Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Чвартацкая, Оксана Викторовна

• Чвартацкая, Оксана Викторовна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Чвартацкая, Оксана Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Принятые сокращения и аббревиатуры

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биологические свойства и функции внеклеточной ДНК

человека

1.1.1 Концентрация внеклеточной ДНК в биожидкостях

1.1.2 Размеры фрагментов внеклеточной ДНК

1.1.3 Модификация оснований внеклеточной ДНК

1.2 Происхождение фрагментов внеклеточной ДНК в организме

1.3 Микроокружение внеклеточной ДНК

1.4 Взаимодействие внеклеточной ДНК с клетками

1.4.1 Белки семейства «toll-like» рецепторов (TLR)

1.4.1.1 Лиганды для белков TLR9

1.5 ТЬК9-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-сигнальные пути

1.6 Роль цитокинов в организме

1.6.1 Провоспалительные цитокины

1.6.2 Противовоспалительные цитокины

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток

2.1.2 Исследование экспрессии клетками поверхностных

белков

2.2 Определение концентрации повторяющейся последовательности ДНК человека в крови

2.3 Конструирование плазмиды п(рДНК)

2.4 Выделение РНК из мезенхимальных стволовых клеток

2.4.1 Обработка выделенной РНК ДНКазой

2.4.2 Определение концентрации РНК

2.5 Выделение ДНК из мезенхимальных стволовых клеток

2.5.1 Определение концентрации ДНК

2.6 Постановка полимеразцой цепной реакции

2.6.1 Проведение реакции обратной транскрипции

2.6.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени

2.7 Иммуногистохимия

2.7.1 Связывание антител с №-кВ

2.7.2 Связывание антител с ТЫ19

2.8 Иммуноферментный анализ секреции цитокинов

2.8.1 Иммуноферментный анализ секреции цитокина 1Ь-10

2.8.2 Иммуноферментный анализ секреции цитокина ТЫБа

2.9 Определение активности каспазы 3

2.10 Статистическая обработка результатов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1 Рецепторы, отвечающие на действие Св-богатой внеклеточной ДНК

3.1.1 Определение экспрессии мРНК ТЫ19 в мезенхимальных стволовых клетках, при действии на них вкДНК, модельной

п(рДНК) и ДНК Е.соН

3.2 Исследование сигнальных путей, активирующихся в мезенхимальных стволовых клетках в ответ на действие фрагментов п(рДНК)

3.2.1 Кинетика изменения во времени экспрессии мРНК ТЫ19 и адаптера ТЬЯ-сигнального пути - МуЭ88 в ответ на стимуляцию

мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК)

3.2.2 Активация ЫР-кВ ЖК/р38-, ¡ИР- сигнальных путей в ответ на стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток фрагментами п(рДНК)

3.2.3 Транслокация МР-кВ в ядро мезенхимальных стволовых клеток при действии фрагментов п(рДНК)

3.2.4 П(рДНК) стимулирует увеличение количества мРНК цитокинов ИЛОиЮТа

3.3 Снижение ферментативной активности каспазы 3 в мезенхимальных стволовых клетках при действии модельных

фрагментов внеклеточной ДНК

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

4 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Принятые сокращения и аббревиатуры

CpG-ОДН - CpG-содержащие олигонуклеотидные аналоги; GAPDH - глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназа; IL - интерлейкин;

IRAK - (от англ. interleukin-1 receptor-associated kinase ) - интерлейкин-1 рецептор - связанная киназа;

IRF3/7 - фактор, регулирующий транскрипционную активность гена интерферона;

JNK (англ. c-Jun N-terminal kinase; c-Jun N-концевые киназы) - стресс-активируемые протеинкиназы

МАРК - митоген активируемая протеинкиназа;

MyD88 - (от англ. Myeloid differentiation primary response gene) - ген

миелоидной дифференцировки первичного ответа;

NF-kB (ядерный фактор «каппа-би»; англ. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells, NF-kB) — универсальный фактор транскрипции

PAMP - (от англ. pathogen-associated molecular pattern) -патоген-связывающий молекулярный паттерн;

real-time PCR - полимеразная цепная реакция в реальном времени;

SDS - додецилсульфат натрия;

SSC - стандартный солевой раствор;

ТВР - ТАТА-связывающий белок;

TCR - Т-клеточный рецептор;

TIR- (от англ. toll-interleukin-1 receptor) - толл-интерлейкин-1 рецептор; TLR - (от англ. toll-like receptor) - семейство толл-подобных рецепторов; TNF - фактор некроза опухоли; АПК - антигенпредставляющие клетки;

вкДНК - внеклеточная ДНК; г ДНК - геномная ДНК;

ГКГ - главный комплекс гистосовместимости;

5

инг-ОДН - ингибирующие олигодезоксинуклеотиды;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ИФН - интерферон;

КД - контрольные доноры;

МСК - мезенхимальные стволовые клетки;

НК-клетки - клетки нормальных киллеров;

ОДН - олигодезоксинуклеотиды; ОНП - однонуклеотидный полиморфизм;

п(рДНК) - фрагменты рибосомной ДНК, встроенные в плазмиду

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РАИЛ - рецептор антагонистов интерлейкинов;

СатШ - клонированный фрагмент субфракции сателлита 3;

ТАТА - короткий А-Т-обогащенный участок (типичная последовательность

—

ТКР - Т-клеточный антигенраспознающий рецептор;

ТОрДНК - транскрибируемая область рибосомного повтора человека; ТФР(3 - трансформирующий фактор роста бета;

ФНОа - фактор некроза опухоли а;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота; я ДНК - ядерная ДНК;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Воздействие фрагментов рибосомных генов, накапливающихся во внеклеточной ДНК, на свойства мезенхимальных стволовых клеток человека»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Внеклеточная ДНК (вкДНК) в норме присутствует в плазме крови человека и в межклеточном веществе. До сих пор остаются невыясненными вопросы ее происхождения, однако в литературе обсуждаются две главных модели. Первая из них предполагает, что появление вкДНК связано с гибелью клеток в организме, то есть циркулирующая вкДНК в кровотоке -это фрагменты ДНК клеток, подвергшихся апоптозу. В рамках второй модели вкДНК появляется в межклеточном веществе в результате секреции клетками фрагментов ДНК. Показано, что в крови пациентов с различными патологиями концентрации вкДНК существенно возрастают. Поэтому на данный момент наибольший интерес научного сообщества вызывает ее применение в диагностике различных заболеваний.

До недавнего времени предполагалось, что вкДНК не оказывает влияния на клетки организма. Известно, что геномная ДНК млекопитающих не обладает иммуностимулирующим действием, так как содержит незначительное количество неметилированных CpG-мотивов в своем составе, а также включает иммуносупрессорные последовательности. Однако вкДНК существенно отличается от ядерной ДНК (яДНК) по ряду свойств. Установлено, что вкДНК в отличие от яДНК обогащена повторяющейся последовательностью - транскрибируемой областью рибосомного повтора (ТОрДНК) [Калашникова и соавт., 2006; Костюк и соавт., 2006; Вейко и соавт., 2007], которая аналогично бактериальной ДНК является потенциальным иммуномодулятором, также было показано, что вкДНК и фрагмент ТОрДНК обладает стимулирующим действием на лимфоциты человека [Вейко и соавт., 2006]. Кроме того, отмечено, что активирующее действие ТОрДНК на клетки иммунной системы опосредуется через рецепторы семейства Toll-like, или TLR - (от англ. toll-like receptor) [Вейко и соавт., 2006].

Однако остается не известным, оказывают ли воздействие фрагменты вкДНК на свойства мезенхимальных стволовых клеток.

За последнее время достигнуты большие успехи в изучении биологии стволовых клеток, но остается еще много вопросов, связанных с их взаимодействием с клетками микроокружения, а также ролью различных сигнальных путей в регуляции стволовых клеток. Стволовые клетки обладают уникальными свойствами: они представляют собой неспециализированные клетки, не имеют тканеспецифических маркеров и поддерживают статус недифференцированных клеток. При действии определенных биологических сигналов стволовые клетки способны дифференцироваться в специализированные клетки [Morrison et al., 2006]. Применение эмбриональных стволовых клеток открывает широкие возможности для клинической практики, но вызывает большое количество этических проблем. Поэтому в настоящее время все больше внимания уделяется изучению свойств стволовых клеток из других источников. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются предшественниками клеток мезенхимальной линии, это хрящи, кости, сухожилия, жир, мышцы. МСК достаточно легко выделяются из костной и жировой тканей, а также из других источников, и быстро растут в лабораторных условиях. Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки способны оказывать иммуносупрессорное действие посредством индукции регуляторных Т-лимфоцитов и дендритных клеток [Stagg, 2007]. Эти свойства способствуют применению мезенхимальных стволовых клеток в практической медицине. В то же время не полностью изучена регуляция этих клеток и сигнальные пути, активирующиеся при их взаимодействии с клетками организма, поскольку эти сигнальные пути образуют сложную сеть.

Известно, что стволовые клетки локализованы и функционируют в

определенном микроокружении, называемом "нишей" [Morrison et al., 2008].

Нишу образуют клетки микроокружения, продуцирующие факторы роста и

другие регуляторные молекулы, и внеклеточный матрикс, представленный

8

базальными мембранами на границе эпителиальных и мезенхимных тканей. «Ниша» обеспечивает жизнеспособность, самоподдержание и самовоспроизведение стволовых клеток, а также длительное их пребывание в состоянии покоя и дифференциацию дочерних транзиторных клеток, тем самым она защищает стволовые клетки от внешних воздействий [Morrison et al., 2008]. При определенных условиях стволовые клетки могут покидать ниши (процесс мобилизации стволовых клеток), сохраняя жизнеспособность и возвращаться в свои ниши («хоуминг» CK) [Lapidot et al., 2005]. Повреждение ткани стимулирует переход стволовых клеток к пролиферации, поскольку стволовые клетки являются пролиферативным резервом при регенерации ткани [Lehrer et al., 1998]. Свойство стволовых клеток способствовать репарации поврежденных тканей активно используется в практической медицине. В очаг повреждения либо вводятся аутологичные стволовые клетки, либо стимулируются к пролиферации эндогенные стволовые клетки, либо активируется мобилизация стволовых клеток из других источников с помощью ряда цитокинов с их последующей миграцией в зоны повреждения [Daniels, 2007]. Однако процессы, происходящие со стволовыми клетками в очаге повреждения, также остаются малоизученными.

Целью настоящей работы является изучение влияния внеклеточной ДНК и ее фрагментов на мезенхимальные стволовые клетки, посредством моделирования in vitro ситуации, когда эндогенные мезенхимальные стволовые клетки, мигрирующие из ниши в очаги повреждения, или мезенхимальные стволовые клетки, введенные в организм с целью терапии, контактируют с ГЦ-богатой вкДНК, которая в норме и при патологии содержится в плазме крови.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать адекватные условия культивирования МСК, полученных из жировой ткани;

2. Выявить рецепторы в МСК, которые активируются в ответ на действие вкДНК;

3. Изучить сигнальные пути, участвующие в ответе МСК на действие модельного ГЦ-богатого фрагмента вкДНК;

4. Проследить, какие механизмы выживаемости активируются в МСК при контакте с ГЦ-богатыми фрагментами вкДНК;

Научная новизна. Впервые было показано активирующее действие вкДНК и ГЦ-богатого фрагмента (ТОрДНК) на мезенхимальные стволовые клетки человека, сопровождающееся усилением синтеза РНК и высокой продукцией цитокинов IL10 и TNFa. Стимулирующее действие вкДНК и ТОрДНК на мезенхимальные стволовые клетки человека реализуется посредством активации рецепторов семейства «toll-like» (в частности TLR9), которые узнают ГЦ-богатые последовательности ДНК. Установлено, что плазмида (п(рДНК)), содержащая в своем составе фрагменты ТОрДНК, активирует в мезенхимальных стволовых клетках ТЫ19-сигнальный путь и связанные с ним NF-kB-, JNK/p38-, IRF-сигнальные пути.

Научно-практическая значимость работы. В последнее время терапия стволовыми клетками приобретает все более актуальное значение для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей. Массовая гибель клеток, пересаженных в очаг поражения тканей, остается серьезной проблемой в транспланталогии. Для того, чтобы повысить жизнеспособность пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, проводят предварительную обработку клеток, в частности, TNFa [Yao et al., 2009] или синтетическими олигонуклеотидами (ГЦ-ОДН) [Tomchuck et al., 2008]. Эффективность этой предварительной обработки в значительной степени зависит от активации NF-kB и его транслокации в ядро [Yao et al., 2009]. Полученные данные указывают на то, что культивирование мезенхимальных стволовых клеток с ГЦ-богатой плазмидой п(рДНК) в низких концентрациях (50 нг/мл) в течение короткого времени вызывает стимуляцию TLR9, что

ю

приводит к активации и транслокации №-кВ в ядро. П(рДНК) может быть использована для предварительной обработки культуры пересаживаемых мезенхимальных стволовых клеток, наряду с предлагаемой обработкой стволовых клеток синтетическими ГЦ-ОДН для стимуляции ТЫ19.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Биологические свойства и функции внеклеточной ДНК человека

История изучения биологии циркулирующих нуклеиновых кислот ведет свое начало с 1948 года, когда исследователи Мендель и Метаис впервые обнаружили их в плазме крови человека. С тех пор нуклеиновые кислоты были обнаружены как в различных циркулирующих жидкостях в организме животных, так и в межклеточном веществе в тканях, а также в средах культивирования различных клеток растений [Gahan et al., 2008]. Этот факт был подтвержден также на бактериях и клетках растений [Peters and Pretorius, 2011]. Фрагменты ДНК, которые были выделены из жидкостей организма, принято называть внеклеточной ДНК (вкДНК), экстрацеллюлярной ДНК, внехромосомной ДНК, ДНК плазмы, cell-free DNA, circulating DNA [Gahan et al., 2008; Peters and Pretorius, 2011]. Особое внимание уделяется вкДНК после того, как современные методы позволили провести анализ первичной структуры очень маленьких фрагментов ДНК. Отдельное внимание уделяется совершенствованию методов анализа фрагментов измененной ДНК опухоли, которые циркулируют в крови пациента, или ДНК плода, частицы которой можно обнаружить в крови матери. ВкДНК используется как маркер патологии при аутоиммунных заболеваниях, диабете, травмах, инсультах, инфарктах миокарда и т.д. Вопросу использования феномена вкДНК в диагностике различных заболеваний посвящено много работ и обзоров (обзор [Tong et al., 2006]). Для того, чтобы понять влияние вкДНК на жизненноважные процессы организма, необходимо изучить свойства вкДНК и характер взаимодействия фрагментов вкДНК с клетками организма.

К свойствам вкДНК относят следующие характеристики: концентрация фрагментов в биожидкости, наличие однонитевых разрывов цепи и длина фрагментов, изменение последовательностей во вкДНК по сравнению с геномной ДНК, модификация функциональных групп ДНК.

1.1.1 Концентрация внеклеточной ДНК в биожидкостях

Внеклеточная ДНК является нормальной составляющей крови и может быть обнаружена в плазме крови любого человека. Однако уровень ДНК в образцах плазмы крови здоровых людей довольно низкий. Его оценки сильно различаются в зависимости от способа измерения и выборки доноров. Обычно значения нижней границы диапазона близки - около 3,6-5 нг/мл [Suzuki et al., 2008], однако в некоторых исследованиях наблюдается существенный разброс данных, например, 1,8-36 нг/мл [Gahan and Stroun, 2010].

На данный момент считается перспективным направлением исследований изучение диагностического значения концентраций вкДНК. При патологических состояниях концентрация вкДНК, как правило, значительно увеличивается [Umetani et al., 2006; Zhong et al., 2006]. Отмечены колебания концентрации вкДНК при инфарктах. При остром инфаркте концентрация вкДНК значительно растет по сравнению с нормой (от 36,3±23,8 нг/мл до 511±398 нг/мл), и изменение ее концентрации коррелирует с изменениями количества традиционных маркеров инфаркта, например, тропонина. Впрочем, в этом исследовании не учитывался размер поврежденной области, что может объяснить широкий разброс данных. Концентрация вкДНК может служить хорошим критерием для прогноза отдаленных последствий инфаркта миокарда. По сравнению с контрольной группой (пациенты, не имевшие осложнений), где концентрация составила 475-530 пг/мкл, в группах, где развились осложнения, она была больше: 1060 пг/мкл у пациентов с развившейся позднее сердечной недостаточностью; 1000 пг/мкл у пациентов, у которых позже повторился инфаркт; 1350 пг/мкл у пациентов с последующей остановкой сердца и 725 пг/мкл у пациентов, повторно поступивших через 6 месяцев после первой госпитализации [Butt and Swaminathan, 2008].

Что касается онкологических заболеваний, на данный момент

измерение концентрации вкДНК в крови не позволяет отличить рак от

13

других заболеваний; однако увеличение ее концентрации однозначно свидетельствует о развитии болезни, а снижение - о выздоровлении или ремиссии [Gahan and Swaminathan, 2008].

Помимо этого, изучалось участие вкДНК в развитии асептического воспаления, например, при интенсивной физической нагрузке. В группе покоя концентрация вкДНК составила 18,01 пг/мкл, после бега на длинную дистанцию она возросла до 334,4 пг/мкл, но уже через два часа упала практически до исходного значения - 30,44 пг/мкл [Butt and Swaminathan, 2008]. Таким образом, даже у здорового человека концентрация вкДНК в крови может существенно колебаться.

Показано также нахождение фетальной вкДНК в плазме материнской крови; однако она меньше по размерам (<300 п.н., в то время как материнская > 300 п.н.). В настоящее время делаются попытки диагностировать по вкДНК, выделенной из материнской крови, как материнские заболевания (преэклампсия, замедление внутриматочного развития), так и болезни плода (резус-несовместимость, р-талассемия). Производятся попытки с помощью метилированных специфических маркеров фетальной ДНК диагностировать анеуплоидию. Параллельно налаживается технология ранней диагностики пола [Gahan and Swaminathan, 2008].

Таким образом, поиск применения вкДНК крови в диагностике является активно развивающимся направлением. И несмотря на то, что на данный момент большинство оценок носит количественный характер, уже найдены некоторые основные корреляции и делаются попытки качественной диагностики конкретных заболеваний [Gahan and Swaminathan, 2008].

1.1.2 Размеры фрагментов внеклеточной ДНК

С самого момента открытия циркулирующей ДНК исследователей интересовал вопрос: насколько она похожа на геномную ДНК по структуре и составу? Ожидалось, что обнаружение каких-либо структурных

14

особенностей вкДНК позволит судить о ее происхождении и роли в организме, а также будет способствовать развитию диагностических технологий.

Было установлено, что вкДНК двухцепочечная и представляет собой фрагменты длиной от 180 до 10 000 н.п. [Anker et al., 1975]. При этом короткие фрагменты преобладают, средняя их длина в образцах крови здоровых людей составляет 176 н.п. [Suzuki et al., 2008].

ГЦ-состав вкДНК также отличает ее от геномной ДНК. ВкДНК значительно обогащена ГЦ-парами, аналогично бактериальной ДНК [Malinovskaya et al., 2010], в особенности 5' и З'-концы фрагментов [Suzuki et al., 2008]. При этом содержание АТ-богатых последовательностей снижено [Malinovskaya et al., 2010], процент ГЦ-пар составляет примерно 53,7% [Suzuki et ah, 2008]. Показано, что при сердечно-сосудистой патологии, при аутоиммунных заболеваниях и при действии внешних источников излучения содержание маркерных ГЦ-последовательностей в составе вкДНК плазмы крови может увеличиваться в несколько раз [Malinovskaya et al., 2010]. Вероятно, это происходит благодаря высокой устойчивости ГЦ-богатых фрагментов к двунитевой фрагментации при накоплении однонитевых разрывов, вносимых нуклеазами крови [Veiko et al., 2010].

В том, что касается сравнения смыслового состава геномной ДНК и

вкДНК, мнения авторов расходятся. Исследование вкДНК из крови 50

здоровых людей, проведенное в 2009 году, показало, что соотношение

количества всех функциональных элементов генома в вкДНК и геномной

ДНК было примерно 1. Это указывает на то, что нуклеом по набору

последовательностей в целом отражает геном; наибольший разброс в

соотношениях между индивидуальными донорами наблюдался для белок-

кодирующих последовательностей, нетранслируемых областей и псевдогенов

[Beck et al., 2009]. В то же время, секвенирование и RQ-PCR недостоверно

показали равную встречаемость в нуклеоме всех частей генома. Это может

быть связано как с индивидуальными особенностями транскрипции, так и с

15

различиями в транспорте и выведении отдельных фрагментов вкДНК. Однако это может свидетельствовать и о целенаправленном характере выделения ДНК в кровь.

Также существует множество данных о том, что онкогенные мутации и амплификации отдельных генов, изменения в области микросателлитов, а также эпигенетические модификации, как, например, метилирование ДНК, могут быть обнаружены в циркулирующей вкДНК. При этом утверждается, что они схожи с таковыми, обнаруживаемыми в опухолевой ткани раковых больных. Это сходство позволяет некоторым авторам предположить, что циркулирующая вкДНК, вероятно, происходит из клеток первичной опухоли [Van der Vaart and Pretorius, 2008].

1.1.3 Модификация оснований внеклеточной ДНК

В литературе практически нет информации относительно содержания

модифицированных фрагментов в составе вкДНК. Ожидаемо, что в составе

вкДНК содержатся окисленные основания ДНК, так как окислительный

стресс - явление, часто встречающееся в организме, особенно при

патологических состояниях. Наличие фрагментов, содержащих окисленные

основания во вкДНК, было показано иммуноферментными методами.

Оказалось, что при ревматоидном артрите в синовиальной жидкости и

сыворотке определяются основания окисленной ДНК. Модифицированные

основания в составе вкДНК были обнаружены и у здоровых доноров в

следовых количествах. Показано, что под действием вкДНК в клетках

эндотелия развивается окислительный стресс, образуются двунитевые

разрывы ДНК [Ermakov et al., 2011], активируются системы репарации

(похожие результаты также получены на лимфоцитах - [Ermakov et al.,

2009]), увеличиваются экспрессия эндотелиальной и индуцибельной NO-

синтаз и синтез оксида азота (аналогичные данные получены для первичной

культуры гранулярных клеток мозжечка крысы - [Efremova et al., 2010]),

снижаются активность каталазы и каспазы-3 [Костюк и др., 2010]. Было

16

также обнаружено, что добавление интактной ДНК клеток в среду культивирования эндотелиоцитов в условиях окислительного стресса, вызванного экзогенным действием перекиси водорода, значительно увеличивало окислительный стресс. Этот эффект можно объяснить окислительной модификацией ДНК активными формами кислорода и азота в процессе культивирования клеток в присутствии перекиси водорода и вторичным действием на клетки этой окисленной ДНК, усиливающей окислительный стресс [Veiko et al., 2010].

1.2 Происхояедение фрагментов внеклеточной ДНК в организме

Происхождение вкДНК является на данный момент одним из самых спорных аспектов ее биологии. До сих пор не существует общепринятой точки зрения по этому вопросу. Отчасти это может быть объяснено противоречивостью получаемых результатов, отчасти - недостаточным количеством исследований в этом направлении.

Многие гипотезы происхождения вкДНК были отметены довольно быстро. Так, предполагалось, что ее источниками могли быть вирусы (вирусы Эпштейна-Барра, гепатита В и т.д.), однако это не объясняло появления вкДНК в крови здоровых людей. В качестве альтернативной гипотезы предлагалась секреция ДНК клетками в ходе терминальной дифференцировки. Но при росте опухоли так же сильно растет концентрация вкДНК, в то время как терминальной дифференцировки не наблюдается [Van der Vaart and Pretorius, 2008]. На данный момент обсуждаются две основные гипотезы: клеточная гибель и целенаправленная секреция.

Гипотеза клеточной гибели предполагает, что вкДНК, обнаруживаемая в крови, образуется в результате распада клеток, погибших в результате некроза или апоптоза [Malinovskaya et al., 2010].

Большая часть авторов склоняются к тому, что источником вкДНК

являются именно апоптотические клетки. Это связано с тем, что, как было

сказано выше, вкДНК представляет собой фрагменты, аналогичные тем,

17

которые появляются при расщеплении геномной ДНК в ходе апоптоза (т.н. «нуклеосомная ДНК) [Choi et al., 2005]. Расщепление происходит сначала на большие (50-300 т.н.п.) фрагменты, а затем на олиго- или мононуклеосомы (180-200 н.п.) с помощью эндогенных Са2+-, М§2+-зависимых ядерных эндонуклеаз. Сами нуклеосомы устойчивы к расщеплению, предположительно, благодаря прочным электростатическим ДНК-гистонным взаимодействиям. На электрофореграмме они выглядят как «нуклеосомная лесенка» («ladder pattern»), и аналогичная картина наблюдается при электрофорезе фракции вкДНК [Butt et al., 2008]. В отличие от апоптоза, при некрозе осуществляется спонтанное, неспецифическое и неполное расщепление ДНК. Показано, что в результате некроза образуются фрагменты размером более 10 т.п.н. [Van der Vaart et al., 2008]. Также апоптотическую ДНК можно определить по типичным концевым последовательностям, что объясняется специфичностью ДНКазы II, действующей при апоптозе.

Однако существуют и аргументы в пользу некротического происхождения вкДНК. Так, например, известно, что большая часть апоптотических тел поглощается соседними клетками и фагоцитами, и ДНК, таким образом, полностью расщепляется на нуклеотиды лизосомальной ДНКазой II. Поэтому существует вероятность, что фрагменты ДНК, высвобожденные из клеток в результате апоптоза, полностью удаляются из межклеточной среды еще до выхода в кровоток. Также показано, что совместное культивирование макрофагов с некротическими клетками приводит к высвобождению ДНК в среду, и этот процесс носит дозо-зависимый характер. В то же время, кокультивирование с апоптотическими клетками приводит к уменьшению количества вкДНК [Choi et al., 2005].

В рамках второй гипотезы предполагается, что вкДНК может

выделяться живыми клетками как нормальная составляющая их метаболизма

[Malinovskaya et al., 2010]. Термин «метаболическая ДНК» был введен

Stephen Pelc в 1968 году. Используя метод авторадиографии с Н3-тимидином,

18

он показал наличие синтеза ДНК в неделящихся клеточных популяциях (так, например в кардиомиоцитах). Он предположил, что новосинтезированная ДНК играет метаболическую роль, используется для транскрипции, но быстро изнашивается и заменяется новой [Gahan et al., 2008]. Это согласуется с данными других авторов, которые утверждают, что человеческие лимфоциты выделяют ДНК-содержащий комплекс in vitro при стимуляции фитогемаглютинином. Отмечается также, что процесс высвобождения ДНК не связан с клеточной смертью и регулируется гомеостатическими механизмами [Anker et al., 1975; Rogers et al., 1972]. Далее при отсутствии гибели клеток в культуре, вкДНК обнаруживается в среде культивирования. Также отмечено, что лимфоциты в культуре выделяют вкДНК до тех пор, пока ее концентрация не достигнет некоторого порога, вне зависимости от длительности инкубации. Эта ДНК преимущественно новосинтезированная. Также было показано, что электрофореграмма этой секретеруемой вкДНК похожа на апоптотическую ДНК [Van der Vaart et al., 2008].

Целенаправленная секреция характерна для делящихся и покоящихся

клеток, но не для мертвых или умирающих. Она была показана для

нормальных и патологических клеток бактерий, растений, амфибий, птиц,

приматов и даже человека [Gahan et al., 2008]. Более того, на

многочисленных объектах (растения, сперматозоиды животных, клетки

млекопитающих) был показан следующий эффект: при длительном

охлаждении часть ДНК теряется, однако она восстанавливается при

возвращении к оптимальной температуре. Полагают, что эта лабильная

фракция ДНК и является истинной метаболической ДНК [Gahan et al., 2008].

Таким образом, для лабильной фракции ДНК характерны следующие

признаки: а) она синтезируется как в пролиферирующих, так и в

дифференцированных клеточных популяциях; б) в обоих типах популяций ее

количество изменчиво; в) она имеет меньший молекулярный вес, чем

стабильная фракция (3-5 х 105 дальтон); г) ее синтез сопряжен с различными

19

метаболическими процессами, характерными для данной ткани [ваЬап е1 а1., 2008].

На данный момент остается вероятным, что оба процесса (как гибель клеток, так и целенаправленная секреция) вносят определенный вклад в формирование общего пула вкДНК.

1.3 Микроокружение внеклеточной ДНК

ДНК может присутствовать в крови как в растворе, так и в связанном виде. Структуры, с которыми она связана, относятся к гистоновым, везикулярным или ассоциированным с другими макромолекулярными комплексами.

Фрагментированная на нуклеосомы ДНК часто присутствует в ядрах нормальных клеток. В последнее время растет количество данных о том, что гистоны могут проходить сквозь плазматические мембраны и могут быть обнаружены в различных клеточных органеллах. Эта способность обусловлена нековалентными и неспецифичными ионными взаимодействиями; она может быть по-разному выражена у разных гистонов. Следовательно, гистоны можно рассматривать как комплексы, участвующие в транспорте ДНК. Помимо этого, обнаружены корреляции между концентрацией некоторых гистонов в крови и степенью развития определенных раковых заболеваний, что подтверждает теорию транспортировки ДНК с помощью гистонов.

Везикулярные ДНК-содержащие структуры можно разделить на три

группы: апоптотические тельца, микрочастицы и экзосомы. Микрочастицы

отделяются в ходе апоптоза, в процессе формирования апоптотических

телец. Экзосомы образуются в результате слияния плазматической мембраны

с внутриклеточными везикулами. Была прослежена их миграция в кровотоке

на длительные расстояния; они были также обнаружены и в других

жидкостях, как моча и спинномозговая жидкость. Сигнализация через

экзосомы осуществляется посредством их слияния с другими клетками и

20

передачи таким образом их содержимого. Показано нахождение в них мРНК и микроРНК, некоторые авторы также утверждают, что в них может находиться и ДНК. Однако существует мнение, кто вклад экзосомной ДНК в общее количество вкДНК незначителен по сравнению с некротической и апоптотической.

В последнее время удалось обнаружить вкДНК в составе макромолекулярных комплексов. Так, многими авторами было показано регулируемое высвобождение новосинтезированного ДНК-РНК-липопротеинового комплекса, содержащего также ДНК-зависимые ДНК- и РНК-полимеразы [Gahan et al., 2008]. Этот комплекс назвали виртосомой. Также было показано, что этот комплекс выделяется целиком как делящимися, так и дифференцированными клетками. ДНК в составе виртосом двухцепочечная и схожа с геномной ДНК. Ее размеры - 450-700 п.н. На культуре лимфоцитов было показано, что виртосомы выделяются до достижения некоторой пороговой концентрации вкДНК в среде культивирования; дальше выделение прекращается. Предполагают существование двух механизмов поддержания постоянной концентрации: а) наличие обратной связи, с помощью которой клетка «узнает» о концентрации виртосомной ДНК в среде; б) существование баланса между секрецией

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чвартацкая, Оксана Викторовна, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вейко Н.Н, Калашникова Е.А., Кокаровцева С.Н., Костюк С.Н., Ермаков A.B., Иванова С.М., Рязанцева Т.А., Еголина H.A., Ляпунова H.A., Спитковский Д.М.. Стимулирующее действие фрагментов транскрибируемой области рибосомного повтора на лимфоциты периферической крови человека.// БЭБиМ. - 2006. №10. - С.409-413.

2. Вейко H.H., Иванова С.М., Костюк C.B., Шубаева Н.О., Ермаков А.И., Еголина Н.Ф., Рязанцева Т.Ф., Сперанский А.И. Изменение свойств внеклеточной ДНК периферической крови при ревматоидном артрите. // Иммунология,- 2007.- Т28, №3. - С.147-151.

3. Вейко H.H., Костюк C.B., Ермаков A.B., Калашникова Е.А., Купавцева O.A., Рязанцева Т.А., Сперанский А.И.. Сыворотка периферической крови здоровых людей содержит антитела к фрагменту транскрибируемой области рибосомного повтора. // БЭБиМ. - 2007. -№9- С.277-281.

4. Ермаков A.B., Костюк C.B., Еголина H.A. и др. Фрагменты ДНК, обнаруживаемые в среде после воздействия ионизирующей радиации в в адаптирующих дозах, являются факторами стресс-сигнализации между лимфоцитами и клетками-свидетелями. // Радиоэкология. -2007. - Т. 47, № 2. - С. 133-140.

5. Калашникова Е.А., Вейко H.H. , Кокаровцева С.Н. , Костюк С.В, Ермаков A.B., Еголина H.A., Ляпунова H.A., Спитковский Д.М. Активация мононуклеаров периферической крови фрагментами транскрибируемой области рибосомного гена человека in vitroV/Тез. докл. X международной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 29 мая - 1 июня 2006 г., СПб, Медицинская иммунология. -2006.-Т. 8, №2-3.- С. 143-144.

6. Костюк C.B., Алексеева А.Ю., Конькова М.С., Смирнова Т.Д., Ермаков A.B., Ефремова Л.В., Конорова И.Л., Вейко H.H. Внеклеточная ДНК

95

влияет на функциональную активность клеток эндотелия. // Медицинская генетика. 2010. №1. С. 38-46.

7. Костюк С.В., Вейко Н.Н., Калашникова Е.А, Кокаровцева С.Н., Иванова С.М., Рязанцева Т.А., Сперанский А.И. Периферическая кровь здоровых доноров содержит антитела к фрагментам ДНК рибосомного повтора человека (ТОрДНК).// Материалы 6 съезда аллергологов и иммунологов СНГ. Аллергология и иммунология. -2006. - Т.7.№3. - С.254.

8. Костюк С.В., Замулаева И.А., Агапова Р.К., Ермаков А.В., Саенко А.С., Орлова Н.В., Смирнова С.Г., Вейко Н.Н., Спитковский Д.М. Изменение свойств внеклеточной ДНК периферической крови и частоты TCR-мутантных клеток при действии на организм человека ионизирующей радиации.// Радиац. биология. Радиоэкология.- 2008.- Т.48, № 1. - С. 513.

9. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В., Рыбалко С. JL, Шляховенко В. А. Иммуностимулирующая CpG-ДНК: перспективы клинического применения в онкологии. // Онкология. - 2006- Т.8, №22

Ю.Симбирцев А.С. Цитокины:классификация и биологические функции. Цитокины и воспаление. 2004; 3(2): 16-21.

11.Ahmad-Nejad P., Hacker Н., Rutz М., et al. Bacterial CpG-DNA and lipopolysaccharides activate Toll-like receptors at distinct cellular compartments. // Eur. J. Immunol. - 2002. - V. 32. - P. 1958-1968.

12.Akira S, Sato S. Toll-like receptors and their signaling mechanisms. // Scand J Infect Dis. - 2003. - V.35, №9. - P.555-562.

13.Akira, S., and K. Takeda. 2004. Toll-like receptor signaling. // Nat. Rev. Immunol. - V.4., №7. - P.499-511.

14.Andersen J.M., Al-Khairy D., Ingalls R.R. Innate immunity at the mucosal surface: role of toll-like receptor 3 and toll-like receptor 9 in cervical epithelial cell responses to microbial pathogens. // Biol. Reprod. - 2006. V.74., №5. - P.824-31.

15.Anker P., Stroun M., Maurice P.A. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system. // Cancer Res. - 1975. -V.35. - P.2375-2382.

16.Antonatos D., Patsilinakos S.,Spanodimos S., Korkonikitas P.,Tsigas D. Cell-free DNA levels as a prognostic marker in acute myocardial infarction. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2006. - V.1075, № 9. - P.278-81.

17.Armstrong L, Hughes O, Yung S, Hyslop L, Stewart R, Wappler I, et al. The role of PI3K/AKT, MAPK/ERK and NFkappabeta signalling in the maintenance of human embryonic stem cell pluripotency and viability highlighted by transcriptional profiling and functional analysis. Hum Mol Genet; - 2006.- 15(1 l):1894e913.

18.Atamaniuk J., Ruzicka K., Stuhlmeier K.M., et al. Cell-free plasma DNA: a marker for apoptosis during hemodialysis. // Clin. Chem. - 2006. - V.52, №3.-P. 523-526.

19. Atamaniuk J., Vidotto C., Tschan H., et al. Increased Concentrations of Cell-Free Plasma DNA after Exhaustive Exercise. // Clinical Chemistry. -2004. - V.50. - P.1668-1670.

20.Azzam E.I., de Toledo S.M. and Little J.B. Oxidative metabolism, gap junctions and the ionizing radiation-induced bystander effect. // Oncogene. 2003. V. 22. P. 7050-7057.

21.Barchet W., Cella M., Colonna M. Plasmacytoid dendritic cells—virus experts of innate immunity. // Semin Immunol. - 2005. - V. 17. - P.253-61.

22.Basu S., Fenton MJ. Toll-like receptors: function and roles in lung disease. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. - 2004. - V. 286. - P. 887-L892.

23.Beck J., Urnovitz H.B., Riggert J., Clerici M., Schutz E. Profile of the circulating DNA in apparently healthy individuals. // Clin. Chem. 2009. V. 55. P. 730-738.

24.Beutler B. TLR4 as the mammalian endotoxin sensor// Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2002. - Vol. 270. - P. 109-120.

25.Bin, L. H., Xu, L. G., Shu, H. B. TIRP, a novel Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain-containing adapter protein involved in TIR signaling. // J. Biol. Chem. - 2003. - V.278. - P.24526-24532.

26.Bonizzi G., Karin, M. The two NF-кВ activation pathways and their role in innate and adaptive immunity// Trends Immunol. - 2004. - Vol. 25. - P. 280-288.

27.Boyd J.H., Mathur S., Wang Y., Bateman R.M., Walley K.R. Toll-like receptor stimulation in cardiomyoctes decreases contractility and initiates an NF-kappaB dependent inflammatory response. // Cardiovasc Res. - 2006. -V. 72, № 3. - P.384-93.

28.Brikos C, O'Neill LA. Signalling of toll-like receptors. //Handb Exp Pharmacol (183) - 2008 - 21-50.

29.Bulicheva N., Veiko N., Fidelina O., Mkrtumova N., Neverova M. Cell-free DNA of patients with cardiomyopathy and ribosomal repeat alone plays a role in cardiomyocyte contractility. Clinical Chemistry, Abstracts for CNAPS.- 2007. - V 53, № 10.

30.Butt A.N., Swaminathan R. Overview of Circulating Nucleic Acids in Plasma/Serum. Update on Potential Prognostic and Diagnostic Value in Diseases Excluding Fetal Medicine and Oncology. // Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1137 P. 236-242.

31.Chem. Sept. 30 [Epub ahead of print] PMID: 14519765 (2003).

32.Chi H, Barry SP, Roth RJ, Wu JJ, Jones EA, Bennett AM, Flavell RA. Dynamic regulation of pro- and anti-inflammatory cytokines by МАРК phosphatase 1 (MKP-1) in innate immune responses. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2006. V.103, №7. - P.2274-2279.

33.Choi J.J., Reich C.F., Pisetsky D.S. The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells. // Immunology. 2005. V. 115. №. 1. P. 55-62.

34.Cortez-Gonzalez X., Pellicciotta I., Gerloni M., et al. TLR9-independent activation of B lymphocytes by bacterial DNA. // DNA Cell Biol. - 2006. -V. 25, №5.-P. 253-261.

35.Daniels JT. Stem cells: moving the biology towards the clinic. Regen Med. -2007.- May;2(3):313-5.

36.Dong C, Davis RJ, Flavell RA. Signaling by the JNK group of MAP kinases, c-jun N-terminal Kinase. // J Clin Immunol. - 2001. - V.21, №4. -P.253-257.

37.English K, Mahon BP. Allogeneic mesenchymal stem cells: agents of immune modulation. // J Cell Biochem. - 2011. - V.112, №8. - P.1963-1968.

38.Efremova L.V., Kostyuk S.V., Konorova I.L., Khaspekov G.P., Veiko N.N.. Accumulating fragments of extracellular DNA (ecDNA) influence rat primary cerebellum granule cell culture. // In Book "Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum". Springer Science+Business Media B.V.: 2010.

39.Ermakov AV, Kon'kova MS, Kostiuk SV, Ershova ES, Smirnova TD, Kameneva LV, Efremova LV, Liubchenko LN, Veiko NN. The response of human cancer stem cells on low-dose X-ray exposure. // Radiats Biol Radioecol. - 2009. - V.49, №5. - P.528-537.

40.Ermakov AV, Konkova MS, Kostyuk SV, Smirnova TD, Malinovskaya EM, Efremova LV, Veiko NN. An extracellular DNA mediated bystander effect produced from low dose irradiated endothelial cells. // Mutat Res. — 2011.— V.712, №1-2. — P. 1-10.

41.Ermakov AV, Kostyuk SV, Konkova MS, Egolina NA, Malinovskaya EM, Veiko NN. Extracellular DNA Fragments Factors of Stress Signaling between X-Irradiated and Nonirradiated Human Lymphocytes // Ann. N.Y. Acad. Sei. - 2008. - №1137. - P.41-46.

42.Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sei USA.- 2008. - Oct 21; 105(42): 16266-71.

99

43.Fitzgerald K.A, Palsson-McDermott E.M., Bowie A.G., et al. Mai (MyD88-adapter-like) is required for Toll-like receptor-4 signal transduction. // Nature - 2001. - V.413. - P.78-83.

44.Fitzgerald K.A., McWhirter S.M., Faia K.L., et al. IKK and TBK1 are essential components of the IRF3 signaling pathway. // Nat. Immunol. -2003,-V.4.-P.491-496.

45.Fusco A.J., Huang D.B., Miller D„ Wang V.Y., Vu D., Ghosh G. 2009. NF-kappaB p52:RelB heterodimer recognizes two classes of kappaB sites with two distinct modes. EMBORep.lQ, 152-159.

46.Gahan P.B., Anker P., Stroun M. Metabolic DNA as the origin of spontaneously released DNA // Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 7-17.

47.Gahan P.B., Stroun M. The virtosome - a novel cytosolic informative entity and intercellular messenger. // Cell. Biochem. Funct. 2010. V. 28. P. 529538.

48.Gahan P.B., Swaminathan R. Circulating nucleic acids in plasma and serum. Recent developments. // Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 1-6.

49.Goulopoulou S, Matsumoto T, Bomfim GF, Webb RC. Toll-like receptor 9 activation: a novel mechanism linking placenta-derived mitochondrial DNA and vascular dysfunction in pre-eclampsia. // Clin Sci (Lond). - 2012. -V.123, №7. -P.429-435.

50.Guillot, S. Medjane, K. Le-Barillec, V. Balloy, C. Danel, M. Chignard, M. Si-Tahar. Response of Human Pulmonary Epithelial Cells to Lipopolysaccharide Involves Toll-like Receptor 4 (TLR4)-dependent Signaling Pathways. Evidence for an intracellular compartmentalization of TLR4/ // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279, Issue 4. - P. 2712-2718.

51.Hahn S, Rusterholz C, Hosli I, Lapaire O. Cell-free nucleic acids as potential markers for preeclampsia. // Placenta. - 2011. - Suppl:S17-20.

52.Harada H, Takahashi E, Itoh S, Harada K, Hori TA, Taniguchi T. Structure and regulation of the human interferon regulatory factor 1 (IRF-1) and IRF-2

genes: implications for a gene network in the interferon system. // Mol Cell Biol. - 1994. - V.14, №2. - P. 1500-1509.

53.Hardy M. P., McGettrick A. F., O'Neill L. A. Transcriptional regulation of the human TRIF (TIR domain-containing adaptor protein inducing interferon p) gene// Biochem. J. - 2004. - Vol. 380. - P. 83-93.

54.Hayashi, F.; Smith, K. D.; Ozinsky, A., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. // Nature - 2001. -V.410 - P.1099-1103.

55.Hayden M.S., Ghosh S. 2008. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132, 344362.

56.He XX, Bai H, Yang GR, Xue YJ, Su YN. Expression of Toll-like receptors in human bone marrow mesenchymal stem cells. // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. - 2009. - V.17, №3. - P.695-699.

57.Hemmi H., O. Takeuchi, S. Sato, M. Yamamoto, T. Kaisho, H. Sanjo, T. Kawai, K. Hoshino, K. Takeda, S. Akira. The roles of two IkB kinase-related kinases in lipopolysaccharide and double stranded RNA signaling and viral infection//J. Exp. Med. - 2004.-Vol. 199.-P. 1641-1650.

58.Hoebe K., Du X., Georgel P., Janssen E., et al. Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signalling. // Nature - 2003 -V.424 - P.743-748.

59.Honda K., Yanai H., Mizutani T., et al. Role of a transductional-transcriptional processor complex involving MyD88 and IRF-7 in Toll-like receptor signaling. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2004. - V. 101. - P. 15416-15421.

60.Honda K.; Ohba Y.; Yanai H., et al. Spatiotemporal regulation of MyD88-IRF-7 signalling for robust type-I interferon induction. // Nature. - 2005. -V. 434.-P. 1035-1040.

61.1i WA, Sakamoto K, Leifer CA. TLR9 is important for protection against intestinal damage and for intestinal repair. // Sci Rep. - 2012;2:574. Epub 2012 Aug 14.

62.1shimura D., Yamamoto N., Tajima K., Ohno A., Yamamoto Y., Washimi O., Yamada H. Differentiation of adipose-derived stromal vascular cell fraction culture cells into chondrocytes using the method of cell sorting with a mesenchymal stem cell marker. // Tohoku. J. Exp. Med. 2008. № 216. P. 149-156.

63.Janssens S., Beyaert R. A universal role for MyD88 in TLR/IL-1 receptor-mediated signaling. // Trends Biochem. Sci. - 2002. - V.27. - P.474-482.

64.Jiang Z., Zamanian-Daryoush M., Nie H., et al. Poly(I-C)-induced Toll-like receptor 3-mediated activation of NF-kB and MAP kinase is through an interleukin-1 receptor-associated kinase-independent pathway employing the signaling components TLR3-TRAF6-TAK1-TAB2-PKR. // J. Biol. Chem. -2003. - V.278. -P.16713-16719.

65.Kato H., Sato S., Yoneyama M., et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. // Immunity. - 2005. - V. 23. - P. 19-28.

66.Kawai T., Akira S. TLR signaling. // Cell Death Differ. - 2006. - V.13. -P.816-825.

67.Kawai Y., Yoshida M., Arakawa K., et al. Diagnostic Use of Serum Deoxyribonuclease I Activity as a Novel Early-Phase Marker in Acute Myocardial Infarction. // Circulation. - 2004. - V. 109. - P. 2398-2400.

68.Khazen W., M'bika J.P., Collinet M., et al. Differentiation-dependent expression of interferon gamma and toll-like receptor 9 in 3T3-F442A adipocytes. // Biochimie. - 2007. - V. 89, № 5. - P. 669-675.

69.Konorova IL, Veiko NN, Novikov VE. Influence of plasma DNA on acid-base balance, blood gas measurement, and oxygen transport in health and stroke. // Ann N Y Acad Sci. -2008. - V. 1137. - P.278-282.

70.Krieg A., Yi A., Matson S., Waldschmidt T., et al. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. // Nature. - 1995. - V. 374. - P. 546549.

71.Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. // Ann.

Rev. Immunol. - 2002. - V. 20. - P. 709-60.

102

72.Lapidot T, Dar A, Kollet O. How do stem cells find their way home Blood. 2005 Sep 15;106(6):1901-10. Epub May 12. Review.

73.Lebre M.C., van der Aar A.M., van Baarsen L., et al. Human keratinocytes express functional Toll-like receptor 3, 4, 5, and 9. // J. Inves. Dermatol. -2007. - V. 127, № 2. - P. 331-41.

74.Lee N, Wong CK, Hui DS, Lee SK, Wong RY, Ngai KL, Chan MC, Chu YJ, Ho AW, Lui GC, Wong BC, Wong SH, Yip SP, Chan PK.Role of human Toll-like receptors in naturally occurring influenza A infections// Influenza Other Respi Viruses. 2013 Apr 1. doi: 10.111 l/irv.12109. [Epub ahead of print].

75.Lehrer MS, Sun TT, Lavker RM. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci.- 1998.-Octjlll ( Pt 19):2867-75.

76.Lenert P., Goeken J.A., Ashman R.F. Extended sequence preferences for oligodeoxyribonucleotide activity. // Immunology. - 2006. - V. 117, № 4, -P. 474-481.

77.Lenert P., Yi A.K., Krieg A.M., Stunz L., Ashman R.F. Inhibitory oligonucleotides block the induction of AP-1 transcription factor by stimulatory CpG oligonucleotides in B cells. // Antisense Nucl. Acid. Drug. Dev.-2003.-V. 13.-P. 143-150.

78.Lenert P.S. Targeting Toll-like receptor signaling in plasmacytoid dendritic cells and autoreactive B cells as a therapy for lupus. // Arthritis Res. Ther. -2006.-V. 8, № 1. - P. 203.

79.Levy DE, Raz R, Durbin JE, Bluyssen H, Muzaffar R, Pisharody S. Cytoplasmic transcription factors: mediators of cytokine signaling. //Agents Actions Suppl. - 1995. -V.47. - P.79-85.

80.Li K., Foy E., Ferreon J.C., et al. Immune evasion by hepatitis C virus NS3/4A protease-mediated cleavage of the Toll-like receptor 3 adaptor protein TRIF. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - V. 102. - P. 29922997.

81.Li K.; Chen Z.; Kato N., et al. Distinct poly(I-C) and virus-activated signaling pathways leading to interferon-beta production in hepatocytes. // J. Biol. Chem. - 2005. - V. 280. - P. 16739-16747.

82.Li T, Sun M, Yin X, Wu C, Wu Q, Feng S, Li H, Luan Y, Wen J, Yan L, Zhao B, Xu C, Sun Y. Expression of the calcium sensing receptor in human peripheral blood T lymphocyte and its contribution to cytokine secretion through MAPKs or NF-kB pathways// Mol Immunol. 2013 Apr;53(4):414-20.

83.Locke M., Windsor J. and Dunbar P.R. Human adipose-derived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery. // ANZ. J. Surg. 2009. V. 79. P. 235-244.

84.Majewska M., Szczepanik M. The role of Toll-like receptors (TLR) in innate and adaptive immune responses and their function in immune response regulation. // Postepy Hig. Med. Dosw. (Online). - 2006. - V. 60. - P. 5263.

85.Malinovskaya E.M., Kostyuk S.V., Ermakov A.V., Kon'kova M.S., Smirnova T.D., Kameneva L.V., Efremova L.V., Alekseeva A.Yu., Lyubchenko L.N., Veiko N.N. Fragments of Cell-free DNA (cfDNA) Enhance Transcription Activity in Human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) and Inhibit Their in vitro Differentiation. // In Book "Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum". P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V. 2010, chapter №30.

86.Malinovskaya EM, Kostyuk SV, Ermakov AV, Kon'kova MS, Smirnova TD, Kameneva LV, Efremova LV, Alekseeva AYu, Lyubchenko LN, Veiko NN. Fragments of cell-free DNA (cfDNA) enhance transcription activity in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and inhibit their in vitro differentiation. In Book "Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum". P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V. - 2010. - chapter №30. - P.199-205.

87.Mal'shakova V.S., Pyshnyi D.V., Bondar A.A., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Isolation and sequencing of short cell-surface-bound DNA. // Ann. NY. Acad. Sei. 2008. V. 1137. P. 47-50.

88.Martin-Armas M., Simon-Santamaria J., Pettersen I., Sveinbjornsson B. Toll-like receptor 9 (TLR9) is present in murine liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and mediates the effect of CpG-oligonucleotides. // J. Hepatol. - 2006. - V. 44, № 5. - P. 939-946.

89.Mayer A.K., Muehmer M., Mages J., et al. Differential recognition of TLR-dependent microbial ligands in human bronchial epithelial cells. // J. Immunol. - 2007. - V. 178, № 5. - P. 3134-3142.

90.McCoy S.L., Kurtz S.E., Hausman F.A., et al. Activation of RAW264.7 Macrophages by Bacterial DNA and Lipopolysaccharide Increases Cell Surface DNA Binding and Internalization. // J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279.-P. 17217-17223.

91.McGettrick A. F., O'Neill L. A. The expanding family of MyD88-like adaptors in Toll-like receptor signal transduction// Mol. Immunol. - 2004. -Vol. 41.-P. 577-582.

92.Meylan E., Curran J., Hofmann K., et al. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. // Nature. -2005. - V. 437. - P. 1167-1172.

93.Meylan E., K. Burns, K. Hofmann, V. Blancheteau, F. Martinon, M. Kelliher, J. Tschopp. RIP1 is an essential mediator of Toll-like receptor 3-induced NF-kB activation// Nat. Immunol. - 2004. - Vol. 5. - P. 503-507.

94.Miggin S.M.. O'Neill L.A.J. New insights into the regulation of TLR signaling. // J. Leukoc. Biol. - 2006. - V. 80. - P. 220-226.

95.Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. // J. Nippon. Med. Sch. 2009. V. 76. № 2. P. 56-6

96.Moore KW, de Waal MR, Coffman RL, O'Garra A. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. // Annu Rev Immunol. - 2001. - V. 19. - P.683-765.

105

97.Moro L, Venturino M, Bozzo C, Silengo L, Altruda F, Beguinot L, Tarone G, Defllippi P. Integrins induce activation of EGF receptor: role in MAP kinase induction and adhesion-dependent cell survival. EMBO J. - 1998.-Nov 16;17(22):6622-32

98.Morrison S J, Kimble J. Asymmetric and symmetric stem-cell divisions in development and cancer. Nature. - 2006 - Jun 29;441(7097): 1068-74.

99.Morrison SJ, Spradling AC. Stem cells and niches: mechanisms that promote stem cell maintenance throughout life// Cell. - 2008. - Feb 22;132(4):598-611

100. Oshiumi, H., Sasai, M., Shida, K., Fujita, T., Matsumoto, M., and Seya, T., TICAM-2: A bridging adapter recruiting to Toll-like receptor 4 TICAM-1 that induces interferon-B. J. Biol.

101. Palmer S., Chen Y.H. 2008. Bcl-3, a multifaceted modulator of NF-kappaB-mediated gene transcription Immunol Res. 42, 210-218.

102. Palsson-McDermott E.M., O'Neill L.A. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. // Immunology. - 2004. -V. 113.-P. 153-162.

103. Papantonis A, Kohro T, Baboo S, Larkin JD, Deng B, Short P, Tsutsumi S, Taylor S, Kanki Y, Kobayashi M, Li G, Poh HM, Ruan X, Aburatani H, Ruan Y, Kodama T, Wada Y, Cook PR. TNFa signals through specialized factories where responsive coding and miRNA genes are transcribed//EMBO J. 2012 Nov 28;31(23):4404-14.

104. Peters DL, Pretorius PJ. Origin, translocation and destination of extracellular occurring DNA — a new paradigm in genetic behaviour. // Clin Chim Acta. - 2011. - V.412, № 12. - P.806-811.

105. Pevsner-Fischer M., Morad V., Cohen-Sfady M., Rousso-Noori L., Zanin-Zhorov A., Cohen S., Cohen I.R. and Zipori D. Toll-like receptors and their ligands control mesenchymal stem cell functions. // Blood. 2007. V. 109. №4. P. 1422-1432.

106. Pine R, Canova A, Schindler C. Tyrosine phosphorylated p91 binds to a single element in the ISGF2/IRF-1 promoter to mediate induction by IFN alpha and IFN gamma, and is likely to autoregulate the p91 gene. // EMBO J. - 1994. - V.13, №1. -P.158-167

107. Potten CS, Wilson JW, Booth C. Regulation and significance of apoptosis in the stem cells of the gastrointestinal epithelium. Stem Cells. -1997. - 15(2):82-93

108. Puszyk W.M., Crea F., Old R.W. Unequal representation of different unique genomic DNA sequences in the cell-free plasma DNA of individual donors. // Clin. Biochem. 2009. V. 42. P. 736-738.

109. Raicevic G, Rouas R, Najar M, Stordeur P, Boufker HI, Bron D, Martiat P, Goldman M, Nevessignsky MT, Lagneaux L. Inflammation modifies the pattern and the function of Toll-like receptors expressed by human mesenchymal stromal cells. // Hum Immunol. - 2010. - V.71, №3. -P.235-244.

110. Reginato MJ, Mills KR, Paulus JK, Lynch DK, Sgroi DC, Debnath J, Muthuswamy SK, Brugge JS. Integrins and EGFR coordinately regulate the pro-apoptotic protein Bim to prevent anoikis.: Nat Cell Biol. - 2003.-Aug;5(8):733-40

111. Rogers J.C., Boldt D., Kornfeld S., Skinner A., Valeri C.R. Excretion of deoxyribonucleic acid by lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin or antigen. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 1685-1689.

112. Rutz M., Metzger J., Gellert T., et al. Toll-like receptor 9 binds single-stranded CpG-DNA in a sequence- and pH-dependent manner. // Eur. J. Immunol. - 2004. - V. 34. - P. 2541-2550.

113. Sano H, Takai O, Harata N, Yoshinaga K, Kodama-Kamada I, Sasaki T. Binding properties of human anti-DNA antibodies to cloned human DNA fragments. // Scand. J. Immunol. - 1989. - V. 30. - P. 51-63.

114. Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. // Nat Rev Cancer. - 2011. - V.ll, №6. -P.426-437.

115. Seth R.B., Sun L., Chen Z.J. Antiviral innate immunity pathways. // Cell Res.-2006.-V. 16.-P. 141-147.

116. Seya T., Oshiumi H., Sasai M., Akazawa T., Matsumoto M. TICAM-1 and TICAM-2: toll-like receptor adapters that participate in induction of type 1 interferons. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005. - V. 37. - P. 524-529.

117. Sharif MN, Tassiulas I, Hu Y, Mecklenbrauker I, Tarakhovsky A, Ivashkiv LB. IFN-alpha priming results in a gain of proinflammatory function by IL-10: implications for systemic lupus erythematosus pathogenesis. // J Immunol. - 2004. - V. 172. - P.6476-6481.

118. Sharma S., tenOever B.R., Grandvaux N., et al. Triggering the interferon antiviral response through an IKK-related pathway. // Science. -2003.-V. 300.-P. 1148-1151.

119. Siess D.C., Vedder C.T,. Merkens L.S., et al. A human gene coding for a membrane-associated nucleic acid-binding protein. // Stem Cells. 2004. -V.22, № 5. - P. 725-40.

120. Simeonidis S, Stauber D, Chen G, Hendrickson WA, Thanos D. Mechanisms by which IkappaB proteins control NF-kappaB activity. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. - V.96, №1. - P.49-54.

121. Singer NG, Caplan Al. Mesenchymal stem cells: mechanisms of inflammation. // Annu Rev Pathol. - 2011. - V.6. - P.457-478.

122. Stagg J. Immune regulation by mesenchymal stem cells: two sides to the coin. Tissue Antigens. - 2007 - Jan;69(l):l-9. Review.

123. Sun L., L. Deng, C. K. Ea, Z. P. Xia, Z. J. Chen. The TRAF6 ubiquitin ligase and TBK1 kinase mediate IKK activation by BCL10 and MALT1 in T lymphocytes// Mol. Cell. - 2004. - Vol. 14. - P. 289-301.

124. Sun Z, Zhang R, Wang H, Jiang P, Zhang J, Zhang M, Gu L, Yang X,

Zhang M, Ji X. Serum IL-10 from systemic lupus erythematosus patients

108

suppresses the differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells//J Biomed Res. 2012 Nov;26(6):456-66.

125. Suzuki N, Kamataki A, Yamaki J, Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. // Clin Chim Acta. - 2008. -V.387. -P.55-58.

126. Suzuki N, Kamataki A, Yamaki J, Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. // Clin Chim Acta. - 2008. -V.387.-P.55-58.

127. Suzuki N., Kamataki A., Yamaki J., Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. // Clin. Chim. Acta. 2008. V. 387. P. 55-58.

128. Takagi M. Toll-like Receptor. // J Clin Exp Hematop. - 2011. - V.51, №2. - P.77-92.

129. Tobias P., Curtiss L.K. Thematic review series: The Immune System and Atherogenesis. Paying the price for pathogen protection: toll receptors in atherogenesis. // Journal of Lipid Research. - 2005. - V. 46. - P. 404-411.

130. Tomchuck SL, Zwezdaryk KJ, Coffelt SB, et al. Toll-like receptors on human mesenchymal stem cells drive their migration and immunomodulating responses. // Stem Cells. - 2008. - V.26, №1. - P.99-107.

131. Tong Y.K., Lo YM. Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acids.// Clin Chim Acta. - 2006. -V.363, №1-2. -P.187-196.

132. Umetani N., Giuliano A.E., Hiramatsu S.H., et al. Prediction of breast tumor progression by integrity of free circulating DNA in serum. // J. Clin. Oncol. - 2006. - V. 24. - P. 4270-4276.

133. Van der Vaart M., Pretorius P.J. Circulating DNA. Its origin and fluctuation. //Ann. NY. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 18-26.

134. Veiko NN, Kalashnikova EA, Kokarovtseva SN, Kostyuk SV,

Ermakov AV, Ivanova SM, Ryazantseva TA, Egolina NA, Lyapunova NA,

109

Spitkovskii DM. Stimulatory effect of fragments from transcribed region of ribosomal repeat on human peripheral blood lymphocytes. // Bull Exp Biol Med. - 2006. - V.142, №4. - P.428-432

135. Veiko NN, Shubaeva NO, Ivanova SM, Speranskii AI, Lyapunova NA, Spitkovskii DM. Blood serum DNA in patients with rheumatoid arthritis is considerably enriched with fragments of ribosomal repeats containing immunostimulatory CpG-motifs. // Bull Exp Biol Med. - 2006. -V.142, №3.-P.313-316.

136. Veiko NN, Spitkovskii DM. The accumulation of single-stranded breaks does not lead to paired DNA damage—the characteristic of the transcribing fragment of the human ribosomal operon that allows its being detected in biological fluids at the death of different body cells. // Radiats Biol Radioecol. - 2000. - V.40, №4. - P.396-404.

137. Vogel S.N., Fitzgerald K.A., Fenton M.J. TLRs: differential adapter utilization by toll-like receptors mediates TLR-specific patterns of gene expression. // Mol. Interv. - 2003. - V. 3. - P. 466-477.

138. Wagner H., Bauer S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. // JEM - V.203, № 2, - P. 265-268

139. Wang B.G., Huang H.Y.,Chen Y.C., et al. Increased plasma DNA integrity in cancer patients. // Cancer Res. - 2003. - V. 63. - P. 3966-3968.

140. Wang C., Deng L., Hong M., et al. TAK1 is a ubiquitin-dependent kinase of MKK and IKK. // Nature. - 2001. - V. 412. -P. 346-351.

141. Wang H., Rayburn E., Zhang R. Synthetic oligodeoxynucleotides containing deoxycytidyl-deoxyguanosine dinucleotides (CpG ODNs) and modified analogs as novel anticancer therapeutics. // Curr. Pharm. Des. -2005.-V. 11.-P. 2889-2907.

142. Wang L, Zhao Y, Liu Y, Akiyama K, Chen C, Qu C, Jin Y, Shi S.

IFN-y and TNF-a Synergistically Induce Mesenchymal Stem Cell

Impairment and Tumorigenesis via NFkB Signaling// Stem Cells. 2013 Apr

4. doi: 10.1002/stem.l388. [Epub ahead of print].

no

143. Wang ZJ, Zhang FM, Wang LS, Yao YW, Zhao Q, Gao X. Lipopolysaccharides can protect mesenchymal stem cells from oxidative stress-induced apoptosis and enhance proliferation of MSCs via Toll-like receptor(TLR)-4 and PI3K/Akt. Cell Biol Int. - 2009. - Apr 17.

144. Wier EM, Neighoff J, Sun X, Fu K, Wan F. Identification of an N-terminal truncation of the NF-kB p65 subunit that specifically modulates ribosomal protein S3-dependent NF-kB gene expression//J Biol Chem. 2012 Dec 14;287(51):43019-29.

145. Windheim M., Stafford M., Peggie M., Cohen P. 2008. Interleukin-1 (IL-1) induces the Lys63-linkedpolyubiquitinationofIL-l receptor-associated kinase 1 to facilitate NEMO binding and the activation of IkappaBalpha kinase. Mol Cell Biol. 28, 1783-1791.

146. Yamamoto M., S. Sato, H. Hemmi, S. Uematsu, K. Hoshino, T. Kaisho, O. Takeuchi, K. Takeda, S. Akira TRAM is specifically involved in the Toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway// Nat. Immunol. - 2003. - Vol. 4. - P. 1144-1150.

147. Yamamoto M., Sato S., Hemmi H., et al. Essential role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR4. // Nature. -2002.-V. 420.-P. 324-329.

148. Yao Y, Zhang F, Wang L, et al. Lipopolysaccharide preconditioning enhances the efficacy of mesenchymal stem cells transplantation in a rat model of acute myocardial infarction. // J Biomed Sci. - 2009. - V.16, №1. -P.74-85.

149. Yasuda K., Yu P., Kirschning C.J., et al. Endosomal translocation of vertebrate DNA activates dendritic cells via TLR9-dependent and -independent pathways. // J. Immunol. - 2005. - V. 174. - P. 6129-6136.

150. Yasuda, K., Ogawa Y., Yamane I., Nishikawa M., Takakura Y.

Macrophage activation by a DNA/cationic liposome complex requires

endosomal acidification and TLR9-dependent and -independent pathways. //

J. Leukoc. Biol. - 2005. - V. 77. - P. 71-79.

in

151. Yoneyama M., Kikuchi M., Natsukawa T., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. // Nat. Immunol. - 2004. - V. 5. - P. 730-737.

152. Zhang X., Wu M., Zhang W., Shen J., Liu H. Differentiation of human adipose-derived stem cells induced by recombinantly expressed fibroblast growth factorlO in vitro and in vivo. // In. Vitro. Cell. Dev. Biol. Animal. 2010. V. 46. P. 60-71.

153. Zhang Z, Vuori K, Reed JC, Ruoslahti E. The alpha 5 beta 1 integrin supports survival of cells on fibronectin and up-regulates Bcl-2 expression. Proc Natl Acad Sei USA.- 1995.- Jun 20;92(13):6161-5.

154. Zhong B., Tien P., Shu H-B. Innate immune responses: Crosstalk of signaling and regulation of gene transcription. // Virology. - 2006. - V. 352. -P. 14-21.

155. Zhong X.Y , Hahn S., Kiefer V., Holzgreve W. Is the quantity of circulatory cell-free DNA in human plasma and serum samples associated with gender, age and frequency of blood donations. // Ann. Hematol. - 2006. -V. 86.-P 139-143.

Благодарности

Я благодарю д.б.н., заведующую лаборатории молекулярной биологии Наталью Николаевну Вейко, а также к.м.н., ведущего научного сотрудника лаборатории молекулярной биологии Светлану Викторовну Костюк ФГБУ Медико-генетического научного центра РАМН за помощь в организации и проведении научных исследований по теме диссертации.