Цитотоксическая и иммуномодулирующая активность высокоэффективных ингибиторов белкового синтеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Бугхлала, Самира

• Бугхлала, Самира
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бугхлала, Самира

Оглавление

Введение

1. Обзор литературы

1.1 .Молекулярные механизмы активации лимфоцитов

1.1.1. Мембранные изменения при активации лимфоцитов

1.1.2. Роль кальция в активации лимфоцитов

1.1.3. Система внутриклеточных посредников в активации лимфоцитов

1.2. Цитотоксичвское противоопухолевое действие лимфоцитов

1.3. Общая характеристика и механизмы активация тромбоцитов 1.3.1. Противоопухолевая цитогоксичность тромбоцитов

1.4. Токсические растительные токсины

1.4.1. Токсически лекгины псшш-сотгштз

1.4.2. Структура и специфичность углеводсвязывающих центров В-субьеданицы

токсических лектинов

1.4.3. Ферментативная активность каталитических субьединиц

1.4.4. Связывание с клеточной поверхностью

1.4.5. Интернализация токсических лектинов

1.4.6. Внутриклеточный путь токсинов

1.5. Иммунноконьюгаты

1.5.1. Переносчики и цитотоксические агенты для элиминации

опухолевых клеток

1.5.2. Использование МАТ в составе конъюгатов с различными соедининиями

1.5.3. Иммунотоксины

1.5.4. Способы повышение эффективность иммунотоксинов

1.6. Физиологическая гибель клеток 36 2. Материалы и методы исследования

2.1 Выделение мононуклеарных клетск

2.2 Выделение тромбоцитов

5 10 10 10 12 13 15 18 19 19

2.3 Активация мононуктюарных клеток

24. Функциональные исследование тромбоцитов

2.5 Определение цитотоксической активности кггеток

2.6 Использование иммуноферметживнсго анализа для определения уровня цитокинов в супернатантах, стимулированных мононуклеарных клеток

2.7 Выделение белков из с^тггернатантов МНК

2.7.1 Фракционирование белков по молекулярным массам с помощью центрифугирования с использованием мембран 4^

2.7.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография белков

2.7.3 ДСН - электрофорез белков и электроблоттинг

2.7.4 Сканирование бе.лков

2.7.5 Определение Ы-коицевой аминокислотной последовательности белков

2.8. Определение нуклеосомальной фрагментации клеток мишеней 4

2.9. Исследование пролиферации клеток по включению [ЗН]ткми дина 48 3. Результаты и обсуждение

3.1. Повышение эффективности иммунотоксида КТА'ВЗР?

3.2. Прямая противоопухолевая дихотоксичность разных токсинов на К562

3.3. Определение иитотоксичности моншукпеарнььх клеток после их активации разными токсинами и конъюгатами в концентрациях не вызывающих шбелъ опухолевых клеток линии К562

3.4. Тестирование цитокинов в супернатантах стимулированных рицином

мононуклеаров

3.5. Сравнение щтгогоксичностъ мононуклеаров стимушфованных разными

факторами (ФГА, К ОН-А, Са-ионофор-А23187 и рицин)

3.6. Цитотоксическая активность тромбоцитов человека, стзадулированных различными экзогенными агентами

3.7. Функциональные исследования тромбоцитов, спт^улированных различными

экзогенными агентами

3.8. Сравнение циготоксичности мононуклеаров и тромбоцитов, стимулировшнььх

рицином и Са-ионофором

3.9. Исследование супернатантов мононуклеаров, активированных разными факторами

3.10, Исследование биологической активности р!4 86 3.11 Тестирование нуклеосомальной фрагментация ДНК мононуклеарньтх

Клеток

Заключение

Выводы

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - аминокислоты

AT -антитела

ИТ - иммуннотоксины

ЕК - естественные киллеры

К562 - эритролейкомическая линия клеток

Кон-А - конканавалин-А

ЛПС - липополисахариды

мАТ - моноклональные антитела

МНК - мононуклеарные клетки

РТА - А-цепь рицина

РТВ - В-цепь рицина

TAX - транбоксан

ФАТ - фактор активации тромбоцитов

ФГА - фитогемагглютинин

ФЛС - фосфолипазы - С

ФЛА - фосфолипазы - А

ФСБ - фосфатно солевой буфер

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Цитотоксическая и иммуномодулирующая активность высокоэффективных ингибиторов белкового синтеза»

ВВЕДЕНИЕ

Элиминация опухолевых клеток из организма является одной из важнейших проблем в современной биологии и медецине. Для решения этой проблемы многие исследователей удоляли большое внимание иммуной системе. Среди разных видов взаимодействия организма и опухоли одним из основных является взаимодействие, осуществляюмое с помощью иммунологических механизмов. Клетки иммунокомпетентной системы обусловливают выявление трансформированной опухолевой клетки. Они первыми вступают в непосредственный контакт с опухолевыми клетками и вызывают их повреждение или удаление из организма. Иммунная система обладает автономностью в распознавании и элиминации из организма генетически чужеродных клеток и субстанций. При этом распознаются ' гетерогенные вещества, находящиеся на плазматической мембране трансформированных клеток. Все остальные системы (нервная и эндокринная) организма, осуществляющие интеграцию его деятельности, оказывают регулирующее воздействие на функции иммунной системы. Они изменяют интенсивность ее реакции на опухолевую клетку [2].

В настоящее время показано, что центральными элементами иммунной системы являются лимфоциты- клетки, которые принимают участие в основных иммунных, в том числе противоопухолевых, реакциях. Распознавание опухолевых клеток и первичный ответ на них связаны с активацей Т-лимфоцитов. В составе Т-субпопуляций лимфоцитов входят антиген-реактивные клетки, которые участвуют в распознавании ассоцированного с опухолью антигена и определяют начало иммунной реакции. Важную роль в механизме распознавания играет комплекс гистосовместимости. При дальнейшем развитии иммунного ответа стимулируются эффекторные Т-клетки, что приводит к образованию цитотоксических клеток. Воздействие цитотоксических Т-клеток (Т-киллер) на опухолевую клетку -мишень связано с ее чувствительностью к серологически определенным антигенам комплекса гистосовместимости, хотя не исключена возможность действия на

другие структуры. После кратковременного контакта цитотоксичес ких Т-киллеров с чужеродной клеткой в последней могут возникнуть необратимые изменения, приводящие ее к гибели. При этом Т-киллер не синтезирует ДНК и существенно не изменяется , что позволяет одному Т-киллеру разрушить несколько клеток мишеней [3].

Кроме специфической цитотоксичности, в организме есть еще один вид киллерной реакции по отношению к опухолевым клеткам с помощью Е К. Они отличают от макрофагов, не имеют маркеров Т- и В- лимфоцитов, их действие на опухолевые клетки не зависит от антитела, комплемента и макрофагов. Т-лимфоциты могут значительно увеличивать активность естественных киллеров, помогая им установить контакт с опухолевой клеткой [93].

В цитотоксическом эффекте, осуществляемом антителами, большое значение имеют К- клетки, относящиеся к одной из субпопуляций В-лимфоцитов.

V

Фиксированные на В-лимфоцитах антитела, направленные против клеток опухоли, превращают В-лимфоцит в цитотоксическую эффекторную клетку, на поверхности которой обнаруживаются иммуноглобулиновые молекулы и рецепторы для Рс-фрагмента ^ в.

Активность К-клеток проявляется в начале роста опухоли или в период ее регрессии и отсутствует при быстром росте новообразования.

Макрофаги также являются главными киллерами опухолевых клеток. Изолированные от влияния лимфоцитов, макрофаги оказывают более выраженное киллерное действие на опухолевые клетки, чем в присутствии этих клеток. Лимфоциты при отсутствии макрофагов значительно теряют их киллер ные свойства. Способность макрофагов разрушать опухолевые клетки связана с фагоцитозом.

Кроме этого, в литературе есть данны свидетельствующие о способности тромбоцитов периферической крови осуществлят противоопухолевое цитотоксическое действие [4]. Ранее было известно только то, что тромбоциты способствуют метастазированию и эндоваскулярной инвазии злокачественных клеток [5].

Однако последние исследования показали, что тромбоциты могут подавлять рост опухолевых клеток, обработанных антителами. В других исследованиях было показано, что тромбоциты способны лизировать эритроциты ципленка и опухолевые клетки in vitro. Но механизм этой лизирующей реакции авторы объяснить не смогли. О способности тромбоцитов лизировать опухолевые клетки было сообщено в работе Grethen 1985 [6].

Авторы изучали цитотоксичность тромбоцитов периферической крови против клеток перевиваемых опухолевых линий и предположили, что механизм литического действия тромбоцитов связан с выделением цитотоксического медиатора.

Стимуляция цитотоксической активности лимфоцитов, макрофагов и тромбоцитов связана с их активацей. Так, к стимулятаром лимфоцитов и макрофагов относятся различные агенты, способствующие повышению иммунного ответа при антигенной стимуляции. Такими свойствами обладают химически агенты (латекс, алюминий, берилий), витамины (ретинол), нуклеиновые кислоты, синтетические полинуклеотиды, микроорганизмы (бактерии, вирусы, паразиты), вещества выделенные из растений. Иммунокомпетентные клетки вырабатывают много биологически активных факторов, имеющих значение для процессов пролиферации, дифференцировки и запуска эффекторных механизмов, среди них спектр интерлейкинов. Так, главную роль в развитии клеточного иммунного ответа играет ИЛ-2. Он активирует цйтотоксические Т- клетки (усиливая синтез эстераза) и обеспечивает пролиферация любых Т-клеток при условии экспресс на их поверхности рецептора к ИЛ-2 [7]. В пользу этого положения свидетельствуют тот факт, что при ингибировании синтеза ИЛ-2 глюкокортикоидами или связывании ганглиозидов с рецептором к ИЛ-2, пролиферация Т-клеток останавливалась [8]. Взаимодействие ИЛ-2 с рецепторами служит механизмом запуска последующих событий, приводящих к пролиферации Т-клетки, которые уже не требуют присутствия митогена или антигена.

При стимуляции лимфоцитов специфическими или неспецифическими факторами наблюдаются морфологические и цитохимические изменения. Так,

исследование ультраструктуры стимулированных лимфоциотов показала, что наиболее ранним признаком активации являются поляризация ядра и цитоплазмы и агглюцинация рибосом, после этого в ядрах активированных лимфоцитов увеличивается количество эухроматины и размеры ядрышка и потом увеличивается объем ядра и цитоплазмы, митохондрий и аппарата Гольда-и. Похожие изменения были обнаружении также при стимуляции цитотоксической активности тромбоцитов тромбином или ФАТ. Тромбоциты экспрессируют Рс фрагмента и 1^также они экспрессируют антигены комплекса

гистосовместимости, по характеру экспрессии которых эти клетки близки к лимфоцитам и моноцитам.

Исследование способность новых веществ к активацию лимфоцитов и тромбоцитов является одной из вожных путей не только для расшерения спектра иммуномодулирующих факторов но и для понимания данного сложного механизма активации, который в настоящее время, имеет большое научное и практическое значение и представляет интерес для многих исследователей. Цель работы.

Целью настоящей работы явилось изучение способности ряда высокотоксичных веществ к активации, им му некомпетентных клеток и тромбоцитов, а также получение из клеточного материала медиаторов, способных активировать пролиферации мононуклеарных клеток.

Основные задачи исследования: для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. изучить прямую цитотоксическую активность токсинов и их конъюгатов (рицина, абрина, микотоксинТ2 и его конъюгат Т2-БСА) на опухолевые клетки линий К562.

2. Исследование влияния цитотоксических концентраций токсинов (рицин, абрин, Т2 и Т2-БСА) на киллерные свойства МНК.

3. Сравнение свойства активированых МНК рицином и классическими факторами (ФГА, Кон-А и Саионофор А23187).

4. Изучение цитотоксической активности тромбоцитов против К562 после их активация разными факторами (ФГА, ФАТ, Кон-А Саионофор А23187 и рицином).

5. Получение и исследование супернатантов активированных МНК рицином и другими факторами (определение уровень цитокинов (ИЛ 1а, ИЛ 10, ИЛ2), определение фактора некроза опухоли.

6. Определение механизма гибели клеток- мишеней и выделение цитотоксического фактора МНК.

Научная новизна работы:

В настоящей работе впервые показано, что высокотоксичные вещества (рицин, абрин, Т2 и Т2-БСА) способны не только разрушать клетки но и стимулировать мононуклеарные клетки, если использовать их в низких концентрациях. При этом цитотоксичность мононуклеаров против опухолевых клеток значительно увеличивается.. Вследствие активации мононуклеаров супернизкими дозами рицина выделяется ряд медиаторов, таких как ИЛ 1а, ИЛ2, фактор некроза опухоли, а также продемонстрировано, что при действии МНК стимулированных рицином на опухолевые клетки происходит фрагментация ДНК данных клеток. Кроме этого, рицин как и другие факторы (ФГА, КонА, Саионофор А23187) стимулирует не только мононуклеарных клеток, но и тромбоциты, повышая их цитотоксичность против опухолевых клеток.

Впервые было показано, что при стимуляции мононуклеарных клеток рицином и другими факторами в межклеточное пространство секретируются специфический белковый медиатор Р14, оказывающий пролиферативный эффект на мононуклеарные клетки. Данный фактор был получен также при активации тромбоцитов рицином и другими факторами (ФГА, Саионофор-А 23187 и ФАТ).

Заключение диссертации по теме «Онкология», Бугхлала, Самира

выводы

1. Высокоэффективные ингибиторы белкового синтеза природного происхождения рицин, абрин, Т-2 токсин и конъюгаты на их основе оказывают выраженное щгготоксическое действие на опухолевые клетки К562 в низких концентрациях (10" М, 10"1 ^М).

2 Ргашн, абрин, Т-2 токсин и конъюгат Т-2 токсина с БСА в супермалых концентрациях достоверно повышают 1фотивоопухолевую щгтотоксическую активность мононуктеаров крови человека Средне-;-4)фекТ1Шше Дозы ЕД50 соогвественно равны 2.4.10"'" (8,98.10"15: 1.1» 1.Ii); ) М, 6,88.10'9 (8,01.10 10: 2,64.10 l!) М,. 4,9.10's (1,58.10 7: 2.9.10'5)М 5.87.10 10(1?02.10'10: 1,33.10S)M.

3. Ингибиторы белкового синтеза природного происхождения (рицина, абрина, Т-2 и Т-2-БС А) усиливают киллерные свойства тромбоцитов по отношению к опухолевым клеткам линии К562.

4. Механизм стимулирующего влияния супермалых доз ингибиторов белкового синтеза может быть обусловлен их способностью активировать синтез мононукле арами регуляторных цигокинов (TL 1а, IL Iß, IL2, TNF) и метаболитов арахидоновой кислоты (ТХА2) тромбоцитами.

5. Установлено, что активированные рицином мононуклеары и тромбоциты секретиругот щгтотокстреский пептид р14 для которого определена N-концевая аминокислотная последовательность.

6 Активированные рицином мононуклеары вызывают гибель опухолевых клеток, сопороваждаклций, фрагментации ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Активации лимфоцитов - сложный процесс, шдуцируемьш различными внеклеточными стимулами, В настоящее время известны многие антигены, ферменты, цитокины и другие биологические активные вещества, модифтщирчтощие клеточные структуры и вызывающие многие изменения, ироводяющие к активации лимфоцитов.

В настоящем работе наш бьпю интересно изучить противоопухолевое действие высокоэффективных ингибиторов синтеза белков природного происхождения (рицин, абрин, Т-2 и коньюгаг Т-2-БСА) и их способность к иммуномодуляции. Интерес представляет как и нн сколько эффективно использовать данные вещества в активации лимфоцитов.

На первом этапе работы была изучена прямая щпотоксичность рицина, абрина, Т-2 и Т-2-БСА на опухолевые клетки после инкубации нн разных сроках, результаты показали, что рицин более токсичен, чем остальные токсины и также отметили, что циготоксичность Т-2 повышается при его коньюгировании с БСА Это может быгъсвязано с тем что часть из эндоцируемого токсина Т-2 в свободной форме подвергается деградации в шкосойах но при его конъюгирование, БСАон не попадает в лизосомы и не происходит его деградация

Изучение цитотоксичности высокоэффективных ингибиторов синтеза белка в зависимости от времени их инкубация с клетками показало, что шгготоксичноетъ повышается, если время инкубации продольжается (рис. 2.3.4.5). Это связано со сложностью процесса интернализации токсинов внутри клетки и транспорта через разные компаргменгы клеток, чтобы попасть в конце в цитозоль и воздействовать на рибосомы. Механизм экдоцитгаа и секреция требуют как клеточную энергию, так и время. Для эффективного действия на клетки, токсины нуждаются в максимуме времени (72 часа),

При изучении цитотоксичности данных тсксинов, было определено для каждого из них интервалы доз, не вызывающие гибель клеток. Данные концентрации использовались ддя активации мононуклеарных клеток и тестирования цитотоксичность прошв опухолевых клеток. Установлено, что все токсинов в супермалых дозах усиливают действие МНК по сравнению с контролем (неактивированные МНК), при этом рицин показал большую активность (рис .6.7.8.9),

Для объяснерпш эффекта стимуляции, исследовали еупернатаны активированных рицином МНК с помощью ELISA. Результаты показали, что МНК выделяют спектр шгтокинов (ИЛа, IL26, JL2 и TNF) (рис.10) в разных концентрациях (до 240 pgvml). Это объесняет тог факт, чю активация лимфоцитов и повышение противоопухолевого действия связано с секрецией в межклеточное пространство спектра щггокинов и веществ, способные вызывать киллинг опухолевых клеток. Предпологаем, что механизм синтеза и секреция связаны в основном с комплексом Гольджи, который является главным секреторным аппаратом в жшфощггах. Таким образом, рицин в низких концентрациях эндоцируется внутри клетки и трасиорптруется в аппарат Гольджи, который активируется и секретирует цитокины Секреция щггокинов мононуклеарами периферической крови бьшо отмечено также при стимуляции МНК Кон-А и ФГА.

При сравнении активироавнных рицином мононуклеаров с активированными Кон-А, ФГА и Саионофором-А23187 показали , что рицин более активен (рис. 11).

Ранее показано, что тромбоциты способные проявлять цитогоксическую активность в отношении различных опухолевых клеток. В ряде работ показано, что нестимулированные равно как и стимулированные тромбоциты человека проявляют цитотоксичность в отношении Ж - чувствительных клеток линии К562. Причем киллинг опухолевых клетск происходил после активации тромбоцитов, вызванной либо экзогеннами агентами (ФАТ и тробином) либо непосредственным контактом с клеткой мишенью. Как характерные морфологические изменения тромбоцитов, так и биохимическиеявления в обоих случаяхсвидетельствовали об активации тромбоцитов. Очевидно, что активация тромбоцитов может не только приводить к их апрегациии, но и стимулировать щттжсическую активность, Было предложение о том, что токсины в низких дозы могут стимулировать не только МНК, но и тромбоциты. Для этого стимулировали тромбоциты рицином и другими активаторами (ФГА ФАТ, СаионофоромА23187) в разных концентрациях и тестировали цитогоксичностъ против К562. Результаты показали, что рицин как и другие факторы повьшшшцитотоксичностъ тромбоцитов против К 562 (рис. 12). Максимумы цитотоксической активности тромбоцитов были зарегистрированы после стимуляции 1Û-7M Са-ионофорА23187 (32,6-4,1%), 10-8М ФАТ(27,3-6%), 10-9М ФГ А(30,6-3,9%) 10-15М рицин (28,6-3,4%) и нестимушфованные тромбоциты (21,3-4,2%).

Для объяснения механизма действия рищша и других стимуляторов на тромбоцитах, измеряли продукций ТХА2 после стимуляции тромбоцитов данными факторами, Во всех случаях было зарегистрировано значительное повышение продукции ТХВ2, не менее,, чем в 7 раз по сравнению с контролем (ТХВ2 является про дуга-ом гидролиза ТХА2). Максимальный уровень продукции ТХВ2 (3.62пкг\106 клеток) был зарегистрирован при стта-1уляции тромбоцитов 10-7М С аионофором-А23187 (pic. 13 ).

Было даказано, что стимуляция заверпшющаяся аггрегшдаей, происходит раздельно (Большие концентращш одних и тех же стимуляторов опосредуют активацию и аггрегицию тромбоцитов, тогда как меншие стимушфуют их шгготоксичность). На ранних стадиях заболевания, также как и в здоровом организме, контакт между тромбоцитами и клеткой — мишенью вызывает "непольную активацию", т.е. стимулирует цитотокеичность трмбоцитов. При значительном росте опухоли высокая концентрация в крови коагулирующих факторов в купе с другими опухолевыми воздействиями, усиливает такую "непольную активацию". В результате, тромбоциты при любом, даже слабом, внешнем стимуле активируются "польностью",что всегда завершается их аггрегацией; при этомцитогоксичнсть почти не проявляется.

Сравнение вдггагокеичности активированных ьюнонуклеаров рицином, Саионофором-А23187 и ФГА и тромбоцитов, стимулированных одними и теми же активаторами показало, что МНК имеют большая цитогоксичностъ против К562 как при их активации рицином (72,7%) Саионофором (56%) и ФГА (654%) (рис.14),

Недавно из супернатангов активированных тромбоцитов разными факторами (ФГА Саионофором, ФАТ и рицином) выделяли цитотсжсические факторы Р14 и Р28. К-концевой участок Р14 гомологичен региону от241-249 амшкжислотного остатка С1&- компоненту комплемента человека Исследование Р28 не удалось определить какую либо гомологию ТчГ-концевого участка данного белка по отношению к известным белкам человека.

В настоящей работе выделяли белок с молекулярной массой 14 кДа из мононуклеарных клеток после активации рицином. По результатам определения М-концевой аминокислотной последовательности и по результатам анализа биологической активности был сделан вывод, что данный белок идентичен Р14 белковому фактору из супернатантов стимулированных тромбоцитов. Выделение Р14 было также обнаружено при стимуляции МНК другими факторами, как ФГА, Сшюнофором-А23187 и Кон-А.

Кромв этого, нами было показано, что активация мононуклеарных клеток рицином выделяют факторы, способные индуцировать апоптогический процесс в опухолевых клетках.

Таким образом, токсины - ингибирующие синтез белка - способные в низких дозах повышать щтготоксическую активностью МНК против опухолевых клеток. Это происходит за счет активации секреторных механизмов в лимфоцитах. При этом аппарат Гольджи играет главную роль, поскольку синтез и секреция цитокинов и других факторов индуцирующих алолтоз в опухолевых клетах происходят именно в этом компаргменте. Они также способные активировать тромбоциты с использованием другого механизма: рицин в супер-малых дозах индуцирует секрецию метаболитов арахидоновой кислоты (ГХА2).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бугхлала, Самира, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Фиодоров Н.А. биологическое и клиническое значение циклических нуклеотадов.М: медицина, 1979. С. 184,

2. Петров Р. В. ,Клеточные основы иммунитета и проблемы клинической иммунологии - клин. Медицина, 1976, 54, Н 11, с. 12-19.

3. Петров Р.В. Прикладная иммунология 1984, 320-с. 188-189.

4. ПригожинаТ.А. Тромбоциты. Большая Мед Энцикл. 1985, т.25,с.320-332.

5. Тонививдзш А.Г., Агапов И.И., Топыпш А.Ю., Сарма Т., Корсакова О.В., Гадагадза З.Г., Барынжиков А.Ю., Дебабов В.Г, Сравнение щп?огоксических свойств иммуногоксинов с А-цепью рицина против дафференцировочных антигенов Т-лимфоцитов человекаю Дскладь1 Академии Наук, T.344.H.2, с.245-248, 1994

6. Шумаков ВюИюб МойсакЯ.Г., Муромцева И.Б.. Алексеев Л.П., Топгьшш А.Ю, Коренькова Ю.В., Тоневицкий AT , Петров Р.В, Первый клинический опыт. Исследование антиген - CD45 иммуногоксина и обработки донорских почек перед трансплантацией. Транспланталогия и искуственные органы.н.1, с.22-23. 1995. " ■

7. Abel М., Kay N.E., Jacol G. Human platelets exeit cytotoxLx effects on turner cells. Blood 1985. V,65,P.P. 1252-1259.

8. AraM Т., Fimalsu G..The complete amino acid sequence of the В-chain of ricin E isolated from small-grain bean seeds. Biochim Biophys. Acta, v.911, pp. 191-200, 1987

9. Barbieri L,, Battelli M.G., Stupe F. Biochem. Biophys. Acta- 1993. V.1154, p.237-

ООО

10.Bchatachauya BJ.Biochem. andbiophys.res.commim.l976.v.73.P.383.

11.Bouigiiigmn L. Y. W., Jy W., Majercik M.H. et al. J.celLBiochem. 1988. V.37.P. 131-150.

12. Brass L,F. Ca2+ Homeostasis in unstumulated platelets, J.Biol. Chem 1984. V.259 P. 12563-12572,

13. Casellas P., Bourne B.J., Gros P., JansenF.K. Kinetics of cytotoxicity induced by immunotoxins. Enhancement by lysosomotropic amines and carboxylic ionophores. J. Biol. Chem.Vol.259, pp.9359-9364, 1984.

14.Clien Si.-Yi.. Zand C., Khomi Y.. Marasco W.A.. Design of a Novel Form of Iminunotoxins for Therapy. In; Proceedings of poster communication, 4-th M. Symposium on immunotoxins, South Carolina , p.44-46, 1995

! 5. Endo Y., Wool IG. The site of action of sarcin on eukaryotic nbosoincs. J.Biol. Cliem.. v.257. p.9054-9060, 1982

16. Endo Y., Mitsui K., Motizuld M., Tsurugi K. The mechanisin of action of ricin and related toxic lectins on eukaryotic ribosomes. J, Biol, Chem, v. 262, pp. 59085912, 1987.

17. Endo Y., Tsurugi K. RNA N-glycosidase activity of nein A-chain. J. Biol. Chem., v.262. p,8128-8130, 1987b. 23 Endo Y„ Tsurugi K. RNA N-glycosidase activity of ricin A- chain J. Biol. Chem, v.263, p.8735-8739, 1988.

18. Endo Y„ Tsurugi K., Lambert J.M. The site of action of six different ribosome-inactivating proteins from plants on eukariotic ribosomes: the RNA N-glycosidase actmty of the proteins Biochem.Biophyrs.Res.Cornmun.,v. 150, p. 1032-1036, 1988b

19. Franch R., Lngiinells S.,Stevenson G., Glennie M. Coopératif mixtures of bispecific F(ab')2 antibodies for delivering saporin to lymphoma in vitro and in vivo. Cancer Res., v.51, pp.2353-2361,1991

20. Frankel A.E. Immuiiotoxin therapy of cancer. Qieology hunting. 1993. v.7. p. 69-78.

21. Gleeson P.A., Hughes R.C. Binding and the uptake of toxic lectin modeccin by baby hamster kidney (BHK) cells. Isolation of mutants defective in the irternalization of modeccin. J.Cell.Sci, v.76, p.283-301, 1985

22. Gluck A., Endo Y., Wool I. The ribosomal RNA identity elemeris for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that close a GAGA tetraloop. Nucleic Acids Res., 2Zpp.321-324, 1994.

23 Glucksman A. Cell death in normal and vertebrale ontogeny, Biol Rev v.26, P. 26-86, 1951.

24. Granger G. A, Kolb W.P. lympliocyte in vitrocytotoxicity, j. immunol. ,101,11] 1986.

25 Graaser A, Serpelt G., Hoelser D. The role of GM-CSF, irterieukin -3, and erythropoietin in myelodysplastic syndromes- AmJ.Cli.Oncol. 1991.v. 14.P. 34-39.

26. Grethen I.M., Kay N.E.. Jhonson G.J., Jakob H.S. Human plateltes exert, cytotoxic effects on tumor cells. Blood 1985.V.65.P. 1252-1255.

27.Han T,, Takita H. Immunologic impairment in bronchoge nie carcinoma: a study of lymphocyte response to phyt©hemagglutinin Cancer, 1972.V.51.P.616-620.

28. Gurwitz.. SokolovskyM.ochenLandbiopljys.res.comnnm 1980.V.96.P. 1296.

29. Hart D.A infect.Immunol. 1989.v. 14.P.457.

30.Hennery C S. Quantitation of the cell-mediated response. I. the number of cytolytically active mouse lymphoud cells induced by immunisation with allogeneic mastogjoma cells, j.Immunol., 116,146 1971.

31. Hennerv C S, T-cell mediated cvtolvsis: an overview of some current issues.

r' & w>

contemps. Top Imnmnobiol.,7,245 1977.

32. Hennery C.S., Bubers J.E, Artigen t-lymphocyte interaction Mbhition by cytochalatsin B,J.irnmunol, 111,85 1973.

33. Hennery C.S. Quantitation of the cell-mediated response. I. The number of cytolytically active mouse lymphoud cells induced by immunisation with allogenic masto^oma cells. J. Immunol. V.26.P116-124. 1971.

34.Herbemian R.,ed, Natural cell mediated immunity against tumors tumors, academic press, NewYrork, 1980.

35. Houston L., Dooley T. Binding of two molecules* 4-methyhimbelliferyl galactose or 4-methylumbelliferyl N-acetylgalactosamine to the B-chains of ricin and Ricinus communis agglutinin and to the purified ricin B-chain J. Biol. Chem v.257, p.4147-4151. 1982.

36. Justineil L., Eur. J.immunol. 1986.V.137.P.3664.

37.Kawa.se I., Urdal, Brooks C.G., Hennry C.S. Selective depletin of NK cell activity in vitro and its effect on the grouth of NK sensitive and NK resistarte tumor cell variants. int.J, Can, 29,567 1982/

38.Keix J.F., Wirterford C.M., Harmon B.V. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 1994. V.73.P 2013-2026.

39.Kerr J.F., Wyllie A.H.. Cnrrie AR. Apoptosis : a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kitntics. BrJ. Cancer 1972.V.26.P239-257.

40. KrishmR.K.M., Schwartz S.A. Clinimrrainol. and immunopathol. 1980.V.16.P.463.

11.Ladin B., Murray E., Hailing A., Hailing K., Tilakaratne N., Long G., Houston L,, Weaver R. Characterisation of a cDNA encoding ncm E, a hybrid ricin-Ricinus communis agglutinin gene from the castor plant R.communis. Plant MolBioL v.9. pp.287-295, 1987

42 Lambert J., Goldmacher V., Collinson A„Nadler L., Blattler W. An immunoto^n prepared with blocked ricin: A natural plant toxin adapted for therapeutic use. Cancer Research v.51, p.6236-6242, 1991

43.Lamck J.W., Enns C., Raubitscliek A.. Weintraub H. Receptor-mediated endocvtosis of human transferrin and its cell surface receptor. J. Cell. Physiol., v. 124, pp.283-287, 1985,

44.Le beiton B., Khawli L., Alaudidin M„ Miller G.K.. Charak B.S., Musunder A., Epstein AL. Enhansed tumor uptake of macromolecules indused by a novel vasoactive irterleukine 2 immunocoiijiigate. Cancer res. 1990. Y.5. P. 2694-2698.

45.Lendaro E., Ippohti R._ Bellelli A, Brunori M., Evangelists V., Guidarini D., Benedetti P. Intracellular dinamics of ricin followed by Fluorescence microscopy on living cells reveals a rapid accumulation of the dimeric toxin in the Golgi apparatus. FEBS Lett., v.344, pp.99-104, 1994

46.Livingstone C.J., Schachte D. Biochemistry 1980 V.19.P.4823.

47 .LoskshinR.A., Williams C.M. Programmed cell death. The influence of drugs on the breakdown of the intersegmental muscles of silkmoths, J. Insect Physiol 1965 v. 11 P.803-809.

48.Lord J.,Roberts L., Robeitus J. Ricin: structure, mode of action some current application FASEB J.,v.8,p.201-208,199459 Magnusson S., Berg T., Turpin E., Frenoy G,P,% Meraetion of ricin with sinusoidal endothelial xat liver cells. Different.

involvement of two distinct carbohydrate -specific 'mechanism in surface binding and internalization Biochem J.,v. 277, p.855-861, 1991.

49.Marcum J.M., Gill M.. Bastida E., Ordinas A.. Jamieson G.A. Tlie interaction of plateletes. tumor cells and vascular- subendothehmnJ.Lab.ClmMed, 1980. V. 23.P. 18-27.

50. Marsh J. Intracellular processing of a ricin-antibody coigugate. In Proceedings of posters communication 2-nd M. Symposium on immnnotoxire. Lake Buerta Vista Florida.p. 54, 1990.

51 Maitz E. Mechanism of tumor cell lysis by T-lymphocytes, contemp. Top.imrnunol., 7-301 1977,

52.Marx J. Natural killer cells help defend the body. Science. 1980.V.7.P. 624-626.

53. Montfoit W., Villifranca J E., Monzmgo A.F., Ernst S.„ Katzin B., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R.. Robertus J.D. Tlie three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. J. Biol. Chem, v.262, p.5398-5403, 1987.

54. Morgan A.C. Jr., SivamG., Beaumier P. et al Mol. Immunol l990.v27.P 273-282.

55. MorgensternE., Edelman L., Reimers H.J., Miyshita C, Haurand M. Fibrinogen distribution on surfaces and in organelles of ADP stimulated human blood plateletes. Eur. J Cell. Biol. 1985, v.38.P.292-300. /-

56.Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxic assays, J. of Immun Methods, 65, p. 55-63, 1983.

57.Mmzm A., Lesk A., Chothia C. (Beta)-trefoil fold J.Mol.Biol., v.223, p.531-543, 1992

58.Nicolson G. Ulltrastructuial analysis of toxin bmding and entry iito mammalial cells. Nature, v.251, pp.628-630, 1974

59.01eksowicz L., Paciucci P. A, Zuskerman D., Colorito A., Rand J.D., Holland J.F, Alteration of platelete function induced by interleukm-2. hnmunother. 199 l.v. 10.P.363-370.

öO.Olsnes S., Pihl A. Toxic lectins and related proteins. In Molecular action of toxins and viruses. Eds. Cohen P., Van Heyrriiigen S., Elsevier, Amsterdam, p. 51105, 1982.

61. Olsnes S., Saldvet E., Phil A. Isolation and comparison of galactose-binding lectins from Abras procatorius and Ricinus communis. J. Biol. Chem., 249-803, 1974.

62. Olsnes S., Sandvig K.. Eklid K. Properties and mechanism of action of the toxic lectin modecciii Interaction with cell lines resistant to modeccin abrin and riein J. Supramol. Struct., v.2, p. 15-25, 1978.

63. Olsnes S., Stirpe F., Sandvig K., and Plril A, Isolation and cliaracterizaion of \iscumin, a toxoc lectin from Viscum Album L. (misletoe), J. Biol. Chem, 257 p. 13263-13270. 1982b.

64.Pietersz G.A, Roland M.J., Smyth IF., Mokenzie. Chemo-imnwnoeonjugates for the treatment of cancer, Adv. In immunology. 1994, V.56. P.301-386,

65.Ready M., Wilson K., Piatak M., Robertus J.D. Ricin-like plait toxins are evolutionarily related to single-chain ribosome-inhibiting proteins from Phytolacca. J.Biol. Chem, v.259. p. 15252-15256, 1984.

66.Reed J.C. Bcl2 and the regulation of programmed cell death J. Cell biol. 1994.v. 124.P. 203-214,

67.Reid L.M., Minaton, Gresser I., Holland J., Kadish A., Blomi B.R. Influence of aitimouse interferon serum on the growth and metastasis of tumor cell persistent injected with virus and of human prostatic tumors inathymic nude mice, Pro. Natl. Sci. USA 78, 1171. 1981.

68. Ritfenllouse S.E, Hunan platelets contain pliospholipase C tliat hydrolyses polyphosphoinositides. Proc. Natl. Acad.sci. USA. 1983.V.P.P. 5417-5422.

69.Russell.J.H., Dobas C.B. Eur.J.imniunol.198 v.ll. 840.

70.Rulenber E., ReaifyM., Robeitus J.D., Structure and evolution of Ricin B-chain Nature, v.326, p.624-626, 1987.

71.RutenberE„ Robertus J.D. Structure of Ricin B-chain at 2.5 A Resolution Proteins, v. 10, p.260-269, 1991.

72. Sagawa T., KodamaT., Tominaga A.} Okada M, Cytotoxicity of unstimulated and tronbin acti\-ated plateltes to human tumor cells. Immunology 1993.V.78.P.650-662.

73. Sandoval A, PagalaM.K. J. Membr.biol.l978.v.41.P.309.

74. SandvigK., Olsnes S., Pilú A Kinetics of binding of the toxic lectins abrin and ricin to surface receptors on human cells. J. Biol. Chem, v. 251, pp. 3977-3984, 1976.

75. Sarcadi R.J.Ger.physiol. 1979.V.72.P.249.

76.Saunder J.W. Death in embiyoic systems. Science. 1966. V.154.P.604-612.

77. Scannon P. Supression of the human immune response to immunot toxins drugs (meeting abstract). Non-serial fourth intematinal conference on monoclonal artibody rmmunocorgugates for cancer, Marsh 1989. P.30/

78. Simon N.. Lectin-carbohydrate complexes of plaits and anmals: an atomic view. TIBS, v. 18, p.221-226, 1993.

79. SHmoda T., Funatsu G. Binding of lactose and galactose to rative and iodinated ricin D. Agi-. Biol. Chem, 49, p.2125-2130, 1985.

80. Stilting R.D., Beike G. Nature of lymphocyt-tumor interaction A general metod for cellular nnmunoadsorptionj .Exp. Med., 137.932 1973.

81. Stirpe F., SandvigK., Olsnes S., Phil A. Action of Escurran, a toxic lectin from Mistletoe, on cells in culture. J. Biol. Chem, v.257, p. 13271-13277, 1982

82. Stirpe F., Barbieii L. Ribosome-inactivating proteins up to date. FEBS Lett., v. 195, p. 1-7, 1986

83.Tahirov T., Lu T., LiawY., Chen Y., Lin J-." Crystal structure of abrin-a at 2,14 A // J.MoLBiol„ v.250, p.354-367, 1995

84.Talmadge J.E., Myers KM., Stoiekey J.R. Role of NK cells in tumor growth and metastasis in beige mice. Nature. V. 15.P.284. 1980.

85.Tomei L.D. Apoptosis a program for death or survival in : Tomei L.D., Cope F.O, cds. Current communications in cellular and molecular Biology. Cold Spring Harbor laboratory Press. 1991 279-316.

86.Tran A, Vanhee D., CapronA., Vomg H., Braquet P., JosephM. Induction of human blood platelet aggregation or cytotoxicity by different conceiirations of PAF- acether and thrombin-Ageii actions 1992, v.36.P.39^3.

87.Treim G., Takayama H., Sikorsky M. Antigen receptor regulated exocytosis of cytolytic granules nay not be required for target cell lysis by cytotoxic T-lymphocytes. Nature 1987. Y.330.P 72-81.

88. Van Deurs B., Pedersen L.R., Sundan A, Olsnes S., Sandvig K.. Receptor-mediated endocytosis of a ricin-colloidal gold conjugate in Vero cells.Intracellular routing to vacuolar and tudulo-vesicular portions of the endosomal system Exp, Cell Res., v. 159, p.287-304, 1985

89. Wawrzynczak E.J., Waston G.J., Cumber A.J., Henry R.V., Parnell G.D., Rieber E.P., Thorpe E.P. Blocked and non blocked ricin immunotixins against the GD4 antigen exhibit higher cytotoxic potency than a ricin A- chain immunotoxin potentiated with ricin B-cliain or with a ricin B- chain immunotoxin Cancer Immunol. Immunother. 1991.V.32.P.289.

90.Wyllie AH., Ken' J.F. Cell death; the significance of apoptosis Int.Rev. Cytoi 1980.V. 69.P.251-306.

91. Wu Y., GadmaM., Tao-Cherg J.„ Youle R.J.. Retinoic acid disrupts the Golgi apparatus and increases the cytosolic routing of specific protein toxins. J. Cell Biol., v. 125, p.743-753,1994

92. Youle R.J., Colombatti M.. Hybridoma cells containing intracellular anti-ricin antibodies show ricin meets secretory ailibody before entering the cytosol. J. Biol. Chem, v. 262, p.4676-4682, 1987.

93. Youle R., Huand A Protein bodies of castor bean endosperm Plant physiol. V.58. P.703-709. 1976.

94.Yee G.C. Colony-stimulating factors and tomorrow s pharmacy; why we must be ready-Am J.Hosp. Phaim 1989.V.46. P.24-29.

95.Zaripy D., Bernard J., Thierness N., Feldman M., Beike G. Isolation and characterisation of individual fonetionnally reactive cytotoxic T-lymphocytes: conjugation, rilling and recyclir^ at the sir^le cell level,. J.imrnur»l., c 5-818. 1975.

96.Ziska P., GelbinM., Franz H.. Interaction of Mistletoe lectins ML-l ML-II, and ML-III with carbohydrates. lit Lectins: Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry, v. 8, p. 10-13, 1993