Радиационно-индуцированный "эффект свидетеля" в совместной культуре лимфоцитов разнополых доноров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.01, кандидат биологических наук Колесникова, Ирина Станиславовна

  • Колесникова, Ирина Станиславовна
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2012, Москва
  • Специальность ВАК РФ03.01.01
  • Количество страниц 150
Колесникова, Ирина Станиславовна. Радиационно-индуцированный "эффект свидетеля" в совместной культуре лимфоцитов разнополых доноров: дис. кандидат биологических наук: 03.01.01 - Радиобиология. Москва. 2012. 150 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Колесникова, Ирина Станиславовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности биологического действия ионизирующего излучения в малых

дозах

1.2. Радиационно-индуцированный эффект свидетеля

1.2.1. Ранние исследования опосредованных (дистанционных) эффектов

17

ионизирующей радиации

1.2.2. Современные представления о возможных механизмах ЭС

90

1.2.2.1. Оксидативный стресс при РИЭС

00

1.2.2.2. Межклеточная сигнализация при РИЭС

1.2.2.3. Внутриклеточные молекулярные сигнальные процессы в клетках-

свидетелях

О А

1.2.2.4. Репаративные процессы при РИЭС

1.2.2.5. Эпигенетические изменения и биоэлектрические процессы при РИЭС

33

1.2.3. Методы исследования РИЭС

38

1.2.4. Критерии оценки РИЭС

1.3. Радиационно-индуцированныи адаптивныи ответ

юксидантной защиты 1.3.1.2. Индукция систем репарации ДНК при РИАО.

1.3.1.1. Индукция систем антиоксидантной защиты при РИАО

1.3.1. Возможные механизмы

1.

РИАО

1.3.1.3. Другие внутриклеточные молекулярные процессы при

1.3.1.4. Изменения клеточного цикла и возможные популяционные механизмы

РИАО

47

1.3.1.5. Перестройка хроматина при РИАО

1.4. Радиационно-индуцированная нестабильность генома

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика материала

2.2. Схемы экспериментов

2.2.1. Исследование РИЭС по критерию АО при временной схеме адаптирующего и

повреждающего облучений

2.2.2. Исследование РИЭС по критерию АО при временной схеме адаптирующего и повреждающего облучений Gi-Gj

2.2.3. Сопоставление количества индуцированных в лимфоцитах ХА в моно- и совместных культурах при временной схеме облучения Gt-Gj

2.2.4. Исследование взаимного влияния необлучённых и облучённых в дозе 1 Гр

лимфоцитов на частоту ХА в них

2.3. Облучение лимфоцитов

2.4. Культивирование лимфоцитов крови и приготовление метафазных

препаратов

2.5. Микроскопический анализ препаратов

2.6. Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3 1. Влияние облучения в дозе 0.05 Гр на развитие адаптивного ответа в облучённых (ПАО) и необлучённых (ОАО) лимфоцитах при совместном

культивировании

3.1.1. Временная схема адаптирующего и повреждающего облучений Go-G}

3.1.2. Временная схема адаптирующего и повреждающего облучений

5 1 3. Общий статистический анализ данных по всем донорам при обеих временных '

схемах адаптирующего и повреждающего облучений

3.1.4. Выраженность ПАО и ОАО у доноров при различных временных схемах

облучений

3.2. Сопоставление результатов облучения моно- и совместных культур при одинаковой схеме адаптирующего и повреждающего облучений (GrG0

3.3. Влияние облучения лимфоцитов в дозе 1 Гр на частоту ХА в необлучённых

лимфоцитах при их совместном культивировании

3 4 Влияние необлучённых лимфоцитов на частоту ХА в лимфоцитах, облучённых в

дозе 1 Гр, при их совместном культивировании

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

ИР - ионизирующая радиация

РИЭС - радиационно-индуцированный «эффект свидетеля»

РИАО - радиационно-индуцированный адаптивный ответ

РИНГ - радиационно-индуцированная нестабильность генома

РУ - радиоустойчивость

ПАО - прямой адаптивный ответ

ОАО - опосредованный адаптивный ответ

АК - аберрантные клетки

ХА - хромосомные аберрации

вкДНК - внеклеточная ДНК

РКВ - реакционно-способные кислородсодержащие вещества

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Радиобиология», 03.01.01 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Радиационно-индуцированный "эффект свидетеля" в совместной культуре лимфоцитов разнополых доноров»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Традиционно считалось, что биологические эффекты ионизирующей радиации обусловлены только прямыми повреждениями молекул ДНК. Однако данные многочисленных исследований свидетельствуют о том, что в рамках классической «теории мишени» не всегда можно объяснить наблюдаемые медико-биологические последствия облучения, особенно при низких дозах лучевого воздействия. Ещё в 60-70х годах прошлого века было показано, что при относительно высоких дозах, кроме прямого механизма действия радиации на клетки, существует и опосредованный, называвшийся тогда дистанционным, гуморальным (Керкис Ю.Я. и др., 1964; Zhumiel I. et al., 1971). Он выражался в том, что нарушения возникали не только в облучённых клетках, но и в гуморально связанных с ними интактных. Применительно к малым дозам ионизирующих излучений непрямой эффект радиации на клетки получил название радиационно-индуцированного «эффекта свидетеля» (РИЭС). Считается, что именно РИЭС может лежать в основе нестабильности генома потомства облучённых популяций клеток и организмов, радиационного канцерогенеза и неопухолевой отдалённой лучевой патологии при низкодозовом радиационном воздействии (Mothersill С. and Seymour С., 2000). На основании большого количества экспериментальных данных были высказаны различные предположения о природе этих немишенных эффектов

ионизирующих излучений. Однако до сих пор конкретные механизмы, лежащие в основе РИЭС до конца не ясны.

Как правило, в работах по изучению РИЭС используются достаточно сложные методические приёмы: инкубирование необлучённых клеток в среде от облучённых (Mothersill С. et al, 2001), облучение культур клеток излучением с высокой ЛПЭ (Nagasawa Н., Little J.D., 1992), внутреннее облучение клеток путём включения в них радиоактивных изотопов (Bishayee A. et al., 2001), трансплантация облучённых клеток костного мозга необлучённым реципиентам (Watson G.E. et al., 2000), облучение отдельных клеток микропучками заряженных частиц (Folkard М. et al., 1997 a; Folkard М. et al., 1997 b). Многие из них дорогостоящи и доступны лишь технически хорошо оснащённых лабораториям.

В связи с вышесказанным, продолжение исследования самого феномена РИЭС, а также поиск простых и доступных моделей для его выявления и

изучения является актуальным.

Пели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении РИЭС на модели совместной культуры человеческих лимфоцитов

разнополых доноров.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать возможность развития опосредованного адаптивного

ответа (ОАО) по критерию хромосомных аберраций (ХА) в

необлучённых лимфоцитах женских/мужских доноров при

совместном культивировании с облучёнными в адаптирующей дозе лимфоцитами доноров противоположного пола при временной схеме адаптирующего и повреждающего воздействий в0 - в].

2. Провести аналогичное исследование при временной схеме адаптирующего и повреждающего облучений в] - О].

3. Изучить взаимное влияние в совместной культуре облучённых в дозе 1 Гр и необлучённых лимфоцитов разнополых доноров на частоту спонтанных и индуцированных ХА.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе для исследования РИЭС был применён новый методический подход: совместное культивирование человеческих лимфоцитов периферической крови разнополых доноров. Кариотипическое различие мужских и женских клеток (XX и ХУ) даёт возможность регистрации генетических нарушений раздельно в облучённых лимфоцитах и в соседствующих с ними необлучённых. Преимуществом метода является его простота, использование недорогой рутинной процедуры культивирования лимфоцитов, возможность изучения влияния облучённых клеток на необлучённые не только по наиболее часто используемым в литературе морфологическим и биохимическим показателям радиационного поражения (ХА, микроядра, двунитевые разрывы, сестринские хроматидные обмены, генные мутации, изменение экспрессии генов), но и по исследованным значительно меньше функциональным критериям. В настоящей работе РИЭС исследовался по

одной из важных функциональных характеристик лимфоцитов - способности к адаптивному ответу. Было показано, что в необлучённых лимфоцитах прн совместном культивировании с облучёнными в адаптирующей дозе клетками противоположного пола может развиваться адаптивный ответ по механизму «эффекта свидетеля». Эта способность выражена неодинаково у разных доноров и зависит от используемой временной схемы адаптирующего и повреждающего воздействий (G, - G, и G, - G,). Предлагаемый новый метод даёт* возможность изучать количественные закономерности РИЭС по критерию адаптивного ответа, изменяя дозы облучений, соотнощепие и время контакта облучённых и необлучённых клеток в смешанной культуре. Он позволяет изучать РИЭС, культивируя необлучённые мужские/женские лимфоциты с лимфоцитами донора противоположного пола, облучённых не только in vitro, но и in vivo (от людей, подвергшихся неконтролируемому облучению, космонавтов) и устанавливать таким образом, возможна ли передача сигналов от облучённых клеток к необлучённым в условиях целостного организма. Данные пилотного эксперимента с совместной культурой облучённых в дозе 1 Гр и необлучённых лимфоцитов, свидетельствующие о возможности не только негативного (мутагенного) влияния облучённых лимфоцитов на необлучённые, но и обратного, пози—о (антимутагенного) эффекта, являются новыми и представляют интерес в связи с практической клинической проблемой профилактики осложнений после лучевой терапии онкологических пациентов.

Теоретическое значение работы. Полученные в работе результаты важны для понимания роли немишенных механизмов в развитии отдалённой лучевой патологии у людей, подвергшихся действию ионизирующей радиации в малых дозах. Они позволяют также приблизиться к пониманию причин развития так называемых «вторичных» опухолей у пациентов после лучевой терапии первичных. Метод совместно культивирования лимфоцитов разнополых доноров, апробированный в работе на примере РИЭС по цитогенетическому критерию адаптивного ответа, теоретически может использоваться и для изучения других немишенных эффектов малых доз ионизирующей радиации (геномная нестабильность, повышение радиочувствительности).

Положения, выносимые на защиту

1. При совместном культивировании лимфоцитов, облучённых в адаптирующей дозе 0.05 Гр, и неадаптированных лимфоцитов после разрешающего облучения в дозе 1 Гр наблюдается адаптивный ответ по критерию ХА как в предварительно облучённых клетках, так и в необлучённых клетках-свидетелях, при обеих использованных временных схемах адаптирующего и повреждающего воздействий (во-й! и ОгвО.

2. При совместном культивировании облучённых в дозе 1 Гр и необлучённых лимфоцитов наблюдается: в необлучённых клетках -повышение количества ХА по сравнению со спонтанным уровнем в

монокультуре, в облучённых - снижение количества индуцированных ХА по сравнению с аналогично облучённой монокультурой.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на международной научно-практической конференции «Отдалённые последствия воздействия ионизирующего излучения» (Киев, 2007); международной школе-конференции «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов», (Санкт-Петербург, 2007); научной конференции «От лучей рентгена - к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института» (Санкт-Петербург, 2008); V съезде ВОГиС (Москва, 2009); международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и загрязнение окружающей среды» (Сыктывкар, 2009); I Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010); V международной научно-практической конференции "Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения" (Томск, 2010); VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) «25 лет с момента аварии на Чернобыльской АЭС» (Москва, 2010); конференции молодых ученых Санкт-Петербурга «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», (Санкт-Петербург, 2010); международной конференции «Медико-биологические проблемы действия радиации» (Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ, и 10 тезисов съездов и конференций.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 4 рисунка. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 4 рисунка. Список цитируемой литературы включает 205 источников, из них 148 иностранных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности биологического действия ионизирующего излучения в малых дозах.

Традиционное представление об эффектах ионизирующей радиации (ИР) на живые клетки и организмы основывалось на предположении о том, что радиационные повреждения возникают исключительно в облучённой клетке и что ДНК является главной молекулой-мишенью в ней. Однако накопленные данные привели к изменению основной парадигмы радиобиологии, поскольку наблюдаемые радиационные эффекты не всегда можно было объяснить одним лишь мишенным механизмом действия ИР. Такие явления как радиационно-индуцированный «эффект свидетеля» (РИЭС), радиационно-индуцированный адаптивный ответ (РИАО) и радиационно-индуцированная нестабильность генома (РИНГ), являющиеся немишенными радиационными эффектами, в настоящее время являются предметом всестороннего изучения и обсуждения. При этом считается, что немишенные эффекты ИР наиболее явно проявляют себя при малых дозах облучения.

Существует несколько подходов к определению понятия малых доз радиации. Единой формулировки данного понятия не существует, однако по мнению большинства радиобиологов малыми, или низкими дозами ИР являются дозы, не вызывающие детерминистских патологических эффектов в

облучённых организмах. Иными словами, для радиационных эффектов, имеющих порог зависимости от дозы облучения, низкими будут считаться дозы ниже пороговой. Данная формулировка предполагает зависимость диапазона доз, относимых к низким, от учитываемого радиационного

эффекта (поражения).

С физической точки зрения малые дозы были определены как дозы, соответствующие одному событию пролета частицы сквозь заданный чувствительный объем (Kellerer A.M., 1976). Это дозы излучения, при которых в критической мишени реализуется в среднем не более одного радиационного события. Так, для а-частиц пределы варьирования низких доз составляют от 20 до 100 мГр, для у-излучения Со60 - около 0.2 мГр, для нейтронов - от 0.4-8 до 50 мГр (быстрые нейтроны) (Котеров А.Н., 2010).

С точки зрения радиационной медицины и эпидемиологии малые дозы -это дозы, которые не вызывают видимых серьезных нарушений жизнедеятельности человека. Границу таких доз НКДАР устанавливает в

районе 200 мГр (UNSCEAR. 2000).

С точки зрения радиационной цитогенетики для определения понятия малых доз используется зависимость доза-эффект для хромосомных аберраций (ХА), а именно соотношение вклада линейной и квадратичной компонент в линейно-квадратичное уравнение, описывающее эту зависимость. Границей малых доз считают то значение, при котором в уравнении кривой доза-эффект начинает преобладать квадратичная

компонента.

t. Установлено, что, например, для гамма-излучения это происходит начиная с 20-40 мГр (IAEA, 2001). Кроме того, для доз ниже 30 мГр не наблюдалось превышение уровня ХА над спонтанным (Pohl-Ruehling J. et al„ 1983; Lloyd D.C. et al„ 1992). По цитогенетическому критерию НКДАР относит к низким дозы ниже 20-40 мГр (UNSCEAR. 2000).

Радиационные катастрофы, такие, как авария на Чернобыльской АЭС, характеризующиеся выбросом больших количеств радиационно активных веществ, являются чрезвычайными ситуациями, складывающимися достаточно редко. В повседневной жизни люди чаще всего сталкиваются не с однократным, острым, а с хроническим, низкодозовым воздействием ионизирующей радиации: повышенный радиационный фон на загрязнённых территориях, диагностические медицинские процедуры, излучение от приборов и проч.. Поэтому с точки зрения радиационной эпидемиологии для прогноза медицинских последствий облучения важно исследование действия именно низких доз ИР, при которых преобладают немишенные эффекты, на

клетки, ткани и организмы в целом.

Немишенные эффекты ИР важно учитывать при оценке рисков как

первичного радиационного канцерогенеза, так и развития вторичных опухолей после лучевой терапии. Существует мнение, что эффект свидетеля может быть одним из механизмов вторичного канцерогенеза (Baskar R., 2010). Кроме того, имеются данные о том, что у пациентов после радиохимиотерапии обнаруживается геномная нестабильность. Было

высказано предположение о том, что именно она может являться фактором, повышающим риск развития у таких людей вторичных лейкемий (ОепиагсИ М. & а1., 1988).

Способность к повышению радиорезистентности после облучения в малой дозе (индукции РИАО) является важной функциональной характеристикой клетки. Как следует из имеющихся литературных данных, отсутствие способности к индукции РИАО или обратная реакция клеток и организмов на низкодозовое предварительное облучение свидетельствует об имеющихся в них и организме в целом нарушениях в результате внутренних (генетически и физиологически обусловленных) и/или внешних (обусловленных неблагоприятными воздействиями) причин. Таким образом, характер и выраженность эффектов низких доз ИР может дать ценную информацию о состоянии клеток и организма в целом. Эту характеристику можно использовать в прогностических целях. Способность к РИАО была названа среди биологических маркеров, которые могут быть полезны как показатели повышенного риска возникновения заболеваний, в том числе и онкологических, а также одним из возможных критериев профессионального

отбора (Пелевина И.И. и др., 2007).

Не менее актуален вопрос немишенных эффектов ИР с точки зрения радиотерапии. Известны попытки индукции РИАО в здоровых, но не в раковых клетках с целью защиты первых от пагубного влияния последующего радиотерапевтического воздействия. В работе (В1апкепЬескег

R., 2010) предлагалось использовать предварительное воздействие на пациентов ИР в низких дозах перед последующим облучением в рамках радиотерапии, что, по мнению автора, могло бы улучшить эффективность радиотерапии, уменьшить побочные эффекты радиотерапевтических процедур, а также снизить количество сеансов облучения и стоимость лечения. Приводимые автором результаты экспериментов на собаках, страдающих раком ротовой полости, свидетельствуют об ослаблении нежелательных побочных эффектов радиотерапии у животных, предварительно испытавших низкодозовое облучение по сравнению с контролем (стандартная радиотерапия). Другие авторы (Jin S.Z. et al., 2007) опубликовали радиотерапевтический протокол, разработанный на модели мышиной меланомы и лёгочной карциномы и предусматривающий наряду со стандартным облучением предварительноре воздействие на больных животных ИР в низких дозах (0.075 Гр) вместо части процедур высокодозового облучения. Такой протокол значительно повышал эффективность радиотерапии по нескольким различным параметрам: повышалась выживаемость животных, сокращался средний вес опухоли и уменьшалось метастазирование, подавлялся внутриопухолевый рост сосудов. Таким образом, важность исследований немишенных эффектов низких доз ИР и их учёта при решении прогностических, диагностических вопросов и практических задач не вызывает сомнений.

1.2. Радиационно-индуцированный эффект свидетеля.

1.2.1. Ранние исследования опосредованных (дистанционных) эффектов

ионизирующей радиации.

О дистанционных эффектах ионизирующих излучений исследователи сообщали ещё с начала второй половины прошлого века.

В 1966 г. A.M. Кузиным было сформулировано понятие «радиотоксинов», т.е. продуктов гуморальной природы, образующиеся в тканях облучаемых растений и животных. Было показано, что в облучённых тканях растений образуются метаболиты, обладающие неспецифическим цитотоксическим и мутагенным действием на живые необлучённые клетки (Кузин A.M., 1966). Введение интактным мышам водно-солевых экстрактов из тканей облучённых животных вызывало повышение ХА в клетках эпителия роговицы реципиентов в 3.5-6 раз по сравнению с интактным контролем (Керкис Ю.Я. и др., 1964). Подобные результаты были получены и при действии экстракта из тканей облучённых мышей на культуры лейкоцитов человека: при инкубировании клеток с такими экстрактами количество клеток, несущих хромосомные аберрации, возрастало в 19 раз по сравнению с интактными клетками и клетками, инкубированными с экстрактами из тканей необлучённых животных (Яснова JI.H., Керкис Ю.Я., 1966).

В опытах по локальному облучению крыс с экранированием головы животного свинцом было отмечено 10-кратное увеличение количества

хромосомных мутаций в эпителии роговицы облучённых таким образом животных по сравнению с интактными крысами. В этой же работе была показана индукция ХА в клетках костного мозга и эпителия роговицы необлучённых крыс после инъекции им гомогената тканей облучённых животных (Керкис Ю.Я. и др, 1964).

В исследованиях (Рябуха А.К., Резвая С.П., 1970) было продемонстрировано значительное увеличение выживаемости облучённых в дозе 500 Р. крыс, которым после облучения осуществляли аутотрансплантацию изъятых до облучения клеток костного мозга в диффузионных камерах (контролем служили животные, которым были интродуцированы аналогичные пустые камеры). Авторы допускали гуморальное влияние на выживаемость облучённых крыс продуктов жизнедеятельности находившихся в диффузионных камерах необлучённых костномозговых клеток. При облучении животных в дозе 600 Р. такого эффекта не наблюдалось. Было высказано предположение, что при дозе 600 Р. одних лишь продуктов жизнедеятельности интактных клеток из диффузионных камер без их расселения в организме уже не достаточно для повышения выживаемости животных.

В опытах с переносом среды (г1иише1 I. et а1., 1971) было показано снижение темпов роста клеток линии мышиных лейкемийных фибробластов Ь5178У как необлучённых, так и облучённых в дозе 300 рад, культивированных в среде от облучённых в дозе 10000 рад, по сравнению с

соответствующими клетками, культивированными в «чистой» среде. При этом сунернатант от облучённых культур оказывал на клетки менее губительное влияние, чем облучённая в той же дозе «пустая» культуральная среда, что авторы объясняли взаимодействием клеток, от которых получали супернатант, с повреждающими компонентами среды.

В работе (Littlefield L.G. et al., 1969) исследователи вносили в культуры нормальных необлучённых лейкоцитов человека плазму крови онкопациентов, получивших существенные дозы облучения в связи с радиотерапией. Авторы наблюдали значительно большее количество хромосомных повреждений (разрывов) в таких культурах по сравнению с контролями (культурами клеток с добавлением аутологичной плазмы, плазмы крови других необлучённых здоровых людей и плазмы крови

необлучённых онкопациентов).

В настоящее время опосредованный эффект ИР носит название радиационно-индуцированного эффекта свидетеля (РИЭС). Он продемонстрирован в различных биологических моделях и по различным показателям, однако его механизмы до сих пор не вполне ясны и являются предметом всестороннего изучения. Всплеск современных исследований РИЭС открыла работа (Nagasawa Н„ Little J.D., 1992), в которой авторы сообщили об индукции повышенного числа сестринских хроматидных обменов в клетках СНО, непосредственно не затронутых облучением.

1.2.2. Современные представления о возможных механизмах ЭС

Среди основных факторов, составляющих механизм реализации РИЭС, называют следующие: оксида— стресс - выделение клетками реактивных кислород- и азотсодержащих радикалов во внешнюю среду; передача сигнала посредством контактов gap junction; образование сигнальных молекул, выделяющиеся во внешнюю среду, например, монооксид азота, фрагменты внеклеточной ДНК и др.

1.2.2.1. Оксидативный стресс при РИЭС.

Известно, что клетки, подвергнутые низкодозовому облучению,

производят реакционно-активные кислородсодержащие вещества (РКП) и радикалы (НА, 02*"), которые при попадании во внеклеточное пространство могут воздействовать на необлучённые клетки, вызывая повреждения ДНК либо являясь сигнальным фактором, запускающим дальнейшие процессы в клетках-свидетелях. Было обнаружено также повышение количества РКВ в необлучённых клетках при воздействии на них среды от облучённых. При этом количество РКВ как в непосредственно облучённых клетках, так и в клетках-свидетелях зависело от величины дозы облучения (Narayanan Р.К. et al„ 1997). Считается, что океидативному стрессу принадлежит важнейшая роль в индукции повреждений в необлучённых клетках при РИЭС. Показано, что добавление в культуральную среду от облучённых клеток супероксид-дисмутазы (SOD) предотвращает возникновение сестринских хроматидных

обменов в клетках-свидетелях (Lehnert В.Е., Goodwin Е.Н., 1992) и снижение их клоногенной способности (Lyng F.M. et al., 2006). Добавление меланина перед облучением также ослабляет проявление РИЭС, сокращая количество индуцируемых повреждений в необлучённых клетках, испытавших воздействие культуральной среды от облучённых, и подавляя сигнализацию между клетками (Mosse I. et al., 2006).

Важная роль в оксидативном стрессе при РИЭС принадлежит митохондриям. Было показано, что при воздействии на необлучённые клетки культуральной среды от облучённых наблюдалась деполяризация митохондриальной мембраны, в случае предварительной инкубации необлучённых клеток в присутствии SOD и каталазы изменения потенциала митохондриальной мембраны не наблюдалось (Lyng F.M. et al., 2006). Клетки с удалённой митохондриальной ДНК обнаруживали значительно меньшую способность к индукции РИЭС по сравнению с нормальными. Аналогичный эффект наблюдался при воздействии на клетки перед облучением ингибиторов дыхательной цепи (ротенона, антимицина А и олигомицина)

(Chen S. et al., 2008).

Исследования мутаций, возникающих в непосредственно облучённых клетках и в клетках-свидетелях, показали, что характер индуцированных повреждений в них различен. При изучении индуцированных в клетках китайского хомячка мутаций в гене HPRT при облучении клеток а-частицами в дозах 0.5 сГр (напрямую повреждались 0.3% ядер клеток) и 10 сГр

(повреждались не менее чем 44% ядер) было обнаружено, что в первом случае подавляющее большинство индуцированных мутаций было представлено точковыми мутациями, в то время как во втором - делециями (Huo L. et al., 2001). По мнению авторов, механизм возникновения мутаций в клетках-свидетелях отличается от имеющего место при прямом воздействии ионизирующего излучения, и соответствуют скорее окислительному повреждению оснований нежели двунитевым разрывам ДНК (Huo L. et al., 2001; Литтл Д.Б., 2007). Другие данные, полученные при исследовании фокусов гистонов у-Н2АХ, ассоциирующихся с двунитевыми разрывами ДНК, свидетельствуют о том, что возникновение двунитевых разрывов является ранним событием не только в непосредственно облучённых фибробластах, но и в клетках-свидетелях, поскольку в последних количество этих фокусов также значительно возрастает как при локальном облучении монослойной культуры клеток, так и при добавлении к необлучённым клеткам среды от облучённых (Han W. et al., 2007). 1.2.2.2. Межклеточная сигнализация при РИЭС.

Предполагается наличие двух основных путей стресс-сигнализации при РИЭС: взаимодействие через каналы gap-junction и посредством секреции облучёнными клетками факторов стресс-сигнализации в межклеточную среду. В пользу первого механизма свидетельствует подавление РИЭС линданом - ингибитором межклеточных контактов (Zhou Н. et al., 2000; Azzam E.I. et al., 2001), а также обнаруженых в работе (Zhou Н. et al., 2000)

отсутствие влияния на РИЭС добавления к культивируемым гибридным клеткам Аь диметилсульфоксином (DMSO) - агента, связывающего РКВ. Однако данные другой группы исследователей свидетельствуют о том, что воздействие DMSO приводит к исчезновению способности культуральной среды от облучённых клеток индуцировать двунитевые разрывы в клетках-свидетелях (Han W. et al., 2007). Было показано, что добавление форбол-миристиновой кислоты (phorbol myristate acid - PMA), также ингибитора контактов gap junction, перед облучением не снижало, а даже усиливало гибель как непосредственно облучённых клеток, так и необлучённых, на которые воздействовали культуральной средой от облучённых (Mothersill С., Seymour С., 1998).

Многочисленные успешные эксперименты по индукции «эффекта свидетеля» посредством переноса среды от облучённых клеток к необлучённым неоспоримо свидетельствует о важной роли в этом процессе сигнальных факторов, выделяемых облучёнными клетками во внеклеточное пространство. В исследовании (Mothersill С., Seymour С., 1998) было продемонстрировано, что количество межклеточных контактов в облучённой культуре эпителиальнх фибробластов и кератиноцитов человека не влияет на способность среды от таких культур сокращать выживаемость (клоногенную способность) клеток-свидетелей. Авторы считают, что для реализации РИЭС важна лишь плотность клеток в культуре. По их мнению, именно сигнальная транедукция, а не высвобождение напрямую цитотоксичных факторов,

является основным механизмом регулирования выживаемости клеток-свидетелей. Показано также, что индукция двунитевых разрывов в клетках-свидетелях более выражена в случае, когда к необлучённым фибробластам добавляли среду от облучённых, чем в случае локального облучения монослойной культуры (Han W. et al„ 2007). Вероятно, РИЭС может реализовываться посредством обоих предполагаемых механизмов как посредством контактов gap junction, так и за счёт выделения факторов сигнализации во внеклеточную среду, и в разных случаях вклад различных путей стресс-сигнализации в реализацию РИЭС может различаться.

Основными сигнальными молекулами в РИЭС, как показывают исследования, являются азотсодержащие радикалы, а именно оксид азота NO* (Matsumoto Н. et al„ 2001; Leach J.K. et al., 2002; Shao C. et al., 2003), участвующий также в реализации РИАО. В работе (Matsumoto Н. et al., 2001) на клетках глиобластомы человека было продемонстрировано накопление белков стрессового ответа (HSP72 и ТР53) в необлучённых клетках, культивированных совместно с облучёнными. Та же реакция в необлучённых клетках наблюдалась при воздействии на них среды от облучённых. Этот эффект полностью отсутствовал при добавлении в культуры аминогуанидина (ингибитора NO-синтазы), что наряду с повышением концентрации NO в среде после облучения указывало на его непосредственное участие в сигнализации между облучёнными и необлучёнными клетками. В другом исследовании (Shao С. et al., 2003) при добавлении в культуру клеток T98G

глиобластомы человека 2-(4-карбоксигенил)-4.4.5.5-тетраметилимидазолина-1-оксил-З-оксида (с-РТЮ), специфически связывающего N0, выраженность РИЭС значительно снижалась. При добавлении с-РТЮ к среде от таких облучённых культур её цитотоксический эффект (РИЭС) также подавлялся. Кроме того, с помощью специфичного к N0 4-амино-5-метиламино-2',7'-дифлуорофлоуресцина (DAF-FM) было выявлено повышение количества флуоресцирующих клеток в культуре и общей интенсивности их флуоресценции после индивидуального облучения 1% клеток, что указывало на увеличение продукции N0 после облучения. Об участии в процессе межклеточной сигнализации реакционно-способных кислород- и азотсодержащих молекул может свидетельствовать исчезновение способности культуральной среды от облучённых клеток индуцировать двунитевые разрывы в клетках-свидетелях при добавлении DMSO (Han W. et

al, 2007).

Обнаружена также сигнальная роль фрагментов ДНК, выделяемых в межклеточную среду клетками, облучёнными в низких дозах. В среде культивирования лимфоцитов, облучённых в низкой дозе обнаруживаются фрагменты внеклеточной ДНК (вкДНК), которые, как было показано, вызывают при добавлении к необлучённым клеткам-свидетелям реакции, характерные для непосредственно облучённых, такие как перемещение гомологичных хромосомных локусов от периферии ядра к его центру и активация ядрышковых организаторов (Ермаков A.B. и др., 2007 а). При

инкубировании лимфоцитов-свидетелей в присутствии фрагментов вкДНК из среды культивирования интактных лимфоцитов таких реакций не наблюдалось (Ермаков А.В. и др., 2007 а, б). Аналогичные реакции сопровождают адаптацию клеток, облучённых в низких дозах, к последующему высокодозовому облучению (Спитковский Д.М. и др., 2000). Основным источником вкДНК может являться субпопуляция клеток, характеризующихся повышенной частотой апоптоза, индуцированного радиацией, которые после гибели высвобождают специфическую ДНК, претерпевшую изменения после облучения (Ермаков А.В. и др., 2007 а). Культивирование лимфоцитов-свидетелей в присутствии фрагментов внеклеточной ДНК, выделенных из среды культивирования клеток, в которых ингибирована каспаза 3 (участник апоптотических процессов), не приводило к изменениям позиции хромосомных локусов и активации ядрышек, т.е. РИЭС отсутствовал (Ермаков А.В. и др., 2007 б).

Одними из кандидатов на роль рецепторов фрагментов вкДНК являются белки семейства 'toll-like" рецепторов, TLR9 (Ермаков А.В. и др., 2007 б). Лигандами для этих рецепторов служат неметилированные CpG-мотивы ДНК, присутствующие, например, в транскрибируемой области рибосомного повтора - ТОрДНК. Известно что её фрагменты накапливаются во вкДНК человека (Вейко Н.Н., Спитковский Д.М., 2000) и обладают выраженным стимулирующим действием на человеческие лимфоциты, вызывая те же эффекты, что и радиация в малых дозах (Вейко Н.Н. и др., 2006). При

ингибировании TLR9 после добавления фрагментов вкДНК от облучённых клеток в лимфоцитах-свидетелях не было обнаружено индуцируемой по механизму эффекта свидетеля транспозиции хромосомных локусов, хотя стимуляция ядрышко-организующих районов наблюдалась (Ермаков A.B. и др., 2007). Было высказано предположение, что существует не один путь, с помощью которого вкДНК осуществляет сигнализацию между лимфоцитами (Вейко H.H. и др., 2006; Ермаков A.B. и др., 2007).

Последние исследования позволили предположить возможное участие в межклеточной сигнализации молекул микро-РНК (miR). В крови (цит. по Krutovskih V.A., Herceg Z., 2010) и других жидкостях (Gilad S. et al. 2008.; Nilsson J. et al. 2009; цит. по Krutovskih V.A., Herceg Z., 2010) онкологических больных обнаруживаются специфические miR, которые используют в качестве диагностического маркера. Показано, что эти miR очень стабильны и устойчивы к внешним воздействиям (Mitchell P.S. et al., 2008). Обнаружено, что miR содержатся в выделяемых клетками микроскопических мембранных пузырьках - экзосомах. Экзосомы от раковых клеток (онкосомы) могут взаимодействовать с мембранами здоровых клеток, высвобождая в них своё содержимое. Этот процесс полагают одним из возможных механизмов распространиния опухоли (Valadi Н. et al. 2007.; Skog J. et al. 2008.; Al-Nedawi K. et al. 2008.; цит. по Krutovskih V.A., Herceg Z., 2010). Можно было бы предположить, что подобный процесс может иметь место и при РИЭС, поскольку в клетках-свидетелях, как и в раковых клетках, наблюдаются

существенные изменения микро-РНКома (Koturbash I. et al., 2007; Kovalchuk О. et al., 2010), и «эффект свидетеля» считают одним из возможных механизмов возникновения вторичных опухолей (Baskar R., 2010). Однако данные последней работы (Dickey J.S. et al., 2011) заставляют усомниться в том, что miR играют первостепенную роль в межклеточном сигналлинге при РИЭС. Выраженность РИЭС в культурах клеток карциномы с частично нокаутированным геном, кодирующим белок Dicer (рибонуклеаза, необходимая для окончательного созревания miR) не отличалась от таковой в клетках карциномы дикого типа. Однако при этом авторы отмечают, что, поскольку полностью нокаутные по Dicer клетки нежизнеспособны и некоторое количество miR в них всё ещё присутствует, необходимы дальнейшие исследовании роли miR в межклеточной сигнализации при РИЭС.

1.2.2.3. Внутриклеточные молекулярные сигнальные процессы в клетках-свидетелях.

Показано участие в реализации РИЭС сигнального каскада циклооксигеназы 2 (СОХ-2): в клетках-свидетелях была обнаружена её трёхкратная сверхэкспрессия, а её ингибирование снижало количество индуцируемых в клетках-свидетелях мутаций более чем в 6 раз (Zhou Н. et al., 2005). Было установлено, что в клетках-свидетелях активируются также связанные с СОХ-2 каскадом МАР-киназные каскадные пути (Lyng F.M. et al., 2006). Ингибирование сигнального пути иммуноглобулина F (IGF),

активирующего МАР-киназные пути, также уменьшало количество мутаций в клетках-свидетелях почти в 4 раза (Zhou Н. et al., 2005). В клетках-свидетелях обнаружена активация протеинкиназ ERK и JNK, при этом добавление ингибитора ERK приводило к значительному усилению выраженности РИЭС, а ингибитора JNK - напротив, к его ослаблению (Lyng F.M. et al., 2006). Имеются свидетельства об активации в клетках-свидетелях ядерного фактора кВ (NF-кВ) (связан с путями митохондриального стресса), серинтреонинкиназы Raf-1 (активируется клеточными ростовыми факторами), МАР-киназа р38 (играет важную роль во многих путях сигнальной трансдукции) (Azzam E.I. et al., 2002). Показано, что фактор роста опухолей TGF-a и фактор некроза опухолей TNF-a, выделяемые облучёнными клетками, индуцируют в клетках-свидетелях активацию упомянутых выше сигнальных путей МАР-киназ MEK-ERK и упомянутого выше каскада СОХ-2, активность которых связывают со снижением выживаемости и мутагенезом, индуцируемыми по «свидетельскому» механизму (Zhou Н. et al., 2005). Обнаружено возрастание в клетках-свидетелях количества изоформ протеинкиназы С: PKG-(3II, PKC-a/j3, РКС-0 (Baskar R. et al., 2008). Продемонстрировано также увеличение внутриклеточного пула ионов Са2+ за счёт их высвобождения из эндоплазматического ретикулума, что, как полагают авторы, может играть важную роль в индукции апоптотической гибели клеток-свидетелей (Lyng F.M. et al., 2006). В клетках-свидетелях была обнаружена активация

апоптотического белка BCL2 (Maguire P. et al., 2005), а также участие в ответе клеток-свидетелей на сигал от облучённых клеток р53-апоптотического пути (Mothersill С. et al., 2011). 1.2.2.4. Репаратиеные процессы при РИЭС.

Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что в клетках, дефектных по репарации ДНК, повреждения при РИЭС значительно более выражены, нежели в нормальных клетках. Так, в яйцеклетках китайского хомячка, мутантных по генам репарации двойных разрывов ДНК, РИЭС оказался в несколько раз более выражен по сравнению с нормальными клетками (Yamaoca К. et al., 1991). Обнаружено, что индукция хромосомных аберраций в клетках-свидетелях зависит от функционирования репарационной системы NHEJ (Nonhomologous end joining). РИЭС усилен в клетках, дефицитных именно по этой системе, по сравнению с клетками дикого типа (Little J.B. et al., 2003). В то же время в клетках-свидетелях, дефицитных по HR (Homologous recombination), РИЭС по критерию количества ХА был выражен настолько же, насколько и в клетках-свидетелях дикого типа, но при этом не был выявлен при анализе сестринских хроматидных обменов. Это, по мнению автора исследования, согласуется с ролью HR в индукции сестринских хроматидных обменов (Литтл Д.Б., 2007). Предположительно, HR играет роль в индукции сестринских хроматидных обменов в клетках-свидетелях, однако она не способна полностью репарировать возникающие в них двунитевые разрывы, что приводит к

появлению хромосомных аберраций. Вероятно, двунитевые разрывы также возникают вследствие опосредованных повреждений ДНК, однако в нормальных клетках большинство из них репарируется системой NHEJ (Литтл Д.Б, 2007). Об индукции процессов репарации двунитевых разрывов в клетках-свидетелях говорит также транспозиция в ядрах необлучённых клеток, испытавших воздействия среды от облучённых, гомологичных районов хромосом, которая, как отмечают авторы, необходима для гомологичной рекомбинации (Ермаков А.В. и др., 2005).

1.2.2.5. Эпигенетические изменения и биоэлектрические процессы при РИЭС.

Имеются данные о роли в реализации РИЭС эпигенетических процессов. В работе (Koturbash, Boyko, Rodrigues et al, 2007) были обнаружены значительные эпигенетические изменения в клетках экранированной селезёнки при облучении головы мышей: снижение глобального метилирования ДНК, изменение метилирования LINE-1 элементов (являющихся ретротранспозонами), подавление активности ДНК-метилтрансфераз и метил-СрО-связывающего белка 2 (МеСР2). Кроме того, наблюдалось значительное усиление экспрессии микро-РНК miR-194, мишенью которой, как предполагают, являются ДНК-метилтрансфераза За и МеСР2. Было обнаружено также сокращение в клетках экранированных тканей количества метилтрансфераз DNTM3a и ЗЬ и повышение количества метил-связывающих белков MeCPl и MBD2, участвующих в процессе подавления транскрипции (Koturbash I. et al, 2006). В опытах с локальным

облучением мышей были выявлены различия во временном характере и выраженности изменений метилирования ДНК и экспрессии микро-РНК в клетках экранированной селезёнки и экранированных участков кожи: в селезёнке изменения метилирования МеСР2 обнаруживались значительно дольше по времени и были выражены значительно сильнее, чем в клетках кожи. Таким образом, эпигенетические изменения в клетках-свидетелях, по-видимому, тканеспецифичны (Ilnitskyy Y. et al., 2009).

На основании того факта, что меланин, поглощающий излучение практически любой длины волны, защищает от опосредованных радиационных эффектов, было высказано предположение о возможном значении для РИЭС физических процессов (Mosse I. et al., 2006). Известно, что биоэлектрические и магнитные поля могут влиять на клетки и организмы в целом (Gandhi O.P., 2002; Brodsky L.M. et al., 2003; Swanson J. and Kheifets L., 2006; Yamaguchi et al., 2006), a также на продукцию биомолекул, в частности, ростовых факторов (Aaron R.K. et al., 2004). В работе (Mothersill С. et al., 2006) была экспериментально подтверждена возможная роль биоэлектрических и биомагнитных эффектов в реализации РИЭС: облучение культуры кератиноцитов человека внутри клетки Фарадея (устройства, которое представляет собой заземленную клетку, выполненную из материала с хорошей электропроводностью и экранирующее находящиеся внутри него объекты от внешних электромагнитных полей) значительно уменьшало выраженность РИЭС. Одним из возможных биоэлектрических эффектов,

возникающих при облучении клеток, является деполяризация их мембран, которая, по мнению авторов, может продуцировать биоэлектромагнитное поле клетки. В этой же работе авторы высказывают предположение о зависимости выраженности РИЭС от плотности клеток в среде, связывая это с продукцией клетками биологических электромагнитных полей.

Литературные данные свидетельствуют о том, что «эффект свидетеля» может иметь место не только при воздействии ИР. Показана индукция эффекта свидетеля ультрафиолетовым излучением (Вапецее О. е! а1., 2005), тепловым шоком (РигесКке М. et а1., 2010).

Таким образом, имеется большое количество экспериментальных данных, на основе которых базируются предположения о механизмах опосредованных эффектов ионизирующих излучений. По-видимому, РИЭС имеет комплексную природу, и каждый из предполагаемых механизмов играет ту или иную роль в его индукции и развитии. 1.2.3. Методы исследования РИЭС

Хронологически первыми методами исследования непрямых эффектов ионизирующих излучений были: использование диффузионных камер (Рябуха А.К., Резвая С.П., 1970), культивирование необлучённых клеток в среде от облучённых (21идше1 I. е1 а1., 1971), а также локальное облучение животных (Керкис Ю.Я. и др., 1964).

Методика культивирования клеток в диффузионных камерах была введена в практику А^ке с соавторами. Устройство камер должно было

предотвращать миграцию клеток из камеры и внутрь неё, но не препятствовать диффузии сигнальных молекул. Действительно, авторы не обнаружили свидетельств выхода имплантированных клеток из камер или входа в камеры лейкоцитов животных-реципиентов (А^ге в.Н. ег а1., 1954).

Частичное экранирование подопытных животных также использовалось в основном в ранних исследованиях опосредованного действия ИР. Так, в экспериментах (Керкис Ю.Я. и др., 1964) животных облучали таким образом, что голова их была защищена свинцовой полусферой, а затем исследовали количество индуцированных ХА в клетках роговицы глаза. Контролями служили полностью интактные животные и животные, полностью экранированные свинцовой полусферой. В настоящее время методика локального облучения активно используется канадской группой исследователей. Они облучают голову подопытных животных, экранируя туловище, и исследуют метилирование ДНК и изменения микро-РНКома в необлучённой селезёнке и необлучённых участках кожи (КоШгЬаБЬ I. е1 а1., 2006; КоШгЬазЬ I. е! а1., 2008).

Использовался и такой методический подход как введение интактным животным гомогената из тканей облучённых животных с последующим анализом количества ХА в клетках роговицы глаза подопытных особей (Керкис Ю.Я. и др., 1964).

Другим популярным до сих пор методом исследования РИЭС стало инкубирование необлучённых клеток в среде от облучённых. Обычно в таких

исследованиях используют один из двух способов воздействия ИР. Первый предполагает внешнее облучение клеток (Zhumiel I. et al., 1971), второй -внутреннее облучение с использованием радиоактивных изотопов, в частности, трития (Н3) в виде Н3-тимидина, которые включаются в ДНК клетки при их культивировании (Pinto М. et al., 2006). В некоторых

123т 131т

исследованиях в качестве радиоактивного изотопа использовался 1, 1, 211 At в виде соответствующих мета-бензилгуанидинов (Boyd М. et al., 2006).

Существуют также работы по исследованию РИЭС, в которых осуществлялось внутреннее облучение клеток путём включения в них трития в виде Н3-тимидина (Bishayee А. et al., 2001) или ,251 в виде 5[1251]йодо-2'-дезоксиуридина (Xue L.Y. et al., 2002) и затем смешивание их с необлучёнными клетками. При этом предполагалось, что излучаемые радиоактивными изотопами ионизирующие частицы имеют длину пробега, не превышающую размеры клетки, и следовательно не покидают её пределы.

Имеется ряд работ, в которых исследовали РИЭС, добавляя плазму крови облучённых доноров в культуры необлучённых клеток. В работе (Littlefield L.G. et al., 1969) индуцировали РИЭС (хроматидные разрывы) путём внесения в культуры нормальных необлучённых лейкоцитов человека плазму крови онкопациентов, облучавшихся локально в общей дозе порядка 70 Гр в связи с радиотерапией. В исследовании (Морозик П.М. и др., 2011) наблюдали РИЭС (повышенное количество микроядер) после добавления в культуру человеческих кератиноцитов сыворотки крови людей,

пострадавших в результате аварии на ЧАЭС. В работе (Acheva A. et al, 2008) для индукции РИЭС использовали плазму крови здоровых людей, облученной in vitro.

Существует также методика трансплантации облучённых клеток костного мозга необлучённым реципиентам. Чтобы отличать цитогенетические эффекты, связанные непосредственно с передачей сигнала облучённых клеток необлучённым, от изменений, связанных с расселением трансплантированых клеток, в экспериментах (Watson G.E. et al., 2000) был использован цитогенетический маркёр - стабильная реципрокная транслокация Т6 между хромосомами 14 и 15, присутствовавшая в соматических клетках необлучённых мышей-реципиентов.

В 90х годах прошлого века в исследованиях опосредованных эффектов ИР начали использовать методический подход, заключающийся в облучении культур клеток излучением с высокой ЛПЭ (например, а-частицами) в низких дозах. При этом количество затронутых облучением клеток определяли расчётным путём исходя из дозы облучения. Такой метод использовали, в частности, в работе (Nagasawa H., Little J.D., 1992).

Наиболее распространённой в настоящее время методикой изучения РИЭС является облучение отдельных клеток микропучками заряженных частиц, обычно - ядер гелия (а-частицы). Этот метод, разработанный в последние годы прошлого века, позволяет облучать отдельные клетки или даже их отдельные части, например, только ядро, или цитоплазму, не

затрагивая ядра (Folkard М. et al., 1997; Folkard M. et al., 1997). Этот метод дорогой и доступен лишь тем лабораториям, у которых имеется соответствующее оборудование. Одной из установок, применяющихся для микрооблучения, является часто упоминающаяся в литературе RARAF (Singletron of the Radiological Research Accelerator Facility) Университета округа Колумбия, США (Randers-Pehrson G. et al., 2001) .

В 2003 году И. E. Воробцовой был предложен, а затем начал нами разрабатываться новый методический подход к изучению РИЭС, который заключается в совместном культивировании лимфоцитов мужского и женского доноров. Лимфоциты мужчины либо женщины подвергают облучению, в то время как клетки донора противоположного пола не облучают. После этого лимфоциты обоих доноров культивируют совместно в одном флаконе. Кариотипическое различие мужских (XX) и женских (XY) клеток позволяет чётко различать на метафазных препаратах клетки, подвергшиеся воздействию, и клетки-свидетели. При этом гарантируется их полная физическая разобщённость в момент воздействия. Таким образом, данный метод представляет собой удобную модель для исследования РИЭС при различных параметрах облучения и культивирования.

Данный методический подход разрабатывается также украинскими исследователями (Шеметун О.В., Пилинская М.А., 2005; Шеметун О.В. и др., 2006).

1.2.4. Критерии оценки РИЭС

Как правило, РИЭС регистрируется по различным морфологическим параметрам:, выживаемость клеток в культуре или клоногенная активность (Mothersill С. et al, 2006), апоптоз (Lyng F.M. et al, 2000), хромосомные аберрации (Little J.B. et al, 1997), микроядра (Azzam E.I. et al, 2002), двунитевые разрывы, выявляемые посредством иммонофлуоресцентной детекции гистона у-Н2АХ (Chen S. et al, 2008), генные мутации (Zhou H. et al, 2000; Zhou H. et al, 2005), сестринские хроматидные обмены (Nagasawa H. et al, 1997).

Ряд исследователей регистрирует РИЭС по некоторым функциональным критериям: экспрессия генов (Azzam E.I. et al, 2002; Ghandhi S.A. et al. 2010), опухолевая трансформация (Sigg M. et al, 1997; Sawant S.G. et al, 2001), пролиферативная активность клеток (Iyer R, Lehnert B.E, 2000), геномная нестабильность (Lorimore S.A. et al, 1998; Watson G.E. et al, 2000; Lorimore S.A, Wright E.G., 2003), транспозиция локусов хромосом (Ермаков А.В. и др, 2005), деполяризация митохондриальной мембраны (Acheva A. et al, 2008), индукция тканевой дифференцировки (Belyakov O.V. et al, 2006), РИАО в неадаптированных клетках, соседствующих с адаптированными (Iyer, Lehnert, 2003а; Iyer, Lehnert, 2003b; Воробцова И.Е, Колесникова И.С, 2007; Колесникова И.С, Воробцова И.Е, 2011).

1.3. Радиационно-индуцированный адаптивный ответ.

Радиационно-индуцированный адаптивный ответ (РИАО) - это общая индуцибельная реакция клеток и организмов на воздействие ИР в малых дозах, выражающаяся в повышении резистентногсти к последующему облучению в высоких дозах (Пелевина И.И. и др., 2007).

РИАО в лимфоцитах человека был описан в 1984 году (Olivieri G. et al., 1984) и с тех пор активно изучается многими исследователями. Однако первые свидетельства о том, что воздействие мутагенов в низких дозах может способствовать выживаемости клеток, появились раньше. В работе (Samson L., Carnis J., 1977) сообщалось об индукции в бактериях Escherichia coli алкилирующим агентом М-метил-№-нитрозогуанидином в низких дозах репарации ДНК, об уменьшении количества мутаций и повышении выживаемости при последующем воздействии тех же агентов в более высоких. Позже аналогичные результаты были получены на клетках СНО и на трансформированных вирусом SV40 фибробластах из кожи человека. Было показано увеличение выживаемости и снижение количества индуцированных сестринских хроматидных обменов в предобработанных N-метил-К'-нитрозогуанидином в низких дозах клетках по сравнению с клетками, не подвергавшимися предварительной обработке (Samson L.,

Schwartz J.L., 1980).

В лимфоцитах человека адаптивный ответ возникает под воздействием

ИР в низких дозах (2-5 сГр) и регистрируется не менее чем через 4 часа после

адаптирующего воздействия (Shadley J.D. et al., 1987). Его выраженность зависит от дозы адаптирующего (Красавин Е.А. и др., 2000; Schwarz S.B. et al., 2008) и повреждающего (Черникова С.Б. и др., 1993) облучения и от его интенсивности (Shadley J.., Wiencke J.K., 1989), а также от возраста доноров (Gadhia Р.К., 1998). Показано, что в культуре лимфоцитов здоровых доноров РИАО может сохраняться в течение не менее 72 часов после адаптирующего облучения, то есть на протяжении как минимум 2-3 клеточных поколений (Осипов А.Н. и др., 2009). 1.3.1. Возможные механизмы РИАО.

Механизмы РИАО остаются до конца не выясненными. Существует мнение, что невозможно постулировать единый механизм развития РИАО, и в зависимости от индивидуальных особенностей клетки/организма, а также условий формирования адаптации, причины повышения радиоустойчивости после низкодозового облучения могут иметь различную природу (Котеров А.Н., Никольский A.B., 1999; Серебряный A.M. и др., 2004; Серебряный A.M. и др., 2008).

1.3.1.1. Индукция систем антиоксидантной защиты при РИАО.

Считается, что низкодозовое облучение индуцирует в клетках систему антиоксидантной защиты. Так, показано усиление антиоксидантной активности ферментов в плазме крови мышей после облучения в малой дозе. При этом облучение животных (собак и мышей) в летальной и сублетальной дозах приводило, напротив, к снижению активности соответствующих

Похожие диссертационные работы по специальности «Радиобиология», 03.01.01 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Радиобиология», Колесникова, Ирина Станиславовна

выводы

2. В женских (мужских) лимфоцитах, культивированных совместно с предоблучёнными в дозе 0.05 Гр лимфоцитами доноров противоположного пола, наблюдается ОАО, развивающийся по механизму ЭС.

3. ОАО наблюдается в клетках-свидетелях как при временной схеме адаптирующего и повреждающего воздействий О0-Оь так и при временной схеме 01-01.

4. Наблюдается значительная межиндивидуальная вариабельность в способности доноров к ОАО.

5. В пилотном эксперименте на модели совместной культуры лимфоцитов 2х разнополых доноров показано, что в необлучённых лимфоцитах, культивированных совместно с облучёнными в дозе 1 Гр клетками, увеличивается частота ХА по сравнению со спонтанным уровнем, а в облучённых - снижается количество индуцированных ХА по сравнению с уровнем в монокультуре.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В исследованиях 60х-70х годов прошлого века для изучения непрямых эффектов ИР использовали локальное облучение и диффузионные камеры. Эти методы прменимы только для экспериментальных животных. Также применяли инкубирование необлучённых клеток в культуральной среде от облучённых. Этот подход предполагает полную пространственную изоляцию клеток-мишеней и клеток-свидетелей друг от друга на протяжении всего эксперимента. Позднее для изучения РИЭС были разработаны и другие методы: облучение клеточной суспензии или клеточного монослоя излучением с высокой ЛПЭ в низких дозах, когда повреждались лишь единичные клетки (их количество определяли расчётным путём), включение в клетки радиокативных изотопов, испускающих заряженные частицы с коротким пробегом (который, как и дозу облучения, также определяли расчётным путём, при этом существовала вероятность выхода отдельных ионизирующих частиц за пределы клетки). Эти методики не позволяли гарантировать точную регистрацию облучённых и необлучённых клеток. Опосредованные эффекты ИР исследовали также, пересаживая облучённые клетки костного мозга необлучённым реципиентам (и наоборот). Эта методика требует обязательного наличия чёткого ицтогенетического маркера в клетках одного из доноров. В настоящее время распространённым методом изучения РИЭС является облучение отдельных клеток микропучками заряженных частиц с помощью дорогостоящих установок. Этот метод требует соответствующего технического оснащения и применим только для монослойных культур клеток, но не для суспензий, (см. п. 1.2.3) В настоящей работе был использован новый методический подход, заключающийся в совместном культивировании лимфоцитов женского и мужского донора. Благодаря кариотипическому различию мужских (ХУ) и женских (XX) клеток метод позволяет регистрировать ХА раздельно в облучённых и необлучённых лимфоцитах (рис.4), т.е. хромосомный пол служит удобным и достоверным маркером прямого или непрямого радиационного эффекта, поскольку полностью гарантируется разобщённость облучаемых и интактных клеток во время облучения.

Основные достоинства предлагаемого метода:

1. Возможность работать на нормальных человеческих клетках;

2. Возможность регистрировать повреждения раздельно в облучённых и необлучённых лимфоцитах человека в смешанной культуре благодаря кариотипическим отличиям полов;

3. Возможность оценивать РИЭС не только по стркутурным (ХА), но и по функциональным критериям (адаптивный ответ);

4. Возможность изучать количественные закономерности РИЭС (меняя дозу облучения, соотношение и время контакта облучённых и необлучённых лимфоцитов); полученном из их совместной культуры. В клетке женского донора присутствует дицентрическая хромосома с ацентрическим парным фрагментом, мужская не содержит аномалий.

НИР Г 9 , сПс+сК

ШШШШ сПс мёк и?

ПВ

ЯШ

Нпшм вшшиг И

ШВМШЖ

НЁВ

5. Возможность исследовать РИЭС при облучении лимфоцитов не только in vitro, но и in vivo (космонавты, онкопациенты после лучевой терапии, ликвидаторы радиационных аварий).

6. Техническая простота и экономичность метода;

7. Возможность использовать в качестве морфологического критерия не только нестабильные ХА, но и другие критерии: транслокации (в сочетании с FISH с зондом, специфичным к прицентромерному району Y-хромосомы, и коктейлями WCP-зондов для любых хромосом), микроядра (в сочетании с

FISH с СЕР-зондом для Y-хромосомы).

Следует также отметить достоинства лимфоцитов человека как модели исследований. Практически все клеточные линии, используемые в исследованиях in vitro, получены из малигнизированных клеток, что значительно затрудняет адекватную экстраполяцию получаемых на них результатов на нормальне клетки. Получаемые на культурах человеческих лимфоцитов результаты позволяют избегать неточностей, связанных с экстраполяцией на человека данных, получаемых на модельных животных. Фактически, это едва ли не единственная доступная модель для исследования процессов, происходящих в нормальных человеческих клетках.

Поскольку для изучения РИЭС по критерию ХА при малой дозе облучения (0.05 Гр) потребовалось бы анализировать очень большое количество метафазных лимфоцитов, в качестве показателя проявления РИЭС в данном случае был использован критерий, характеризующий функциональное состояние клетки - способность к адаптивному ответу. В большинстве известных работ РИЭС регистрировался по различным морфологическим изменениям в необлучённых клетках, соседствующих с облучёнными, и лишь в ряде исследований он был выявлен также по некоторым функциональным критериям (см. п.2.2.4). Совокупность полученных в настоящей работе данных свидетельствует о принципиальной возможности передачи адаптированными низкодозовым облучением клетками некоего сигнала, который переводит соседстующие с ними в совместной культуре необлучённые лимфоциты в состояние большей устойчивочти к последующему воздействию радиации в повреждающей дозе (ОАО).

Исследования были проведены на лимфоцитах 6 разнополых доноров и выявили межиндивидуальную вариабельность в выраженности не только ПАО, но и ещё большую - ОАО, то есть в проялении «эффекта свидетеля». Это можно объяснить сочетанием индивидуальных внутренних факторов, влияющих на способность к развитию РИАО, с факторами, влияющими на способность к РИЭС. Поскольку РИЭС имеет комплексную природу и включает в себя различные пути сигнализации и ответа клеток-свидетелей, его выраженность, видимо, будет зависеть от функционирования и вклада в его реализацию различных механизмов, неодинаковых у разных доноров. Реакция на адаптирующее облучение также существенно различается между индивидуумами, что приводит к ещё более значительному варьированию

Как ПАО, так и ОАО в настоящм исследовании были выявлены при обеих временных схемах адаптирующего и пореждающего воздействий: G0-Gi и Gi-Gj. Для схемы Gi-Gj эффекты наблюдались на более высоком уровне ХА, чем для G0-G]. Это совпадает с данными литературы о большей радиоустойчивости G0 и ранней предсинтетической стадии по сравнению с поздней Gi (Севанькаев А.В, 1987). По всей вероятности, к 29 часу культура лимфоцитов становится асинхронной и в ней присутствуют клетки не только Gb но и S и G2 фаз, которые более радиочувствительны, чем Gj (Dewey W.C. et al, 1966; Кукушкина JI.M, Михалевич JI.C, 1977). Об этом свидетельствует и увеличение доли аберраций хроматидного типа в общем пуле ХА при временной схеме GrGi по сравнению с G0-G] как для исходной РУ, так и для ПАО и ОАО (табл. 2-9). При этом выраженность ПАО при обеих схемах облучения существенно не различалась. В то же время ОАО имел тенденцию к большей выраженности при временной схеме облучений GrGi по сравнению с Go-Gi- В литературе имеются данные, указывающие на необходимость для индукции РИЭС пролиферативной активности клеток (Belyakov O.V. et al, 2003). Возможно, это связано с активацией при стимуляции клеток к делению каких-либо важных для межклеточной сигнализации и реализации РИЭС процессов. Поэтому, адаптирующее облучение нестимулированных лимфоцитов вполне могло оказаться менее эффективным для индукции ОАО, чем адаптация активно пролиферирующих клеток на 24 часу культивирования (поздняя стадия От), когда лимфоциты находятся в процессе подготовки к митозу. Следует дополнительно отметить, что при временной схеме адаптирующего и разрешающего воздействий О0-в! ОАО был имел тенденцию в среднем к меньшей выраженности, чем ПАО, а при ОрО] - наоборот, к большей (табл. 10).

В настоящей работе РИЭС был выявлен также по морфологическому критерию - частоте ХА - при облучении в дозе 1 Гр. Таким образом, РИЭС может наблюдаться не только при малых, но и при относительно высоких дозах облучения. Одновременно показан и защитный эффект необлучённых клеток на облученные. Поскольку клетки вводились в совместную культуру после облучения, это антимутагенное влияние осуществляется, вероятно, через процессы репарации в облучённых клетках. Обнаруженный эффект может представлять существенный интерес с точки зрения возможности его использования в профилактике лучевых поражений и осложнений после радиотерапии у онкологических пациентов. Данные результаты носят презварительный характер и требуют подтверждения на других донорах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Колесникова, Ирина Станиславовна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аклеев A.B., Алещенко А. В.,Готлиб В. Я. и др. Адаптивный ответ у потомков первого поколения, родители которых подверглись хроническому облучению // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47. - №5. - С.550-

557.

2. Александров С.Н., Воробцова И.Е., Китаев Э.М. // Вопросы экспериментальной и клинической рентгенорадиологии: Методические рекомендации по итогам научной сессии ЦНИРРИ МЗ СССР. Под ред. Тихонова К.Б. Л.: ЦНИРРИ МЗ СССР. 1974. С.94-99.

3. Александров С.Н., Галковская К.Ф. О половых различиях в радиочувствительности // Радиобиология. - 1962. - Т.2. - №3. - С.401-405.

4. Безлепкин В.Г. и Газиев А.И. Индуцированная нестабильность генома половых клеток животных по мини- и микросателлитным последовательностям // Радиац. биология. Радиоэкология. 2001. - Т.41. - №5. -С.475-488.

5. Бондарчук И.А. Анализ роли репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза в радиационно-индуцированном адаптивном ответе клеток млекопитающих// Радиац. биология. Радиоэкология. - 2003. Т.43. -№1. - С.19-28.

6. Вейко H.H., Ермаков A.B., Еголина H.A., Ляпунова H.A., Спитковский Д.М. Активация транскрипции тотальной и рибосомальной РНК при воздействии адаптирующих доз ионизирующей радиации, индуцирующих

изменение координат локусов хромосом в ядрах О0-лимфоцитов человека // Радиац. биология. Радиоэкология. 2004. - Т.44. - №5. - С.501-508.

7. Вейко H.H., Калашникова Е.А., Кокаровцева С.Н. и др. Стимулирующее действие фрагментов транскрибируемой области рибосомного повтора на лимфоциты периферической крови человека // Бюл. Эксперим. Биол. Мед. -2006. - №10. - С.409-413.

8. Вейко H.H., Спитковский Д.М. Накопление одиночных разрывов не приводит к парному разрыву ДНК - особенность транскрибируемого фрагмента рибосомного оперона человека, позволяющая его детектировать в биологических жидкостях при гибели различных клеток организма // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2000. - Т.40. - № 4. - С.396-404.

9. Воробцова И.Е. Генетические и соматические эффекты ионизирующей радиации у человека и животных (сравнительный аспект) // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2002. - Т.42. - №6. - С.639-643.

10. Воробцова И.Е. Мутабельность клеток печени потомства облучённых самцов крыс// Радиобиология. - 1987. - Т.27. - №3. - С.377-381.

11. Воробцова И.Е. Особенности потомков облучённых биологических объектов. // Медицинская радиология. - 1974. - №11. - С.76-83.

12. Воробцова И.Е., Воробьева М.В. Радиочувствительность хромосом детей, родители которых подвергались противоопухолевой рентгено-химиотерапии. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1992. - №12. -С.655-657.

13. Воробцова И.Е., Воробьёва М.В., Корытова Л.И., Шуст В.Ф. Исследование цитогенетической реакции лимфоцитов на облучение in vitro у детей, рождённых пациентами после противоопухолевой терапии и химиотерапии // Цитология. - 1995. - Т.31. - №5-6. - С.449-457.

14. Габелов A.A., Хачкурузова Э.С. Применение метода аутотрансплантации костного мозга для профилактики и лечения лучевой лейкопении, возникающей при терапевтическом облучении больных // Эффект экранирования части костного мозга при фракционированном облучении организма. Под ред. Г.С. Стрелина. JI: Медицина. 1978. С.73-80.

15. Галковская К.Ф., Жданова Н.В. Влияние экранирования части костного мозга на при длительном фракционированном облучении на регенерацию костной ткани у мышей // Эффект экранирования части костного мозга при фракционированном облучении организма. Под ред. Г.С. Стрелина. JI: Медицина. 1978. С. 83-91.

16. Д.Б. Литтл. Немишенные эффекты ионизирующих излучений // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47. - №3. - С.262-272.

17. Докучаева Н.Ф., Хаитов Н.Ф., Ефимов A.B. и др. // Опыт использования аутотрансплантации костного мозга из необлучённой части при лучевом лечении онкологических больных // Эффект экранирования части костного мозга при фракционированном облучении организма. Под ред. Г.С. Стрелина. Л: Медицина. 1978. С.80-82.

18. Ермаков A.B., Костюк C.B., Егодина H.A. и др. Сигнализация между лимфоцитами человека после индукции эффекта свидетеля воздействием ионизирующей радиации в адаптирующих дозах // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47. - №6. - С.650-657.

19. Ермаков A.B., Костюк C.B., Егодина H.A. и др. Фрагменты внеклеточной ДНК, обнаруживаемые в среде культивирования после воздействия ионизирующей радиации в адаптирующих дозах, являются фактором сигнализации между лимфоцитами и клетками-свидетелями // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47. - №2. - С. 133-140.

20. Ефимов A.B. Морфологические особенности тонкой и толстой кишок крыс в условиях неравномерного облучения организма с экранированием конечности // Эффект экранирования части костного мозга при фракционированном облучении организма. Под ред. Г.С. Стрелина. JI: Медицина. 1978. С.91-94.

21. Засухина Г.Д., Семячкина А.Н., Македонов Г.П., Цховребова JI.B. Механизм защиты клеток человека при радиоадаптивном ответе и антимутагенной активности интерферона имеет общие пути // Генетика. -2000. - Т.36. - №3. - С.393-398.

22. Захаров А. Ф., Бенюш В. А., Кулешов Н. П. и др. Хромосомы человека. Атлас. // М.: Медицина, 1982. 264 с.

23. Кащенко Л.А., Бокальска-Нешева М.В., Чигерицкая Г.Г. Реакция щитовидной железы на длительное фракционированное облучение при

24. Кащенко Л.А, Чигерицкая Г.Г. Влияние экранирования части костного мозга при длительном фракционированном облучении на постлучевое восстановление сперматогенеза у мышей // Эффект экранирования части костного мозга при фракционированном облучении организма. Под ред. Г.С. Стрелина. Л: Медицина. 1978. С.111-127.

25. Керкис Ю.Я, Свердлов А.Г, Яснова Л.Н, Урженко A.B. О возможности дистанционного мутагенного действия ионизирующей радиации у млекопитающих. // Радиобиология. - 1964. - Т.4. - Вып.6. - С.847-853.

26. Котеров А.Н. Малые дозы радиации: факты и мифы. Книга первая: Основные понятия и нестабильность генома // М. Типография ФМБЦ им. А.И. Бурназяна. 2010. 284 с.

27. Котеров А.Н, Никольский A.B. Адаптация к облучению in vivo // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1999. - Т.39. - №6. - С.648-662.

28. Котеров А.Н, Сидорович Г.И. Разнонаправленное изменение антиоксидантной активности в плазме (сыворотке) крови млекопитающих после воздействия радиации в большой и малой дозе // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2009. - Т.49. - №6. - С.671-680.

29. Красавин Е.А, Фадеева Т.А, Шмакова Н.Л. и др. Дозовая зависимость цитогенетических повреждений и адаптивный ответ клеток млекопитающих

30. Кузин A.M. В сб. «Радиотоксины». Атомиздат. 1966. Стр.5.

31. Кукушкина Л.М., Михалевич Л.С. Влияние стадий клеточного цикла на вызод аберраций хромосом, индуцированных радиацией в культуре лимфоцитов человека // Информационный бюллетень научного совета по радиобиологии АН СССР. - 1977. - № 20. - С.104-105.

32. Литтл Д.Б. Немишенные эффекты ионизирующих излучений: выводы применительно к низкодозовым воздействиям // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47. - №3. - С.262-272.

33. Осипов А.Н. Лизунова Е. Ю., Воробьева Н. Ю,, Пелевина И. И. Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах крови человека, облучённых в адаптирующей дозе // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2009. - Т.49. - №1. - С.42-45.

34. Пелевина И. И., Алещенко А. А., Антощина М. М. и др. Индивидуальная вариабельность в проявлении адаптивного ответа клеток человека на воздействие ионизирующей радиации. Подходы к её определению // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47. - №6. - С.658-666.

35. Пелевина И.И., Афанасьев Г.Г., Готлиб В .Я. и др. Экспозиция клеток в культуре ткани и животных (мышей) в 10-километровой зоне аварии на ЧАЭС. Влияние на чувствительность к последующему облучению. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1993. - Т.ЗЗ. - №1(4). - С.508-520.

36. Пелевина И.И., Алещенко А. В., Афанасьев Г. Г. и др. Феномен повышения радиочувствительности после облучения лимфоцитов в малых адаптирующих дозах // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2000. - Т.40. - №5. . С.544-548.

37. Пелевина И.И., Алещенко A.B., Готлиб В.Я. и др. Реакция лимфоцитов крови индивидуумов с соматическими заболеваниями на воздействие радиации в малых дозах // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2005. - Т.45. -№6. - С.412-415.

38. Пелевина И.И., Антощина М.М., Бондаренко В.А. и др. Индивидуальные цитогенетические и молекулярно-биологические особенности лимфоцитов крови лётчиков и космонавтов // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2007. -Т.47. - №2. - С.141-150.

39. Пелевина И.И., Афанасьев Г.Г., Алещенко A.B. и др. Радиоиндуцированный адаптивный ответ у детей и влияние на него внешних факторов // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1999. - Т.39. - №1. - С. 106112.

40. Пелевина И. И., Алещенко А. В., Антощина М. М. и др. Уровень спонтанных и индуцированных облучением цитогенетических повреждений в лимфоцитах крови детей в зависимости от возраста и условий жизни // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2001. - Т. 41. - № 5. - С.573-579.

42. Рябуха А.К., Резвая С.П. К вопросу о механизме лечебного действия пересадок кроветворных тканей при лучевых поражениях // ДАН СССР. -1970. - Т. 191. - №1. - С.244-246.

43. Рябченко H.H., Антошина М.М., Насонова В.А., Фесенко Э.В. Цитогенетический анализ адаптивного ответа у лимфоцитов доноров, проживающих на территориях с различным уровнем радиоактивного загрязнения // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1995. - Т.35. - №5. - С.670-675.

44. Севанькаев A.B. Радиочувствительность хромосом человека в митотическом цикле. // Под ред. A.B. Матвеевой. М: Энергоатомиздат, 1987. 160 с.

45. Серебряный A.M., Алещенко А. В., Антощина М. М. и др. Изменение радиочувствительности лимфоцитов крови, человека в разных митотических циклах после облучения в малых дозах // Радиац. биология. Радиоэкология. -2008. - Т.48. - №6. - С.713-720.

46. Серебряный A.M., Алещенко A.B., Готлиб В.Я. и др. О новом механизме формирования адаптивного ответа // Радиац. биология. Радиоэкология. -2004. - Т.44. - №6. - С.653-656.

- №1. - С.81-85.

48. Серебряный A.M., Антощина М.М., Алещенко А.В, и др. О механизме адаптивного ответа. Оценка способности лимфоцитов крови человека к радиационному адаптивному ответу с помощью разных критериев. // Цитология. - 2008. - Т.50. - №5. - С.462-466.

49. Спитковский Д.М., Вейко H.H., Ермаков A.B. и др. Структурные и функциональные преобразования, индуцированные Х-радиацией в диапазона адаптирующих доз, в нормальных и дефектных по репарации двойных разрывов ДНК Go-лимфоцитах феловека // Радиац. биология. Радиоэкология.

- 2003. - Т.43. - №2. - С.136-143.

50. Спитковский Д.М., Кузьмина И. В., Вейко Н. Н. и др. О возможной связи мутационного процесса, индуцированного малыми дозами ионизирующей радиации, и позиционной динамикой хромосом в ядрах клеток эукариот // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2000. - Т.40. - №5. - С.554-566.

51. Тырсина Е.Г., Алипов Е.Д., Иваненко Т.В. Структурные перестройки хроматина в ходе адаптивного ответа в двух генетически родственных линиях фибробластов джунгарского хомячка с различной радиочувствительностью // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2006. - Т.46. -№6. - С.697-705.

52. Хандогина Е.К, Мутовин Г.П, Акифьев А.П. и др. Отсутствие радиационно-индуцированного адаптивного ответа в лимфоцитах пациентов с синдромом Дауна // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1991. - Т.112. - №9. - С.290-292.

53. Черникова С.Б, Готлиб В.Я, Пелевина И.И. Влияние малых доз ионизирующей радиации на чувствительность к последующему облучению. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1993. - Т.ЗЗ. - №1(4). - С.537-541.

54. Шеметун О.В, Пилинская М.А. Моделирование радиационно-индуцированного «эффекта свидетеля» в культуре лимфоцитов периферической крови человека // Тезисы докладов III Международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций» и семинара «Перспективные проблемы космической радиобиологии применительно к длительным орбитальным и межпланетным пилотируемым полётам», Дубна, 4-7 октяюря 2005г. с. 136-137.

55. Шеметун О.В, Талан О.О, Пшнська М.А. Дослщження рад1ацшно шдукованного «ефекту свщка» з використанням модел1 з л1мфощгив кров1 людини при опромшенш in vitro // Журнал АМН Украши. - 2007. - Т.13. -№3. - С.592-599.

56. Шеметун О.В, Талан О.О, Пшнська М.А. Модель для дослщження рад1ацшно шдукованного «ефекту свщка» з використанням лiмфoцитiв периферичноТ KpoBi людини // Журнал АМН Украши. - 2006. - Т. 12. - №3. -С.556-565.

57. Яснова Л.Н., Керкис Ю.Я. Действие экстрактов тканей облучённых животных на хромосомы лейкоцитов периферической крови человека. // «Радиобиология» Инф. бюлл. - 1966.

58. Aaron R.K., Boyan B.D., Ciombor D.M. et al. Stimulation of growth factor synthesis by electric and electromagnetic fields // Clin. Ortop. Relat. Res. - 2004. -

V.419. - P.30-37.

59.Acheva A., Georgieva R., Rupova I. et al. Bystander responses in low dose irradiated cells treated with plasma from gamma irradiated blood // Journal of Physics: conference series. - 2008. - V.101. - Pap.01205.

60. Ahmed K.M. Fan M.,Nantajit D„ Cao N.,Li J.J. Cyclin D1 in radiation induced adaptive response // Oncogene. - 2008. - V.27. No.53. - P.6738-6748.

61. Alexandrov S.N. Late Radiation Pathology of Mammals. // S. Eckardt, A. Graff, E. Magdon, Th. Mafthes, St. Tanneberger and H. Wrba (Eds.). Academic

Verlag. Berlin. Germany. 1982. 156 p.

62. Algire, G.H., Weaver, J.M., and Prehn, R.T. Growth of cells in vivo in diffusion chambers. I. Survival of homografts in immunized mice // J. Nat. Cancer

Inst..- 1954. -N.15.-P.493.

63. Azzam E.I., de Todeo S.M., Gooding Т., Little J.B. Intercellular communication is involved in the bystander regulation of gene expression in human cells exposed to very low fluences of alpha particles. // Rad. Res.. - 1998. -

V.150. - P.497-504.

64. Azzam E.I., de Toledo S., Little J.B. Direct evidence for the participation of gap junction-mediated intercellular communication in the transmission of damage signals from alpha -particle irradiated to nonirradiated cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - V.98. - N.2. - P.473-478.

65. Azzam E.I., De Toledo S.M., Spitz D.R, Little J.B. Oxidative metabolism modulates signal transduction and micronucleus formation in bystander cells from a-particle-irradiated normal human fibroblast cultures // Cancer Research. - 2002. -V.62. - P.5436-5442.

66. Banerjee G., Gupta N., Kaporr A., Raman G. UV induced bystander signalling leading to apoptosis // Cancer Letters. - 2005. - V.223. - P.275-284.

67. Barber R., Plumb M.A., Boulton E. et al. Elevated mutation rates in the germ line of first- and second-generation offspring of irradiated male mice // Proc Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - V.99. - No.10. - P.6877-6882.

68. Baskar R. Emerging role of radiation induced bystander effects: cell communications and carcinogenesis // Genome Integrity. 2010. V.l. Publ. 13.

69. Baskar R., Balajee A.S., Geard C.R., Hande M.P. Isoform-specific activation of protein kinase C in irradiated human fibroblaasts and their byystander cells // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2008. - V.40. - P. 125-134.

70. Beer J.Z. Heritable lesions affecting proliferation of irradiated mammalian cells. // Adv. Radiat. Biol. - 1979. - V.8. - P.363-417.

71. Belyakov O.V., Folkard M., Mothersill C., Prise K.M. and Michael B.D. A proliferation dependent bystander effect in primary porcine and human urothelial

72. Belyakov O.V., Folkard M., Mothersill C., Prise K.M., Michael B.D. Bystander-induced differentiation: a major response to targeted irradiation of a urothelial explant model // Mutat. Res.. - 2006. - V.597. - V.l-2. - P.43-49.

73. Bishayee A., Hill H.Z., Stein D., Rao D.V., Howell R.W. Free radical-initiated and gap junction-mediated bystander effect due to nonuniform distribution of incorporated radioactivity in a three-dimensional tissue culture model // Rad. Res.. - 2001. - V.155. - No.2. - P.335-344.

74. Blankenbecker R. Low dose pretreatment for radiation therapy // Dose-Response. - 2010. - V.8. - P.534-542.

75. Boyd M., Ross M.C., Dorrens J. et al. Radiation induced biologic bystander effect elicited in vitro by targeted radiopharmaceuticals labeled with a-, (3- and Auger electron-emitting radioniclides // Journal of Nuclear Medicine. - 2006. -V.47. - P.1007-1015.

76. Bravard A., Luccioni C., Moustacci E. and Riguard O. Contribution of antioxidant enzymes to the adaptive response to ionizing irradiation in human lymphoblasts // Int. J. Rad. Biol.. - 1999. - V.75. - P.639-645.

77. Brenner J.D., Little J.D., Sachs R.S. The bystander effect in radiation oncogenesis: II. A quantitive model // Rad. Res.. - 2001. - V.l 15. - No.3. - P. 402408.

79. Bychkovskaya I.B., Ochinskaya G.K. Stable heritable increase in death rate (experiments on Amoebae proteus, treated with high temperature and radiation) // Genetika. - 1977. - V.13. - P.1289-1293.

80. Cai L., Liu S.-Z. Induction of cytogenetic adaptive response of somatic and germ cells in vivo and in vitro by low-dose X-irradiation // Int. J. Radiat. Biol. -1990. - V.58. - No.l. - P.187-194.

81. Chen S., Zhao Y., Han G. et al. Mitochondria-dependent signaling pathways are involved in the process of radiation-induced bystander effects // British Journal of Cancer. - 2008. - V.98. - P.1839-1844.

82.Cheng K.C., Loeb L.A. Genomic instability and tumor progression: mechanistic considerations // Adv. Cancer Res. - 1993. - V.50. - P.121-156.

83.Clutton S.M., Townsend K.M.S., Walker C. et al. Radiation-induced genomic instability and persistant oxidative stress in primary bone marrow cultures // Carcinogenesis. - 1996. - V.17. - No.8. - P.1633-1639.

84.Coates,P.J. Rundle J.K., Lorimore S.A., Wright E.G. Indirect macrophage responses to ionizing radiation: implications for genotype-dependent bystander signaling // Cancer Research. - 2008. - V.68. - No.2. - P.450-456.

85. Cox R. Molecular mechanisms of radiation oncogenesis // Int. J. Rad. Biol.. -1994. - V.65.-P.57-64.

86. Cramers P, Atanasova P, Vrolijk H. et al. Pre-exposure to low doses: Modulation of X-ray-induced DNA damage and repair // Rad. Res.. - 2005. -V.164. - P.383-390.

87. Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment // Technical Reports Series № 405. Vienna: IAEA. 2001. 57 p.

88. Dent P, Yacoub A, Contessa J. et al. Stress and radiation-induced activation of multiple intracellular signalling pathways // Rad. Res.. - 2003. - V.159. - P.283-300.

89. Dewey W.C, Humphrey R.M, Sedita B.A. Cell cycle kinetics and radiation-induced chromosomal aberrations studied with C14 and H3 labels // Biophys. J. 1966. - V.6. - P.247-260.

90. Dickey J.S, Zemp F.J, Altamirano A. et al. H2AX phosphorylation in response to DNA double-strand break formation during bystander signalling: effect of microRNA knockdown // Radiation Protection Dosimetry. - 2011. - V. 141. -No.2-4. - P.264-269.

91. Doll R, Evans H.J, Darby S.C. Paternal exposure not to blame // Nature. -1994. - V.367. - No.6465. - P.678-680.

92. Draper G.J, Little M.P, Sorahan T. et al. Cancer in the offspring of radiation workers: a record linkage study // British Medical Journal. - 1997. - V.315. -P.1181-1188.

93. Fan M, Ahmed K.M., Coleman M.C, Spitz D.R, Lee J.J. Nuclear factor-kB and manganese superoxide dismutase mediate adaptive radioresistance in low-dose

irradiated mouse skin epithelial cells // Cancer Research. - 2007. - V.67. - No.7. -P.3220-3228.

94. Folkard M., Vojnovic B., Hollis K.J. et al. A charged-particle microbeam: II. A single-particle micro-collimation and detection system // Int. J. Rad. Biol.. - 1997. -V.72. - P.387-395.

95. Folkard M., Vojnovic B„ Prise K. et al. A charged-particle microbeam: I. Development of an experimental system for targeting cells individually with counted particles // Int. J. Rad. Biol.. - 1997. - V.72. - P.375-385.

96. Gadhia P.K. Possible age-dependent adaptive response to a low dose of X-rays in human lymphocytes // Mutagenesis. - 1998. - V.13. - No.2. - P.151-152.

97.Gardner M.J., Snee M.P., Hall A.J. et al. Results of a case control study of leukaemia and lymphoma among young people near Sellafield nuclear plant in West Columbia // Journal of Medical Genetics. - 1990. - V.300. - P.423-429.

98. Genuardi M., Zollino M„ Serra A. et al. Long-term cytogenetic effects of antineoplastic treatment in relation to secondary leukemia. // Cancer Genet Cytogenet. - 1988. - V.33. - No.2. - P.201-211.

99. Ghandhi O.P. Electromagnetic fields: human safety issues // Ann. Rev. Biomed. Eng. - 2002. -V.4. - P.211-234.

100. Ghandhi S.A., Ming L., Ivanov V.N., Hei T.K., Amundson S.A. Regulation of early signaling and gene expression in the alpha-particle and bystander response of IMR-90 human fibroblasts // BMC Med. Genomics. - 2010. - V.3. - Pub.31.

102. Haimovitz-Friedman A. Radiation-induced signal transduction and stress ressponse // Rad. Res.. - 1998. - V.150. - P.102-108.

103. Han W., Wu L., Hu B. et al. The early and initiation processes of radiation induced bystander effects involved in the induction of DNA double strand breaks in non-irradiated cultures // The British journal of radiology. - 2007. - V.80. - P.S7-S12.

104. Harms-Ringdal M. Some aspects of radiation induced transmissible genome instability. // Mutat. Res.. - 1998. - V.404. P.27-33.

105. Hatch T., Derijk A.A.H.A., Black P.D. et al. Maternal effects of the scid mutation on radiation-induced transgenerational instability in mice // Oncogene. -2007. - V.26. - P.2720-2724.

106. Huang L., Kim P.M., Nickoloff J.A., Morgan W.F. Targeted and nontargened effects of low-dose ionizing radiation on delayed genomic instability in human cells // Cancer Research. - 2007. - V.67. - No.3. - P. 1099-1104.

107. Huo L., Nagasawa H, Little J.B. HPRT mutants induced in bystander cells by very low fluences of alpha particles result primarily from point mutations // Rad. Res.. - 2001. - V.156. - P.521-525.

109. Ikushima T. Chromosomal responses to ionizing radiation reminiscent of an adaptive response in cultured Chinese hamster cells // Mutat. Res.. - 1987. - V.180. No.2. P.215-221.

110. Ilnitskyy Y., Koturbash I., Kovalchuk O. Radiarion-induced bystander effects in vivo are epigrnrticaly regulated in a tissue-specific manner // Environmental and Molecular Mutagenesis. - 2009. - V.50. - P. 105-113.

111. Iyer R., Lehnert B.E. Factors underlying the cell-growth related bystander responses to a-particles // Cancer Research. - 2000. - V.60. - P. 1290-1298.

112. Iyer, R. and Lehnert, B. E. Alpha-particle-induced increases in the radioresistance of normal human bystander cells. // Rad. Res.. - 2002. - V.157. -P.3-7.

113. Iyer, R. and Lehnert, B. E. Low dose, low-LET ionizing radiation-induced radioadaptation and associated early responses in unirradiated cells. // Mutat. Res.. -2002. - V.503. -P.l-9.

114. Jin S.Z., Pan X.N., Wu N. et al. Whole-body low dose iradiation promotes the efficacy of conventional radiotherapy for cancer and possible mechanisms // Dose-Response. - 2007. - V.5. - P.349-358.

116. Kellerer A.M. 5th Symposium on Microdosimetry, EUR 5452 // Eds J. Booz, H. G. Ebert, B. G. R. Smith. Luxembourg : Commission of the European Communities. 1976. P.409-442.

117. Khandogina E.K., Mutovin G.R., Zvereva S.V. et al. Adaptive response in irradiated human lymphocytes: radiobiological and genetical aspects // Mutat. Res.. - 1991. - V.252. - No.2. - P.181-186.

118. Koturbash I., Boyko A., Rodrigues-Juares R. et al. Role of epigenetic effectors in maintainance of the long-term persistent bystander effect in spleen in vivo // Carcinogenesis. - 2007. - V.28. - No.8. - P.1837-1838.

119. Koturbash I., Baker M., Lorie J. et al. Epigenetic dysregulation underlies radiation-induced transgenerational genome instability in vivo. // Int J Radiat Oncol Biol Phys. - 2006. - V.66 - No.2. - P.327-30.

120. Koturbash I., Kutanzi K., Hendrickson K. et al. Radiation-induced bystander effects in vivo are sex specific // Mutat. Res.. - 2008. - V.642. - P.28-36.

121. Koturbash I., Rugo R.E., Hendricks C.A. et al. Irradiation induces DNA damage and modulates epigenetic effectors in distant bystander tissue in vivo // Oncogene. - 2006. - Y.25. - No.31. - P.4267-4275.

123. Kovalchuk O., Zemp F.J., Filkowski J.N. et al. MicroRNAome changes in bystander three-dimensional human tissue models suggest priming of apoptotic pathways // Carcinigenesis. - 2010. - V.31. - No. 10. - P. 1882-1888.

124. Krutovskih V.A., Herceg Z. Oncogenic microRNAs (OncomiRs) as anew class of cancer biomarkers // Bioessays. - 2010. - V.32. - P.894-904.

125. Kulka U., Huber R., Muller P. et al. Combined FISH painting and harlequin staining for cell cycle-controlled chromosome analysis in human lymphocytes // Int. J. Rad. Biol.. - 1995. - Vol.68. - No.l. - P.25-27.

126. Kurihara Y., Rienkjkarn M., Etoh H. Cytogenetic adaptive response of cultured fish cells to low doses of X-rays // J. Radiat. Res. (Tokyo). - 1992. - V.33.

- No.4. - P.267-274.

127. Leach J.K., Black S.M., Scmidt-Ullrich R.K., Mikkelsen R.B. Activation of consstitutive nitric-oxide synthase activity is an early signalling event induced by ionizing radiation // The Journal of Biological Chemistry. - 2002. - V.277. - No. 18.

- P.15400-15406.

128. Lehnert B.E., Goodwin E.H. Eatracellular factor(s) following exposure to a-particles can cause sister chromatid exchanges in normal human cells // Cancer Researsh. - 1997. - V.57. - P.2164-2171.

130. Little J.B, Nagasawa H, Li G.G. Involvement of the nonhomologous end joining DNA repair pathway in the bystander effect for chromosomal aberrations // Rad. Res.. - 2003. - V.159. - N.2. - P.262-267.

131. Little J.B, Nagasawa H, Pfenning T, Vetrovs H. Radiation-induced genomic instability: delayed mutagenic and cytogenetic effects of X rays and alpha particles // Radiat. Res. - 1997. - V.148. - P.299-307.

132. Littlefield L.G, Hollowell J.G, Pool W.H. Chromosomal aberrations induced by plasma from irradiated patients: an indirect effect of X-radiation. // Radiology. - 1969. - V.93. - P.879-886.

133. Lloyd D.C, Edwards A.A, Leonard A. et al. Chromosomal aberrations in human lymphocytes induced in vitro by very low doses of X-rays // Int. J. Rad. Biol.. - 1992. - V.61. - P.335-343.

134. Lorimore S.A, Kadhim M.A, Pocock D.A. et al. Chromosomal instability in the descendants of unirradiated surviving cells after a-particle irradiation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. P.5730-5733.

135. Lorimore S.A, Wright E.G. Radiation-induced genomic instability and bystander effects: related inflammatory-type responses to radiation-induced stress and injury? A review. // Int. J. Radiat. Biol. - 2003. - V.79. - No.l. - P. 15-25.

137. Lyng F.M., Seymour C.B., Mothersill C. Production of a signal by irradiated cells which leads to a response in unirradiated cells characteristic of initiation of apoptosis // British Journal of Cancer. - 2000. - V.83. - No.9. - P.1223-1230.

138. Maguire P., Mothersill C., Seymour C., Lyng F.M. Medium from irradiated cells induces dose-dependent mitochondrial changes and BCL2 responses in unirradiated human keratinocytes // Rad. Res.. - 2005. - V.163. - No.4. - P.384-390.

139. Matsumoto H., Hayashi S., Hatashitta M. et al. Induction of radioresistance by a nitric oxide-mediated bystander effect // Radiat Res. - 2001. - V.155. - No.3. -P.387-396.

140. Matsumoto H., Takahashi A., Onishi T. Nitric acid radicals choreograph a radioadaptive response // Cancer Research. - 2007. - V.61. - N.18. - P.8574-8579.

141. Mendonca M.S., Antonio R.J., Redpath L.J. Delayed heritable damage and epigenetics in radiation induced neoplastic transformation of human hybrid cells // Rad. Res.. - 1993. - V.134. - No.2. - P.209-216.

142. Mitchell P.S., Parkin R.K., Kroh E.M. et al. Circulating microRNAs as stable blod-based marker for cancer detection. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2008. - V.105. - P.10513-10518.

144. Moskalev A.A., Plyusnina E.N., Shaposhnikov M.V. Radiation hormesis and radioadaptive response in Drosophila melanogaster flies with different genetic backgrounds: the role of cellular stress-resistance mechanisms // Biogerontology. -2011. - V.12. - P.253-263.

145. Mosse I., Marozik P., Seymour C. and Mothersill C. The effect of melanin on the bystander effect in human keratinocytes // Mutat. Res.. - 2006. - V.597. -P.133-137.

146. Mothersill C., Bristow R.G., Harding S.M. et al. A role for p53 in the response of bystander cells to receipt of medium borne signals from irradiated cells // Int. J. Rad. Biol.. - 2011. - V.87. - No.l 1. - P.l 120-1125.

147. Mothersill C., Crean M., Lyons M. et al. Expression of delayed toxicity and lethal mutations in the progeny of human cells surviving exposure to radiation and other environmental mutagens // Int. J. Radiat. Biol. - 1998. - V.74. - No.6. -P.673-680.

148. Mothersill C., Lyng F., Seymour C. et al. Genetic factors influencing bystander signaling in murine bladder epithelium after low-dose irradiation // Radiation Reserch. - 2005. - V.163. - No.4. - P.391-399.

150. Mothersill C., O'Malley. K., Seymour C.B. Characterisation of a bystander effect induced in human tissue explant cultures by low let radiation // Radiat. Prot. Dosimetry. - 2002. - V.99. - P. 163-167.

151. Mothersill C., Rea D., Wright E.G. et al. Individual variation in the production of a "bystander signal" following irradiation of primary cultures of normal human urothelium // Carcinogenesis. - 2001. - V.22. - No.9. - P. 1465-1471.

152. Mothersill C., Seymour C. Cell-cell contact during Gamma-irradiation is not required to induce a bystander effect in normal human keratinocytes: evidence for release during irradiation of a signal controlling survival into the medium // Rad. Res.. - 1998. - V.149. - No.3. - P.256-262.

153. Mukai T. and Coekerham C.C. Spontaneous mutation rate at enzyme loci in Drosophila melanogaster. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1977. - V.74. - P.2514-2517.

154. Nagasawa H., Little J.D. Induction of sister chromatid exchanges by extremely low doses of alpha-particles // Cancer Research. - 1992. - V.52. - No.22. - P.6394-6396.

155. Narayanan P.K., Goodwin E.H., Lehnert B.E. a-Particles initiate biological production of superoxide anions and hydrogen peroxide in human cells // Cancer Research. - 1997. - V.57. - P.3963-3971.

156. Nemetova G., Kalina J., Racekova N. The adaptive response of peripheral blood lymphocytes to low doses of mutagenic agents in patients with ataxia teleangiectasia // Mutat. Res.. - 1995. - V.296. - P.575-577.

157. Nomura T. Parental exposure to X-rays and chemicals induced heritable

tumors and abnormalilies in mice //Nature. - 1982. - V.345. - P.671-672.

158. Ojima M., Hamano H„ Suzuki M. et al. Delayed induction of telomere instability in normal human fibroblast cells by ionizing radiation // J. Radiat. Res. -2004.-V.45.-No.l--P. 105-110.

159. Olivieri G., Bodycote J., Wolff S. Adaptive response of human lymphocytes to low concentrations of radioactive thymidine // Science. - 1984. - V.223. -No.4636. - P.594-597.

160. Osmak M., Horvat D. Chromosomal analysis of Chinese hamster V79 cells exposed to multiple gamma-ray fractions: induction of adaptive response to mitomycin C. // Mutat. Res.. - 1992. - V.282. - N.4. - P.259-263.

161. Pinto M., Azzam E.I., Howell R-W. Bystander responses in three-dimensional cultures containing radiolabeled and unlabelled human cells // Radiat. Prot. Dosimetry. - 2006. - V.122. - No.1-4. - P.252-255.

162. Pohl-Ruehling J., Fisher P., Haas O. et al. Effect of low-dose acute X-irradiation on the frequencies of chromosomal aberrations in human peripheral lymphocytes in vitro // Mutat. Res.. - 1983. - V.l 10. - P.71-82.

163. Prise K.M., Belyakov O.V., Folkard M., Michael B.D. // Int. J. Radiat. Biol.

- 1998. - V.74. -P.793-798.

165. Purschke M, Laubach H.J, Anderson R.R, Manstein D. Thermal injury causes DNA damage and lethality in unheated surrounding cells: active thermal bystander effect // J. Invest. Dermatol. - 2010. - V.130. - No.l. - P.86-92.

166. Randers-Pehrson G, Geard C.R, Johnson G, Elliston C.D, Brenner D.J. The Columbia University single-ion microbeam // Rad. Res.. - 2001. - V.156. -No.2. - P.210-214.

167. Rigaud O, Moustacchi E. Radioadaptation for gene mutation and the possible molecular mechanisms of the adaptive response // Mutat. Res.. - 1996. -V.358. -No.2. -P.127-134.

168. Ryabchenko N.I, Antoshchina M.M, Fesenko E.V. et al. Cytogenetic adaptive response in cultured human lymphocytes: dependence on the time of exposure to adapting and challenging doses of y-rays // Mutat. Res.. - 1998. -V.418. - P.7-19.

169. Sabatier L, Lebeau J, Dutrillaux B. Chromosomal instability and alterations of telomeric repeats in irradiated human fibroblast. // Int. J. Rad. Biol.. -1993. - V.66. - No.5. - P.611-613.

170. Salone B, Grillo R, Aillaud M, Bosi A, Olivieri G. Effects of low-dose (2 cGy) X-ray on cell-cycle kinetics and on induced mitotic delay in human lymphocyte //Mutat. Res.. - 1996. - V.351. - P. 193-197.

172. Samson L., Schwartz J.L. Evidence for an adaptive DNA repair pathway in CHO and human skin fibroblast cell lines // Nature. - 1980. - V.287. - No.5785. -P.861-863.

173. Sasaki M.S. On the reaction kinetics of the radioadaptive response in cultured mouse cells // Int. J. Rad. Biol.. - 1995. - V.68. - P.281-291.

174. Sawant S.G., Randers-Pehrson G., Geard C.R. The bystander effect in radiation oncogenesis: I. Transformation in C3H10T1/2 cells in vitro can be initiated in unirradiated neighbours of irradiated cells // Rad. Res.. - 2001. - V.l 15. - No.3. - P.397-401.

175. Schwarz S.B., Schaffer P.M., Kulka U. et al. The effect of radio-adaptive doses on HT29 and GM637 cells // Radiat. Oncol. - 2008. - V.3. - No.l. - P. 12.

176. Seo H., Chung H.Y., Lee Y.J. et al. p27Cip/kip is involved in Hsp25 or inducible Hsp70 mediated adaptive response by low-dose irradiation // J. Radiat. Res. - 2006. - V.47. - P.83-90.

177. Seymour C.B., Mothersill C. and Alper T. High yields of lethal mutation in somatic mammalian cells that survive ionizing radiation. // Int. J. Radiat. Biol. -V.50. - 1986. -P.161-179.

178. Shadley J.., Wiencke J.K. Induction of the adaptive response by X-rays is dependent on radiation sensivity // Int. J. Radiat. Biol. - 1989. - V.56. - N.l. -P.107-118.

179. Shadley J.D., Afzal V., Wolff S. Characterization of the adaptive response to ionizing radiation induced by low doses of X-rays to human lymphocytes // Rad. Res.. - 1987. - V.lll. - P.511-517.

180. Shadley J.D., Dai G.O. Cytogenetic and survival adaptive response in Gl phase human lymphocytes // Mutat. Res.. 1992. V.265. No.2. P.273-281.

181. Shao C., Stewart V., Folkard M. Nitric oxide-mediated signalling in the bystander response of individually targeted glioma cells // Cancer Research. -2003.- V.63.-P.8437-8442.

182. Shofield P.N. Impact of genomic imprinting on genomic instability and radiation-induced mutation // Int. J. Rad. Biol.. 1998. V.74. No.6. P.705-710.

183. Sigg M., Crompton N.E., Burkart W. Enhanced neoplastic transformation in an inhomogeneous radiation field: an effect of the presence of heavily damaged cells //Radiat. Res. - 1997. - V. 148. - No.6 - P.543-547.

184. Sinclair W.K. X-ray induced heritable damage (small colony formation) in cultured mammalian cells // Rad. Res.. - 1964. - V.21. - P.584-611.

185. Somodi Z., Zyuzikov N.A., Kashino G. et al. Radiation-induced genomic instability in repair deficient mutants of Chinese hamster cells // Int. J. Radiat. Biol. - 2005. - V.81. - № 12. - P.929-936.

186. Suzuki K., Ojima M., Kodama S., Watanabe M. Delayed activation of DNA damage checkpoint and radiation-induced genomic instability // Mutat. Res. -2006. - V.597. - No.1-2. - P.73-77.

187. Suzuki K., Kodama S., and Watanabe M. Extremely low-dose ionizing radiation causes activation of mitogen-activated protein kinase pathay and enhances proliferation of normal human diploid cells // Cancer Research. - 2001. -V.61. -P.5396-5401.

188. Swanson J. and Kheifets L. Biophysical mechanisms: a component in the weight of evidense for health effects of power frequency electric and magnetic fields // Rad. Res.. - 2006. - V.165. - P.470-478.

189. Szumiel I., Ziemba-Zak B., Rosiek O., Sablinski J., Beer J.Z. Harmful effects of an irradiated cell culture medium // Int. J. Radiat. Biol. - 1971. - V.20. No.2. - P.153-161.

190. Takahashi A. Pre-irradiation at a low dose-rate blunted p53 response // J. Radiat. Res. - 2002. - V.43. - No.l. - P.l-9.

191. UNSCEAR, 2000 Report to the General Assembly, with Scientific Annex. United G. Biological effects at low radiation doses //New York. 2000. P.73-175.

192. Venkat S., Chaubey R.C., Chauhan P.S. Radio-adaptive response in human lymphocytes in vitro // Indian. J. Exp. Biol. - 1996. - V.34. - No.9. - P.909-912.

193. Vorobtsova I.E. and Kitaev E.M. Uretane-induced lung adenomas in the first-generation progeny of irradiated male mice // Carcinogenesis. - 1988. - V.9. -No.ll. - P. 1931-1934.

194. Vorobtsova I.E. Increased cancer risk as genetic effect of ionizing radiation // Prenatal and multigeneration carcinogenesis. - 1989. - No.2. - P.389-401.

195. Vorobtsova I.E., Aliyakparova L.M., Anisimov V.N. Promotion of skin tumors by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in two generations of descendants of male mice exposed to X-ray irradiation // Mutat. Res. - 1993. - V.287. - P.207-216.

196. Vorobtsova I.E., Vorobyova M.V., Bogomasova A.N. Chromosomal instability in the progeny of irradiated parents. // Proceedings of 27th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology. Montpellier. Numero special de Radioprotection. - 1996. - V.32. - P.73.

197. Wang Z.-Q., Saigusa S., Sasaki M.S. Adaptive response to chromosome damage in cultured human lymphocytes primed with low doses of X-rays // Mutat. Res.. - 1991. - V.246. - P.179-186.

198. Watson G.E., Lorimore S.A., Macdonald D.A., Wright E.G. Chromosomal instability in unirradiated cells induced in vivo by a bystander effect of ionizing radiation // Cancer Research. - 2000. - V.60. - P.5608-5611.

199. Wojcik A., Sauer C., Zölzer F., Bauch T., Müller W.U. Analysis of DNA damage recovery processes in the adaptive response to ionizing radiation in human lymphocytes. // Mutagenesis. - 1996. - V.l 1 - No.3 - P.291-297.

200. Xue L.Y., Butler N.J., Makrigiorgos G.M., Adelstein S.J., Kassis A.I. Bystander effect produced by radiolabeled tumor cells in vivo // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 2002. - V.99. - No.21. - P.13765-13770.

202. Yamaoca K., Edamatsu R., Mori A. Increased SOD activities and decreased lipid peroxide levels induced by low dose X irradiation in rat organs. // Free Radical Biol. Med. - 1991. - V.l 1. - No.3. - P.299-306.

203. Zhou H., Ivanov V., Gillespie J. et al. Mechanism of radiation-induced bystander effect: role of the cyclooxygenase-2 signalling pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - V.102. - P.14641-14646.

204. Zhou H., Randers-Pehrson G., Waldren C.A. et al. Induction of a bystander mutagenic effect of alphaparticles in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol.97. No.5. P.2099-2104.

205. Zhou P.K. and Riguard O. Down-regulation of the human CDC 16 gene after exposure to ionizing radiation: a posible role in the radioadaptive response // Rad. Res.. - 2001. - V.155.-P.43-49.

Автор диссертации выражает глубочайшую благодарность и признательность своему научному руководителю, д.б.н, проф. Воробцовой И.Е, за всё, чему автор научилась за это время и научится в будущем, и, разумеется, за посильную помощь и консультации при написании работы. Автор также выражает благодарность всем прошлым и нынешним сотрудникам лаборатории радиационной генетики ФГБУ РНЦРХТ Минздравсоцразвития за помощь в освоении методик и моральную

поддержку.

Хотелось бы также поблагодарить рецензентов работы д.б.н, проф. Шутко А.Н. и д.м.н. Волчкова В.А. и оппонентов д.б.н, проф. Пелевину И.И. и к.м.н, доц. Спивак И.М. за их труд и внимание.

Большую признательность автор выражает диссертационному совету Д 501.001.65 Биологического факультета МГУ за предоставленную возможность защиты диссертационной работы.

И в заключение автор выражает огромную благодарность всем родным, друзьям и знакомым за всяческую поддержку в период работы над

диссертацией.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.