Выделение и характеристика противоопухолевых белков их лимфоцитов и тромбоцитов человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Паромов, Виктор Максимович

• Паромов, Виктор Максимович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Паромов, Виктор Максимович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Тромбоциты как эффекторы иммунной системы.

1.1. Морфология и функциональные особенности тромбоцитов.

1.1.1. Морфология тромбоцитов.

1.1.2. Основные механизмы активации тромбоцитов.

1.2. Противоопухолевые свойства тромбоцитов.

1.2.1. Цитотоксическая активность тромбоцитов.

1.2.2. Взаимодействие тромбоцитов и опухоли.

1.3. Цитокины тромбоцитов.

1.3.1. Тромбоциты и цитокины: проекция и отклик.

1.4. Основные механизмы клеточной гибели.

1.4.1. Некроз.

1.4.2. Апоптоз.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Реактивы, буферы и растворы.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Культивирование и стимуляция тромбоцитов человека.

2.2.2. Получение лизатов стимулированных тромбоцитов человека.

2.2.3. Получение супернатантов стимулированных тромбоцитов человека.

2.2.4. Культивирование и стимуляция мононуклеаров периферической крови человека.

2.2.5. Получение супернатантов стимулированных мононуклеаров периферической крови человека.

2.2.6. Функциональные исследования тромбоцитов.

2.2.7. Фракционирование белков по молекулярным массам с помощью центрифугирования с использованием мембран М1сгосоп.

2.2.8. Высокоэффективная жидкостная хроматография белков.

2.2.9. ДСН-электрофорез белков и электроблоттинг наРУОР мембрану.

2.2.10. Сканирование белков иммобилизованных на Р\Т)Р мембране.

2.2.11. Определение аминокислотной последовательности белков иммобилизованных на РУОБ мембране.

2.2.12. Элюция белков сР\Т>Б мембраны.

2.3.13. Цитотоксический тест с использованием витального красителя МТТ.

2.3.14. Исследование пролиферации клеток по включению [3Н]тимидина.

2.3.15. Статистическая обработка результатов.

2.3.16. Получение поликлональных антител к цитотоксическим белкам тромбоцитов.

2.3.17. Иммуноблоттинг.

2.3.18. Определение нуклеосомальной фрагментации клеток-мишеней.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследования стимулированных тромбоцитов человека.

3.1.1. Цитотоксическая активность тромбоцитов человека, стимулированных различными экзогенными агентами.

3.1.2. Функциональные исследования тромбоцитов, стимулированных различными экзогенными агентами.

3.1.3. Сравнительная цитотоксичность тромбоцитов и мононуклеаров периферической крови человека, стимулированных Са-ионофором.

3.2. Выделение и характеристика цитотоксических белков из экстракта тромбоцитов человека, стимулированных Са-ионофором.

3.2.1. Выделение и структурные исследования цитотоксических белков ЦТФи ЦТФ-28 из лизата тромбоцитов человека, стимулированных Са-ионофором.

3.2.2. Исследования цитотоксичности белков ЦТФ-14 и ЦТФ-28.

3.2.3. Изучение механизма гибели клеток-мишеней, индуцируемого белками

ЦГФ-14 и ЦТФ-28.

3.2.4. Идентификация белков ЦТФ-14 и ЦТФ-28 в супернатантах и лизатах тромбоцитов человека, стимулированных различными экзогенными агентами.

3.3. Выделение и характеристика белка массой 14 кДа, повышающего пролиферативный ответ мононуклеаров периферической крови человека на стимуляцию конканавалином А, из супернатанта тромбоцитов человека, стимулированных Са-ионофором.

3.3.1. Выделение и структурные исследования белка массой 14 кДа из супернатанта тромбоцитов человека, стимулированных Са-ионофором.

3.3.2. Исследования биологической активности белка массой 14 кДа из супернатанта тромбоцитов человека, стимулированных Са-ионофором.

3.3.3. Идентификация белка массой 14 кДа в супернатанте мононуклеаров периферической крови человека, стимулированных Са-ионофором.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и характеристика противоопухолевых белков их лимфоцитов и тромбоцитов человека»

Актуальность проблемы.

Важную роль в осуществлении иммунного ответа организма играют цитокины -белковые факторы, продуцируемые в основном лимфоцитами и другими клетками иммунной системы. Цитокины составляют особый класс секреторных белков, которые действуют через рецептор-опосредованные пути и регулируют различные межклеточные взаимодействия, вызывая гуморальный ответ как иммунных, так и тканевых клеток организма. Цитокины, таким образом, вызывают широчайший спектр клеточных ответов: активацию, пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов и других клеток крови, направленную миграцию клеток-эффекторов, активизацию процессов программируемой клеточной гибели и т.п. Изучение как самих цитокинов, так и всего многообразия опосредованных ими клеточных ответов имеет традиционно важное значение для развития новейших методов иммунотерапии онкологических заболеваний.

Основное внимание при изучении клеточных механизмов противоопухолевого иммунитета традиционно уделяется лимфоцитам (в особенности Т-клеткам) как важнейшим клеткам-эффекторам иммунной системы, а также, немного в меньшей степени, - макрофагам, гранулоцитам и моноцитам. Однако, последние исследования в данной области показали, что наряду с лимфоцитами и другими иммунными клетками важную роль в проведении сигналов и осуществлении как противовоспалительных, так и противоопухолевых функций играют клетки крови, основные "задачи" которых напрямую не связаны с модуляцией иммунных ответов организма. К таким клеткам относятся, например, тромбоциты, основными функциями которых являются, как известно, адгезивно-аггрегационная и абсорбционно-транспортная способности. Наряду с этими функциями тромбоциты, как было показано [1], играют заметную роль в процессах цитолиза различных опухолевых клеток.

В ряде последних работ показано, что тромбоциты проявляют 1§С-, опосредованную цитотоксичность как в отношении паразитических одноклеточных микроорганизмов [2,3], так и в отношении эндотелиальных клеток [4,5] и эритроцитов [6]. Противоопухолевая цитотоксичность тромбоцитов может быть опосредована антителами и белками комплемента [7]. В то же время, как активированные, так и неактивированные тромбоциты способны эффективно лизировать различные линии опухолевых клеток в отсутствии специфических антител и белков комплемента [8,9]. Таким образом, тромбоциты можно рассматривать в качестве полноценных эффекторных клеток иммунной системы. Хотя эти кровяные тельца довольно малы по сравнению с лимфоцитами или макрофагами и, кроме того, не обладают ядром, по общему количеству и общей площади поверхности клеточных мембран находящиеся в кровяном русле организма тромбоциты значительно превосходят как лимфоциты, так и любые другие "классические" клетки-эффекторы иммунной системы. Таким образом, роль тромбоцитов в активизации защитных процессов организма на клеточном уровне заслуживает пристального внимания.

Стимуляция цитолитической активности тромбоцитов так или иначе связана с их активацией. Как было показано [10] стимуляция тромбоцитов фактором активации тромбоцитов (ФАТ) или тромбином в различных концентрациях ведет либо к их активации и агрегации (при больших концентрациях стимулятора), либо к стимуляции противоопухолевой цитолитической активности тромбоцитов (при меньших концентрациях стимулятора). Как первый, так и второй процессы могут быть модулированы различными рецептор-опосредованными сигналами, например - под воздействием лимфокинов. Так интерлейкин-1 (ИЛ-1) и интерлейкин-8 (ИЛ-8), рецепторы которых экспрессируют как активированные, так и неактивированные тромбоциты, вызывают как активацию и агрегацию тромбоцитов, так и стимуляцию их цитолитической активности против опухолевых клеток-мишеней [11]. Интерлейкин-2 (ИЛ-2), напротив, опосредованно ингибирует агрегацию тромбоцитов [12]. Сами тромбоциты, также, активно секретируют различные цитокины, в частности, гомопоэтические факторы ТОБ-р, РБОБ, РО-ЕСОБ, влияющие на пролиферацию и дифференцировку лейкоцитов, а также, способные активировать макрофаги и нейтрофилы [13,14].

Электронно-микроскопические исследования показали, что характер морфологических изменений тромбоцита (изменение формы клеточной мембраны после образования фокального межклеточного контакта, гипертрофия аппарата Гольджи, укрупнение секреторных гранул и скопление их в зоне контакта) при его взаимодействии с клеткой-мишенью, предшествующих гибели последней, очень похожи на аналогичные морфологические реакции лимфоцитов [15] (Рис. 1,2). Кроме того, активация тромбоцитов может быть опосредована оккупацией специфических мембранных рецепторов, идентичных УЬА-2, УЬА-5 и СЭ69 активационным рецепторам Т-лимфоцитов [16]. Как и другие иммунные эффекторные клетки, тромбоциты активно экспрессирют на мембранной поверхности рецепторы к Бс-фрагментам иммуноглобулинов класса О (^в) всех четырех типов, а также к Бс-фрагменту иммуноглобулина Е (1§Е) [17,6].

Рис. 1

Адсорбция тромбоцита на поверхности опухолевой клетки. Стрелками показана линия укрупнения микрофиламента около зоны фокального контакта. Увеличение 1 х 20 ООО

Рис. 2

Морфологические изменения тромбоцита при его адсорбции на поверхности опухолевой клетки: гипертрофия микротрубочек (МТ) около зоны фокального контакта; укрупнение гранул хранения и скопление их около зоны контакта. DB - плотные тельца. SCS -поверхностно-вакуолярная система. Увеличение 1 х 20 ООО (верх) 1x115 ООО (низ)

11

По характеру поверхностной экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), тромбоциты близки к полиморфно-ядерным лейкоцитам и моноцитам [18]. Киллинг опухолевых клеток, опосредованный тромбоцитами, по некоторым данным [19] может происходить посредством выделения в зону межклеточного контакта закиси азота, впервые охарактеризованной как эффекторный агент, продуцируемый макрофагами [20].

Все вышеперечисленные факты дают основание предполагать, что механизмы противоопухолевой активности тромбоцитов и других эффекторных клеток иммунной системы, в особенности макрофагов и моноцитов, с которыми они имеют общих предшественников, имеют много общего, а также, предполагать существование секретируемых тромбоцитами белковых факторов, способных оказывать прямое цитолитическое воздействие на опухолевые клетки, и, возможно, белковых медиаторов, участвующих в активации других эффекторных клеток.

Цель работы.

Основной целью данной работы являлось изучение механизмов стимуляции тромбоцитов различными экзогенными агентами (Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА и рицином) и последующее выделение из полученного клеточного материала белковых медиаторов, способных оказывать прямое цитолитическое воздействие на опухолевые клетки, либо активирующих мононуклеарные клетки периферической крови.

В ходе исследования предполагалось решение следующих задач: 1. Изучение цитотоксической активности очищенных тромбоцитов человека против клеток линии К 562 после стимуляции первых различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА в наномольных концентрациях и рицином в пикомольных концентрациях, а также определение наличия апоптотической гибели клеток-мишеней.

2. Определение возможной активации очищенных тромбоцитов человека по циклооксигеназному пути при стимуляции различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА в наномольных концентрациях и рицином в пикомольных концентрациях.

3. Получение и исследование лизатов и супернатантов очищенных тромбоцитов человека, активированных различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА и рицином.

4. Выделение цитотоксических белковых факторов из полученных лизатов и супернатантов, определение их ]М-концевых аминокислотных последовательностей и изучение опосредованного ими механизма гибели клеток-мишеней.

5. Выделение из полученных супернатантов белковых медиаторов, активирующих мононуклеарные клетки периферической крови, определение их М-концевых аминокислотных последовательностей и изучение механизмов воздействия.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе на примере клеток линии К562 было показано, что противоопухолевая цитотоксичность тромбоцитов человека может быть эффективно стимулирована различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, ФГА и рицином в наномольных и пикомольных концентрациях. При этом стимуляция цитотоксичности сопровождается активацией тромбоцитов по классическому циклооксигеназному пути. Также показано, что стимулированные всеми вышеперечисленными экзогенными агентами тромбоциты человека не опосредуют апоптоз клеток-мишеней.

Кроме того, было показано, что стимулированные всеми вышеперечисленными экзогенными агентами тромбоциты человека накапливают и секретируют в межклеточное пространство специфические медиаторы белковой природы (цитотоксические тромбоцитарные факторы) ЦТФ-14 и ЦТФ-28. Данные медиаторы, однако, не способны вызывать апоптоз клеток-мишеней.

Вышеупомянутые цитотоксические тромбоцитарные факторы были выделены и их активность в разных концентрациях против клеток К 562 была изучена. Впервые определена ТМ-концевая аминокислотная последовательность цитотоксического белка тромбоцитов массой 28 кДа.

Из супернатанта тромбоцитов человека, стимулированных Са-ионофором А23187 был выделен ранее не описанный белок массой 14 кДа, способный усиливать пролиферативный ответ мононуклеарных клеток периферической крови человека на стимуляцию конканавалином А. Была определена ТМ-концевая аминокислотная последовательность данного белкового фактора.

Апробация работы и публикации.

Результаты данной работы были представлены на межлабораторных семинарах Института Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и на межлабораторной конференции НИИ Клинической Онкологии Онкологического Научного Центра РАМН.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Паромов, Виктор Максимович

Выводы

1. Исследована цитотоксическая активность тромбоцитов человека в отношении опухолевых клеток линии К 562 после стимуляции первых различными экзогенными агентами: Са-ионофором А23187, ФАТ, конканавалином А и рицином в наномольных и пикомольных концентрациях. Определены концентрации стимуляторов (10"7М Са-ионофор А23187, 10"8М ФАТ, 10"9М ФГА, 10"13М рицин), вызывающие наибольшее повышение цитотоксичности тромбоцитов. Характерно, что данные концентрации на один или несколько порядков ниже тех, при которых данные стимуляторы вызывают полную агрегацию тромбоцитов, что частично подтверждает гипотезу дифференцированного ответа (малые концентрации одних и тех же стимуляторов повышают цитотоксичность тромбоцитов, а сравнительно большие - вызывают активацию и агрегацию).

2. Установлено, что стимуляция цитотоксической активности тромбоцитов сопровождается резким повышением продукции тромбоксана А2, что показывает очевидное сходство начальных этапов активации и стимуляции цитотоксичности тромбоцитов.

3. Установлено, что цитолитический эффект тромбоцитов в отношении клеток линии К 562 во многом определяется воздействием на данные опухолевые клетки растворимых цитотоксических тромбоцитарных факторов ЦТФ-14 и ЦТФ-28, находящихся, вероятно, в гранулах хранения тромбоцитов и секреггируемых после стимуляции.

4. Выделены цитотоксические тромбоцитарные факторы ЦТФ-14 и ЦТФ-28, являющиеся растворимыми белками молекулярными массами 14 кДа и 28 кДа соответственно. Определены 1М-концевые аминокислотные последовательности данных белковых медиаторов. Для ЦТФ-14 показана уникальность ТЧ-концевой последовательности и ограниченная степень гомологии фрагменту СЛв компонента комплемента человека:

1 УАРОХОРвР9-. ЦТФ-14

-241УАОВК0РОР249-. СЬ

Для ЦТФ-28 показана уникальность И-концевого участка (БУОЬТ-), не имеющего гомологии каким-либо фрагментам известных белковых последовательностей.

5. Определены концентрации ЦТФ-14 и ЦТФ-28, в которых они наиболее цитотоксичны для опухолевых клеток линии К 562.

6. Установлено, что совместная инкубация как нестимулированных, так и стимулированных тромбоцитов человека с клетками линии К 562, а также инкубация данных опухолевых клеток в присутствии ЦТФ-14 и ЦТФ-28 в наиболее цитотоксических концентрациях, не вызывают нуклеосомальной фрагментации ДНК клеток-мишеней.

7. Выделен уникальный белок р-14 из супернатанта тромбоцитов, стимулированных Са-ионофором, а также из супернатанта мононуклеаров периферической крови, стимулированных Са-ионофором. Определена Ы-концевая аминокислотная последовательность данного белка, который оказался в высокой степени гомологичен региону (99 - 103 аминокислотный остаток) антигена БС>-Р1 класса II главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) человека:

1VLERTXA7-. p-14

VLERTRA105-. HLADQ-pl

8. Установлено, что p-14 не обладает собственной цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток линий К 562 и ACL, а также, не стимулирует цитотоксичность МНК периферической крови при совместной 48-часовой инкубации. В то же время данный белковый фактор оказывает слабое стимулирующее влияние на пролиферацию МНК, а также, усиливает митогенное воздействие субоптимальных концентраций конканавалина А на пролиферацию МНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Паромов, Виктор Максимович, 1999 год

1. 1.ele G.M., Kay N.E., Jonson К.J., Jacol G. Human platelets exert cytotoxic effects on tumor cells. - Blood 1985, v.65, p.p. 1252-1259.

2. Joseph M., Auriant C., Gapron A., Vorng H., Viens P. A new function for platelets: IgE-dependent killing of schistosomes. J. Exp. Med. 1983, v.303, p.p.810-821.

3. Yong E.C., Chi E.Y., Eritsche T.R., Henderson W.R. Human platelet-mediated cytotxicity against Toxoplasma gondii: Role of tromboxane. J. Exp. Med. 1991, v. 173, p.p.65-72.

4. Jorgensen L., Hovig Т., Rowsell H.S., Mustard J.F. Adenosine diphosphate-indused platelet aggregation and vascular injury in swine and rabbits. Am. J. Pathol. 1970, v.61, p.p. 161-167.

5. Kishi Y., Numago F. In vitro study of vascular endothelial injury by activated platelets and its prevention. Atherosclerosis 1972, v.76, p.p.95-101.

6. Okada M., Kodama Т., Tominaga А. Коп K., Sagawa Т., Utsumi S. Cytotoxicity of activated platelets to autologous red blood cells. Br. J. Haematol. 1993, v.82, p.p. 142-149.

7. Slezak S., Symer D., Shin H. Platelet-mediated cytotoxicity. Role of antibody and C3, and Localization of the cytotoxic system. J. Exp. Med. 1987, v. 166, p.p.489-505.

8. Быковская C.H., Сперанский Д.Л., Куприянова Т.А. Специфическая противоопухолевая цитотоксичность тромбоцитов периферической крови больных раком легкого. Бюлл. эксп. биол. мед. 1988, т.6, с.708-712.

9. Sagawa Т., Kodama Т., Tominaga A., Okada М. Cytotoxicity of unstimulated and trombin-activated platelets to human tumor cells. Immunology 1993, v.78, p.p.650-662.

10. Callard R., Gearing A. The cytokine facts book. Academic Press, New York, 1994.

11. Heldin C.H., Usuki K., Miyazono K. Platelet-derived endothelial cell growth factor. J. Cell. Biochem. 1991, v.47, p.p.208-210.

12. Bykovskaya S.N., Bolvacheva A.V., Kiselevsky M.V., Khaylenko V.A., Bykovsky A.F. Platelet-mediated cytotoxicity and its enhancement by platelet-activating factor. -Biomed. Pharmacother. 1991, v.44, p.p.74-82.

13. Testi R., Pulcinelli F., Frati L., Gazzaniga P.P., Santoni A. CD69 is expressed on platelets and mediates platelet activation and aggregation. J. Exp. Med. 1990, v. 172, p.p.701-707.

14. Criep L.H. Allergy and clinical immunology. Acad. Press, London, 1976, p.p.511-517.

15. Физиология висцеральных систем. 1991, Высшая школа, Москва, с. 152-163. 22Лригожина Т.А. Тромбоциты. Большая Мед. Энцикл. 1985, т. 25, с. 320-332.

16. Morgenstern E., Edelmann L., Reimers H.-J., Miyashita C., Haurand M. Fibrinogen distribution on surfaces and in organelles of ADP stimulated human blood platelets. -Eur. J. Cell. Biol. 1985, v.38, p.p.292-300.

17. Siess W. Molecular mechanisms of platelet activation. Physiol. Rev. 1989, v.69, p.p.58-74.

18. Ruf A., Patscheke H., Morgenstern E. Role of internalization in platelet activation by collagen fibers. Thromb. Haemostas. 1991, v.66, p.p.708-714.

19. Steiner M. Platelet surface glycosaminoglycans are an effective shield for distinct platelet receptors. Biochim. Biophys. Act. 1987, v.931, p.p.286-293.

20. Cerletti C., Rajtar G., Marchi E., Degaetano G. Interaction between glycosaminoglycans, platelets, and leukocytes. Sem. Thromb. Haemostas. 1994, v.20, p.p.245-252.

21. Хэм А., Кормак Д. Кровяные пластинки. Гистология, т.2 (пер. с англ.), Мир, Москва, 1983, с. 120-142.

22. Harrison P., Cramer Е.М. Platelet alpha-granules. Blood Rev. 1993, v.7, p.p.52-62.

23. Preissner K.T., de Groot P. Platelet adhesion molecules in natural immunity. In: Natural immune system: humoral factors (Ed. Sim E.) Oxford University Press, 1993, p.p.281-318.

24. Morgenstern E., Bastian D., Dierichs S. The formation of compound granules from different types of secretory organelles in human platelets (dense granules and alpha-granules). Eur. J. Cell. Biol. 1995, v.68, p.p.183-190.

25. Morgenstern E., Ultracytochemistry of human blood platelets. Progr. Histochem. Cytochem. 1980, 12/4, Fischer, Stuttgart-New York, p.p. 1-86.

26. Bentfeld-Barker M.E., Bainton F. Identification of primary lysosomes in human megacaryocytes and platelets. Blood, 1982, v.59, p.p.472-481.

27. Hamamoto K., Ohga S., Nomura S., Yasunaga K. Cellular distribution of CD63 antigen in platelets and in three megacaryocytic cell lines. Histochem. J. 1994, v.26, p.p.367-375.

28. Могош Г. Тромбозы и эмболии при сердечно-сосудистых заболеваниях, (пер. с румынск.) Бухарест, 1979, с. 24-25.

29. Branehog I., Kutti J., Weinfeld A. Platelet survival and platelet production in idiopathic thrombocytopenic purpura. Brit. J. Haematol. 1974, v.27, p.p. 127-132.

30. Nalbadian R.M., Henry R.L., Bick R.L. Thrombotic thrombocytopenic purpura. -Thromb. Haemost. 1979, v.5, p.p.216-123.

31. Kroll M.H., Schafer A.I. Biochemical mechanisms of platelet activation. Blood 1989, v.74, p.p.1181-1196.

32. Santoro S.A. Identification of a 160 000 Da platelet membrane protein that mediates the initial divalent cation-dependent adhesion of platelets to collagen. Cell 1986, v.46, p.p.913-922.

33. Halushka P.V., Mais D.E., Saussy D.L.Jr. Platelet and vascular smooth muscle thromboxane A2/prostaglandin H2 receptors. Fed. Proc. >987, v.46, p.p. 149-156.

34. Hwang S.B., Lee C.S.C., Cheah M.J., Shen T.Y. Specific receptor sites for l-O-alkyl-2-O-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine (platelet activating factor) on rabbit platelet and guinea pig smooth muscle membranes. Biochemistry 1983, v.22, p.p.4756-4763.

35. Adler J.R., Handin R.I. Solubilization and characterization of a platelet membrane ADP-binding protein. J. Biol. Chem. 1979, v.254, p.p.3866-3874.

36. Alexander R.W., Cooper В., Handin R.I. Characterization of the human platelet a-adrenergic receptor. J. Clin. Invest. 1978, v.78, p.p. 1136-1148.

37. Schafer A.I., Cooper В., O'Hara D., Handin R.I. Identification of platelet receptors for prostaglandin I2 and D2 . J. Biol. Chem. 1979, v.254, p.p.2914-1926.

38. McGowan E.B., Detwiler T.C. Modified platelet responses to thrombin. Evidence for two types of receptors or coupling mechanisms. J. Biol. Chem. 1986, v.261, p.p.739-752.

39. Shuman M.A. Thrombin-cellular interactions. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1986, v.485, p.p.228-231.

40. Harmon J.T., Jamieson G.A. Activation of platelets by oc-thrombin is a receptor-mediated event. J. Biol. Chem. 1986, v.261, p.p.15928-15932.

41. Casey P. J., Gilman A.G. G protein involvement in receptor-effector coupling. J. Biol. Chem. 1988, v.263, p.p.2577-2582.

42. Neer E.J., Clapham D.E. Roles of G protein subunits in transmembrane signalling. Nature, 1988, v.333, p.p.129-134.

43. Kim D., Lewis D.L., Graziadei L., Neer E.J., Bar-Sagi D., Clapham D.E. G-protein f3y-subunits activate the cardiac muscarinic K+-channel via phospholipase A2. Nature 1989, v.337, p.p.557-562.

44. Gilman A.G. G-proteins and dual control of adenylate cyclase. Cell 1984, v.36, p.p.577-589.

45. Rittenhouse-Simmons S. Production of diglyceride from phosphatidyl-inositol in activated human platelets. J. Clin. Invest. 1979, v.63, p.p.580-588.

46. Mauco G., Chap H., Doulste-Blazy L. Characterization and properties of a phosphatidylinositol phosphodiesterase (phospholipase C) from platelet cytosol. FEB S Lett. 1979, v.100, p.p.367-372.

47. Bell R.L., Majerus P.W. Thrombin-induced hydrolysis of phosphatidylinositol in human platelets. J. Biol. Chem. 1980, v.255, p.p.1790-1799.

48. Rittenhouse S. E. Human platelets contain phospholipase C that hydrolyses polyphosphoinositides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, v.80, p.p. 5417-5422.

49. Broekman M.J., Ward J.W., Marcus A.J. Phospholipid metabolism in stimulated human platelets; changes in phosphatidylinositol, phosphatidic acid, and lysophospholipids. J. Clin. Invest. 1980, v.66,. p.p.275-284.

50. Brass L.F., Joseph S.K. A role for inositol trisphosphate in intracellular Ca2+mobilization and granule secretion in platelets. J. Biol. Chem. 1985, v.260, p.p. 15172-15186.

51. Brass L.F. Ca2+ homeostasis in unstimulated platelets. J. Biol. Chem. 1984, v.259, p.p.12563-12572.

52. Brass L.F. Shattil S.J. Changes in surface-bound and exchangeable calcium during platelet activation. J. Biol. Chem. 1982, v.257, p.p. 14000-14012.

53. Лысогоров H.B., Муляр А.Г., Макаров В.А. Ультраструктура и функции кровяных пластинок. Актуальные проблемы сердечно-сосудистой патологии. Вып.2. 1975, Москва, с.51.

54. Вашникель В.К., Петров М.Н. Ультраструктура и функции тромбоцитов человека. Наука, Ленинград, 1982, с.36.

55. Приживойт Г.Н. К вопросу о значении скопления тромбоцитов вокруг опухолевых клеток в кровяном русле. Вопр. клинич. экспер. онкол. 1970, т.7, с.147-154.

56. Scheider W., Scharf R.E., Aul С. Trombozyten und tumorkrankheit. Z. Gastroenterol. 1984, v.22, p.p.80-92.

57. Уколова М.А., Квакина Е.Б. О связи опухолевого процесса с тромбокиназной активностью. Арх. патол. 1962, т.5, с.7-12.

58. Мокина Г.Р., Приживойт Г.Н. О скоплении тромбоцитов вокруг опухолевых клеток, обнаруживаемых в крови. Вопр. клинич. экспер. онкол. 1965, т.2, с. 177-182.

59. Philippe С., Philippe В., Fouqueray В., Perez J., Lebret М., Baud L. Protection from tumor necrosis factor-mediated cytolysis by platelets. Am. J. Pathol. 1993, v. 143, p.p. 17131723.

60. Fidler I.J., Gersten D.M., Hart I.R. The biology of cancer invasion and metastasis. Adr. Cancer Res. 1978, v.28, p.p.149-161.

61. Avenarius H.J., Freund M., Poliwoda H. Effect of recombinant human granulocyte colony-stymulating factor (rh-G-CSF) on circulating platelets. Ann. Hematol. 1993, v.58, p.p. 189193.

62. Yee G.C. Colony-stimulating factors and tomorrow's pharmacy: why we must be ready. Am. J. Hosp. Pharm. 1989, v.46, Suppl. 2, p.p.24-29.

63. Ganser A., Seipelt G., Hoelzer D. The role of GM-CSF, G-CSF, interleukin-3, and erythropoietin in myelodysplasia syndromes. Am. J. Clin. Oncol. 1991, v. 14, Suppl. 1, p.p.34-39.

64. Antoniades H.N. Human platelet-derived growth factor (PDGF): purification of PDGF-I and PDGF-II and separation of their reduced subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, v.78, p.p.7314-7317.

65. Meyer-Ingold W., Eichner W. Platelet-derived growth factor. Cell. Biol. Int. 1995, v. 19, p.p.3 89-398.

66. Zetter B.R., Antoniades H.N. Stimulation of human vascular endothelial cell growth by a platelet-derived growth factor and thrombin. J. Supramol. Struct. 1979, v.l 1, p.p.361-370.

67. Witte L.D., Cornicelli J.A. Platelet-derived growth factor stimulates low density lipoprotein receptor activity in cultured human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1980, v.77, p.p.5962-5966.

68. Owen AJ.3d, Geyer R.P., Antoniades H.N. Human platelet-derived growth factor stimulates amino acid transport and protein synthesis by human diploid fibroblasts in plasma-free media. -Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1982, v.79, p.p.3203-3207.

69. Inglot A.D., Inglot O. Hormonal-like modulation of growth of moloney virus-induced tumors by interferon and platelet-derived growth factor. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 1983, v.31, p.p.243-248.

70. Claesson-Welsh L. Mechanism of action of platelet-derived growth factor. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1996, v.28, p.p.373-385.

71. Heldin C.H., Usuki K., Miyazono K. Platelet-derived endothelial cell growth factor. J. Cell. Biochem. 1991, v.47, p.p.208-210.

72. Miyazono K., Takaku F. Platelet-derived endothelial cell growth factor: structure and function. Jpn. Circ. J. 1991, v.55, p.p. 1022-1026.

73. Moghaddam A., Zhang H.T., Fan T.P., Hu D.E., Lees V.C., Turley H., Fox S.B., Gatter K.C., Harris A.L., Bicknell R. Thymidine Phosphorylase is angiogenic and promotes tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995, v.92, p.p.998-1002.

74. Nakayama Y., Sueishi K., Oka K., Kono S., Tomonaga M. Stromal angiogenesis in human glioma: a role of platelet-derived endothelial cell growth factor. Surg. Neurol. 1998, v.49, p.p.181-188.

75. Griffiths L., Stratford I.J. Platelet-derived endothelial cell growth factor thymidine Phosphorylase in tumour growth and response to therapy. Br. J. Cancer 1997, v.76, p.p.689-693.

76. Golstein P., Ojcius D., Young J. Cell death mechanisms and the immune system. Immunol. Rev. 1991, v.121, p.p.29-43.

77. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Brit. J. Cancer 1972, v.26, p.p.239-257.

78. Wyllie A.H., Kerr J.F., Currie A.R. Cell death: the significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol. 1980, v.69, p.p.251-306.

79. Trenn G., Takayama H., Sikorsky M. Antigen-receptor regulated exocytosis of cytolytic granules may not be required for target cell lysis by cytotoxic T-lymphocytes. Nature 1987, v.330, p.p.72-81.

80. Perotti M., Toddei F., Mirabelli F., Vairett M., Bellomo G., McConkey D.J., Orrenius S. Calcium-dependent DNA fragmentation in human synovial cells exposed to cell shock. FEB S Lett. 1990, v.259, p.p.331-334.

81. Yoshida A., Ueda T., Wana Y., Nakamura T. DNA damage and cell killing by camptothecin and its derivatives in human leukaemia HL 60 cells. J.Cancer Res. 1993, v.84, p.p.566-573.

82. Tomei L.D., Shapiro J.P., Cope F.O. Apoptosis in C3H/10T1/2 mouse embrionic cells: evidence for internucleosomal DNA modification in the absence of doublesrand cleavage. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1993, v.90, p.p.853-862.

83. Bicknell G.R., Cohen G.M. Cleavage of DNA to large hilobase pair fragments occurs in some forms of necrosis as well as apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, v.207, p.p.40-49.

84. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1968, v.97, p.p.77-89.

85. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, v.227, p.p.680-687.

86. Van de Loosdrecht A.A., Nennie E., Ossenkoppele G.J., Beelen R.H., Langenhuijsen M.M. Cell mediated cytotoxicity against U 937 cells by human monocytes and macrophages in a modified colorimetric MTT assay. Immunol. Methods 1991, v. 141, p.p. 15-21.

87. Pearson E.S., Hartley H.O. Biometrika Tables for Statisticians. Cambridge University Press, 1966.

88. Gerrard J.M., White J.G., Rao G.H.R. Effects of ionophore A23187 on blood platelets. -Am. J. Pathol. 1974, v.77, p.p.151-158.

89. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. Ribosome-inactivating proteins from plants. Biochim. Biophys. Acta 1993, v. 1154, p.p.237-282.