Изучение глутатионилирования Na,K-АТРазы под действием окисленного глутатиона тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Мэн Сяньюй

• Мэн Сяньюй
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Мэн Сяньюй

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ыа,К-зависимая аденозинтрифосфатаза

1.1. Общая характеристика Ыа,К-АТРазы как АТРазы Р-типа

1. 2. Структура К-АТРазы

1.2. 1. Субъединичный состав К-АТРазы

1. 2. 2. а-Субъединица К-АТРазы

1. 2. 3. Основные конформационные состояния К-АТРазы

1. 2. 4. Третичная структура а-субъединицы

1. 2. 5. Доменная организация а-субъединицы Ыа,К-АТРазы

1. 2. 6. Участки связывания катионов

1. 2. 7. р-Субъединица Ыа,К-АТРазы

1. 2. 8. у-Субъединица Ыа,К-АТРазы

1. 2. 9. Четвертичная структура Ыа,К-АТРазы

2.1. Уабаин - ингибитор К-АТРазы

2.2. Изоформы субъединиц Иа,К-АТРазы

3.1. Механизм функционирования Ыа,К-АТРазы

4. Глутатионилирование белков

4. 1. Окислительный стресс

4. 2. Глутатион

4. 3. Окислительная модификация БН-групп белков

4. 4. Механизм глутатионилирования белков

4. 5. Специфичность глутатионилирования белков

4. 6. Цистеиновые остатки N8,К-АТРазы

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧА ИССЛЕДОВАНИЯ

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ

5.1. Получение фракции микросом из и почек кролика

5.2. Получение фракции микросом из солевых желез уток

5.3. Очистка Ыа,К-АТРазы из микросом солевых желёз утки и почек кролика

5.4. Получение фракции микросом из сердца крысы

з

5.5. Определение концентрации белка

5.6. Определение активности Ыа,К-АТРазы

5.7. Электрофорез в полиакриламидном геле

5.8. Окрашивание белков на геле Кумасси голубым G-250

5.9. Иммуноблоттинг

5.10. Стриппинг- освобождение мембраны от антител

5.11. Изотермическая калориметрия титрования (ITC)

5.12. Масс-спектрометрия

5.13. Математическая обработка полученных результатов

5.14. Материалы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

6.1 Характеристика препаратов Na,K-ATPa3bi из почек кролика, солевых желез утки и сердца крысы

6.2 Ингибирование Na,K-ATPa3bi уабаином в препаратах, выделенных из солевых желез утки

и сердца крысы

6.3 Глутатионилирование Na,K-ATPa3bi в препаратах, выделенных из солевых желез утки, почек кролика и сердца крысы

6.4 Окисленный глутатион (GSSG) инактивирует Na,K-ATPa3y в препаратах, выделенных из почек кролика и сердца крысы

6.5 Адениновые нуклеотиды (ATP, ADP и AMP) защищают Na,K-ATPa3y от инактивации GSSG

6.6 Глутатионилирование предотвращает связывание ADP с №,К-АТРазой

6.7 Идентификация глутатионилированных цистеиновых остатков а 1-субъединицы Ыа,К-АТРазы

6.8 Моделирование взаимодействия связанного глутатиона с аминокислотами,

участвующими в формировании участка связывания АТР

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение глутатионилирования Na,K-АТРазы под действием окисленного глутатиона»

ВВЕДЕНИЕ

Na,K-ATPa3a - фермент, входящий в состав плазматической мембраны клеток животных. Он гидролизует АТР до ADP и Pi, используя освобождающуюся энергию для переноса ионов Na и К через мембрану против электрохимического градиента. В состав фермента входит минимум 2 типа субъединиц: каталитическая а- и регуляторная ß-субъединица, причем в различных тканях эти субъединицы представлены разными изоформами (Kaplan, J.H., 2002).

В результате функционирования Na,K-ATPa3bi на плазматической мембране возникает потенциал покоя, в возбудимых тканях возможна генерация потенциала действия (Glitsch, H.G., 2001). За счет поддержания определенной внутриклеточной концентрации Na+ и К+ Na,K-ATPa3a обеспечивает регуляцию клеточного объема, вторично-активный транспорт некоторых ионов (например, Са2+ и Н+), а также метаболитов, сопряженный с переносом натрия по градиенту концентраций. Кроме того, Na,K-ATPa3a является рецептором для сердечных гликозидов, таких как уабаин и дигоксин, которые, связываясь с ферментом, инициируют передачу сигнала через различные сигнальные каскады (Xie, Z., Askari, А., 2002).

Многообразие физиологических функций Na,K-ATPa3bi и наличие различных изоформ предполагает, что этот важный для клетки фермент в разных тканях должен подвергаться регуляции с использованием разнообразных механизмов. В частности, показано, что фосфорилирование Ыа,К-АТРазы некоторыми протеинкиназами по-разному влияет на ее активность и распределение в разных типах клеток.

Внутриклеточный трипептид глутатион (y-Glu-Cys-Gly) - самый распространенный

низкомолекулярный тиол цитоплазмы. Он существует в двух формах: восстановленной (GSH)

и окисленной (GSSG). Ранее считалось, что функция глутатиона - это защита клеток от

токсичных ксенобиотиков, поддержание внутриклеточного редокс-статуса (Schafer, F.Q.,

Buettner, G.R., 2001), а также антиоксидантное действие. Связывание глутатиона с

SH-группами белка (S-глутатионилирование) препятствует необратимому окислению

SH-групп до -SO2H и -SO3H, поскольку глутатион может быть легко удален с белка с

помощью различных внутриклеточных систем, в частности, глутаредоксина. В настоящее

время появляются данные о том, что связывание глутатиона с SH-группами белков с

образованием S-S-связи (S-глутатионилирование) может быть механизмом регуляции

5

функции их, таким же, например, как фосфорилирование (Mieyal, J., et al., 2008). Поскольку соотношение GSH/GSSG, определяющее редокс-статус клетки, значительно снижается при развитии окислительного стресса, глутатионилирование является редокс-чувствительной модификацией, которая может играть регуляторную роль (Schafer, F., Buettner, G.R., 2001). Установлено, что глутатионилированию подвергается Са-АТРаза саркоплазматического ретикулума, родственная Na,K-ATPa3e. В результате этого Са-АТРаза активируется (Adachi, Т., et al., 2004). Показано также, что под действием GSH и ONOO" глутатионилируется ß-субъединица Na,K-ATPa3bi, что снижает активность фермента примерно на 20% (Figtree, G.A., et al., 2009), однако глутатионилирования а-субъединицы до сих пор обнаружено не было.

Каталитическая а 1-субъединица Na,K-ATPa3bi содержит 23 остатка цистеина, 15 из которых находятся в цитозольной области, причем не выявлено существования дисульфидных связей между этими цистеиновыми остатками. При поочередной замене всех остатков цистеина а-субъединицы Na,K-ATPa3bi на аланин она сохраняет свою активность, хотя при такой замене аминокислот в некоторых позициях наблюдается снижение числа оборотов фермента (Shi, H.G., et al., 2000). В связи с этим возникает вопрос о состоянии SH-групп а-субъединицы Na,K-ATPa3bi и о влиянии этих групп на ферментативную активность при изменении соотношения GSH/GSSG, особенно при повышении концентрации окисленного глутатиона, которое характерно для гипоксии. Решению этой проблемы посвящена настоящая работа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Na,K-3aBiiciiMaH аденозинтрифосфатаза

1.1. Общая характеристика Na,K-ATPa3bi как АТРазы Р-типа

Для клеток характерна способность поддерживать в цитоплазме концентрацию некоторых катионов, отличающуюся от их концентрации вне клетки. Это возможно, с одной стороны, за счет ограниченной проницаемости мембран для ионов. Кроме того, в мембранах клетки находятся ионные насосы, компенсирующие пассивные потоки катионов. Насосы представляют собой ферменты, обеспечивающие трансмембранный перенос катионов против электрохимического градиента за счет энергии, освобождающейся при гидролизе АТР. Эти ферменты называются ион-транспортирующими АТРазами. Среди них выделяют семейство АТРаз Р-типа, сходных между собой по структуре и механизму функционирования (Carafoli, Е., 1991; Inesi, G., Kirley, M.R., 1992; Moller, J., etal., 1996).

Первый представитель семейства, Na,K-ATPa3a, была открыта в 1957 году Йенсом Скоу (Skou, J.С., 1957). Затем была обнаружена Са-АТРаза CP у животных (Hasselbach, W., Makinose, М., 1961), позднее Са-АТРаза плазматических мембран у животных и растений. И, наконец, появилась информация о существовании АТРаз Р-типа у микроорганизмов.

Методами генной инженерии к концу 80-х годов 20-го века была установлена первичная структура АТРаз Р-типа. Они объединяются в семейство гомологичных белков, которые обнаружены у эукариот и прокариот. Эукариотические АТРазы Р-типа животных включают: Na,K-ATPa3y, Н,К-АТРазу, ответственную за секрецию Н+ в желудке, и, по-видимому, за реабсорбцию К+ в тонком кишечнике и собирательных трубочках почек, Са-АТРазы плазматических мембран и сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA АТРазы), участвующие в регуляции концентрации Ca внутри клетки (эти АТРазы есть также у растений). У растений и дрожжей идентифицирована Н-АТРаза, необходимая для поддержания потенциала на мембране и участвующая в Независимом поглощении метаболитов. Представителями прокариотических АТРаз Р-типа являются Kdp-АТРаза кишечной палочки (Esherichia coli), обеспечивающая аккумуляцию

К+, Mg2+-ATPa3a,

Cd2+-ATPa3a и Си+-АТРаза, которые участвуют в транспорте этих катионов у прокариот (Moller, J., et al., 1996). Си+-АТРаза присутствует и у эукариот.

Основной структурной и функциональной единицей АТРаз Р-типа является интегральный мембранный белок, который у эукариот имеет молекулярную массу около 110 кДа (исключение - Са-АТРаза плазматических мембран с молекулярной массой около 140 кДа). Молекулярная масса прокариотических АТРаз Р-типа составляет около 70 кДа (Hicks, B.W., Parsons, S.M., 1992).

Полипептидная цепь АТРаз Р-типа, переносящих ионы тяжелых металлов, образует 8 трансмембранных фрагментов, из них 6 расположены в N-концевой части молекулы (рис. 1, А). По-видимому, отделение этих АТРаз от общей ветви произошло на ранней стадии эволюции. Их относят к подтипу I, остальные АТРазы этого типа представляют подтип II.

Полипептидная цепь АТРаз Р-типа подтипа II эукариот расположена в мембране так, что ее N- и С-концевые фрагменты находятся в цитоплазме (рис. 1, Б). Она пересекает мембрану 10 раз, формируя трансмембранные фрагменты в виде а-спиралей. 4 таких фрагмента располагаются в N-концевой половине цепи и 6 - в С-концевой. Контактирующие между собой трансмембранные фрагменты образуют канал, через который проходят катионы. Большая петля между трансмембранными фрагментами М4 и М5 образует цитоплазматический домен (он содержит примерно 50% аминокислотных остатков белка). Здесь расположен активный центр, обеспечивающий гидролиз АТР, за счет чего происходит изменение конформации белка, в том числе в области трансмембранного домена, образующего канал.

Основное свойство АТРаз Р-типа, благодаря которому они отличаются от других мембранных АТРаз (V- и Fl/FO-типов), - это образование в каталитическом цикле фосфорилированного фермента (фосфорилированного интермедиата, ЕР). Интермедиат ЕР появляется в результате переноса терминального фосфорильного остатка АТР на остаток аспарагиновой кислоты в активном центре фермента. Помимо этого, в процессе каталитического цикла АТРазы Р-типа находятся в двух основных различных конформациях, El и Е2. Каталитический цикл АТРаз Р-типа - это комбинация процессов фосфорилирования-дефосфорилирования фермента и конформационных переходов Е1~*Е2 —-Е1. Цикл можно описать схемой: El —El-P—Е2-Р—Е2—El. Гидролиз АТР в соответствии с этой схемой сопряжен с переносом ионов через мембрану (Olesen, С., et al., 2007).

Na,K-ATPa3a - наиболее изученная АТРаза Р-типа. Фермент гидролизует АТР и осуществляет сопряженный с ним перенос ионов Na и К через мембрану против электрохимического градиента: 3 иона Na выходят из клетки, а 2 иона К перемещаются из внеклеточной среды в клетку (Post, R.L., et al., 1965; Garrahan, P.J., Glynn, I.M., 1967a).

связывание металла

фосфорилпрование ATP

фосфорилирование 'ATP

цитоплазма

мембрана м а

СООН

СООН

Рис. 1. Структура АТРаз Р-типа эукариот (Moller, J., et al., 1996). Слева (А)- АТРазы, переносящие ионы тяжелых металлов, справа (Б) - АТРазы, переносящие Na+, К+, Н+, Са2+.

С работой этого фермента связано выполнение важных физиологических функций: поддержание потенциала покоя, генерация потенциала действия в возбудимых клетках (Glitsch, H.G., 2001), сопряженный с переносом Na+ транспорт ионов и метаболитов. Na,K-ATPa3a является единственным рецептором для кардиостероидов (Xie, Z., Askari, А., 2002), связывание которых с ферментом приводит к различным физиологическим эффектам: к смерти клеток (эпителий почек), остановке апоптоза (гладкие мышцы сосудов) или гипертрофии клеток (кардиомиоциты).

1. 2. Структура Na,K-ATPa3bi

1. 2. 1. Субъединичный состав Na,K-ATPa3bi

Na,K-ATPa3a состоит, как минимум, из двух типов субъединиц, каталитической а- и регуляторной ß-субъединицы (Forbush, В., et al., 1978). В некоторых тканях в состав фермента входит небольшая у-субъединица, член белков семейства FXYD, которые могут существовать отдельно от Na,K-ATPa3bi и выполнять самостоятельные функции.

Молекулярная масса а-субъединицы составляет 110 кДа (ЭФ подвижность этой цепи соответствует молекулярной массе 100 кДа) (Yamaguchi, М., Tonomura, Y., 1979). Р-Субъединица Na,K-ATPa3bi - гликопротеид с молекулярной массой белковой части 35 кДа, углеводный фрагмент увеличивает её до 55-65 кДа (Yamaguchi, М., Tonomura, Y., 1979).

Как и у всех АТРаз этого подтипа полипептидная цепь а-субъединицы Na,K-ATPa3bi образует 10 трансмембранных сегментов. Регуляторная р-субъединица Na,К-АТРазы пронизывает мембрану только 1 раз. Вся углеводная часть Р-субъединицы располагается с наружной стороны плазматической мембраны (рис. 2 ).

Основную роль в процессе гидролиза АТР и переносе ионов играет а-субъединица Na,K-ATPa3bi, р-субъединица обеспечивает доставку а-субъединицы к плазматической мембране после синтеза и влияет на ее кинетические свойства, в частности, меняет сродство к ионам К (Lopina, O.D., 2000). Расположение полипептидных цепей а- и Р-субъединиц Na,K-ATPa3bi в мембране представлено на рис. 2.

Формирование центра

спя )ыванпя АТР

Рис. 2. Расположение полипептидных цепей а- и Р-субъединиц Na,К-АТРазы в мембране. На петле между 4-й и 5-й фрагментами расположен центр связывания АТР и участок фосфорилирования (Р). (Болдырев, A.A., 1998).

1. 2. 2. а-Субъединица Na, К-АТРазы

Первичная структура. Аминокислотная последовательность а-субъединицы Na,К-АТРазы была установлена путем анализа кДНК в конце 80-х годов 20-го века. Прочтение первичной структуры а-субъединицы Na,К-АТРазы разных организмов выявило

наличие нескольких её изоформ, которые имеют различия в аминокислотной последовательности и длине цепи, кроме того 1Ма,К-АТРаза, содержащая различные изоформы различается по чувствительности к сердечным гликозидам, АТР и Na+ (Shull, G.E., et al., 1988). Схема расположения субъединиц Na,K-ATPa3bi в мембране и сходство между разными изоформами даны на рис 3.

sss

к П с

о s я

и I

05

U

Вторичная структура а-субъединицы. Расположение трансмембранных фрагментов а-субъединицы сначала установили по профилю гидрофобное™ ее первичной структуры. Было предсказано наличие четырех трансмембранных фрагментов в N-концевой части и 4-6 таких фрагментов в С-концевой части а-субъединицы (Shull, G.E., et al., 1988). Исследования локализации отдельных частей а-субъединицы с помощью гидрофильных и гидрофобных меток показали, что в белке есть несколько фрагментов, устойчивых к протеолизу. Анализ продуктов протеолиза выявил, что N- и С-концы белка находятся в цитоплазме, где расположен и участок фосфорилирования, Asp-369. Центр связывания уабаина находится вне клетки, в его связывании участвуют трансмембранные фрагменты (Jorgensen, P.L., et al., 1982). Методы предсказания вторичной структуры позволили заключить, что трансмембранные фрагменты а-субъединицы имеют вид а-спирали. В большом цитоплазматическом домене, присутствуют и а-спирали, и Р-слои (Arzamazova, N.M., et al., 1988).

1. 2. 3. Основные конформационные состояния Na,K-ATPa3bi

Различия в конформационном состоянии Na,K-ATPa3bi в среде с Na+ (конформация Е1) и К+ (конформация Е2) впервые были выявлены Йоргенсеном и соавторами в опытах с ограниченным протеолизом (Jorgensen, P.L., 1975, 1977; Jorgensen P.L., Collins, J.H., 1986; Jorgensen, P.L., 1988). Под действием трипсина а-субъединица дает различный набор пептидов в зависимости от присутствия в среде Na+ или К+ ф-субъединица фермента устойчива к трипсинолизу). В конфомации Е2 трипсин гидролизует в а-субъединице пептидную связь между Arg-438 и Ala-439 (участок трипсинолиза Ti), из а-субъединицы (112 кДа) образуются два белка с молекулярной массой 48 и 64 кДа. В среде с Na+ трипсин действует на участок Т2 (Lys-30 - Glu-31), в результате освобождается N-концевой пептид (из 30 аминокислот). Далее гидролизуется связь между Arg-262 и 11е-263 (участок трипсинолиза Тз). Химотрипсин (Сз) гидролизует связь, расположенную рядом с участком Тз (Leu-266): она разрывается лишь в Е1-конформации. Таким образом, переход из конформации Е1 в Е2 изменяет расположение аминокислотных остатков а-субъединицы: участки протеолиза Тз и Сз становятся недоступными для протеаз, а участок Т), напротив, появляется на поверхности молекулы. Эти выводы подтверждаются данными, по моделированию конформаций

Na,K-ATPa3bi на основе данных рентгеноструктурного анализа El- и Е2-конформаций родственной Са-АТРазы.

Различия в El- и Е2-конформации а-субъединицы Na,K-ATPa3bi были выявлены при измерении собственной флуоресценции фермента и флуоресценции связанных с ней меток. Интенсивность флуоресценции Е2-формы на 2-3% выше, чем El-формы (Karlish, S.J.D., Yates, D.W., 1978). Введение в белок флуоресцентных меток, например, флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) (Karlish, S.J.D., 1980; Faller, L., et al., 1991), 5-йодацетамидфлуоресцеина (ИАФ) (Kapakos, J.G., Steinberg, M., 1982), эозина (Karlish, S.J.D., 1980; Skou, J.C., Esmann, M., 1983) позволяет значительно увеличить флуоресцентный ответ на добавление Na+ и К+.

Данные по модификации 1Ча,К-АТРазы липофильными агентами показывают, что в Е2-конформации фермент погружен в липидный бислой глубже, чем в Е1-конформации: в Е2 включается на 10-25% больше [1251]-йодонафтилазида - гидрофобной фотоактивируемой метки (Karlish, S.J.D., et al., 1977). Андерсен и соавторы, исследовавшие модификацию El- и Е2-форм Са-АТРазы, заключили, что при El—>Е2 переходе не менее 38 аминокислот перемещается внутрь липидного бислоя (Andersen, J.P., et al., 1986).

1. 2. 4. Третичная структура а-субъединицы

Трехмерная структура а-субъединицы Na,K-ATPa3bi сначала была установлена методом электронной микроскопии с разрешением 11 À. В белке идентифицировали цитоплазматическую, внеклеточную части и трансмембранный домен. Третичная структура а-субъединицы Na,K-ATPa3bi похожа на третичную структуру Са-АТРазы CP (SERCA). Сравнение аминокислотных последовательностей а-субъединицы Na,K-ATPa3bi и Са-АТРазы показало, что они идентичны на 32,8%, 53,3% аминокислотной последовательности этих белков гомологичны (замены аминокислот консервативны) (Ettrich, R., et al., 2001). Выравнивание аминокислотных последовательностей этих белков выявило высокое сходство в районе цитоплазматического домена. Это позволило заключить, что строение цитоплазматических доменов и изменение конформации при El —» Е2 переходе у двух этих АТРаз очень схожи (Rice, W.J., et al., 2001).

Методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,6 Â были получены данные о

строении разных конформации Са-АТРазы (рис. 4). На основе этих результатов была создана

13

модель изменения конформации белка в процессе каталитического цикла, которая в дальнейшем была применена к №,К-АТРазе (Ло^епзеп, Р.Ь., е1 а1., 2003).

полость ретикулума

С/

мембрана ретикулума

Рис. 4. Конформация молекулы Са-АТРазы в состояниях Е1Са2+ (слева, фиолетовый цвет) и Е2 (справа, зеленый цвет) в мембране СР (ТоуозЫта, С., е1 а1., 2003). а-Спирали в виде цилиндров пронумерованы в доменах А, Р и трансмембранном домене, р-складки показаны в виде стрелок. Красные стрелки (пунктир) показывают направление движения доменов ТМ, Р и А при Е1—► Е2 переходе. Голубые окружности 1 и II показывают расположение Са-связывающих центров в трансмембранном домене фермента, голубая пунктирная стрелка (справа) - возможный путь, по которому ионы Са из цитоплазмы попадают в эти центры.

Эксперименты по установлению третичной структуры а-субъединицы Ка,К-АТРазы и ее сравнение со структурой Са-АТРазы проводили для а1-изоформы белка, поскольку лишь его можно получать в больших количествах в очищенном состоянии. Недавно сделан рентгеноструктурный анализ а 1-субъединицы №,К-АТРазы в Е2Р-конформации (МоПЬ, Л.Р., е1 а!., 2007). Его результаты подтверждают наличие сходства каталитических субъединиц и Са-АТРаз (рис. 5). Строение а-субъединицы №,К-АТРазы в Е2-конформации практически совпадает с предсказанным на основе анализа Са-АТРазы (МоЛЬ, .1.Р., е1 а!., 2009). Исключение - меньший размер М-домена, в котором у а-субъединицы №,К-АТРазы отсутствует участок, имеющийся в Са-АТРазе.

1. 2. 5. Доменная организация а-субъединицы Na,K-ATPa3bi

Итак, а-субъединица Na,K-ATPa3bi имеет 10 трансмембранных a-спиральных участков, разделенных большой цитоплазматической петлей на 2 группы: Ml - М4 и М5 - М10 (рис. 1). Между М2 и МЗ имеется малая цитоплазматическая петля. Внутриклеточная часть молекулы разделяется на 3 субдомена: N (нуклеотид-связывающий), Р (фосфорилируемый) и А (актуаторный). Домен А состоит из N-концевого участка и малой цитоплазматической петли, большая цитоплазматическая петля формирует домены N и Р (рис. 5). В N-домене каталитической субъединицы находится центр связывания АТР. Он состоит из 8 элементов антипараллельного Р-слоя. Есть 2 фрагмента, выходящие за пределы р-слоя, каждый из которых содержит «шпильку» и 2-3 a-спирали. Адениновое основание АТР связывается в гидрофобном кармане, который формируется 4-6 и 7-м элементами р-слоя. Структура этого участка была определена для Са-АТРазы, после чего были выявлены аминокислотные остатки, консервативные для Са-АТРазы и а-субъединицы Na,K-ATPa3bi. Для последней это остатки Lys501, Lys480 и Arg544, вовлеченные в связывание АТР.

Р-домен образован р-слоем из шести параллельных элементов, они формируют 2 складки Россмана, по его краям находится один параллельный и один антипараллельный Р-элемент (Olesen, С., et al., 2004; Morth, J.P., et al., 2009). Фосфорилированию при катализе подвергается остаток Asp369 (зрелая al-субъединица из почек свиньи). Аминокислотные остатки мотивов 369-DKTGTL, 610-TGD и 708-TGDGVND вовлечены в связывание фосфатных групп АТР и координацию иона Mg2+ (рис. 6).

A-домен состоит из N-концевой части белка (Glyl - Gln88) и малой цитоплазматической петли (Lys205 - Glu312). Он претерпевает значительные изменения конформации при El—>Е2 переходе. Петля между фрагментами М2 и МЗ взаимодействует с трансмембранными спиралями, обеспечивая их передвижение, необходимое для транспорта катионов (Jorgensen, P.L., et al., 2003).

В N-концевом фрагменте есть 2 спирали: HI (аминокислотные остатки 27 - 33) и Н2 (остатки 42 - 50), влияющие на конформационные изменения а-субъединицы в процессе каталитического цикла. Делеции в спирали Н2 сдвигают равновесие между конформациями в сторону El, а точечные мутации в HI стабилизируют Е2-Р и в меньшей мере Е2-конформацию а-субъединицы (Scanzano, R., et al., 2007). Строение трансмембранных

спиралей выявлено путем рентгеноструктурного анализа только для Е2-конформации.

15

Другие методы позволили выяснить их расположение относительно друг друга. При переходе Е1-Е2 они из полностью параллельного состояния перемещаются до расположения под углом 50°. Трансмембранные фрагменты М2, М4 и М5 (но не М9 и М10) контактируют с цитоплазматическим доменом. Канал для транспорта катионов образуют фрагменты М4-М6 и М8 (Jorgensen, P.L., et al., 2003).

N-domain

P-domain

switch region

extracellular domain

Рис. 5. Данные рентгеноструктурного анализа, демонстрирующие трехмерную структуру Na,K-ATPa3bi в Е2-конформации (Morth, J.P., et al., 2009).

домен

домен

Рис. 6. Структура Ы- и Р-доменов а-субъединицы Ка,К-АТФазы (.1ог§еп5еп, Р.Ь.,е1 а1., 2003).

1.2.6. Участки связывания катионов

В связывание 2-х из 3-х ионов Ыа вовлечены отрицательно заряженные атомы кислорода боковых радикалов аминокислот и пептидных связей трансмембранных спиралей. Поверхность белка, где находятся центры связывания, имеет отрицательный заряд. Для Са-АТРазы методом точечных мутаций установлено, что вход катионов в полость канала со стороны цитоплазмы контролируется петлей, расположенной между трансмембранными фрагментами Мб и М7. Выравнивание последовательностей Са-АТРазы и а-субъединицы Ыа,К-АТРазы выявило аминокислотные остатки, координирующие 2 иона Ыа (рис. 7). Для центра связывания первого катиона - это Азп776, 01и779, ТЬг807 и С1п923. В центре связывания второго иона N3 такими остатками являются 01и327, Азр804, а также карбонильные группы Уа1322, А1а323 и Уа1325. Боковая цепь Азр808 участвует в координации связывания обоих катионов (До^епБеп, Р., ег а!., 2003).

Рис. 7. Строение катион-связывающих центров I и II а-субъединицы №,К-АТФазы (МоЛЬ, J.P., й а!., 2007).

Расположение двух центров связывания №+ установили по аналогии с Са-АТРазой, точная локализация третьего центра связывания до сих пор не выяснена. Он образуется только после связывания первых двух ионов № и располагается в первой трети фрагментов М5, Мб и М9. Координация катиона осуществляется с помощью атомов кислорода бокового радикала и пептидной части 8ег768, а также трех молекул воды. Кроме того, выявлены контакты с ТЬг772 ^огдепвеп, Р.Ь., е1 а1., 2003).

В связывании ионов К участвуют те же аминокислотные остатки, что связывают 1Ма+, но центры связывания образуют более крупную полость (диаметр иона 1ч1а 1,9 А, иона К - 2,7 А) за счет отдаления друг от друга С1и327, С1п923 и карбонильных групп Уа1322, А1а323 и Уа1325 (рис. 7). Трансмембранные фрагменты М5 и Мб остаются на месте, М4 и М8 перемещаются относительно них (8Ыпос1а, Т., е1 а!., 2009; Ogawa, Н., ег а1., 2009). Данные о структуре №,К-АТРазы, полученные методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 3,5 А, подтверждают изложенное выше (Мог1И, .1.Р., е1 а1., 2007).

Существует различие в положении некоторых трансмембранных фрагментов в а-субъединице по сравнению с таковым в Са-АТРазе. В фрагменте М7 №,К-АТРазы находится 01у848, присутствие которого приводит к изгибу а-спирали. Отличается и строение цитоплазматического конца фрагмента М10. Это может быть связано с

присутствием в №,К-АТРазы ß-субъединицы, взаимодействующей именно с этими трансмембранными доменами (Morth, J.P., et al., 2007).

1. 2. 7. ß-Субъединица Na,K-ATPa3bi

ß-Субъединица Na,K-ATPa3bi является гликопротеидом (Geering, К., et al., 1996; Mobasheri, A., et al., 2000). Она представляет собой трансмембранный белок, полипептидная цепь которого пересекает мембрану 1 раз (рис. 8). Её N-концевая часть расположена в цитоплазме, а С-концевая - с наружной стороны клетки. В состав ß-субъединицы входит около 300 аминокислот. Большая часть её имеет антипараллельную ß-структуру и расположена вне клетки. Три пары SH-групп образуют 3 дисульфидных связи: Cysl21-Cysl50, Cysl60-Cysl76 и Cys215-Cys278, есть одна свободная SH-группа Cys46, расположенная на границе между цитоплазмой и бислоем мембраны (Kirley, T.L., 1989; Miller, R.P., Farley, R.A., 1990). Гликозилирование ß-субъединицы происходит по остаткам аспарагина, содержащимся в последовательностях Asn-Ser/Thr и расположенным на внеклеточной стороне мембраны (рис. 8). Углеводные фрагменты состоят в основном из N-ацетилглюкозамина, галактозы и маннозы, их содержание специфично для разных тканей (Chow, D.C., Forte, J.G., 1995).

ß-Субъединица Na,K-ATPa3bi имеет характерные структурные элементы, например, глициновую «молнию» (GxxxGxxxG). В ее состав входит консервативный мотив из семи аминокислот (abcdefg, где остатки and формируют гидрофобные контакты, а е и g представлены заряженными аминокислотами и образуют солевые мостики) (Gurezka, R., et al., 1999). Эти мотивы располагаются на разных поверхностях трансмембранного домена ß-субъединицы и отвечают за разные функции. Методом точечных мутаций установлено, что гептадные повторы вовлечены во взаимодействие трансмембранного домена ß-субъединицы с а-субъединицей. Особенно важную роль в этом взаимодействии выполняют остатки Туг43 и Phe50 ß-субъединицы (рис. 9). Кроме того, на расстоянии, достаточном для взаимодействия с а-субъединицей, находятся остатки Туг39 и Phe42 (Barwe, S.P., et al., 2007).

Внеклеточное

Углеводные остатки

пространство

ъ

с

<ъ

Мембрана

Цитоплазма

Р

N

Рис. 8. Строение и расположение в мембране Р-субъединицы Na,K-ATPa3bi.

Р-Субъединица взаимодействует внутри мембраны с мембранными фрагментами М7 и М10 а-субъединицы, находясь ближе к фрагменту М7 (Morth, J.P., et al., 2007). Это подтверждается данными о том, что при тепловой денатурации фрагментов М8-М10 Р-субъединица остается связанной с М7. Мембрану р-субъединица пересекает мембрану под углом примерно в 45°, приближаясь к М10 возле ее внеклеточного конца (рис. 9).

Глициновая «молния» в Р-субъединице (G44xxxG48xxxG52), по-видимому, необходима для олигомеризации оф-комплексов. Методом точечных мутаций установлено, что для этого важен Gly48 (рис. 9). Гликозилирование Р-субъединицы Ыа,К-АТРазы необходимо для формирования межклеточных контактов: когда в клетках почечного эпителия линии MDCK 50% молекул гликозилированной Р-субъединицы была заменена на негликозилированные, у клеток снижалась способность к межклеточной адгезии (Rajasekaran, S.A., et al., 2003).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мэн Сяньюй, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Болдырев А.А. (1998) №,К-АТФфза - свойства и биологическая роль. Сорос, обр. журн., 4, 2-9.

2. Торчинский Ю. М. (1977) Сера в белках, Наука, Москва.

3. Adachi, Т., Weisbrod, R.M., Pimentel, D.R., Ying, J., Sharov, V.S., Schoneich, C., Cohen, R.A. (2004) S-Glutathiolation by peroxynitrite activates SERCA during arterial relaxation by nitric oxide. Nat. Med., 10(11), 1200-1270.

4. Ahmed, K., Rohrer, D.C., Fullerton, D.S., Kitatsuji, E., Deffo, Т., From, A.H.L. (1983) Interaction of Na,K-ATPase and digitalis genins: a general model for inhibitory activity. J. Biol. Chem., 258, 8092-8097.

5. Aldini, G., Dalle-Donne, I., Vistoli, G., Maffei-Facino, R., and Carini, M. (2005) Covalent modification of actin by 4-hydroxy-trans-2-nonenal (HNE): LC-ESI-MS/MS evidence for Cys374 Michael adduction. J. Mass. Spectrom., 40, 946-954.

6. Andersen, J.P., Vilsen, В., Collins, J.H., Jorgensen, P.L. (1986) Localization of E1-E2 conformational transition of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase by tryptic cleavage and hydrophobic labeling. J. Membr. Biol., 93, 85-92.

7. Aracena-Parks, P., Goonasekera, S.A., Gilman, C.P., Dirksen, R.T., Hidalgo, C., Hamilton, S.L. (2006) Identification of cysteines involved in S-nitrosylation, S-glutathionylation, and oxidation to disulfides in ryanodine receptor type 1. J Biol Chem. 281(52):40354-40368.

8. Arzamazova, N.M., Arystarkhova, E.A., Gevondyan, N.M., Luneva, N.M., Efremov, R.G., Aldanova, N.A., Nesmeyanov, V.A., Modyanov, N.N. (1988) Sequence analysis of exposed domains of membrane-bound Na+,K+-ATPase. Model of transmembrane arrangement, in Progress in clinical and biological research, Alan R.Liss,Inc.,New York, 268A, pp. 57-64.

9. Arystarkhova, E., Sweadner, K.J. (1997) Tissue-specific expression of the Na,K-ATPase beta3 subunit. The presence of beta3 in lung and liver addresses the problem of the missing subunit. J. Biol. Chem., 272, 22405-22408.

10. Arystarkhova, E., Wetzel, R.K., Asinovski, N.K., Sweadner, K.J. (1999).The gamma subunit modulates Na+ and K+ affinity of the renal Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 21 A, 33183- 33185.

11. Askari, A. (1987) Na,K-ATPase: on the number ATP sites of the functional unit. J. Biomembr., 19, 359-373.

12. Askari, A. (2000) Na,K-ATPase and related ATPases (Taniguch, K., and Kaya, S„ eds)

Elsevier Science., Amsterdam, pp. 17-26.

13. Bagrov, A.Y., Fedorova, O.V. (1998) Effects of two putative endogenous digitalis-like factors, marinobufagenin and ouabain, on the Na ,K -pump in human mesenteris arteries. J. Hypertens., 16,1953-1958.

14. Bagrov, A.Y., Fedorova, O.V., Dmitrieva, R.I., Howald, W.N., Hunter, A.P., Kuznetsova, E.A., Shpen, V.M. (1998) Characterization of a urinary bufodienolide Na+,K+-ATPase

inhibitor in patients after acute myocardial infarction. Hypertension., 31(5):1097-1103.

15. Barlet-Bas, C., Arystakhova, E., Chevall, E., Marsy, S., Sweadner, K., Modyanov, N., Doucet, A. (1993) Are there several isoforms of Na,K-ATPase alpha subunit in the rabbit kidney ? J. Biol. Chem., 268, 11512-11515.

16. Bar-Or, D., Curtis, C.G., Sullivan, A., Rael, L.T., Thomas, G.W., Craun, M., Bar-Or, R., Maclean, K.N., Kraus, J.P. (2004) Plasma albumin cysteinylation is regulated by cystathionine beta-synthase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 325, 1449-1453.

17. Barwe, S.P., Kim, S., Rajasckaran, S.A., Bowie, J.U., Rajasekaran, A.K. (2007) Janus model of the Na,K-ATPase beta subunit transmembrane domain: distinct faces mediate alpha/beta assembly and beta-beta homo-oligomerization. J. Mol. Biol., 365(3), 706-714.

18. Beguin, P., Hasler, U., Staub, O., Geering, K. (2000) Endoplasmic reticulum quality control of oligomeric membrane proteins: topogenic determinants inwolved in the degradation of the unassembled Na,K-ATPase a subunit and in its stabilization by P subunit assembly. Molecular. Biology of the cell., 11, 1657-1672.

19. Blanco, G., Mercer, R.W. (1998) Isozymes of the Na,K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. Am. J. Physiol., 275, F633-F650.

20. Blostein, R. (1970) Sodium-activated adenosine triphosphatase activity of the erythrocyte membrane. J. Biol. Chem., 245, 270-275.

21. Brennan, J.P., Wait, R., Begum, S., Bell, J.R., Dunn, M.J., Eaton, P. (2004) Detection and mapping of widespread intcrmolecular protein disulfide formation during cardiac oxidative stress using proteomics with diagonal electrophoresis. J. Biol. Chem., 279: 41352-41360.

22. Cai, H., Li, Z., Dikalov, S., Holland, S.M., Hwang, J., Jo, H., Dudley, S.C.Jr., and Harrison, D.G. (2002) NAD(P)H oxidase-derived hydrogen peroxide mediates endothelial nitric oxide production in response to angiotensin II. J. Biol. Chem., 277, 48311-48317.

23. Cappel, R.E., Bremer, J.M., Timmons, T.M., Nelson, T.E., Gilbert, H.F. (1986) Thiol/disulfide redox equilibrium between glutathione and glycogen debranching enzyme (amylo-l,6-glucosidase/4-alpha-glucanotransferase) from rabbit muscle. J. Biol. Chem., 261(33): 15385-15389.

24. Cappiello, M., Voltarelli, M., Cecconi, I., Vilardo, P. G., Dal Monte, M., Marini, I., Del Corso, A., Wilson, D. K., Quiocho, F. A., Petrash, J. M., and Mura, U. (1996) Specifically targeted modification of human aldose reductase by physiological disulfides. J. Biol. Chem., 271, 33539-33544

25. Carafoli, E. (1991) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev., 71, 121-153.

26. Carballal, S., Alvarez, B., Turell, L., Botti, H., Freeman, B.A., Radi, R. (2007) Sulfenic acid in human serum albumin. Amino. Acids., 32, 543-551.

27. Carballal, S., Radi, R., Kirk, M.C., Barnes, S., Freeman, B.A., Alvarez, B. (2003) Sulfenic acid formation in human serum albumin by hydrogen peroxide and peroxynitrite. Biochemistry., 42, 9906-9914.

28. Casagrande, S., Bonetto, V., Fratelli, M., Gianazza, E., Eberini, I., Massignan, T., Chang, G., Holmgren, A., Ghezzi, P. (2002) Glutathionylation of human thioredoxin: a possible crosstalk between glutathione and thioredoxin systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9617-9618.

29. Cavieres, J.D., Glynn, I.M. (1979) Sodium-sodium exchange through the sodium pump: the roles of ATP and ADP. J. Physiol., Dec, 297(0), 637-645.

30. Chai, Y.C., Ashraf, S.S., Rokutan, K., Johnston, R.B.Jr, Thomas, J.A. (1994) S-thiolation of individual human neutrophil proteins including actin by stimulation of the respiratory burst: evidence against a role for glutathione disulfide. Arch. Biochem. Biophys., 310, 273-281.

31. Chai, Y.C., Hoppe, G., Sears, J. (2003) Reversal of protein S-glutathiolation by glutaredoxin in the retinal pigment epithelium. Exp. Eye. Res., 76, 155-159.

32. Choi, H.J., Kang, S.W., Yang, C.H., Rhee, S.G., Ryu, S.E. (1998) Crystal structure of a novel human peroxidase enzyme at 2.0 A resolution. Nat. Struct. Biol., 5, 400-406.

33. Chow, D.C., Forte, J.G. (1995) Functional significance of the beta-subunit for heterodimeric P-type ATPases. J. Exp. Biol., 198, 1-17.

34. Clavreul, N., Adachi, T., Pimental, D.R., Ido, Y., Schoeich, C., Cohen, R.A. (2006) S-glutathiolation by peroxynitrite of p21ras at cysteine-118 mediates its direct activation and downstream signaling in endothelial cells. FASEBJ20, 518-520.

35. Cohen, R.A. adn Adachi, T. (2006) Nitric-oxide-induced vasodilatation: regulation by physiologie S-glutathiolation and pathologie oxidation of the sarcoplasmic endoplasmic reticulum calcium ATPase. Trends. Cardiovasc. Med., 16, 109-114.

36. Cortes, V.F., Veiga-Lopes, F.E., Barrabin, H., Alves-Ferreira, M., Fontes, C.F. (2006) The gamma subunit of Na+, K+-ATPase: role on ATPase activity and regulatory phosphorylation by PKA. Int. J. Biochem. Cel.l Biol., 38(11),1901-1913.

37. Cumming, R.C., Andon, N.L., Haynes, P.A., Park, M., Fischer, W.H., Schubert, D. (2004) Protein disulfide bond formation in the cytoplasm during oxidative stress. J. Biol. Chem. 279, 21749-21758.

38. Dalle-Donne, I., Giustarini, D., Rossi, R., Colombo, R., and Milzani, A. (2003) Reversible S-glutathionylation of Cys374 regulates actin filamentformation by inducing structural changes in the actin molecule. Free Radie Biol Med., 34: 23-32.

39. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Ceciliani, F., Giustarini, D., Colombo, R., Milzani, A. (2006a) Proteins as sensitive biomarkers of human conditions associated with oxidative/nitrosative stress. In: Redox Proteomics: from Protein Modifications to Cellular Dysfunction and Diseases, edited by Dalle-Donne, I., Scaloni, A., and Butterfield, D.A. Hoboken: John Wiley and Sons, Inc., pp. 487-525.

40. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. (2006b) Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem., 52, 601-623.

41. Dempski, R.E., Friedrich, T., Bamberg, E. (2005) The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme. J. Gen. Physiol., 125(5), 505-520.

42. Despa, S., Bers, D.M. (2007) Functional analysis of Na+/K+-ATPase isoform distribution in rat ventricular myocytes. Am. J. Physiol., Cell Physiol., 293(1): C321-327.

43. Dominici, S., Valentini, M., Maellaro, E., Del Bello, B., Paolicchi, A., Lorenzini, E., Tongiani, R., Comporti, M., Pompclla, A. (1999) Redox modulation of cell surface protein thiols in U937 lymphoma cells: the role of gammaglutamyl transpeptidase-dependent H2O2 production and S-thiolation. Free. Radie. Biol. Med., 27, 623-635.

44. Eaton, P., Byers, H.L., Leeds, N., Ward, M.A., Shattock, M.J. (2002a) Detection, quantitation, purification, and identification of cardiac proteins S-thiolated during ischemia and reperfusion. J. Biol. Chem., 277, 9806-9811.

45. Eaton, P., Fuller, W., Shattock, M.J. (2002b) S-thiolation of HSP27 regulates its multimeric

aggregate size independently of phosphorylation. J. Biol. Chem., 277, 21189-21196.

46. Erdmann, E., Schoner, W. (1974) Ouabain-receptor interactions in (Na+ plus K+)-ATPase preparations. IV. The molecular structure of different cardioactive steroids and other substances and their affinity to the glycoside receptor. Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol., 283(4), 335-356.

47. Esmann, M., and Skou, J. C. (1985) Occlusion of Na+ by the Na,K-ATPase in the presence of oligomycin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 127, 857-863.

48. Esmann, M., Hideg, K., Marsh, D. (1992) Conventional and saturation transfer EPR spectroscopy of Na+/K(+)-ATPase modified with different maleimide-nitroxide derivatives. Biochim. Biophys. Acta., 1159(1 ):51-59.

49. Ettrich, R., Melichercik, M., Teisinger, J., Ettrichova, O., Krumsheid, R., Hofbauerova, K., Kvasnicka, P., Schoner, W., Amler, E. (2001) Three-dimensional structure of the large cytoplasmic H4 - H5 loop of Na+/K+-ATPase deduced by restraint-based comparative modeling shows only one ATP binding site. J. Mol. Model.,1, 184-192.

50. Facundo, H.T., De Paula, J.G., Kowaltowski, A.J. (2007) Mitochondrial ATP-sensitive K(+) channels are redox-sensitive pathways that control reactive oxygen species production. Free. Radic. Biol. Med., 42, 1039-1048.

51. Faller, L., Diaz, R., Scheiner-Bobis, G., Farley, R.A. (1991) Temperature dependence of the rates of conformational changes reported by fluorescein 5'-isothiocyanate modification of H,K-ATPase. Biochemistry., 30, 3503-3510.

52. Farman, N., Corthesy-Theulaz, I., Bonvalet, J.P., Rossier, B.C. (1991) Localization of alpha-isoforms of Na+-K+-ATPase in rat kidney by in situ hybridization. Am. J. Physiol., 260, C468-C474.

53. Fernandes, A.P. and Holmgren, A. (2004) Glutaredoxins: glutathione-dependent redox enzymes with functions far beyond a simple thioredoxin backup system. Antioxid. Redox. Signal., 6, 63-74.

54. Figtree, G.A., Liu, C.C., Bibert, S., Hamilton, E.J., Garcia, A., White, C.N., Chia, K.K., Cornelius, F., Geering, K., Rasmussen, H.H. (2009) Reversible oxidative modification: a key mechanism ofNa+-K+ pump regulation. Circ. Res. Jul. 17, 105(2), 185-193.

55. Findlay, V.J., Townsend, D.M., Morris, T.E., Fraser, J.P., He, L., Tew, K.D. (2006) A novel role for human sulfiredoxin in the reversal of glutathionylation. Cancer. Res., 66, 6800-6806.

56. Forbush, B. (1987a) Rapid release of 42K+ and 86Rb+ from an occluded state of the Na,K-pump in the presence of ATP or ADP. J. Biol. Chem., 262, 11104-11115.

57. Forbush, B. (1987b) Rapid release of 42K+ and 86Rb+ from two distinct transport sites on the Na,K-pump in the presence of Pi or V04. J. Biol. Chem., 262, 11116-11127.

58. Forbush, B., Kaplan, J.H., Hoffman, J.F. (1978) Characterization of a new photoaffinity derivative of ouabain: labeling of the large polypeptide and of a proteolipid component of the Na,K-ATPase. Biochemistry, 17, 3667-3676.

59. Franzin, C.M., Gong, X.M., Thai, K., Yu, J., Marassi, F.M. (2007). NMR of membrane proteins in micelles and bilayers: the FXYD family proteins. Methods., 41, 398-408.

60. From, A.H., Fullerton, D.S., Ahmed, K. (1990) Digitalis receptor sugar bingding site characteristics a base upon studies of Na,K-ATPase preparations with different digitalis sensitivities. Mol. Cell. Biochem., 94, 157-165.

61. Gallogly, M. M., and Mieyal, J. J. (2007) Mechanisms of reversible protein glutathionylation in redox signaling and oxidative stress. Curr. Opin. Pharmacol., 7, 381-391.

62. Garrahan, P.J., Glynn, I.M. (1967a) The stoichiometry of the sodium pump. J. Physiol., (London) 192,217-235.

63. Garrahan, P.J., Glynn, I.M. (1967b) The sensitivity of sodium pump to external sodium. J. Physiol., 175-188.

64. Gatto, C., Thornewell, S.J., Holden, J.P., Kaplan, J.H. (1999) Cys(577) is a conformationally mobile residue in the ATP-binding domain of the Na,K-ATPase alpha-subunit. J. Biol. Chem., 274(35):24995-5003.

65. Geering, K., Beggah, A., Good, P., Girardet, S., Schaer, D., Jaunin, P. (1996) Oligomerization and maturation of Na,K-ATPase: functional interaction of the cytoplasmic NH2 terminus of the beta subunit with the alpha subunit, J. Cell Biol., 133, 1993-1204.

66. Geering, K., Beguin, P., Garty, H., Karlish, S., Fuzesi, M., Horisberger, J.D., Grambert, G. (2003) FXYD proteins: new tissue- and isoform-specific regulators of Na,K-ATPase. Ann. N.Y. Acad Sci., 986, 388-394.

67. Ghezzi, P., Bonetto, V., Fratelli, M. (2005) Thiol-disulfide balance: from the concept of oxidative stress to that of redox regulation. Antioxid. Redox. Signal., 7, 964-972.

68. Ghezzi, P., Casagrande, S., Massignan, T., Basso, M., Bellacchio, E., Mollica, L., Biasini, E., Tonelli, R., Eberini, I., Gianazza, E., Dai, W.W., Fratelli, M., Salmona, M., Sherry, B.,

Bonetto, V. (2006) Redox regulation of cyclophilin A by glutathionylation. Proteomics., 6, 817-825.

69. Giustarini, D., Dalle-Donne, I., Colombo, R., Milzani, A., Rossi, R. (2004a) Interference of plasmatic glutathione and hemolysis on glutathione disulfide levels in human blood. Free. Radie. Res., 38, 1101-1106.

70. Giustarini, D., Dalle-Donne, I., Lorenzini, S., Milzani, A., Rossi, R. (2006) Age-related influence on thiol, disulfide and protein mixed disulfide levels in human plasma. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Scl, 61, 1030-1038.

71. Giustarini, D., Milzani, A., Aldini, G., Carini, M., Rossi, R., Dalle-Donne, I. (2005) S-nitrosation versus S-glutathionylation of protein sulfhydryl groups by S-nitrosoglutathione. Antioxid. Redox. Signal., 7, 930-939.

72. Giustarini, D., Rossi, R., Milzani, A., Colombo, R., Dalle-Donne, I. (2004b) S-Glutathionylation: from redox regulation of protein functions to human diseases. J. Cell. Mol. Med., 8, 201-212.

73. Glitsch, H.G. (2001) Electrophysiology of the sodium-potassium-ATPase in cardiac cells. Physiol. Rev., 81(4), 1791-1826.

74. Gloor, S., Antonicek, H., Sweadner, K.J., Pagliusi, S., Frank, R., Moos, M., Schachner, M. (1990) The adhesion molecule on glia (FVOG) is a homologue of the (3-subunit of the Na,K-ATPase. J. Cell. Biol., 110, 165-174.

75. Glynn, I.M. (1964) The action of cardiac glycosides on ion movements. Pharmacol. Rev., Dec, 16, 381-407.

76. Glynn, I.M. (1985) The Na,K-transporting adenosine. The enzymes of biological membrane, ed. Martonosi A. N., Plenum. Press., N-Y, v.3, 35-114.

77. Glynn, I.M., Hoffman, J.F. (1971) Nucleotide requirements for sodium-sodium exchange catalyzed by the sodium pump in human red cells. J. Physiol., (London) 218, 239-256.

78. Glynn, I.M., Richards, D.S. (1982) Occlusion of rubidium ions by the sodium-potassium pump: its implications for the mechanism of potassium transport. J. Physiol., (London) 330, 17-43.

79. Godfraind, T., Ghysel-Burton, J. (1977) Binding sites related to ouabain-induced stimulation or inhibition of the sodium pump. Natrue., 265, 165-166.

80. Goldin, S.M., Tong, S.W. (1974) Reconstitution of active transport catalyzed by the purified

94

sodium and potassium ion-stimulated adenosine triphosphatase from canine renal medulla. J. Biol. Chem., Sep, 25, 249(18), 5907-5915.

81. Goto, A., Ishiguro, T., Yamada, K., Ishii, M., Yoshioka, M., Eguchi, C., Shimora, M., Sugimoto, T. (1990) Isolation of a urinary digitalis-like factor insistinguishable from digoxin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 173, 1093-1101.

82. Gravina, S.A. and Mieyal, J.J. (1993) Thioltransferase (aka glutaredoxin) is a specific glutathionyl mixed disulfide oxidoreductase. Biochemistry., 32, 3368-3376.

83. Gurezka, R., Laage, R., Brosid, B., Langosch, D. (1999) A heptad motif of leucine residues found in membrane proteins can drive self-assembly of artificial transmembrane segments. J. Biol. Chem., 274(14), 9265-9270.

84. Hamlyn, J.M., Hamilton, B.P., Manunta, P. (1996) Endogenous ouabain, sodium balance and blood pressure: a review and a hypothesis. J. Hypertens., 14, 151-167.

85. Han, F., Bossuyt, J., Despa, S., Tucker, A.L., Bers, D.M. (2006). Phospholemman phosphorylation mediates the protein kinase C-dependent effects on Na+/K+pump function in cardiac myocytes. Circ. Res., 99(12), 1376-1383.

86. Harigaya, S., Schwartz, A. (1969) Rate of calcium binding and uptake in normal animal and failing human cardiac muscle. Membrane vesicles (relaxing system) and mitochondria. Circ. Res., 25(6), 781-794.

87. Hasselbach, W., Makinose, M. (1961) Die Calcium Pumpe der "Erschlafungsgrana" des Muskels und ihre Abhängigkeit von der ATP-Spaltung. Biochem. Z., 333, 518-528.

88. Hayashi, Y., Mimura, K., Matsui, H., Takagi, T. (1989) Minimum enzyme unit for Na,K-ATPase is the alpha-beta protomer. Determination by low-angle laser light scattering photometry coupled with high-performance gel chromatography for substantially simultaneous measurement of ATPase activity and molecular weight. Biochim. Biophys. Acta., 983,217-229.

89. Hayes, J.D. and McLellan, L.I. (1999) Glutathione and glutathione-dependent enzymes represent a coordinately regulated defense against oxidative stress. Free. Radic. Res., 31, 273-300.

90. Hicks, B. W., Parsons, S. M. (1992) Characterizatin of the P-type and V-type ATPase of cholinergic synaptic vesicles and coupling of nucleotide hydrolysis to acetylcholine transport. J. Neurochem., 58(4), 1211-20.

91. Homolya, L., Varadi, A., Sarkadi, B. (2003) Multidrug resistance-associated proteins: export pumps for conjugates with glutathionee, glucuronate or sulfate. Biofactors., 17, 103-114.

92. Hopkins, B.E., Wanger, HJr., Smith, T.W. (1976) Sodium and potassium-activated adenosine triphosphatase of the nasal salt gland of the duck (Anas platyrhynchos). Purification, characterization, and NH2-terminal amino acid sequence of the phosphorylating polypeptide. J. Biol. Chem., 251,4365-4371.

93. Hoppe, G., Chai, Y.C., Crabb, J.W., Sears, J. (2004) Protein S-glutathionylation in retinal pigment epithelium converts heat shock protein 70 to an active chaperone. Exp. Eye. Res., 78, 1085-1092.

94. Inesi, G., Kirley, M.R. (1992) Structural features of cation transport ATPases. J. Bioenerg., Biomembr., 24, 271-283.

95. Jacob, C., Knight, I., Winyard, P.G. (2006) Aspects of the biological redox chemistry of cysteine: from simple redox responses to sophisticated signalling pathways. Biol. Chem., 387, 1385-1397.

96. Jones, D.P., Go, Y-M., Anderson, C.L., Ziegler, T.R., Kinkade, J.M., Kirlin, W.G. (2004) Cysteine/cystine couple is a newly recognized node in the circuitry for biologic redox signaling and control. FASEB. J., 18, 1246-1248.

97. Jones, D.P. (2002) Redox potential of GSH/GSSG couple: assay and biological significance. Methods. Enzymol., 348: 93-112.

98. Jones, D.P. (2006) Redefining oxidative stress.Antioxid. Redox. Signal., 8, 1865-1879.

99. Jones, L.R., Phan, S.H., Besch, H.R.Jr. (1978) Gel electrophoretic and density gradient analysis of the (K++Ca2+)-ATPase and the (Na++K+)-ATPase activities of cardiac membrane vesicles. Biochim. Biophys. Acta., 514(2), 294-309.

100. Jorgensen, P.L. (1974) Purification and characterization of Na,K-ATPase. III. Purification from the outer medulla of mammalian kidney after selective removal of membrane components by sodium dodecylsulphate. Biochim. Biophys. Acta., 356, 36-52.

101. Jorgensen, P.L. (1975) Purification and characterization of Na,K-ATPase. V. Conformational changes in the enzyme. Transitions between the Na-form and K-form studied with tryptic digestion as a tool. Biochim. Biophys. Acta., 401, 399-415.

102. Jorgensen, P.L. (1977) Purification and characterization of Na,K-ATPase. VI. Differential

trytic modification of catalytic functions of the purified enzyme in the presence ofNaCl and

96

KC1. Biochim. Biophys. Acta., 597, 305-317.

103. Jorgensen P.L. (1988) Structural basis for coupling of E1-E2 transitions in aP-units of renal Na,K-ATPase to Na,K-translocation. in Progress in clinical and biological research, Alan R.Liss,Inc.,New York, 268A, pp. 19-38.

104. Jorgensen, P.J., Collins, J.H. (1986) Tryptic and chymotryptic cleavage sites in sequence of alpha-subunit of Na,K-ATPase from outer outer medullaof mammalian kidney. Biochim. Biophys. Acta., 860, 570-576.

105. Jorgensen, P.L., Hakansson, K.O. Karlish, S.J.D. (2003) Structure and mechanism of Na,K-ATPase: functional sites and their interactions. Annu. Revs. Physiol., 65, 817-849.

106. Jorgensen, P.L., Karlish, S.J.D, Gitler, C. (1982) Evidence for the organization of the transmembrane segments (Na,K)-ATPase based on labeling lipid-embedded and surface domains of the a-subunit, J. Biol. Chem., 257 (13), 7435-7442.

107. Juhaszova, M., Blaustein, M.P. (1997) Distinct distribution of different Na+ pump a subunit isoforms in plasmalemma: physiological implications. Ann. N.Y. Acad. Sci., 834, 524-536.

108. Jung, C.H. and Thomas, J.A. (1996) S-glutathiolated hepatocyte proteins and insulin disulfides as substrates for reduction by glutaredoxin, thioredoxin, protein disulfide isomerase, and glutathione. Arch. Biochem. Biophys., 335, 61-72.

109. Kapakos, J.G. and Steinberg, M. (1982) Fluorescent labeling of Na,K-ATPase by 5-iodacetamidofluorescein. Biochim. Biophys. Acta., 693, 493-496.

110. Kaplan, J.H. (2002) Biochemistry of Na,K-ATPase. Annual Review of Biochemistry., 71, 511-535.

111. Kaplan, J. H. and Kenney, L. J. (1982) ADP supports ouabain-sensitive. K:K ex change in human red blood cells. Ann. NY Acad. Sci., 402, 292-295.

112. Karlish, S.J.D (1980) Characterization of conformational changes in Na,K-ATPase labeled with fluorescein in the active site. J. Bioenerg. Biomembr., 12, 111-136.

113. Karlish, S.J.D., Yates, D.W. (1978) Tryptophane fluoreseence of Na,K-ATPase as a tool for study of the enzyme mechanism. Biochim. Biophys. Acta., 527, 115-130.

114. Karlish, S.J.D., Jorgensen, P.L., Gitler, C. (1977) Identification of a membrane embedded segment of a-subunit of Na,K-ATPase, Nature., 269, 715-717.

115. Kawamura, A., Guo, J., Itagaki, Y., Bell, C., Wang, Y., Haupert, G.T., Jr., Magil, S., Gallagher, R.T., Berva, N., Nakanishi, K. (1999) On the structure of endogenous ouabain.

Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96, 6654-6659.

116. Kemmink, J, Darby, N.J., Dijkstra, K., Nilges, M., and Creighton, T.E. (1996) Structure determination of the N-terminal thioredoxin-like domain of protein disulfide isomerase using multidimensional heteronuclear 13C/15N NMR spectroscopy. Biochemistry., 35, 7684-76891.

117. Kim, G. and Levine, R.L. (2005) Molecular determinants of S-glutathionylation of carbonic anhydrase 3. Antioxid. Redox. Signal., 7, 849-854.

118. Kim, J.R., Yoon, H.W., Kwon, K.S., Lee, S.R., Rhee, S.G. (2000) Identification of proteins containing cysteine residues that are sensitive to oxidation by hydrogen peroxide at neutral pH. Anal. Biochem., 283, 214-221.

119. Kirley, T.L. (1989) Determination of three disulfide bonds and one free sulfhydryl in the P-subunit of Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 264, 7185-7192.

120. Klatt, P. and Lamas, S. (2000) Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress. Eur. J. Biochem., 267(16), 4928-4944.

121. Komiyama, Y., Dong, X.H., Nishimura, N., Masaki, H., Yoshika, M., Masuda, M., Takahashi, H. (2005) A novel endogenous digitalis, telocinobufagin, exhibits elevated plasma levels in patients with terminal renal failure. Clin. Biochem., 38, 36-45.

122. Komniski, M.S., Yakushev, S., Bogdanov, N., Gassmann, M., Bogdanova, A. (2011) Interventricular heterogeneity in rat heart responses to hypoxia: The tuning of glucose metabolism, ion gradients, and function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 300(5), H1645-H1652.

123. Koster, J.C., Blanco, G., Mercer, R.W. (1995) A cytoplasmic region of the Na,K-ATPase alpha-subunit is necessary for specific alpha/alpha association. J. Biol. Chem., 270, 14332-14339.

124. Kruh, G.D. and Belinsky, M.G. (2003) The MRP family of drug efflux pumps. Oncogene., 22, 7537-7552.

125. Kuster, B., Shainskaya, A., Pu, H.X., Goldshleger, R., Blostein, R., Mann, M., Karlish, S.J. (2000) A new variant of the gamma subunit of renal Na,K-ATPase. Identification by mass spectrometry, antibody binding, and expression in cultured cells. J. Biol. Chem., 275(24), 18441-18446.

126. Kuster, G.M, Pimentel, D.R., Adachi, T., Ido, Y., Brenner, D.A., Cohen, R.A., Liao, R., Siwik,

D.A., Colucci, W.S. (2005) Alpha-adrenergic receptor- stimulated hypertrophy in adult rat

98

ventricular myocytes is mediated via thioredoxin-1-sensitive oxidative modification of thiols on Ras. Circulation., 111, 1192-1198.

127. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Natrue., 221, 680-685.

128. Lancel, S., Qin, F., Lennon, S.L., Zhang, J., Tong, X., Mazzini, M.J., Kang, Y.J., Siwik, D.A., Cohen, R.A., Colucci, W.S. (2010) Oxidative posttranslational modifications mediate decreased SERCA activity and myocyte dysfunction in Galphaq-overexpressing mice. Circ. Res., 107(2):228-232.

129. Lancel, S., Zhang, J., Evangelista, A., Trucillo, M.P., Tong, X., Siwik, D.A., Cohen, R.A., Colucci, W.S. (2009) Nitroxyl activates SERCA in cardiac myocytes via glutathiolation of cysteine 674. Circ. Res., 104(6):720-723.

130. Lands, L.C., Grey, V.L., Grenier, C. (2000) Total plasma antioxidant capacity in cystic fibrosis. Pediatr. Pulmonol., 29(2):81-87.

131. Lichtstein, D., Gati, I., Samuelov, S., Berson, D., Rozenman, Y., Landau, L., Deutsch, J. (1993) Identification of digitalis-like compounds in human cataractous lenses. Eur. J. Biochem., 216, 261-270.

132. Lind, C., Gerdes, R., Hamnell, Y., Schuppe-Koistinen, I., von Lowenhielm, H.B., Holmgren, A., Cotgreave, I.A. (2002) Identification of Sglutathionylated cellular proteins during oxidative stress and constitutive metabolism by affinity purification and proteomic analysis. Arch. Biochem. Biophys., 406, 229-240.

133. Lingrel, J.B. (1992) Na,K-ATPase: isoform strucrure, function and expression. J. Bioenerg. Biomembr., 24, 263-270.

134. Lopina, O.D. (2000) Na,K-ATPase: structure, mechanism, and regulation. Membr. Cell Biol., 13, 721-744.

135. Lou, M.F., Dickerson, J.E.Jr., Tung, W.H., Wolfe, J.K., Chylack, L.T.Jr. (1999) Correlation of nuclear color and opalescence with protein Sthiolation in human lenses. Exp. Eye. Res., 68, 547-552.

136. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.J., Randall, R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-275.

137. Lu, S.C. (2000) Regulation of glutathione synthesis. Curr. Top. Cell. Regul., 36, 95-116.

138. Lutsenko, S. and Kaplan, J.H. (1994) Molecular events in close proximity to the membrane

99

associated with the bingding of iigands to the Na,K-ATPase. J. Biol. Chem., 269, 4555-4564.

139. Lytton, J. (1985) The catalytic subunits of the Na,K-ATPase alpha and alpha(+) isozymes are the products of different genes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 132, 764-769.

140. Maher, P. (2006) Redox control of neural function: background, mechanisms, and significance. Antioxid. Redox. Signal., 8, 1941-1970.

141. Malik, N., Canfield, V.A., Beckers, M.C., Gros, P., Levenson, R. (1996) Identification of the mammalian Na,K-ATPase 3 subunit. J. Biol. Chem., 271, 22754-22758.

142. Mallis, R.J., Buss, J.E., Thomas, J.A. (2001) Oxidative modification of H-ras: S-thiolation and S-nitrosylation of reactive cysteines. Biochem. J., 355, 145-153.

143. Mallis, R.J., Hamann, M.J., Zhao, W., Zhang, T., Hendrich, S., Thomas, J.A. (2002) Irreversible thiol oxidation in carbonic anhydrase III: protection by S-glutathiolation and detection in aging rats. Biol. Chem., 383, 649-662.

144. Mallis, R.J., Poland, B.W., Chatterjee, T.K., Fisher, R.A., Darmawan, S., Honzatko, R.B., Thomas, J.A. (2000) Crystal structure of S-glutathiolated carbonic anhydrase III. FEBS. Lett., 482, 237-241.

145. Martin-Vasallo, P., Dackowski, W., Emanuel, J.R., Levenson, R. (1989) Identification of putative isoform of the Na,K-ATPase P-subunit. J. Biol. Chem., 264, 4613-4618.

146. Mercer, R.W. (1993) The structure of Na,K-ATPase. Int. Rev. Cytol., 137C, 139-168.

147. Mieyal, J.J., Gallogly, M.M., Qanungo, S., Sabens, E.A., Shelton, M.D. (2008) Molecular mechanisms and clinical implications of reversible protein S-glutathionylation. Antioxid. Redox. Signal., 10(1 1), 1941-1988.

148. Miller, R.P., Farley, R.A. (1990) Beta-subunit of Na,K-ATPase contains three disulfide bonds. Biochemistry., 29, 1524-1532.

149. Mimura, K., Matsui, H., Takagi, T., Hayasi, Y. (1993) Change in oligomeric structure of solubilized Na,K-ATPase induced by octaethylene glycol dodecel ether, phospatidylserine and ATP. Biochim. Biophys. Acta., 1145, 63-74.

150. Mobasheri, A., Avila, J., Cozar-Castcllano, I., Brownleader, M.D., Tervan, M., Francis, M.J., Lamb, J.F., Martin-Vasallo, P. (2000) Na,K-ATPase isozyme diversity; comparative biochemistry and physiological implications of novel functional interactions. Biosci. Rep., 20, 51-91.

151. Moller, J., Juul, D., le Maire, M. (1996) Strucrural organization, ion transport and energy

100

transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta., 1286, 1-51.

152. Moran, L.K., Gutteridge, J.M., Quinlan, G.J. (2001) Thiols in cellular redox signalling and control. Curr. Med. Chem., 8, 763-772.

153. Moriarty-Craige, S.E. and Jones, D.P. (2004) Extracellular thiols and thiol/disulfide redox in metabolism. Annu. Rev. Nutr., 24, 481-509.

154. Moriarty-Craige, S.E., Ha, K.N., Sternberg, P.Jr., Lynn, M., Bressler, S., Gensler, G., Jones, D.P. (2007) Effects of long-term zinc supplementation on plasma thiol metabolites and redox status in patients with age-related macular degeneration. Am. J. Ophthalmol., 143, 206-211.

155. Morth, J.P., Pedersen, B.P., Toustrup-Jensen, M.S., Sorensen, T.L., Petersen, J., Andersen, J.P., Vilsen, B., Nissen, P. (2007) Crystal structure of the sodium-potassium pump. Nature., 450(7172), 1043-1052.

156. Morth, J.P., Poulsen, H, Toustrup-Jensen, M.S., Schack, V.R., Egebjerg, J, Andersen, J.P, Vilsen, B, Nissen, P. (2009) The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., Jan 27, 364(1514),217-227.

157. Noguchi, S., Mutoh, Y., Kawamura, M. (1994) The functional roles of disulfide bonds in the beta-subunit of (Na,K)ATPase as studied by site-directed mutagenesis. FEBS. Lett., 341, 233-238.

158. Nulton-Persson, A.C., Starke, D.W., Mieyal, J.J., Szweda, L.I. (2003) Reversible inactivation of alpha-ketoglutarate dehydrogenase in response to alterations in the mitochondrial glutathione status. Biochemistry., 42, 4235-242.

159. Ogawa, H., Shinoda, T., Cornelius, F., Toyoshima, C. (2009) Crystal structure of the sodium-potassium pump Na,K-ATPase with bound potassium and ouabain. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 106, 13742-13747.

160. Olesen, C., Picard, M., Winther, A.M. (2007). The structural basis of calcium transport by the calcium pump. Nature., 450 (7172), 1036 - 1042.

161. Olesen, C., Sorensen, T.L, Nielsen, R.C., Moller, J.V., Nissen, P. (2004) Dephosphorylation of the calcium pump coupled to counterion occlusion. Science., (NY). 306, 2251-2255.

162. Park, E.M. and Thomas, J.A. (1988) S-thiolation of creatine kinase and glycogen phosphorylase b initiated by partially reduced oxygen species. Biochim. Biophys. Acta., 964, 151-160.

163. Pastore, A., Tozzi, G., Gaeta, L.M., Bertini, E., Serafini, V., Di Cesare, S., Bonetto, V., Casoni, F., Carrozzo, R., Federici, G., Piemonte, F. (2003) Actin glutathionylation increases in fibroblasts of patients with Friedreichs ataxia: A potential role in the pathogenesis of the disease. J. Biol. Chem., 43, 42588-42595.

164. Patzelt-Wenczler, R., Pauls, H., Erdmann, E., Schoner, W. (1975) Evidence for a sulfhdryl group in the ATP-binding site of (Na+ + K+)-activated ATPase. Eur. J. Biochem., 53,301-311.

165. Pauls, H., Serpersu, E.H., Kirch, U., and Schoner, W. (1986) Chromium(III) ATP inactivating Na,K-ATPase supports Na-Na and Rb-Rb exchange in inverted red dlood cells but not Na,K-transport. Eur. J. Biochem., 157, 585-595.

166. Periyasama, S.M., Huang, W.H., Askari, A. (1983) Subunit associations of Na,K-dependent adenosine triphosphatase. Chemical cross-linking studies. J. Biol. Chem., 258, 9878-9885.

167. Pineda-Molina, E., Klatt, P., Vazquez, J., Marina, A., Garcia de Lacoba, M., Perez-Sala, D., Lamas, S. (2001) Glutathionylation of the p50 subunit of NF-kappaB: a mechanism for redox-induced inhibition of DNA binding. Biochemistry., 40, 14134-14142.

168. Poole, L.B., Karplus, P.A., Claiborne, A. (2004) Protein sulfenic acids in redox signaling. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 44, 325-347.

169. Post, R.L., Hegyvary, C., Kume, S. (1972) Activation by adenosine triphosphate in the phosphorylation kinetics of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem., 247(20), 6530-6540.

170. Post, R.L., Sen, A.K., Rosenthal, A.S. (1965) A phosphorylated intermediate in adenosine triphosphate dependent sodium and potassium transport across kidney membranes. J. Biol. Chem., 240, 1437-1445.

171. Post, R.L., Kume, S., Tobin, T., Oreutt, B., Sen, A.K. (1969) Flexibility of an active center in sodium-plus-potassium adenosine triphosphatase. J. Gen. Physiol., 54, 306-326S.

172. Rajasekaran, S.A., Gopal, J, Rajasekaran, A.K. (2003) Expression of Na,K-ATPase beta-subunit in transformed MDCK cells increases the translation of the Na,K-ATPase alpha-subunit. Ann NY Acacl. Sci., Apr, 986, 652-654.

173. Rajasekaran, S.A., Gopa, J., Willis, D., Espineda, C., Twiss, J.L., Rajasekaran, A.K. (2004) Na,K-ATPase {beta} 1-subunit increases the translation efficiency of the {alpha} 1-subunit in

MSV-MDCK cells. Mol. Biol. Cell., 15(7), 3224-3232.

102

174. Rathbun, W.B., Betlanch, M.N. (1969) Estimation of enzymically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate. Anal. Biochem., 28(1), 436-445.

175. Reynaert, N.L., Ckless, K., Guala, A.S., Wouters, E.F., van der Vliet, A., Janssen-Heininger, Y.M. (2006) In situ detection of S-glutathionylated proteins following glutaredoxin-1 catalyzed cysteine derivatization. Biochim. Biophys. Acta., 1760, 380-387.

176. Rhee, S.G., Bae, Y.S., Lee, S.R., Kwon, J. (2000) Hydrogen peroxide: a key messenger that modulates protein phosphorylation through cysteine oxidation. Sci. STKE., 53, PE1.

177. Rice, W.J., Young, H.S., Martin, D.W., Sachs, J.R., Stokes, D.L. (2001) Structure of Na+,K+-ATPase at 11-A resolution: comparison with Ca2+-ATPase in El and E2 states. Biophys. J., 80(5), 2187-2197.

178. Roederer, M., Staal, F.J., Osada, H., Herzenberg, L.A. (1991) CD4 and CD8 T cells with high intracellular glutathione levels are selectively lost as the HIV infection progresses. Int. Immunol., 3, 933- 937.

179. Rokutan, K., Thomas, J.A., Sies, H. (1989) Specific S-thiolation of a 30-kDa protein from rat liver under oxidative stress. Eur. J. Biochem., 179, 233-239.

180. Rokutan, K., Thomas, J.A., Johnston, R.B.Jr. (1991) Phagocytosis and stimulation of the respiratory burst by phorbol diester initiate Sthiolation of specific proteins in macrophages. J. Immunol., 147, 260-264.

181. Sachs, J.R. (1981) Mechanistic implication of the potassium-potassium exchange carried out by the sodium-potassium pump. J. Physiol., (London) 316, 263-277.

182. Sampathkumar, R., Balasubramanyam, M., Sudarslal, S., Rema, M., Mohan, V., Balaram, P. (2005) Increased glutathionylated hemoglobin (HbSSG) in type 2 diabetes subjects with microangiopathy. Clin. Biochem., 38, 892-899.

183. Sanchez, G., Nguyen, A.T., Timmerberg, B., Tash, J.S., Blanco, G. (2006) The Na,K-ATPase a4 isoform from humans has distinct enzymatic properties and is important for sperm motility. Molecular. Human. Reproduction., (12), 565- 576.

184. Saurin, A.T., Neubert, H., Brennan, J.P., Eaton, P. (2004) Widespread sulfenic acid formation in tissues in response to hydrogen peroxide. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101, 17982-17987.

185. Sbrana, E., Paladini, A., Bramanti, E., Spinetti, M.C., Raspi, G. (2004) Quantitation of reduced glutathione and cysteine in human immunodeficiency virus-infected patients. Electrophoresis., 25, 1522-1529.

186. Scanzano, R., Segall, L., Blostein, R. (2007) Specific sites in the cytoplasmic N terminus modulate conformational transitions of the Na,K-ATPase. J.Biol. Chem., 282(46), 33691-33697.

187. Schafer, F.Q. and Buettner, G.R. (2001) Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free, Radic, Biol, Med., 30, 1191-1212.

188. Schneider, R., Wray, V., Nimtz, M., Lehmann, W.D., Kirch, U., Antolovic, R., Schoner, W. (1998) Bovine adrenals contain, in addition to ouabain, a second inhibitor of the sodium pump, J.Biol.Chem., 273, 784-792.

189. Schwartz, A., Allen, J.C., Harigaya, S. (1969) Possible involvement of cardiac Na,K-adenosine triphosphatase in the mechanism of action of cardiac glycosides. J. Pharmacol, Exp, Ther., 168(1), 31-41.

190. Seres, T., Ravichandran, V., Moriguchi, T., Rokutan, K., Thomas, J.A., Johnston, R.B.Jr. (1996) Protein S-thiolation and dethiolation during the respiratory burst in human monocytes. A reversible post-translational modification with potential for buffering the effects of oxidant stress. J. Immunol., 156, 1973-1980.

191. Shelton, M.D., Chock, P.B., Mieyal, J.J. (2005) Glutaredoxin: role in reversible protein S-glutathionylation and regulation of redox signal transduction and protein translocation. Antioxid. Redox. Signal., 7, 348-366.

192. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J.V., Mann, M. (2006) In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Protoc., 1(6), 2856-2860.

193. Shi, H.G., Mikhaylova, L., Zichittella, A.E., Arguello, J.M. (2000) Functional role of cysteine residues in the (Na,K)-ATPase alpha subunit. Biochim. Biophys. Acta., 1464(2), 177-187.

194. Shinoda, T., Ogawa, H., Cornelius, F., Toyoshima, C. (2009) Crystal structure of the sodium-potassium pump at 2.4 A resolution. Nature., 459, 446-450.

195. Shull, G.E., Greeb, J., Lingrel, J.B. (1986) Molecular cloning of three distinct forms of the Na,K-ATPase a-subunit from rat brain. Biochemistry., 25, 8125-8132.

196. Shull, G.E., Young, R.M., Greeb, J., Lingrel, J.B. (1988) Amino acid sequences of the a and P subunits of the Na,K-ATPase. in Progress in clinical and biological research, Alan R.Liss,Inc.,New York, 268A, pp. 3-18.

197. Sies, H. (1999) Glutathione and its role in cellular functions. Free. Radic. Biol. Med., 27,

104

916-921.

198. Sies, H. and Jones, D. (2007) Oxidative stress. In: Encyclopedia of Stress, 2nd ed., edited by Fink G. Elsevier, Academic. Press, vol.3, pp. 45-48.

199. Simons, T.J.B. (1974) Potassium: potassium exchange catalyzed by the sodium pump in human red cells. J. Physiol., (London) 244, 731-739.

200. Skou, J.C. (1957) The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta., 23, 394-401.

201. Skou, J.C. (1960) Further investigations on a Mg,Na-activated adenosine triphosphatase, possibly related to the active, linked transport of Na+ and K+ across the nerve membrane. Biochim. Biophys. Acta., 42, 6-23.

202. Skou, J.C., Esman, M. (1983) The effects of Na and K on the conformational transitions of Na,K-ATPase. Biochim. Biophys. Acta., 746, 101-113.

203. Soltoff, S.P. and Mandel, L.J. (1984) Active ion transport in the renal proximal tubule. III. The ATP dependence of the Na pump. J. Gen. Physiol., 84(4):643-662.

204. Starke, D.W., Chock, P.B., Mieyal, J.J. (2003) Glutathione-thiyl radical scavenging and transferase properties of human glutaredoxin (thioltransferase). Potential role in redox signal transduction. J. Biol. Chem.,21%, 14607-14613.

205. Stone, R.L. and Dixon, J.E. (1994) Protein-tyrosine phosphatases. J. Biol. Chem., 269, 31323-31326.

206. Sweadner, K.J. (1989) Isozymes of the Na/K-ATPase. Biochim. Biophys. Acta., 998, 185-220.

207. Sweadner, K.J., Arystarkhova, E., Donnet, C„ Wetzel, R.K. (2003) FX YD proteins as regulators of the Na,K-ATPase in the kidney. Ann. N.Y. Acad. Sci., 986, 382-387.

208. Sweadner, K.J., Rael, E. (2000) The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression. Genomics., 68, 41-56.

209. Thomas, J.A., Poland, B., Honzatko, R. (1995) Protein sulfhydryls and their role in the antioxidant function of protein S-thiolation. Arch. Biochem. Biophys., 319, 1-9.

210. Towbin, H., Stachelin, T., Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 4350-4354.

211. Toyoshima, C., Nomura, H., Sugita, Y. (2003) Structural basic of ion pumping by Ca(2+)-ATPase of sarcoplasmic reticulum. FEBS. Lett., 555, 106-110.

212. Urayama, O., Shutt, H., Sweadner, K.J. (1989) Identification of three isozyme proteins of the catalytic subunit of the Na,K-ATPase in rat brain. J. Biol. Chem., 264(14), 8271-8280.

213. Vagin, O., Turdikulova, S., Tokhtaeva, E. (2007) Polarized membrane distribution of potassium-dependent ion pumps in epithelial cells: different roles of the N-glycans of their beta subunits. Cell.Biochem. Biophys., 47(3), 376-391.

214. Wallick, W.T., Schwartz, A. (1988) Interaction of cardiac glycosides with Na,K-ATPase. Methods. Enzymol., 156, 201-213.

215. Wang, J., Boja, E.S., Tan, W„ Tekle, E., Fales, H.M., English, S., Mieyal, J.J., Chock, P.B. (2001) Reversible glutathionylation regulates actin polymerization in A431 cells. J. Biol. Chem., Dec 21, 276(51), 47763-47766.

216. Winterbourn, C.C. and Metodiewa, D. (1999) Reactivity of biologically important thiol compounds with superoxide and hydrogen peroxide. Free. Radic. Biol. Med., 27, 322-328.

217. Xie, Z., Asrari, A. (2002) Na(+)/K(+)-ATPase as a signal transducer. Eur. J. Biochem. 269(10), 2434-2439.

218. Xu, K. Y., Zweier, J. L., Becker, L. C. (1997) Oxygen free radicals directly attack the ATP-binding site of the cardiac Na_,K_-ATPase. Ann.N.Y. Acad Sci., 834, 680-683

219. Yamaguchi, M., Tonomura, Y. (1979) Simultaneous binding of three Na+and two K+ions to Na+,K+-dependent ATPase and changes in its affinities for the ions induced by the formation of a phosphorylated intermediate. J. Biochem., 86, 509-523.

220. Zima, A.V., Blatter, L.A. (2006) Redox regulation of cardiac calcium channels and transporters. Cardiovasc. Res., 71 (2):310-21.

Web-источники

1. PubMed:

2. Графический портал:

3. Электронная библиотека:

4. CBS Prediction Servers:

wwvv.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed www.rands.ru wvvw.lib.mexmat.ru www.cbs.dtu.dk/services

Благодарности

Выражаю особую благодарность моим научным руковадителям Лопиной Ольге Дмитриевне и Петрушанко Ирине Юрьевне за постоянное внимание и за неоценимую помощь в выполнении данной работы.

Благодарю Анашкину Анастасию Андреевну, Митькевича Владимира Александровича и Зиганшина Рустама Хусмановича за сотрудничество и помощь при выполнении работы. Благодарю Гусева Николая Борисовича и Рубцова Александра Михайловича, а также всех сотрудников и аспирантов кафедры биохимии за отзывчивость и готовность помочь в любой момент.

Огромную благодарность выражаю всей моей семье за поддержку, помощь и терпение, проявленные за все эти годы.