Участие эндогенных протеинкиназ в сезонной регуляции активности Ca-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кондрашев-Луговский, Александр Сергеевич

• Кондрашев-Луговский, Александр Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кондрашев-Луговский, Александр Сергеевич

I. Введение

II. Обзор литературы

II.1. Гибернация млекопитающих

II.2. Регуляция энергетического метаболизма при гибернации

II.3. Регуляция экспрессии генов

II.4. Контроль метаболизма посредством влияния температуры на свойства ферментов

II.5. Регуляция функциональной активности сердца и скелетных мышц при гибернации

II.6. Основные белковые и липидные компоненты мембран CP

II.7. Регуляция функциональной активности CP

II.8. Особенности функционирования CP животных-гибернаторов

III. Цели и задачи

IV. Материалы и методы

IV. 1. Экспериментальные животные

IV. 2. Получение микросомального препарата CP

IV. 3. Определение концентрации белка

IV. 4. Определение активности Са-АТРазы

IV. 5. Определение влияния фосфорилирования белков CP на активность Са-АТРазы CP

IV. 6. Электрофорез в полиакриламидном геле

IV. 7. Фосфорилирование белков CP эндогенными протеинкиназами

IV. 8. Определение уровня фосфорилирования белков CP

IV.9. Авторадиография

IV. 10. Очистка препарата Са-АТРазы аффинной хроматографией на колонке с Reactive RED-120 агарозой

IV. 11.Анализ спектра белков, взаимодействующих с Са-АТРазой

IV. 12. Идентификация белков, взаимодействующих с Са-АТРазой.

IV. 13. Определение консервативных аминокислотных последовательностей и потенциальных участков фосфорилирования в белках, взаимодействующих с Са-АТРазой

IV. 12. Материалы

V. Результаты и обсуждение

V.I. Характеристика мембранных препаратов CP скелетных мышц , используемых в работе

1.1 Выход белка CP и активность Са-АТРазы

1.2 Белковый состав исследуемых препаратов CP

V.2. Определение оптимальных условий фосфорилирования белков в препаратах CP эндогенными протеинкиназами

V.3. Анализ включения фосфата в белки препаратов CP скелетных мышц суслика

3.1 Белки-мишени эндогенных протеинкиназ в мембранах CP

3.2 Фосфорилирование белков CP в присутствии активаторов эндогенных протеинкиназ

3.3 Анализ локализации протеинкиназ в препаратах CP

3.4 Анализ спектра протеинкиназ, присутствующих в препаратах CP

V.4. Влияние фосфорилирования белков CP эндогенными протеиникназами на акгивнось Са-АТРазы

V.5. Определение роли казеинкиназьу^ фосфорилировании белков CP скелетных мышц сусликов.

V.6. Выявление белков, взаимодействующих с Са-АТРазой

V.7. Идентификация белков - мишеней казеинкиназы II, связывающихся с Са-АТРазой.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие эндогенных протеинкиназ в сезонной регуляции активности Ca-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus»

Известно, что понижение температуры тела большинства млекопитающих, и человека в том числе, всего на несколько градусов Цельсия приводит к тяжелым последствиям и даже к смерти. Однако существует большая группа животных, которые могут переносить понижение температуры тела до 0°С и даже ниже, не теряя при этом жизнеспособности и контроля за протеканием обмена веществ. Более того, многие из этих животных способны "управлять" температурой своего тела, "согреваясь" несколько раз в течение зимы до нормальной температуры тела и снова "охлаждаясь". Речь идет о млекопитающих, которые проводят зиму в состоянии зимней спячки (гибернации). В ответ на понижение температуры, ограничение длинны светового дня и снижение количества пищи эти животные впадают в глубокое оцепенение, при котором скорость обмена веществ падает до 1-5% от нормального значения, а температура тела составляет 1-2°С. Снижение температуры тела и скорости метаболизма не является простым следствием температурозависимого падения скорости химических реакций - напротив, это является результатом большого количества тонко скоординированных биохимических процессов, проходящих в различных органах и сопровождающихся значительными адаптационными изменениями как на биохимическом, так и на функциональном уровне. На биохимическом уровне гибернация сопровождается изменением кинетических свойств большого числа ферментов, обусловленных как влиянием различных аллостерических регуляторов или фософрилированием или дефосфорилированием протеинкиназами или протеинфосфатазами, так и экспрессией специфических изоформ различных ферментов и белков. Кроме того, в процессе подготовки к спячке в организме накапливается большое количество запасных питательных веществ, отличных от обычного пищевого рациона животного, и метаболизм перестраивается на их потребление в процессе спячки и последующего пробуждения.

В настоящее время во многих лабораториях ведутся интенсивные исследования физиологических и биохимических процессов, которые происходят в организме животных во время зимней спячки. Однако многие вопросы остаются пока неясными. Так, например, неизвестно, что является сигналом для "согревания" и кратковременного пробуждения спящих животных в зимнее время. Более того, известно, что только 30% тепла при пробуждении выделяется в бурой жировой ткани, и это тепло идет на согревание сердца, мозга и ряда других внутренних органов. Остальное тепло выделяется в мышечной ткани, однако механизм теплопродукции в мышцах пока не известен.

Структурные и функциональные изменения, проходящие в разных типах мышц при гибернации, представляют особый интерес. Ряд мышц (сердце, диафрагма, межреберные мышцы, ряд скелетных мышц, поддерживающих специфическую позу гибернирующего животного) должны функционировать в экстремальных условиях. Частота сердечных сокращений у спящего животного составляет 4-5 ударов в минуту, за то же время происходит 1-2 акта вдоха/выдоха. В начале пробуждения резко увеличивается электрическая активность в скелетных мышцах, в которых зарегистрированы многочисленные, следующие один за другим потенциалы действия. Однако пока температура тела не повысится до 12-14°С, эти потенциалы действия не приводят к сокращению мышц. Таким образом, "источник тепла" в мышцах при низких температурах в процессе так называемого несократительного термогенеза пока не ясен. Предполагается, что тепло при этом может выделяться за счет работы миозиновой АТРазы, однако неясно, почему эта работа не приводит к сокращению мышц. С другой стороны, более вероятным кажется высказанное в нашей лаборатории предположение, согласно которому главную роль в несократительном термогенезе играет саркоплазматический ретикулум. Содержащиеся в мембранах СР Са-каналы способны в ответ на потенциал действия освобождать кальций из внутренних полостей ретикулума в цитоплазму, а Са-АТРаза, также локализованная в мембранах ретикулума, АТР-зависимо аккумулирует его обратно. Таким образом, при одновременной работе Са-каналов и Са-АТРазы СР имеет место классический футильный цикл, результатом которого и будет продукция тепла.

Известно также, что функционирование Са-каналов и Са-АТРазы СР зависит от их взаимодействия с рядом регуляторных белков, присутствующих в мембранах ретикулума, а также от свойств липидного бислоя мембраны. Имеющиеся в литературе данные указывают на крайнее разнообразие путей регуляции активности Са-транспортирующих систем мембран саркоплазматического ретикулума, зачастую строго видоспецифичных. Однако информация о свойствах Са-каналов и Са-АТРазы СР скелетных мышц гибернирующих животных, а также информация о белковом составе мембран СР этих животных в литературе в настоящее время очень скудна.

В связи с этим, в настоящей работе было проведено исследование белкового состава мембран СР скелетных мышц активных (летних) и гибернирующих (зимних) сусликов БрегторИИш ипйиШт и фосформирования этих белков под действием эндогенных протеинкиназ, присутствующих в мембранных препаратах СР.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

П.1. ГИБЕРНАЦИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Гибернация - это один из способов биологической адаптации животных к неблагоприятным условиям окружающей среды. Термин «гибернировать» означает проводить зиму в оцепенении. Под это широкое понятие может подойти зимнее оцепенение рептилий и амфибий, рыб и беспозвоночных. Но гибернация млекопитающих отличается от гибернации других животных рядом специфических особенностей:

1. Млекопитающие могут охлаждаться до низкой температуры тела без нарушения координации между отдельными физиологическими процессами в организме. У длительно гибернирующих видов температура тела может падать до 0°С и даже несколько ниже (Barnes, 1989), при этом скорость метаболизма уменьшается до 1% от нормальных значений (Geiser, Ruf, 1995). Характерно, что при наступлении состояния спячки снижению температуры тела животного предшествует снижение скорости метаболизма (Geiser, 1988; Heldmaier, Ruf, 1992). Это свидетельствует о сложной внутренней регуляции биохимических процессов, приводящей к наступлению состояния гибернации, в отличие от оцепенения беспозвоночных и холоднокровных, где ингибирование метаболизма обусловлено снижением температуры окружающей среды и, соответственно, температуры тела. В отличие от гибернации, оцепенение, характерное для ряда мелких млекопитающих, не всегда приводит к таким драматическим изменениям в организме; например, дневное оцепенение в летнее время длится только несколько часов, и падение температуры тела и скорости метаболизма во время такой формы оцепенения менее выражено, чем во время зимней гибернации: обычно температура тела при дневном оцепенении снижается до 11-28°С, а скорость метаболизма уменьшается примерно до 30% (Hudson, 1973).

2. Млекопитающие способны пробуждаться и «согреваться» при низкой температуре окружающей среды, благодаря своей теплокровности и общему контролю над температурой тела и метаболизмом, что их резко отличает от других позвоночных (рептилий, амфибий, рыб). Зимняя спячка состоит из последовательности так называемых баутов продолжительностью 1,5-2 недели с кратковременными, на 20-30 часов, пробуждениями между ними (интербауты) (Lyman, 1982; Постникова и др., 1997). Во время таких баутов происходит существенное уменьшение скорости биения сердца и дыхательных движений, например, у ехидны Tachiglossus aculeatus в активном состоянии при температуре тела 32°С сердце сокращается со скоростью 50-70 ударов в минуту, а во время гибернации - 2-4 удара в минуту (при температуре тела 10°С) (Grigg, Beard, 1996). У суслика Spermophihis undulatus в активном состоянии при температуре тела 35,2 - 36,8°С частота пульса составляет 150 - 370 ударов в минуту, а во время гибернации - 4-5 ударов при температуре тела 3-5°С (Соколов и др., 1995).

3. Наличие запаса питательных веществ позволяет некоторым видам млекопитающих проводить в состоянии оцепенения долгое время. В течение летнего периода в состоянии физиологической активности у животных-гибернаторов происходит накопление в организме питательных веществ. Во время активного периода у суслика Spermophilus lateralis содержание жира увеличивается на 35-40%. Для нормального протекания спячки оптимальная диета животного во время активного накопления жиров должна содержать достаточно ненасыщенных жирных кислот, чтобы депонировать жиры с общим содержанием ненасыщенных жирных кислот 80-85%. При этом процент полиненасыщенных жирных кислот в диете должен быть в 2 раза больше мононенасыщенных. Возможно, это отчасти связано с тем, что организм не может синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты, в отличие от мононенасыщенных, и они должны поступать с пищей (Frank, Storey, 1996). Как было установлено, именно линолевая и леноленовая полиненасыщенные жирные кислоты, температура затвердевания которых лежит ниже 0°С, служат основным горючим во время спячки некоторых видов сусликов. В то же время количество насыщенных жирных кислот за время гибернации практически не изменяется.

Олеиновая кислота, температура плавления которой 16-18°С, содержащая одну двойную связь, очевидно, расходуется во время спячки лишь частично, в основном в периоды пробуждения, особенно в первые недели после спячки, когда источники кормов весьма скудны (Калабухов, 1985).

У суслика Spermophilns lateralis в период с мая по сентябрь увеличение мышечной массы и количества жира было пропорционально. Во время спячки оба эти параметра так же пропорционально снижались. Животные, чья диета в активный период была обеднена жирами, впадали в состояние гибернации существенно позже, чем животные с полной диетой, и теряли во время спячки в основном в мышечной, а не в жировой массе, хотя на длительность баутов спячки диета животных не сказывалась (Pulawa, Florant, 2000).

Источниками жиров у спящих животных служат бурая и белая жировая ткани. Бурая жировая ткань обильно снабжена сосудами и состоит из мелких полигональных клеток, которые содержат множество липидных капелек и митохондрий. В отличие от бурой жировой ткани, в клетках белой жировой ткани митохондрий очень мало (Калабухов, 1985; Ныосхолм, Старт, 1977). Симпатическая стимуляция бурой жировой ткани происходит, в основном, через рЗ-адренергические рецепторы, что приводит к окислению липидов и продукции тепла (Cannon et al., 1996) Кроме того, в последнее время получено множество данных в пользу участия и al-адренергической стимуляции в термогенезе (Nedergaard et al., 1996).

Опыты с зимоспящими животными с вживленными в бурый жир и некоторые другие ткани термопарами показали, что в период начального этапа пробуждения животного в бурой жировой ткани температура увеличивается раньше, чем в других тканях (Ныосхолм, Старт, 1977). Бурый жир, в соответствии со своей локализацией, способствует разогреванию в первую очередь головного и спинного мозга, а также сердца и внутренних органов в области сердца. В результате этого происходит увеличение потребления кислорода животными и увеличение частоты сердцебиений (Постникова и др., 1997).

Гибернация наблюдается у представителей нескольких отрядов млекопитающих: яйцекладущих (ехидна, утконос), сумчатых (сумчатая мышь, тасманийский опоссум), насекомоядных (тенрек, землеройка), рукокрылых (летучие мыши), приматов (карликовые лемуры с острова Мадагаскар), хищных (медведь, скунс, енот), грызунов (суслики, сурки, тушканчики, хомяки, хомячки) (Lyman, 1982).

Существует ряд факторов, которые вызывают и регулируют процесс гибернации животных:

1. Понижение температуры окружающей среды.

2. Отсутствие или высыхание корма (при этих условиях некоторые животные впадают в спячку даже при 12-22°С (Калабухов, 1985).

3. Продолжительность светового дня. Показано, что для многих животных именно естественный ход изменения длительности периодов дня и ночи определяет возникновение оцепенения (Калабухов, 1985).

Но для некоторых млекопитающих, таких как ночная сумчатая мышка Sminthopsis crassicaudata и летучая мышь Syronycteris austral is, для которых характерно непродолжительное оцепенение (1-10 часов) - это более вероятное отражение реакции на низкую температуру окружающей среды и/или уменьшение доступности пищи, чем на фотопериод (Holloway, Geyzer, 1996; Coburn, Geyzer, 1996).

II.2. РЕГУЛЯЦИЯ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА

ПРИ ГИБЕРНАЦИИ

Во время баутов гибернации тело животного сохраняет полную неподвижность, что приводит к атрофии ряда скелетных мышц (Agostini et al., 1991; Wickler et al., 1991). Так, у гибернирующего хомяка Cricetus cricetus атрофия камбаловидной и поясничной мышц достигает 25% (Agostini et al., 1991). Вместе с тем, процессы сердцебиения и дыхания, хоть и значительно замедляются, но не останавливаются полностью. Это сопровождается работой сердечной мышцы, межреберных мышц и диафрагмы, а так же мышц, отвечающих за поддержание специфической позы спящего животного. При этом масса активных мышц может даже возрастать по сравнению с параметрами активного летнего животного. Так, во время гибернации масса сердечной мышцы суслика может увеличиться на 21 % (Wickler et al., 1991).

В период зимней спячки в организме животного происходят перестройки метаболизма, направленные на уменьшение энергетических затрат: наблюдается значительное уменьшение скорости дыхания (Pehowich, Wang, 1984) и окислительного фосфорилирования в митохондриях (Bronnikov et al., 1990). Так, показано, что уменьшение сродства регуляторного участка связывания Н-АТРазы для АТР и ADP и уменьшение в 5 раз концентрации этих нуклеотидов существенно лимитирует скорость окислительного фосфорилирования в митохондриях печени гибернирующих сусликов (Bronnikov et al., 1990). Уменьшение активности дыхательных ферментов определяется не только влиянием низкой температуры тела, но и рядом специфических регуляторных механизмов. Например, предполагается, что основным механизмом, вызывающим уменьшение скорости дыхания в митохондриях печени суслика Citellus parry во время гибернации является ингибирование оксалоацетатом окисления сукцината (Fedotcheva et al., 1985).

Интенсивность дыхания в мышцах непосредственно связана с активностью этих мышц при гибернации. Так, скорость поглощения кислорода в бедренной и жевательной мышцах краснощекого суслика (Spermophilus erythrogenys) снижается при гибернации на 15 % (Эмирбеков, Львова, 1991). Вместе с тем, в некоторых мышцах окислительная активность при гибернации увеличивается. В икроножной мышце суслика Spermophilus lateralis она увеличивается на 65%, в полусухожильной мышце - на 37%. Активность цитратсинтазы в сердце возрастает на 20% (Wickler et al., 1991). Очевидно, что повышение окислительной активности в мышцах связано с практически полным подавлением гликолиза и активацией процесса окисления жиров (Storey, 1997).

Во время гибернации наблюдается общее подавление гликолитической активности в результате изменения количества метаболитов, которые являются субстратами или аллостерическими регуляторами ферментов гликолиза, изменения кинетических параметров ключевых ферментов гликолиза, а также фосфорилирования ряда ферментов протеинкиназами. Так, активность гексокиназы и фосфофруктокиназы скелетных мышц гибернирующего тушканчика Jaculus orientalis снижается вдвое. При этом активность фосфофруктокиназы заингибирована в результате низкого содержания фруктозо-6-фосфата и уменьшения соотношения ATP/ADP в ткани (El Hachimi et al., 1990).

Контроль за скоростью гликолиза может осуществляться также на уровне обратимой ассоциации ферментов со структурными элементами в клетке. Например, гликолитические ферменты могут обратимо связываться с цитоскелетом и митохондриями, что изменяет их кинетические параметры. У мыши Peromyscus maniculatus значительно уменьшается связывание с внутриклеточными структурами фосфофруктокиназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и пируваткиназы в скелетных мышцах, и увеличивается связывание гексокиназы, фосфофруктокиназы, пируваткиназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в сердце во время оцепенения (Nestler at all., 1996).

Во время гибернации происходят изменения кислотно-основных условий: в результате удержания СО2 наблюдается значительное увеличение рСС>2, уменьшение внутриклеточного и внеклеточного рН и, возможно, как следствие, возникает уменьшение связывания различных ферментов с внутриклеточными структурами и подавление метаболизма углеводов в скелетных мышцах (Nestler et al.,1996).

Очевидно, изменение свойств ферментов гликолиза во время гибернации отражает процесс общего снижения интенсивности метаболизма в организме и используется для подавления углеводного обмена, а в ряде случаев и для обеспечения глюконеогенеза (Storey, 1997).

Подавление углеводного метаболизма перестраивает организм гибернирующих животных на использование в качестве топлива жиров. Например, метаболизм летучей мыши Eptesicus fuscus поддерживается в процессе гибернации почти всецело окислением жиров за счет сильного ингибирования окисления пирувата пальмитоилкарнитином (Yacoe, 1983).

П.З. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Гибернация сопровождается значительными изменениями в уровне белкового синтеза. Эксперименты по определению уровня синтеза белков у черного медведя {Ursus americanus) показали, что максимально высоким уровень синтеза белков мышц был летом, при избытке кормов. Во время спячки уровень синтеза белков резко снижался, однако оставался постоянным в течение всей зимы, что свидетельствует о регуляции процессов синтеза и протеолиза белков во время спячки (Lohuis et al., 2007).

Несмотря на общее угнетение метаболизма при гибернации в организме животных-гибернаторов продолжают протекать процессы транскрипции и трансляции. Скрининговые исследования суммарной экспрессии генов показали, что изменения уровня мРНК при гибернации затрагивают многие органы. Подобные изменения были отмечены в бурой жировой ткани, печени, сердце, гипоталамусе, скелетных мышцах (Yan et al., 2008). Сезонные колебания содержания характерны для большого количества ферментов, вовлеченных в основные метаболические пути организма: гликолиз и гликогенолиз, обмен аминокислот и жирных кислот, молекулярного транспорта, сокращений разных типов мышц, клеточного роста и апоптоза и т.д. (Yan et al., 2008).

С другой стороны, анализ уровня мРНК в печени арктического суслика Spermophilus panyii показал, что содержание мРНК в организме активного летнего и спящего животного не отличается (Knight et al., 2000). Вместе с тем, показано значительное снижение количества полисом в организме спящего животного, что свидетельствует о снижении уровня синтеза белка на стадии трансляции. Есть мнение, что в течение интербаутов в организме резко увеличивается скорость трансляции, возмещающая естественную убыль белков, происходящую во время баута. Следует отметить, что при гибернации наблюдается изменение экспрессии ряда генов. Например, во время гибернации у сусликов Spermophilus richardsonii и Spermophilus columbianus увеличивается содержание сывороточного альбумина и аг-макроглобулина в плазме крови. Известно, что а2-макроглобулин способен ингибировать широкий спектр протеаз и, скорее всего, он принимает участие в уменьшении протеолиза во время гибернации. Кроме этого, он известен как основной физиологический ингибитор фактора свертывания крови Ха, поэтому предполагается, что а2-макроглобулин способен подавлять свертывание крови (Srere et al., 1992).

Интересно отметить, что в крови бурого медведя Ursus arctos обнаружены сезонные изменения содержания гаптоглобина, который как и а2-макроглобулин является белком так называемой острой фазы стресса. Поскольку концентрация гаптоглобина была выше всего зимой, предполагается, что это не только результат зимней спячки, но и реакция на холодовой стресс (Mominoki et al., 1996).

В крови бурундука Tamias asiaticus в активном состоянии были найдены четыре неизвестных ранее белка (молекулярные массы 20, 25, 27, 55 кДа), формирующие 140 кДа комплекс, который исчезает во время гибернации. Функции этого комплекса до конца не выяснены. Установлено, что 55 кДа белок обладает высокой степенью гомологии с сц-антитрипсином, а три других гомологичны друг другу, причем МН2-концевой участок этих белков содержит коллагеноподобные аминокислотные последовательности (Kondo, Kondo, 1992).

В последнее время появился ряд данных, указывающих на то, что процесс гибернации сопровождается значительным окислительным стрессом, и что многие ткани организма гибернаторов в течение спячки находятся в предапоптотическом состоянии. Исследование процессов перекисного окисления липидов в слизистой оболочке кишечника гибернирующего суслика Spermophilus tridecemlineatus показало, что уровень диеновых коныогатов (продуктов перекисного окисления липидов) увеличивался при погружении животного в спячку и оставался постоянно повышенным в течение всей гибернации. Уровень митохондриального стрессорного белка GRP75 также увеличивался при погружении животного в спячку, причем его содержание нарастало от момента засыпания к интербауту (Carey et al., 2000). Изучение баланса окисленной и восстановленной форм глутатиона (который играет в клетке роль основного окислительно-восстановительного буфера) у суслика Spermophilus tridecemlineatus показало, что гибернация сопровождается изменением баланса глутатиона в сторону его окисленного состояния. Общий пул свободного глутатиона снижается в течение баута и возрастает в интербауте (Carey et al., 2003). Кроме того, в слизистой кишечника засыпающих и находящихся в состоянии баута животных увеличивается экспрессия HSP70, снижающаяся затем при пробуждении и в интербауте. Возможно, это является ответом на стресс, приводящий к нарушению фолдинга белков во время погружения организма в спячку (Carey et al., 2003). Таким образом, при гибернации синтез одних белков может активироваться, тогда как другие белки, наоборот, синтезируются в меньших количествах.

Следует отметить, что большое физиологическое значение придается в последнее время различным пептидам, которые обнаружены во многих тканях гибернирующих животных, причем спектр этих пептидов и их содержание резко изменяются при впадении животных в спячку или при выходе из нее. Предполагается, что именно пептиды могут выступать в качестве «триггеров», запускающих различные биохимические и физиологические механизмы, ответственные за гибернацию. В частности, из тканей гибернирующих животных были изолированы биологически активные пептиды, которые регулируют потенциалзависимые Са-каналы в плазматической мембране кардиомиоцитов крыс и сусликов и обладают кардиотропной, гипер- или гипотермной и пролиферативной активностями (Ziganshin et al., 1996; Kogler et al., 2006).

II.4. КОНТРОЛЬ МЕТАБОЛИЗМА ПОСРЕДСТВОМ ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Во время гибернации наблюдаются изменения в температурной чувствительности ферментов, которые отражаются на их кинетических параметрах. Так, фруктозо-1,6-бисфосфатаза из печени гибернирующей летучей мыши Miotis lucífugas является более чувствительной к изменению температуры, чем фермент из печени животных в активном состоянии. Для фермента из гибернирующего животного наблюдалось 75% уменьшение Км для фруктозо-1,6-бисфосфата при 5°С по сравнению с 37°С, в то время как для фермента из активного животного - только 25% уменьшение (Storey, 1997). Напротив, повышенная температурная чувствительность для связывания фосфоенолпирувата и ADP у пируваткиназы отмечается у активного животного, но не у гибернирующего (Borgmann, Moon, 1976).

Одной из характерных особенностей процесса гибернации является снижение уровня синтеза белков. В связи с этим возникает необходимость поддерживать минимально необходимый уровень ключевых ферментов организма и регулировать процесс протеолиза. Одним из путей регуляции является обусловленное низкой температурой снижение активности протеаз. Кроме того, имеются данные о существовании регуляторного механизма протеолиза путем регуляции процесса присоединения убиквитина к белкам -мишеням протеосом (Velickovska, Breukelen, 2007).

Таким образом, в регуляцию метаболизма во время гибернации вовлечено множество механизмов, направленных на выживание. К ним следует отнести обратимое фосфорилирование регуляторных белков, изменение кинетических и аллостерических свойств ферментов в результате изменения температуры, изменение содержания некоторых метаболитов, уменьшение аденилатного уровня и т.д. Существенную роль играет также контроль на уровне транскрипции и трансляции.

П.5. РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СЕРДЦА И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ ГИБЕРНАЦИИ

Несмотря на то, что снижение температуры тела всего на несколько градусов у большинства животных приводит к необратимым изменениям в метаболизме и является летальным, гибернаторы могут снижать температуру своего тела практически до 0 °С без заметного ущерба. При этом продолжаются процессы дыхания и сердечной деятельности, необходимые для поддержания жизнедеятельности организма. В связи с этим несомненный интерес представляют адаптационные процессы, происходящие в сердце и мышцах гибернирующего животного, позволяющие этим органам функционировать в экстремальных условиях и не только обеспечивающие выживание организма в условиях спячки, но и участвующие в начальном этапе теплопродукции при пробуждении.

Известно, что электрические и механические характеристики сердечной мышцы гибернирующих бурундуков Tamias sibiricus отличаются от таковых у активных животных, что связано с необходимостью выживания при низких температурах. Ряд наблюдаемых при этом процессов указывают на быстрое и эффективное связывание Са2+ внутренними структурами кардиомиоцитов, в первую очередь саркоплазматическим ретикулумом, во время гибернации (Kondo, Shibata, 1984). В подтверждение этому, саркоплазматический ретикулум, изолированный из сердца гибернирующего суслика Spermophilus richardsonii, обнаруживает более высокую скорость поглощения Са2+ по сравнению с осенними и летними сусликами (Belke et al., 1987).

В скелетных мышцах сусликов Citellus undulatus во время гибернации происходят обратимые адаптационные изменения: наблюдается снижение актин-активируемой АТРазной активности миозина, а Ca -чувствительность актомиозина спящих и пробуждающихся сусликов снижена на 60 и 55% соответственно. Это свидетельствует о значительном снижении функциональных свойств основного сократительного белка миозина при зимней спячке (Лукоянова и др., 1997b). В период спячки наблюдаются изменения в содержании изоформ тяжелых и легких цепей миозина. Предполагается, что это регулирует способ упаковки миозина в нитях, что, по-видимому, контролирует двигательные способности мышц при разных температурах тела животных, особенно в процессе пробуждения. В начальный момент пробуждения нити миозина имеют неупорядоченную структуру, в отличие от нитей миозина гибернирующих животных и животных, находящихся в поздней стадии пробуждения (Лукоянова и др., 1996).

Анализ изо ферментного состава тяжелых цепей миозина в сердечной мышце хомяка Cricetus cricetus показал, что у летних активных животных присутствует в основном ß-изоформа тяжелого миозина, составляющая до 80 % от всего миозина, в то время как у гибернирующих животных преимущественной изоформой является а-изоформа (до 53%). Зимние активные хомяки имеют такой же изоферментный состав тяжелых цепей миозина, что и летние активные животные (Morano et al., 1992).

В скелетных мышцах спящих сусликов на 50% снижается содержание одной из изоформ тяжелых цепей миозина 2В, характерной для быстрых мышечных волокон. Количество легких цепей 3 миозина (MLC3) в скелетных мышцах гибернирующих сусликов уменьшается до 40% по сравнению с активными животными и затем при пробуждении за 1 - 2 часа увеличивается до 60%. При пробуждении содержание тяжелых цепей 2В также увеличивается примерно на 10% по сравнению со спящими животными (Лукоянова и др., 1997а). Поскольку миозины сердечной и медленных скелетных мышц, в отличие от быстрых скелетных мышц, не содержат MLC3, данные по уменьшению количества быстрых изоформ тяжелых и легких цепей миозина указывают на возможную трансформацию при гибернации быстрых волокон скелетных мышц в медленные. Обнаруженные изменения изоформного состава коррелируют с результатами сравнительного анализа механических характеристик одиночных волокон скелетных мышц у спящих и активных сусликов (Rogdestvenskaya et al., 1994). Это также согласуется с данными о преимущественной атрофии быстрых мышечных волокон при гибернации (Wickler et al., 1991). Время, за которое происходит столь существенное изменение изоформного состава миозина, невелико, но вполне реально, учитывая гиперактивацию синтеза белков в тканях суслика в конце каждого баута спячки и в начале интербаута (Zhegunov et al., 1992).

При гибернации меняется и уровень фосфорилирования молекул миозина. Показано, что в скелетных мышцах спящих сусликов 30-50% легких регуляторных цепей миозина (MLC2) находится в фосфорилированном состоянии, в то время, как в препаратах пробуждающихся и активных сусликов MLC2 полностью дефосфорилированы (Лукоянова и др., 1996). Вероятно, это вносит дополнительный вклад в уменьшение АТРазной активности миозина. Так как снижение двигательной активности мышц является вероятным следствием снижения АТРазной активности миозина, изменение уровня фосфорилирования легких цепей миозина может играть существенную роль в регуляции двигательной активности скелетных мышц при гибернации.

Недавно было показано увеличение уровня мРНК сердечной изоформы MLC1 в 2 раза в сердце и в 3-4 раза в скелетных мышцах гибернирующих сусликов Spermophilus lateralis, что также может вносить вклад в изменение сократительной активности мышц при низких температурах (Fahlman et al., 2000).

При гибернации изменяется способность миозина связывать ключевые ферменты гликолиза. Миозин, изолированный из скелетных мышц спящих и пробуждающихся сусликов, значительно хуже связывает фосфофруктокиназу, чем миозин из активных животных. Возможно, что эти изменения являются следствием изменения структурной организации миозина (Лукоянова и др., 1997b). Поскольку связывание с сократительными нитями активирует фосфофруктокиназу (Подлубная, 1992), уменьшение количества связанного фермента приводит к снижению его активности в клетке при гибернации и снижению скорости гликолиза, что хорошо согласуется с данными по ингибированию гликолиза во время зимней спячки (El Hachimi et al., 1992). Если же учесть, что связывание фосфофруктокиназы с сократительными нитями имеет значение для синхронизации запуска гликолитической и сократительной мышечных систем, а также для увеличения скорости доставки АТР к АТР-гидролизующим центрам миозина, то обнаруженное снижение связывания будет вносить свой вклад в ингибирование сократительной активности скелетных мышц (Лукоянова и др., 1997а).

В зимний период содержание миоглобина в скелетных мышцах в 2,5-3 раза превышает его содержание летом. Предполагается, что с наибольшей вероятностью увеличение содержания миоглобина у сусликов зимой связано с обеспечением потребности мышц в кислороде на первом этапе пробуждения в процессе несократительного термогенеза, когда кислородзависимые процессы в мышцах протекают в условиях отключенного периферического кровотока и неработающей системы анаэробного гликолиза (Постникова и др., 1997).

Общее содержание адениловых нуклеотидов в скелетных мышцах при зимней спячке не изменяется, но у гибернирующих тушканчиков Jaculus orientalis соотношение ATP/ADP в 2 раза выше, чем у активных (El Hachimi et al., 1989). Однако в других тканях содержание адениловых нуклеотидов в процессе гибернации может изменяться. Так общее содержание АТР и ADP было в 5 раз ниже в митохондриях печени гибернирующих сусликов Citellas undulatus, чем у активных (Bronnikov et al., 1990).

Таким образом, во время гибернации наблюдаются изменения электромеханических свойств скелетных мышц, функциональных свойств миозинов, содержания миоглобина, ADP и АТР, которые, по-видимому, приводят к значительному уменьшению сократительной активности мышц. Так как огромную роль в регуляции сокращения и расслабления скелетных мышц играет саркоплазматический ретикулум и его белки, то функциональная активность СР также может изменяться во время гибернации. К настоящему времени накоплен ряд данных об изменениях структурной и функциональной активности СР при гибернации. Более подробно этот вопрос будет рассмотрен в Главе II.8.

П.6. ОСНОВНЫЕ БЕЛКОВЫЕ И ЛИПИДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ

МЕМБРАН САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА (СР)

Саркоплазматический ретикулум мышц представляет собой высокосртруктурированную систему замкнутых цистерн и трубочек, пронизывающих саркоплазму в непосредственной близости от миофибрилл. В области трансверзальных впячиваний сарколеммы - трубочек Т-системы -локализованы терминальные цистерны СР, а миофибриллы окружены продолговатыми трубочками ретикулума.

В ответ на деполяризацию сарколеммы, распространяющуюся внутрь мышечного волокна по трубочкам Т-системы, из СР через Са-каналы терминальных цистерн (рианодиновые рецепторы, RyR) выбрасывается Са2+, который индуцирует образование актомиозинового комплекса и, как следствие, сокращение мышц (Martonosi, Feretos, 1964; MacLennan et al., 1997) (Рис. 1)

При повышении концентрации Са2+ в цитоплазме активируется Са-АТРаза, которая локализована в продолговатых трубочках СР. Са-АТРаза обеспечивает 2+ аккумуляцию Са во внутреннее пространство СР, т.е. осуществляет снижение 2+ концентрации Са в цитоплазме, что приводит к расслаблению мышцы (Inesi,

1985; MacLennan et al., 1997, Stephenson et al., 1998) (Рис.1).

Содержание липидов в препаратах CP составляет примерно 0,5 мг/мг белка CP (Meisner, 1975). Примерно 80% всех липидов CP - это фосфолипиды, из них 65-73% составляет фосфатидилхолин, 12-19% - фосфатидилэтаноламин, 9% - фосфатидилинозитол, 2% - фосфатидилсерин, 4% - сфингомиелин, 0,1-0,3% -кардиолипин; остальную часть составляют нейтральные жиры, в основном холестерин и триацилглицериды (Tada et al., 1978). Локализация фосфолипидов в бислое асимметрична. Около 70-80% фосфатидилэтаноламина расположено во внешнем слое мембраны и только 20-30% - на внутренней поверхности. Фосфатидилсерин и сфингомиелин локализованы преимущественно на внутренней поверхности мембран. Фосфатидилхолин содержится по обе стороны мембраны примерно в равном количестве (Vale, Carvalho, 1980).

Терминальные цистерны, контактирующие с Т-трубочками, образуют так называемые триады и их фрагменты представляют собой тяжелую фракцию ретикулума, а фрагменты продолговатых трубочек - легкую фракцию (Meissner, 1975; Saito et al., 1984). Используя дифференциальное центрифугирование и/или центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, эти фракции можно разделить. Исследование процессов кальциевого обмена в ретикулуме показало, что разные отделы CP несут различные функции - терминальные цистерны осуществляют выброс Са2+ в ходе мышечного сокращения, а продолговатые a i трубочки осуществляют аккумуляцию Ca на стадии расслабления (Martonosi, Feretos, 1964; Rosemblatt, Scales, 1989).

Основными белковыми компонентами легкой фракции CP являются Са-АТРаза (до 50% от общего содержания белка), Са-связывающие белки кальсеквестрин (20-25%), кальретикулин (5-7%), саркалюменин, богатый гистидином Са-связывающий белок и высокомолекулярный белок с кажущейся молекулярной массой около 450 кДа, представляющий собой Са-канал (RyR) (Costello et al., 1988).

Са-канал (рианоднновый рецептор, RyR) CP представляет собой тетрамерный белок, состоящий из четырех идентичных субъединиц с молекулярной массой около 560 кДа каждая, то есть функционально активный

Са-канал имеет молекулярную массу более 2-106 Да (Franzini-Armstrong, Protasi, 1997). Характерной особенностью этого белка является его способность связывать с высоким сродством растительный алкалоид рианодин с Kd от 2 до 7 нМ для разных изоформ (Ogawa et al., 1999). Рианодин связывается с RyR в стехиометрии 1 моль/моль тетрамера, причем он взаимодействует только с открытым Са-каналом и фиксирует его в этом состоянии. Связывание рианодина происходит в С-концевой области RyR, причем в формировании центра связывания принимает участие две соседние субъединицы Са-канала (Callaway et al., 1994; Mackrill, 1999).

Каждая субъединица рианодинового рецептора состоит из 12 трансмембранных а-спиральных доменов, формирующих ион-проводящий канал, по которому Са выходит из полостей CP в цитоплазму, и большого цитоплазматического домена, образованного N-концевой частью молекулы и петлями, соединяющими трансмембранные спирали. В состав четырех трансмембранных спиралей входят отрицательно заряженные аминокислоты, высококонсервативные для всех известных изоформ RyR. Предполагается, что именно эти аминокислоты участвуют в формировании Са-связывающего участка (Chen et al., 1998). Кроме того, столь же высококонсервативным является и С-концевой участок молекулы RyR. Вероятно, этот участок молекулы участвует в формировании функционально активного Са-канала (Gao et al., 1997). (Рис. 2)

В тканях млекопитающих рианодиновый рецептор представлен тремя изоформами с высокой (60-70%) степенью гомологии, кодирующимися генами, локализованными в разных хромосомах (Sutko, Airey, 1996). Изоформа RyRl экспрессируется преимущественно в скелетной мускулатуре и в мозжечке, RyR2 - в сердце и мозге, a RyR3 - в эпителиальных тканях и некоторых отделах мозга. Тетрамерные комплексы всех изоформ RyR формируются только полипептидными цепями одного типа, имеют сходную пространственную структуру и близкие кинетические параметры (Ogawa et al., 1999). Согласно данным криоэлектронной микроскопии с высоким разрешением, тетрамерный комплекс RyR напоминает по форме гриб с квадратными «шляпкой» (27 х 27 х 11 нм) и «ножкой» (12 х 12 х 6,5 нм) (Sorrentino, Reggiani, 1999). «Ножка» гриба гидрофобный домен RyR, формирующий трансмембранный канал) погружена в мембрану CP, а «шляпка» (гидрофильный домен) экспонирована в цитоплазму (Franzini-Armstrong, Protasi, 1997; Ogawa et al., 1999; Sorrentino, Reggiani, 1999). (Рис. 2)

Активация Са-каналов в скелетных мышцах осуществляется за счет непосредственного контакта с Са-каналом сарколеммы (дигидропиридиновым рецептором, DHPR) (Meissner, Lu, 1995; Ogawa et al., 1999; Lamb, 2000). RyRl локализован в так называемых контактных зонах мембран CP - участках терминальных цистерн ретикулума, образующих плотные контакты с направленными внутрь мышечного волокна трубочками Т-системы, содержащими в своем составе молекулы DHPR. Половина молекул RyRl непосредственно контактирует с четырьмя молекулами DHPR каждая (так называемой тетрадой). При деполяризации сарколеммы конформация DHPR меняется таким образом, что некоторые домены перемещаются в направлении, перпендикулярном плоскости цитоплазматической мембраны, что, в свою очередь, приводит к изменению конформации связанных с ними доменов молекул RyR и открытию канала (Franzini-Armstrong, Protasi, 1997; Ogawa et al., 1999). Молекулы RyR формируют в мембране CP правильные ряды, в которых тетрамеры контактируют друг с другом «углами» своих гидрофильных доменов, что обеспечивает, например, кооперативные взаимодействия между молекулами RyR при связывании Са2+ (Ogawa et al., 1999). По-видимому, тесный контакт молекул RyR отвечает и за синхронность открытия каналов, так как молекулы RyR, не связанные напрямую с молекулами DHPR, открываются синхронно с каналами, непосредственно контактирующими с молекулами дигидропиридинового рецептора. Необходимым условием нормального взаимодействия между молекулами RyR является наличие белка FKBP12, участвующего в синхронизации работы молекул RyR (Wagenknecht et al., 1997).

Переход Са-каналов в открытое состояние сопровождается значительными конформационными изменениями, которые затрагивают как гидрофильную, так и гидрофобную части молекулы RyR. При этом просвет центрального ион-проводящего канала увеличивается подобно тому, как открывается диафрагма объектива фотоаппарата или расширяется зрачок глаза (Sorrentino, Reggiani, 1999).

Электромеханическое сопряжение в сердце отличается от такового в скелетных мышцах. В основе его лежит Са-индуцируемая активация Са-каналов. По сравнению со скелетной мускулатурой система Т-трубочек в сердце развита слабо и большая часть RyR2 с сарколеммой не контактирует. Для активации RyR2 необходим вход в цитоплазму ионов Са2+ через потенциал-чувствительные Са-каналы плазмалеммы (Sutko, Airey, 1996, Ogawa et al., 1999). Необходимым условием нормального функционирования RyR2 является сердечная изоформа белка FKBP12 -FKBP12,6 (Shou et al., 1998).

Са-АТРаза сарко(эндо)плазматнческого ретикулума (АТР-фосфогидролаза, ЕС 3.4.1.38) (SERCA), принадлежащая к обширному семейству ион-транспортирующих АТРаз Р-типа, является основным белковым компонентом легкой фракции саркоплазматического ретикулума. В разных тканях она представлена разными изоформами: SERCA1 в быстрых скелетных мышцах, SERCA2a в сердце, медленных скелетных и гладких мышцах, SERCA2b в разных типах клеток (мозг, почки, гладкие мышцы) и SERCA3 в клетках крови и эпителиальных клетках (Moller et al., 1996).

Локализация этого фермента в мембране асимметрична: 70% аминокислотных остатков обращено в цитоплазму, 25% приходится на трансмембранный домен и 5% экспонировано в полость ретикулума (Toyoshima et al., 1993). Са-АТРаза быстрых скелетных мышц (SERCA1) состоит из 994 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу около 115 кДа (MacLennan et al., 1985). Рентгеноструктурный анализ Са-АТРазы показал, что цитоплазматический фрагмент состоит из трех доменов - N-домена, Р-домена и домена А (Toyoshima et al., 2000). (Рис. 3)

Центральную часть молекулы составляет Р-домен, в состав которого входит фосфорилируемый в ходе реакционного цикла остаток Asp351. Этот домен состоит из 2-х частей - N-терминальной, находящейся между остатками Asp330 и Asp359 и соединенной с трансмембранной спиралью М4, и С-терминальной (Lys605 - Asp737), соединенной с трансмембранной спиралью М5.

Эти две части Р-домена, образованные семью слоями параллельных Р-структур и восемью короткими спиралями, формируют россмановскую складку.

Нуклеотидсвязывающй домен (N-домен) содержит участок связывания АТР и является самым большим из цитоплазматических доменов. Он образован аминокислотными остатками с Gln360 по Arg604 и располагается между двумя областями Р-домена. Он формируется семыо фрагментами антипараллельной структуры, объединенными двумя а-спиралями.

A-домен (так же называемый р-доменом) - самый маленький из цитоплазматических доменов. Он состоит из 110 аминокислотных остатков петли между спиралями М2 и МЗ, формирующих неупорядоченную структуру, и 40 остатков N-концевой части фермента, формирующих две короткие спирали. По всей видимости, этот домен обеспечивает взаимодействие между гидрофильной и гидрофобной частями фермента.

Участок фосфорилирования (Asp351) находится на расстоянии 25 Á от нуклеотидсвязывающего центра, что свидетельствует о необходимости сближения доменов во время гидролиза АТР. Ряд данных свидетельствует о том, что в отсутствие

С а N -домен находится в фиксированном состоянии, но в присутствии Са2+ приобретает лабильность, что в сочетании с конформационными изменениями, претерпеваемыми N-доменом в процессе связывания АТР, приводит к сближению N- и Р-доменов (Danko et al., 2001).

Трансмембранная часть фермента состоит из 10 a-спиралей. Спирали М4, М5, Мб и М8 располагаются вокруг двух высокоплотных областей, которые на основании данных рентгеноструктурного анализа были идентифицированы как ионы Са2+. Два участка связывания кальция находятся в мембране на одном уровне на расстоянии 5,7 Á друг от друга (Toyoshima et al., 2000).

Толщина гидрофобного домена Са-АТРазы (около 21 Á) меньше толщины фосфолипидного бислоя мембраны (около 31 Á). Вместе с тем, некоторые трансмембранные спирали выступают из мембраны над ее цитоплазматической поверхностью (Lee, 2002). В то же время, присутствие большого количества заряженных аминокислотных радикалов в трансмембранных спиралях Са-АТРазы на границе раздела липид/вода свидетельствует о важной роли электростатических взаимодействий полярных групп фосфолипидов с молекулой фермента в стабилизации ее структуры (Lund et al., 1989; Lee, 1998).

Са-АТРаза относится к семейству ион-транспортирующих АТРаз Е1-Е2-типа (или Р-типа), для которых характерны следующие свойства:

1. Использование для транспорта катионов энергии АТР.

2. Образование фосфорилированного интермедиата.

3. В ходе реакционного цикла фермент находится в двух основных конформационных состояниях: El и Е2. В процессе реакционного цикла происходит изменение конформации молекулы фермента, приводящее к изменению сродства АТРаз к переносимым катионам (Pedersen, Carafoli, 1987).

Механизм функционирования Са-АТРазы саркоплазматического ретикулума к настоящему времени хорошо изучен и описан в ряде обзоров (Inesi, 1985; MacLennan et al., 1997). Фермент в конформации El, которая характеризуется высоким сродством к Са , связывает два иона Са и АТР с цитоплазматической стороны, после чего фосфорилируется, при этом у-фосфат АТР переносится на остаток Asp351 фермента. Это индуцирует конформационные изменения: Е1-конформация переходит в конформацию Е2, при этом происходит снижение сродства Са-АТРазы к ионам Са2+ и высвобождение их во внутреннюю полость ретикулума. Затем происходит Mg -зависимый гидролиз фосфофермента с освобождением P¡ в цитоплазму, и изомеризация: фермент из конформации Е2 переходит в El (De Foresta et al., 1990).

Реакцию, осуществляемую Са-АТРазой, можно провести в обратном направлении в присутствии ADP и высокой концентрации Са2+ внутри везикул и низкой наружной концентрации Са2+. Обратный транспорт 2 ионов Са2+ сопровождается синтезом 1 молекулы АТР (Mintz et al., 1990).

Са-АТРаза CP активируется Са2+ в концентрациях ниже 10"7 М. Этот фермент снижает концентрацию свободного Са2+ в цитоплазме до 10"8 М. Поскольку в полостях CP большая часть ионов Са2+ связывается Са-связывающими белками CP, присутствующими в ретикулуме в большом количестве, то концентрация общего Са2+ в полостях CP может достигать 60 - 75 мМ, что создает 1000-кратный градиент Са2+ на мембране CP (Mintz, Guillain, 1997; MacLennan et al., 1997).

Зависимость активности Са-АТРазы от концентрации АТР не описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, так как в области высоких концентраций субстрата (0,5 - 1,0 мМ) наблюдается дополнительная активация фермента (Yamamoto, Tonomura, 1967). Показано, что график зависимости активности Са-АТРазы от концентрации АТР в координатах Лайнуивера-Берка имеет вид двух пересекающихся прямых. Рассчитанные значения Km для АТР составили 10 мкМ в области низких концентраций субстрата (до 100 мкМ) и 400 мкМ в области высоких концентраций АТР (свыше 100 мкМ) (Yamamoto, Tonomura, 1967; De Meis, Inesi, 1982). Подобная зависимость активности от концентрации субстрата характерна и для ряда других АТРаз Р-типа, в частности для Na,K-ATPa3bi плазматических мембран (Post et al., 1972) и H,К - АТРазы (Wallmark et al., 1980).

Существует несколько причин, которыми объясняют дополнительную активацию Са-АТРазы в присутствии высоких концентраций АТР. Во-первых, дополнительная активация может быть обусловлена существованием различных изоформ фермента, обладающих разными кинетическими характеристиками. Однако современные данные не выявили гетерогенности фермента в мембранах ретикулума.

Другим возможным объяснением негиперболической зависимости активности Са-АТРазы от концентрации АТР может быть изменение сродства активного центра Са-АТРазы к АТР в ходе реакционного цикла (Moczydlowski, Fortes, 1981; White, Dewey, 1987). Предполагается, что в конформации El Са-АТРаза имеет высокое сродство к АТР, а после перехода фермента в конформацию Е2 и освобождения продуктов реакции активный центр приобретает низкое сродство к субстрату.

Еще одно объяснение подобного поведения Са-АТРазы - наличие второго, регуляторного центра связывания АТР в молекуле фермента (Coll, Murphy, 1991). Предполагается, что регуляторный центр имеет низкое сродство к АТР, но связывание с ним нуклеотида активирует гидролиз субстрата в активном центре, который имеет высокое сродство к субстрату (Dupont et al., 1985).

Наконец, дополнительная активация Са-АТРазы высокими концентрациями АТР может быть связана с присутствием в мембранах CP олигомерных комплексов фермента, взаимодействие мономеров в которых и приводит к нарушению Михаэлисовской кинетики. Было показано присутствие в мембранах CP олигомерных комплексов Са-АТРазы (Maguire, Ohlendieck, 1996; Lennon et al., 1999; Harmon et al., 2001), причем в ряде случаев данные экспериментов наиболее хорошо описываются моделями, предполагающими наличие кооперативных взаимодействий между нуклеотидсвязывающими центрами мономеров Са-АТРазы в составе олигомерных комплексов (Merino et al., 1999; Dode et al., 2001).

Известно, что кроме ATP Са-АТРаза может гидролизовать и другие нуклеозидтрифосфаты: GTP, ITP, UTP, СТР (Martonosi, 1984), причем скорость гидролиза падает в ряду ATP>ITP>GTP>CTP>UTP от 100 до 25%. Кроме нуклеозидтрифосфатов Са-АТРаза может гидролизовать большой набор ацилфосфатов: ацетилфосфат и карбамоилфосфат (Liguri et al., 1980), пара-нитрофенилфосфат (Ribeiro et al., 1980) и т.д. Причем необходимо отметить, что гидролиз всех этих соединений подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен; эти субстраты не обладают аллостерическим действием, характерным для АТР и в больших концентрациях не вызывают дополнительной активации фермента.

Помимо кальциевого канала и Са-АТРазы CP содержит большое количество различных белков, выполняющих разнообразные функции.

Наиболее известным интегральным мембранным белком контактной зоны терминальных цистерн CP является гликопротеид триадин, представляющий собой соединенный дисульфидными связями гомополимер с молекулярной массой 95 кДа, который способен взаимодействовать как с RyR, так и с al-субъединицей DHPR (Mackrill, 1999). Предполагалось, что именно триадин обеспечивает контакт этих белков и может принимать непосредственное участие в передаче конформационного сигнала от DHPR на RyR в процессе электромеханического сопряжения в скелетных мышцах. Однако триадин имеет только одну трансмембранную a-спираль, а его цитоплазматический N-концевой домен состоит всего из 47 аминокислотных остатков, что, вероятно, недостаточно для прямого контакта с расположенным в сарколемме DHPR (Knudson et al., 1993).

В последнее время появились данные о том, что триадин в организме является не единственным белком, но представляет собой большое семейство белков и их изоформ с различной локализацией и функциями (Marty, 2004). Была идентифицирована новая изоформа триадина с молекулярной массой 51 кДа, имеющая отличную от 95 кДа триадина последовательность С-концевого региона (Marty et al., 2000). Анализ генной организации этих двух изоформ триадина показал, что обе они являются результатом альтернативного сплайсинга одного гена (Thevenon et al., 2003). Кроме того, индуцируемый деполяризацией выход Са снижает экспрессию изоформы 95 кДа и не влияет на экспрессию изоформы 51 кДа, что позволяет предположить, что именно I изоформа 95 кДа участвует в регуляции процесса высвобождения Са из полостей CP (Rezgui et al., 2005). Из быстрых скелетных мышц крысы были выделены две новые изоформы триадина с молекулярными массами 32 и 49 кДа. Эти изоформы экспрессируются и в быстрых, и в медленных скелетных мышцах, но в быстрых мышцах скорость их экспрессии много больше. Характерной особенностью этих изоформ является то, что ни одна из них не локализуется в области триад и, следовательно, по-видимому, не участвует в процессах электромеханического сопряжения и открытия кальциевых каналов (Vassilopoulos et al., 2005).

В то же время, с богатым положительно заряженными аминокислотными остатками С-концевым доменом триадина, локализованным внутри ретикулума, связывается основной Са-связывающий белок CP кальсеквестрин, который в результате такого взаимодействия оказывается в непосредственной близости от RyR (Mackrill, 1999). Люминальный домен триадина содержит множественные повторы Lys и Glu, организованные в КЕКЕ-мотивы. Подобный мотив содержится и в кальсеквестрин-связывающем домене, состоящем из 25 аминокислотных остатков (Kobayashi et al., 2000). Вместе с тем, триадин способен связывать богатый гистидином Са-связывающий белок СР. В люминальной части молекулы был локализован КЕКЕ-мотив, видимо, участвующий в связывании этого белка (Lee et al., 2001). Именно кальсеквестрину и другим Са-связывающим белкам, локализованным внутри полостей ретикулума, и их роли в регуляции Са-каналов уделяется в последнее время пристальное внимание исследователей.

Кальсеквестрин представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 63 кДа, способный связывать до 40-50 моль Ca /моль белка с низким сродством (K¿ » 1 мМ) и освобождать его в каждом цикле сокращение-расслабление (Yano, Zarain-Herzberg, 1994).

Кальсеквестрин содержится в полостях терминальных цистерн, образуя в них сетчатые структуры (Yano, Zarain-Herzberg, 1994). Олигомеризация кальсеквестрина обусловлена концентрацией свободного Ca . При концентрации Са2+ около 1 мМ и выше кальсеквестрин представляет собой высокоструктурированный олигомерный комплекс. При снижении концентрации Са2+ ниже 1 мМ структурные перестройки в молекуле кальсеквестрина приводят к его диссоциации (Beard et al., 2005).

Кальсеквестрин представляет собой довольно кислый белок, представленный рядом изоформ. В настоящее время известны скелетная и сердечная изоформы белка, имеющие 68% идентичности. Различные изоформы отличаются и по участкам фосфорилирования. Общим участком ф о сформирования кальсеквестрина казеинкиназой II является положение Thr253. Вместе с тем, скелетная изоформа кальсеквестрина содержит участок фосфорилирования в положении Thr353, а сердечная - Thr378 и Thr385, причем сердечная изоформа фосфорилируется с более высокой стехиометрией и в 50 раз быстрее (Cala, Jones, 1991).

Кальрстикулин также локализован внутри везикул СР. Он представляет собой кислый (pi = 4,7) Са-связывающий белок с молекулярной массой 55 кДа. Синтез его осуществляется в ответ на истощение внутриклеточной концентрации Са2+. Кальретикулин имеет два участка связывания для Са2+, обладающих разным сродством (Kd = 2,5 мМ и 250 мкМ соответственно) (Coppolino, Dedhar, 1998). N-Концевой домен молекулы содержит участок фосфорилирования. Показано, что кальретикулин коэкспрессируется совместно с изоформой Ca

АТРазы SERCA2b (Camacho, Lechleiter, 1995). Кальретикулин способен модулировать функцию интегринов в плазмалемме и факторы транскрипции в ядре, а так же обладает функцией шаперона в эндоплазматическом ретикулуме (Krause, Michalak, 1997). Кальретикулин может взаимодействовать с 30 кДа мембранным белком CP, который, предположительно, осуществляет л I заякоривание кальретикулина в местах выделения Ca (Burns, Michalak, 1993).

Саркалюменин - Са-связывающий белок CP, локализованный в основном внутри продолговатых трубочек CP и связывающий до 35 моль Ca на моль белка (Leberer et al., 1990). В организме саркалюменин существует в виде двух изоформ (55 кДа и 130 кДа), по видимому, являющиеся результатом альтернативного сплайсинга одного гена. Константа связывания кальция саркалюменином зависит от ионной силы: в присутствии 20 мК KCl Kj составляет 300 мкМ и 600 мкМ в присутствии 150 мМ KCl. Этот белок находится в непосредственной близости от Са-АТРазы и, очевидно, вовлекается в связывание ионов Са2+, закачиваемых в полость ретикулума Са-АТРазой в процессе мышечного расслабления (Froemming, Ohlendieck, 1998).

Богатый гнстнднном Са-связывающий белок - внутрилюминальный высокомолекулярный (165 кДа) Са-связывающий белок, связывающий Ca с высокой емкостью и низким сродством, представлен в ретикулуме олигомерными комплексами, которые, как предполагается, более чем пентамеры (Suk et al., 1999). При повышении концентрации Ca эти олигомерные комплексы диссоциируют на более мелкие структуры - димеры и тримеры, с образованием менее упорядоченных структур.

Выше уже упоминалось о том, что богатый гистидином Са-связывающий белок может связываться с триадином и в таком виде участвовать в регуляции выхода Ca из СР. Однако данные об особенностях образования комплекса этих белков весьма противоречивы. С использованием мягкого трипсинолиза была показана совместная локализация богатого гистидином Са-связывающего белка и люминального домена триадина (Sacchetto et al., 2001).

Фосфоламбан - трансмембранный белок с молекулярной массой около 6 кДа, экспрессирующийся в сердце и медленных скелетных мышцах (Simmerman,

Jones, 1998). В свободном виде он существует в мембране ретикулума в виде пентамеров. N-Конец фосфоламбана обращен в цитоплазму и содержит положительно заряженные аминокислоты, в результате чего N-концевые домены мономеров фосфоламбана отталкиваются друг от друга. Кроме того, в цитоплазматическом домене находятся остатки Serl6 и Thrl7, являющиеся мишенями протеинкиназ.

Сарколнпин - 31 членный протеолипид с молекулярной массой 6 кДа, экспрессирующийся в основном в быстрых скелетных мышцах (Odermatt et al., 1998). Сарколипин обладает сходным строением с фосфоламбаном и локализуется в мембранах CP совместно с Са-АТРазой.

Джанктнн - гомологичный триадину 26 кДа трансмембранный белок CP (Mitchell et al., 1988). Показано, что в CP кардиомиоцитов он связывает кальсеквестрин (Jones et al., 1995). Джанктин непосредственно может взаимодействовать с кальсеквестрином, триадином и рианодиновым рецептором. Люминальный домен джанктина, подобно триадину, обогащен заряженными аминокислотами, организованными в КЕКЕ-мотивы, ответственные за белокбелковые взаимодействия в комплексе джанктин-триадин-кальсеквестрин

2+ рианодиновый рецептор, необходимые для регулирования выхода Ca (Zhang et al., 1997).

II.7. РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА.

Как уже отмечалось выше, саркоплазматический ретикулум является важнейшим внутриклеточным компартментом, отвечающим за регулирование обмена Ca и осуществление процесса мышечного сокращения. Очевидно, что процессы высвобождения ионов Ca из полостей ретикулума и их последующей аккумуляции обратно должны быть тонко отрегулированы. В осуществлении регуляции функционирования основных белковых компонентов,

2+ осуществляющих высвобождение и закачку Ca , принимает участие большое количество различных веществ, как низкомолекулярных, так и крупных белков и их комплексов.

В настоящее время известно большое количество низкомолекулярных лигандов, способных модулировать активность кальциевого канала СР. Так, RyR

2+ может активироваться микромолярными концентрациями Ca , адениловыми нуклеотидами, кофеином, рианодином (в наномолярных концентрациях), ионами тяжелых металлов, окисленным глутатионом, перекисью водорода и другими модификаторами SH-групп. Ингибиторами Са-каналов являются Ca и

Mg (в миллимолярных концентрациях), рутениевый красный, рианодин (в микромолярных концентрациях), лактат и вещества, восстанавливающие дисульфидные связи в белках (Favero, 1999)

2+

Зависимость активности рианодинового рецептора от концентрации Ca имеет вид колоколообразной кривой с максимумом в области 100 мкМ Ca2+(Meissner, 1986).

2+

Ca -индуцируемый выброс Ca активируется миллимолярными концентрациями ATP (Meissner, 1986). Кроме АТР, активирующим эффектом обладают и другие адениловые нуклеотиды (ATP, ADP, AMP, сАМР аденозин, аденин). Активация канала осуществляется за счет связывания нуклеотидов в регуляторных участках (Michalak et al., 1988).

Предполагается, что in vivo основным физиологическим регулятором активности Са-каналов является не ATP, a Mg2+-ATP. Внесение Mg2+ и АТР в концентрациях, близких к физиологическим (5 мМ АТР и Mg2+ и дополнительно о i

700 мкМ свободного Mg ) оказывало стимулирующий эффект при индукции выброса Са2+ микромолярными концентрациями Са2+, что свидетельствует о существовании регуляторного участка, при связывании в котором Mg2+-ATP Са-канал становится более чувствительным к активации более низкими концентрациями Са2+ (Meissner, 1986).

Особый интерес представляет вопрос о регулировании активности RyR при помощи белок-белковых взаимодействий, а так же путем активации различных протеинкиназ.

Молекула RyR является мишенью для большого числа различных протеинкиназ. Установлено, что изоформы RyRl и RyR2 фосфорилируются протеинкиназами А, С, G и Са/СаМ-зависимой протеинкиназой (Strand et al.,

1993, Беге, 2006).

Фосфорилирование сердечной изоформы рианодинового рецептора (ЯуЯ2) протеинкиназами А, С и Э увеличивает уровень связывания рианодина, в то время как фосфорилирование Са/СаМ - зависимой протеинкиназой - снижает (Takasago е1 а1., 1991). Поскольку рианодин связывается только с открытой формой Са-канала, то можно говорить о регуляторной роли фосфорилирования изоформы Яу112 разными протеинкиназами. Тем не менее, ряд данных указывает на то, что Са/СаМ - зависимое фосфорилирование ЯуЯ2 не только не снижает активности Са-канала, но наоборот увеличивает ее. Так, встроенный в плоский фосфолипидный бислой КуЯ2 активировался при фосфорилировании как эндогенной, так и экзогенной Са/СаМ-зависимой киназой (\Vitcher е1 а1., 1992). С использованием сайт-специфического мутагенеза был выявлен участок фосфорилирования Са/СаМ-зависимой протеинкиназы, отличный от сайта протеинкиназы А. Фосфорилирование по этому участку увеличивало чувствительность Яу112 к Са2+. Кроме того, было показано, что Са/СаМ-зависимая протеинкиназа активируется при увеличении частоты сердечных сокращений, когда возникает необходимость стимулировать Са-индуцируемое освобождение Са2+ из полостей СР (\Vehrens е1 а1., 2004). Возможно, это противоречие можно объяснить наличием в молекуле К.уЯ2 двух или более участков фосфорилирования для Са/СаМ-зависимой протеинкиназы, один из которых совпадает с участком фосфорилирования сАМР-зависимой протеинкиназой, а другой (другие) является уникальным. При этом фосфорилирование по разным участкам может сопровождаться различными эффектами.

На изолированных кардиомиоцитах показано, что фосфорилирование ЯуЯ2 протеинкиназой А усиливается в присутствии Р-адренергического агониста изопротеренола и блокируется пропранололом, т. е. данный эффект осуществляется через Р-адренергические рецепторы. Следовательно, положительный инотропный эффект Р-адренергических агонистов может включать сАМР-зависимое фосфорилирование сердечной изоформы ЯуЯ (УозЫёа е1 а1., 1992).

Протеинкиназа А осуществляет фосфорилирование RyR2 по двум участкам: Ser2030 и Ser2808, причем Ser2030 является более высококонсервативной мишенью для протеинкиназы А. Фосфорилирование по этому участку более чувствительно к p-адренергической стимуляции изопротеренолом, а также к специфическим ингибиторам протеинкиназы А. Кроме того, Ser2808, в отличие от Ser2030 стехиометрически фосфорилировался cGMP - зависимой протеинкиназой (Xiao et al., 2006).

Изменение стехиометрии фосфорилирования RyR2 протеинкиназой А по остатку Ser2808 может сопровождаться интересными эффектами. Показано, что физиологический уровень фосфорилирования остатка Ser2808 в молекуле RyR2 составляет около 75%. При таком уровне фосфорилирования Са-канал функционирует в обычном режиме и регулируется взаимодействием с различными лигандами. Однако при увеличении уровня фосфорилирования Ser2808 протеинкиназой А до 100% наступает резкое увеличение Са2+-проводимости канала за счет увеличения времени его закрытия. Этот эффект нивелируется активацией протеинфосфатазы 1, вероятно, снижающей уровень фосфорилирования Ser2808 (Carter et al., 2006).

Функциональное значение фосфорилирования RyRl различными протеинкиназами пока окончательно не установлено. В Са-каналах скелетных мышц, встроенных в липидные бислои, под действием эндогенного фосфорилирования (главным образом, Са/СаМ-зависимой протеинкиназой) увеличивалась вероятность перехода канала в открытое состояние и возрастала чувствительность к Са2+ и АТР. Этот эффект устранялся под действием фосфатазы 2А (Hermann-Frank et al., 1991). Недавно было обнаружено, что инкубация встроенных в липидные бислои везикул тяжелого CP скелетных мышц в присутствии АТР в течение 5-8 минут приводит к необратимой активации Са-каналов за счет их фосфорилирования эндогенными протеинкиназами, причем в результате такого фосфорилирования чувствительность Са-каналов к АТР, аденозину и Са2+ снижается (Dulhunty et al., 2001). Ингибиторный анализ и использование специфических антител показали, что фосфорилирование RyR обеспечивается эндогенной Са/СаМ-зависимой протеинкиназой II, которая локализована в мембранах CP вблизи Са-каналов.

Как уже отмечалось выше, рианодиновый рецептор является центром массивного макромолекулярного комплекса, включающего в себя большое количество регуляторных белков. В этот комплекс входят как белки, взаимодействующие с цитоплазматической частью молекулы RyR, так и трансмембранные и внутрилюминальные белки CP (кальсеквестрин, кальмодулин, кальстабин 2, сорцин, триадин, джанктин, протеинкиназы А и С, шАКАР, богатый гистидином Са-связывающий белок и т.д.) (Bers, 2004).

В скелетных мышцах RyR формирует устойчивый комплекс с триадином, джанктином и кальсеквестрином. При этом каждый из белков имеет участки связывания с другими участниками комплекса. Триадин непосредственно взаимодействует со второй люминальной петлей RyR. Входящие в ее состав остатки Asp4878, Asp4907 и Glu4908 взаимодействуют с КЕКЕ-мотивом триадина (Lee et al., 2004).

Цитоплазматический домен триадина обладает свойствами глутатионтрансферазы (Colpo et al., 2001). Учитывая то, что RyR обладает высокой чувствительностью к окислительно-восстановительному потенциалу в клетке, который поддерживается, главным образом, за счет баланса окисленной и восстановленной форм глутатиона, можно предположить, что триадин способен модулировать активность Са-канала путем обратимого окисления и/или восстановления тиоловых групп глутатиона. Необходимо так же отметить, что цитоплазматический домен триадина является мишенью эндогенной Са/СаМ-зависимой протеинкиназы, что, возможно, так же является одним из путей модуляции активности RyR (Colpo et al., 2001).

Кальсеквестрин может взаимодействовать как с триадином, так и непосредственно с молекулой RyR. Этот белок играет роль внутриклеточного кальциевого сенсора RyR. При концентрации Са в ретикулуме более 4 мМ кальсеквестрин диссоциирует от мембраны ретикулума. При более низких концентрациях он связывается с молекулой RyR, ингибируя ее активность (Beard et al., 2004).

Очищенная сердечная изоформа рианодинового рецептора (RyR2), реконструированная в мембрану, не реагировала на изменение концентрации Са2+ с люминальной стороны молекулы с 20 мкМ до 5 мМ (вубгке е1 а1., 2004). Добавление кальсеквестрина с люминальной стороны Са-канала не изменяло активности ЯуЯ, но восстанавливало его способность реагировать на люминальный Са2+. При добавлении к очищенному и реконструированному ЯуЯ триадина и джанктина открытое состояние канала стабилизировалось, но Са-чувствительность канала отсутствовала. После ассоциации со всеми тремя белками активность ЯуЯ значительно повышалась при увеличении концентрации люминального Са2+ (вубгке е1 а!., 2004). Таким образом, кальсеквестрин играет, по видимому, роль сенсора, «чувствующего» Са и ингибирующего ЯуЯ при низком значении люминального кальция, а триадин и джанктин могут быть необходимыми посредниками, осуществляющими заякоривание кальсеквестрина у молекулы Са-канала и модулирующими их взаимодействие.

Стимуляция выхода Са2+ из ретикулума различными агонистами ЯуЯ приводит к быстрому увеличению концентрации свободного Са внутри СР, который затем выходит в цитоплазму через Са-каналы. Этот Са освобождается кальсеквестрином, что говорит о взаимодействии ЯуЯ2 и этого белка. Удаление

9+ кальсеквестрина устраняет такие изменения уровня Са внутри СР, а его суперэкспрессия в кардиомиоцитах мыши в 10 раз увеличивает количество высвобождаемого из

СР Са2+ (МаскгШ, 1999).

Кальсеквестрин имеет несколько участков фосфорилирования протеинкиназами и находится в СР в фосфорилированном состоянии. Считалось, что фосфорилирование необходимо для нормальной посттрансляционной модификации (гликозилирования) этого белка и его адресной доставки в терминальные цистерны СР, но не играет существенной роли в его взаимодействии с ЯуЯ. Однако мутантные формы кальсеквестрина, лишенные участков фосфорилирования, также обнаруживаются в области контактной зоны мембран СР (Herzog е1 а1., 2000). Более того, было установлено, что активацию ЯуЯ обеспечивает только дефосфорилированная форма кальсеквестрина, причем для полумаксимальной активации ЯуЯ достаточно дефосфорилирования всего 1% этого белка, имеющегося в области контактной зоны мембран СР (Szegedi е1 al., 1999; Herzog et al., 2000). Таким образом, именно фосфорилирование-дефосфорилирование кальсеквестрина играет важнейшую роль в регуляции функциональной активности Са-каналов СР.

Кроме вышеперечисленных, в регуляции активности RyR2 в сердце участвует еще ряд белков. В частности, в состав мультиферментного комплекса Са-канала CP кардиомиоцитов входит белок кальстабин (12,6-kDa FK506-binding protein). Этот белок с молекулярной массой 12,6 кДа представляет собой пептидилпролил-цис/транс-изомеразу и стабилизирует закрытое состояние RyR2. В молекуле кальстабина содержится остаток Asp37, являющийся ключевым для ассоциации кальстабина и RyR2 (Huang et al., 2006). Кальстабин может служить высокочувствительным сенсором уровня фосфорилирования RyR2 по остатку Ser2808. Как уже упоминалось выше, фосфорилирование Ser2808 более чем на 75% приводит к серьезному нарушению активности Са-канала. В частности, такое состояние наблюдается при ряде сердечных патологий. Гиперфосфорилирование RyR2 протеинкиназой А по остатку Ser2808 приводит к снижению сродства к кальстабину и его диссоциации из макромолекулярного комплекса RyR2, что, видимо, и приводит к нарушению закрывания Са-канала (Wehrens et al., 2004). Однако необходимо отметить, что есть данные, показывающие, что кальстабин может связываться и с фосфорилированным по остатку Ser2808 RyR2 (Xiao et al., 2004). Недавно появились данные о том, что в гладкой мускулатуре кальстабин может модулировать активность RyR путем взаимодействия с фосфатазой кальцинейрином (Macmillan et al., 2007).

Помимо кальсеквестрина внутри CP скелетных мышц присутствуют еще два высокомолекулярных Са-связывающих гликопротеина - саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок (Mackrill, 1999). Фосфорилирование этих белков эндогенными протеинкиназами ингибирует активность RyRl (Shoshan-Barmatz et al., 1996; Orr, Shoshan-Barmatz, 1996). Кроме того, было показано, что богатый гистидином Са-связывающий белок может фосфорилироваться заякоренной на внешней поверхности мембраны Са\СаМ-киназой и не фосфорилируется люминальной казеинкиназой II (Sacchetto et al.,

2001). Впрочем, последнее утверждение по меньшей мере спорно, так как имеется достаточно данных о том, что люминальная казеинкиназа II осуществляет фосфорилирование богатого гистидином Са-связывающего белка (Shoshan-Barmatz et al., 1996; Shoshan-Barmatz, Ashley, 1998).

Еще одним белком, осуществляющим модуляцию активности Са-канала кардиомиоцитов CP, является сорцин. Он представляет собой 22 кДа Са-связывающий белок, структурно родственный кальмодулину и кальпаину и локализованный в области цитоплазматического домена RyR2 (Meyers et al., 1995). Сорцин обладает выраженным ингибирующим эффектом на открытие канала. Кроме того, он полностью ингибирует связывание рианодина. Фосфорилирование сорцина протеинкиназой А значительно снижало способность сорцина к модуляции RyR2. Таким образом, сорцин может регулировать функции RyR2 в клетке и уровень его регуляторной способности изменяется под воздействием сигнальных путей, увеличивающих активность протеинкиназы A (Lokuta et al., 1997).

Активность Са-АТРазы - другого важнейшего компонента CP, осуществляющего аккумуляцию Са2+ в полости ретикулума, также регулируется целым рядом различных механизмов.

Способность АТР активировать Са-АТРазу обсуждалась выше. Кроме того, специфическим ингибитором Са-АТРазы является растительный лактон тапсигаргин. Модулировать активность Са-АТРазы могут продукты гликолиза. Показано, что фруктозо-1,6-бисфосфат может стимулировать активность Са-АТРазы в кардиомиоцитах (Cai et al., 2006).

Обработка саркоплазматического ретикулума фосфолипазами или экстракция липидов детергентами приводит к обратимой инактивации Са-АТРазы (Рэкер, 1979). Для восстановления активности Са-АТРазы необходимо, что бы с одной молекулой фермента было ассоциировано не менее 30 молекул фосфолипидов (De Meis, Inesi, 1982). Поскольку для восстановления активности Са-АТРазы могут быть использованы не только фосфолипиды, но и различные неионные детергенты (Melgunov, Akimova, 1980), было высказано предположение, что липиды необходимы для создания гидрофобного окружения трансмембранного домена молекулы фермента; кроме того, важную роль играет взаимодействие полярных групп фосфолипидов с полярными доменами молекулы фермента на границе раздела липид-вода (Lee et al., 1995).

Однако липиды мембран CP могут играть не только структурную, но и регуляторную роль. Отрицательно заряженные фосфолипиды (фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол) способны активировать гидролиз АТР и аккумуляцию Са2+ за счет уменьшения обратного выхода кальция из везикул CP в процессе работы Са-АТРазы (Szymanska et al., 1991; Dalton et al., 1999). Кроме того, было установлено, что активность Са-АТРазы зависит от толщины липидного бислоя и его структурного состояния. Активность Са-АТРазы существенно снижается, когда микровязкость фосфолипидного бислоя увеличивается, а для проявления максимальной активности Са-АТРазы необходимо, чтобы липиды находились в «жидком» состоянии и не ограничивали конформационную подвижность молекулы фермента (Starling et al., 1995).

Одним из главных путей регуляции активности разных изоформ Са-АТРазы являются белок-белковые взаимодействия. К ним можно отнести как взаимодействия молекул Са-АТРазы в составе олигомерных комплексов, так и взаимодействия Са-АТРазы с регуляторными белками (Andersen, 1989; Shorina et al., 1997).

С использованием ряда сшивающих агентов было показано, что Са-АТРаза в мембранах CP присутствует как в виде димеров, так и тетрамеров (Napier et al., 1987). Однако после реконструкции Са-АТРазы в везикулы с избыточным содержанием липидов уровень образования сшивок сильно снижался. Это можно объяснить тем, что степень олигомеризации Са-АТРазы прямо зависит от частоты случайных столкновений молекул белка в мембране (Andersen, 1989). Однако детальный анализ олигомерной организации разных изоформ Са-АТРазы показал, что фермент в мембранах CP находится в основном в виде олигомерных комплексов (Harmon et al., 2001).

На функциональную роль олигомеров Са-АТРазы в мембранах CP существует несколько точек зрения. Одно из предположений связано с возможностью стабилизации фермента в мембране за счет белок-белковых взаимодействий. С использование различных детергентов было показано, что стабильность мономерной формы фермента намного ниже, чем олигомерной (Molleretal., 1980; 1982).

Обратимая олигомеризация Са-АТРазы может являться способом модуляции ее функциональной активности (Birmachu, Thomas, 1990; Voss et al., 1994). Ряд исследований показал, что агрегация фермента, индуцированная воздействием различных агентов (тапсигаргин, фосфоламбан, мелитгин) приводит к снижению его функциональной активности (Karon et al., 1994; Voss et al., 1994; 1995).

Кроме того, возможно, что Са-АТРаза находится в мембранах CP и функционирует именно в составе олигомерных комплексов, причем взаимодействие между мономерами в составе олигомерного комплекса необходимо для нормальной регуляции и работы фермента (Harmon et al., 2001). Выше упоминалось, что дополнительная активация Са-АТРазы высокими концентрациями АТР может быть объяснена кооперативными эффектами связывания в составе олигомерного комплекса.

В регуляции активности Са-АТРазы принимают участие различные белки, как цитоплазматические, так и внутриретикулярные.

Основным регулятором Са-АТРазы в сердце и медленных скелетных мышцах (изоформа SERCA 2а) является интегральный белок мембран CP фосфоламбан. Фосфоламбан представляет собой белок с молекулярной массой около 6 кДа, состоящий из 52 аминокислот, имеющий одну трансмембранную спираль и существующий в свободном виде в виде пентамеров.

Экспрессия этого белка варьирует в широких пределах и является не только видо- , но и тканеспецифичной. Показано, что уровень экспрессии фосфоламбана у крысы значительно ниже, чем у человека. Вместе с тем, у крысы максимальный уровень экспрессии фосфоламбана наблюдался в кардиомиоцитах, в то время как содержание фосфоламбана в медленных скелетных мышцах было незначительным (Damiani et al., 2000b).

N-конец фосфоламбана экспонирован в цитоплазму и обогащен положительно заряженными аминокислотами, в результате чего N-концевые домены молекул фосфоламбана отталкиваются друг от друга. Кроме того, цитоплазматический домен фосфоламбан содержит остатки Serl6 и Thrl7, которые являются мишенями протеинкиназ. Раньше высказывалось предположение, что в дефосфорилированном состоянии мономеры фосфоламбана электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженным цитоплазматическим доменом Са-АТРазы, что приводит к ее агрегации и ингибированию. Фосфорилирование фосфоламбана по остатку Serl6 (сАМР -зависимая протеинкиназа) и Thrl7 (Са/СаМ-зависимая протеинкиназа) нивелирует избыточный положительный заряд цитоплазматических доменов фосфоламбана, молекулы фосфоламбана диссоциируют от Са-АТРазы и объединяются в пентамеры, а Са-АТРаза переходит в неагрегированное активное состояние (Simmerman, Jones, 1998). Однако в последние годы получены свидетельства того, что фосфорилирование фосфоламбана не нарушает его связи с молекулой Са-АТРазы, а регуляция объясняется конформационными перестройками в комплексе фосфоламбан-Са-АТРаза (Asahi et al., 2000). Анализ меченного флуорофором фосфоламбана показал, что как минимум трансмембранный домен остается связанным с Са-АТРазой во время всего реакционного цикла (Chen, Bigelow, 2002). Однако данные по механизму ингибирования фосфоламбаном Са-АТРазы и обращения этого процесса путем фосфорилирования очень противоречивы.

Цитозольный домен свободного фосфоламбана обладает малоупорядоченной структурой и может принимать различные конформации относительно трансмембранного домена (Li et al., 2003). Это свидетельствует о необходимости наличия в области контакта цитоплазматического и трансмембранного доменов высоколабильной области, позволяющей осуществлять структурные переходы в цитоплазматическом домене. Действительно, в области контакта трансмембранного и цитоплазматического доменов была выявлена высоколабильная петля (аминокислотные остатки с 17 по 21), содержащая в своем составе Pro 21, критичный для осуществления регуляторной функции фосфоламбана (Li et al., 2005). Связывание с Са-АТРазой стабилизирует фосфоламбан в одной конформации. По всей видимости, связанный стабилизированный фосфоламбан блокирует латеральную подвижность нуклеотид-связывающего домена Са-АТРазы, что ингибирует активность фермента (Li et al., 2004а). p-адренергическая стимуляция в сердце приводит к активации сАМР-зависимой протеинкиназы, которая фосфорилирует Serl6, что снижает ингибирующий эффект фосфоламбана. Однако данные по механизму этого процесса сильно различаются. С одной стороны, показано, что фосфорилирование свободного фосфоламбана приводит к стабилизации и компактизации цитоплазматического домена фосфоламбана, заключающейся в увеличении спирализации и образовании солевого мостика между Ser-P 16 и Argl3. Соответственно, уменьшение пространственных размеров цитоплазматического домена может снимать стерические препятствия для подвижности нуклеотидсвязывающего домена Са-АТРазы, обращая таким образом ингибиторный эффект фосфоламбана (Li et al., 2003; 2004b).

Однако в последние годы получен ряд данных, противоречащих этой модели. Так, показано, что фосфорилирование свободного фосфоламбана напротив приводит к переходу его цитоплазматического домена в более динамическую и неупорядоченную форму, сопровождающуюся частичной деспирализацией а-спирали цитоплазматического домена и распрямлением петли, связывающей его с трансмембранной областью белка (Metcalfe et al., 2005; Karim et al., 2006; Traaseth et al., 2006). По видимому, снижение ингибирующего эффекта при этом можно объяснить тем, что, теряя при фосфорилировании стабильную упорядоченную структуру цитоплазматического домена, фосфоламбан, в силу приобретенной лабильности не может уже мешать подвижности нуклеотидсвязывающего домена Са-АТРазы. В любом случае, ингибирующий эффект фосфоламбана на Са-АТРазу и обращение этого эффекта при фосфорилировании объясняется перераспределением белок-белковых контактов в белковом комплексе и изменением пространственной структуры доменов белков.

Кроме регуляторного эффекта фосфоламбана, опосредованного фосфорилированием, существует другой, независимый от фосфорилирования путь модуляции активности Са-АТРазы этим белком. При низкой концентрации

Са2+ фосфоламбан связывается с Са-АТРазой и ингибирует ее. Однако при высоких (микромолярных) концентрациях Са ингибиторный эффект исчезал, что, по-видимому, обуславливалось диссоциацией фосфоламбана из макромолекулярного комплекса (Karim et al., 2006).

Несмотря на то, что фосфоламбан не экспрессируется в быстрых скелетных мышцах, в экспериментах in vitro по совместной экспрессии белков было показано, что изоформа SERCA 1 регулируется фосфоламбаном так же, как и Са-АТРаза сердца и медленных скелетных мышц (SERCA2a). Очевидно, это объясняется высокой степенью гомологии этих изоформ (Moller et al., 1996).

В быстрых скелетных мышцах активность Са-АТРазы модулируется другим трансмембранным белком - сарколипином. Экспрессия сарколипина так же осуществляется в сердце и медленных скелетных мышцах. При помощи иммунохимического анализа показана совместная локализация сарколипина и Са-АТРазы в мембранах ретикулума (Odermatt et al., 1998). Структура и функции сарколипина во многом напоминают таковые фосфоламбана. Он, как и фосфоламбан, снижает активность Са-АТРазы, разобщая Са-насос, либо увеличивая опосредованную Са-АТРазой утечку Са2+ (Smith et al., 2002; MacLennan et al., 2003).

В последнее время детально исследованы последствия совместной экспрессии сарколипина и фосфоламбана в кардиомиоцитах. Показано, что ингибиторные эффекты этих двух белков на Са-АТРазу тесно связаны, причем сарколипин усиливает ингибиторный эффект фосфоламбана. Сарколипин может увеличивать сродство фосфоламбана к Са-АТРазе, а так же стабилизирует комплекс фосфоламбана и Са-АТРазы в присутствии высоких концентраций

2+

Са , препятствуя диссоциации фосфоламбана. В отсутствии Са-АТРазы сарколипин может непосредственно связываться с фосфоламбаном, блокируя процесс образования пентамеров фосфоламбана, что также может усиливать ингибиторный эффект фосфоламбана (Asahi et al., 2002; 2004).

Са-АТРаза, фосфоламбан и сарколипин образуют в мембране саркоплазматического ретикулума макромолекулярный комплекс. Мутационный анализ показал, что и фосфоламбан, и сарколипин связываются с одними и теми же аминокислотами Са-АТРазы. Вместе с тем, мутации в фосфоламбане были более критичны для функционирования Са-АТРазы, чем мутации в сарколипине, что подтверждает приоритет фосфоламбана в образовании комплекса с Са-АТРазой. При образовании тройного комплекса происходит первичное образование гетеродимера фосфоламбана и сарколипина, который затем связывается с Са-АТРазой (Asahi et al., 2003).

В ответ на стимуляцию изопротеренолом сарколипин кардиомиоцитов может подвергаться фосфорилированию под действием Ser/Thr-киназы 16, что снижает ингибирование Са-АТРазы в сердце трансгенной линии мышей с нокаутом гена фосфоламбана. С использованием сайт-направленного мутагенеза было показано, что специфической мишеныо этого фосфорилирования является Thr5 сарколипина. Таким образом, можно говорить о том, что сарколипин является функциональным гомологом фосфоламбана (Gramolini et al., 2006).

В модуляции активности Са-АТРазы могут принимать участие и цитозольные ферменты, а также изменение цитоархитектуры в клетке. Было показано, что высокое соотношение ATP/ADP, необходимое для нормального функционирования Са-насоса, может поддерживаться разными путями. Одним из них может являться непосредственное поступление нуклеотидов из митохондрий. Сближение митохондрий и трубочек саркоплазматического ретикулума может осуществляться путем регулируемого изменения цитоархитектуры в клетке (Wilding et al., 2006). Другим путем локального увеличения концентрации АТР вблизи Са-АТРазы может являться креатинкиназа, катализирующая фосфатный обмен между ADP и фосфокреатином и заякоренная на поверхности мембран CP в непосредственной близости от Са-АТРазы (Korge et al., 1993; Wilding et al., 2006). Показано, что креатинкиназа может входить в состав тройного комплекса с гликогенфосфорилазой и Са-АТРазой. По-видимому, такой комплекс может играть существенную роль в регуляции процессов гликогенолиза в непосредственной близости от СР. Роль Са-АТРазы в таком комплексе пока непонятна (Field et al., 2006).

Интересно отметить, что креатинкиназа претерпевает существенные изменения при гибернации. В мышцах суслика Spermophilus richrdsonii ее активность во время спячки снижается на 20%, а содержание mRNA - на 70%. Кроме того, существенно снижается сродство к АТР и креатину. Уровень фосфорилирования белка также претерпевает существенные изменения: у летних активных сусликов фермент присутствует в виде смеси фосфорилированной и дефосфорилированной форм, в то время как мышцы гибернирующего животного содержат только фосфорилированную форму фермента (Abnous et al., 2008).

Хотелось бы отметить, что процесс гибернации часто сопровождается изменениями в уровне активности и синтеза различных протеинкиназ и протеинфосфатаз. Анализ свойств протеинкиназы В из скелетных мышц и печени суслика Spermophilus richardsonii показал, что ее активность во время спячки снижается на 60 - 65 % от уровня активности киназы у летнего бодрствующего животного. Общее содержание белка зимой и летом не различается, однако фосфорилирование по остатку Ser473 снижается на 40% в мышцах и не изменяется в печени. Анализ изозимного состава белка в мышцах показал, что у активных животных присутствуют 3 формы белка, отличающиеся уровнем фосфорилирования, а у гибернирующих сусликов таких форм присутствует только две (Abnous et al., 2008).

Активность Са-АТРазы может непосредственно модулироваться протеинкиназами. Фосфорилирование Са-АТРазы сердца и медленных скелетных мышц (SERCA2) Са/СаМ-зависимой протеинкиназой II почти в два раза увеличивает активность Са-АТРазы (Hawkins et al., 1994). Фосфорилирование Са-АТРазы происходит по остатку Ser38 (Toyofuku et al., 1994). В нативном работающем сердце около 20% белка Са-АТРазы находится в фосфорилированном состоянии (Xu et al., 1999). Очевидно, фосфорилирование Са-АТРазы сердца является важным физиологическим механизмом регуляции функциональной активности этого фермента.

В препаратах ретикулума скелетных мышц крысы был идентифицирован а-Кар белок с молекулярной массой около 25 кДа, который заякоривает Са/СаМ-зависимую протеинкиназу на мембране CP (Damiani et al., 2000a). Этот белок является альтернативным некиназным продуктом гена мозговой а-СаМ киназы (Bayer et al., 1998). Это позволяет предположить, что протеинкиназы участвуют в регуляции активности Са-АТРазы и в скелетной мускулатуре.

Интересно отметить, что функционирование Са-АТРазы и Са-каналов в мембранах CP может быть определенным образом синхронизировано, хотя эти белки локализованы в разных, пространственно удаленных друг от друга компартментах СР. Так, было обнаружено, что при активации Са-каналов CP наблюдаются значительные изменения конформации молекулы Са-АТРазы, которая, вероятно, получает определенный сигнал из терминальных цистерн (Meszaros et al., 1987). Наиболее вероятными кандидатами, участвующими в передаче такого сигнала из терминальных цистерн CP (где находятся Са-каналы) на продолговатые трубочки CP (где в основном локализована Са-АТРаза), являются Са-связывающие белки кальсеквестрин, кальретикулин и саркалюменин, которые локализованы вместе с Са-каналами и Са-АТРазой в различных областях CP (Leberer et al., 1990; Koyabu et al., 1994; Yano, Zarain-Herzberg, 1994; Shoshan-Barmatz et al., 1996).

II.8. ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА ЖИВОТНЫХ-ГИБЕРНАТОРОВ

Очевидно, что при гибернации, сопряженной со значительными перестройками метаболизма, заметные изменения должны происходить и в саркоплазматическом ретикулуме. В настоящее время получены некоторые данные по этому поводу, но в целом этот вопрос исследован далеко не в полной мере.

Известно, что помимо участия в электромеханическом сопряжении Са-каналы и Са-АТРаза CP могут принимать участие и в несократительном термогенезе. Одновременная работа Са-каналов, высвобождающих ионы Са2+ из полостей саркоплазматического ретикулума, и Са-АТРазы, закачивающей ионы обратно, образует футильный цикл, приводящий к гидролизу АТР и продукции тепла. Подобный процесс наиболее наглядно представлен в «нагревательном органе» рыб семейств марлиновых ('Istiophoridae) и скумбриевых (Scombridae) (Block, 1994).

Участие такого футильного цикла в термогенезе млекопитающих исследовано недостаточно. Однако есть ряд указаний, что подобный процесс может включаться при пробуждении гибернирующего животного. Бурый жир, хорошо развитый у всех гибернаторов, осуществляет разогревание в основном мозга и сердца. Вместе с тем, до 70% тепла выделяется в скелетных мышцах. В процессе пробуждения от спячки в начале процесса сразу же резко повышается электрическая активность в двигательных нервах, иннервирующих скелетные мышцы, но это не сопровождается мышечными сокращениями (Lyman, 1982). В связи с тем, что нервная стимуляция приводит к активации Са-каналов, можно предположить, что при низких температурах тела футильный цикл участвует в несократительном термогенезе. По достижении телом определенной температуры включается процесс сократительного термогенеза, обусловленный участием белков сократительного аппарата.

Данные, полученные с использованием флуоресцентных зондов показали, что свойства фосфолипидного бислоя CP спящих и активных сусликов отличаются. У спящих животных микровязкость мембран саркоплазматического ретикулума уменьшается, а гидрофобный объем возрастает (Малышева и др., 2001). Эти изменения, возможно, связаны с различиями в белковом составе мембран CP либо с изменением соотношения белок/фосфолипид в CP зимних и летних животных. Кроме того, снижение микровязкости мембран спящих животных может быть объяснено накоплением в мембранах полиненасыщенных жирных кислот, что является необходимым условием выживания животных во время зимней спячки (Пантелеев, 1983).

Белковый состав мембран саркоплазматического ретикулума также претерпевает значительные изменения, касающиеся в основном изменения в соотношении белковых компонентов мембран. В частности, CP сердца гибернирующих сусликов имеет необычно высокое число кальциевых каналов, связывание рианодина с которыми активируется только высокими концентрациями Са2+, что крайне необычно для сердечной изоформы рианодинового рецептора и гораздо ближе к параметрам скелетной изоформы Са-канала (Milner et al., 1991). Возможно, это объясняет нетипичный характер электромеханического сопряжения в сердце гибернаторов, где выход Са2+ из саркоплазматического ретикулума играет основную роль в сокращении (Копс1о, 8ЫЬа1а, 1984).

В препаратах СР спящих сусликов уменьшается содержание белков с молекулярными массами 450 кДа, 350 кДа (рианодиновый рецептор и его протеолитический фрагмент), 205 кДа (тяжелые цепи миозина), 165 кДа (богатый гистидином Са-связывающий белок), 130 кДа (саркалюменин) и 63 кДа (кальсеквестрин) белков; в то же время, содержание белковых полос с молекулярными массами 80, 72, 55, 45, 30 и 22 кДа увеличивается (Малышева и др., 2001; ЯиЫзоу, 2001).

Анализ белкового состава мембран саркоплазматического ретикулума сердца гибернаторов (суслики БрегторИИш пскаЫзопи и БреппорИИш со1итЫапи£) показал, что в них присутствует специфическая изоформа Са-связывающего белка ретикулума кальсеквестрина (МПпег е1 а1., 1991). Некоторые свойства этого белка отличают его от других изоформ млекопитающих: он обладает уникальной элекгрофоретической подвижностью при электрофорезе в щелочной и нейтральной среде, которая соответствует кажущейся молекулярной массе 48,5 кДа и 58 кДа соответственно, что отличает его от всех известных изоформ кальсеквестрина из скелетных мышц (42 кДа и 63 кДа) и сердца (46 кДа и 55 кДа) других млекопитающих. Кроме того, он отличается от других изоформ кальсеквестрина по степени и типу гликозилирования.

В нашей лаборатории было обнаружено, что в СР скелетных мышц суслика БрегторИНш ипйиШш присутствуют специфические изоформы саркалюменина и богатого гистидином Са-связывающего белка, отличающиеся по своим размерам от изоформ, встречающихся в СР скелетных мышц кролика и крысы (Шутова и др., 1999).

Активность Са-АТРазы СР скелетных мышц гибернирующего хомяка

СпсеШ спсеШ увеличивалась в процессе спячки. При этом скорость 2+ аккумуляции Са и уровень его накопления увеличивались, но сродство Са

1 2+

АТРазы к Са падало, что, на фоне неизменной скорости гидролиза АТР свидетельствовало об увеличении эффективности сопряжения гидролиза субстрата и транспортной функции фермента (Agostini et al., 1991). Интересно отметить, что подобные изменения наблюдались и у активных, не впавших в

2+ спячку зимних животных. Такой характер изменения метаболизма Ca в корне отличается от изменений, затрагивающих кальциевый обмен в кардиомиоцитах, где при отсутствии глубокой спячки все адаптационные изменения возвращаются к норме (Belke et al., 1987).

Анализ функциональных характеристик Са-АТРазы мембран СР скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus показал, что удельная активность Са-АТРазы в скелетных мышцах гибернирующего животного составляет только около 50% от активности в мышцах бодрствующего животного (Малышева и др., 2001). Снижение активности Са-АТРазы, проходящее в осенний период, сохраняется в течение всей зимы вне зависимости от уровня физиологической активности животного, что хорошо согласуется с вышеизложенными данными. Содержание Са-АТРазы в препаратах гибернирующих животных снижено только на 10%, что не может объяснить столь значительное падение активности фермента (Малышева и др., 2001; Rubtsov, 2001). Снижение активности Са-АТРазы СР при гибернации может быть связано с изменением характера взаимодействия молекул фермента в мембранах. Известно, что при гибернации в мембранах эндоплазматического ретикулума клеток нервной ткани наблюдается значительное латеральное разделение мембранных компонентов. При этом белки мембран агрегируют, образуя тесные скопления, и в мембране появляются значительные по площади участки, свободные от белков (Azzam et al., 2000). Возможно, что причиной изменения активности Са-АТРазы является изменение взаимодействия фермента с регуляторными белками саркоплазматического ретикулума, содержание которых при гибернации значительно изменяется (Малышева и др., 2001).

У холодоустойчивой лягушки Rana sylvatica зависимость активности Са-АТРазы скелетных мышц от концентрации АТР и Са2+ описывается стандартной кинетикой Михаэлиса-Ментен. По сравнению с Са-АТРазой СР других животных, первичная структура этого фермента содержит всего 7 аминокислотных замен, три из которых находятся в АТР-связывающем домене.

Поскольку аминокислоты, располагающиеся в этих участках, консервативны в Са-АТРазе большинства видов животных, предполагается, что именно эти замены приводят к изменению белок-белковых взаимодействий в составе олигомерных комплексов Са-АТРазы, вследствие чего не наблюдается дополнительной активации этого фермента высокими концентрациями АТР (Dode et al., 2001).

Подобный тип зависимости активности Са-АТРазы от концентрации АТР демонстрирует и Са-АТРаза CP скелетных мышц гибернирующего суслика Spermophilus undulatus (Malysheva et al., 2001).

Отсутствие дополнительной активации АТРазы высокими концентрациями АТР так же описано для Na,К-АТРазы скелетных мышц гибернирующего суслика Spermophilus lateralis (MacDonaldet, Storey, 1999). Активность этого фермента была в три раза ниже, чем у летних активных животных. Предполагается, что причиной изменения кинетических параметров №,К-АТРазы скелетных мышц гибернирующего суслика является фосфорилирование этого фермента протеинкиназами.

Недавно были получены данные, позволяющие предполагать, что активность Са-АТРазы CP скелетных мышц при гибернации может регулироваться посредством фосфорилирования/дефосфорилирования фермента и/или регуляторных белков при участии эндогенных протеинкиназ и протеинфосфатаз. Так, в экспериментах на гомогенатах скелетных мышц суслика Spermophilus richardsonii было установлено, что в условиях активации эндогенных протеинкиназ и ингибирования протеинфосфатаз наблюдается значительное увеличение активности Са-АТРазы CP, наиболее выраженное для гибернирующих животных (K.B.Storey, персональное сообщение). В то же время, активация эндогенных протеинфосфатаз приводила к снижению активности фермента в гомогенатах скелетных мышц летних активных животных. В нашей лаборатории было показано, что подобный эффект наблюдается не только в гомогенатах скелетных мышц, но и в препаратах изолированного CP (Rubtsov, 2001). В условиях активации эндогенных протеинкиназ активность Са-АТРазы препаратов CP скелетных мышц суслика

Spermophilas undulatus возрастала в 2-4 раза для препаратов зимних гибернирующих животных, и незначительно (на 20%) увеличивалась для препаратов летних активных сусликов.

Интересно заметить, что подобный тип регуляции был описан для другой мембранной АТРазы Р-типа - Na,K-ATPa3bi плазматических мембран скелетных мышц гибернирующего суслика (MacDonald, Storey, 1999). В этом случае фосфорилирование фермента как эндогенными, так и экзогенно добавленными протеинкиназами приводило к ингибированию его активности. Таким образом, можно предполагать, что в процессе гибернации регуляция активности мембранных ион-транспортирующих АТРаз осуществляется за счет обратимого фосфорилирования и/или дефосфорилирования фермента и/или регуляторных белков.

Известно, что сердечная изоформа Са-АТРазы SERCA2 может непосредственно фосфорилироваться Са/СаМ-зависимой протеинкиназой, что приводит к увеличению активности фермента (Hawkins et al., 1994). Кроме того, как отмечалось выше, регуляция этой изоформы Са-АТРазы осуществляется за счет обратимого фосфорилирования и дефосфорилирования регуляторного белка мембран CP фосфоламбана. Данные о возможности фосфорилирования Са-АТРазы и других белков CP скелетных мышц, которые могут принимать участие в регуляции ее активности, в настоящее время практически отсутствуют, хотя, как отмечалось выше, такое фосфорилирование может существенно изменять функциональную активность Са-каналов СР. Тем более, ничего пока неизвестно об эндогенном фосфорилировании белков CP скелетных мышц животных-гибернаторов.

III. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

Основной целью нашей работы было выявить участие эндогенных протеинкиназ в регуляции активности Са-АТРазы СР скелетных мышц суслика Spermophilus undulstus. Для этого мы поставили следующие задачи:

1. Исследовать спектр белков СР, фосфорилируемых эндогенными протеинкиназами активных и спящих животных.

2. Оценить вклад различных протеинкиназ в фосфорилирование белков СР.

3. Определить возможный механизм регуляции активности Са-АТРазы СР скелетных мышц суслика протеинкиназами.

IV. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

IV.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ.

Взрослых сусликов Spermophilus iindnlatus отлавливали в Якутии и содержали в виварии Института биофизики клетки РАН (Пущино) в индивидуальных клетках при 20-25°С в условиях естественной длины светового дня и стандартного кормления. В ноябре сусликов помещали в темную комнату и содержали при температуре 2-4°С. В течение января - февраля зимние спящие суслики декапитировались в середине баута спячки. Материалы летних активных животных получали в июле - августе. После декапитации скелетные мышцы задних конечностей освобождали от сухожилий и жира, замораживали в жидком азоте и затем хранили при температуре -70°С до использования (до полугода без потери энзиматической активности).

IV.2. ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОСОМАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА.

Препараты микросом CP получали из скелетных мышц методом дифференциального центрифугирования (Ритов и др., 1977) с некоторыми изменениями.

Замороженные конечности размораживали в ледяном физиологическом растворе. Далее срезали мышцы, очищали их от жира и измельчали ножницами. Полученный фарш помещали в 4-х кратный объем буфера, содержащего 0,3 М сахарозы и 10 мМ гистидина, рН = 7,7, и гомогенизировали в ножевом гомогенизаторе три раза по 30 секунд с интервалом в 15 секунд (10000 об/мин).

Гомогенат центрифугировали в течение 20 мин на центрифуге «Вескшап J2-21», ротор JA-14 при 12000xg. Супернатант фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали 100 мин при 31000xg на роторе JA-20. Осадок суспендировали в растворе, содержащем 0,6 М КС1, 0,6 мг/мл БСА, 10 мМ гистидина (рН 7,2). Затем суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе Потгера 3 раза по одной минуте с минутным интервалом при скорости вращения пестика, задаваемой напряжением в 150 В. Объем гомогената доводили до 30 мл тем же раствором и инкубировали 1 час при 4°С при механическом перемешивании. Затем суспензию центрифугировали в течение 100 мин при 31000xg на роторе JA-20. Осадок суспендировали в среде хранения (0,25 М сахароза и 25 мМ имидазол, рН 7,0) и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера вручную. Препарат замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

IV.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА.

Определение концентрации белка в препаратах проводили по методу Лоури (Lovvry et al., 1951) . Препараты белков готовили на 1%-м растворе дезоксихолата Na. В качестве стандарта использовали раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащий 1 мг/мл белка. Измерения проводили на спектрофотометре «Hitachi 200-20» при длине волны 750 нм.

IV.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ Са-АТРазы В СОПРЯЖЕННОЙ СИСТЕМЕ.

Измерение активности Са-АТРазы проводили в системе сопряженных реакций (Gould et al., 1987):

ATP + H20 ADP + Н2Р04 + H+ (АТРаза) ADP + PEP ATP + PYR (пируваткиназа - PK) PYR + NADH LAC + NAD+ (лакгатдегидрогеназа - LDH) Активность Са-АТРазы регистрировали на спектрофотометре «Hitachi 200-20» при 37°С по изменению оптической плотности при длине волны X = 340 нм, происходящей в результате снижения концентрации NADH в системе. Длинна оптического пути составляла 1 см.

Реакцию проводили в среде, содержащей 80 мМ КС1, 50 мМ MOPS (рН 7,0), 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 2 мМ PEP, 2,5 мМ АТР (рН 7,0), 0,3 мг/мл NADH, 5 ед РК, 10 ед LDH. Концентрации РК и LDH были подобраны так, что бы они не лимитировали АТРазную реакцию.

Реакцию начинали добавлением в пробу объемом 1 мл препарата саркоплазматического ретикулума в количестве 10 мкг белка. После добавления препарата CP в пробу регистрировали некоторую активность, обусловленную присутствующей в препарате ]У^2+-зависимой АТРазой. Затем в пробу вносили Са2+ и 2 мкл кальциевого ионофора А23187 (1 мг/мл), препятствующего накоплению Са2+ в везикулах саркоплазматического ретикулума и ингибированию Са-АТРазы внутривезикулярным кальцием.

Расчет активности Са-АТРазы проводили по формуле:

А = ДБ / (6,22 х С), где ДБ — изменение оптической плотности за 1 мин,

6,22 М"1 см"1 - коэффициент молярной экстинкции для КАОН,

С - концентрация белка в пробе, мг/мл.

1У.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА НА АКТИВНОСТЬ

Са-АТРазы СР.

Для определения потенциального влияния фосфорилирования белков СР эндогенными протеинкиназами на активность Са-АТРазы микросомальные препараты СР инкубировали в среде, содержащей 2 мМ 1у^С12, 1 мМ БТТ, 1 мМ ЕвТА, 1 мМ РМЭР, 10 мМ имидазол и 2 мМ АТР, рН 7,0 при 37 С. Концентрация белка в пробе составляла 1 мг/мл. Затем из пробы отбирали 10 мкл раствора и вносили в кювету для измерения активности Са-АТРазы. Дальнейшее измерение и расчет активности проводили, как описано выше.

1У.6. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ.

Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэммли в присутствии додецилсульфата натрия в пластинах ПААГ толщиной 0,75 мм при силе тока 20 мА в концентрирующем и 60 мА в разделяющем гелях (Ьаетт1у, 1970), используя 4%-й концентрирующий и 6-20%-й разделяющий градиентный гели (ЗЬоппа сС а1., 1997). В качестве белков-маркеров для определения молекулярной массы белков СР использовались фосфорилаза Ь (97 кДа), бычий сывороточный альбумин (66,2 кДа), овальбумин (45 кДа), карбоангидраза (31 кДа), ингибитор трипсина 21,5 кДа), лизоцим (14,4 кДа). Фиксацию гелей проводили в растворе, содержащем 10% изопропанола и 25 % уксусной кислоты в течение часа. Окраску проводили в растворе, содержащем 25% изопропанола, 10% уксусной кислоты и 0,25% кумасси Brilliant Blue R-250. От избытка красителя гели отмывали в растворе уксусной кислоты (10%). Отмытые гели сканировали с разрешением 600 dpi и анализировали с помощью программы Foretix ID (Nonlinear Dynamics Ltd).

При необходимости выявления малых количеств белка гели прокрашивали серебром. После проведения электрофореза гель фиксировали в растворе, содержащем 40% этанола и 10% уксусной кислоты в течение 30 - 60 мин, затем дважды отмывали в 10% этаноле, после чего 5 раз по 5 мин отмывали дистиллированной водой. После этого гели помещали на 2 мин в ослабитель Фармера (0,15% K3Fe(CN)6, 0,3% Na2S203, 0,5% Na2C03), снова промывали 4 раза по 5 мин дистиллированной водой и помещали на 30 мин в 0,1% нитрата серебра. Затем гели отмывали в течение 5 мин в 2,5% растворе Na2C03 и проявляли в растворе, содержащем 2,5% Na2C03 и 0,02% формальдегида до проявления окраски. После проявки гели на 5 мин помещали в 1% раствор уксусной кислоты.

IV.7. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ CP ЭНДОГЕННЫМИ ПРОТЕИКИНАЗАМИ.

Микросомальные препараты инкубировали среде, содержащей 15 мМ TRIS-HC1 (рН = 7,4), 1 мМ DTT, 5 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 0,1 мМ Na3V04, 5 мМ NaF, 1мМ pNPP (субстрат для протеинфосфатаз) и 1 мМ PMSF (ингибитор сериновых протеаз) (Hawkins et al., 1994; Пелози, Донелла-Деана, 2000). Содержание белка в пробе составляло 2 мг/мл. В "холодный" АТР вносили меченный у[32Р]АТР так, чтобы на пробу приходилось 106 распадов в мин. Реакцию начинали добавлением в среду раствора АТР. Реакцию проводили при температуре 37°С и останавливали добавлением буфера, содержащего SDS, используемого для приготовления образцов для проведения электрофореза. Разделение образцов проводили при помощи электрофореза в полиакриламидном геле по описанной ранее методике.

IV.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА.

Определение уровня включения фосфата в белки саркоплазматического ретикулума в результате протеинкиназной реакции проводили методом отбора проб. Метод основан на измерении количества Р, перенесенного в процессе реакции от у[32Р]АТР на белки ретикулума. Из реакционной среды отбирали по 2 мкл на определение общего содержания метки в среде реакции. Аликвоты наносили на листочки хроматографической бумаги Whatman ЗММ размером 15 х 15 мм и высушивали на воздухе. Затем отбирали по 6 мкл среды реакции, наносили на аналогичные листочки и фиксировали в 10% растворе ТХУ, содержащем 10 мМ Na2P207 и 10 мМ NaH2P04. Фиксирование проводили в течение 20 мин, а затем фильтры отмывали от невюпочившегося фосфата в растворе аналогичного состава четыре раза по 20 мин при механическом перемешивании раствора. Полноту отмывки определяли путем измерения счета контрольных фильтров. После отмывки фильтры высушивали, помещали в стеклянные флаконы, содержащие по 5 мл толуольной сцинтилляционной жидкости ЖС-106 и просчитывали в фосфорном канале жидкостного сцинтилляционного счетчика «Rackbeta 2114» (Швеция). Включение фосфата в препараты саркоплазматического ретикулума рассчитывали по формуле:

1000* А * В С * D где X - включение фосфата в пмоль/мг белка, А - радиоактивность фильтра с образцом после отмывки, В — радиоактивность фильтра с общим содержанием метки в пробе, С - содержание АТР в пробе (все параметры приведены к одному мкл среды реакции), D - содержание белка в пробе (в мкг).

IV.9. АВТОРАДИОГРАФИЯ

Регистрацию включения меченого фосфата в индивидуальные белки CP проводили методом авторадиографии. После проведения электрофореза окрашенные и высушенные гели помещали в авторадиографическую камеру

Sigma с флуоресцентным экраном на рентгеновскую пленку Fuji и экспонировали 5-7 дней при температуре -20°С. Пленку проявляли проявителем, предназначенным для получения максимально контрастного изображения. Полученные авторадиограммы сканировали с разрешением 600 dpi и анализировали с помощью программы Foretix ID (Nonlinear Dynamics Ltd).

IV.10. ОЧИСТКА ПРЕПАРАТА Са-АТРазы МЕТОДОМ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА КОЛОНКЕ С REACTIV RED-120 АГАРОЗОЙ.

Очистку Са-АТРазы проводили по методу Coll, Myrphy (1984; 1987) с изменениями. В работе использовали колонку объемом 2 мл (длина 2 см, диаметр 1 см). Колонку с сорбентом промывали 2 М раствором KCl (4-5 объемов колонки) и уравновешивали буфером солюбилизации, содержащем 20% сахарозы, 4% Ci2E9, 1 мМ СаС12, 1 мМ MgCl2, 50 мМ MOPS (pH 7,0; 4-5 объемов колонки). Белок солюбилизировали в буфере солюбилизации при концентрации белка 2 мг/мл, затем центрифугировали в течение 30 минут при 27000xg. Супернатант наносили на колонку, затем промывали 4-5 объемами буфера солюбилизации. Далее проводили элюцию связавшейся с колонкой Са-АТРазы путем промывания колонки буфером солюбилизации, содержащем 0,4 мМ ßy-имидо-АТР (1-2 объема колонки). Затем колонку промывали буфером солюбилизации (4-5 объемов колонки) и раствором KCl (2М) в буфере солюбилизации.

IV.11. АНАЛИЗ СПЕКТРА БЕЛКОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С Са-АТРазой.

Для определения спектра белков, взаимодействующих с АТРазой, использовали метод сшивок. В качестве сшивающего агента применяли бифункциональный сшивающий агент дитиобиссукцинимидилпропионат (DTSP) (Bateman, Nicholson, 1984). Характерной его особенностью является возможность последующего разрушения образованной связи между белками путем обработки сшитого препарата ß-меркаптоэтанолом. DTSP разводили в

DMF до концентрации 100 мМ и добавляли к белку, суспендированному в растворе NaH2P04 (5 мМ, рН 7,0). Конечная концентрация белка составляла 2 мг/мл. По окончании реакции добавляли стоп-раствор (0,1 М лизин, рН 7,0) в соотношении У*. Для электрофоретического разделения сшитых препаратов использовали восьмикратный буфер для образцов (см. выше), не содержащий (3-меркаптоэтанола. Для расшивки сшитых препаратов использовали обработку стандартным буфером для образцов, содержащим (3-меркаптоэтанол.

IV.12. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С Са-АТРазой.

Идентификацию белков проводили методом тандемной масс-спектрометрии, сопряженной с ВЭЖХ с нанопотоками (LC-MS/MS). Работы по определению белков проводились в лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Зиганьшиным P. X.

Для проведения анализа из полиакриламидного геля, прокрашенного Кумасси вырезали полосу соответствующего белка, разрезали на кусочки размером около 1 мм , переносили в пробирку для ПЦР-анализа и промывали два раза по 15 минут в 100 мкл 50-%-го раствора ацетонитрила, приготовленного на 0,2М NH4HCO3. Затем фрагменты геля заливали на 15 минут 100 мкл ацетонитрила, после чего ацетонитрил удаляли, а гели сушили на приборе SpeedVac в течение 15 минут. К высушенному гелю добавляли 10 мкл раствора трипсина (0,01 мкг/мл), приготовленного на 0,02М NH4HCO3, инкубировали 90 минут при 0 °С, после чего образцы помещали в термостат при 37 °С на 12 часов. Затем к образцам добавляли 50 мкл 50%-го ацетонитрила, приготовленного на 0,1% трифторуксусной кислоте, инкубировали в течение 2-х часов, переносили в новую пробирку и высушивали на приборе SpeedVac. Высушенный триптический гидролизат белка растворяли в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты и отбирали 5 мкл для LS-MS/MS анализа.

LS-MS/MS анализ проводили на хроматографе Ultimate Plus (LC Packings), соединенном с масс-спектрометром Esquire 6000 (Bruker Daltonic). Для

разделения использовали колонку размером 75 мкм х 20 см, содержащую носитель Luna С18 с диаметром гранул 5 мкм (Phenomenex). Разделение проводили линейным градиентом ацетонитрила (от 5% до 50%-го раствора ацетонитрила на 0,1% муравьиной кислоте) в течение 45 минут при скорости потока 250 нл/мин. Эксперименты по ESI-MS (масс-спектрометрия по методу электрораспыления) и MS/MS (тандемная масс-спектрометрия) проводили в режиме регистрации положительных ионов в диапазоне масс от 300 до 2000 Да. Масс-спектрометрические данные анализировали с использованием программы Data Analyses 2.1 (Bruker Daltonic), поиск в базе данных транслированных последовательностей нуклеиновых кислот NCBI проводили с использованием поисковой программы Mascot (Matrixscience). Поиск аминокислотных последовательностей белков, содержащих полученные пептиды, осуществляли с помощью пакета программ BLAST (программа BLASTP (standart protein-protein BLAST)), расположенного на сервере NCBI.

IV.13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСЕРВАТИВНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ УЧАСТКОВ Ф О СФОРМИРОВАНИЯ

Поиск консервативных последовательностей в идентифицированных белках проводили аналитически с использованием программы Blast, расположенной на сервере www.expasy.ch. При этом из базы данных программы отбирались последовательности белков, имеющие наибольшую гомологию с анализируемой аминокислотной последовательностью. Из представленных структур отбирались имеющие наибольший Score и в них определялась степень гомологии а так же уровень консервативности аминокислотных замен.

Потенциальные участки фосфорилирования определялись по первичной структуре анализируемых белков с помощью программы NetPhosK 1.0 Server, расположенной на сайте www.cbs.dtu.dk. При этом определялись аминокислотные остатки, являющиеся потенциальными мишенями для различных протеинкиназ и степень вероятности их фосфорилирования. Из представленных данных отбирались остатки, имеющие наибольшую вероятность фосфорилирования (Score >0,65).

IV. 14. МАТЕРИАЛЫ

В работе использовались следующие реактивы: А23187, ATP, DMF, DRB, DTSP, EGTA, гепарин, PEP, PMSF, pNPP, Reactiv Red-120 агароза, Na3V04, тритон X100, ру-имидо ATP, Р-меркаптоэтанол, БСА, Ci2E9, Кумасси Brilliant Blue R-250, кальмодулин - фирмы Sigma; PK, LDH, H89 -фирмы ISN; имидазол и MOPS - фирмы Acros organics; гистидин - фирмы Serva; КС1, SDS, TRIS, акриламид, дезоксихолат Na , метиленбисакриламид, сахароза, стандарты молекулярных масс - фирмы Helicon; cAMP, cGMP, GTP, NADH -фирмы «Реанал»; СаС12, DTT, MgCl2, Na2P207, NaF, NaH2P04, изопропанол, сцинтилляционная жидкость ЖС-106, ТХУ, уксусная кислота - фирмы «Реахим»

V. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе были использованы препараты СР, полученные из скелетных мышц животных в двух состояниях физиологической активности: активных летних сусликов (температура тела 37°С) и зимних гибернирующих в середине баута спячки (температура тела 5°С). Общее количество животных, использованных в течение работы, составляло не менее 40 экземпляров в каждой группе. При этом выборка в каждом из проведенных экспериментов составляла не менее 5-ти животных каждой группы. Хотя известно, что между отдельными животными наблюдаются некоторые индивидуальные различия как в активности Са-АТРазы, так и в белковом составе мембран СР, тем не менее, происходящие в период гибернации изменения этих параметров значительно превышают самые большие индивидуальные различия между животными (Малышева и др., 2001; КиЫБОУ, 2001). Все параметры были измерены 3-5 раз и их величина не различалась между измерениями более, чем на 5-10%.

У.1. ХАРАКТЕРИСТИКА МЕМБРАННЫХ ПРЕПАРАТОВ СР СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ.

1.1 ВЫХОД БЕЛКА СР И АКТИВНОСТЬ Са-АТРазы

Данные по выходу белка СР из скелетных мышц разных животных представлены в таблице 1. Как видно из этой таблицы, выход белка СР из скелетных мышц активных животных примерно в полтора раза выше, чем зимних гибернирующих. Это хорошо согласуется с данными литературы о том, что при гибернации в результате отсутствия нагрузки наблюдается умеренная атрофия скелетных мышц (Ьутап е1 а1., 1982; ЯцЫвоу, 2001), что и может быть причиной пониженного выхода СР из ткани.

Активность Са2+-АТРазы была измерена в стандартных условиях. Полученные значения представлены в таблице 1. Из приведенных данных видно, что активность Са-АТРазы (при расчете на мг белка СР) у бодрствующих сусликов примерно в 3 раза выше, чем у спящих животных. Возможно, такое снижение активности Са-АТРазы направлено на уменьшение потребления АТР в период спячки, что лежит в общем русле стратегии на снижение энергозатрат. Тем не менее, необходимо помнить, что при пробуждениях между баутами спячки скелетные мышцы сусликов сохраняют способность выполнять необходимый объем мышечной работы.

Снижение активности Са-АТРазы не может быть обусловлено снижением содержания белка Са-АТРазы в исследуемых препаратах СР, так как удельная активность фермента, рассчитанная с учетом этого содержания, у зимних гибернирующих сусликов в 1,8 раз ниже, чем у активных животных (табл. 1). Эти данные полностью согласуются с результатами аналогичных опытов, проведенных ранее в нашей лаборатории (Малышева и др., 2001; КчЫбоу, 2001).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кондрашев-Луговский, Александр Сергеевич

VII. выводы

1]

1. В препаратах саркоплазматичеекого ретикулума скелетных мышц суслика присутствует эндогенная протеинкиназная активность. Фосфорилирование белков ретикулума эндогенными протеинкиназами приводит к активации Са-АТРазы в ретикулуме гибернирующего суслика.

2. Эндогенные протеинкиназы локализованы преимущественно внутри везикул ретикулума. Около 50 % протеинкиназной активности приходится на долю казеинкиназы II. Са-АТРаза не является субстратом эндогенных протеинкиназ ретикулума.

3. Фосфорилирование белков ретикулума казеинкиназой II приводит к активации Са-АТРазы саркоплазматичеекого ретикулума гибернирующего суслика.

4. Белки с молекулярными массам 63, 55, 44 и 30 кДа, являющиеся субстратами казеинкиназы II, сшиваются с Са-АТРазой в присутствии бифункционального сшивающего агента БТ8Р.

5. Наиболее вероятными белками, фосфорилирование которых казеинкиназой II может участвовать в сезонной регуляции активности Са-АТРазы, являются кальсеквестрин и саркалюменин.

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенная нами экспериментальная работа позволяет сделать несколько заключений. Во-первых, установлено, что препараты СР скелетных мышц суслика обладают эндогенной протеинкиназной активностью. Эндогенными субстратами этих протеинкиназ является большое число белков СР, причем уровень фосфорилирования некоторых из них существенно различается в зависимости от физиологического состояния животного. Ориентировочная оценка стехиометрии включения фосфата в индивидуальные белки мембран СР показала, что фосфорилированию подвергается около 20 индивидуальных белков СР. Это может говорить о том, что многие белки присутствуют в выделяемых препаратах СР уже в фосфорилироваипом виде, что показано, например, для кальсеквестрипа (Szegedi et al., 1999; Herzog et al., 2000), или же их фосфорилирование затруднено тем, что многие белки СР формируют олигомерные агрегаты как в мембранах СР, так и во внутреннем пространстве ретикулума (Mackrill, 1999). Поскольку различия в фосфорилировапии белков СР активных и спящих сусликов носили в большей степени количественный, а не качественный характер, и отличались не столько спектрами фосфорилировапиых белков, сколько уровнем включения фосфата в те или иные белковые полосы, можно с уверенностью сказать, что при изменении физиологической активности животного изменяется только степень фосфорилирования белков. Примером может служить мышечная изоформа протеинкиназы В, имеющая два участка фосфорилирования при гибернации и 3 участка летом у активного животного (Abnous et al., 2008).

Исходя из полученных нами результатов и известных данных (Rubtsov, 2001; А.Н.Шутова, неопубликованные данные) можно предположить, что активность Са-АТРазы СР скелетных мышц суслика определяется балансом активности протеинкиназ и/или протеинфосфатаз в СР. Поскольку включения фосфата в белок Са-АТРазы СР суслика мы не обнаружили, можно предположить, что активность этого фермента регулируется уровнем фосфорилировапия/дефосфорилирования регуляторных белков, способных взаимодействовать с Са-АТРазой.

Необходимо заметить, что мы обнаружили значительные различия в уровне фосфорилирования Са-связывающих белков (богатого гистидином Са-связывающего белка, саркалюмепина и кальсеквестрипа) у активных и гибернирующих животных. Поскольку эти белки являются хорошо известными регуляторами функциональной активности Са-каиалов CP (рианодиновых рецепторов) (Mackrill, 1999), можно предположить, что при гибернации может наблюдаться значительное изменение активности не только Са-АТРазы, но и Са-каналов СР. Этот вопрос представляет определенный интерес и также может быть предметом специального анализа.

Л i

Нами были получены интересные данные о роли Са в фосфорилировании белков CP скелетных мышц. Хотя присутствие

94

Са /кальмодулип зависимой протеинкипазы в CP скелетных мышц различных животных было показано неоднократно (Пелози, Донелла-Деана,2000; Damiani et al., 2000а, 2000b), тем не менее, мы обнаружили резкое подавление включение фосфата в белки CP на фоне присутствия Са . Возможной причиной подобного ji эффекта может быть как отсутствие или чрезвычайно низкая активность Са -зависимых протеинкиназ в везикулах CP животных-гибернагоров, так и

У 4- '74необычная чувствительность других протеинкиназ к Са . Известно, что Са может выступать и ингибитором некоторых протеинкиназ, например протеинкиназы А и казеинкиназы II (Rosen, 1975). Кроме того, Са может активировать Са2+-зависимые протеинфосфатазы (Cohén, 1989).

Нами был получен ряд данных, указывающих на преимущественно внутривезикулярную локализацию протеинкиназ СР. Об этом свидетельствует резкое увеличение в присутствии детергента включения фосфата в белки CP как активных, так и спящих сусликов. Кроме того, в присутствии Тритона XI00 эффективным ингибитором фосфорилирования белков CP выступает гепарин -непроникающий через мембрану ингибитор протеинкиназ.

На основании анализа фосфорилирования белков CP в присутствии гепарина нами было высказано предположение о том, что в полостях ретикулума CP содержится казеинкиназа И, играющая заметную роль в общем фосфорилировании белков СР. Присутствие этой протеинкиназы в полостях СР скелетных мышц кролика было показано ранее (Orr, Shoshan-Barmatz, 1996; Shoshan-Barmatz et al., 1996). Дальнейшие эксперименты с использованием специфического ингибитора казеиикиназы II DRB и GTP в качестве донора фосфата подтвердили наше предположение о наличии в ретикулуме этой протеинкиназы. Вместе с тем, анализ включения фосфата в присутствии активаторов и ингибитора протеинкиназы А не показал существенного вклада этой протеинкиназы в суммарное фосфорилирование белков СР.

Необходимо отметить, что нами были получены данные о том, что ряд белков СР активных и спящих животных фосфорилируется неодинаково. В частности, у активных животных больший уровень включения наблюдается в белки с молекулярными массами 230, 165, 55, 35 кДа. У гибернирующих сусликов лучше фосфорилируются белки с молекулярными массами 98, 63, 44, 33 и 30 кДа.

Одной из основных предпосылок нашей работы являлись данные о том, что фосфорилирование препаратов СР зимних гибернирующих сусликов приводит к двукратному увеличению активности Са-АТРазы СР скелетных мышц спящих сусликов и не влияет на активность белка в СР активных животных (Малышева и др., 2001). В нашей работе мы показали, что сама Са-АТРаза не подвергается фосфорилированию как у активных, так и у спящих сусликов. На основании этих данных мы высказали предположение о существовании некоего регуляторного белка (или белков), обратимое фосфорилирование которых модулирует активность Са-АТРазы при гибернации. Механизм подобной регуляции для Са-АТРазы СР миоцитов хорошо изучен и заключается в обратимом фосфорилировании регуляторного белка фосфоламбана. В быстрых скелетных мышцах фосфоламбан не экспрессируется, но присутствие его функциональных аналогов вполне вероятно.

Проведенные нами эксперименты по исследованию влияния фосфорилирования белков СР иа активность Са-АТРазы в присутствии в качестве донора фосфата GTP показали практически полную идентичность наблюдаемых эффектов с описанными в литературе результатами работы по фосфорилированию в присутствии АТР (Малышева и др., 2001). Кроме того, полученная нами активация Са-АТРазы полностью обращалась при внесении в среду реакции ингибитора казеинкиназы II. Это позволило нам утверждать, что протеинкиназой, осуществляющей регулирование активности Са-АТРазы СР скелетных мышц гибернирующих сусликов является казеинкиназа 2-го типа.

С использованием у "Р меченного вТР мы определили набор белков, являющихся мишенями казеинкиназы 2-го типа. Интересно, что уровень включения фосфата в эти белки у активных и гибернирующих животных резко различался, причем белки СР гибернирующего суслика фосфорилировались лучше, чем у активного животного.

Использование бифункционального сшивающего агента ОТ8Р, с последующей аффинной очисткой препаратов Са-АТРазы СР позволило нам определить спектр белков, взаимодействующих с Са-АТРазой СР скелетных мышц сусликов летом и во время спячки. Оказалось, что с Са-АТРазой СР летних сусликов взаимодействует значительно большее количество белков (не менее 5 индивидуальных белков), в то время как с Са-АТРазой СР гибернирующих животных связывается только 2 белка. Подобное различие можно объяснить как большей олигомеризоваииостыо белков в препаратах СР гибернирующих сусликов и, следовательно, меньшей возможностью для взаимодействия с Са-АТРазой, так и тем, что степень фосфорилирования белка влияет на его способность образовывать олигомеры. Необходимо отметить, что практически все белки, связывающиеся с Са-АТРазой, являются мишенями казеинкиназы II и, вероятно, один из них является модулятором активности Са-АТРазы.

Проведенная нами идентификация белков показала, что в СР Са-АТРаза может взаимодействовать с кальсеквестрином и саркалюмеиином. Оба эти белка являются внутршпоминальными белками СР, выполняют регуляторные функции и обладают участками первичной структуры, которые могут являться потенциальными мишенями для казеинкиназы II.

Вместе с тем, необходимо отметить, что молекула Са-АТРазы обладает очень незначительным внутрилюминальным доменом, эффективное взаимодействие которого с регуляторными белками может быть затруднено. Однако известно, что в СР существуют механизмы для эффективного заякоривания регуляторных белков у внутренней поверхности мембраны СР. Такой механизм показан для кальсеквестрина, который заякоривается на внутренней поверхности мембраны СР путем взаимодействия с люминальным доменом трансмембранного белка триадина (МаскгШ, 1999), что играет важную роль в регуляции активности Са-канала СР. Не исключено, что в предлагаемой нами схеме регуляции активности Са-АТРазы СР скелетных мышц животных-гибернаторов участвует еще один белковый трансмембранный компонент, обеспечивающий непосредственную совместную локализацию Са-АТРазы и ее белка-регулятора.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кондрашев-Луговский, Александр Сергеевич, 2009 год

1. Калабухов Н. И. (1985) Спячка млекопитающих. Москва, «Наука», 285

2. Лукоянова Н. А., Игнатьев Д. А., Колаева С. Г., Подлубпая 3. А. (1997а) Изучение АТФазных и регуляторных свойств миозина скелетных мышц Citellus undulatus на разных стадиях зимней спячки. Биофизика 42, 343 -347

3. Малышева А.Н., Стори К.Б., Зиганшин Р.Х., Лопина О.Д., Рубцов А. М. (2001) Характеристика мембранных препаратов саркоплазматического ретикулума, выделенных из скелетных мышц активных и гибернирующих сусликов Spermophilus undulatus. Биохимия 66, 918-925

4. Ньюсхолм Э., Старт К. (1977) Регуляция метаболизма. Москва, «Мир», 397

5. Пашовкин А. Т. (2005) Характеристика препаратов тяжелого саркоплазматического ретикулума скелетных мышц сусликов Spermophilus undulates Дипломная работа. МГУ

6. Пантелеев П. А. (1983) Биоэнергетика мелких млекопитающих: адаптация грызунов и насекомоядных к температурным условиям окружающей среды. М., Наука, 271 с.

7. Пелози М., Донелла-Деана А. (2000) Локализация, очистка и характеристика кальмодулин-зависимой протеинкиназы, связанной с саркоплазматическим ретикулумом кролика. Биохимия 65, 309-320

8. Подлубная 3. А. (1992) Ферменты в толстых нитях поперечнополосатых мышц позвоночных. Биохимия 57, 1785-1814

9. Постникова Г. Б., Целикова С. В., Игнатьев Д. А., Колаева С. Г. (1997) Сезонные изменения содержания миоглобина в мышцах зимоспящего якутского суслика. Биохимия 62, 167 — 170

10. Ритов В.Б., Мельгуиов В. И., Комаров П. Г., Алексеева О. II., Акимова Е. И. (1977) Интегральные белки мембран саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика и карпа. Докл. АН СССР 233, 727-733

11. Рэкер Э. (1979) Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. Москва, «Мир», 216

12. Соколов В. Е., Сухов В.П., Сухова Г.С., Игнатьев Д. А. (1995) Суточные и сезонные изменения температуры и сердечного ритма длиннохвостого суслика Citellus undulates. Докл. Акад. Наук 344, 282286

13. Ченцов Ю.С. (1995) Общая цитология. Москва, «Издательство Московского университета», 300

14. Шутова А.Н., Стори К.Б., Лопина О.Д., Рубцов А. М. (1999) Сравнительная характеристика препаратов саркоплазматического ретикулума скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus, крыс и кроликов. Биохимия 64, 1480 1488

15. Эмирбеков Э.З., Львова С.П. (1991) Энергетический метаболизм при гибернации у представителей разных филогенетических групп. Успехи физиол. наук 22, 97-111

16. Abnous К., Dieni С.А., Storey K.B. (2008) Regulation of Akt during hibernation in Richardson's ground squirrels. В. B. Acta. 1780(2), 185-193

17. Agostini В., De Martino L., Soltau В., Hasselbach W. (1991) The modulation of the calcium transport by skeletal muscle sarcoplasmicreticulum in the hibernating European hamster. Z Naturforsch C. 46(11-12), 1109-1126

18. Akiyama T., Ishida J., Nakagawa S., Ogawara H., Watanabe S., Itoh N., Shibuya M., Fukami Y. (1987) Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. J Biol Chem. 262(12), 5592-5595

19. Andersen J. P. (1989) Monomer-oligomer equilibrium of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase and role of subunit interaction in the Ca2+ pump mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 988, 47 72

20. Asahi M., Kurzydlowski K., Tada M., MacLennan D.H. (2002) Sarcolipin inhibits polymerization of phospholamban to induce superinhibition of sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPases (SERCAs). J. Biol. Chem. 277(30), 26725-26728

21. Asahi M., McKenna E., Kurzydlowski K., Tada M., MacLennan D.H.2000) Physical interactions between phospholamban andsarco(endo)plasmic reticulum Ca -ATPases are dissociated by elevated 2+

22. Ca , but not by phospholamban phosphorylation, vanadate, or thapsigargin, and are enhanced by ATP.J. Biol. Chem. 275(20),15034-15038

23. Asahi M., Sugita Y., Kurzydlowski K., De Leon S., Tada M., Toyoshima C., MacLennan DH. (2003)Sarcolipin regulates sarco(endo)plasmic reticulumy I

24. Ca -ATPase (SERCA) by bindingto transmembrane helices alone or in association with phospholamban. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(9), 5040-5045

25. Azzam A. N., Hallenbeck M. J., Bechara K. (2000) Membrane changes during hibernation. Nature 407, 317-318

26. Barnes B.M. (1989) Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator. Science 244(4912), 1593-1595

27. Bateman E., Nicholson B.H. (1984) Cross-linking of wheat germ RNA polymerase II with dithiobis(succinimidyl propionate). Biochem. Biophys. Res. Commun. 121(2), 680-685

28. Bayer K.U., Harbers K., Schulman H. (1998) AlphaKAP is an anchoring protein for a novel CaM kinase II isoform in skeletal muscle. EMBO J. 17(19), 5598-5605

29. Beard N.A., Casarotto M.G., Wei L., Varsanyi M., Laver D.R., Dulhunty A.F. (2005) Regulation of ryanodine receptors by calsequestrin: effect of high luminal Ca2+ and phosphorylation. Biophys. J. 88(5), 3444-3454

30. Beard N.A., Laver D.R., Dulhunty A.F. (2004) Calsequestrin and the calcium release channel of skeletal and cardiac muscle. Prog. Biophys. Mol. Biol 85(1), 33-69

31. Beard N.A., Wei L., Cheung S.N., Kimura T., Varsanyi M., Dulhunty A.F. (2008) Phosphorylation of skeletal muscle calsequestrin enhances its Ca(2+) binding capacity and promotes its association with junctin. Cell Calcium, Epub ahead of print

32. Belke, D.D., Pehowich, D.J., Wang, L.C.H. (1987) Seasonal variation in calcium uptake by cardiac sarcoplasmic reticulum in a hibernator, the Richardson's ground squirrel. J. Therm. Biol. 12, 53-56

33. Bers D.M. (2004) Macromolecular complexes regulating cardiac ryanodine receptor function. J. Mol. Cell Cardiol. 37(2), 417-429

34. Bers D.M. (2006) Cardiac ryanodine receptor phosphorylation: target sites and functional consequences. Biochem. J. 396(1), 7-16

35. Birmachu W., Thomas D.D. (1990) Rotational dynamics of the Ca2+-ATPase in sarcoplasmic reticulum studied by time-resolved phosphorescence anisotropy. Biochemistry 29(16), 3904-3914

36. Block, B.A. (1994) Thermogenesis in muscle. Ann. Rev. Physiol. 56, 535577

37. Borgman A. I., Moon T. W. (1976) Enzymes of normothermic and hibernating bat, Myotis Lucifugits: temperature as a modulator of pyruvate kinase. J. Comp. Physiol. 107B, 185-199

38. Bronnikov, G.E., Vinogradova, S.O., Mezentseva, V.S. (1990) Changes in kinetics of ATP-synthase and in concentration of adenine nucleotides in ground squirrel liver mitochondria during hibernation. Comp. Biochem. Physiol. B97, 411-415

39. Burns K., Michalak M. (1993) Interaction jf calreticulin with proteins of the endoplasmic and sarcoplasmic reticulum memdranes. FEBS Lett. 318, 181185

40. Cai W„ Chen J.Z., Ruan L.M., Wang Y.N. (2005) Effects of fructose-1,6-diphosphate on concentration of calcium and activities of sarcoplosnic Ca -ATPase in cardiomyocytes of Adriamycin-treated rats. J. Zhejiang. Univ. Set B. 6(7), 622-625

41. Cala S. E., Jones L. R. (1991) Phosphorylation of cardiac and skeletal muscle calsequestrin isoforms by casein kinase II. Demonstration of a cluster of unique rapidly phosphorylated sites in cardiac calsequestrin. J. Biol. Chem. 266, 391-398

42. Camacho P, Lechleiter JD. (1995) Calreticulin inhibits repetitive intracellular Ca2+ waves. Cell, 82, 765-771

43. Carey H.V., Frank C.L., Seifert J.P. (2000) Hibernation induces oxidative stress and activation of NK-kappaB in ground squirrel intestine. J. Comp. Physiol. IB. 170(7), 551-559

44. Carey H.V., Rhoads C.A, Aw T.Y. (2003) Hibernation induces glutathione redox imbalance in ground squirrel intestine. J. Comp. Physiol. B. 173(4), 269-276

45. Cechetto J.D., Soltys B.J., Gupta R.S. (2000) Localization of mitochondrial 60-kD heat shock chaperonin protein (I-Isp60) in pituitary growth hormone secretory granules and pancreatic zymogen granules. J. Histochem. Cytochem. 48(1), 45-56

46. Chen B., Bigelow D.J. (2002) Phosphorylation induces a conformational transition near the lipid-water interface of phospholamban reconstituted with the Ca2+-ATPase. Biochemistry 41(47), 13965-13972

47. Chen S.R., Ebisawa K., Li X., Zhang L. (1998) Molecular identification of the ryanodine receptor Ca2+ sensor. J. Biol. Chem. 273(24), 14675-14678

48. Cohen P. (1989) The structure and regulation of protein phosphatases. Ann. Rev. Biochem. 58, 453-508

49. Coll R.J., Murphy A.J. (1984) Purification of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum by affinity chromatography. J. Biol. Chem. 259(22), 14249-14254

50. Coll R.J., Murphy A.J. (1987) Inhibition of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase by Reactive Red 120. Biochim. Biophys. Acta. 904(2), 227-238

51. Coll R.J., Murphy A.J. (1991) Kinetic evidence for two nucleotide binding94sites on the Ca -ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 30(6), 1456-1461

52. Colpo P., Nori A., Sacchetto R., Damiani E., Margreth A. (2001) Phosphorylation of the triadin cytoplasmic domain by CaM protein kinase in rabbit fast-twitch muscle sarcoplasmic reticulum. Mol. Cell. Biochem. 223(1-2), 139-145

53. Coppolino M.G., Dedhar S. (1998) Calreticulin. Int J. Biochem. Cell. Biol. 30(5), 553-558

54. Costello B., Chadwick C., Fleischer S. (1988) Isolation of the junctional face membrane of sarcoplasmic reticulum. Methods Enzymol. 157, 46-50

55. Dalton K.A., Pilot J.D., Mall S., East J.M., Lee A.G. (1999) Anionic94phospholipids decrease the rate of slippage on the Ca -ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 342, 431-438

56. Damiani E., Sacchetto R., Margreth A. (2000a) Phosphorylation of anchoring protein by calmodulin protein kinase associated to the sarcoplasmic reticulum of rabbit fast-twitch muscle. Biochem. Biophys. Res. Commurt. 279(1), 181-189

57. Danko S., Yamasaki K., Daiho T., Suzuki H., Toyoshima C. (2001) Organization of cytoplasmic domains of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase in E(1)P and E(1)ATP states: a limited proteolysis study. FEBS Lett. 505(1), 129-135

58. De Foresta B, Champeil P, le Maire M. (1990) Different classes of tryptophan residues involved in the conformational changes characteristic of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase cycle. Eur. J. Biochem. 194, 383388

59. De Meis L, Inesi G. (1982) ATP synthesis by sarcoplasmic reticulum ATPase following Ca2+, PH, temperature, and water activity jumps. J. Biol Chem. 257, 1289-1294

60. Dobrowolska G., Lozeman F.J., Li D., Krebs E.G. (1999) CK2, a protein kinase of the next millennium. Mol Cell Biochem. 191(1-2), 3-12

61. Dode L., Van Baelen K., Wuytack F., Dean W.L. (2001) Low temperature molecular adaptation of the skeletal muscle sarco(endo)plasmic reticulum Ca -ATPase 1 (SERCA 1)in the wood frog (Rana sylvatica). J. Biol. Chem.276(6), 3911-3919

62. Dulhunty A.F., Laver D., Curtis S.M., Pace S., Haarmann C., Gallant E.M. (2001) Characteristics of irreversible ATP activation suggest that native skeletal ryanodine receptors can be phosphorylated via an endogenous CaMKII. Biophys. J. 81(6), 3240-3252

63. Dupont Y., Pougeois R., Ronjat M., Verjovsky-Almeida S. (1985) Two distinct classes of nucleotide binding sites in sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase revealed by 2',3'-0-(2,4,6-trinitrocyclohexadienylidene)-ATP. J. Biol. Chem. 260(12), 7241-7249

64. El Hachimi Z, Tijane M, Benjouad A, Desmadril M, Yon JM. (1989) Conformational modification of muscle phosphofructokinase from Jaculus orientalis upon ligand binding. FEBSLett. 245, 30-34

65. El Hachimi Z., Tijane M., Boissonnet G., Benjouad A., Desmadril M., Yon J.M. (1990) Regulation of the skeletal muscle metabolism during hibernation of Jaculus„ orientalis. Comp. Biochem. Physiol B. 96(3), 457459

66. Fahlman A., Storey J.M., Storey K.B. (2000) Gene up-regulation in heart during mammalian hibernation. Cryobiology 40(4), 332-342

67. Favero T.G. (1999) Sarcoplasmic reticulum Ca release and muscle fatigue. J. Appl. Physiol. 87(2), 471-483

68. Fedotcheva, N.J., Sharyshev, A.A., Mironova, G.D., Kondrashova, M.N. (1985) Inhibition of succinate oxidation and K+ transport in mitochondria during hibernation. Comp. Biochem. Physiol. B82, 191-195

69. Field M.L., Khan O., Abbaraju J., Clark J.F. (2006) Functional compartmentation of glycogen phosphorylase with creatine kinase and Ca2+-ATPase in skeletal muscle. J. Theor. Biol. 238(2), 257-268

70. Franzini-Armstrong C, Protasi F. (1997) Ryanodine receptors of striated muscles: a complex channel capable of multiple interactions. Physiol. Rev. 77, 699-729

71. Froemming G.R., Ohlendieck K. (1998) Oligomerisation of Ca2+-regulatory membrane components involved in the excitation-contraction-relaxation cycle during postnatal development of rabbit skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta. 1387(1-2), 226-238

72. Gao L., Tripathy A., Lu X., Meissner G. (1997) Evidence for a role of C-terminal amino acid residues in skeletal muscle Ca release channel (ryanodine receptor) function. FEBS Lett. 412(1), 223-226

73. Geiser F. (1988) Reduction of metabolism during hibernation and daily torpor in mammals and birds: temperature effect or physiological inhibition? J. Comp. Physiol. B. 158(1). 25-37

74. Geiser F., Ruf T. (1995) Hibernation versus daily torpor in mammals and birds. Physiological variables and classification of torpor patterns. Physiol. Zool. 68, 935-966

75. Gould G. W., McWhirter J. M., Lee A. J. (1987) A model for the uptake and release of Ca 2+ by sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 245, 739-749

76. Gyorke I., Hester N., Jones L.R., Gyorke S. (2004) The role of calsequestrin, triadin, and junctin in conferring cardiac ryanodine receptor responsiveness to luminal calcium. Biophys. J. 86(4), 2121-2128

77. Hadad N., Meyer H.E., Varsanyi M., Fleischer S., Shoshan-Barmatz V. (1999) Cardiac sarcalumenin: phosphorylation, comparison with the skeletal muscle sarcalumenin and modulation of ryanodine receptor. J. Membr. Biol. 170(1), 39-49

78. Han J.W., Thieleczek R., Varsanyi M., Heilmeyer L.M.Jr. (1992) Compartmentalized ATP synthesis in skeletal muscle triads. Biochemistry. 31(2), 377-384

79. Harmon S., Froemming G.R., Leisner E., Pette D., Ohlendieck K. (2001) Low-frequency stimulation of fast muscle affects the abundance of Ca2+-ATPase but not its oligomeric status. J. Appl. Physiol. 90(1), 371-379

80. Hawkins C., Xu A., Narayanan N. (1994) Sarcoplasmic reticulum calcium pump in cardiac and slow twitch skeletal muscle but not fast twitch skeletal muscle undergoes phosphorylation by endogenous and exogenous

81. ICa /calmodulin-dependent protein kinase. Characterization of optimalconditions for calcium pump phosphorylation J. Biol. Chem. 269(49),31198-31206

82. Heldmaier G., Ruf T. (1992) Body temperature and metabolic rate during natural hypothermia in endotherms. J. Comp. Physiol. BJ. 162(8), 696-706

83. Hermann-Frank A., Darling E., Meissner G. (1991) Functional characterization of the Ca2+-gated Ca2+ release channel of vascular smooth muscle sarcoplasmic reticulum. FEBS Lett., 221, 119-123

84. Herzog A, Szegedi C, Jona I, Herberg FW, Varsanyi M. (2000) Surface plasmon resonance studies prove the interaction of skeletal muscle sarcoplasmic reticular Ca2+ release channel/ryanodine receptor with calsequestrin. FEBS Lett. 472, 73-77

85. Huang F., Shan J., Reiken S., Wehrens X.H., Marks A.R. (2006) Analysis of calstabin2 (FKBP12.6)-ryanodine receptor interactions: rescue of heart failure by calstabin2 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(9), 34563461

86. Hudson J. W. (1973) Torpidity in mammals. Comp. Biochem. Physiol., 112A, 59-66

87. Inesi G. (1985) Mechanism of calcium transport. Annu. Rev. Physiol. 47, 573-601

88. Karim C.B., Zhang Z., Howard E.C., Torgersen K.D., Thomas D.D. (2006) Phosphorylation-dependent conformational switch in spin-labeled phospholamban bound to SERCA. J. Mol. Biol. 358(4), 1032-1040

89. Karon B.S., Mahaney J.E., Thomas D.D. (1994) Halothane and cyclopiazonic acid modulate Ca2+-ATPase oligomeric state and function in sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 33(46), 13928-13937

90. Kemp B.E., Froscio M., Rogers A., Murray A.W. (1975) Multiple protein kinases from human lymphocytes. Identification enzymes phosphorylating exogenous histon and casein. Biochem J. 145(2), 241-249

91. Knight J.E., Narus E.N., Martin S.L., Jacobson A., Barnes B.M., Boyer B.B. (2000) mRNA stability and polysome loss in hibernating Arctic ground squirrels (Spermophilusparryii). Mol. Cell. Biol 20(17), 6374-6379

92. Knudson C.M., Stang K.K., Moomavv C.R., Slaughter C.A., Campbell K.R1993) Primary structure and topological analysis of a skeletal muscle-specific junctional sarcoplasmic reticulum glycoprotein (triadin). J. Biol. Chem. 268(17), 12646-12654

93. Kobayashi Y.M., Alseikhan B.A., Jones L.R. (2000) Localization and characterization of the calsequestrin-binding domain of triadin 1. Evidence for a charged beta-strand in mediating the protein-protein interaction. J. Biol Chem. 275(23), 17639-17646

94. Kondo N. and Shibata S. (1984) Calcium source for excitation-contraction coupling in myocardium of nonhibernating and hibernating chipmunks. Science 225, 641-643

95. Kondo N., Kondo J. (1992) Identification of novel blood proteins specific for mammalian hibernation. J. Biol. Chem. 267, 473-478

96. Korge P., Byrd S.K., Campbell K.B. (1993) Functional coupling between sarcoplasmic-reticulum-bound creatine kinase and Ca -ATPase. Eur. J. Biochem. 213(3), 973-980

97. Koyabu S., Imanaka-Yoshida K., Ioshi S. O., Nakano T. and Yoshida T.1994) Switching of the dominant calcium sequestering protein during skeletal muscle differentiation. Cell Motility & Cytoskeleton 29, 259-270

98. Krause K.-H., Michalak M. (1997) Calreticulin. Cell. 88(4), 439-443

99. Laemmli U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 227, 680-685

100. Lamb G.D. (2000) Excitation-contraction coupling in skeletal muscle: comparisons with cardiac muscle. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 27(3), 216-224

101. Lee A. G., Dalton K. A., Duggleby R. C., East J. M. and Starling A. P. (1995) Lipid structure and Ca2+-ATPase function. Biosci. Rep. 15, 289-298

102. Lee A.G. (1998) How lipids interact with an intrinsic membrane protein: the case of the calcium pump. Biochim. Biophys. Acta. 1376(3), 381-390

103. Lee A.G. (2002) Ca2+-ATPase structure in the El and E2 conformations: mechanism, helix-helix and helix-lipid interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1565(2), 246-266

104. Lee H.G., Kang H., Kim D.H., Park W.J. (2001) Interaction of HRC (histidine-rich Ca2+-binding protein) and triadin in the lumen of sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 276(43), 39533-39538

105. Lee J.M., Rho S.H., Shin D.W., Cho C., Park W.J., Eom S.H., Ma J., Kim D.H. (2004) Negatively charged amino acids within the intraluminal loop of ryanodine receptor are involved in the interaction with triadin. J. Biol. Chem. 279(8), 6994-7000

106. Lennon N.J., Harmon S., Mackey A., Ohlendieck K. (1999) Oligomerization of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase SERCA2 in cardiac muscle. Mol. Cell. Biol. Res. Commiin. 1(3), 182-187

107. Li J., Bigelow D.J., Squier T.C. (2003) Phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase modulates the structural coupling between the transmembrane and cytosolic domains of phospholamban. Biochemisty. 42(36), 10674-10682

108. Li J., Xiong Y., Bigelow D.J., Squier T.C. (2004a) Phospholamban binds ina compact and ordered conformation to the Ca -ATPase. Biochemistry 43(2), 455-463

109. Li J., Bigelow D.J., Squier T.C. (2004b) Conformational changes within the cytosolic portion of phospholamban upon release of Ca2+-ATPase inhibition. Biochemistry 43(13), 63870-63879

110. Li J., Boschek C.B., Xiong Y., Sacksteder C.A., Squier T.C., Bigelow D.J. (2005) Essential role for Pro21 in phospholamban for optimal inhibition of the Ca2+-ATPase. Biochemistry 44(49), 16181-16191

111. Liguri G., Stefani M., Berti A., Nassi P., Ramponi G. (1980) Effect of acylphosphates on Ca uptake by sarcoplasmic reticulum vesicles. Arch. Biochem. Biophys. 200(2), 357-263

112. Lincoln T.M., Komalavilas P., Boerth N.J., MacMillan-Crow L.A., Cornwell T.L. (1995) cGMP signaling through cAMP- and cGMP-dependent protein kinases. Adv. Pharmacol. 34, 305-322

113. Lohuis T.D., Harlow H.J., Beck T.D. (2007) Hibernating black bears (Ursus americanns) experience skeletal muscle protein balance during winter anorexia. Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 147(1), 20-28.

114. Lokuta A.J., Meyers M.B., Sander P.R., Fishman G.I., Valdivia H.H. (1997) Modulation of cardiac ryanodine receptors by sorcin. J. Biol. Chem. 272(40), 25333-25338

115. Lowry O. II., Rosebrough N. J., Farr A. L. and Randall R. J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 195, 265-275

116. Lund S., Orlowski S., de Foresta B., Champeil P., le Maire M., Moller J.V.1989) Detergent structure and associated lipid as determinants in the2+stabilization of solubilized Ca -ATPase from sarcoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 264(9), 4907-4915

117. Lyman C. P. (1982) Who is Who among the Hibernators. In: Hibernation and torpor in Mammals and Birds. (Lyman C. P., Willis J. S., Malan A., Wang L. C. H., eds.). Academic Press, New York, 12-31

118. MacDonald, J.A., Storey, K.B. (1999). Regulation of ground squirrel Na+/K+-ATPase activity by reversible phosphorylation during hibernation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 424-429

119. Mackrill J.J. (1999) Protein-protein interactions in intracellular Ca2+-release channel function. Biochem. J. 337, 345-361

120. MacLennan D.H., Brandl C.J., Korczak B., Green N.M. (1985) Amino-acid sequence of a Ca2+ + Mg2+-dependent ATPase from rabbit muscle sarcoplasmic reticulum, deduced from its complementary DNA sequence. Nature 316(6030), 696-700

121. MacLennan D.H., Rice W.J., Green N.M. (1997) The mechanism of Ca2+94transport by sarco(endo)plasmic reticulum Ca -ATPases. J. Biol. Chem. 272(46), 28815-28818

122. MacLennan D.H., Asahi M., Tupling A.R. (2003) The regulation of SERCA-type pumps by phospholamban and sarcolipin. Ann. N.-Y. Acad. Sci. 986, 472-480

123. Macmillan D., Currie S., McCarron J.G. (2007) FK506-binding protein (FKBP12) regulates ryanodine receptor-evoked Ca2+ release in colonic but not aortic smooth muscle. Cell Calcium. Oct 19 Epub ahead of print.

124. Maguire P.B, Ohlendieck K. (1996) Oligomerization of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase from rabbit skeletal muscle. FEBS Lett. 396(2-3), 115-118

125. Martonosi A., Feretos R. (1964) Sarcoplasmic reticulum. I. The uptake of Ca2+ by sarcoplasmic reticulum fragments. J. Biol. Chem. 239, 648-658

126. Martonosi A^N. (1984) Mechanisms of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Physiol. Rev. 64(4), 1240-1320

127. Marty I., Thevenon D., Scotto C., Groh S., Sainnier S., Robert M., Grunwald D., Villaz M. (2000) Cloning and characterization of a new isoform of skeletal muscle triadin. J. Biol. Chem. 275(11), 8206-8212

128. Marty I. (2004) Triadin: a multi-protein family for which purpose? Cell. Mol. Life. Sci. 61(15), 1850-1853

129. Meissner G. (1975) Isolation and characterization of two types of sarcoplasmic reticulum vesicles. Biochim. Biophys. Acta. 389(1), 51-68

130. Meissner G. (1986) Evidence of a role for calmodulin in the regulation of calcium release from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 25(1), 244-251

131. Meissner G, Lu X. (1995) Dihydropyridine receptor-ryanodine receptor interactions in skeletal muscle excitation-contraction coupling. Biosci. Rep. 15(5), 399-408

132. Melgunov V.I., Akimova E.l. (1980) The dependence for reactivation of lipid-depleted Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum by non-ionic detergents on their hydrophile/lipophile balance. FEBS Lett. 121(2), 235238

133. Merino J.M., Gutiérrez-Merino С., Henao F. (1999) Plausible stoichiometry of the interacting nucleotide-binding sites in the Ca2+-ATPasc from sarcoplasmic reticulum membranes. Arch. Biochem. Biophys. 368(2), 298302.

134. Meszaros L. G., Brown K. L., Ikemoto N. (1987) 4',6-Diamidino-2-phenylindole, a novel conformational probe of the sarcoplasmic reticulum1. Л I n i

135. Ca pump, and its effect on Ca release. J. Biol. Chem. 262, 11553-11558

136. Metcalfe E.E., Traaseth N.J., Veglia G. (2005) Serine 16 phosphorylation induces an order-to-disorder transition in monomeric phospholamban. Biochemistry 44(11), 4386-4396

137. Meyers M.B., Pickel V.M., Sheu S.S., Sharma V.K., Scotto K.W., Fishman G.I. (1995) Association of sorcin with the cardiac ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 270(44), 26411-26418

138. Michalak M., Dupraz P., Shoshan-Barmatz V. (1988) Ryanodine binding to sarcoplasmic reticulum membrane; comparison between cardiac and skeletal muscle. Biochim. Biophys. Acta. 939(3), 587-594

139. Milner R. E., Michalak M. and Wang L. C. H. (1991) Altered properties of calsequestrin and the ryanodine receptor in the cardiac sarcoplasmic reticulum of hibernating mammals. Biochim. Biophys. Acta 1063, 120-128

140. ATPase. Biochim. Biophys. Acta. 1318(1-2), 52-70

141. Mitchell R.D., Palade P., Saito A., Fleischer S. (1988) Isolation of triads from skeletal muscle. Methods Enzymol. 157, 51-68

142. Mitev V., Pauloin A., Houdebine L.M. (1994) Purification and characterization of two casein kinase type II isozymes from bovine brain gray matter. J. Nenrochem. 63(2), 17-26

143. Molina E., Plana M., Itarte E. (1991) Heterogeneity of rat liver cytosol casein kinase 2. Association between the alpha/alpha' -subunits of casein kinase 2 and the phosphorylatable protein pp49. Biochem J. 277 ( Pt 3), 811-818

144. Moller J.V., Andersen J.P., le Maire M. (1982) The sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Mol. Cell. Biochem. 42(2), 83-107

145. Moller J.V., Juul B., le Maire M. (1996) Structural organization, ion transport, and energy transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta. 1286(1), 1-51

146. Napier R.M., East J.M., Lee A.G. (1987) State of aggregation of the (Ca2+ +2+

147. Mg )-ATPase studied using saturation-transfer electron spin resonance. Biochim. Biophys. Acta. 903(2), 365-373

148. Nishizuka Y. (1986) Studies and perspectives of protein kinase C. Science. 233(4761), 305-312

149. O'Dell T.J., Kandel E.R., Grant S.G. (1991) Long-term potentiation in the hippocampus is blocked by tyrosine kinase inhibitors. Nature. 353(6344),558.560

150. Odermatt A., Becker S., Khanna V.K., Kurzydlowski K., Leisner E., Pette D., MacLennan D.H. (1998) Sarcolipin regulates the activity of SERCA1, the fast-twitch skeletal muscle sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. J. Biol. Chem. 273(20), 12360-12369

151. Ogawa Y, Kurebayashi N, Murayama T (1999) Ryanodine receptor isoforms in excitation-contraction coupling. Adv. Biophys. 36, 27-64

152. Orr I., Shoshan-Barmatz V. (1996) Modulation of the skeletal muscle ryanodine receptor by endogenous phosphorylation of 160/150-kDa proteins of the sarcoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 1283, 80-88

153. Pedersen P. L., Carafoli E. (1987) Ion motive ATPase. Ubiquity, properties and significance to cell function. TIBS 12, 1315-1322

154. Pehowich D.J., Wang L.C.H. (1984) Seasonal changes in mitochondrial succinat dehydrogenase activity in a hibernator Spermophilus richardsonii. J. Comp. Physiol. 154B, 495-501

155. Post R.L., Hegyvary C., Kume S. (1972) Activation by adenosine triphosphate in the phosphorylation kinetics of sodium and potassium ion transport adenosine triphosphatase. J. Biol. Chem. 247(20), 6530-6540

156. Pulawa L.K., Florant G.L. (2000)The effects of caloric restriction on the body composition and hibernation of the golden-mantled ground squirrel (Spermophilus lateralis). Physiol. Biochem. Zool. 73(5), 538-546

157. Ribeiro J.M., Aragao E.S., Vianna A.L. (1980) Steady state kinetics of the (Ca2+/Mg2+)-dependent P-nitrophenylphosphatase activity of sarcoplasmic reticulum vessicles. Ann. Acad. Bras. Cienc. 52(2), 403-409

158. Rogdestvenskaya Z.E., Khromov A.S., Srebnitskaya L.K. (1994) The hibernation-induced changes in structure and function of m.psoas fromground squirrel. Abstr. Book of Intern. Symp. "Biological Motility", Pushino, Russia, 189

159. Rosemblatt M.S., Scales D.J. (1989) Morphological, immunological and biochemical characterization of purified transverse tubule membranes isolated from rabbit skeletal muscle. Mol. Cell Biochem. 87(1), 57-69

160. Rosen O.M., Erlichman J., Rubin C.S.(1975) Molecular structure and characterization of bovine heart protein kinase. Adv. Cyclic Nucleotide Res. 5, 253-263

161. Rubtsov A.M. (2001) Hibernation: protein adaptations. In Cell and Molecular Responces to Stress, Vol. 2 (Storey, K.B., and Storey, J.M., eds.), Elsevier Science, Amsterdam, pp. 57-71

162. Sacchetto R., Damiani E., Turcato R, Nori A., Margreth A. (2001) Ca2+-dependent interaction of triadin with histidine-rich Ca -binding protein carboxyl-terminal region. Biochem. Biophys. Res. Commnn. 289(5), 11251134

163. Sagara Y., Inesi G. (1991) Inhibition of the sarcoplasmic reticulum Ca transport ATPase by thapsigargin at subnanomolar concentrations. J. Biol. Chem. 266, 13503-13506

164. Saito A., Seiler S., Chu A., Fleischer S. (1984) Preparation and morphology of sarcoplasmic reticulum terminal cisternae from rabbit skeletal muscle. J. Cell. Biol. 99(3), 875-885

165. Shorina E. A., Mast N. V., Lopina O. D., Rubtsov A. M. (1997) Melittin-induced inhibition and aggregationof Ca -ATPasein skeletal musclesarcoplasmic reticulum: a comparative study. Biochemistry 36, 13455-13460

166. Shoshan-Barmatz V., Ashley R.H. (1998) The structure, function, and cellular regulation of ryanodine-sensitive Ca2+ release channels. Int. Rev. Cytol. 183, 185-270

167. Shou W., Aghdasi B., Armstrong D.L., Guo Q., Bao S., Charng M.J., Mathews L.M., Schneider M.D., Hamilton S.L., Matzuk M.M. (1998) Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature 391(6666), 489-492

168. Simmerman, H.K.B., Jones, L.R. (1998) Phospholamban: protein structure, mechanism of action, and role in cardiac contraction. Physiol. Rev. 78, 921946

169. Smith W.S., Broadbridge R., East J.M., Lee A.G. (2002) Sarcolipin uncouples hydrolysis of ATP from accumulation of Ca2+ by the Ca2+-ATPase of skeletal-muscle sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 361(Pt 2), 277-286

170. Sorrentino V, Reggiani C. (1999) Expression of the ryanodine receptor type 3 in skeletal muscle. A new partner in excitation-contraction coupling? Trends. Cardiovasc. Med. 9, 54-61

171. Srere II. K., Wang L. C. H. and Martin S. L. (1992) Central role of differential gene expression in mammalian hibernation. Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 7119-7123

172. Starling A.P., East J.M., Lee A.G. (1995) Effects of gel phase phospholipid on the Ca2+-ATPase. Biochemistry 34(9), 3084-3091

173. Stephenson D.G., Lamb G.D., Stephenson G.M. (1998) Events of the excitation-contraction-relaxation (E-C-R) cycle in fast- and slow-twitch mammalian muscle fibres relevant to muscle fatigue. Acta. Physiol. Scand. 162(3), 229-245

174. Storey K. B. (1987) Regulation of liver metabolism by enzyme phosphorylation during mammalian hibernation. J. Biol. Chem. 262, 16701673

175. Storey K. B. (1997) Metabolic regulation in mammalian hibernation:enzyme and protein adaptation. Comp. Biochem. Physiol., 118A (4), 11151124

176. Strand M.A., Louis C.F., Mickelson J.R. (1993) Phosphorylation of the porcine skeletal and cardiac muscle sarcoplasmic reticulum ryanodine receptor. Biochim. Biophys. Acta. 1175(3), 319-326

177. Suk J.Y., Kim Y.S., Park W.J. (1999) HRC (histidine-rich Ca2+-binding protein) resides in the lumen of sarcoplasmic reticulum as a multimer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 263(3), 667-671

178. Sutko J.L., Airey J.A. (1996) Ryanodine receptor Ca2+ release channels: does diversity in form equal diversity in function? Physiol. Rev. 76(4), 10271071

179. Szegedi C, Sarkozi S, Herzog A, Jona I, Varsanyi M. (1999) Calsequestrin: more than 'only' a luminal Ca buffer inside the sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 337, 19-22

180. Szymanska G., Kim II.W., Kranias E.G. (1991) Reconstitution of the94skeletal sarcoplasmic reticulum Ca -pump: influence of negatively charged phospholipids. Biochim. Biophys. Acta. 1091(2), 127-134

181. Tada M., Yamamoto T., Tonomura Y. (1978) Molecular mechanism of active calcium transport by sarcoplasmic reticulum. Physiol. Rev. 58(1), 1-79

182. Takasago T., Imagawa T., Furukawa K., Ogurusu T., Shigekawa M. (1991) Regulation of the cardiac ryanodine receptor by protein kinase-dependent phosphorylation. J. Biochem. 109(1), 163-170

183. Toyofuku T., Curotto Kurzydlowski K., Narayanan N., MacLennan D.H. (1994) Identification of Ser38 as the site in cardiac sarcoplasmic reticulum1. Or o.

184. Ca -ATPase that is phosphorylated by Ca /calmodulin-dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 269(42). 26492-26496

185. Toyoshima C., Sasabe H., Stokes D.L. (1993) Three-dimensional cryo-electron microscopy of the calcium ion pump in the sarcoplasmic reticulum membrane. Nature 362(6419), 467-471

186. Toyoshima C., Nakasako M., Nomura IT, Ogawa H. (2000) Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution. Nature 405(6787), 647-655

187. Traaseth N.J., Thomas D.D., Veglia G. (2006) Effects of Serl694phosphorylation on the allosteric transitions of phospholamban/Ca -ATPase complex. J. Mol. Biol. 358(4), 1041-1050

188. Turi A., Somogyi J. (1988) Possible regulation of the myometrial Na+/K+-ATPase activity by Ca and cAMP-dependent protein kinase. Biochim. Biophys. Acta. 940(1), 77-84

189. Vale M.G., Carvalho A.P. (1980) Effect of temperature on the reversal of the calcium ion pump in sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 186(2), 461-467

190. Velickovska V., van Breukelen F. (2007) Ubiquitylation of proteins in livers of hibernating golden-mantled ground squirrels Spermophilus lateralis. Cryobiology 55(3), 230-235

191. Voss J., Jones L.R., Thomas D.D. (1994) The physical mechanism of calcium pump regulation in the heart. Biophys. J. 67(1), 190-196

192. Voss J.C., Mahaney J.E., Thomas D.D. (1995) Mechanism of Ca-ATPase inhibition by melittin in skeletal sarcoplasmic reticulum. Biochemistry 34(3), 930-939

193. Wallmark B., Stewart H.B., Rabon E., Saccomani G., Sachs G. (1980) The catalytic cycle of gastric H+/K+-ATPase. J. Biol. Chem. 255(11), 5313-5319

194. Wehrens X.H., Lehnart S.E., Reiken S.R., Marks A.R. (2004) Ca /calmodulin-dependent protein kinase II phosphorylation regulates the cardiac ryanodine receptor. Circ. Res. 94(6), 61-70

195. White T.E., Dewey T.G. (1987) A fluorescence investigation of the nucleotide binding sites of the Ca2+- ATPase. Membr. Biochem. 7(1), 67-72

196. Wickler SJ., I-Ioyt D.F., van Breukelen F. (1991) Disuse atrophy in the hibernating golden-mantled ground squirrel, Spennophilus lateralis. Am. J. Physiol. 261(5 Pt 2), 1214-1217

197. Witcher D.R., Strifler B.A., Jones L.R. (1992) Cardiac-specific phosphorylation site for multifunctional Ca /calmodulin-dependent protein kinase is conserved in the brain ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 267(7), 4963-4967

198. Xiao B., Sutherland C., Walsh M.P., Chen S.R. (2004) Protein kinase A phosphorylation at serine-2808 of the cardiac Ca2+-release channel (ryanodine receptor) does not dissociate 12.6-kDa FK506-binding protein (FKBP12.6). Circ. Res. 94(4), 487-495

199. Xiao B., Zhong G., Obayashi M., Yang D., Chen K., Walsh M.P., Shimoni

200. Xu K.Y., Becker L.C. (1998) Ultrastructural localization of glycolytic enzymes on sarcoplasmic reticulum vesticles. J. Histochem. Cytochem. 46(4), 419-427

201. Xu K.Y., Zweier J.L., Becker L.C. (1995) Functional coupling between glycolysis and sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport. Circ. Res. 77(1), 8897

202. Xu L., Tripathy A., Paselc D.A., Meissner G. (1999) Ruthenium red modifies the cardiac and skeletal muscle Ca release channels (ryanodine receptors) by multiple mechanisms. J. Biol. Chem. 274(46), 32680-32691

203. Yacoe M. E. (1983) Adjustments of metabolic pathways in the pectoralis mucsles of the bat Eptesicus fuscus related to carbohydrate sparing during hibernation. Physiol. Zool. 56 (4), 648-658

204. Yamaguchi N., Kagari T., Kasai M. (1999) Inhibition of the ryanodine receptor calcium channel in the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle by an ADP/ATP translocase inhibitor, atractyloside. Biochem Biophys Res Commun. 258(2), 247-251

205. Yamaguchi N., Kasai M. (1998) Identification of 30 kDa calsequestrin-binding protein, which regulates calcium release from sarcoplasmic reticulum of rabbit skeletal muscle. Biochem. J. 335 (3), 541-547

206. Yamamoto T., Tonomura Y. (1967) Reaction mechanism of the Ca2+ -dependent ATPase of sarcoplasmic reticulum from skeletal muscle. I. Kinetic studies. J. Biochem. 62(5), 558-575

207. Yan J., Barnes B.M., Kohl F., Marr T.G. (2008) Modulation of gene expression in hibernating arctic ground squirrels. Physiol. Genomics. 32(2), 170-81.

208. Yano K. and Zarain-Herzberg A. (1994) Sarcoplasmic reticulum calsequestrins: structural and functional properties. Mol. Cell. Biochem. 135, 61-70

209. Yoshida A., Takahashi M., Imagawa T., Shigekawa M., Takisawa H., Nakamura T. (1992) Phosphorylation of ryanodine receptors in rat myocytes during beta-adrenergic stimulation. J. Biochem. 111(2), 186-190

210. Zandomeni R., Weinmann R. (1984) Inhibitory effect of 5,6-dichloro-l-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole on a protein kinase. J. Biol. Chem. 259(23), 14804-14811

211. Zhegunov G.F., Kotljarov A.P., Sutshenko E.S. (1992) The role of protein rearrangement in cell of heterothermal animals in the cource of adaptation to low temperatures. In: Mechanisms of natural hypometabolic states. Pushchino Research Center, 147-154

212. Depolarization \Д . Depolariiatkm1. Exterior1. Cytosol Ca2" ATPase ■1. Terminal cisterna Ca* Caof SR Ca2* Ca1' Ca?"1. SR membrane1. T tubule membrane1. CaJ* release channel3 Ca3* recovery1. ATP , Ali? ADP+ P,

213. Рисунок I. Принципиальная схема функционирования саркоплазматического ретикулума. Пояснения в тексте. Рисунок из Molecular cell biology, fourth edition, 2001, s.7791. Ope n i fate

214. Рисунок 2. Трехмерная реконструкция пространственной структуры Са-канала CP (RyR), полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (по Sorrento, Reggiani, 1999)1. ТИР-АИР1. Цитоплазма1. МембранаМ

215. Рисунок 3. Схема пространственной организации молекулы Са-АТРазы (изоформа 8ЕЯСА I). Данные рентгеноструктурного анализа (по ТоуозЫта е1 а1., 2000).