Связывание уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATРазой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Климанова, Елизавета Андреевна

• Климанова, Елизавета Андреевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Климанова, Елизавета Андреевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура Na,K-ATPa3bi. Изоформы а- и [З-субъединиц

2. Механизм гидролиза АТР и транспорта ионов 1Ча,К-АТРазой

3. Катионсвязывающие центры Na,К-АТР азы

4. Регуляция активности Na,K-ATPa3bi

5. Олигомеризация Na,К-АТР азы

6. Конформационные изменения №,К-АТРазы

7. Na,K-ATPa3a - рецептор кардиотонических стероидов

8. Связывание Na,K-ATPa3bi с кардиотоническими стероидами

9. Биосинтез кардиотонических стероидов

10. Токсический эффект кардиотонических стероидов

11. Физиологические эффекты кардиотонических стероидов

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы

2. Методы

2.1. Получение фракции микросом из солевых желез утки

2.2. Очистка Na,K-ATPa3bi из микросом солевых желез уток

2.3. Определение концентрации белка

2.4. Определение активности Na,K-ATPa3bi

2.4.1. Определение активности Ыа.К-АТРазы по накоплению Pi

2.4.2. Определение активности с использованием системы сопряженных ферментов

2.5. Исследование ингибирования №,К-АТРазы под действием КТС и расчет 1С50

2.6. Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле

2.7. Вестерн-блоттинг

2.8. Методы регистрации конформационных изменений, индуцированных связыванием Na,K-ATPa3bT с кардиотоническими стероидами

2

2.8.1. Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Na,K-АТРазы из солевых желез утки

2.8.2. Включение 5-иодацетамидфлуоресцеина (5-ИАФ) в препараты Na,K-АТРазы, полученные из солевых желез утки

2.8.3. Измерение флуоресценции ФИТЦ- и 5-ИАФ-меченных препаратов Na,K-ATPa3bi, полученных из солевых желез утки

2.8.4. Регистрация конформационных переходов при связывании различных лигандов методом изотермической калориметрии титрования

Устройство прибора VP-ITC Micro Calorimeter

Изотермическая калориметрия титрования

2.9. Молекулярное моделирование

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика препаратов Ыа,К-АТРазы, полученных из солевых желез утки

2. Ингибирование №,К-АТРазы уабаином и маринобуфагенином

3. Изучение взаимодействия Na,K-ATPa3bi с уабаином и маринобуфагенином с помощью измерения флуоресценции ковалентно связанных с ферментом меток

4. Изучение взаимодействия Na,K-ATPa3bi с уабаином и маринобуфагенином методом изотермической калориметрии титрования

5. Моделирование участка а-субъединицы Na,K-ATPa3bi, связанного с молекулой маринобуфагенина

6. Изучение взаимодействия Na,K-ATPa3bi с AMP, ADP и АТР методом изотермической калориметрии титрования

7. Изучение взаимодействия Na,K-ATPa3bi с уабаином и маринобуфагенином в присутствии ADP и АТР методом изотермической калориметрии титрования

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

5-ИАФ - 5-иодацетамидфлуоресцеин ADP - аденозиндифосфат

AEBSF - 4-(2-аминоэтил)бензенсульфонилфторид гидрохлорид

AMP - аденозинмонофосфат

АТР - аденозинтрифосфат

ВАХ - белок, вызывающий аноптоз

Вс1-2 — белок, подавляющий апоптоз

C7-MDCK - линия клеток почечного эпителия собаки

СНО — линия клеток яичников китайских хомячков

DMSO - диметилсульфоксид

Е-64 - (1S, 28)-2-(((8)-1-((4-гуанидинобутил)амино)-4-метил-1-оксопентан ил)карбамоил)циклопропанкарбоксильная кислота

EGF(R) - эпидермальный фактор роста

ERK1/2 — протеинкиназы, активируемые внеклеточными сигналами

ITC - изотермическая калориметрия титрования

JNK - стресс-активируемые протеинкиназы

Mal 04 - линия клеток почечного эпителия обезьяны

МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа

NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный

NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

PBST - фосфатпо-солевой буфер, содержащий 0,1% твин

Pi - фосфат неорганический

PI3K. - фосфатидилинозитол-3-киназы

РКА — протеинкиназа А

РКС - протеинкиназа С

PKG — протеинкиназа G

PMSF - фенилметансульфонилфторид

PVDF — поливинилиденфторид

Raf — семейство серин/треониновых протеинкиназ

Ras - семейство белков, регулирующих процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и морфологии

SDS - додецилсульфат натрия

SGHPL-4 - клетки цитотрофобласта человека

ДАБ - 3,3'-диаминобензидин

ДТТ - дитиотреитол

КТС - кардиотонические стероиды

ПААГ — полиакриламидный гель

Трис — трис(гидроксиметил)метиламин

ФЕП - фосфоенолпируват

ФИТЦ — флуоресцеинизотиоцианат

ЭГТА - этиленгликоль-бис(бета-аминоэтил-эфир)-М, N, N N'-тетраацетат ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Связывание уабаина и маринобуфагенина с Na,K-ATРазой»

ВВЕДЕНИЕ

Na,K-ATPa3a (Na-Hacoc) — это фермент, встроенный в плазматическую мембрану, который обеспечивает перенос ионов Na+ из клетки наружу, а К+ - в противоположном направлении. Оба катиона перемещаются против электрохимического градиента, для чего используется энергия, освобождающаяся при гидролизе АТР до ADP и неорганического фосфата.

Na,K-ATPa3a поддерживает градиент ионов Na+ и К+ через плазматическую мембрану фактически во всех типах клеток животных. Этот градиент имеет существенное значение для передачи сигналов и обеспечения вторичного транспорта, поддержания клеточного объема, осмотической активности, он также необходим для генерации потенциала действия.

Na,K-ATPa3a - один из первых открытых мембранных ферментов, относящихся к семейству АТРаз Р-типа, которое включает в себя не только натриевый, кальциевый и протонный насосы, но и насосы, обеспечивающие транспорт тяжелых металлов, а также липидные флиппазы [1]. Как и многие другие белки клетки, Na,K-ATPa3a существует в виде нескольких изоферментов. Специфическим ингибитором этого фермента является уабаин — соединение, относящееся к классу так называемых кардиотонических стероидов (КТС), которые являются производными холестерина. Помимо уабаина существует множество других представителей этого класса соединений (дигоксин, дигитоксин, строфантин, буфалин, маринобуфагенин и др.), которые также являются ингибиторами Na,K-ATPa3bi. Эти соединения принято делить на два подкласса (карденелиды и буфадиенолиды), различающиеся между собой строением и свойствами.

Еще в 1953 году Szent-Gyorgyi высказал идею о том, что в организме млекопитающих существуют так называемые эндогенные кардиотонические стероиды [2]. В настоящее время достоверно известно, что подобные соединения присутствуют во многих тканях млекопитающих [3], [4], [5], [6], а их концентрация в плазме человека колеблется от 0,1 до 1 нМ [7].

В том же 1953 году Schatzman обнаружил, что Na-Hacoc, присутствующий в плазматических мембранах клеток животных, является рецептором

кардиотонических стероидов [8], а в 1957 году Бкои идентифицировал №,К-АТРазу [9] и показал, что она является тем самым Ыа-насосом.

В последние годы было установлено, что помимо своей основной функции

№,К-АТРаза также принимает участие в инициации некоторых сигнальных

каскадов. Существует две гипотезы, которые объясняют функцию КТС в генерации

клеточных сигналов [10]. Одна из них предполагает, что в результате

взаимодействия Ыа,К-АТРазы с кардиотоническими стероидами происходит

ингибирование фермента, вследствие чего наблюдается локальное увеличение

концентрации ионов внутри клетки. Это, в свою очередь, приводит к

активации Ка+/Са2+-обменника и последующему локальному увеличению

концентрации ионов Са2+. Повышение концентрации Са2+ стимулирует

2+

высвобождение еще большего количества из эндоплазматического

ретикулума, расположенного вблизи плазматической мембраны, и, как следствие, может быть причиной запуска ряда Са2+-опосредованных каскадов.

Вторая гипотеза рассматривает №,К-АТРазу в качестве компонента так называемой сигналосомы, в состав которой входит ряд белков, взаимодействие с которыми обусловлено конформационными перестройками молекулы фермента. Предполагается, что вследствие связывания КТС с Ыа,К-АТРазой происходит взаимодействие Ы-концевой части а-субъединицы фермента с Ы-концом рецептора инозитол-1,4,5-трифосфата эндоплазматического ретикулума, что приводит к увеличению чувствительности этого рецептора к его лиганду [11]. Наряду с Бгс-зависимым фосфорилированием фосфолипазы С (РЬС-а1) и последующей ее активацией это приводит к образованию инозитол-1,4,5-трифосфата, вследствие чего открывается Са-канал эндоплазматического ретикулума и происходит высвобождение Са . Увеличение концентрации ионов Са и образование диацилглицерина активируют протеинкиназу С (РКС). Активация Эгс-киназы в результате взаимодействия КТС с Иа,К-АТРазой, с другой стороны, является причиной фосфорилирования рецептора эпидермального фактора роста и активации сигнального пути, включающего белки Каз/11а17МЕК/Егк1/2. Стоит отмстить, что активация данного сигнального пути кардиотоническими стероидами наблюдается также в случае мутантных форм ИаД-АТРазы, не обладающих функцией насоса [12]. Таким образом, его активация не зависит от концентраций

ионов Иа+ и Са2+, т.е. в данном случае активация сигнального пути вызвана не ингибированием ферментативной активности Ка,К-АТРазы, а конформационными перестройками молекулы фермента под действием КТС, приводящими к взаимодействию №,К-АТРазы с белками-партнерами и последующей активацией сигнальных каскадов клетки.

Хотелось бы обратить внимание на тот факт, что различные представители группы кардиостероидов по-разному ведут себя в отношении не только разных типов клеток, но даже оказывают различные эффекты на одну и ту же клетку.

Таким образом, можно полагать, что механизмом запуска некоторых сигнальных каскадов является не только ингибирование №,К-АТРазы под действием КТС, но и изменение конформации этого фермента при их связывании.

Данная работа посвящена изучению взаимодействия №,К-АТРазы с двумя различными представителями кардиотонических стероидов — уабаином и маринобуфагенином, с особым вниманием к изменению конформации фермента под действием двух этих КТС.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура Na,K-ATPa3bi. Изоформы а- и р-субъединиц

Na,K-ATPa3a состоит из полипептидных цепей минимум двух типов, названных а- и р-субъединицами, которые сочетаются друг с другом в эквимолярных соотношениях.

а-Субъединица Na,K-ATPa3bi, содержащая участки связывания ATP, Na+ и К+, а также специфического ингибитора уабаина, способна полностью выполнять каталитические функции и перенос катионов через мембрану [13]. В процессе каталитического цикла она подвергается фосфорилированию-

369

дефосфорилированию по аминокислотному остатку Asp (число оборотов фермента составляет 7000-10000 мин"1). а-Субъединица трансформирует освобождающуюся при гидролизе АТР энергию в изменения конформации, приводящие в конечном итоге к переносу ионов по каналу «с шлюзом», сформированному этой субъединицей [14]. а-Субъединица в среднем состоит из 1021-1023 аминокислотных остатков, 5 из которых, расположенных на N-конце, могут отщепляться в процессе посттрансляционной модификации (al и а2). Каталитическая субъединица фермента содержит 10 фрагментов (Ml-М10), состоящих из 17-25 аминокислотных остатков и формирующих a-спирали, расположенные внутри мембраны (рис. 1) [14], [15].

Рис. 1. Схематическое изображение расположения a-субъединицы Na,K-АТРазы в мембране [15].

S

N

i) к

N- и С-копцевые фрагменты полипептидной цепи а-субъединицы располагаются в цитозоле. N-конец представляет собой гибкий, неспирализованный, богатый остатками лизина участок, который вовлечен в конформационные изменения и в регуляцию чувствительности №,К-АТРазы к катионам. С-концевая часть полипептидной цепи а-субъединицы содержит 6 трансмембранных фрагментов (М5-М10). Около половины аминокислотных остатков цепи находятся в цитоплазме, образуя большой цитоплазматический домен, значительно меньшая их часть расположена с наружной стороны мембраны. Внутри мембраны трансмембранные фрагменты (М4, М5, Мб и М8) располагаются достаточно близко друг к другу, формируя капал, по которому осуществляется перенос катионов [16], [17].

Цитозольные фрагменты а-субъедипицы формируют 6 цитоплазматических доменов, CD1-6 (Рис. 2). Между трансмембранными фрагментами М4 и М5 находится большой цитоплазматический домен, включающий примерно 400 аминокислотных остатков. Он состоит из чередующихся a-спиральных участков и р-складок. р-структуры образуют центральное ядро цитоплазматического домена, вокруг которого расположены a-спирали, соединенные подвижными петлями. В цитоплазматическом домене а-субъединицы выделяют три субдомена: нуклеотидсвязывающий, фосфорилируемый и актуаторный. В нуклеотидсвязывающем субдомене (участок полипептидной цепи от Asp369 до Asp586) находится центр связывания АТР. Этот домен представлен Р-складками, и в первичной структуре он находится между двумя последовательностями, которые вместе формируют фосфорилируемый домен (участок полипептидной цепи от Ala348 до Cys364 и от Asn638 до Asp749).

Рис. 2. Схематическое представление расположения а-субъединицы в мембране. CD 1 -6 - цитоплазматические домены [18].

Фосфорилируемый домен также представлен р-слоем, состоящим из шести параллельных элементов, которые формируют 2 складки Россмана, ограниченные по краям одним параллельным и одним антииараллельным Р-элементом. Фосфорилированию подвергается остаток Aspj69. Выявлены мотивы первичной структуры 369-DKTGTL, 610-TGD и 708-TGDGVND, многие аминокислотные остатки которых участвуют в связывании фосфатных групп АТР и координации иона Mg . Актуаторный субдомен - самый маленький из субдоменов цитоплзаматической части а-субъединицы. Он состоит из N-концевой части

I 312

полииептидной цепи (Glu - Glu ) и петли между вторым и третьим трансмембранными участками (М2 — МЗ), которые содержат, в основном, р-складчатые участки, чередующиеся с небольшим количеством а-спиралей (рис. 3). Молекулярная масса а-субъединицы составляет около 110 кДа [19].

Рис. 3. Данные рентгеноструктурного анализа, отображающие трехмерную структуру Ыа,К-АТРазы в Е-2-конформации [1].

Р-Субъединица Ыа,К-АТРазы непосредственного участия в катализе не принимает, но влияет на транспортные функции фермента, изменяя сродство к транспортируемым катионам. Она нековалентно связана с а-субъединицей. [3-Субъединица является гликопротеидом, и в зависимости от степени гликозилирования в различных тканях ее молекулярная масса составляет от 40 до 60 кДа. Полипептидная цепь р-субъединицы содержит только один трапсмембранный фрагмент и ориентирована в плазматической мембране так, что ее Ы-конец находится в цитоплазме, а С-конец - во внеклеточном пространстве [20]. На примере (31-изоформы крысы было показано, что во внеклеточной части формируются три дисульфидные связи (Суз|Ь-Су8|4х. Суз'^-Суз174. Суя2|2-Су82Ъ (рис. 4)) [14]. [15]. Здесь же содержатся от 3 до 6 аспарагиновых остатков в участках АБП-Зег/ТИг. которые могут быть гликозилированы. Разветвленные углеводные цепи (31-субъединицы содержат в основном галактозу, маннозу и Ы-

ацетилглюкозамин. При этом состав Сахаров углеводной части субъединицы характеризуются тканевой специфичностью [14]. Чувствительность №,К-АТРазы к ионам Ыа и К+ изменяется в зависимости от того, какая изоформа Р-субъединицы входит в состав фермента. Например, сродство к натрию убывает в ряду а2{52 > и2р1 >а1р1 = «3(32 > аЗр! [21].

Внеклеточное пространство

\

Цитоплазма

N

Рис. 4. Схематическое изображение р-субъединицы Ыа,К-АТРазы [15].

Стоит добавить, что в клетках позвоночных животных Р-субъединица может выступать в роли шаперона, контролирующего правильное сворачивание а-субъединицы, а также последующее ее встраивание в плазматическую мембрану [8]. В ассоциации с а-субъединицей участвуют 10 аминокислотных остатков, расположенных поблизости от С-концевого фрагмента Р-субъединицы. В этой области формируются структуры с чередующимися гидрофильными и гидрофобными аминокислотными остатками. При замене гидрофобных остатков наблюдается значительное снижение стабильности ар-комплекса [22].

Также известно, что р-субъединица Ыа.К-АТРазы принимает участие в формировании десмосом и запирающих межклеточных контактов, в обеспечении клеточной подвижности и оикогенной трансформации [23].

На рис. 5 представлено схематическое изображение структуры Ка.К-АТРазы и ее расположения в плазматической мембране.

Внеклеточное пространство

|

§ I

Цитоплазма

^тшниимиимАг '¿.»мтттоечэжма» ©о«?^ эо»

• » ф> у» ■ «о®

® НЮ «® . ■ »• «"О ,

. ■ * ф • Ф < «>> ■ • » «о тц&жчю«е^

«ОМв&Эее&тЮВМ» ф . <><■> •

явввс ®»® ®о®& ФвФФ9Ф*ФФгФвФФФ1ЮФФвСФОСФФ >'

Рис. 5. Схематическое изображение структуры ИаД-АТРазы (а(3-изофермента) и ее расположения в плазматической мембране [21]. Звездочкой обозначен каждый 50-й аминокислотный остаток.

Изоферментм 1\а,К-АТРазы. Как и многие присутствующие в клетке белки, каждая субъединица Ыа,К-АТРазы представлена в виде нескольких изомерных форм, которые могут сочетаться друг с другом в различных комбинациях. Доказательство существования изоферментов ЫаД-АТРазы, состоящих из разных изоформ, было получено, в частности, в экспериментах по ее связыванию с уабаином. Оказалось, что разные по составу изоформ изоферменты Ыа,К-Л ГРазы демонстрируют различную чувствительность к этому кардиостероиду (КТС).

В настоящее время известны 4 изоформы а-субъединицы (а1, а2, аЗ и а4) и 3 изоформы (3-субъединицы ([31, [32 и РЗ) №,К-АТРазы, которые кодируются различными генами. а1-Изоформа обнаружена во всех клетках и является преобладающей во всех сегментах почек. а2 представлена в нейропальной ткани, желудочках сердца и является основной изоформой а-субъединицы №.К-АТРазы в скелетных мышцах. аЗ-Изоформа встречается главным образом в мозге. Четвертая изоформа(а4) обнаружена лишь в семенниках [1]. [24]. [25]. [26].

Для изоформ р-субъединицы также характерна тканеспецифичность. pi-Изоформа Na,K-ATPa3bi встречается во всех типах клеток животных. р2-Изоформа характерна, главным образом, для нервной ткани, но встречается также в скелетных мышцах. рЗ-Изоформа обнаруживается в тканях семенников, печени и легких [1].

Субъединицы семейства FXYD. В составе очищенных препаратов Na,K-АТРазы почек помимо а- и р-субъединиц присутствует белковый компонент, ассоциированный с ферментом, который был назван у-субъедипицей. Forbush впервые продемонстрировал, что данный гидрофобный пептид имеет отношение к Na,K-ATPa3e [27]. Эта субъединица является трансмембранным белком семейства FXYD и, взаимодействуя с Na,K-ATPa3ott, выполняет регуляторные функции [28], [29]. FXYD-семейство - это семь пизкомолекулярных белков (FXYD1-7), которые, помимо взаимодействия с Na,K-ATPa3ofi, формируют каналы и взаимодействуют с другими белками, например, с Na/Ca-обменником. Они состоят из 60-160 аминокислотных остатков и кодируются генами с 6-9 экзонами, их экспрессия тканеспецифична [30]. Эти белки имеют два консервативных остатка глицина и один остаток серина в трансмембранном домене [31]. у-Субъединица почки овцы представляет собой небольшой полипептид, состоящий из 58 аминокислот с молекулярной массой около 7,2 кДа и электрофоретической подвижностью, соответствующей белку с молекулярной массой 10 кДа. Такое значение электрофоретической подвижности обусловлено наличием в структуре у— субъединицы большого количества положительно заряженных аминокислотных остатков. Эта субъединица пронизывает мембрану один раз, причем С-конец полипептидной цепи располагается внутри клетки, а N-конец - снаружи. Трансмембранный домен содержит 19 аминокислотных остатков (21-39) [32]. Считается, что присоединение у-субъединицы к комплексу ар- влияет на сродство Na,K-ATPa3bi к переносимым катионам и АТР [28], [33]. Кроме того, существует предположение, что у-субъединица может стабилизировать Na,K-ATPa3y [23]. В препаратах Na,K-ATPa3bi из других тканей вместо у-субъединицы могут находиться другие белки семейства FXYD. Например, в сердце с Ыа,К-АТРазой взаимодействует белок этого семейства, фосфолеммап. Фосфолемман обеспечивает связывание комплекса ар-субъединиц с микротрубочками. Показано, что

некоторые члены семейства FXYD способны фосфорилироваться [23], [34], [35]. Например, фосфорилирование фосфолеммана протеинкиназами А и С влияет на его взаимодействие с микротрубочками [36].

2. Механизм гидролиза АТР и транспорта ионов Na,K-ATPa3oft

В начале 60-х годов прошлого века Albers и Post предложили модель, описывающую механизм функционирования фермента (рис. 6) [37], [38]. В этой схеме каталитический цикл фермента представлен последовательным чередованием двух основных конформационных состояний, Е1 и Е2, которые различаются по сродству к переносимым катионам. Помимо этого, каждое конформационное состояние может быть в фосфорилированной и дефосфорилированной по активному центру форме. Наличие переходов Е1-Е2 впервые показал Jorgensen, который использовал для этой цели метод ограниченного протеолиза Ыа,К-АТРазы под действием трипсина [19]. Он обнаружил, что в присутствии ионов Na+ а-субъединица фермента расщепляется трипсином на 2 фрагмента с молекулярными массами 48 и 64 кДа, а в присутствии ионов К+ - на три фрагмента: 30 кДа, 76 кДа и низкомолекулярный N-концевой пептид. Эти данные подтвердили идею о том, что связывание разных катионов индуцирует различные конформационные состояния Ыа,К-АТРазы [19].

Каталитический цикл Na,K-ATPa3bi начинается со связывания с ферментом трех ионов Na с цитоплазматической стороны мембраны. Это конформационное состояние фермента носит название Е1, оно характеризуется высоким сродством к АТР и ионам Na+. После связывания этих ионов происходит перенос терминального фосфорильного остатка АТР на остаток аспарагиновой кислоты

369

активного центра а-субъединицы фермента (Asp ) с образованием ацилфосфатной ковалентной связи. В результате фосфорилирования молекулы образуется интермедиат El-P, a ADP высвобождается из активного центра и возвращается в цитоплазму. Фосфорилированный фермент переходит в такое состояние, когда ионы Na+ не способны высвобождаться ни в цитоплазму, ни во внеклеточное пространство, т.е. они окклюдированы в мембране [22].

Затем Na,K-ATPa3a спонтанно переходит в новое конформационное состояние Е2, которое характеризуется низким сродством к ионам Na+ и высоким - к ионам

К . Этот переход существенно активируется ионами Mg , хотя специфических

2+

центров связывания Mg на молекуле Na,K-ATPa3bi не обнаружено. Предполагается, что за связывание Mg2+ отвечают аминокислотные остатки Asp443 и Asp710 [39]. В результате происходит освобождение трех ионов Na+ с внеклеточной стороны и связывание двух ионов внеклеточного К+. Связывание К+ активирует гидролиз ацилфосфатной связи, вследствие чего освобождается неорганический фосфат. Затем, в свою очередь, происходит окклюзия ионов К+ и их последующее освобождение в цитоплазму. После того как произошла диссоциация ионов К+ от центра связывания, конформер Е2 медленно превращается в конформер Е1. Этот процесс значительно ускоряет АТР, который, связываясь в центре низкого сродства, повышает сродство фермента к Na+ и снижает его сродство к 1С [22], [40]. Благодаря этим последовательно происходящим процессам осуществляется активный транспорт ионов Na+ из клетки и ионов К+ в клетку.

Исходной конформацией фермента можно считать Е1, поскольку обычно около 70% молекул фермента находится в этой конформации в среде, где отсутствуют ионы Na+ и К+ [41]. Кроме того, конформации Е1 и Е2 различаются и по чувствительности к специфическому ингибитору уабаину. Дело в том, что центр связывания молекулы кардиотонического стероида образуется на конформере Е2, при этом с конформацией Е1 он связывается очень плохо. По этой причине уабаин и другие КТС гораздо эффективнее связываются с нефункционирующими молекулами фермента в конформации Е2, связывание с функционирующими молекулами Ыа,К-АТРазы происходит менее эффективно [42].

Внеклеточное пространство EiP ouabain

EiP2Na

2Na

E2P

2K 4

Na

EiP(3Na)

ADP,

♦ E;P2K Pi

E:(2K) J^-ATP

E:ATP(2K)

EiATP3Na

3Na

EiATP

2K

E.ATP2K

Цитоплазма

Рис. 6. Каталитический цикл Na,K-ATPa3bi. Схема Альберса-Поста. El и Е2 — различные конформационпые состояния Na,K-ATPa3bi [15].

3. Катионсвязывающие центры Na,K-ATPa3bi

а-Субъединица Na,K-ATPa3bi имеет высокую степень гомологии с каталитическими субъединицами других представителей АТРаз Р-типа, например, с Са-АТРазой саркоплазматического ретикулума и Н,К-АТРазой слизистой оболочки желудка [43]. Поскольку для Са-АТРазы имеются данные о третичной структуре в различных конформациях, этот факт позволил Ogawa и Toyoshima идентифицировать катион-связывающие центры Na,K-ATPa3bi с помощью метода гомологичного моделирования [44].

В образование центра связывания I для ионов Na+ вовлечены аминокислотные остатки трансмембранных фрагментов М5 (Asn783, Glu786), Мб (Thr814, Asp815) и М8 (Gln9j0). В связывании участвует также одна молекула воды. Центр II формируется остатками фрагментов М4 (Val329, Ala330, Val332, Glu334) и Мб (Asp811, Asp815). В формировании центра связывания III, который образуется после того, как связались два первых иона Na+, принимают участие остатки фрагментов М5 (Туг778) и Мб (Gly8b, Thr814) и М9-цепей (Glu961). Помимо этого здесь также присутствуют две молекулы воды. Этот центр связывания граничит с центром связывания I.

Центр связывания I для ионов К+ имеет сходство с таковым для ионов Na+, в его

формировании также принимает участие одна молекула воды. Остатки,

формирующие данный центр, принадлежат фрагментам М5 (Ser , Glu786), Мб

18

(Asp811, Asp815) и M8 (Gin930). Центр II образован остатками аминокислот,

ЛЛЛ ТТЛ ллл

входящими в состав трансмембранных фрагментов М4 (Val , Ala , Val ) и М5 (Asn783, Glu786). Вполне вероятно также участие одной молекулы воды [44].

4. Регуляция активности Na,K-ATPa3bi

Играя ключевую роль в регуляции внутриклеточных концентраций Na+ и К+, Na,K-ATPa3a участвует тем самым в поддержании мембранного потенциала, объема клетки, сопряженного транспорта Na+ и аминокислот, глюкозы, нуклеотидов и некоторых ионов через плазматическую мембрану. В связи с этим активность этого фермента регулируется с использованием многочисленных механизмов, запускаемых в результате изменений состояния клетки. Наиболее простой способ регуляции — это изменение соотношения Na+/K+ и доступности АТР (так называемый фактор краткосрочной регуляции активности). Обычно в нормальных условиях содержание АТР в клетке мало изменяется, тогда как соотношение Na+/K+ зависит от многих причин и является по существу одним из основных факторов, контролирующих активность Na,K-Hacoca. Кроме того, содержание АТР и ADP в клетке, а также их соотношение может оказывать влияние на регуляцию сигнальных каскадов, запускаемых посредством Na,K-АТРазы. Известно, что Src-киназа и Na,K-ATPa3a организуют так называемую сигналосому [45], [46] путем формирования прямых контактов друг с другом: nejpwfi контакт образован через СБ2-домен Na,K-ATPa3bi и 8Н2-8НЗ-домены Src, второй контакт образован с помощью СБЗ-домена Na,K-Hacoca и SHl-домена протеинкиназы. Последнее взаимодействие осуществляется только в том случае, если Na,K-ATPa3a активна. При ингибировании фермента (КТС или ванадатом) SH1-домен Src освобождается и происходит активация протеинкиназы. Так как гидролитическая активность Na,K-ATPa3bi определяет соотношение ATP/ADP в клетке, то мы можем говорить о непрямой регуляции активации Src через Na,K-АТРазу [47].

Поскольку Na,K-ATPa3a - мембранный белок, то липиды мембраны способны влиять на ее активность. Было показано, что липиды, обеспечивающие формирование бислоя и увеличивающие текучесть мембраны, способствуют оптимальной активности насоса, тогда как свободные жирные кислоты,

присутствующие в мембране, имеют тенденцию ингибировать этот фермент [48], [49], [50].

Известно, что Na,K-ATPa3a взаимодействует с такими компонентами цитоскелета, как спектрин, актин, аддуцин, пасин и анкирин [51], [52], [53], [54], [55], [56]. В связи с этим было высказано предположение, что упомянутые выше белки влияют на функционирование Na,K-Hacoca. Позже эти гипотезы были подтверждены рядом экспериментальных данных. Так, было показано, что мономерный актин активирует Na,K-ATPa3y, а аддуцин увеличивает сродство Ыа,К-насоса к АТР, что также приводит к увеличению активности фермента [48], [57], [58].

Функционирование Na,K-ATPa3bi в клетке подвергается краткосрочной и долгосрочной регуляциям различными гормонами (кортикостероиды, катехоламины, пептидные гормоны). Краткосрочный эффект заключается в прямом воздействии па кинетические параметры фермента, например, за счет такой посттрансляционной модификации, как фосфорилирование, либо на транслокацию Na,K-Hacoca между плазматической мембраной и цитоплазмой, где предварительно синтезированный фермент находится в составе небольших везикул. Долгосрочная регуляция затрагивает процессы синтеза и деградации Na,K-ATPa3bi [48]. В частности, синтез Na,K-ATPa3bi в эпителии почек активируется под действием альдостерона [59], [60], [61], [62], [63].

В клетке Na,K-ATPa3a подвергается фосфорилированию рядом гормон-активируемых протеинкиназ. Установлено, что РКА, РКС и PKG могут фосфорилировать остатки серина. Помимо того, тирозин в составе Na,K-ATPa3bi тоже может находиться в фосфорилированном состоянии. В случае РКА участком фосфорилирования является Ser943 (здесь и далее нумерация аминокислотных остатков приводится с учетом пяти посттрансляционно отщепляющихся N-концевых остатков для al-субъединицы для почек крысы), а в случае РКС - Ser23. Для тирозиновых киназ мишенью является остаток Туг10. Кроме того, было показано, что помимо протеинкиназ с Na,K-nacocoM взаимодействуют и некоторые фосфатазы, причем регуляция активности путем фосфорилирования-дефосфорилирования носит антагонистический характер [48], [64], [65], [66], [67], [68], [69], [70], [71].

Кроме вышеописанных механизмов регуляции активности Na.K-АТРазы существует еще как минимум один, изучение которого в последние несколько лет является весьма актуальной проблемой. Этим механизмом является глутатионилирование цистеиновых остатков белка, приводящее к ингибированию ферментативной активности Na-nacoca, что позволяет экономить запасы АТР в клетке в условиях окислительного стресса. Глутатион - основной клеточный антиоксидант, который может обратимо связываться с молекулой белка с образованием смешанных дисульфидов (P-S-S-G), тем самым регулируя функции этого белка [72]. В настоящее время описано глутатионилирование а-субъединицы [73], [74], pi-субъединицы Na,K-ATPa3bi [75], [76] и регуляторного белка фосфолеммана [77], [78]. Показано, что связывание глутатиона с остатками Cys244, Cys454, Cys458 и Cys459 приводит к полной потере АТР-азной активности [73], поскольку связывание глутатиона с этими остатками цистеина стерически препятствует связыванию АТР в активном центре. После устранения окислительного стресса глутатион освобождается от этих остатков за счет разрыва S-S-связи между глутатионом и ферментом с участием глутатионредуктазы и глутаредоксина, вследствие чего активность фермента восстанавливается. Кроме того, существуют данные о том, что восстановленный глутатион защищает клетки от цитотоксического эффекта уабаина, в основе которого лежит, предположительно, увеличение фосфорилирования тирозиновых остатков и экспрессии генов Ras [79].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Климанова, Елизавета Андреевна, 2015 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Morth J.P. et al. The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.- 2009.-Vol. 364(1514).- P. 217-227.

2. Szent-Gyorgyi A. Chemical physiology of contraction in body and heart muscle. Academic Press. - 1953. - P. 1893-1986

3. Gruber K.A., Whitaker J.M., Buckalew V.M. Endogenous digitalis-like substance in plasma of volume-expanded dogs. // Nature. - 1980. - Vol. 287(5784). - P. 743-745.

4. Hamlyn J.M. et al. A circulating inhibitor of Na,K-ATPase associated with essential hypertension. // Nature. - 1982. - Vol. 300(5893). - P. 650-652.

5. Goto A., Yamada K. Purification of endogenous digitalis-like factors from normal human urine. // Clin. Exp. Hypertens. - 1998. - Vol. 20(5-6). - P. 551-556.

6. Schoner W. Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones. // Eur. J. Biochem. - 2002. - Vol. 269(10). - P. 2440-2448.

7. Hamlyn J.M. et al. Observations on the nature, biosynthesis, secretion and significance of endogenous ouabain. // Clin. Exp. Hypertens. - 1998. - Vol. 20(5-6). - P. 523-533.

8. Schatzmann H.J. Cardiac glycosides as inhibitors of active potassium and sodium transport by erythrocyte membrane. // Helv. Physiol. Pharmacol. Acta. - 1953. -Vol. 11 (4).-P. 346-354.

9. Skou J.C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. // Biochim. Biophys. Acta. - 1957. - Vol. 23(2). - P. 394^01.

10. Scheiner-Bobis G. The Na,K-ATPase: more than just a sodium pump. // Cardiovasc. Res. -2011.-Vol. 89(1).-P. 6-8.

11. Zhang S. et al. Distinct role of the N-terminal tail of the Na,K-ATPase catalytic subunit as a signal transducer. // J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281(31). - P. 2195421962.

12. Liang M. et al. Functional characterization of Src-interacting Na/K-ATPase using RNA interference assay. // J. Biol. Chem. - 2006. - Vol. 281(28). - P. 1970919719.

13. Mironova G.D. et al. Ion-transporting properties and ATPase activity of (Na,K-ATPase large subunit incorporated into bilayer lipid membranes. // Biochim. Biophys. Acta. - 1986. - Vol. 861(2). - P. 224-236.

14. Lingrel J.B., Kuntzweiler T. Na,K-ATPase // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269(31).-P. 19659-19662.

15. Kaplan J.H. Biochemistry of Na,K-ATPase. // Annu. Rev. Biochem. - 2002. - Vol. 71.-P. 511-535.

16. Karlish S.J. Organization of the membrane domain of the Na/K-pump. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1997. - Vol. 834. - P. 30-44.

17. Mobasheri A. et al. Na,K-ATPase isozyme diversity; comparative biochemistry and physiological implications of novel functional interactions. // Biosci. Rep. 2000. - Vol. 20(2). - P. 51-91.

18. Zampar G.G. et al. Acetylated tubulin associates with the fifth cytoplasmic domain of Na,K-ATPase: possible anchorage site of microtubules to the plasma membrane. // Biochem. J. - 2009. - Vol. 422(1). - P. 129-137.

19. Jorgensen P.L. Transmission of E1-E2 structural changes in response to Na+ or K+ binding in Na,K-ATPase. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2003. - Vol. 986. - P. 22-30.

20. Yoon K.L., Guidotti G. Studies on the membrane topology of the Na,K-ATPase. // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269(45). - P. 28249-28258.

21. Blanco G., Mercer R.W. Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function. // Am. J. Physiol. - 1998. - Vol. 275(5 Pt. 2). - P. F633-F650.

22. Lopina O.D. Na,K-ATPase: structure, mechanism, and regulation. // Membr. Cell Biol. - 2000. - Vol. 13(6). - P. 721-744.

23. Geering K. Functional roles of Na,K-ATPase subunits. // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. - 2008. - Vol. 17(5). - P. 526-532.

24. Woo A.L., James P.F., Lingrel J.B. Characterization of the fourth alpha isoform of the Na,K-ATPase. // J. Membr. Biol. - 1999. - Vol. 169(1). - P. 39-44.

25. Woo A.L., James P.F., Lingrel J.B. Roles of the Na,K-ATPase alpha4 isoform and the Na,H-exchanger in sperm motility. // Mol. Reprod. Dev. - 2002. - Vol. 62(3). -P. 348-356.

26. Lingrel J. et al. Functional roles of the alpha isoforms of the Na,K-ATPase. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2003. - Vol. 986. - P. 354-359.

27. Forbush B., Kaplan J.H., Hoffman J.F. Characterization of a new photoaffmity derivative of ouabain: labeling of the large polypeptide and of a proteolipid component of the Na, K-ATPase. // Biochemistry. - 1978. - Vol. 17(17). - P. 3667-3676.

28. Arystarkhova E. et al. The gamma subunit modulates Na+ and K+ affinity of the renal Na,K-ATPase. // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274(47). - P. 33183-33185.

29. Geering K. FXYD proteins: new regulators of Na-K-ATPase. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. - 2006. - Vol. 290(2). - P. F241-F250.

30. Franzin C.M. et al. Structures of the FXYD regulatory proteins in lipid micelles and membranes. // J. Bioenerg. Biomembr. - 2007. - Vol. 39(5-6). - P. 379-383.

31. Sweadner K.J., Rael E. The FXYD gene family of small ion transport regulators or channels: cDNA sequence, protein signature sequence, and expression. // Genomics. - 2000. - Vol. 68(1). - P. 41-56.

32. Mercer R. W. et al. Molecular cloning and immunological characterization of the gamma polypeptide, a small protein associated with the Na,K-ATPase. // J. Cell Biol. - 1993. - Vol. 121(3). -P. 579-586.

33. Teriete P. et al. Structure of the Na,K-ATPase regulatory protein FXYD1 in micelles. // Biochemistry. - 2007. - Vol. 46(23). - P. 6774-6783.

34. Geering K. et al. FXYD proteins: new tissue- and isoform-specific regulators of Na,K-ATPase. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2003. - Vol. 986. - P. 388-394.

35. Crambert G., Geering K. FXYD proteins: new tissue-specific regulators of the ubiquitous Na,K-ATPase. // Sci. STKE. - 2003. - Vol. 2003(166). - P. RE1.

36. Bibert S. et al. Phosphorylation of phospholemman (FXYD1) by protein kinases A and С modulates distinct Na,K-ATPase isozymes. // J. Biol. Chem. - 2008. - Vol. 283(1).- P. 476-486.

37. Albers R.W. Biochemical aspects of active transport. // Annu. Rev. Biochem. -1967. - Vol. 36. - P. 727-756.

38. Post R.L. et al. Flexibility of an active center in sodium-plus-potassium adenosine triphosphatase. // J. Gen. Physiol. - 1969. - Vol. 54(1). - P. 306-326.

39. Patchornik G. et al. The ATP-Mg -binding site and cytoplasmic domain interactions of Na+,K+-ATPase investigated with Fe2+-catalyzed oxidative cleavage and molecular modeling. // Biochemistry. - 2002. - Vol. 41(39). - P. 11740-11749.

40. Jorgensen P.L. Purification and characterization of Na,K-ATPase. VI. Differential tryptic modification of catalytic functions of the purified enzyme in presence of NaCl and KC1. // Biochim. Biophys. Acta. - 1977. - Vol. 466(1). - P. 97-108.

41. Болдырев A.A. Роль Na/K-Hacoca в возбудимых тканях (обзор).// Сибирский федеральный университет. -2008. - С. 206-225.

42. Болдырев АЛ. №,К-АТФаза - свойства и биологическая роль // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - С. 2—9.

43. Apell H.-J. Structure-function relationship in P-type ATPases - a biophysical approach. // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. -2003. - Vol. 150. - P. 1-35.

44. Ogawa H., Toyoshima C. Homology modeling of the cation binding sites of Na,K-ATPase. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2002. - Vol. 99(25). - P. 1597715982.

45. Haas M., Askari A., Xie Z. Involvement of Src and epidermal growth factor receptor in the signal-transducing function of Na+/K+-ATPase. // J. Biol. Chem. -2000. - Vol. 275(36). - P. 27832-27837.

46. Tian J. et al. Binding of Src to Na,K-ATPase forms a functional signaling complex. // Mol. Biol. Cell. - 2006. - Vol. 17(1). - P. 317-326.

47. Weigand K.M. et al. Na,K-ATPase activity modulates Src activation: a role for ATP/ADP ratio. // Biochim. Biophys. Acta. - 2012. - Vol. 1818(5). - P. 12691273.

48. Therien A.G., Blostein R. Mechanisms of sodium pump regulation. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2000. - Vol. 279(3). - P. C541-C566.

49. Mahmmoud Y. a, Christensen S.B. Oleic and linoleic acids are active principles in Nigella sativa and stabilize an E(2)P conformation of the Na,K-ATPase. Fatty acids differentially regulate cardiac glycoside interaction with the pump. // Biochim. Biophys. Acta.-2011.-Vol. 1808(10).-P. 2413-2420.

50. Howie J. et al. Regulation of the cardiac Na+-pump by palmitoylation of its catalytic and regulatory subunits. // Biochem. Soc. Trans. - 2013. - Vol. 41(1). - P. 95-100.

51. Kashgarian M. et al. Na,K-ATPase co-distributes with ankyrin and spectrin in renal tubular epithelial cells. // Prog. Clin. Biol. Res. - 1988. - Vol. 268B. - P. 245-250.

52. Nelson W.J., Hammerton R.W. A membrane-cytoskeletal complex containing Na,K-ATPase, ankyrin, and fodrin in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells: implications for the biogenesis of epithelial cell polarity. // J. Cell Biol. - 1989. -Vol.-108(3).-P. 893-902.

53. Koob R. et al. Association of kidney and parotid Na,K-ATPase microsomes with actin and analogs of spectrin and ankyrin. // Eur. J. Cell Biol. - 1990. - Vol. 53(1). -P. 93-100.

54. Nelson W.J., Hammerton R.W., McNeill H. Role of the membrane-cytoskeleton in the spatial organization of the Na,K-ATPase in polarized epithelial cells. // Soc. Gen. Physiol. Ser. - 1991. - Vol. 46. - P. 77-87.

55. Palier M.S. Lateral mobility of Na,K-ATPase and membrane lipids in renal cells. Importance of cytoskeletal integrity. // J. Membr. Biol. - 1994. - Vol. 142(1). - P. 127-135.

56. Piepenhagen P.A. et al. Differential expression of Na,K-ATPase, ankyrin, fodrin, and E-cadherin along the kidney nephron. // Am. J. Physiol. - 1995. - Vol. 269(6 Pt 1).-P. C1417-C1432.

57. Ferrandi M. et al. Evidence for an interaction between adducin and Na(+)-K(+)-ATPase: relation to genetic hypertension. // Am. J. Physiol. - 1999. - Vol. 277(4 Pt 2). - P. H1338-H1349.

58. Torielli L. et al. alpha-Adducin mutations increase Na/K pump activity in renal cells by affecting constitutive endocytosis: implications for tubular Na reabsorption. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. - 2008. - Vol. 295(2). - P. F478-F487.

59. Jorgensen P.L. The role of aldosterone in the regulation of (Na,K-ATPase in rat kidney. //J. Steroid Biochem. - 1972. - Vol. 3(2). - P. 181-191.

60. Verrey F. et al. Regulation by aldosterone of Na+,K+-ATPase mRNAs, protein synthesis, and sodium transport in cultured kidney cells. // J. Cell Biol. - 1987. -Vol. 104(5).-P. 1231-1237.

61. Seok J.H. et al. Aldosterone directly induces Na, K-ATPase alpha 1-subunit mRNA in the renal cortex of rat. // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1999. - Vol. 47(2). -P. 251-254.

62. Musch M. W., Lucioni A., Chang E.B. Aldosterone regulation of intestinal Na absorption involves SGK-mediated changes in NHE3 and Na+-pump activity. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. - 2008. - Vol. 295(5). - P. G909-G919.

63. Salyer S.A. et al. Aldosterone regulates Na, K-ATPase activity in human renal proximal tubule cells through mineralocorticoid receptor. // Biochim. Biophys. Acta.-2013.-Vol. 1833(10).-P. 2143-2152.

64. Chibalin A. V et al. Phosphorylation of Na,K-ATPase alpha-subunits in microsomes and in homogenates of Xenopus oocytes resulting from the stimulation of protein kinase A and protein kinase C. // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol. 267(31). -P. 22378-22384.

65. Béguin P. et al. Phosphorylation of the Na,K-ATPase alpha-subunit by protein kinase A and C in vitro and in intact cells. Identification of a novel motif for PKC-mediated phosphorylation. // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269(39). - P. 2443724445.

66. Blanco G., Mercer R.W. Regulation of the alpha 2 beta 1 and alpha 3 beta 1 isozymes of the Na,K-ATPase by Ca2+, PKA, and PKC. // Ann. N. Y. Acad. Sci. -

1997. - Vol. 834. - P. 572-575.

67. Cheng X.J. et al. Regulation of rat Na,K-ATPase activity by PKC is modulated by state of phosphorylation of Ser-943 by PKA. // Am. J. Physiol. - 1997. - Vol. 273(6 Pt 1). -P. C1981-C1986.

68. Blanco G., Sánchez G., Mercer R.W. Differential regulation of Na,K-ATPase isozymes by protein kinases and arachidonic acid. // Arch. Biochem. Biophys. -

1998. - Vol. 359(2). - P. 139-150.

69. Mahmmoud Y.A., Vorum H., Cornelius F. Identification of a phospholemman-like protein from shark rectal glands. Evidence for indirect regulation of Na,K-ATPase by protein kinase c via a novel member of the FXYDY family. // J. Biol. Chem. -2000. - Vol. 275(46). - P. 35969-35977.

70. Layne J., Yip S., Crook R.B. Down-regulation of Na-K-Cl cotransport by protein kinase C is mediated by protein phosphatase 1 in pigmented ciliary epithelial cells. // Exp. Eye Res. - 2001. - Vol. 72(4). - P. 371-379.

71. Gomes P., Soares-da-Silva P. Role of cAMP-PKA-PLC signaling cascade on dopamine-induced PKC-mediated inhibition of renal Na,K-ATPase activity. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. - 2002. - Vol. 282(6). - P. F1084-F1096.

72. Cai Z., Yan L. Protein Oxidative Modifications: Beneficial Roles in Disease and Health. // J. Biochem. Pharmacol. Res. Biochem. Pharmacol. Res. - 2013. - Vol. 1(1).-P. 15-26.

73. Petrushanko I.Y. et al. S-glutathionylation of the Na,K-ATPase catalytic a subunit is a determinant of the enzyme redox sensitivity. // J. Biol. Chem. - 2012. - Vol. 287(38). - P. 32195-32205.

74. Xianyu M. et al. Glutathionylation of the alpha-subunit of Na,K-ATPase from rat heart by oxidized glutathione inhibits the enzyme. // Biochem. Biokhimiia. - 2014. -Vol. 79(2).-P. 158-164.

75. Figtree G. a et al. Reversible oxidative modification: a key mechanism of Na,K-pump regulation. // Circ. Res. - 2009. - Vol. 105(2). - P. 185-193.

76. Liu C.-C. et al. Susceptibility of pi Na,K-pump subunit to glutathionylation and oxidative inhibition depends on conformational state of pump. // J. Biol. Chem. -

2012. - Vol. 287(15). - P. 12353-12364.

77. Fuller W. et al. Regulation of the cardiac sodium pump. // Cell. Mol. Life Sci. -

2013.-Vol. 70(8).-P. 1357-1380.

78. Dey K. et al. Role of phospholemman and the 70 kDa inhibitor protein in regulating Na,K-ATPase activity in pulmonary artery smooth muscle cells under U46619 stimulation. // FEBS Lett. -2013. - Vol. 587(21). -P. 3535-3540.

79. Valente R.C. et al. Mechanisms of ouabain toxicity. // FASEB J. - 2003. - Vol. 17(12).-P. 1700-1702.

80. Laughery M., Todd M., Kaplan J.H. Oligomerization of the Na,K-ATPase in cell membranes. // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279(35). - P. 36339-36348.

81. Blanco G., Koster J.C., Mercer R. W. The alpha subunit of the Na,K-ATPase specifically and stably associates into oligomers. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1994. - Vol. 91(18). - P. 8542-8546.

82. Vilsen B. et al. Occlusion of 22Na+ and 86Rb+ in membrane-bound and soluble protomeric alpha beta-units of Na,K-ATPase. // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262(22).-P. 10511-10517.

83. Jorgensen P.L. Purification and characterization of Na, K-ATPase. V. Conformational changes in the enzyme Transitions between the Na-form and the K-form studied with tryptic digestion as a tool. // Biochim. Biophys. Acta. - 1975. -Vol. 401(3).-P. 399-415.

84. Jorgensen P.L., Collins J.H. Tryptic and chymotryptic cleavage sites in sequence of alpha-subunit of Na,K-ATPase from outer medulla of mammalian kidney. // Biochim. Biophys. Acta. - 1986. - Vol. 860(3). - P. 570-576.

85. Karlish S.J., Yates D.W. Tryptophan fluorescence of Na,K-ATPase as a tool for study of the enzyme mechanism. // Biochim. Biophys. Acta. - 1978. - Vol. 527(1). -P. 115-130.

86. Karlish S J. Characterization of conformational changes in Na,K-ATPase labeled with fluorescein at the active site. // J. Bioenerg. Biomembr. - 1980. - Vol. 12(3-4). -P. 111-136.

87. Kapakos J.G., Steinberg M. Ligand binding to Na,K-ATPase labeled with 5-iodoacetamidofluorescein. // J. Biol. Chem. - 1986. - Vol. 261(5). - P. 2084-2089.

88. Taniguchi K. et al. ATP dependent reversible conformational change of Na+,K+-ATPase modified with N-(p-(2-benzimidazoly)phenyl)maleimide. // J. Biochem. -1980. - Vol. 88(2). - P. 609-612.

89. Taniguchi K., Suzuki K., Iida S. Stopped flow measurement of conformational change induced by phosphorylation in Na,K-ATPase modified with N-[p-(2-benzimidazolyl)phenyl]maleimide. // J. Biol. Chem. - 1983. - Vol. 258(11). - P. 6927-6931.

Taniguchi K. et al. Conformational change accompanying formation of oligomycin-induced Na+-bound forms and their conversion to ADP-sensitive

phosphoenzymes in Na,K-ATPase. // J. Biochem. - 1991. - Vol. 109(2). - P. 299306.

91. Harris W.E., Stahl W.L. Conformational changes of purified Na,K-ATPase detected by a sulfhydryl fluorescence probe. // Biochim. Biophys. Acta. - 1977. -Vol. 485(1).-P. 203-214.

92. Robinson J.D., Pratap P.R. Indicators of conformational changes in the Na,K-ATPase and their interpretation. // Biochim. Biophys. Acta. - 1993. - Vol. 1154(1). -P. 83-104.

93. Skou J.C., Esmann M. Effects of ATP and protons on the Na: K selectivity of the Na,K-ATPase studied by ligand effects on intrinsic and extrinsic fluorescence. // Biochim. Biophys. Acta. - 1980. - Vol. 601(2). - P. 386-402.

94. Pratap P.R., Robinson J.D., Steinberg M.I. The reaction sequence of the Na,K-ATPase: rapid kinetic measurements distinguish between alternative schemes. // Biochim. Biophys. Acta. - 1991. - Vol. 1069(2). - P. 288-298.

95. Akera T. Membrane adenosinetriphosphatase: a digitalis receptor? // Science. -1977.-Vol. 198(4317).-P. 569-574.

96. Newman R.A. et al. Cardiac glycosides as novel cancer therapeutic agents. // Mol. Interv. - 2008. - Vol. 8(1). - P. 36^19.

97. Bagrov A.Y., Shapiro J.I., Fedorova O. V. Endogenous cardiotonic steroids: physiology, pharmacology, and novel therapeutic targets. // Pharmacol. Rev. -2009. - Vol. 61(1). - P. 9-38.

98. Nesher M. et al. The digitalis-like steroid hormones: new mechanisms of action and biological significance. // Life Sci. - 2007. - Vol. 80(23). - P. 2093-2107.

99. Mijatovic T. et al. Cardiotonic steroids on the road to anti-cancer therapy. // Biochim. Biophys. Acta. - 2007. - Vol. 1776(1). - P. 32-57.

100. Larre I., Cereijido M. Na,K-ATPase is the putative membrane receptor of hormone ouabain. // Commun. Integr. Biol. - 2010. - Vol. 3(6). - P. 625-628.

101. Schoner W., Scheiner-Bobis G. Endogenous and Exogenous Cardiac Glycosides and their Mechanisms of Action // Am. J. Cardiovasc. Drugs. - 2007. - Vol. 7(3). -P.173-189.

102. Schoner W., Scheiner-Bobis G. Role of endogenous cardiotonic steroids in sodium homeostasis. // Nephrol. Dial. Transplant. - 2008. - Vol. 23(9). - P. 2723-2729.

103. Chen Y. et al. Regulation of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptor-mediated Calcium Release by the Na,K-ATPase in Cultured Renal Epithelial Cells // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 283(2). - P. 1128-1136.

104. Lingrel J.B. The physiological significance of the cardiotonic steroid/ouabain-binding site of the Na,K-ATPase // Annu. Rev. Physiol. - 2011. - Vol. 72. - P. 395-412.

105. Liu J., Xie Z.-J. The sodium pump and cardiotonic steroids-induced signal transduction protein kinases and calcium-signaling microdomain in regulation of transporter trafficking. // Biochim. Biophys. Acta. - 2010. - Vol. 1802(12). - P. 1237-1245.

106. Munzer J.S. et al. Tissue- and isoform-specific kinetic behavior of the Na,K-ATPase. // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269(24). - P. 16668-16676.

107. Marks M.J., Seeds N.W. A heterogeneous ouabain-ATPase interaction in mouse brain. // Life Sci. - 1978. - Vol. 23(27-28). - P. 2735-2744.

108. Matsui H., Schwartz A. Mechanism of cardiac glycoside inhibition of the (Na+-K+)-dependent ATPase from cardiac tissue. // Biochim. Biophys. Acta. - 1968. -Vol. 151(3).-P. 655-663.

109. Ogawa H. et al. Crystal structure of the sodium-potassium pump (Na,K-ATPase) with bound potassium and ouabain. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2009. - Vol. 106(33).-P. 13742-13747.

110. Price E.M., Lingrel J.B. Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme. // Biochemistry. - 1988. -Vol. 27(22). - P. 8400-8408.

111. Qiu L.Y. et al. Phe783, Thr797, and Asp804 in transmembrane hairpin M5-M6 of Na+,K+-ATPase play a key role in ouabain binding. // J. Biol. Chem. - 2003. -Vol. 278(47). - P. 47240^7244.

112. Yoda A. Association and dissociation rate constants of the complexes between various cardiac monoglycosides and Na, K-ATPase. // Ann. N. Y. Acad. Sci. -1974. - Vol. 242. - P. 598-616.

113. Cornelius F., Mahmmoud Y. a. Interaction between cardiotonic steroids and Na,K-ATPase. Effects of pH and ouabain-induced changes in enzyme conformation. // Biochemistry. - 2009. - Vol. 48(42). - P. 10056-10065.

114. Yoda A., Yoda S. Influence of pH on the interaction of cardiotonic steroids with sodium- and potasssium-dependent adenosine triphosphatase. // Mol. Pharmacol. -1978. - Vol. 14(4). - P. 624-632.

115. Paula S., Tabet M.R., Ball W.J. Interactions between cardiac glycosides and sodium/potassium-ATPase: three-dimensional structure-activity relationship models for ligand binding to the E2-Pi form of the enzyme versus activity inhibition. // Biochemistry. - 2005. - Vol. 44(2). - P. 498-510.

116. Askari A., Kakar S.S., Huang W.H. Ligand binding sites of the ouabain-complexed Na,K-ATPase. 11 J. Biol. Chem. - 1988. - Vol. 263(1). - P. 235-242.

117. Yatime L. et al. P-type ATPases as drug targets: tools for medicine and science. // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. - Vol. 1787(4). - P. 207-220.

118. Yatime L. et al. Structural insights into the high affinity binding of cardiotonic steroids to the Na,K-ATPase. 11 J. Struct. Biol. Elsevier Inc. - 2011. - Vol. 174(2). -P. 296-306.

119. Perrin A. et al. Bovine adrenocortical cells in culture synthesize an ouabain-like compound. // Mol. Cell. Endocrinol. - 1997. - Vol. 126(1). - P. 7-15.

120. Lichtstein D. et al. Biosynthesis of digitalis-like compounds in rat adrenal cells: hydroxycholesterol as possible precursor. // Life Sci. - 1998. - Vol. 62(23). - P. 2109-2126.

121. Qazzaz H.M.A.M. et al. De novo biosynthesis and radiolabeling of mammalian digitalis-like factors. 11 Clin. Chem. - 2004. - Vol. 50(3). - P. 612-620.

122. El-Masri M.A. et al. Human adrenal cells in culture produce both ouabain-like and dihydroouabain-1 ike factors. // Clin. Chem. - 2002. - Vol. 48(10). - P. 1720-1730.

123. Dmitrieva R.I. et al. Mammalian bufadienolide is synthesized from cholesterol in the adrenal cortex by a pathway that Is independent of cholesterol side-chain cleavage. // Hypertension. - 2000. - Vol. 36(3). - P. 442^48.

124. Braunwald E., Klocke M.D., Klocke F.J. Digitalis // Annu. Rev. Med. - 1965. -Vol. 16.-P. 371-386.

125. Akera T., Brody T.M. The role of Na,K-ATPase in the inotropic action of digitalis. // Pharmacol. Rev. - 1977. - Vol. 29(3). - P. 187-220.

126. Barry W.H., Hasin Y., Smith T.W. Sodium pump inhibition, enhanced calcium influx via sodium-calcium exchange, and positive inotropic response in cultured heart cells. 11 Circ. Res. - 1985. - Vol. 56(2).-P. 231-241.

127. Dvela M. et al. Diverse biological responses to different cardiotonic steroids. // Pathophysiology. - 2007. - Vol. 14(3-4). - P. 159-166.

128. Schoner W., Scheiner-Bobis G. Endogenous and exogenous cardiac glycosides: their roles in hypertension, salt metabolism, and cell growth. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2007. - Vol. 293(2). - P. C509-C536.

129. Wansapura A.N. et al. Marinobufagenin enhances cardiac contractility in mice with ouabain-sensitive alpha 1 Na,K-ATPase. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. -2009. - Vol. 296(6). - P. H1833-H1839.

130. Thomas S.M., Brugge J.S. Cellular functions regulated by Src family kinases. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. - 1997. - Vol. 13. - P. 513-609.

131. Cordero J.B. et al. c-Src drives intestinal regeneration and transformation. //EMBO j. _ 2014.-Vol. 33(13).-P. 1474-1491.

132. Liu J. et al. Ouabain interaction with cardiac Na,K-ATPase initiates signal cascades independent of changes in intracellular Na+ and Ca2+ concentrations. // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275(36). - P. 27838-27844.

133. Xie Z. Ouabain interaction with cardiac Na,K-ATPase reveals that the enzyme can act as a pump and as a signal transducer. // Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand). -2001. - Vol. 47(2). - P. 383-390.

134. Haas M. et al. Src-mediated inter-receptor cross-talk between the Na,K-ATPase and the epidermal growth factor receptor relays the signal from ouabain to mitogen-activated protein kinases. // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277(21). - P. 18694-18702.

135. Gable M.E. et al. Digitalis-induced cell signaling by the sodium pump: on the relation of Src to Na,K-ATPase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. Elsevier Inc. -2014.-Vol. 446(4).-P. 1151-1154.

136. Orlov S.N. et al. Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3. // J. Biol. Chem. - 1999. -Vol. 274(23). - P. 16545-16552.

137. Orlov S., Akimova O., Hamet P. Cardiotonic Steroids: Novel Mechanisms of Na+ i-Mediated and - Independent Signaling Involved in the Regulation of Gene Expression, Proliferation and Cell Death // Curr. Hypertens. Rev. Bentham Science Publishers. - 2005. - Vol. 1(3). - P. 243-257.

138. Pchejetski D. et al. Inhibition of Na,K-ATPase by ouabain triggers epithelial cell death independently of inversion of the [NaVtK^i ratio. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2003.-Vol. 301(3).-P. 735-744.

139. Akimova O. a et al. Cardiotonic steroids differentially affect intracellular Na+ and [Na+],/[K+]1-independent signaling in C7-MDCK cells. // J. Biol. Chem. - 2005. -Vol. 280(1).-P. 832-839.

140. Akimova O. a et al. Death of ouabain-treated renal epithelial cells: evidence for p38 MAPK-mediated Na^/K^-independent signaling. // Apoptosis. - 2009. - Vol. 14(11).- P. 1266-1273.

141. Akimova O. a. et al. Investigation of mechanism of p38 MAPK activation in renal epithelial cell from distal tubules triggered by cardiotonic steroids // Biochem. -2010. - Vol. 75(8). - P. 971-978.

142. LaMarca H.L. et al. Marinobufagenin impairs first trimester cytotrophoblast differentiation. // Placenta. - 2006. - Vol. 27(9-10). - P. 984-988.

143. Uddin M.N. et al. Marinobufagenin inhibits proliferation and migration of cytotrophoblast and CHO cells. // Placenta. - 2008. - Vol. 29(3). - P. 266-273.

144. Uddin M.N. et al. Marinobufagenin causes endothelial cell monolayer hyperpermeability by altering apoptotic signaling. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2009. - Vol. 296(6). - P. R1726-R1734.

145. Hopkins B.E., Wagner H., smith T.W. Sodium- and potassium-activated adenosine triphosphatase of the nasal salt gland of the duck (Anas platyrhynchos). Purification, characterization, and NH2-terminal amino acid sequence of the phosphorylating polypeptide. // J. Biol. Chem. - 1976. - Vol. 251(14). - P. 43654371.

146. Groubman M.A. et al. Neutral endopeptidase neprilysin is copurified with Na,K-ATPase from rabbit outer medulla and hydrolyzes its a-subunit. // Biochem. Biokhimiia. - 2010. - Vol. 75(10). - P. 1281-1284.

147. Lowry O.H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.-1951.-Vol. 193.-P. 265-275.

148. Rathbun W.B., Betlach M. V. Estimation of enzymically produced orthophosphate in the presence of cysteine and adenosine triphosphate. // Anal. Biochem. - 1969. -Vol. 28(1).-P. 436-445.

149. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. - 1970. - Vol. 227(5259). - P. 680-685.

150. Andersen J.P. et al. Localization of E1-E2 conformational transitions of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase by tryptic cleavage and hydrophobic labeling. // J. Membr. Biol. - 1986. - Vol. 93(1). - P. 85-92.

151. Carilli C.T. et al. The active site structure of Na+- and K+-stimulated ATPase. Location of a specific fluorescein isothiocyanate reactive site. // J. Biol. Chem. -1982. - Vol. 257. - P. 5601-5606.

152. Tyson P.A. et al. Identification of the 5-iodoacetamidofluorescein reporter site on the Na,K-ATPase. // J. Biol. Chem. - 1989. - Vol. 264(2). - P. 726-734.

153. Kapakos J.G., Steinberg M. Fluorescent labeling of Na,K-ATPase by 5-iodoacetamidofluorescein. // Biochim. Biophys. Acta. - 1982. - Vol. 693(2). - P. 493-496.

154. Ladbury J.E., Doyle M.L. Biocalorimetry 2: Applications of Calorimetry in the Biological Sciences. -Wiley, 2005.-276 pp.

155. Mitkevich V.A. et al. Termination of translation in eukaryotes is mediated by the quaternary eRFl*eRF3*GTP*Mg2+ complex. The biological roles of eRF3 and prokaryotic RF3 are profoundly distinct. // Nucleic Acids Res. - 2006. - Vol. 34(14).-P. 3947-3954.

156. Leavitt S., Freire E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry // Curr. Opin. Struct. Biol. -2001. - Vol. 11(5). -P.560-566.

157. Jorgensen P.L., Skou J.C. Purification and characterisation of Na,K-ATPase I. The influence of detergents on the activity of Na,K-ATPase in preparations from the outer medulla of rabbit kidney // Biochim. Biophys. Acta. - 1971. - Vol. 233(1971).- P. 366-380.

158. Yakushev S.S. et al. Effect of colchicine on sensitivity of duck salt gland Na,K-ATPase to Na+ // Biochem. - 2008. - Vol. 73(9). - P. 990-994.

159. Steinberg M., Karlish S.J. Studies on conformational changes in Na,K-ATPase labeled with 5-iodoacetamidofluorescein. // J. Biol. Chem. - 1989. - Vol. 264(5). -P. 2726-2734.

160. Grell E., Schick E., Lewitzki E. Membrane receptor calorimetry: cardiac glycoside interaction with Na,K-ATPase // Thermochim. Acta. - 2001. - Vol. 380(2). - P. 245-254.

161. Laursen M. et al. Crystal structure of the high-affinity Na,K-ATPase-ouabain complex with Mg2+ bound in the cation binding site. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.-2013.-Vol. 110(27).-P. 10958-10963.

162. Reinhard L. et al. Na,K-ATPase as a docking station: protein-protein complexes of the Na,K-ATPase. // Cell. Mol. Life Sci. - 2013. - Vol. 70(2). - P. 205-222.

163. Lauf P.K. et al. Interaction between Na,K-ATPase and Bcl-2 Proteins BclXL and BAK. //Am. J. Physiol. Cell Physiol. -2014. Vol. 308(1). - P. C51-C60.

164. Lauf P.K. et al. Canonical Bcl-2 motifs of the Na,K-pump revealed by the BH3 mimetic chelerythrine: early signal transducers of apoptosis? // Cell. Physiol. Biochem. - 2013. - Vol. 31(2-3). - P. 257-276.

165. Morrill G. a, Kostellow A.B., Askari A. Caveolin-Na,K-ATPase interactions: role of transmembrane topology in non-genomic steroid signal transduction. // Steroids. - 2012. - Vol. 77(11).-P. 1160-1168.

166. Li Z., Xie Z. The Na,K-ATPase/Src complex and cardiotonic steroid-activated protein kinase cascades. // Pflugers Arch. - 2009. - Vol. 457(3). - P. 635-644.

167. Jorgensen P.L., Hakansson K.O., Karlish S.J.D. Structure and mechanism of Na,K-ATPase: functional sites and their interactions. // Annu. Rev. Physiol. Annual Reviews. - 2003. - Vol. 65. - P. 817-849.

168. Humphrey P. A. et al. Mechanism of the rate-determining step of the Na(+),K(+)-ATPase pump cycle. // Biochemistry. - 2002. - Vol. 41(30). - P. 9496-9507.

169. Forbush B. Rapid release of 42K and 86Rb from an occluded state of the Na,K-pump in the presence of ATP or ADP. // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262(23). - P. 11104-11115.

170. Grell E. et al. Nucleotide/Protein Interaction: Energetic and Structural Features of Na, K-ATPase // J. Therm. Anal. Calorim. - 2004. - Vol. 77(2). - P. 471^181.

171. Fedosova N.U., Champeil P., Esmann M. Rapid filtration analysis of nucleotide binding to Na,K-ATPase. // Biochemistry. - 2003. - Vol. 42(12). - P. 3536-3543.

172. Xu K.Y., Zweier J.L., Becker L.C. Oxygen-Free Radicals Directly Attack the ATP Binding Site of the Cardiac Na,K-ATPase // Ann. N. Y. Acad. Sei. - 1997. - Vol. 834(1).-P. 680-683.

173. Toyoshima C. et al. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 Ä resolution // Nature. - 2000. - Vol. 405(6787). - P. 647-655.

174. Winther A.-M.L. et al. The sarcolipin-bound calcium pump stabilizes calcium sites exposed to the cytoplasm. // Nature. - 2013. - Vol. 495(7440). - P. 265-269.

175. S0rensen T.L.-M., Müller J.V., Nissen P. Phosphoryl transfer and calcium ion occlusion in the calcium pump. // Science. - 2004. - Vol. 304(5677). - P. 16721675.

176. Jelesarov I., Bosshard H. Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition // J. Mol. Recognit. - 1999. - Vol. 12. - P. 3-18.

177. Kairane C. et al. The Effects of Different Antioxidants on the Activity of Cerebrocortical MnSOD and Na,K-ATPase from post mortem Alzheimer's Disease and Age-matched Normal Brains //.Current Alzheimer Research. - 2014. - Vol. 11(1).-P. 79-85.

178. Hauryliuk V. et al. The pretranslocation ribosome is targeted by GTP-bound EF-G in partially activated form. // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. - 2008. - Vol. 105(41). -P. 15678-15683.

179. Perozzo R., Folkers G., Scapozza L. Thermodynamics of protein-ligand interactions: history, presence, and future aspects. // J. Recept. Signal Transduct. Res.-2004.-Vol. 24(1-2).-P. 1-52.

180. Kanai R. et al. Crystal structure of a Na+-bound Na,K-ATPase preceding the E1P state. // Nature. - 2013. - Vol. 502(7470). - P. 201-206.

181. Shinoda T. et al. Crystal structure of the sodium-potassium pump at 2.4 Ä resolution. //Nature. - 2009. - Vol. 459(7245). - P. 446-450.

182. Segall L. et al. Structural basis for alphal versus alpha2 isoform-distinct behavior of the Na,K-ATPase. // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278(11). - P. 9027-9034.

183. Fuller W. et al. Cardiac ischemia causes inhibition of the Na,K-ATPase by a labile cytosolic compound whose production is linked to oxidant stress. // Cardiovasc. Res.-2003.-Vol. 57(4).-P. 1044-1051.

184. Sorensen T.L.-M., Moller J.V., Nissen P. Phosphoryl transfer and calcium ion occlusion in the calcium pump. // Science. - 2004. - Vol. 304(5677). - P. 16721675.

185. Lingrel J.B. The physiological significance of the cardiotonic steroid/ouabain-binding site of the Na,K-ATPase. // Annu. Rev. Physiol. - 2010. - Vol. 72. - P. 395-412.

186. Buckalew V.M. Endogenous digitalis-like factors: an overview of the history. // Front. Endocrinol. - 2015. - Vol. 6. - P. 49.

187. Hamlyn J.M. et al. Identification and characterization of a ouabain-like compound from human plasma. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1991. - Vol. 88(14). - P. 6259-6263.

188. Lichtstein D. et al. Identification of digitalis-like compounds in human cataractous lenses // Eur. J. Biochem. - 1993. - Vol. 216(1). - P. 261-268.

189. Numazawa S. et al. A cardiotonic steroid bufalin-like factor in human plasma induces leukemia cell differentiation. // Leuk. Res. - 1995. - Vol. 19(12). - P. 945953.

190. Oda M. et al. Determination of bufalin-like immunoreactivity in serum of humans and rats by time-resolved fluoroimmunoassay for using a monoclonal antibody. // Life Sci. - 2001. - Vol. 68(10). - P. 1107-1117.

191. Bagrov A.Y. et al. Characterization of a Urinary Bufodienolide Na,K-ATPase Inhibitor in Patients After Acute Myocardial Infarction // Hypertension. - 1998. -Vol. 31(5).-P. 1097-1103.

192. Fedorova O. V., Doris P.A., Bagrov A.Y. Endogenous Marinobufagenin-Like Factor In Acute Plasma Volume Expansion. // Clinical and Experimental Hypertension. - 1998. - Vol. 20(5-6).-P. 581-591.

193. Verheye-Dua F.A., Bohm L. Influence of apoptosis on the enhancement of radiotoxicity by ouabain. // Strahlenther. Onkol. - 2000. - Vol. 176(4). - P. 186191.

194. lizuka N. et al. Downregulation of intracellular nm23-Hl prevents cisplatin-induced DNA damage in oesophageal cancer cells: possible association with Na, K-ATPase. //Br. J. Cancer. - 2000. - Vol. 83(9).-P. 1209-1215.

195. Yeh J.Y. et al. Inhibitory effects of digitalis on the proliferation of androgen

dependent and independent prostate cancer cells. // J. Urol. - 2001. - Vol. 166(5). -P. 1937-1942.

196. Prinsloo G. et al. A cardiac glucoside with in vitro anti-HIV activity isolated from Elaeodendron croceum. //Nat. Prod. Res. -2010. - Vol. 24(18). - P. 1743-1746.

197. Wong R.W. et al. Digoxin suppresses HIV-1 replication by altering viral RNA processing. // PLoS Pathog. - 2013. - Vol. 9(3). - P. el003241.

198. Laird G.M. et al. A novel cell-based high-throughput screen for inhibitors of HIV-1 gene expression and budding identifies the cardiac glycosides. // J. Antimicrob. Chemother. - 2014. - Vol. 69(4). - P. 988-994.

Мне бы хотелось выразить огромную благодарность сотрудникам и преподавателям кафедры за те знания и навыки, которые я получила за годы обучения.

Я глубоко признательна Лопиной Ольге Дмитриевне за неоценимую помощь и поддержу при выполнении данной работы.

Я благодарю Петрушанко Ирину Юрьевну за помощь в постановке и проведении экспериментов и критическое обсуждение полученных результатов.

Отдельную благодарность я выражаю Багрову Алексею Яковлевичу за любезно предоставленный маринобуфагенин.

Я очень признательна своей семье и близким мне людям за поддержку и чуткое отношение.