более мелкие. Величина

листьев стевии зависит не только от вида растения, а и от условий выращивания. Листья стевии опушены с обеих сторон, однако менее насыщенно, чем стебель. Цветки белые, небольшого размера (7-15 мм). Корневая система мочковатая (Ramesh, Singh, Megeji, 2006).

У данного растения довольно высокие требования к теплу. Для формирования зеленой массы растения среднесуточная температура должна быть 23-30°С во время всего вегетационного периода. При снижении её до 13-15°С заметно замедляется рост и развитие растения, с уровнем критической температуры является +8°С (Батукаев, 1999).

Произрастает стевия на различных почвах, но лучше всего на легких (песчаных или супесчаных) почках, со слабокислой (рН 5,5-6) реакцией.

Внешний вид изучаемого растения представлен на рисунке 1.

Рис. 1. Внешний вид растения Stevia rebaudiana Bertoni (https://bg.goodhealth-

goodlife.com/3305881-what-is-vtevia)

1.1.2 История изучения Stevia rebaudiana Bertoni

Стевия произрастает в Южной и Центральной Америке и Мексике. Родиной её можно считать высокогорья Парагвая, где она росла на песчаных почвах вблизи рек (Brandie, 1998). Индейцы использовали его как подсластитель для национального напитка мате.

Стевия первые была исследована в XVI веке испанским ботаником и врачом Петрусом Якобусом Стевусом (Petrus Jacobus Stevus), в честь кого и была названа. Внимание европейцев стевия впервые обратила на себя в 1887 году, когда Мойзес Сантьяго Бертони (Moisys Santiago Bertoni) узнал его уникальные свойства от парагвайских индейцев. В 1899 году стевия была впервые описана Мойзесом Бертони.

Первые растениы были доставлены в нашу страну Н. И. Вавиловым из Ботанического сада г. Суенфуэгос о. Кубы. В тридцатые годы двадцатого века он приехал с экспедицией на американский континент и вывез оттуда несколько образцов семян стевии. Вавилов планировал серьезную работу по выращиванию стевии в России. К сожалению, тогда семена не взошли, а затем наступили времена войн и репрессий, про стевию надолго забыли.

Интерес к стевии возник в годы II Мировой войны - из-за дефицита сахара. В 1942 году семена были отправлены в Англию, наладить производство не удалось. Первая попытка коммерческого выращивания была предпринята в Парагвае в 1964 году. В 1954 году японцами были предприняты значительные усилия, направленные на изучение и выращивание стевии в оранжереях.

В 70-е годы, после значительного перерыва, в ВИР имени Н. И. Вавилова работа по интродукции стевии была продолжена (Горбатенко, 2000).

Стевию выращивают во многих странах мира с теплым климатом: Израиле, Индонезии, Таиланде, Аргентине, США, и др. Но основной объём производства стевии сосредоточено в Китае и Японии. Уже в 1985 году Япония выпускала более десяти видов пищевых продуктов с применением продукции переработки растения стевии. За 10 лет было разработано и внедрено в производство более 240 патентов, технологий и разработок.

Стевия введена в качестве сельскохозяйственных культур в ряде стран, таких как Бразилия, Корея, Мексика, США, Индонезии, и начиная с 1990

года, Канада (Carakostas, 2008). Сейчас это растение популярно на рынках промышленно развитых стран Дальнего Востока и Юго-Восточной Азии.

В РФ в Государственный реестр селекционных достижений стевия впервые была включена с 1995 г. как техническая культура.

В настоящее время в России официально зарегистрированы пять сортов, допущенных к использованию во всех зонах: «Рамонская сластена» (районирован в 1995 г.), «Детскосельская» (районирован в 1998 г.), «София и Услада» (внесены в Госреестр в 2007 г.), «Ставропольская сластена» (зарегистрирован в 2010 г.) (Гос. Реестр, 2010). Изучение стевии активно продолжается, растёт число исследований опубликованных статей и диссертаций, посвященных этому растению.

1.1.3 Stevia rebaudiana Bertoni - источник стевиозида

Род Стевия включает в себя около 200 видов, но только в одном из них обнаружены дитерпеновые гликозиды (ДГ). Результаты исследований по изучению содержания гликозидов у Stevia rebaudiana показали, что стевиозид имеется во всех частях растения (кроме корней), но больше всего его содержится в листовых пластинках (6-15 % на сухую массу), меньше - в соцветиях, и совсем мало - в стеблях (Chen, 2005).

Всего выделено восемь сладких дитерпеноидных тетрациклических гликозидов, общим признаем которых является агликон стевиол. К ним относятся: стевиозид, ребаудиазид (А-Е), дулказид и стелвиолбиозид (Amzad-Hossain, 2010). Ответственная за сладость субстанция, выделяемая из листьев стевии, для простоты изучения получила общее название стевиозид.

Стевиозид, формула которого приведена на рисунке 2, представляет собой белый кристаллический гигроскопичный порошок без запаха с сильным сладким вкусом, который примерно в 300 раз слаще сахарозы. ДГ низкокалорийны, характеризуются отсутствием токсичности и мутагенности и практически не усваиваются организмом человека (Short, 1991).

НС

ОН

Рис. 2. Молекула стевиозида (https://de.wikipedia.0rg/wiki/Stevi0sid#/media/Datei:Stevi0side.svg)

ДГ перспективны для людей, страдающих от нарушений углеводного обмена и особенно, для больных диабетом, в качестве сахарозаменителей, так как они обладают гипогликемическими свойствами (Chu, 1990; Kumar, 2012).

Стевиозид зарегистрирован в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки Е960 как подсластитель.

1.1.4 Стевиозид как подсластитель

В начале двадцатого столетия ученые в области аналитической химии начали изучать стевию, а после ею заинтересовались медики. В 1913 году лаборатория Гамбурга провела исследования стевии и в результате выдвинула идею о том, что её можно использовать в промышленном масштабе как альтернативу свекольному и тростниковому сахару. Содержащиеся в листьях стевии ДГ оказывают гипогликемическое действие (способствуют снижению уровня сахара в крови). Сохраняя привычные вкусовые свойства пищевого рациона, стевия не приводит к повышению уровня сахара в крови даже в концентрации, в 10-15 раз превышающей ее среднесуточное потребление (Бондарев, 2011).

Стевиозид способен заменить сахар в питании людям, больным сахарным диабетом. К тому же было показано, что он не оказывает сахароснижающего действия у людей, с нормальным уровнем сахара в крови (Curi, 1985).

Самым большим потребителем стевии является Япония. На сегодняшний день в Японии стевиозид занимает почти половину рынка подсластителей (Kohda, Kasai, Yamasaki, Murakami, Tanaka, 1976).

Стевиозид используют в качестве подсластителя в фруктовых соках, безалкогольных напитках, мороженом, жевательной резинки — делая эти продукты и низкокалорийными, и профилактическими для болезней полости рта и желудочно-кишечного тракта).

Стевиозид при нагревании не разрушается, что его и отличает от искусственных подсластителей. Благодаря этому его можно использовать при приготовлении горячих напитков и выпечки. Помимо этого, из-за способности смягчать вкус поваренной соли, его используют в изготовлении соевого соуса, маринадов, рыбных, мясных блюд и высушенных морепродуктов (Ванидзе, 2009).

Отсутствует отрицательное воздействие на организм даже в случае длительного употребления стевии. Это свойство также отличает его от заменителей синтетического происхождения: аспартама, ацесульфата, сахарина и других (Koyama, 2003). Многие их них могут давать серьезные побочные эффекты: нарушения в выделительную систему (мочевой пузырь и почки), а также повышение риска онкологических заболеваний при постоянном их употреблении (Hajime, 1982).

1.1.5 Другие полезные свойства стевиозида

Стевиозид обладает бактерицидными и противогрибковыми свойствами, оказывает профилактическое, укрепляющее и общетонизирующее действие, подавляет развитие некоторых

болезнетворных организмов (Gupta, 2013; Jeppesen, 2002; Muanda, 2011). При нервном и физическом истощении хорошо восстанавливает силы напиток из листьев стевии, повышается интеллектуальная продуктивность, защищает при эмоциональных перегрузках (Starratt, 2002).

Дубильные вещества воздействуют на белки в слизистых оболочках и в коже, превращая их в нерастворимые соединения, обладающие большей прочностью. Это означает, что бактерии на поврежденных участках, лишаются своей пищи. Благодаря этим свойствам растение способно оказать противовоспалительное и защитное действие, что важно при порезах, обморожениях, ожогах и раздражениях кожи. Отвар из листьев используется при лечении послеоперационных швов и гнойных ран (Brandie, Starratt, Gijzen, 1998; Tadhani, 2007).

Стевия способна уменьшить боль и ускорить заживление в случае ожога и укуса ядовитых насекомых. Поможет в борьбе с некоторыми кожными болезнями, такими как экземами и дерматитами. Используется как противовоспалительное, желчегонное, противоаллергическое и мочегонное средство (Curi. 1985).

Стевия повышает эффективность работы почек, селезенки, поджелудочной железы, печени и щитовидной железы. При постоянном употреблении происходит укрепление кровеносных сосудов, улучшение свойств текучесть крови, что является существенным фактором при лечении и закупорки сосудов и образования тромбов. Она оказывает положительное влияние на иммунную систему, выведению из организма вредных веществ, шлаков, продуктов обмена, способствует улучшению обмена веществ и снижению уровня радионуклидов и холестерина в крови, постепенному и стабильному эффекту при снижении веса (Sakamoto, Yamasaki, Tanaka, 1977).

При лечении остеоартрозов артритов также эффективно применение препаратов со стевией, так как при этой патологии происходит нарушение обмена веществ и возникает необходимость ограничивать употребление сахара.

Незаменимость стевии в качестве профилактического средства в борьбе против различных болезней подтверждено экспериментами российских ученых. Наблюдали её восстановительные свойства, которые помогают организму в репарации тканей и клеток, и антиоксидантные свойства, которые важны в профилактики новообразований и их лечения (Sakamoto, Yamasaki, Tanaka, 1977). Стевиозид позволяет избежать повреждений и не даёт образоваться язвам на слизистой оболочке кишечника и желудка, на желудочно-кишечном тракте, показан в употреблении вместе с агрессивными лекарствами.

1.1.6 Содержание ДГ в растениях стевии

Накопление ДГ в растениях происходит неравномерно. Максимальное количество содержится в листьях (около 20 мг/г сухой массы). В значительно меньшем количестве гликозиды содержатся в соцветиях (преимущественно в листочках обертки) - в 7-10 раз, и в стеблях - в 10-16 раза ниже, чем в листьях. В корнях содержание ДГ было в 40 раз ниже по сравнению с содержанием в листьях, менее 0.1 % от сухой массы. В стареющих листьях, расположенных в нижней части побегов, содержится ДГ меньше, чем в активно растущих листьях верхнего яруса (Bondarev, 2003).

Количество гликозидов плавно увеличивается в надземных вегетативных органах (стебли и листья) в течение онтогенеза во время активного вегетативного роста вплоть до начала цветения. Максимальное содержание стевиол-гликозидов в листьях стевии наблюдается перед фазой бутонизации. Сразу после окончания фазы цветения в 2 раза снижается содержание ДГ. Качественный состав стевиол-гликозидов одинаков во всех органах растения (Суханова, 2002).

Что касается пробирочных растений, то в листьях содержание ДГ было ниже в 5-6 раз, а в стеблях - в 3 раза, по сравнению с аналогичными органами интактных растений (Bondarev, 2003).

1.2 Изучение стевии в культуре in vitro и in vivo

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что стевия привлекает исследователей как в области клеточной инженерии, так и в области генной инженерии растений. Основная часть работ направлена на изучение вторичных метаболитов, как в дифференцированных, так и в дедифференцированных клетках. Это связано именно с тем, что растения стевии является источником ценных дитерпеновых гликозидов, а современные физико-химические методы позволяет проводить высококачественную очистку продуктов переработки стевии (Abou-Arab, 2010).

Следует отметить, что большее число работ направлено на изучение влияния различных условий выращивания на клональное микроразмножение стевии in vitro, а также на управление синтезом дитерпеновых гликозидов. В качестве первичного экспланта исследователи используют семена, сегменты стеблей с двумя пазучными почками, а также изолированные листовые пластинки.

Известно, что в природе стевия размножается семенами, но их репродукция требует определенных условий. Трудность работы с семенами состоит в том, что они очень мелкие и быстро теряют всхожесть (Alvarenga-Venutolo & Salazar-Aguilar, 2015; Goettemoeller & Ching, 1999). Поэтому проводятся исследования по подбору условий введения семян стевии в культуру in vitro. В ряде работ приводятся результаты по исследованию влияния различных стерилизующих агентов на получение асептической культуры, на всхожесть семян и формирование проростков (Бутенко, 1999; Молканова, 2002; Муратова, 2003; Муратова, 2004; Тхуи, 2013; Bajaj, 1988; Соловьева, 1991; Сковородников, 2012; Тимофеева, 2012). Согласно результатам отечественных исследований (Васильченко, 2016), наибольшее число стерильных проростков (96%) было получено при стерилизации семян стевии этиловым спиртом 96% в течение 10 секунд, с последующим

выдерживанием их в 10% растворе хлорамина в течение 10 минут. В случае применения в качестве стерилизатора раствор анолита и кратковременное воздействие на семена этилового спирта, а затем хлорамин 10% наблюдали получение в 100% случаев стерильные семена. При такой схеме стерилизации всхожесть семян составила 34% (Васильченко, 2016). В работах зарубежных исследователей (Rosales, Brenes, Salas, 2017) были применены другие методики по получению стерильных семян стевии. Первоначально семена промывали водой с антибактериальным мылом, затем погружали в раствор Агримицина (5 г/л) и Бенлата (5 г/л) на 60 мин. После этого их дезинфицировали гипохлоритом кальция (1,8 %) в течение 10 мин. и промывали трижды стерильной дистиллированной водой. Затем, семена выдерживали в стерильном растворе с антиоксидантами (лимонная кислота и аскорбиновая кислота, по 100 г/л каждого) перед помещением в культуральную среду.

Основной способ размножения стевии in vitro является - клональное микроразмножение (Деменко, 2007; Ковалева, 2000; Молканова, 2002; Sivaram, 2003; Шульгина, 2017). Несмотря на более высокую стоимость получения растений и необходимость наличия квалифицированного ручного труда (Chu, 1990; Кутас, 1997), данный метод позволяет получить большое количество растений с признаками материнского растения в сравнительно краткие сроки (Муратова, 2004; Vilchez & Albany, 2014; Навроцкая 2019). Он даёт возможность в течение одного года получать генетически однородный и безвирусный посадочный материал (Приходько, 1996; Высоцкий, 1998; Воронина, 1977), а также ускорять селекционный процесс. Как показывают исследования, проведенные с культурой стевии in vitro (Бутенко, 1999; Молканова, 2002; Муратова, 2003; Муратова, 2004; Тхуи, 2013), данные биотехнологические подходы являются перспективными и альтернативными методами быстрого размножения и получения дедифференцированных клеточных линий, способных синтезировать и накапливать вещества вторичного метаболизма (Andolfi, 2006).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шульгина Алла Андреевна, 2020 год

Список литературы

1. Аверчева, О. В. Физиологические эффекты узкополосного красно-синего освещения растений: на примере китайской капусты Brassica chinensis L. Автореферат диссертации канд. биол. наук 03.01.05 / Аверчева, Ольга Владимировна - М., 2010 - 26 с.

2. Аладина, О. Н. Укоренение и выращивание крыжовника в контейнерах / О. Н. Аладина, С. В. Акимова, С. Ю. Чернова, Д. Н. Никиточкин // Доклады ТСХА. - 2006. - Вып. 278. - С. 410-413.

3. Аладина, О. Н. Качество укорененных черенков ягодных культур в зависимости от их обработки регуляторами роста в период корнеобразования / О. Н. Аладина, И. И Ханжиян // Регуляторы роста и развития растений: тез. докладов 5-ой Междунар. конф., 29 июня - 1 июля 1999 года. - М. - С. 145.

4. Аладина, О. Н. Применение регуляторов роста в технологии размножения крыжовника / О. Н. Аладина, А. Н. Лесничева, Н. В. Агафонов // Известия ТСХА. - 1989. - Вып. 4. - С. 107-113.

5. Батукаев, А. А. Совершенствование технологии ускоренного размножения винограда методом in vitro и применение регуляторов роста в условиях in 171 vitro и in vivo: автореферат дисертации д-ра с.-х. наук: 06.01.08 / Абдулмалик Абдулхамидович Батукаев - М., 1999. - 60 с.

6. Бахарев, И. Применение светодиодных светильников для освещения теплиц: реальность и перспектива. / И. Бахарев, А. Прокофьев, А. Туркин, А. Яковлев / Современные технологии автоматизации. - 2010. - No 2. - С. 76-82.

7. Бондарев, Н. И. Влияние интенсивности света и фотопериода на накопление стевиол-гликозидов в культурах Stevia rebaudiana in vitro. / Н. И. Бондарев, О. В. Решетняк, А. М. Носов // Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования: материалы VI Международного симпозиума / Всероссийский научно-исследовательский

институт селекции и семеноводства овощных культур. - М., 2005. - С. 234-236.

8. Бондарев, Н. И. Дитерпеновые гликозиды в интактных растениях и культурах in vitro стевии (Stevia rebaudiana Bertoni). автореф. дис. д. б. н. 03.01.05/ Бондарев Николай Ильич М., 2011 - 49 с.

9. Бондарев, Н.И. Морфология и ультраструктура трихомов интактных и in vitro растений Stevia reubadiana Bertoni в связи с образованием и накоплением стевиол-гликозидов. / Н. И. Бондарев, М. А. Суханова, Г. А. Семенова, О. В. Горяева, С. Е. Андреева, А. М. Носов // Вестн. Моск. унта. Сер. 16. Биология. - 2010. - №1. - С. 15-20.

10. Бутенко, Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе / Р. Г. Бутенко - М.: ФБК-Пресс -1999. - 160 с.

11. Будаговский, А. В. Лазерные технологии в сельском хозяйстве / И. Б. Ковш. М. - 2008.

12. Будаговский А. В., Будаговская О.Н., Соловых Н.В., Янковская М. Б., Маслова М. В. Применение лазерной досветки для снижения энергозатрат при размножении растений в культуре in vitro. Вестник ВИЭСХ - 2016 -T. 2(23) - C. 12-16.

13. Будаговский А.В. Стимуляция ризогенеза красной и черной малин in vitro с использованием когерентного излучения. / Соловых Н.В. // Аграрная наука Евро-Северо-Востока, 2018, 5 (66) - С. 64-68.

14. Будаговский А. В. Теория и практика лазерной обработки растений, Мичуринск-наукоград РФ, 2008.

15. Будаговский А. В. Дистанционное межклеточное взаимодействие. М., 2004.

16. Ванидзе, М. Р. Идентификация и количественное определение дитерпеновых гликозидов в растении стевия (Stevia rebaudiana Bertoni) / Каландия А.Г., Чануквадзе Х. Р. // Химия растительного сырья - 2009 -№4. - С. 155-158.

17. Васильченко, Е. Н. Микроклональное размножение стевии (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsl.) в культуре in vitro. Международный научный журнал «Символ науки». 2016 - №6 - С. 19-20.

18. Верзилина, Н. Д. Стевия (Stevia rebaudiana Bertoni) в Центральном Черноземе (агробиологические и физиолого- биохимические аспекты культуры): автореферат диссертации д-ра с.-х. наук / Верзилина Н. Д. -Воронеж, 2005. - 44 с.

19. Воскресенская, Н.П. Действие синего, красного и зеленого света на содержание белка, нуклеиновых кислот и хлорофилла в молодых растениях ячменя / Н. П. Воскресенская, Е. П. Нечаева // Физиология растений. 1967. - Т. 14, № 2. - С. 299-307.

20. Воскресенская, Н.П. Синий свет как фактор регуляции активности РНК-полимераз у проростков ячменя / Н. П. Воскресенская, И. С. Дроздова, Е. Г. Романенко и др. И Физиология растений. 1984. - Т. 31. -С. 82-88.

21. Воронина, А. И. Размножение и выращивание оздоровленного посадочного материала ягодных культур / А. И. Воронина, Е. И. Глебова, А. И. Поташова. - Л.: Колос - 1977. - C. 96.

22. Воскресенская, Н.П. Фотосинтез и спектральный состав света. / Н. П. Воскресенская. - М.: Наука, 1965. - 220с.

23. Высоцкий, В. А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала плодово-ягодных культур: автореферат диссертации д-ра с.-х. наук: 06.01.07; 03.00.12 / Высоцкий Валерий Александрович - М. - 1998. - 44 с.

24. Головацкая, И. Ф. Влияние света на баланс фитогормонов и рост проростков овса / И. Ф. Головацкая, Р.А. Карначук, А. В. Никитина и др. II Физиология и биохимия культурных растений. 2000. - Т. 32, № 6. - С. 453-461.

25. Головацкая, И. Ф. Влияние света разного спектрального состава на рост и гормональный комплекс листа растений: диссертация канд. биол.

наук: 07.00.46: защищена 26.06.92: утв. 27.11.92 / И. Ф. Головацкая. Томск - 1992. - С.117.

26. Головацкая, И. Ф. Гормональная регуляция роста в онтогенезе листа растений на свету / И. Ф. Головацкая, Р. А. Карначук, П. В. Власов II Вопросы взаимосвязи фотосинтеза и дыхания. Томск: изд-во Томск, ун-та - 1988. - С. 169-173.

27. Головацкая, И.Ф. Рецепция зеленого света проростками Arabidopsis thaliana / И.Ф. Головацкая, В.А. Светличный, М. В. Ефимова и др. Ионосферные знания и технологии / Под ред. Г. В. Майера Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. - Вып. 1. - С. 23-26. Гуськов, А.В. Метаболизм ауксинов в растениях и его регуляция / А.В. Гуськов II Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Физиология растений - 1991. - Т. 8. - С. 1-151.

28. Горбатенко, Л. Е. Результаты работы Всесоюзного НИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова по интродукции стевии. / Л. Е. Горбатенко, О. О. Дзюба // III Международная научно-производственная конференция «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений». - Пенза, 2000. - Т. 1. - С. 27-28

29. Деменко, В. И. Микроклональное размножение садовых растений: Учебное пособие для студентов по специальности 310300 -"Плодоовощеводство и виноградарство" / В. И. Деменко // М-во сел. хоз-ва Рос. Федерации, Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К. А. Тимирязева. - М.: ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА - 2007. - 55 с.

30. Доан, Тху Тхуи. Особенности клонального микроразмножения редких и лекарственных растений (Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky. и Aristolochia manshuriensis Kom.): дис. ... канд. биологических наук: 03.01.06 / Доан Тху Тхуи. - М.: МСХА, 2013. - 24 с.

31. Емелин, А. А. Спектральный аспект при использовании облучателей со светодиодами для выращивания салатных растений в условиях

светокультуры Прикупец Л. Б., Тараканов И. Г. / Светотехника. - 2015. -№ 4. - С. 47-52.

32. Запрометов, М.Н. Светорегуляция вторичного метаболизма растений // Физиология растений / М.Н. Запрометов - 1987. - Т. 34, вып. 4. - С. 698-711.

33. Земская, В. А. Физиология растений / В. А. Земская, Ю. В. Ракитин, Л. М. Черникова, З. В. Калиберная. - 1971. - Т. 18, вып. 4. - С.184-185.

34. Калашникова, Е. А. Лабораторный практикум по культуре клеток и тканей растений (учебное пособие) / Чередниченко М. Ю., Киракосян Р. Н, Зайцева С. М., Кочиева Е. З., Карсункина Н. П., Халилуев М. Р.; Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К. А. Тимирязева, Факультет агрономии и биотехнологии, Кафедра генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства. - Москва: ФГБНУ "Росинформагротех" - 2017. - 138 с.

35. Калашникова, Е. А. Клеточная инженерия растений: курс лекций / Изд-во РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева - 2009. - 93 с. М.: Изд-во РГАУ-МСХА, 2012. - 318.

36. Калашникова, Е. А. Применение аэропоники для адаптации микроклонов растений рода Rubus L. / Киракосян Р. Н., Чуксин И. С., Швец Д. А., Аладина О. Н. // Проблемы развития АПК региона. — 2019. — № 4 (40) - С. 64-71.

37. Калашникова, Е. А. Современные аспекты биотехнологии. / Р. Н. Киракосян. // Учебно-методическое пособие. М.: Изд-во РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева - 2016 - 125 с.

38. Калашникова, Е. А. Технология адаптации микроклонов Vitisvinifera к условиям ex vitro. / Киракосян Р. Н., Чуксин И. С., Навроцкая Э. В., Аладина О. Н. // Проблемы развития АПК региона. — 2019 —№ 3 (39). — С. 69-74.

39. Калер, В. Л. Фоторегуляция биосинтеза хлорофилла и развития хлоропластов / В. Л. Ка-лер, Е. Г. Савченко, М. Т. Чайка II Физиология растений - 1987. - Т. 34, вып. 4. - С. 656-668.

40. Карначук, Р. А. Гормональный баланс листа растений на свету разного спектрального состава / Р. А. Карначук, В. А. Негрецкий, И. Ф. Головацкая II Физиология растений - 1990. - Т. 37, вып. З. - С. 527-534.

41. Карначук, Р.А. К вопросу об участии антоцианинов в реакциях фотосинтеза / Р. А. Карначук, И. Ф. Головацкая, Н. С. Новикова II Оперативные информационные материалы. Иркутск: Сиб. ин-т физиологии и биохимии растений СО АН СССР - 1985. - С. 40-12.

42. Карпова, О. В. Возможность использования элиситоров при клональпом микроразмножении ежевики / О. В. Карпова, В. Л. Высоцкий // 175 Плодоводство и ягодоводство России: сб. научных работ. - М., 1999. - Т. 6. - С. 84-87.

43. Карпова, О. В. Адаптация пробирочных растений ягодных культур и последействие криосохранения: автореферат дисертации канд. с.-х. наук: 06.01.07 / Карпова Ольга Викторовна. - М., 2000. - 24 с.

44. Клюваденко, А. А. Особенности получения асептической культуры голубики высокорослой (vaccinium corymbosum l.) / А. А. Клюваденко, О. Ю. Чорнобров, А. Ф. Лиханов // Биологически активные вещества растений - изучение и использование: материалы Междунар. научной конф. / Нац. академия наук Беларуси - Центральный ботанический сад, Отдел биохимии и биотехнологии растений. - Минск, 2013. - С. 331.

45. Ковалева, И.С. Усовершенствование методик клонального микроразмножения и адаптации малино-ежевичного гибрида Тайберри / И. С. Ковалева, Т. В. Данилова, О. И. Молканова // Бюлл. ГБС, 2000. -Вып. 179. - С. 85-91.

46. Константинова, Т. Н. Взаимное влияние света и гормонов на регуляцию морфогенетических процессов в культуре in vitro / Т. Н.

Константинова, Н. П. Аксенова, Л. И. Сергеева, М. Х. Чашахян // Физиология растений. 1987. - Т. 34, № 4. - С. 795-802.

47. Константинова, Т. Н. Влияние спектрального состава света на развитие рудбекии и периллы в условиях длинного и короткого дня / Т. Н. Константинова, Н. П. Аксенова, А. А. Никитина II Физиология растений -1968. - Т. 15, № 2. - С. 363-366.

48. Корниенко, А. В. Характерные особенности и условия выращивания стевии (Stevia rebaudiana Bertoni). / Знаменская В. В., Жужжалова Т. П. // Первый международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования». - Тез. докладов. -Пущино. - 1995. - С. 579-581.

49. Кособрюхов, А. А. Влияние дополнительного люминесцентного излучения низкой интенсивности с максимумом 625 нм на рост и фотосинтез растений / А. А. Кособрюхов, В. Д. Креславский, Р. Н. Храмов и др. II Biotronics - 2000. - № 25. - С. 23-31.

50. Кочетова, Н. И. Особенности регенерации растений крыжовника в условиях in vitro. / Н. И. Кочетова, Л. В., Алешкевич, Ю. В., Кочетов Ю. В. // Вестник с.-х. науки. - 1981. - № 2. - С. 80-82.

51. Крючкова, В. А. Биотехнологические приемы оптимизации микроклолнального размножения и адаптации генотипов сирени: автореф. дис. ... канд. с.-х. наук: 06.01.05, 03.00.23 / Крючкова Виктория Александровна. - М., 2005. - 49 с.

52. Крючкова, В. А. Взаимосвязь между гормональным составом питательной среды при укоренении сирени in vitro и последующей адаптацией к нестерильным условиям / В. А. Крючкова, Е. В. Мамонов, В. И. Деменко // Доклады ТСХА. - М., 2005. - Вып. 277. - С. 450-453.

53. Крючкова, В. А. Приживаемость сирени, размноженнной, при адаптации в культивационных сооружениях. / В. А. Крючкова, В. И. Деменко, Е. В. Мамонов // Докл. ТСХА. - М., - 2004. - Вып. 276. - С. 449451.

54. Крючкова, В. А. Укореняемость сирени обыкновенной Syringa vulgaris L. in vitro в зависимости от регуляторов роста / В. А. Крючкова,

B. И. Деменко, Е. В. Мамонов // Доклады ТСХА. - М., 2002. - Вып. 274. -

C. 109-112.

55. Кутас, Е. Н. Научные основы клонального микроразмножения растений на примере интродуцированных сортов голубики высокой и брусники 178 обыкновенной: автореф. дис. д-ра биол. наук: 03.00.12 / Кутас Елена Николаевна. - М., 1997. - С. 35.

56. Куташова, С. М. Влияние цитокининов на эффективность микроклонального размножения крыжовника бесшипого in vitro. / С. М. Куташова, А. А. Эрст, С. Ю. Толузакова // Инновационное развитие АПК в России: Сборник докладов Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, 12-13 марта 2013 г. -Саратов: ГНУ НИИСХ Юго-Востока Россельхозакадемии, 2013. - 467 с.

57. Кухарчик, Н. В. Культура in vitro в размножении и оздоровлении плодовых и ягодных растений / Н. В. Кухарчик, С. Э. Семенас, Е. В. Колбанова // Актуальные проблемы освоения достижений науки в промышленном плодоводстве: материалы Междунар. научно-практ. конференции. - Минск, 2002. - С. 107-113.

58. Лисицин, В. Н. Стевия - источник здоровья и долголетия нации / В. Н. Лисицин, И. П. Ковалев // Пищевая промышленность. - 2000. - № 5. -С. 38-39.

59. Лисовский, Г. М. Интенсивность и качество света как факторы, определяющие формирование ценоза и урожай растений в светокультуре. / Г. М. Лисовский, Ф.Я. Сидъко, В. И. Полонский и др. II Физиология растений - 1987. - Т. 34, вып. 4. - С. 636-643.

60. Лукин, А.С. Применение аэропонных технологий для адаптации растений-регенерантов хризантем. / Чуксин И. С., Киракосян Р. Н., Калашникова Е. А. // В книге: Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии Сборник

тезисов докладов 19-ой Всероссийской конференции молодых учёных, посвященной памяти академика РАСХН Георгия Сергеевича Муромцева. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт

сельскохозяйственной биотехнологии». - 2019. - С. 19-21.

61. Матушкина, О. В. Влияние минерального состава питательной среды на морфогенез садовых растений in vitro. / О. В. Матушкина, И. Н. Пронина, Л. В. Ярмоленко, С. А. Матушкин // Достижения науки и техники АПК. - 2014. - № 1. - С. 41-42.

62. Молканова, О. И. Клональное микроразмножение представителей семейства крыжовниковых grossulariaceae dumant / О. И. Молканова, Л. Н. Коновалова, Т. В. Смирнова // Клональное Микроразмножение. Ботанические сады: состояние и перспективы сохранения, изучения, использования биологического разнообразия растительного мира: тезисы докладов Международной научной конференции, 30-31 мая 2002 / Центральный Ботанический сад НАН Беларуси. - Минск: БПГУ. - 2002. -С. 186.

63. Молканова, О. И. Клональное микроразмножение интродуцированных сортов Syringa vulgaris L. / О. И. Молканова, О. А. Чурикова, Л. Н. Коновалова, И. Б. Окунева // Вестн. Моск. ун-та, серия Биология. - 2002. - № 4. - С. 8-14.

64. Молканова, О. И. Использование регуляторов роста цитокининового ряда при микроклональном размножении сирени / О. И. Молканова, Л. Н. Коновалова // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях. -2001. - С. 180.

65. Мошков, Б. С. Выращивание растений на искусственном освещении / Б. С. Мошков. — M.-JL: Сельхозиздат - 1953. - 96с.

66. Муратова, С. А. Размножение ягодных культур in vitro. / С. А. Муратова, М. Б. Янковская, Н. В. Соловых, В. М. Тюленев //

Плодоводство. Ягодоводство на современном этапе. / Ин-т плодоводства Нац. акад. наук Беларуси. - 2004. - Т. 15. - С. 232-236.

67. Муратова, С. А. Повышение эффективности клонального микроразмножения плодовых, ягодных и декоративных культур / С. А. Муратова, М. Б. Янковская, В. М. Тюленев, Н. В. Соловых. // Экология человека. Концепция факторов риска и управления рисками: Сборник материалов 7-ой Всероссийской научно-практической конференция -Пенза, 2003. - С. 166-168.

68. Навроцкая, Э. В. Усовершенствование технологии адаптации микроклонов Vitis vinifera ex vitro. / Чуксин И. С., Киракосян Р. Н., Калашникова Е. А. // В книге: Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии Сборник тезисов докладов 19-ой Всероссийской конференции молодых учёных, посвященной памяти академика РАСХН Георгия Сергеевича Муромцева. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии». - 2019. - С. 24-25.

69. Навроцкая, Э. В. Усовершенствование технологии клонального микроразмножения винограда (Vitis vinifera). / Калашникова Е. А., Киракосян Р. Н. // В Сборнике: Проблемы и перспективы развития науки в России и мире. Сборник статей по итогам Международной научно-практической конференции. - 2019. - С. 10-12.

70. Негрецкий, В. А. Влияние зеленого света различной спектральной длины на цветение короткодневного растения мари красной (Chenopodium rubrum L.). / В. А. Негрецкий, В. Н. Ложникова, В. А. Каневский II Докл. АН СССР - 1990. - Т. 314, № 4. - С. 1016-1018.

71. Никонович, Т. В. Влияние спектрального состава света на процесс регенерации лилии Мартагон в культуре in vitro. / Т. В. Никонович, М. О. Моисеева, М. Ю. Шпак // Сборник научных работ «Плодоводство и ягодоводство России». Том ХХХШ. - 2012. - С. 387-395.

72. Никонович, Т. В. Влияние спектрального состава света на рост и развитие растений-регенерантов винограда в период адаптации к условиям in vitro / Т. В. Никонович, А. В. Левый, В. В. Французенок // Вестник БГСХА. - 2012. - No 2. - С. 70-75.

73. Поляков, С. А. Адаптация растений регенерантов земляники к неблагоприятным условиям / С. А. Поляков, С. П. Расторгуев, А. В. Верзилин // Повышение эффективности садоводства в современных условиях: материалы Всероссийской научно-практической конференции - Мичуринск-Наукоград РФ, 2003. - Т. 2 - С. 335-339.

74. Постовалова, В.М. Роль света разного спектрального состава в онтогенезе листа / В. М. Постовалова, Р. А. Карначук, Е. В. Прохорова и др. II Физиология растений - 1987. - Т. 31, вып. 4. - С. 752.

75. Приходько, Ю. Н. Технология оздоровления крыжовника от вирусов / Ю. Н. Приходько // Плодоводство и ягодоводство России. - 1996. - Т. 3 -С. 109-113.

76. Протасова, Н. Н. Светокультура как способ выявления потенциальной продуктивности растений / Н. Н. Протасова. II Физиология растений. - 1987. - Т. 34, № 4. - С. 812-822.

77. Протасова, Н. Н. Спектральные характеристики источников света и особенности растений в условиях искусственного освещения / Н. Н. Протасова, Дж. М. Уеллс, М. В. Добровольский, Л. Н. Цоглин II Физиология растений. - 1990. - Т. 37, вып. 2. - С. 386-395.

78. Ракитин, Ю. В. Биологически активные вещества как средства управления жизненными процессами растений / Ю.В. Ракитин II Научные основы защиты урожая. М.: Изд-во АН СССР. - 1963. - С. 7-42.

79. Ребров, А. Н. Адаптация растений винограда in vitro к условиям нестерильной среды: автореферат дис. канд. биол. наук: 06.01.07 / Ребров Антон Николаевич. - Краснодар, 2007. - С. 27.

80. Скалий, Л. П. Размножение растений зелеными черенками: Учеб. пособие / Л.П. Скалий, Е. Г. Самощенков; Департамент кадровой

политики и образования М-ва сел. хоз-ва Рос. Федерации. Моск. с.-х. акад. им. К. А. Тимирязева - М.: МСХА, 2002. - С. 111.

81. Сковородников, Д. Н. Совершенствование клонального микроразмножения крыжовника / Д. Н. Сковородников // Вестник Орел ГАУ, 2012. - №6 (39) - С. 24-27.

82. Сковородников, Д. Н. Совершенствование клонального микроразмножения крыжовника // Вестник орловского государственного аграрного университета. - 2012. - Т. 39, №6. - С. 24-26.

83. Сковородников, Д. Н. Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины: автореферат дис. канд. с.-х. наук: 06.01.05, 03.00.12 / Сковородников Дмитрий Николаевич. - Брянск, 2004. - С. 20.

84. Соловьева, И. И. Клональное микроразмножение крыжовника / И. И. Соловьева // Ускоренное размножение посадочного материала плодово-ягодных культур с использованием биотехнологических методов. - Алма-Ата, 1991. - С. 108-111.

85. Соловых, Н. В. Стимуляция ризогенеза красной и черной малин in vitro с использованием когерентного излучения. / Будаговский А. В. // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. - 2018 - № 5(66) - С. 64-68.

86. Суханова, М. А. Синтез и накопление стевиол-гликозидов в растениях и культурах клеток стевии: Stevia rebaudiana Bertoni. Автореферат дис. канд. биол. наук: 03.00.12, Суханова, Марина Александровна. - 2002

87. Тараканов, И. Г. Жизненные стратегии растений в зависимости от световых условий витальная и сигнальная роль света. / И. Г. Тараканов // Мир теплиц. - 2005 - № 6 - С. 34-35.

88. Тимофеева, О. А. Клональное микроразмножение растений: учебно-методическое пособие / О. А. Тимофеева, Ю. Ю. Невмержицкая - Казань: Казанский университет, 2012. - 56 с.

89. Титаренко, Т. Е. Оптимизация методов введения в культуру in vitro некоторых ягодных культур - смородины чёрной (Ribes nigrum L.), смородины красной (Ribes rubrum L.) и крыжовника (Ribes uvacrispa L.) / Т. Е. Титаренко // Бютехнолопя. Наука. Освгга. Практика: тези доповщей IV Мiжнародноl науково-практично! конференци, Дншропетровськ, 11 -13 листопада 2008 р. - Дншропетровськ, 2008. - С. 174-175.

90. Тихомиров, А. А. Проблема оптимизации спектральных и энергетических характеристик излучения растениеводческих ламп / А. А. Тихомиров, Г. М. Лисовский, Ф. Я. Сидъко и др. II Препринт ИРСО-28 Б. Красноярск. - 1983. - С. 47.

91. Тихомиров, А. А. Роль спектра и интенсивности ФАР в прохождении онтогенеза растений различных видов / А. А. Тихомиров, Г. М. Лисовский, К. Г. Золотухин II Второй съезд Веер, обществва физиологов растений: Минск, 24-29 сентября 1990. М., 1990. - С. 46.

92. Тихомиров, А. А. Светокультура растений в теплицах / А. А. Тихомиров, В. П. Шарупич, Г. М. Лисовский // Издательство СО РАН. -Новосибирск, 2013. - С. 205.

93. Тихомиров, А. А. Спектральный состав света и продуктивность растений / А. А. Тихомиров, Г. М. Лисовский, Ф. Я. Сидъко. Новосибирск: Наука Сиб. Отделение. - 1991. - 168 с.

94. Трухачев, В. И. Содержание сладких гликозидов в листьях стевии на разных фонах минерального удобрения в условиях выщелоченного чернозема Центрального Предкавказья / А. А. Кривенко, Г. П. Стародубцева, В. И. Жабина, С. И. Любая // Современные направления теоретических и прикладных исследований : Международная научно-практическая конференция (г. Одесса, 15-25 марта 2007 г.). - Одесса, 2007.- С. 14-17.

95. Упадышев, М. Т. Особенности клонального микроразмножения сортовой сирени / М. Т. Упадышев, М. П. Лапинская // Новые и

нетрадиционные растения и перспективы их использования: 4-ый Международный симпозиум - М., 2001. - Т.1. - С. 453-455.

96. Чижик, О. В. Адаптация клонированного посадочного материала древеснокустарниковых видов рода vaccinium с использованием комплексного микробного препарата / О. В. Чижик, В. Л. Филипеня, В. И. Горбацевич, В. Н. Решетников, Л. Е. Картыжова, З. М. Алещенкова // К 75-летию академика НАН Беларуси В. Н. Решетникова: матер. Международной научной конференции, 29-31 мая 2013 г. - Минск, 2013.

- С. 348-349.

97. Шалаева, Е. Е. Спектральный состав света и некоторые особенности мезоструктуры листьев различных растений / Е. Е. Шалаева, Г. М. Лисовский, А. А. Тихомиров II Физиология растений. - 1991. - Т. 38, № 1.

- С. 55-62.

98. Шевелуха, В.С. Сельскохозяйственная биотехнология / Калашникова Е. А., Дегтярев С. В. и др.// Под ред. Шевелухи В.С. - М.: Высшая школа, 1998 - С. 416.

99. Швец, Д. А. Оптимизация технологии клонального микроразмножения ягодных культур рода Rubus. Калашникова Е. А., Киракосян Р. Н. // В сборнике: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ НАУКИ В РОССИИ И МИРЕ сборник статей по итогам Международной научно-практической конференции. - 2019. - С. 15-18.

100. Швец, Д.А. Применение аэропонной системы для адаптации микроклонов рода Rubus. / Калашникова Е. А., Чуксин И. С., Киракосян Р. Н. // В книге: Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии Сборник тезисов докладов 19-ой Всероссийской конференции молодых учёных, посвященной памяти академика РАСХН Георгия Сергеевича Муромцева. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии». - 2019. - С. 30-32.

101. Шульгин, И. А. Влияние спектрального состава света, интенсивности радиации, продолжительности фотопериодов на развитие растений, рост и морфогенез растений / И. А. Шульгин, Ф. М. Куперман, В. М. Мерцалов II Вестн. с.-х. науки. - 1963. - № 4. - С. 21-33.

102. Шульгина, А.А., Калашникова Е. А., Тараканов И. Г. Влияние факторов гормональной и физической природы на морфобиохимические показатели Stevia rebaudiana Bertoni in vitro и in vivo. Труды Кубанского государственного аграрного университета, Ялта - 2017. - Т. 66, № 3 (1) -С. 253-257.

103. Шульгина, А.А. Зависимость морфофизиологических показателей от условий выращивания Stevia rebaudiana Bertoni в условиях in vitro. / Калашникова Е. А. // Ежемесячный научно-практический журнал Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2017. - Т. 20, № 6 - С. 46-50.

104. Яковцева, М. Н., Технология выращивания растений земляники садовой (Fragaria х ananassa Duch.) на основе использования узкополосного спектра фотосинтетически активной радиации / М. Н. Яковцева, И. Г. Тараканов // Сборник материалов региональной научно-практической конференции молодых учёных «Перспективы развития АПК в работах молодых ученых» / ГАУ Северного Зауралья. Тюмень: ГАУСЗ. - 2014. - С. 177-180.

105. Яковцева, М. Н., Фотоморфогенетическая регуляция роста и развития земляники садовой в светокультуре / М. Н. Яковцева, И. С. Буланова, Г. Ф. Говорова, И. Г. Тараканов // Материалы VIII Съезда общества физиологов растений России. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. - 2015 - С. 613.

106. Abou-Arab, A. Physico-chemical assessment of natural sweeteners steviosides produced from Stevia rebaudiana Bertoni plant / A. Abou-Arab and M. F. Abu-Salem // African Journal of Food Science. - 2010. - Vol. 4. - Р. 269-281.

107. Amzad-Hossain, M. Chemical composition of the essential oils of Stevia rebaudiana Bertoni leaves / M. Amzad-Hossain, A. Siddique, S. Mizanur-Rahman and M. Amzad Hossain // Asian Journal of Traditional Medicines. -2010. - Vol. 5. - P. 56-61.

108. Andolfi, L. Agronomic-productive characteristics of two genotype of Stevia rebaudiana in Central Italy. / Macchia, M., & Ceccarini, L. // Italian Journal of Agronomy, 2006 1(2) - P. 257-262.

109. Bajaj, Y. P. S., Furmanowa M., Olszowska O. Biotechnology of the micropropagation of medicinal and aromatic plants // Medicinal and aromatic plants I. - Springer Berlin Heidelberg, 1988. - C. 60-103.

110. Ballare, C. L. Light signals perceived by crop and weed plants. / Casal J. J. // Field Crops Res. - 2000. - V. 67. - № 2. - P. 149-158.

111. Blaaw-Jansen, G. The influence of red and far-red light on growth and phototropism of the Avena seedling / G. Blaaw-Jansen II Thesis Univ.Utrecht. Netherlands. - 1959. - P.234.

112. Bondarev N. I. et al. Steviol glycoside content in different organs of Stevia rebaudiana and its dynamics during ontogeny // Biologia plantarum. - 2003. -T. 47, №. 2. - C. 261-264.

113. Bowden, A. Transferring tissue-cultured plants - in particular grevilleas -to the nursery environment // Comb. Proc. Intern. Plant Propagators' Soc. -1985. - Vol. 34. - P. 76-78.

114. Brainerd, K. E. Acclimatization of in vitro of apple and plum trees to low relative humidity / K. E. Brainerd // Thesis (Ph. D.). - Oregon State University. - 1982. Vol. 80. - P.120-121.

115. Brandle, J. E., Starratt A. N., Gijzen M. Stevia rebaudiana: Its agricultural, biological, and chemical properties // Canadian journal of plant science. -1998. - T. 78. - №. 4. - C. 527-536.

116. Brandle, J. E. Steviol glycoside biosynthesis / J. E. Brandle, P. G. Telmer. // Phytochemistry. - 2007. - № 68. - P. 1855-1863.

117. Briggs, W.R. Blue-light photoreceptors in higher plants. / Huala E. // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. - 1999. - V. 15. - P. 33-62.

118. Carakostas, M. C. et al. Overview: the history, technical function and safety of rebaudioside A, a naturally occurring steviol glycoside, for use in food and beverages // Food and Chemical Toxicology. - 2008. - T. 46. - №. 7. - P. S1-S10.

119. Chen T. H. et al. Mechanism of the Hypoglycemic Effect of Stevioside, Glycoside //Planta medica. - 2005. - T. 71. - №. 02. - C. 108-113.

120. Chory, J. From seed germination to flowering, light controls plant development via the pigment phytochrome / J. Chory, M. Chatterjee, R. K. Cook et al. // II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - Vol. 93. - P. 1206612071.

121. Chu I. Y. E. et al. Commercialization of plant micropropagation //Handbook of plant cell culture. Ornamental species. - 1990. - C. 126-164.

122. Curi R. et al. Effect of Stevia rebaudiana on glucose tolerance in normal adult humans // Brazilian journal of medical and biological research; Revista brasileira de pesquisas médicas e biológicas/ Sociedade Brasileira de Biofísica et al. - 1985. - T. 19. - №. 6. - C. 771-774.

123. Dale, J. E. Light and cell division in primary leaves of Phaseolus / J. E. Dale, D. Murray II Proc. R. Soc. B. 1969. - Vol. 173. - P. 541-553.

124. Drainerd, E. Acclimatization of Aseptically cultured Apple Plants to Low Relative Humidity / E. Drainerd et.al // J. Am. Soc. Hort. Sci. 1981. - Vol. 106, N 4. - P. 515-518.

125. Fankhauser, C. Light perception in plants: cytokinins and red light join forces to keep phytochrome B active. / C. Fankhauser. Trends Plant Sci. -2002. - Vol. 7, № 4. - P. 143-145.

126. Folta, K. M. Green light: a signal to slow down or stop / K. M. Folta, S. A. Maruhnich II J. Exp. Bot. - 2007. - P. 1-13.

127. Frankhauser C. Light perception in plants: cytokinins and red light join forces to keep phytochrome B active // Trends in Plant Science. - 2002. - V. 7.

- P. 143-145.

128. Frederico, A. P. Chromosome studies in some Stevia (Compositae) species from southern Brasil. / Ruas P.M., Marin-Morales M.A., Ruas C.F., Nakajima J.M. // Bras. J. Genet. - 1996. - Vol. 19. - P. 605-609.

129. Gupta, E. Nutritional and therapeutic values of Stevia rebaudiana: A Review / E. Gupta, S. Purwar, S. Sundaram, & G. K. Rai // Journal of Medicinal Plants Research. - 2013. - Vol. 7 (46). - P. 3343-3353.

130. Hajime, M. Enzymatic determination of stevioside in Stevia rebaudiana Text. / M. Hajime // Phytochem. 1982 - V.21. - N. 8. - P. 1927-1930.

131. Jeppesen, P. B. Stevioside induces antihyperglycaemic, insulinotropic and glucagonostatic effects in vivo: studies in the diabetic Goto-Kakizaki (GK) rats / P. B. Jeppesen, S. Gregersen, K. K. Alstrup, K. Hermansen // Phytomedicine.

- 2002. - Vol. 9. - P. 9-14.

132. Kim, S. J., Hahn E. J., Heo J. W., Paek K. Y. Effects of LEDs on net photosynthetic rate, growth and leaf stomata of chrysanthemum plantlets in vitro. Horticulture Science. - 2004, 101 - P. 143-151.

133. Kohda, H., Kasai R., Yamasaki K., Murakami K. and Tanaka O. New sweet diterpene glycosides from Stevia rebaudiana // Phytochemistry. 1976. -V. 15. - P. 981-983.

134. Kohler, K. H. The influence of light on the cytokinin content of Amaranthus seedlings / K. H. Kohler, M. Ddrfler, H. Goring. // II Biol. Plant. 1980. - Vol. 22, № 1. - P. 128.

135. Koyama, E. et al. In vitro metabolism of the glycosidic sweeteners, Stevia mixture and enzymatically modified Stevia in human intestinal microflora // Food and Chemical Toxicology. - 2003. - T. 41. - №. 3. - C. 359-374.

136. Kumar, H. et al. A comprehensive analysis of fifteen genes of steviol glycosides biosynthesis pathway in Stevia rebaudiana (Bertoni) // Gene. -2012. - T. 492. - №. 1. - C. 276-284.

137. Megeji, N. W. Introducing Stevia rebaudiana, a natural zero-calorie sweetener. J. K. Kumar, V. Singh, V. K. Kaul, & P. S. Ahuja. // Current Science. - 2005. - Vol. 88. - P. 801-804.

138. Muir, R. M. Effect of red light on coleoptile growth / R. M. Muir II Plant Physiol. - 1974. - Vol. 54. - P. 286-288.

139. Muanda, F. N. Study on chemical composition and biological activities of essential oil and extracts from Stevia rebaudiana leaves / F. N. Muanda, R. Soulimani, B. Diop and A. Dicko // LWT- Food Sc. Technol. - 2011. - Vol. 3. - P. 1-8.

140. Muthu, S. Red, green, and blue LEDs for white light illumination. / Schuurmans F. J. P., Pashley M. D. //Selected Topics in Quantum Electronics, IEEE Journal of. - 2002. - T. 8. - №. 2. - C. 333-338.

141. Negretsky, V. The effect of green light quality on flowering of short-day plants / V. Negretsky, V. Lozhnikova, V. Kavevsky H Physiol. Plant. - 1990. -Vol. 79, № 2, Pt 2. - P. 20.

142. Ohashi-Kaneko, K., Takase M., Kon N., Fujiwara K., Kurata K. Effect of light quality on growth and vegetable quality in leaf lettuce, spinach and komatsuna. Environ. Control Biology. - 2007, 45 - 189-198.

143. Oliveira, V. M. Chromosomal and morphological studies of diploid and polyploid cytotypes of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni (Eupatorieae, Asteraceae). / Forni-Martins E.R., Magalhaes P.M., Alves M.N. // Genet. Mol. Biol. - 2004. - Vol. 27. - P. 215-222.

144. Pol, J. Characterisation of Stevia rebaudiana by comprehensive two-dimensional liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry / J. Pol, B. Hohnova and T. Hyotylainen // J. Chromatogr A. - 2007. - Vol. 1150. - P. 85-92.

145. Rajapakse, N. C. Exclusion of far red light by photoselective greenhouse films reduces height of vegetable seedlings. / Li S. // Acta Horticulturae. -2004. - V. 631. - P. 193-199.

146. Ramesh, K., Singh V., Megeji N. W. Cultivation of Stevia rebaudiana (Bert.): A Comprehensive Review // Advances in Agronomy. - 2006. - T. 89.

- C. 137-177.

147. Sakamoto, I. Application of 13C NMR spectroscopy to chemistry of natural glycosides: rebaudioside-C, a new sweet diterpene glycoside of Stevia rebaudiana. / Yamasaki K. and Tanaka O. // Chem. Pharm. Bull. 1977. - V. 25. Megeji - P. 844-846.

148. Samuoliene, G. The effect of red and blue light component on the growth and development of frigo strawberries. / A. Brazaityte, A. Urbonaviciüte, G. Sabajeviene, P. Duchovskis // Zemdirbyste-Agriculture - 2010 -Vol. 97, No. 2

- P. 99-104. Schafer, E. Blue-light effects in phytochrome-mediated responses / E. Schafer, W. Haupt II See Ref. - 1983. - Vol. 126a. - P. 723-744.

149. Short, K. C. Rosa spp (Roses): In vitro culture, micro propagation and production of secondary products / K. S. Short, A. V. Roberts. // In: Bajaj Y. P. S. (Ed.). Biotechnology in Agriculture and Forestry. Medicinal and Aromatic Plants. III, Springer. - Verlag, Berlin, 1991. - Vol. 15. - P. 376-391.

150. Sivaram, L. In vitro culture studies on Stevia rebaudiana. / Mukundan U // In vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. - 2003. - T. 39. - №. 5. - C. 520-523.

151. Schmitt, J. Light spectral quality, phytochrome and competition. / Wulff R.D. // Trends in Ecology & Evolution. - 1993. - V. 8, № 2. - P. 47-51.

152. Starratt A. N. et al. Rebaudioside F, a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana // Phytochemistry. - 2002. - T. 59, №. 4. - C. 367-370.

153. Sutter, E. G. Physiological and anatomical aspects of water stress of cultured plants / E. G. Sutter, V. Novello, K. Shackel // Acta Horticulturae (230). - 1988. - P. 113-119.

154. Tadhani, M. B. In vitro antioxidant activities of Stevia rebaudiana leaves / M. B. Tadhani, V. H. Patel and R. Subhash // J. Food Comp. Anal. - 2007. -Vol. 20. - P. 323-329.

155. Tarakanov, I. G. Light control of growth and development in vegetable plants with various life strategies // Acta Horticulturae - 2006 - V 711 - P. 315-321.

156. Tarakanov, I. G. Light-emitting diodes: on the way to combinatorial lighting technologies for basic research and crop production. / Yakovleva O., Konovalova I., Paliutina G., Anisimov A. //Acta Horticulture. - 2012 -Vol. 956 - P.171-178.

157. Tarakanov, I. Studies of innovative biotech plant growth regulator on the basis of rhizosphere microflora metabolites / I. Tarakanov, T. Krasheninnikova, D. Cataldo, N. Nikishenkova, A. Sinitsin, E. Sinchurina // 20th International Conference on Plant Growth Substances. - Universitat Rovira I Virgili, Terragona. Spain. - 2010. - P. 142-143.

158. Tateo, F. et al. Stevioside content of Stevia rebaudiana (Bertoni) grown in east Paraguay // Italian journal of food science. - 1999. - T. 11., №. 3. - C. 265-269.

159. Thomas, M. Controlling vitrificution of petunia in vitro. / M. Thomas et al. // Program and Abstract. - 1988. - P. 758.

160. Yorio N. C., Goins G. D., Kagie H. R., Wheeler R. M., Sager J. C. Improving spinach, radish, and lettuce growth under red light-emitting diodes (LEDs) with blue light supplementation. Horticulture Science. - 2001, 36 - P. 380-383.

161. http://www.aeroponica.su