Сухой очищенный экстракт из листьев стевии (Stevia rebaudiana Bertoni), получение и стандартизация тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, кандидат фармацевтических наук Федоров, Сергей Владимирович

• Федоров, Сергей Владимирович
• кандидат фармацевтических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат фармацевтических наук Федоров, Сергей Владимирович

I. Введение.

И. Обзор литературы.

1. Природное нахождение дитерпеновых гликозидов.

2. Основные типы дитерпеновых гликозидов.

2.1. Сладкие дитерпеновые гликози ды стевии.

2.2. Рубозозиды.

2.3. Байунозид.

3. Структура и химические свойства стевиозида.

3.1. Установление структуры стевиозида.

3.2. Химия стевиола и изостевиола.

4. Получение стевиозида и остальных сладких дитерпеновых гликозидов стевии.

4.1. Выделение.

4.2. Синтез стевиозида.

5. Модифицированные дитерпеновые гликозиды.

5.1. Химическая модификация.

5.2. Ферментативная модификация.

6. Фармакологические свойства дитерпеновых гликозидов.

6.1. Исследование безвредности и биологической активности экстрактов стевии.

6.2. Фармакодинамические свойства экстракта стевии и стевиозида.

7. Применение " сладких "дитерпеновых гликозидов.

III. Результаты и их обсуждение.

1. Получение сухого очищенного экстракта из листьев стевии.

2. Разработка методики ТСХ для качественного определения стевиозида и его препаративного выделения из сухого очищенного экстракта из листьев стевии.;.

3. Разработка универсальной методики количественного определения стевиозида в растительном сырье и сухом очищенном экстракте из листьев стевии.

3.1. Подбор условий хроматографического разделения стевиозида.

3.2. Выбор длины волны детектирования.

3.3. Построение градуировочной кривой. Определение предела детектирования стевиозида.

3.4. Отработка условий экстракции стевиозида из растительного сырья и последующей очистки экстракта.

3.5. Метрологические характеристики методик анализа.

4. Контроль качества и стандартизация сухого очищенного экстракта из листьев стевии.

5. Исследование антивирусного и антибактериального действия сухого очищенного экстракта из листьев стевии.

IV. Экспериментальная часть.

1. Получение сухого очищенного экстракта из листьев стевии.

2. Препаративное выделение стевиозида из сухого очищенного экстракта методом ТСХ.

3. Качественное определение стевиозида в растительном сырье.

4. Количественное определение стевиозида в растительном сырье и сухом очищенном экстракте стевии методом ВЭЖХ.

4.1. Экстракция растительного сырья.

4.2. Очистка экстракта с помощью метода ТФЭ.

5. Исследование антивирусного и антибактериального действия сухого очищенного экстракта из листьев стевии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сухой очищенный экстракт из листьев стевии (Stevia rebaudiana Bertoni), получение и стандартизация»

В настоящее время одной из актуальных и первоочередных проблем отечественного здравоохранения является профилактика и лечение таких широко распространённых и трудно излечимых заболеваний, как диабет и гипогликемия. В связи с этим особое внимание уделяется поиску новых низкокалорийных, интенсивных и безвредных заменителей сахара. Повышенный спрос на низко калорийные напитки и продукты питания, а также высокая стоимость таких традиционных синтетических сахарозаменителей, как сахарин, ацесульфам, аспартам и цикломат стимулируют этот поиск [ 1 - 6 ].

Среди наиболее перспективных и эффективных современных природных подсластителей внимание привлекают сладкие дитерпеновые гликозиды, накапливающиеся в надземной части растения £Уеу/а геЬаисИапа Вейош (в дальнейшем -стевия) в достаточно большом количестве - до 20% в пересчёте на сухой вес и обладающие ярко выраженным сладким вкусом, в 250 - 300 раз превышающим сладость сахарозы. Стевия произрастает в основном в северной части Парагвая, а на сегодняшний день культивируется в промышленных масштабах в Бразилии, Израиле, Вьетнаме, Корее, Китае и Японии. В одной только Японии на нужды пищевой промышленности ежегодно тратится около 1700 тонн листьев стевии [ 7 ].

Экстракты стевии, фигурирующие на мировом рынке под названиями (^еуюэт», «81еу1х», и «МагитШоп 50», используются либо индивидуально, либо в композициях с другими средствами для подслащивания напитков и других продуктов питания [ 8 ].

Во многих странах мира - в первую очередь, в Японии, а также Бразилии, Корее, США, Парагвае, Лаосе, Китае, Индонезии, Таиланде и других - стевиозид, основной дитерпеновый гликозид стевии, используется как подсластитель в широком спектре продуктов питания: винах, безалкогольных напитках, плодово - ягодных сиропах, кондитерских изделиях, при производстве зубной пасты, жевательных резинок и косметических продуктов. Стевиозид нетоксичен, низко калориен, устойчив при температурной обработке (до 120°С) и в широком диапазоне значений рН (2 - 10) [9-13]. При условии применения в частных технологиях производства алкогольных и безалкогольных напитков, молочных продуктов, хлебобулочных и кондитерских изделий, а также майонезов, соусов и консервов, стевиозид наилучшим образом подходит для использования в процессах смешивания в слабокислых средах, в процессах высокотемпературной обработки и может быть внесён в рецептуру на любой стадии [ 9 -13].

В последние годы в различных странах проводятся интенсивные исследования терапевтического действия стевиозида при таких распространённых заболеваниях, как гипогликемия и диабет. Обнаружены также и другие лечебные свойства, так, экстракт стевии согласно последним данным проявляет контрацептивную и антивирусную активности [ 1,14 ].

Растущий интерес к продуктам переработки стевии и появление продуктов питания и пищевых добавок на основе стевиозида на российском рынке обуславливают необходимость разработки эффективных методик контроля их качества с использованием современных методов анализа. В связи с неординарными органолептическими свойствами и биологической активностью дитерпеновых гликозидов стевии требуется углублённое изучение физико - химических и биологических свойств данных соединений, а также совершенствование методов их выделения из растительного сырья.

Поэтому представляло интерес:

Разработать и оптимизировать универсальные и высокочувствительные методы стандартизации сухого очищенного экстракта стевии;

Совершенствовать способ выделения сухого очищенного экстракта из листьев стевии;

Оценить биологическую активность, в частности антивирусную и бактерицидную, полученного стандартизированного сухого очищенного экстракта стевии;

С этой целью в настоящей работе оптимизированы условия лабораторного получения сухого очищенного экстракта из листьев геЬаисИапа ВеЛот

МесИр1атех, Вьетнам) с содержанием стевиозида 65 - 80%.

Разработана и оптимизирована ТСХ - методика качественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки, позволяющая добиться чувствительности 0,5 мкг стевиозида.

Разработан метод ВЭЖХ для количественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки. Улучшены условия хроматографического разделения, а также разработан новый способ экстракции растительного сырья и последующей очистки экстракта с использованием метода твердофазной экстракции. Чувствительность методики составляет 1 мкг стевиозида.

Исследованы физико-химические свойства сухого очищенного экстракта из листьев стевии и индивидуального стевиозида (УФ-, ИК - спектры, спектры 13С - ЯМР, удельное вращение), а также общие физико - химические показатели: температура плавления и потеря в массе при высушивании. Полученные данные использованы для стандартизации и контроля качества продукции, содержащей сладкие дитерпеновые гликозиды Лег/а геЬаисИапа ВегЮш.

В результате впервые проведённых биологических исследований совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии установлено, что сухой очищенный экстракт, выделенный из листьев геЬаисИапа ВеЛош, обладает вирусстатическим и вирулицидным действием на ДНК- и РНК-содержащие вирусы, а также бактериостатическим и бактерицидным действием на возбудитель сибирской язвы в споровой форме.

II. Обзор литературы. и

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Федоров, Сергей Владимирович

V. Общие выводы

1. Оптимизированы условия лабораторного выделения сухого очищенного экстракта из листьев геЬаисИапа Вейош ( МесНр1ап1ех, Вьетнам) с содержанием стевиозида 65 - 72%.

2. Разработана и оптимизирована ТСХ - методика качественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки, позволяющая добиться чувствительности 0,5 мкг стевиозида.

3. Разработан метод ВЭЖХ для количественного определения стевиозида в растительном сырье и продуктах его переработки. Оптимизированы условия подготовки образца с использованием метода твердофазной экстракции. Коэффициент извлечения стевиозида с картриджа для твердофазной экстракции составлял не менее 95%, а средне квадратичное отклонение метода составляло < 2,1% (для п=5). Чувствительность методики составляет 1 мкг стевиозида.

4. Исследованы физико-химические свойства сухого очищенного экстракта стевии и индивидуального стевиозида (УФ-, ИК-спектры, спектры 13С - ЯМР, удельное вращение), а также общие числовые показатели: температура плавления и потеря в массе при высушивании. Полученные данные использованы для стандартизации и контроля качества продукции, содержащей сладкие дитерпеновые гликозиды Лта геЬаисИапа ВеЛош.

5. В результате впервые проведённых биологических исследований совместно с Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии установлено, что сухой очищенный экстракт, выделенный из листьев Stevia геЬаисИапа Вейот, обладает слабым вирусстатическим и вирулицидным действием на ДНК- и РНК-содержащие вирусы, а также слабым бактериостатическим и бактерицидным действием на возбудитель сибирской язвы в споровой форме.

6. Результаты проведённых физико - химических исследований были использованы при разработке технологической документации - проекта ФСП ООО "Научно - исследовательский и учебно - методический Центр фармацевтических технологий" на субстанцию "Сухой очищенный экстракт из листьев стевии" и ТУ на биологически активную добавку к пище - БАД "Стевия".

Список литературы диссертационного исследования кандидат фармацевтических наук Федоров, Сергей Владимирович, 2004 год

1. Hanson J.R., De Oliveira B.H. Stevioside and the related diterpenoid glycosides I I Natural

2. Product Reports. 1993. - №10. - P. 301 - 309.

3. Mazur RH, Schlatter JM, Goldkamp AH. Structure-taste relationships of some dipeptides // J.

4. Am. Chem. Soc. 1969. - № 91. - P. 2684-2691.

5. Kasai R, Matsumoto K., Nie R.L. Glycosides from Chinese medicinal plant, Hemsleya panacis-scandens, and structure-taste relationship to cucurbitane glycosides // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1988. - № 36. - P. 234-243.

6. Shallenberger RS, Acree TE. Molecular theory of sweet taste // Nature. 1967. - № 216. - P.480.482.

7. Castiglione-Morelli M.A., Lelj F., Naider F. Conformation-activity relationship of sweet molecules. Comparison of aspartame and naphthimidazolesulfonic acids // J. Med. Chem. -1990.-№ 33.-P.514-520.

8. Seidemann J. Stevioside, an interesting natural sweetening agent // Nahrung. 1976. - № 20.- P. 675-679.

9. Geuns J.M. Stevioside // Phytochemistry. 2003. - № 64. - P. 913-921.

10. Chang S. S., Cook J.M. Stability studies of stevioside and rebaudioside A in carbonated beverages // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1983. - № 31. - P. 409 - 412.

11. Soejarto D. D., Compadre С. M., Medon P. J. Potential sweetening agents of plant origin. II.

12. Field search for sweet-tasting stevia species // Economic Botany. 1983. - №37. - P. 71 -79.

13. Kinghorn A.D., Soejarto D. D. Current status of stevioside as a sweetening agent for human uses // Progress in Economic and Medicinal Plant Research. London, 1985. - P. 1 - 52.

14. Suttajit M., Vinitketkaumnuen U., Meevatee U. Mutagenicity and human chromosomal effect of stevioside, a sweetener from Stevia rebaudiana Bertoni // Environmental Health Perspective. 1993. №101. - P. 53 - 56.

15. Aze Y., Toyoda K., Imaida K. Subchronic oral toxicity study of stevioside in F344 rats // Eisei-Shikenjo-Hokuku. 1991. - №109. - P. 48 - 54.

16. Kroyer G. Th. The Low Calorie Sweetener Stevioside: Stability and Interaction with Food Ingredients // Lebensm.-Wiss. u.-Technol. 1999. - № 32. - P. 509 - 512.

17. U.S. patent, №5,262,161,1993. Stevia Extract Containing Medicine / Dozono F.

18. Кедик С. А., Януль H. А., Фёдоров С. В. Сладкие дитерпеновые гликозиды стевии // Питание и здоровье. Биологически Активные Добавки. 2002. - № 8. - С. 42 - 44.

19. Bondarev N., Reshetnyak О., Nosov A. Peculiarities of diterpenoid steviol glycoside production in in vitro cultures of Stevia rebaudiana Bertoni // Plant Science. 2001. -№161. - P.155-163.

20. Lovkova M., Buzuk G., Sokolova S. Chemical Features of Medicinal Plants // Applied Biochemistry and Microbiology. 2001. - №.37. - P. 229-237.

21. U.S. patent, №6,255,557, 2001. Stevia Rebaudiana with altered steviol glycoside composition / Brandie J.

22. Totte N. et al. Biosynthesis of the diterpenoid steviol, an ent-kaurene derivative from Stevia rebaudiana Brtoni, via the methylerythritol phosphate pathway // Tetrahedron Letters. -2000.-№41.-P. 6407-6410.

23. Totte N. et al. Corrigendum to "Biosynthesis of the diterpenoid steviol, an ent-kaurene derivative from Stevia rebaudiana Bertoni, via the methylerythritol phosphate pathway" // Tetrahedron Letters. 2000. - №41. - P.7595.

24. Kim K.K., Sawa Y., Shibata H. Hydroxylation of ent kaurenoic acid to steviol in Stevia rebaudiana Bertoni - purification and partial characterization of the enzyme // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 1996. - №332. - P. 223 - 230.

25. Soejarto D.D., Kinghorn A.D., Farnsworth N.R. Potential sweetening agents of plant origin. III. Organoleptic evaluation of Stevia leaf herbarium samples for sweetness. // J Nat Prod. -1982.-№45.-P. 590-599.

26. Mata R, Rodriguez V, Pereda-Miranda R. Stevisalioside A, a novel bitter-tasting ent-atisene glycoside from the roots of Stevia salicifolia // J Nat Prod. 1992. - №55. - P.660-666.

27. Wood H., Allerton R., Diehl W. Stevioside. I. The structure of the glucose moieties // J. Org. Chem. 1955. - № 20. - P. 875 - 883.

28. Mosettig E., Nes W.R. Stevioside. II. The structure of the aglucon // J. Org. Chem. 1955. - № 20. - P. 884 - 899.

29. Pezzuto J. M. , Compadre C. M. , Swanson S. M. Metabolically activated steviol, the aglycone of stevioside, is mutagenic // Proc Natl Acad Sci USA.- 1985. № 82. - P. 24782482.

30. Shi R. et al. Synthesis of Afunctional polymeric adsorbent and its application in purification of stevia glycosides // Reactive & Functional Polymers. 2002. - №.50. -P.107-116.

31. Pasquel A., Meireles M.A.A., Marques M.O.M. Extraction of Stevia glycosides with CO2 + water, CO2 + ethanol, CO2 + water + ethanol // Brazilian Journal of Chemical Engeneering. -2000.-№17.-P.271 -282.

32. U.S. patent, № 4,892,938, 1990. Method For The Recovery Of Steviosides From Plant Raw Material / Giovanetto R.

33. Starratt A. et al. Rebaudioside F, a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana // Phytochemistry. 2002. - №59. - P.367 - 370.

34. U.S. patent, №6,228,996, 2001. Process For Extracting Sweet Diterpene Glycosides / Zhou J. et al.

35. Ogawa T., Nozaki M., Matsui M. Total synthesis of stevioside // Tetrahedron. 1980. -№36.-P. 2641 -2648.

36. Cook I. F., Knox J.R. A synthesis of steviol // Tetrahedron Letters. 1970. - №47. - P. 4091-4093.

37. DuBois G.E., Dietrich P.S., Lee J.F. et al. Diterpenoid sweeteners. Synthesis and sensory evaluation of stevioside analogues nondegradable to steviol // J Med Chem. 1981. - № 24.- P.1269-1271.

38. DuBois G.E., Stephenson R.A. Diterpenoid sweeteners. Synthesis and sensory evaluation of stevioside analogues with improved organoleptic properties // J. Med.Chem. 1985. - №28- P. 93-98.

39. Lobov S.V., Kasai R., Ohtani K. et al. Enzymic production of sweet stevioside derivatives: transglucosylation by glucosidases // Agric. Biol. Chem. 1991. - №55. - P.2959-2965.

40. Ohtani K., Aikawa Y., Ishikawa H. et al. Further study on the 1,4-alpha-transglucosylation of rubusoside, a sweet steviol-bisglucoside from Rubus suavissimus // Agric. Biol. Chem. — 1991. -№55. P.449-453.

41. U.S. patent, №4,332,830, 1982. Sweetening with stevioside analogs / DuBois G.

42. U.S. patent, № 4,381,402, 1983. Steviol compounds / DuBois G.

43. U.S. patent №4,353,889, 1982. Rebaudioside analogs / DuBois G.

44. Vignais P.V., Duee E.D., Vignais P.M. Effects of atractyligenin and its structural analogues on oxidative phosphorylation and on the translocation of adenine nucleotides in mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. 1966. - №118. - P. 465 - 483.

45. U.S. patent №4,403,367, 1983. Glucosubstituented diterpenoid sweeteners / Stephenson R.

46. Toskulkao C., Chaturat L., Temcharoen P. Acute toxicity of stevioside, a natural sweetener, and its metabolite, steviol, in several animal species // Drug.Chem.Toxicol. 1997. - №.20. - P.31-44.

47. Melis M.S. Chronic administration of aqueous extract of Stevia rebaudiana in rats: renal effects // J. Ethnopharmacol. 1995. - №47. - P.129-134.

48. Смоляр В.И., Карпиловская Е.Д., Салий H.C. и др. Влияние нового подсластителя из двулистника сладкого на организм животных // Вопросы питания. — 1992. №1. - С. 60-63.

49. Aze Y., Toyoda К., Ymaida К. et al. Subchrome oral toxicity study of stevioside in F344 rats // Eisei-Shikenjo-Hokoku. 1991. - №109. - P. 48 - 54.

50. Xili L., Chengjiang В., Eryl X. et al. Chronic oral toxicity and carcinogenicity study of stevioside // Food.Chem.Toxicol. 1992. - №30. - P. 957 - 965.

51. Klongpanichpak S., Temcharoen P., Toskulkao C. et al. Lack of mutagenicity of stevioside and steviol in Salmonella typhimurium TA 98 and TA 100 // J.Med.Assoc.Thai. 1997. -№80.-P. 121-128.

52. Usami M., Sakemi K., Kawashima K. et al. Teratogenicity study of stevioside in rats // Eisei Shikenjo Hokoku. 1995. - №113. - P. 31 - 35.

53. Nsami M., Sakemi K., Kawashima K. et al. Teratogenicity study of stevioside in rats // Eisci.shikenjo.Hokoku. 1995. - №113. - P. 31 - 35.

54. Cardoso V.H., Barbosa M.F., Muramoto E. et al. Pharmacokinetic studies of J131-sevioside and its metabolites // Nucl.Med.Biol. 1996. - 23. - P. 97 - 100.

55. Melis M.S. Effects of crude extract of Stevia rebaudiana on renal water and electrolytes excrection // Phytomedicine. 1999. - №6. - P.247-250.

56. Melis M.S. A crude extract of Stevia rebaudiana increases the renal plasma from of normal and hypertension rats // Braz.J.Med-Biol.Res. 1996. - №29. - P. 669 - 675.

57. White J.R., Kramer J., Campbell R.K. Oral use of a topical preparation containing an extract of Stevia rebaudiana and the chrysanthemum flower in the management of hyperglycemia // Diabetes-Care. 1994. - №17. - P. 940 - 945.

58. Curi R., Alvarez M., Bazotte R.B. et al. Effect of stevia rebaudiana on glucose tolerance in normal adult humans // Braz.J.Med.Biol.Res. 1986. - №19. - P. 771 - 774.

59. Takahashi K., Matsuda M., Ohashi K., et al. Analysis of anti-rotavirus activity of extract from Stevia rebaudiana // Antiviral Research. 2001. - №49. - P. 15 - 24.

60. Kinghorn A.D., Nanayakkara N. P., D. Potential sweetening agents of plant origin. I. Purification of Stevia rebaudiana constituents by droplet counter current chromatography // Journal of Chromatography. - 1982. - №237. - P. 478 - 483.

61. Yamasaki K., Kohda H., Kobayashi T. et al. Structures of Stevia Diterpene Glucosides: Application of 13C NMR // Tetrahedron Letters. - 1976. - №13. - P. 1005 - 1008.

62. Mauri P., Catalano G., Gardana C. Analysis of Stevia glycosides by capillary electrophoresis // Electrophoresis. 1996. - №2. - P. 367 - 371.

63. Mizukami H., Shiiba K., Ohashi H. Enzymatic determination of stevioside in Stevia rebaudiana // Phytochemistry. 1982. - №21. - P. 1927 - 1930.

64. Bovanova L., Brandsteterova E., Baxa S. HPLC determination of stevioside in plant material and food samples // Z Lebensm Unters Forsch A. 1998. - №207. - P. 352 - 355.

65. Kolb N., Herrera J.L., Ferreyra D.J Analysis of sweet diterpene glycosides from Stevia rebaudiana: improved HPLC method // J. Agric. Food Chem. 2001. - №49. - 3. 4538 -4541.

66. Kitada Y., Sasaki M., Yamazoe Y. Simultaneous determination of stevioside, rebaudioside A and C and dulcoside A in foods by high-performance liquid chromatography // J.Chromatogr. 1989. - №474. - P. 447 - 451.

67. Кедик C.A., Фёдоров С. В., Януль Н.А. и др. Контроль содержания стевиозида в растительном сырье методами ВЭЖХ и ТСХ // Химико фармацевтический журнал. -2003. - Т. 37. - С. 19-22.

68. Хеншен А., Хуле К. -П., Лотшпайх Ф. И др. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.: Мир, 1988. - 687 с.

69. Scott R.P.W. Chromatography Detectors. NY: M. Dekker Inc., 1997. 536 p.

70. Sadek P. The HPLC solvent guide. New York: John Wiley & Sons, NY, 1996. 346 p.

71. Рудаков О.Б. Растворитель как средство управления хроматографическим процессом в жидкостной хроматографии. Воронеж: ВГУ, 2003. 300 с.

72. Кедик С.А., Федоров С.В., Януль Н.А. Контроль содержания стевиозида в растительном сырье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Сорбционные и хроматографические процессы. 2003. - Т.З. - №6. - С.648-653.

73. Liska I. Fifty years of solid-phase extraction in water analysis historical development and overview // Journal of Chromatography A. - 2000. - №885. - P. 3 - 16.

74. Poole C. F., Gunatilleka A.D., Sethuraman R. Contributions of theory to method development in solid-phase extraction // Journal of Chromatography A. 2000. - №885. - P. 17-39.

75. Hennion M. -C. Solid-phase extraction : method development, sorbents, and coupling with liquid chromatography // Journal of Chromatography A. 1999. - №856. - P. 3 - 54.

76. Huck C.W., Bonn G.K. Recent developments in polymer-based sorbents for solid -phase extraction // Journal of Chromatography A. 2000. - №885. - P. 51 - 72.

77. Fritz S.J., Dumont P.J., Schmidt L.W. Methods and materials for solid phase extraction // Journal of Chromatography A. - 1995. - № 691. - P. 133 - 140.

78. Das S., Das A.K., Murphy R.A. et al. Evaluation of the cariogenic potential of the intense natural sweeteners stevioside and rebaudioside A // Caries Res. 1992. - №26. - P. 363 -366.

79. Gardana C., Simonetti P., Canzi E. et al. Agric. Food Chem. 2003. - № 51. - P. 6618 -6622.

80. Wingard R.E. Jr., Brown J.P., Enderlin F.E. et al. Intestinal degradation and absorption of the glycosidic sweeteners stevioside and rebaudioside A // Experientia. 1980. - № 36. - P. 519-520.

81. Koyama E., Kitazawa K., Ohori Y. et al. In vitro metabolism of the glycosidic sweeteners, stevia mixture and enzymatically modified stevia in human intestinal microflora // Food Chem. Toxicol. 2003 - №41. - P. 359 - 374.

82. Suttajit M., Vinitketkaumnuen U., Meevatee U. Mutagenicity and human chromosomal effect of stevioside, a sweetener from Stevia rebaudiana Bertoni // Environ. Health Perspect. 1993. - № 101.-P. 53 -56.

83. Suttajit M., Vinitketkaumnuen U., Meevatee U. Mutagenicity and human chromosomal effect of stevioside, a sweetener from Stevia rebaudiana Bertoni // Environ. Health Perspect. 1993.-№ 101.-P. 53 -56.

84. Toyoda K., Matsui H., Shoda T. et al. Assessment of the carcinogenicity of stevioside in F344 rats // Food Chem. Toxicol. 1997. - № 35. - P. 597 - 603.

85. Ishii-Iwamoto E.L., Bracht A. Stevioside is not metabolized in the isolated perfused rat liver // Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 1995. - №87 - P. 167 - 175.

86. Hubler M.O., Bracht A., Kelmer-Bracht A.M. Influence of stevioside on hepatic glycogen levels in fasted rats // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 1994 - №84. - P. Ill — 118.

87. Geuns J.M., Augustijns P., Mols R. et al. Metabolism of stevioside in pigs and intestinal absorption characteristics of stevioside, rebaudioside A and steviol // Food Chem. Toxicol. -2003-№41.-P. 1599-1607.

88. Jutabha P., Toskulkao C., Chatsudthipong V. Effect of stevioside on PAH transport by isolated perfused rabbit renal proximal tubule // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2000 - № 78. -P. 737 - 744.

89. Smirnova M.G. Study of physiological and toxic effects of a sweetening agent stevioside // Vopr. Pitan. 2001 - № 70. - P. 41 - 44.

90. Hagiwara A., Fukushima S., Kitaori M. et al. Effects of three sweeteners on rat urinary bladder carcinogenesis initiated by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine // Gann. -1984-№75.-P. 763-768.

91. Geuns J.M., Malheiros R.D., Moraes V.M. et al. Metabolism of stevioside by chickens // J. Agric. Food Chem. 2003. - № 51. - P.1095-1101.

92. Yabu M., Takase M., Toda K. et al. Studies on Stevioside, natural sweetener. Effect on the growth of some oral microorganisms // Hiroshima Daigaku Shigaku Zasshi. 1977. - №9. -P.12-17.

93. Geuns J.M. Bruggeman V. Buyse J.G. Effect of stevioside and steviol on the developing broiler embryos // J. Agric. Food Chem. 2003. - 51. - P. 5162-5167.

94. Jeppesen P.B., Gregersen S., Rolfsen S.E. et al. Antihyperglycemic and blood pressure-reducing effects of stevioside in the diabetic Goto-Kakizaki rat // Metabolism. -2003. -№52. P. 372-378.

95. Jeppesen P.B., Gregersen S., Alstrup K.K. Stevioside induces antihyperglycaemic, insulinotropic and glucagonostatic effects in vivo: studies in the diabetic Goto-Kakizaki (GK) rats // Phytomedicine. 2002. - № 9. - P. 9 - 14.

96. MelisM.S. Effect of crude extract of Stevia rebaudiana on renal water and electrolytes excretion // Phytomedicine. 1999. - № 6. - P. 247 - 250.

97. Wasuntarawat С., Temcharoen P., Toskulkao C. et al. Developmental toxicity of steviol, a metabolite of stevioside, in the hamster // Drug Chem. Toxicol. 1998. - № 21. - P. 207 -222.

98. Yodyingyuad V., Bunyawong S. Effect of stevioside on growth and reproduction // Hum Reprod. 1991. - № 6. - P.158 -165.