Исследование молекулярного механизма действия малых доз радиации на функциональную активность генов стволовых клеток человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Кальянов Андрей Александрович

• Кальянов Андрей Александрович
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Кальянов Андрей Александрович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Степень разработанности темы исследования

Цель и задачи исследования

Методология и методы диссертационного исследования

Научные положения, выносимые на защиту

Научная новизна результатов исследования

Теоретическая и практическая значимость работы

Степень достоверности результатов

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Апробация работы

Личный вклад автора в провидение исследования

Публикации

Структура и объем диссертации

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Модели, описывающие влияние ионизирующего излучения на организм человека

1.1.1. Линейная беспороговая модель прогнозирования биологического ущерба

1.1.2. Методологические проблемы, объясняющие ошибочность применения в исследованиях линейной беспороговой модели при действии малых доз ионизирующего излучения

1.1.3. Различия биологических эффектов, вызываемых ионизирующим излучением в диапазоне малых и высоких доз. Наличие пороговых значений при действии малых доз радиации

1.2. Аспекты воздействия малых доз ионизирующего излучения на разные категории населения

1.2.1. Воздействие малых доз ионизирующего излучения в профессиональных группах

1.2.2. Воздействие фоновой радиации окружающей среды на население

1.2.3. Воздействие малых доз ионизирующего излучения при проведении радиационных медицинских процедур

1.3. Молекулярные исследования воздействия малых доз радиации на клетки

1.3.2. Механизмы репарации повреждений ДНК при действии малых доз радиации на клетки

1.3.3. Механизмы активации апоптоза при действии малых доз радиации на клетки

1.3.4. Механизмы активации аутофагии при действии малых доз радиации на клетки

1.3.5. Остановка клеточного цикла при действии малых доз радиации на клетки

1.3.6. Изменение молекулярных и генетических маркеров в клетках при действии малых доз радиации

1.3.7. Эпигенетические модификации при действии малых доз радиации на клетки

1.4. Эффект свидетеля (Bystander effect) при действии малых доз радиации

1.5. Воздействие малых доз радиации на стволовые клетки

1.6. Сигнальные пути, потенциально задействованные в ответе клеток на действие малых доз радиации

1.6.1. №12-сигнальный путь

1.6.2. NF-kB -сигнальный путь

1.6.3. Вс1-2-сигнальный путь

1.6.4. Сигнальные пути BRCA1 и BRCA2

1.6.5. NOX4 - представитель семейства NADPH-оксидаз

1.7. Вывод на основании обзора литературы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объект исследования

2.2. Воздействие радиации и окисленных фрагментов вкДНК на культуру МСК

2.3. Постановка стандартного МТТ-теста

2.4. Метод проточной цитофлуорометрии

2.5. Метод флуоресцентной микроскопии

2.6. Метод электрофореза одиночных ядер (метод "комет")

2.7. Иммуногистохимия

2.8. Выделение ДНК из среды культивирования клеток после облучения

2.9. Определение уровня 8-окси-дезоксигуанозина дот иммуноблоттингом

2.10. Приготовление окисленных образцов ДНК

2.11. Создание генетической конструкции на основе плазмиды с маркерным геном («green» белок, GFP), содержащей легкоокисляющиеся повторы (G)n

2.12. Выделение РНК и определение ее концентрации

2.13. Обратная транскрипция

2.14. Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени

2.15. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование повреждающего влияния доз радиации 3, 10 и 50 сГр (уровня апоптоза, окислительных модификаций и разрывов ДНК клеток) на мезенхимные стволовые клетки (МСК) жировой ткани человека и активации генов репарации, про- и антиапоптотических генов после облучения этими дозами

3.1.1. Культивирование и описание МСК из 6-ти образцов жировой ткани

3.1.2. Оценка повреждающего действия малых доз радиации (0,1 Гр и 0,5 Гр) на МСК с помощью стандартного МТТ-теста

3.1.3. Малые дозы радиации индуцируют в МСК кратковременный синтез АФК

3.1.4. Малые дозы радиации активируют экспрессию NOX4 и на уровне гена, и на уровне белка

3.1.5. Малые дозы радиации индуцируют повышение уровня окислительных модификаций ДНК в ядрах клеток

3.1.6. Малые дозы радиации активируют антиоксидантные системы в МСК Активация генов репарации, про- и антиапоптотических генов в МСК после облучения дозами ИИ 3, 10 и 50 сГр

3.1.7. Малые дозы радиации (3 сГр и 0,1 Гр) вызывают образование быстрорепарируемых разрывов ДНК стволовых клеток

3.1.8. Малые дозы радиации (3 сГр, 10 сГр) активируют системы репарации ДНК в МСК

3.1.9. Снижение пролиферативной активности и блокировка клеточного цикла МСК, вызванные малыми дозами радиации

3.1.10. Активация антиапоптотического ответа в МСК, вследствие воздействия малых доз радиации (3 сГр и 10 сГр)

3.1.11. Сравнение показателей апоптоза МСК с уровнем окислительных повреждений и двунитевых разрывов ядер клеток

3.2. Анализ характеристик внеклеточной ДНК (концентрации и уровня 8-oxodG), появляющихся в среде культивирования стволовых клеток при действии малых доз радиации (10 сГр) и ее проникновение в клетки

3.2.1. В среде культивирования клеток при действии малых доз радиации возрастает концентрация окисленной вкДНК

3.2.2. Малые дозы радиации способствуют проникновению окисленной вкДНК в цитоплазму МСК

3.3. Сравнительный анализ воздействия малых доз радиации (10 сГр) и окисленной внеклеточной ДНК (выделенной из среды культивирования облученных клеток и модельных фрагментов) на МСК

3.3.1. Исследование действия малых доз радиации (10 сГр) и окисленной внеклеточной ДНК на уровень активных форм кислорода в МСК

3.3.2. При действии фрагментов вкДНКокс увеличивается синтез АФК, который связан с увеличением экспрессии гена N0X4

3.3.3. Исследование рольи митохондрий в реализации ответа МСК на действие малых доз радиации (10 сГр) и фрагментов окисленной вкДНК.

3.3.4. Облучение малыми дозами радиации (10 сГр) и окисленные фрагменты вкДНК вызывают окисление и образование разрывов ДНК ядер в МСК

3.3.5. Окисленная вкДНК, возникающая вследствие стресса, вызванного ИИ, является молекулой, сигнализирующей об образовании быстрорепарируемых разрывов ДНК

3.3.6. Облучение малыми дозами радиации (10 сГр) и окисленные фрагменты вкДНК вызывают репарацию ДНК

3.3.7. Малые дозы радиации и фрагменты окисленной вкДНК вызывают кратковременную задержку клеточного цикла и снижение пролиферативной активности в культуре МСК

3.3.8. Малые дозы радиации и фрагменты окисленной вкДНК активируют антиокислительный ответ в МСК, опосредованный транскрипционным фактором N^2

3.3.9. Фрагменты окисленной вкДНК так же, как и малые дозы радиации, вызывают антиапоптический ответ в МСК

3.3.10. Исследование влияния 10 сГр радиации и окисленной вкДНК на р53-сигнальный путь

3.3.11. Исследование экспрессии генов сигнальных путей, активирующихся в МСК при повреждении ДНК, после действия малых доз радиации (10 сГр) и фрагментов окисленной ДНК

3.3.12. Окисленные фрагменты вкДНК, а также малые дозы радиации вызывают адаптивный ответ в МСК

3.4. Выявление рецепторов, через которые окисленные фрагменты вкДНК реализуют действие малых доз радиации

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ

Список публикаций в других изданиях

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений и условных обозначений

АД - аутосомно-доминантный

АФК - активные формы кислорода

вкДНК - Внеклеточная ДНК

вкДНКокси - окисленная внеклеточная ДНК

Гр - Грей — единица измерения поглощённой дозы ионизирующего излучения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДНКокси - окисленная ДНК ДР - двунитевые разрывы ДР или DSBs - двухцепочечные разрывы

Зв - Зиверт — единица измерения эквивалентной и эффективной поглощенной

дозы ионизирующего излучения

ИИ - ионизирующее излучение

КТ - компьютерная томография

ЛПЭ - линейная передача энергии

МДР - малые дозы радиации

ОР - одноцепочечные разрывы ДНК

ЭС - эффект свидетеля

БЯ - эксцизионная репарация

НЯЯ - гомологичная рекомбинация

ММЯ - мисматч-репарации

КБЯ - эксцизионную репарацию нуклеотидов

КБШ - негомологичное соединение концов

ЯЯ - радиационный риск

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование молекулярного механизма действия малых доз радиации на функциональную активность генов стволовых клеток человека»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования

Исследование биологических эффектов малых доз радиации по-прежнему находится в центре внимания научных исследований из-за неизбежности воздействия на клетки человека ионизирующего излучения. Организм человека подвергается фоновым источникам излучения (радиоизотопы земной коры, космические лучи и т.д.) и источникам, образующимся в результате техногенной деятельности человека (атомная энергетика, радиоактивные отходы, аварии, облучение в клинической и диагностической практике и т.д.). Высокие дозы радиации в повседневной жизни человека встречаются крайне редко, в гораздо большей степени человек подвергается воздействию малых доз радиации. По-прежнему существует множество разногласий о механизме действия радиации в малых дозах на человеческий организм и различные его ткани (Tharmalingam S. и др., 2019).

Стволовые клетки являются недифференцированными клетками, обладающими потенциалом для неограниченного деления и дифференцировки во многие типы клеток. Поскольку стволовые клетки являются резервным пулом для пополнения разных типов клеток организма, исследование молекулярно-генетических механизмов действия малых доз радиации и активирующихся под их воздействием сигнальных путей в МСК человека являются актуальной научной проблемой (Squillaro T. И др., 2018). В то время как умеренные и высокие дозы ионизирующего излучения индуцируют апоптоз в стволовых клетках, низкие дозы не вызывают усиления апоптоза по сравнению с необлученным контролем, а в ряде случаев -снижают уровень гибели клеток и вызывают адаптивный ответ в клетках. Кроме того, отмечается нелинейный характер воздействия разных доз ионизирующего излучения из диапазона малых доз на стволовые клетки.

При действии малых доз радиации обнаружен радиационно-индуцированный эффект свидетеля (bystander effect), который постулирует,

что облучённые клетки способны передавать сигналы соседним необлучённым клеткам либо через непосредственные межклеточные контакты, либо через растворимые факторы - молекулы сигнализации (Бе^ееуа У.Л. и др., 2017). При этом как облучённые, так и необлученные клетки демонстрируют схожие ответы на воздействие малых доз радиации. Адаптивный ответ в клетках при действии малых доз радиации также может развиваться через эффект свидетеля. Поиск медиаторов, являющихся сигнальными молекулами в радиационно-индуцированном эффекте свидетеля, также является актуальной задачей.

Таким образом, исследование эффектов действия малых доз радиации на стволовые клетки актуально как для понимания фундаментальных процессов функционирования стволовых клеток при действии радиации в малых дозах, так и для практического здравоохранения.

Степень разработанности темы исследования

Эффекты малых доз облучения (> 50 сГр) на процессы в стволовых клетках изучены недостаточно. В ряде работ показано влияние малых доз радиации на изменение профиля экспрессии генов контролирующих апоптоз, прогрессию клеточного цикла, пролиферацию и дифференцировку. Кроме того, при действии малых доз радиации наблюдался непропорциональный ответ на разные дозы облучения: облучение в дозе 2 сГр и 10 сГр не оказывало эффекта на пролиферацию МСК по сравнению с необлученным контролем, облучение дозами 5 сГр и 7,5 сГр значительно стимулировало пролиферацию стволовых клеток, однако, объяснения этому эффекту не найдено. Во многих исследованиях показано, что кривая доза-эффект для малых доз радиации носит нелинейный характер, и ответ клеток на малые дозы не может быть экстраполирован с ответа клеток на средние и высокие дозы радиации. Неясно, возникает ли радиационно- индуцированный адаптивный ответ в нормальных стволовых клетках при действии малых доз радиации. Таким образом, радиация оказывает воздействие на стволовые клетки, различающееся в

зависимости от дозы и источника облучения. Ионизирующее излучение может влиять на стволовые клетки путем индукции повреждений ДНК, остановки клеточного цикла и гибели клеток. Сигнальные пути, обеспечивающие выживаемость стволовых клеток при облучении, также исследованы недостаточно.

В работе освещаются вопросы, недостаточно исследованные в мировом научном сообществе: о важной роли фрагментов внеклеточной ДНК в инициации ответа стволовых клеток на облучение в малых дозах; о молекулярно-генетическом механизме развития ответа стволовых клеток на окислительный стресс, индуцированный облучением; о неоднозначности ответа МСК на разные дозы радиации, приводящей к гибели клеток или развитию адаптивного ответа в МСК.

Цель и задачи исследования

Цель исследования: Изучение молекулярных механизмов действия малых доз радиации на сигнальные пути в стволовых клетках человека, активирующиеся при ее воздействии.

Задачи исследования:

1. Исследовать повреждающее воздействие (уровень апоптоза, окислительных модификаций и разрывов ДНК клеток) и активацию генов репарации, про- и антиапоптотических генов в мезенхимных стволовых клетках (МСК) жировой ткани человека после облучения дозами радиации 3, 10 и 50 сГр.

2. Проанализировать характеристики внеклеточной ДНК (концентрацию и уровень 8-oxodG), появляющейся в среде культивирования стволовых клеток при действии малых доз радиации (10 сГр) и исследовать роль окислительной модификации вкДНК при ее проникновении в МСК.

3. Выявить генотоксичное действие (воздействие на уровень активных форм кислорода, окислительных модификаций и разрывов ДНК) малых доз радиации (10 сГр) и окисленной внеклеточной ДНК в МСК.

4. Исследовать транскрипционную активность генов ключевых сигнальных путей в МСК при действии малых доз радиации (10 сГр) и окисленной внеклеточной ДНК (про- и антиапоптотических, про- и антиокислительных, сигнальных путей репарации ДНК, ответа на повреждение ДНК).

5. Выявить развитие адаптивного ответа в МСК при действии малых доз радиации (10 сГр) и окисленной внеклеточной ДНК.

6. Описать молекулярный механизм, через который реализуют действие малых доз радиации в МСК фрагменты окисленной внеклеточной ДНК, появляющиеся в межклеточном пространстве в результате радиационно-индуцированного повреждения клеток.

Методология и методы диссертационного исследования

Методологической основой диссертационного исследования стали работы отечественных и зарубежных исследователей в области радиобиологии и генетики, которые изучали влияние малых доз радиации на клетки человека и животных in vitro и in vivo. В работе исследовалось влияние малых доз радиации на клеточные культуры мезенхимных стволовых клеток человека.

Обоснована концепция развития адаптивного ответа в стволовых клетках через внеклеточный медиатор передачи сигнала между клетками -фрагменты окисленной внеклеточной ДНК. Этот подход к решению проблем воздействия малых доз радиации на стволовые клетки является новым, он позволит внести существенный вклад в понимание механизма действия малых доз радиации на клетки человека, обладающие высоким пролиферативным потенциалом.

Выдвинута гипотеза, основанная на потенциально возможном действии малых доз радиации не непосредственно на стволовые клетки, а отдаленно -через циркулирующую в организме внеклеточную ДНК, которая образуется при гибели части клеток организма, подвергшихся прямому воздействию

ионизирующего облучения в малых дозах. В результате выполнения работы с использованием современной методологической и приборной базы, гипотеза о новой роли ДНК подтвердилась: ДНК, как сигнальная молекула, участвует в передаче информации от погибших в результате радиационного воздействия клеток организма живым, что приводит к активации адаптивных реакций в живых клетках и к их устойчивости к последующему воздействию облучения. В работе исследованы сигнальные пути, активирующиеся в стволовых клетках при действии малых доз ионизирующего излучения, выявлены изменения профиля экспрессии генов ключевых сигнальных путей стволовых клеток при действии радиации в малых дозах, выявлена роль окислительного стресса в развитии ответа стволовых клеток на повреждающее действие малых доз радиации.

В диссертационной работе использованы современные методы исследования: метод ПЦР в реальном времени, метод проточной цитофлуориметрии, метод флуоресцентной микроскопии.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Доза радиации 10 сГр вызывает сильный и быстрый антиапоптотический и адаптивный ответ в МСК, доза радиации 3 сГр вызывает незначительный адаптивный эффект, а доза радиации 50 сГр оказывает сильное повреждающее действие на МСК, не вызывая при этом ярко выраженной адаптивной реакции.

2. При обучении малыми дозами в результате гибели части клеток в среде культивирования МСК in vitro накапливаются окисленные фрагменты внеклеточной ДНК (вкДНКокси), которые проникают в цитоплазму МСК.

3. Вследствие воздействия радиации наблюдается идентичное раннее генотоксичное действие малых доз радиации (10 сГр) и окисленной внеклеточной ДНК в МСК.

4. Радиация в дозе 10 сГр, и окисленные фрагменты вкДНК (50 нг/мл) активируют в МСК транскрипционную активность генов сигнальных путей,

регулирующих репарацию ДНК, антиокислительный ответ, клеточный цикл, ответ на повреждение ДНК, что приводит к снижению уровня апоптоза в популяции клеток.

5. Окисленная вкДНК является медиатором развития радиоадаптивного ответа при действии малых доз радиации на МСК: инкубирование МСК в присутствии окисленной вкДНК и/или предварительное облучение дозой 10 сГр за 3 часа до облучения дозой 2 Гр приводит к снижению уровня гибели клеток в популяции.

6. Окисленные в результате действия радиации фрагменты вкДНК играют роль сигнальных молекул стресс-сигнализации в радиационно-индуцированном эффекте свидетеля - запускают вкДНК-сигнальный путь.

Научная новизна результатов исследования Полученные результаты во многом являются новыми и получены впервые. Эффекты малых доз облучения (< 50 сГр) на процессы в стволовых клетках остаются недостаточно изученными. В диссертационной работе эффекты действия малых доз радиации на мезенхимные стволовые клетки (МСК) подробно исследованы. В результате получены новые данные о действии малых доз радиации на МСК человека.

Впервые продемонстрировано, что радиация в дозе 3 сГр, 10 сГр и 50 сГр вызывает сильный окислительный стресс в МСК, активируя синтез АФК в МСК в течение первых 30 минут после радиационного воздействия, что коррелирует с повышенной экспрессией гена N0X4. Наиболее ярко этот эффект проявляется при действии радиации в дозе 10 сГр. Это, с одной стороны, приводит к окислительной модификации и повреждению ДНК ядер клеток, а с другой стороны, к активации антиокислительных систем в клетках.

Во многих исследованиях, показано, что кривая доза-эффект для малых доз радиации носит нелинейный характер, и ответ клеток на малые дозы не может быть экстраполирован с ответа клеток на средние и высокие дозы радиации. Обнаружен нелинейный характер изменения числа разрывов ДНК

ядер МСК в разном диапазоне малых доз радиации, наиболее выраженный эффект наблюдался для дозы радиации 10 сГр. Радиация в дозе 3 и 10 сГр через 15-30 минут приводит к образованию множественных разрывов ДНК, число которых снижается через 2 часа после действия радиации. Снижение уровня разрывов ДНК обусловлено активацией систем репарации ДНК. Образование быстрорепарируемых разрывов наиболее ярко проявляется при действии радиации в дозе 10 сГр. Радиация в дозе 50 сГр не активирует репарацию ДНК, что приводит к гибели части клеток с множественными повреждениями.

Впервые показано, что в результате действия малых доз радиации (10 сГр) часть клеток погибает, и в среде культивирования МСК в 2 раза возрастает концентрация вкДНК и уровень ее окислительных модификаций; окисленная вкДНК проникает в цитоплазму МСК; эффективность проникновения вкДНК возрастает с увеличением уровня 8-охоёО в ее составе.

Радиация в дозе 10 сГр, и окисленные фрагменты вкДНК (50 нг/мл) активируют в МСК транскрипционную активность генов сигнальных путей, регулирующих репарацию ДНК, антиокислительный ответ, клеточный цикл, ответ на повреждение ДНК, что приводит к снижению уровня апоптоза в популяции клеток. Окисленная вкДНК является медиатором развития радиоадаптивного ответа при действии малых доз радиации на МСК: инкубирование МСК в присутствии окисленной вкДНК и/или предварительное облучение дозой 10 сГр за 3 часа до облучения дозой 2 Гр приводит к снижению уровня гибели клеток в популяции. Кроме того, обнаружено, что в реализации действия вкДНК при облучении МСК малыми дозами радиации задействованы ДНК-сенсоры А1М2 и ТЬЯ9.

Впервые показано, что окисленные в результате действия радиации фрагменты вкДНК играют роль сигнальных молекул стресс-сигнализации в радиационно-индуцированном эффекте свидетеля - передают сигнал от облученных клеток к необлученным и запускают вкДНК-сигнальный путь, включающий следующую последовательность событий в МСК: действие

ионизирующего излучения на МСК^ первичный окислительный стресс ^ окисление геномной ДНК (гДНК) МСК^ апоптоз некоторого количества облученных клеток ^ освобождение окисленной вкДНК ^ синтез активных форм кислорода ^ активные формы кислорода вызывают окислительные модификации ДНК ядер клеток, образование быстрорепарируемых разрывов ДНК ядер, кратковременный арест клеточного цикла ^ активируется репарация ДНК, активируется антиокислительный ответ в МСК^ ингибируется апоптоз.

Для малых доз радиации показано развитие радиационно-индуцированного адаптивного ответа, который придает клеткам большую устойчивость к последующему облучению. Впервые показали, что окисленная вкДНК является медиатором развития радиоадаптивного ответа при действии малых доз радиации на МСК: инкубирование МСК в присутствии окисленной вкДНК и/или предварительное облучение дозой 10 сГр за 3 часа до облучения дозой 2 Гр приводит к снижению уровня гибели клеток в популяции.

Теоретическая и практическая значимость работы

Диссертационное исследование направлено на решение фундаментальной научной проблемы - исследование молекулярных механизмов действия малых доз ионизирующего излучения на мезенхимные стволовые клетки человека (МСК). Выявлен ряд закономерностей механизма передачи сигнала в МСК при облучении в малых дозах. Подтверждена гипотеза о роли окисленных фрагментов внеклеточной ДНК в реализации ответа МСК на воздействие малых доз радиации, что является новым взглядом на проблему межклеточной сигнализации при действии малых доз радиации. Новая научная информация о регуляции активности генома МСК малыми дозами радиации, полученная в результате данного исследования, вносит вклад в научные представления о механизмах воздействия малых и средних доз радиации на стволовые клетки.

Решение фундаментальной задачи - определение молекулярных основ действия радиации в малых дозах - может в дальнейшем привести к решению прикладных задач.

Поскольку МСК представляют собой пул резервных клеток для регенерации тканей, отдаленные последствия действия малых доз радиации могут иметь решающее значение для МСК, поскольку разрывы ДНК ядер клеток могут приводить к перестройкам ДНК.

Одной из самых важных практических задач является поиск молекулярных основ действия радиации в малых дозах и, как следствие, поиск эффективного радиопротектора для снижения негативных факторов, вызванных радиацией. На основании полученных результатов в дальнейшем возможна разработка эффективных радиопротекторов с использованием генетических конструкций, содержащих последовательности ДНК, которые вызывают адаптивный ответ в МСК.

Степень достоверности результатов Экспериментальные данные работы получены на большом экспериментальном материале. Для достижения высокого уровня достоверности работа проводилась с использованием современных методов статистической оценки полученных результатов и с высоким количеством повторов в экспериментах. Работа базируется на современной литературе и теоретически продолжает исследования в области радиобиологии и генетики. Все экспериментальные работы проводились в соответствии с современными литературными данными о молекулярно-биологических и генетических методах проведения исследований. Поставленные в работе цели полностью выполнены, и их результаты полностью отражены в выводах.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Диссертация соответствует формуле специальности 1.5.7. (03.02.07) -«Генетика (биологические науки)», охватывая проблемы реализация генетической информации (транскрипция, трансляция) на молекулярном и

клеточном уровне, механизмы регуляции экспрессии генов и области исследований, описанных в пунктах 4 (Процессы репарации); 5 (Методы генетического анализа у прокариот и эукариот); 7 (Реализация генетической информации (транскрипция, трансляция). Механизмы регуляции экспрессии генов. Роль геномных перестроек в реализации генного действия) и 11 (Генетические основы биотехнологии) паспорта научной специальности.

Апробация работы Материалы диссертационной работы представлены на конференциях: XVI Конференции по космической биологии и медицине с международным участием; XX международной научной конференции молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина»; XXIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова; конференции молодых ученых ФГБНУ «МГНЦ» (2017, 2018); 21-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века»; 10th CNAPS INTERNATIONAL SYMPOSIUM. Recent Advances in circulating DNA and RNA; XX Международной медико-биологическая конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье»; 22-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА»; XIV международном междисциплинарном конгрессе "Нейронаука для медицины и психологии"; I научно-практический конференции аспирантов и ординаторов «актуальные вопросы анестезиологии-реаниматологии и реабилитации»; 5 международной конференции «Постгеном-2018»; FEBS Open Bio Supplement for the 43rd FEBS Congress. Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета 24.1.168.01 (Д 001.016.01) при ФБГНУ «МГНЦ».

Личный вклад автора в провидение исследования Автор исследовательской работы принимал непосредственное участие в проведении работы на всех её этапах: изучение литературы, формулирование

целей и задач, работа над экспериментальной частью, обработка и интерпретация полученных результатов, формулирование выводов и подготовка к публикациям полученных результатов работы. Результаты работы представлены автором на 6 международных и 13 всероссийских конференциях.

Публикации

Материалы диссертационной работы представлены в 20 печатных работах, в том числе в 5 статьях (4 из них - в WoS и Scopus), опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа имеет следующую структуру: список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы, благодарности и приложение. Работа представлена на 200 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 52 рисунка. Библиографический указатель включает 292 наименования, из них 6 отечественных и 286 - зарубежных источников.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Модели, описывающие влияние ионизирующего излучения на

организм человека

С начала 20 века стало известно о негативном влиянии ИИ на живые организмы, это послужило основой для исследований ИИ, в том числе, влияния различных доз радиации на организм человека. На данный момент времени опубликованы многочисленные исследования, определяющие пороговые дозы излучения и предлагающие новые модели оценки негативного влияния ИИ, поскольку беспороговая модель частично потеряла свою актуальность и не учитывает многих факторов, в том числе, и адаптивного влияния при облучении малыми дозами радиации. Предлагаемые современные модели более актуальны, поскольку обучение человека малыми дозами радиации более вероятно, чем высокими дозами. Изучение потенциальных рисков, связанных с ИИ, помогает исследовать молекулярные механизмы повреждения клеток.

1.1.1. Линейная беспороговая модель прогнозирования биологического

ущерба

На сегодняшний день линейная беспороговая модель (LNT, linear no-threshold model) является официальной моделью для оценки биологического ущерба при повреждении клеток тканей и органов человека [203]. В основе данной модели лежит определение первичных стохастических одно- и двунитевых разрывов ДНК, вызванных воздействием ИИ. Стохастическими эффектами при действии радиации считают возникающие случайно генотоксические воздействия, вероятность их возникновения пропорциональна дозе ИИ. Долгосрочные стохастические эффекты зависят от суммарной полученной дозы радиации, их проявление связывают с вторичным повреждением клеток организма АФК после облучения [203].Согласно линейной беспороговой модели считается, что ИИ потенциально опасно для организма при любом уровне дозы, при этом суммарно несколько

повторяющихся облучений малыми дозами могут причинить такой же вред для клеток организма, как эквивалентное по значению единичное облучение в высокой дозе [203].

Согласно линейной беспороговой модели «доза-ответ» любое воздействие, отличное от нуля, увеличивает вероятность развития рака. Модель, которая играет важную роль в исследованиях по радиационной эпидемиологии, это модель, в которой радиационный риск (RR) является линейной функцией дозы. В своей простейшей форме RR(D) = 1 + 0D, где D -доза, RR(D) - относительный радиационный риск при дозе D, а ^-погрешность на единицу дозы. Эта линейная модель радиационных рисков служила основой для оценки риска развития рака тремя комитетами: комитетом по изучению биологических эффектов ионизирующей радиации при Национальной Академии наук США (Комитет BEIR); научным комитетом ООН по действию атомной радиации (НКДАР); Национальными институтами здравоохранения BEIR [192].

Однако, многочисленные исследования показывают несостоятельность линейной беспороговой модели в области воздействия малых доз радиации [100, 192]. Обнаружено, что воздействие низких доз слабоионизирующих излучений, таких как гамма- или рентгеновское излучение in vitro и in vivo, вызывает адаптивные изменения в ДНК, которые являются защитными [61, 62, 215].

1.1.2. Методологические проблемы, объясняющие ошибочность применения в исследованиях линейной беспороговой модели при действии малых доз ионизирующего излучения

Часто ошибочное применение модели в биологии связано с неподходящими для исследований математическими расчетами, и как следствие, ошибочными статистическими подходами [170]. Примером ошибочного подхода в радиобиологических исследованиях является неучтенные МДР. Данные, полученные таким методом, могут привести к

неправильным выводам в пользу линейной беспороговой модели. Правильно спроектированные эксперименты могли бы показать, что использование линейной модели не подходит в их конкретном случае. Второй пример заключается в неправильном выборе исследуемых групп. Например, включение людей, получивших низкую дозу облучения в группу с контрольными людьми, не получавшими облучения. Такой ошибочный подход потенциально может маскировать адаптивные ответы. Кроме того, многие исследования в этой области посвящены изучению групп населения, подвергавшихся воздействию относительно высоких доз радиации в течение относительно короткого периода времени. В этом случае оправдано применение линейной беспороговой модели, поскольку воздействие высоких доз радиации пропорционально дозе облучения. Для малых доз радиации часто затруднительно провести масштабные эксперименты, поскольку человек постоянно подвергается облучению малыми дозами из окружающей среды и при воздействии искусственных источников в профессиональной деятельности человека. Поскольку от полученной дозы зависят молекулярные и биологические механизмы ответа клеток организма на облучения, то целесообразно разделить дозы на диапазоны. Таким образом на данный момент времени дозы ИИ разделены на три диапазона: малые, средние и высокие дозы ионизирующего излучения [131]. В системе СИ для измерения поглощённой дозы используется такая единица измерения, как Грей (Гр). 1 Грей — это количество энергии радиоактивного излучения в 1 Дж, которая поглощена веществом массой в 1 кг, независимо от вида радиоактивного излучения и его энергии. 1 Грей (Гр) = 1Дж/кг = 100 рад. В исследованиях на клеточном уровне принято считать, что высокие дозы радиации относят к диапазону >5 Гр, средние дозы радиации - к диапазону 0,5-5 Гр, а малые доз радиации - к диапазону <0,5 Гр.

Еще одной методологической проблемой является использование экологической и географической модели в радиобиологических

исследованиях. Данный подход основан на усреднённых показателях дозы ИИ, без учета реальной дозы облучения, в областях со сходными экономическими и социальными условиями [150].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кальянов Андрей Александрович, 2021 год

Источник

Костный мозг Жировая ткань

Амниотическая жидкость и мембрана

Зубные ткани

Слизистая оболочка матки

Бутон лимба

Периферическая кровь

Плацента и плода

Слюнная железа

Кожа и крайняя плоть

Оболочка

амниотической

пуповины

Синовиальная

жидкость

Желе Уортона

Таблица 2.

Маркеры клеточной поверхности МСК Маркеры клеточной поверхности

отрицательный

CD105, CD14, CD34, CD45, HLA-DR

CD34,

CD14, CD34,

положительный

CD73, CD90 STRO-1

CD73, CD090, CD29, CD14, CD31 CD44, CD71, CD105, CD45 CD13, CD166, STRO-1 CD29, CD44, CD90, CD10, ,

CD105, CD, SH2, SH3, HLA-DR HLA-DR

CD29, CD44, CD90, CD14, CD34, CD45 CD105

CD73, CD90, CD146

CD13, CD29, CD105, CD106 CD44, CD90, HLA-ABC CD29, CD73, CD105

CD13, CD29, CD90, СТРО-1

CD44, CD73, CD90, CD34, CD45, HLA-DR CD105, CD166, SSEA-4 CD29, CD44, CD73, CD34, CD45 CD90, CD105

CD105, CD34, CD45

CD90, CD3, CD4, CD14, CD15, CD34, CD45, HLA-DR CD105, CD45, CD133

CD90, CD34, CD45

CD44, CD34, CD45

CD44, CD90, CD105, CD31, CD34,

CD147, STRO-1 CD73, CD90, CD105

CD106

CD14, CD34, CD79, HLA-DR

CD45, CD45,

Биологические эффекты воздействия низких доз ионизирующего излучения на стволовые клетки человека до конца не изучены, что порождает множество противоречий в опубликованной литературе. Показано с использованием анализа транскриптома, что даже такие низкие дозы, как 0,05 Гр, могут вызвать статистически значимые изменения в множестве генов стволовых клеток [228].

В течение последнего десятилетия, воздействие высоких доз (> 5 Гр) радиации на стволовые клетки нормальной ткани находилось под пристальным вниманием исследователей [175]. Показана индукция стресс-индуцированного преждевременного старения после облучения в пробирке мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга человека (дозой < 20 Гр). Кроме того, облучение приводит к снижению пролиферации и активации р53 (после облучения дозой 20 Гр) [175]. Выявлены радиационно-индуцированные повреждения ДНК ядер стволовых клеток после облучения, вызванного радиацией в дозе 10 Гр [147]. Частота появления мутантных клеток среди стволовых клеток при облучении 5 Гр в 100 раз выше, чем при облучении в той же дозе дифференцированных клеток, что приводит к предположению, что облучение является более мощным мутагеном для стволовых клеток, чем для более дифференцированных клеток [147].

При исследовании эффектов средних доз (0,5-5 Гр) на нормальные эмбриональные стволовые клетки человека наблюдалась индукция апоптоза (доза 2 и 4 Гр, 48 часов), временная остановка клеточного цикла в G2 / М фазе (но не в G1 фазе) (доза 2 Гр, 8-24 ч после облучения) [156]. При длительном культивировании ЭСК (7-10 суток) после облучения в дозе 2 и 4 Гр показано временное ингибирование пролиферации клеток [230]. Показано, что умеренные дозы облучения приводят к усилению контроля транскрипции различных генов с помощью миРНК (ЭСК человека, облучение 1Гр) [230]. При анализе транскриптома выявлены ранние и поздние ответы, соответственно, через 2 и 16 часов после облучения. Ранний ответ включает

активацию 30 генов проапоптотического ответа. В более поздней временной точке (16 ч после облучения), в общей сложности активируются 354 гена, связанные с выживаемостью клеток [230]. Кроме того, при облучении ЭСК человека дозой 2 и 4 Гр показана активация транскрипции генов р53-сигнализации, клеточной гибели, метаболизма аминокислот, морфологии клеток, молекулярного переноса, клеточного цикла, TGF-B- и Wnt-сигнального путей, при этом не обнаружено влияния средних доз радиации на процесс дифференцировки ЭСК [147].

Значительно менее исследованы эффекты малых доз облучения (<0,5 Гр) на процессы в стволовых клетках [230]. В то время как умеренные дозы (1 Гр) приводили к индукции апоптоза в ЭСК, низкие дозы 200-500 мГр не вызывали выявляемого изменения уровня апоптоза по сравнению с необлученным контролем [230]. Анализ экспрессии генов ЭСК клеточной линии Н9 с помощью микрочипов показал совместную кластеризацию выборки, облученной 400 мГр и необлученного контроля [230]. Однако в ряде работ показано влияние малых доз радиации на изменение профиля экспрессии генов, контролирующих апоптоз, прогрессию клеточного цикла, пролиферацию и дифференцировку [230].

Кроме того, при действии малых доз радиации наблюдался непропорциональный ответ на разные дозы облучения [19, 250]. : облучение в дозе 20 и 100 мГр не оказывало эффекта на пролиферацию МСК по сравнению с необлученным контролем, облучение дозами 50 и 75 мГр значительно стимулировало пролиферацию МСК [129]. Во многих исследованиях, показано, что кривая доза-эффект для малых доз радиации носит нелинейный характер, и ответ клеток на малые дозы не может быть экстраполирован с ответа клеток на средние и высокие дозы радиации [19, 129].

Несмотря на неоднозначность данных разных исследовательских групп, отмечавших неоднозначную и нелинейную зависимость ответа стволовых клеток на действие ИИ, активно исследуют применение МСК в качестве

замещающей терапии при радиационно-индуцированном повреждение слизистой оболочки кишечника [73, 121, 204], при радиационно-индуцированном повреждении печени [70], при радиационной задержке заживления ран [121], что также подтверждает необходимость всестороннего исследования ответа МСК на воздействие ИИ. Кроме того, необходимо учитывать, что продолжительное нахождение стволовых клеток в организме человека увеличивает вероятность накопления генотоксических повреждений, полученных от внешнего источника малых доз радиации или при репликации ДНК [233].

Изменения экспрессии генов являются ранним показателем клеточных реакций на МДР в стволовых клетках человека [10, 227, 228]. Для изучения эффектов МДР в экспериментальных моделях активно использовался геномный анализ ДНК-микрочипов [7, 9, 52, 69, 81, 108, 229]. Данные по изменению профиля экспрессии генов в стволовых клетках человека ограничены [89, 175, 210, 228], но уже и сейчас можно сделать вывод о том, что обнаружена высокая степень вариабельности ответов стволовых клеток человека на воздействие ИИ в малых дозах: ответ на МДР разный в зависимости от дозы облучения, времени воздействия, источника МСК [228] [97, 175].

Проведено масштабное исследование паттернов экспрессии генов мезенхимных стволовых клеток человека в зависимости от дозы и времени при воздействии на клетки 0,01, 0,05, 0,2 и 1 Гр гамма-излучения через 1, 4, 12 и 48 ч после облучения [97]. Изменения транскрипционой активности генов анализировали в зависимости от дозы и времени. В общей сложности 6016 генов показали изменённые паттерны экспрессии более чем в один момент времени или среди исследованных 10800 генов [97]. Гены, которые изменяли профиль экспрессии, вовлечены в сигнальную трансдукцию, регуляцию транскрипции, апоптоза, клеточной адгезии, клеточного цикла, репарации ДНК. антиокислительного ответа, реакции на стресс, протеолиз и метаболизм.

Увеличивалась экспрессия генов, связанных с "фундаментальными клеточными процессами", такими как репликация ДНК, митоз, сплайсинг РНК, репарация ДНК и инициация трансляции [97]. Комбинирование дозового ответа с временными профилями экспрессии генов выявило новые наборы координированно регулируемых генов при действии на МСК малых доз радиации. При этом экспрессия генов нелинейно зависела от времени действия ИИ и изменялась при действии 0,01, 0,05 и 0,2 Гр, но не изменялась в ответ на воздействие 1 Гр [97]. Более того, гены, экспрессия которых повышена при 0,01 Гр, снижали уровень транскрипции тех же генов как при 0,05 Гр, так и при 0,2 Гр, и наоборот [97]. Эти исследования также подтверждают нелинейный характер изменения экспрессии генов в зависимости от дозы и времени облучения МДР [97]. Однако нужны дополнительные исследования для определения связи между дозой ИИ и уровнем экспрессии генов в стволовых клетках человека.

1.6. Сигнальные пути, потенциально задействованные в ответе клеток

на действие малых доз радиации.

Описаны сигнальные пути, активирующиеся в МСК при действии окислительного стресса. К ним относятся, прежде всего, сигнальные каскады, приводящие к активации транскрипционных факторов NF-kB и NRF2. Поскольку МДР сопровождаются развитием окислительного стресса, ниже рассмотрели сигнальные пути, потенциально задействованные в ответе МСК на действие малых доз радиации

1.6.1. №С-сигнальный путь

Транскрипционный фактор N112 играет важную роль в защите клеток от окислительного стресса, контролируя скоординированную работу множества генов, участвующих в антиокислительном ответе. За антиокислительные процессы отвечает более пятисот генов, кодирующих антиапоптотические белки и ферменты, участвующие в детоксикации [164]. В норме N112 связан в цитоплазме ингибитором Кеар1, за счет чего находится в неактивном

состоянии, подвергаясь протеасомной деградации [6]. Различные экзогенные факторы, такие как радиация, токоферолы и фитохимические вещества, являются активаторами Nrf2 [101, 166].

Окислительные и/или электрофильные модификации Cys151 белка Keapl запускают фосфорилирование Ser40 белка Nrf2, что в свою очередь приводит к нарушению связывания Keapl c Nrf2, и накоплению последнего в цитоплазме клеток [273]. Затем Nrf2 транслоцируется в ядро, где происходит его димеризация с небольшими белками Maf, а уже образовавшийся гетеродимер связывается с последовательностями ARE (antioxidant response element) промоторных областей генов-мишеней, активируя их экспрессию [135].

Nrf2 имеет множество генов-мишеней, в число которых входят различные антиоксидантные ферменты (глутатионредуктаза, глутатион-S-трансфераза, у-глутамилцистеинсинтаза, гем-оксигеназа-1, Н-хинондегидрогеназа-1), метаболические ферменты и регуляторы (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа). Однако, на этом список генов-мишеней транскрипционного фактора Nrf2 не заканчивается: гены, участвующие в транспорте белка, регулировке клеточного цикла, а также про- и антиапоптотические гены, в той или иной степени зависят от транскрипционной активности Nrf2 [96].

Активация Nrf2 вызывает повышенную экспрессию генов, участвующих в метаболизме лекарств, тем самым повышая устойчивость к воздействию высоких доз радиации при лучевой терапии и противоопухолевым препаратам. Также Nrf2 влияет на пролиферацию клеток, влияя на пентозофосфатный путь и усиливая синтез пуринов, направляя глюкозу и глутамин к анаболическим путям [101]. Баланс активации и супрессии транскрипционного фактора Nrf2 позволяет клеткам справляться с окислительным стрессом, вызванным различными заболеваниями или действием внешних повреждающих факторов, в том числе, радиации [166,

176]. Дисрегуляция пути Nrf2- Keapl может приводить к апоптозу и онкогенезу за счёт накопления Nrf2 в ядрах клеток [166].

1.6.2. NF-kB -сигнальный путь Ядерный фактор-кВ (NF-kB) представляет собой семейство индуцибельных транскрипционных факторов, которые регулируют большое количество генов, участвующих в различных процессах иммунных и воспалительных реакциях. Это семейство состоит из пяти структурно связанных факторов транскрипции, включая NF-kB1 (также называемый p50), NF-kB2 (также называемый p52), RelA (также называемый p65), RelB и c-Rel, которые обеспечивают транскрипцию генов-мишеней посредством связывания со специфическим элементом ДНК, энхансером кВ, в виде различных гетеро- или гомодимеров. Белки NF-kB обычно изолируются в цитоплазме семейством ингибирующих белков, включая членов семейства IkB и родственных им белков [267]. Белки IkB имеют различное сродство к отдельным комплексам Rel /NF-kB и экспрессируются тканеспецифичным образом. Белки IkB включают в себя белок Bcl-3, p100, p105, IkB-alpha, IkB-beta, IkB-gamma, IkB-epsilon и IkB-zeta [54]. Самым важным и изученным является IKBa (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha) [267]. Взаимодействие белка IkBa c димером р50-RelA блокирует связывание NF-kB с ДНК. Скорость перемещения в ядро комплекса NF-kB-IkBa гораздо ниже скорости перемещения в цитоплазму, за счет чего комплекс в основном находится в цитоплазме в неактивном состоянии [54]. Кроме того, белки-предшественники NF-kB1 и NF-kB2, p105 и p100, служат в качестве 1кВ-подобных белков, поскольку их C-концы напоминают структуру IkB и выполняет функции, ингибирующие NF-kB.

Первоначально NF-kB идентифицирован как регулятор экспрессии к-легкой цепи иммуноглобулина в В-лимфоцитах, его роль исследована в воспалении, иммунитете и почти во всех аспектах клеточной деятельности. NF-kB экспрессируется почти во всех типах клеток и тканей, а специфические сайты

связывания NF-kB присутствуют в промоторах/энхансерах большого числа генов [267].

Транскрипционный фактор NF-kB регулирует множество аспектов врождённых и адаптивных иммунных функций и служит ключевым медиатором воспалительных реакций. NF-kB индуцирует экспрессию различных провоспалительных генов, включая гены, кодирующие цитокины и хемокины, а также участвует в регуляции воспалительных процессов. Кроме того, NF-kB играет критическую роль в регуляции выживания, активации и дифференциации клеток. Следовательно, дисрегуляция NF-kB способствует развитию патогенных процессов и различных воспалительных заболеваний [133]. Хроническое воспаление может привести к нестабильности генома и генетическим мутациям, которые способствуют возникновению и развитию опухоли. Кроме того, медиаторы воспаления, включая цитокины, простагландин E2 (PGE2) могут подавлять механизмы репарации ДНК [267].

Активация NF-kB включает два основных сигнальных пути, канонический и неканонический пути, которые важны для регуляции иммунных и воспалительных реакций. NF-kB может активироваться различными стимулами, такими как цитокины (TNF-a, IL-1P), факторы роста (эпидермальный фактор роста (EGF)), бактериальные и вирусные продукты (липополисахарид (LPS), дцРНК), УФ и ионизирующей радиацией, АФК [267] [136, 138, 140]. NF-kB индуцирует экспрессию антиапоптотических генов, таких как ингибитор каспазы-8 FLIP, ингибитор белков апоптоза c-IAPl/2 и XIAP, а также представителей семейства регуляторов апоптоза Bcl2 [267].

1.6.3. Bcl-2-сигнальный путь.

Bcl2 представляет собой семейство взаимодействующих белков, которые выполняют роль регуляторов апоптоза, данное семейство включает в себя ингибиторы и индукторы гибели клеток. Вместе они регулируют и опосредуют процесс, посредством которого митохондрии запускают внутренний путь апоптоза [87, 118]. Однако, кроме индукции апоптоза, белки

Bcl2 играют критическую роль в физиологии нормальных клеток, и связаны с нейрональной активностью, аутофагией, регуляцией транспорта кальция, функционирования митохондрий [87].

Bcl2, онкопротеин, обнаруженный посредством транслокации хромосом t(14;18), который характеризует фолликулярную лимфому человека, способствует выживанию клеток, а не стимулирует пролиферацию клеток. То есть Bcl2 увеличивает общее количество клеток, предотвращая гибель клеток, а не увеличивая скорость деления клеток [87].

Семейство Bcl2 включает три подсемейства в зависимости от гомологии и функций каждого белка [4, 90]. Bcl2, Bcl-x L, Bcl-w, Mcl-1, A1 и Bcl-B относятся к антиапоптотическому подсемейству и имеют общую гомологию последовательности в мотивах BH1-BH [118, 249]. Напротив, два других подсемейства являются проапоптотическими: одно включает Bax, Bak и Bok, другое - Bim, Bad, Bid, Bik, Bmf, Puma, Noxa и Hrk.

Антиапоптотическое семейство Bcl-2 локализуется в митохондриальной мембране, а также в мембране эндоплазматического ретикулума и ядерной оболочке. Bcl2 и его партнеры предотвращают апоптоз-ассоциированное высвобождение апоптогенных факторов, таких как цитохром С и фактор, индуцирующий апоптоз (AIF), из митохондриального межмембранного пространства в цитоплазму (Рисунок 10). Другой механизм, с помощью которого Bcl-2 предотвращает активацию каспаз, заключается в их способности секвестрировать прокаспазы, связываясь с апоптосомой (комплекс Apaf-1 / прокаспаза-9) [249].

Рисунок 10. Вс1-2 в регуляции апоптоза (сигнальный путь)

Помимо регуляции апоптоза (Рисунок 10), Вс1-2 подавляет аутофагию посредством взаимодействий с белками путофагии: ВЕСШ и AMBRA1. Эти данные подчеркивают сложную взаимосвязь между аутофагией и гибелью клеток, в которой основными участниками являются белок AMBRA1 и антиапоптотические члены семейства Bcl2 [194].

Поскольку семейство белков Bcl2 является ключевым регулятором апоптоза, нарушения в его функции связаны с онкологическими и нейродегенеративными заболеваниями [221]. Активация или ингибирование Вс12-сигнального пути при действии радиации определяет суммарный ответ клеток на радиационное повреждение [189].

1.6.4. Сигнальные пути БЯСЛ1 и БЯСЛ2 BRCA1 и BRCA2 не являются родственными белками, но оба обычно экспрессируются в клетках молочной железы и других тканях, где они участвуют в репарации поврежденной ДНК или апоптозе клетки, если ДНК не может быть восстановлена. Они участвуют в восстановлении хромосомного повреждения и играют важную роль в безошибочном восстановлении

двухцепочечных разрывов ДНК [72, 278]. BRCA1 и BRCA2 представляют собой гены-супрессоры опухолей. Мутации в этих генах увеличивают риск возникновения рака молочной железы и яичников, и являются наиболее распространенными мутациями при наследовании данных видов рака [67, 238, 278]. Белки BRCA1 и BRCA2 участвуют в гомологичной рекомбинации, жизненно важном процессе репарации ДНК, который использует неповрежденную сестринскую хроматиду для осуществления высокоточного восстановления преимущественно связанных с репликацией разрывов двухцепочечной ДНК. Гомологичная рекомбинация, по-видимому, является основным механизмом защиты целостности генома в пролиферирующих клетках [84, 201].

После повреждения ДНК ионизирующим излучением BRCA1 локализуется в местах повреждения ДНК, где накапливается репарационный белок RAD51. Гистон H2AX, фосфорилированный по Ser139 (yH2AX) фланкирует места разрывов ДНК. yH2AX необходим для накопления в местах разрывов ДНК многочисленных факторов репарации повреждений ДНК, в том числе BRCA1, что позволяет предположить, что yH2AX является одним из начальных факторов рекрутирования белков восстановления ДНК [92]. BRCA2 напрямую связывается с RAD51 и облегчает связывание RAD51 с одноцепочечной ДНК и поиск гомологичной матрицы ДНК [68].

Одним из аспектов поддержания целостности генома при радиационном воздействии является сеть сигнальных событий в клетках, которая запускается в ответ на генотоксический стресс. BRCA1 являются решающими медиаторами реакции повреждения ДНК. BRCA1-ассоциированные белки и p53 опосредуют передачу сигналов для образования макрокомплексов и активации контрольных точек клеточного цикла в S, G1/S фазах или в G2/M фазе [201].

1.6.5. NOX4 - представитель семейства NADPH-оксидаз

NOX4 относится к семейству NADPH-оксидаз, которое также включает

в себя N0X1, N0X2, N0X3, N0X5, DUOX1 и DUOX2. Все ферменты имеют трансмембранную структуру, состоящую из 6 доменов. Данный класс ферментов обеспечивает перенос электронов через каталитическую субъединицу N0X с NADPH на молекулярный кислород для обеспечения синтеза АФК [26, 162].

АФК являются химически активными веществами, содержащими кислород. Восстановление молекулярного кислорода (02) приводит к образованию супероксида (0-2), который является предшественником большинства других активных форм кислорода. Дисмутация супероксида приводит к образованию перекиси водорода (Н202). Перекись водорода, в свою очередь, может быть частично восстановлена, образуя гидроксид-ион и гидроксильный радикал (0Н-), или полностью восстановлена до воды. В физиологических условиях АФК необходимы для поддержания таких функций как рост, дифференцировка, метаболизм и выживание клеток. Однако, чрезмерная продукция АФК, в частности, при радиационном воздействии, приводит к нарушению клеточных структур и, в случае сильных необратимых повреждений, к клеточной гибели [117].

Во время окислительного стресса уровень АФК возрастает в основном за счет работы NADPH -оксидаз [5, 160]. N0X1, N0X2 и N0X5 генерируют супероксид анион, тогда как N0X4 продуцирует перекись водорода [28, 149, 160]. Анализ этих ферментов выявил, что N0X4, в отличие от остальных представителей семейства N0X, не нуждается в предварительной активации -синтез АФК регулируется уровнем экспрессии N0X4 [28, 165].

Во внутриклеточной мембране после взаимодействия N0X4 с р22р^х (регулятор N0X4) (Рисунок 11) происходит ряд реакций, в результате которых под действием супероксиддисмутазы супероксид анион превращается в перекись водорода благодаря быстрой дисмутации до того, как 02- покинет фермент, Н202 в свою очередь легко распространятся в клетке и участвует в пролиферации, миграции и гибели клеток [5, 47, 117].

Рисунок 11. Образование гетеродимера N0x4^22 р^х. [118].

На уровень экспрессии N0X4 влияют такие факторы как TGF-P1, Т№а, гормоны (инсулин, ангиотензин II), гипоксия, гипероксия и повреждение сосудов [51]. N0X4 участвует в антиокислительной защите, предотвращая окислительные повреждения за счет регулирования уровня оксида азота и взаимодействия с №£2, в клеточной дифференцировке и в регуляции генной экспрессии [208]. Однако, дисфункция ферментов N0X приводит к ряду патологических процессов. Высокая активность NOX играет роль в развитии сердечно-сосудистых патологий, в ответе клеток на действие ионизирующего излучения [26, 28].

1.7. Вывод на основании обзора литературы Исследование биологических эффектов малых доз радиации по-прежнему в центре внимания научных исследований из-за неизбежности воздействия на клетки человека ионизирующего излучения. На организм человека воздействуют фоновые источники излучения (радиоизотопы земной коры, космические лучи и т.д.) и источники, образуемые в результате техногенной деятельности человека (атомная энергетика, радиоактивные отходы, аварии, облучение в клинической и диагностической практике и т.д.). При этом человек подвергается воздействию низких доз гораздо чаще, чем

воздействию высоких доз. Однако, по-прежнему, существуют разногласия в интерпретации эффектов малых доз.

Воздействие малых доз радиации на стволовые клетки человека изучено мало, хотя исследование эффектов действия малых доз радиации именно на стволовые клетки актуально как для понимания фундаментальных процессов функционирования стволовых клеток при действии малых доз радиации, так и для практического здравоохранения.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Объект исследования

Для работы выделены и культивированы МСК из 6-ти образцов жировой ткани операционного материала молочной железы, доставленного из ФГБУ "РОНЦ им. Блохина" РАМН (г. Москва) в течение часа после резекции молочной железы. От всех доноров биологического материала получено информированное согласие, работа одобрена этическим комитетом ФГБНУ "МГНЦ". Образцы механически измельчены в среде ДМЕМ ("ПанЭко", Москва), содержавшей 250 мкг/мл гентамицина, 60 Ед/мл пенициллина и 60 Ед/мл стрептомицина ("ПанЭко"), ферментативную диссоциацию проводили в среде ДМЕМ, инкубируя препарат в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("PAA", Австрия), 0,04% коллагеназы ("Sigma") и тех же антибиотиков в течение 16 часов при 37°C. Клетки центрифугировали (200g, 10 мин), перенесли во флаконы и культивировали при 37°С в среде AmnioMax С-100 Basal Medium ("Gibco"), содержавшей AmnioMax Supplement C-100, 20 мкмоль/л HEPES ("ПанЭко") и антибиотики.

Полученные МСК охарактеризованы по поверхностным CD-маркерам стволовых клеток методом проточной цитофлуориметрии (CyFlow (PARTEC, Германия)) с использованием соответствующих антител. Полученный профиль характерен для МСК (Таблица 3).

Таблица 3.

Характеристика МСК, используемых в работе.

Клетки Источник Поверхностные маркеры

МСК ЖТ (N=6) Жировая ткань CD34- , CD45-, HLA-ABC+, HLA-DR-, CD44+, CD29+, CD49b low, CD54 low, CD90+, CD106-, CD105+, CD117-.

2.2. Воздействие радиации и окисленных фрагментов вкДНК на

культуру МСК

Культуру МСК подвергали однократному облучению следующими дозами радиации: 3, 10 и 50 сГр. В качестве источника ионизирующего гамма-излучения использовали установку "Арина-7" (Россия).

К среде культивирования МСК добавляли образцы окисленной внеклеточной ДНК (вкДНКокси) в концентрации 50 нг/мкл. Пробы окисленной ДНК для эксперимента приготовлены путем обработкой образца геномной ДНК в присутствии 300mM H202/Fe2+/EDTA или 300mM Н2О2 при облучении ультрафиолетом (X = 312 нм), что способствует интенсивной деградациии Н2О2 и продукции свободных радикалов (гДНКокси). Образцы вкДНК облученных клеток получали из среды культивирования после облучения МСК дозой 10 сГр (вкДНКокс_обл).

2.3. Постановка стандартного МТТ-теста.

MTT-тест - колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. Метод основан на том, что НАДФ-Н-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты митохондрий способны восстанавливать желтый МТТ до темно-фиолетовых гранул формазана. Реакция происходит только в живых клетках с активными митохондриальными ферментами. Гранулы формазана растворяются в диметилсульфоксиде (ДМСО), количество восстановленного продукта измеряется фотометрически.

Для МТТ теста клетки рассеивали на 96-луночный планшет (среда бессывороточная или 10% сыворотки). Через сутки клетки подвергали воздействию и инкубировали 3 суток при 37° С в атмосфере 7,5% СО2. Сливали среду из планшета, в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора МТТ (5 мг/мл на стерильной воде). Инкубировали 1-1,5 ч при 37° С в атмосфере 7,5% СО2. Все из планшета сливали, промывали PBS и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО и инкубировали 15 мин +4° С. Измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре при длине волны

540 нм. Выживаемость клеток в присутствии исследуемого препарата рассчитывали по формуле: (ОП опытных лунок - ОП среды / ОП контр. лунок - ОП среды) Х 100%, где ОП — оптическая плотность.

2.4. Метод проточной цитофлуорометрии.

Метод проточной цитофлуорометрии основан на детекции флюоресценции клеток, окрашенных моноклональными антителами, коньюгированными с флуоресцентой меткой, а также иными флуоресцирующими соединениями. Методом проточной цитометрии исследовали уровень АФК с помощью красителя: 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетата (DCFH-DA) ("Molecular Probes/Invitrogen", "CA", США), который под действием АФК окисляется с образованием флуоресцирующего 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF). Клетки рассеивали на 6-луночные планшеты, через 1 сутки облучали, инкубировали установленное время в атмосфере 7,5% СО2 при температуре 37°С, затем среду сливали, промывали планшет PBS, и добавляли раствор красителя (стоковый раствор 2 мг/мл непосредственно перед использованием разводят PBS в соотношении 1:200), инкубировали 15 мин, промывали PBS. Клетки снимали с подложки и анализировали на проточном цитофлуориметре (CyFlow, "Partek", Германия).

Также методом проточной цитометрии исследовали содержание 8-окси-дезоксигуаноина в составе ДНК ядер клеток с использованием первичных моноклональных антител (Sc-66036, SantaGruz, США)) и вторичных (anti-mouse-FITC, SC-2010, SantaGruz, США), уровень двухцепочечных разрывов ДНК методом анализа гамма-фокусов фосфорилированной формы гистона Н2АХ с применением антител к гистонам H2AX (NB100-78356G, "NovusBio", США) и уровень экспрессии белков с использованием соответствующих моноклональных антител: BCL2 (Sc-783), BRCA2 (NBP1-88361), NOX4 (SC-30141), NRF2 (ab194984), p53 (sc-126-f), PCNA (ab2426) по общему протоколу: культивированные клетки, подвергшиеся воздействию, и контрольные

снимали с подложки стандартным методом Versen-Tripsin, фиксировали 3,7% формальдегидом (AppliChem) 10-15 мин при 37°С, промывали раствором 0,5% альбумина на PBS (ЭКО СЕРВИС, Россия) в течение 10 минут при комнатной температуре и пермеабилизовали 90% метанолом. Затем суспензию клеток инкубировали с первичными антителами (1 мкг антител на 1 мл PBS в присутствии 1% альбумина) ночь при +4°С, и при необходимости, со вторичными антителами (FITC, SantaGruz, США) 1 час при комнатной температуре в темноте и анализировали на проточном цитофлуориметре (CyFlow, «Partek», Германия).

2.5. Метод флуоресцентной микроскопии.

Флуоресцентная микроскопия проводилась на флуоресцентном микроскопе AxioImagerA2 (Carl Zeiss). Клетки культивировались в маленьких чашках Петри. Фиксация клеток проводилась по стандартному протоколу: сливали среду культивирования, клетки промывали раствором PBS 10 минут при комнатной температуре, фиксировали 3,7% формальдегидом 10 минут при 4°С, затем снова промывали раствором PBS и пермеабилизировали 0,1% раствором Тритона X-100 (FERAK BERLIN) при 4°С в течение 15 минут. Затем, в зависимости от задач, красили антителами (1 мкг/мл) в течение суток (при необходимости обрабатывали вторичными антителами, меченными FITC).

2.6. Метод электрофореза одиночных ядер (метод "комет").

Определение количества одно- и двунитевых разрывов ДНК осуществляли с помощью метода "ДНК-комет" (single cell gel electrophoresis -гелевый электрофорез отдельных клеток) по стандартному протоколу (Collins A.R. et al., 2008) на слайдах с агарозной подложкой. После 2-часовой обработки в лизирующем буфере [2,5 моль/л NaCl, 0,1 моль/л EDTA (pH 10,0), 10 ммоль/л Tris (pH 9,6), 1% N-лаурилсаркозинат, 10% DMSO, 1% Triton X-100] при 25°C препараты помещали в электрофорезную камеру в щелочной буфер [0,3 моль/л NaOH, 1 ммоль/л ЭДТА (pH 10,0)] на 20 мин. при 15° С, а

затем подвергали электрофорезу при 300 mA на 20 мин. при той же температуре. Далее препараты фиксировали, окрашивали 10%-ным раствором бромистого этидия ("ПанЭко", Россия) и анализировали на флуоресцентном микроскопе (с увеличением Х 40 раз) при помощи программного обеспечения CASPlab. Определяли два параметра: момент хвоста ДНК-кометы (MomentT, усл.ед.) и доля ДНК в хвосте ДНК-кометы в процентах (DNAtPr, %) на 100150 клетках. Удаление выбросов (гибнущая клетка, артефакты) из выборки производилось по правилу "трех сигм", то есть, не включали в экспериментальные данные клетки, у которых исследуемый параметр отклонялся от среднего более чем на три среднеквадратичных отклонения (СКО), но фиксировали процентную долю таких "выбросов" от общего количества клеток. Ввиду отклонения выборок клеток от нормального распределения использовали робастные оценки среднего и СКО: в качестве оценки среднего брали медиану, а оценкой СКО служил межквартильный размах, то есть разность между третьим и первым квартилями (75% перцентиль минус 25% перцентиль), деленный на 1,349. Для статистической обработки и анализа данных использовали распространяемый свободно пакет программ PAST версии 2.17с (Hammer, O., Harper, D.A.T., Ryan, P.D. 2001. PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia Electronica 4(1): 9pp. Пакет программ доступен по ссылке: http://www.nhm2.uio.no/norlex/past/Past.exe). Уровень значимости отличий, на котором отвергается нулевая гипотеза, являлся стандартным: р = 0,05.

2.7. Иммуногистохимия.

Культивированные клетки фиксировали 3,7% формальдегидом 20 мин при +4°С и пермиабилизовали 0,1% Тритоном Х-100 на PBS с последующей отмывкой и блокировкой 1% раствором альбумина на PBS и инкубировали в течении ночи с первичными антителами при +4°С (1 мкг/мл на PBS в присутствии 1% альбумина, затем, после отмывки PBS, инкубировали 1 ч с

вторичными антителами при комнатной температуре, отмывали PBS и, при необходимости, окрашивали DAPI.

2.8. Выделение ДНК из среды культивирования клеток после

облучения

ДНК выделяли из среды культивирования МСК до и после облучения добавляли к 1 мл среды 200 мкл лизирующего раствора (5% саркозилата натрия), 10 мкл РНКазы (концентрация 190,8 Ед/мкл, Биолот, РФ), помещали на +37оС на 3 часа. Затем добавляли 50 мкл Протеиназы К (концентрация 600 Ед/мл), помещали в термостат на +37 оС на ночь. После инкубации добавляли равный объем фенола, перемешивали и центрифугировали 10 минут при 10 000 об., отбирали верхнюю фазу в чистую пробирку, повторяли 2 раза. К раствору добавляли равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (в соотношении 24:1), центрифугировали 10 минут при 10 000 об. Верхнюю фазу отбирали в чистую пробирку, добавляли % объема насыщенного раствора ацетата натрия (3М) и два объема этилового спирта. Выдерживали при -20оС ночь, центрифугировали 10 минут при 10 000 об., отбирали жидкость. Осадок растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера. Концентрацию вкДНК определяли с использованием интеркалирующего красителя Picogreen (Invitrogen, США). Относительная стандартная ошибка метода измерения концентрации геномной ДНК составила 3 %.

2.9. Определение уровня 8-окси-дезоксигуанозина дот

иммуноблоттингом

Нитроцеллюлозный фильтр (0.45мкм) OPTITRAN BA-S 85 (Sigma-Aldrich Z750697) инкубировали 10 мин в 20-кратном SSC и высушивали. ВкДНК наносили по 1,5 мкл на фильтр, подсушивали и фильтр запекали 30 мин при 80оС. Фильтр смачивали PBS, блокировали 0,5% раствора сухого обезжиренного молока на PBS, затем инкубировали ночь при +4оС с раствором антител к 8-окси-дезоксигуанозину (SantaCruz 66036) в разведении 1:50 (PBS, 0,5% сухое обезжиренное молоко, 0,05% Tween 20), промывали три раза по 5

мин раствором PBS-0,05%-Tween 20, и инкубировали 40 мин при комнатной температуре со вторичными анти-мышиными антителами, коньюгированными с щелочной фосфатазой (Sc-2008) в разведении 1:2000 на PBS-0,05%-Tween 20, промывали три раза по 5 мин раствором PBS-0,05%-Tween 20, один раз AP pH9.5 и проявляли раствором субстрата (BCIP-NBT) при комнатной температуре в темноте. Определяли уровень окислительных модификаций вкДНК при сравнении с калибровочной кривой, для построения которой использовали окисленную ДНК в разведении с известным уровнем 8-окси-дезоксигуанозина.

2.10. Приготовление окисленных образцов ДНК Пробы окисленной ДНК для эксперимента готовили комбинированной обработкой образца геномной ДНК 300 микроМ Н2О2 и ультрафиолетом при длине волны X = 312 нм в течение 1,5 минут. Содержание 8-oxodG в модельных фрагментах составило около 1200 8-oxodG на 106 нуклеотидов ДНК, что эквивалентно реально встречающемуся уровню 8-oxodG во вкДНК при сильном окислительном стрессе.

2.11. Создание генетической конструкции на основе плазмиды с маркерным геном («green» белок, GFP), содержащей легкоокисляющиеся повторы (G)n. В качестве «базового» вектора выбрана коммерчески доступная плазмида pEGFP-C1 (GenBank Accession: U55763). G/C-состав pEGFP-C1 -53,4%, в ее составе 141 участок повтора GGG и 15 участков повтора GGGG (GC-участки - наиболее легко окисляемые). В качестве «маркера» в составе выбранного вектора содержится ген флуоресцирующего белка EGFP (GFP), а качестве легко окисляемой вставки - фрагмент поли-G (один вариант - с поли-(G) 12, второй - с поли- (G) 24). Полученный фрагмент выделяли с помощью гель-электрофореза в агарозном геле, фрагмент и вектор обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BamH1, лигирование проводили с помощью Т4 ДНК-лиазы. Трансформировали полученными плазмидами компетентные

клетки E.coli (штамм JM110), выращивали трансформанты на агаризованной LB с добавкой канамицина (50 мкг/мл). Клоны анализировали методом ПЦР на наличие вставки с помощью специфичных олигонуклеотидов. Соответствие первичной последовательности вставки заданным параметрам проверяли секвенированием.

2.12. Выделение РНК и определение ее концентрации Из культуры МСК выделяли тотальную РНК набором Yellow Solve (Клоноген, Россия), согласно прилагаемой методике. Концентрацию выделенной РНК определяли с помощью красителя Quant-iT RiboGreen RNA reagent ("MoBiTec", Германия), на планшетном спектрофлуориметре («EnSpire», PerkinElmer, Финляндия), длина волны возбуждения 487 нм, длина волны флуоресценции 524 нм. Краситель разводили в ТЕ буфере в соотношении 1:2000. Разведенный краситель в объеме 50 мкл смешивали с 5 мкл РНК, после чего измеряли флуоресценцию раствора. Стандартная относительная ошибка определения составляет 5%.

2.13. Обратная транскрипция Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью реактивов фирмы «Силекс» (Россия). Для постановки реакции смесь из 5 мкл РНК, 1 мкл случайных гексапраймеров и 12 мкл mQ помещали на 5 минут в термостат при 70оС. После чего этот раствор переносили в холод на 10 минут и добавляли по 7 мкл заранее приготовленного раствора (2,5 мкл ОТ-буфера, 4 мкл 1,5 мМ dNTP и 0,5 мкл обратной транскриптазы M-MLV). Полученный раствор выдерживали 11 минут при температуре 25 °С, а затем 60 минут при температуре 37 °С.

2.14. Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном

времени.

Для детекции амплифицируемого продукта использован интеркалирующий краситель SybrGreen. ПЦР проводили с использованием

соответствующих праймеров ("Синтол") на приборе StepOnePlus ("Applied Byosystems", США).

Состав реакционной ПЦР-смеси в объеме 25 мкл: 10,35 мкл стерильной воды mQ, 6 мкл Mg2+, 2,5 мкл ПЦР-буфера (700 ммоль/л Tris-HCl, pH 8,6; 166 ммоль/л сульфатааммония, 35 ммоль/л MgCl2), 2 мкл 1,5 ммоль/л раствора dNTP; 0,75 мкл ДМСО (диметилсульоксид), по 1 мкл 30 пкмоль/л раствора праймеров, кДНК 1 мкл, Tag-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза I) 0,3 мкл, краситель SybrGreen 0,2 мкл. Температуру отжига ПЦР подбирали индивидуально для каждой пары праймеров. Стандартные условия ПЦР: денатурация (95°С, 4 мин), затем 40 циклов амплификации в режиме: 94°С -20 сек, (56-62)°С - 30 сек, 72°С - 30 сек. Элонгация - 72°С в течение 5 мин. Уровень экспрессии генов анализировали в нескольких (не менее трех) независимых экспериментах на клетках от разных доноров, обработку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения прибора; ошибка составляла 2%.

Методы обработки данных ПЦР в реальном времени основаны на применении уравнения: C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E. Два основных принципа обработки данных Real-time ПЦР это: метод калибровочного графика и прямое сравнение данных. Метод калибровочного графика предполагает построение калибровочного графика в координатах C(T) - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах. Поскольку достаточно определить лишь относительную концентрацию субстрата, для построения калибровочного графика использовали серию разведений разных экспериментальных образцов и сравнили эффективности. Ошибка определения (разброс значений) при использовании серийных разведений составила 1,2%. Все экспериментальные значения попадали в область построенной линейной калибровочной прямой. Эффективность реакции можно рассчитать, как E = 10-1/k, где k берется из уравнения прямой C(T) =

k^log P0 + b, полученной путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При E = 2 (или 100% (часто заменяемом на 1) максимально теоретически возможном значении) k ~ -3,32. В нашем случае k >-3,8, а эффективность Е >1,82 (или >91%, часто заменяемом на >0,91). Условия ПЦР (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов (GAPDH, ТВР) близки к условиям ПЦР экспериментальных образцов. Кроме того, мы провели прямое сравнение данных экспрессии исследуемых генов с помощью программного обеспечения прибора StepOnePlus ("Applied Byosystems", США) и сравнили с методом на основе калибровочной кривой. Данные, полученные с использованием программы прибора и посчитанные при сравнении концентраций на основе калибровочных кривых (для эффективности не менее 90%), совпадают. В серии опытов получена хорошая воспроизводимость результатов, ошибка составила ~ 2%.

2.15. Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку проводили с использованием следующих программ: Excel Microsoft Office, Statistica 6.0, StatGraph. При анализе предполагаемых различий между выборками исходили из нуль-гипотезы об отсутствии различий, которую проверяли с помощью расчета U-критерия Манна-Уитни. Различия достоверны при p <0,05. Распределения параметров сравнивали по методу Колмогорова-Смирнова.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Исследование повреждающего влияния доз радиации 3, 10 и 50 сГр (уровня апоптоза, окислительных модификаций и разрывов ДНК клеток) на мезенхимные стволовые клетки (МСК) жировой ткани человека и активации генов репарации, про- и антиапоптотических

генов после облучения этими дозами. 3.1.1. Культивирование и описание МСК из 6-ти образцов жировой

ткани.

МСК, полученные вследствие резекции молочной железы, охарактеризованы с помощью моноклональных антител к поверхностным маркерам методом проточной цитофлуориметрии. Согласно данным литературы МСК характеризуются спектром экспрессирующихся поверхностных маркеров [261].

На поверхности исследуемых клеток выявлена положительная экспрессия HLA-ABC+, CD44+, CD54 (low), CD90+, CD106+, CD29+, CD49b (low), CD105 (low) и отрицательная экспрессия CD34-, CD45-, HLA-DR-, CD117-, что характерно для МСК.

3.1.2. Оценка повреждающего действия малых доз радиации (0,1 Гр и 0,5 Гр) на МСК с помощью стандартного МТТ-теста.

Культуры МСК облучали дозой 10 сГр на источнике ионизирующего гамма-излучения "Арина-7" (Россия). Для оценки цитотоксичности малых доз радиации (0,1 Гр и 0,5 Гр) на МСК проведен стандартный МТТ-тест, основанный на способности митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ метаболически активных клеток восстанавливать бесцветный 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в окрашенный формазан, образование которого детектируется спектрофотометрически на планшетном ридере "EnSpire". МСК культивировали в 96-луночной плашке, после достижения монослоя клетки облучали малыми дозами радиации 0,1 Гр и 0,5 Гр (каждой дозой - отдельную

плашку), культивировали клетки 3 суток после облучения, затем проводили МТТ-тест.

С использованием МТТ-теста показали, что воздействие радиации в дозе до 10 сГр на МСК человека не оказывает статистически значимого повреждения, тогда как действие радиации в дозе 50 сГр снижает число метаболически активных клеток на 40% через 3 суток. Полученные результаты подтвердили, измерив концентрацию ДНК прикреплённых клеток после действия малых доз радиации (0,1 Гр и 0,5 Гр) (клетки обрабатывали лизирующим буфером с ДНК-связывающим красителем Hoechst 33342, затем измеряли интенсивность сигнала на планшетном ридере «EnSpire»), что количество прикрепленных клеток при действии радиации (Рисунок 12) в дозе до 10 сГр значимо не отличалось от контроля, действие радиации в дозе 50 сГр снижало количество клеток в культуре на 45%.

Воздействие радиации на МСК

1,2

1 -

0,8 -

0,6 -

0,4 -

0,2 0

контроль 10 сГр 50 сГр

Рисунок 12. Количество прикрепленных клеток при действии радиации в дозах 10 сГр и 50 сГр.

3.1.3. Малые дозы радиации индуцируют в МСК кратковременный

синтез АФК.

АФК являются важным компонентом в жизнедеятельности клетки. В норме они способствуют росту и дифференцировке клеток, поддерживают их

метаболизм и выживание. Однако чрезмерный синтез АФК приводит к окислительному стрессу [117].

Детекцию и уровень АФК в МСК осуществляли методом проточной цитометрии с использованием красителя Н2ВСБН-ОА (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат), который начинает флуоресцировать при связывании с АФК.

Синтез АФК повышается на 20% через 20 минут и на 40% через 2 часа при действии радиации в дозе 3 сГр. В то же время действие радиации в дозе 10 сГр на МСК через 20 минут кратковременно повышает уровень синтеза АФК клетками в 3,8 раза; уровень АФК падает через 2 часа, до контрольных значений. При действии радиации в дозе 50 сГр регистрируется повышение уровня синтеза АФК как при кратковременном, так и при более длительном воздействии: через 20 минут в 2,3 и через 2 часа в 1,6 раза (Рисунок 13 Ошибка! Источник ссылки не найден. А, Б).

Данные, полученные методом проточной цитофлуориметрии, подтвердили методом флуоресцентной микроскопии в живых клетках с красителем H2DCFH-DA. Уровень синтеза АФК в МСК возрастает через 20 минут после действия радиации в дозе 10 сГр, а через 2 часа снижается до контрольных значений (Рисунок 13 Ошибка! Источник ссылки не найден. Ошибка! Источник ссылки не найден., В).

А

контроль

1000-

оЮ0

а

^ ю

1 0 1

Са1е С ОА1: 0 0 / т1 !2 00% ОА2: 17.21% .¿$235 / т1 ■■'Шщ

ОАЗ: 0 0 / т! 00%|^ ОА4: 82.79% ШВГ4845 / т!

10 100 Р5С

1000

10 сГр, 20 мин.

1000

у. 100

и О

ю

0.1

Сйе: 02 Щ ОА1: 0.00% гЖ?: 58.43% 0 / т1 ¿ ЩИ) / т1 • •■^дкг _ Ж

ОАЗ: 0.00% ^ 0 / т1 ¿$4 Щг ЭА4: 41.57% Й05/т!

10 100 Р5С

1000

Б

4,5 4 3,5 3

си

х 2,5

I-

о

ш 2

и 2 о

1,5

0,5

ММ

3 сГр 10 сГр 50 сГр

I контроль 20 минут 2 часа

2,5

1,5

0,5

В

контроль

10 сГр, 20 мин

3 сГр 10 сГр 50 сГр

I контроль 20 минут 2 часа

10 сГр, 2 часа

*

3

2

1

1

0

0

Рисунок 13. Анализ уровня АФК при действии радиации в дозах 3, 10 и 50 сГр: А,Б - методом проточной цитометрии; В - флуоресцентной микроскопии с использованием красителя H2DCFH-DA; Б - * - отличия достоверны относительно контроля; В -Увеличение х40. Уровень флуоресценции посчитан вручную (среднее для 100 клеток).

Таким образом, показано, что радиация в малых дозах приводит к кратковременному окислительному стрессу, характеризующимся повышением уровня АФК. Предположили, что возрастание уровня АФК в клетках происходит в основном за счёт работы NADPH -оксидаз [5, 160], одним из представителей которых является N0X4.

3.1.4. Малые дозы радиации активируют экспрессию NOX4 и на уровне

гена, и на уровне белка.

N0X4 относится к семейству NADPH-оксидаз, и в отличие от других представителей семейства N0X, не нуждается в предварительной активации -синтез АФК регулируется уровнем экспрессии N0X4 [28, 165].

Радиация вызывает образование короткоживущих суперактивных радикалов. Синтез АФК после облучения связан с биологическими процессами в облученной клетке.

Большинство изоформ N0X производят О2 в качестве основного продукта. Однако Н202 является доминирующей молекулой АФК, обнаруженной при активации N0X4. Сообщалось, что уровни экспрессии N0X4 выше, чем у других N0X в МСК, полученных из жировой ткани [12].

Через 20 минут после воздействия малых доз радиации 3, 10 и 50 сГр происходит увеличение уровня экспрессии гена N0X4 после воздействия - в 3,1; 2,4 и 1,9 раз, соответственно. Через 2 часа уровень экспрессии гена N0X4 снижается, повышенная экспрессия (в 1,6 раз) сохраняется только при действии 50 сГр (Рисунок 14).

Данные флуоресцентной микроскопии показали, что в контрольных клетках N0X4 локализуется в основном в цитоплазме и на клеточной мембране. Более того, экспрессия N0X4 увеличивается не только в цитоплазме, но и в ядрах клеток (Рисунок 15).

Методом проточной цитофлуориметрии показали, что уровень синтеза

белка N0X4 возрастает пропорционально повышению уровня экспрессии гена, что коррелирует с данными, полученными при использовании флуоресцентной микроскопии. Синтез белка N0X4 наблюдали через 20 минут после действия радиации в цитоплазме МСК, а через 40 минут - по поверхности ядер клеток и в ядрах МСК (Рисунок 15).

2,5

8 ? 15

ш х 1,5 о. I-

с о

«о 0,5

15 минут 2 часа

13 сГр ■ 10 сГр ■ 50 сГр

Рисунок 14. Анализ уровня экспрессии гена N0X4 при действии радиации в дозах 3, 10 и 50 сГр методами ПЦР в реальном времени; * - отличия достоверны относительно контроля.

контроль

И) сГр

* . - *

2 часа,

Рисунок 15. Анализ уровня N0X4 при действии радиации в дозе 10 сГр методом флуоресцентной микроскопии с использованием антител к N0X4 конъюгированные с Б1ТС (зелёный) ядра окрашены DAPI (синий), увеличение х40. Уровень флуоресценции посчитан вручную (среднее для 100 клеток).

Таким образом, повышенная экспрессия N0X4 как на уровне гена, так и на уровне белка коррелирует с повышением уровня АФК после воздействия радиации в малых дозах, что в свою очередь может вызывать окисление и повреждение ДНК ядер.

3

2

1

0

3.1.5. Малые дозы радиации индуцируют повышение уровня окислительных модификаций ДНК в ядрах клеток.

В первые минуты после действия малых доз радиации в клетках происходит интенсивный синтез АФК, который может вызывать окисление и повреждение ДНК ядер клеток. 8-охоёО - распространенный маркер окисления ДНК [200]. При помощи антител к 8-oxodG определили в фиксированных клетках меченных фикоэритрином (РЕ) уровень окисления ДНК. Интенсивность флуоресценции увеличивается в цитоплазме клеток при действии радиации в дозе 10 сГр, а также увеличивается количество окрашенных ядер (Рисунок 16).

Методом проточной цитофлуориметрии выявили наличие в контроле двух популяций клеток: 3-8% (Я) с высоким уровнем 8-охоёО; и с низким уровнем 8-охоёО. В контрольных клетках фракция R составляет 8 ± 2% всей популяции. После действия радиации в дозе в дозе 3 сГр, 10 сГр и 50 сГр уровень флуоресценции увеличивается через 20-30 минут в 5, 10 и в 5,5 раз, соответственно (Рисунок 16). После действия радиации в дозе 3 сГр уровень флуоресценции 8-oxodG фракции R через 2 часа остается неизменным, в дозе 10 сГр и 50 сГр уменьшается до контрольных значений.

Общее количество 8-oxodG возрастает после действия радиации (3, 10 и 50 сГр) в 5, 7,5 и 3,2 раза. Через 2 часа после облучения уровень 8-охоёО снижается в 1,5-2,5 раза (Рисунок 16).

А

35

30

25

сс

V 20 ■а

о

х

8 15

10

20 минут 2 часа

I контроль В3 сГр2 ■ 10 сГр ■ 50 сГр

Б

Рисунок 16. Анализ уровня белка 8-oxodG в МСК при действии радиации в дозах 3, 10 и 50 сГр. А - Метод проточной цитометрии (субпопуляция клеток с высоким уровнем флуоресценции) с использованием антител к 8-охоёО, конъюгированных с ФИТЦ. * - пробы достоверно отличаются от контроля. Б -метод флуоресцентной микроскопии с использованием антител к 8-охоёО конъюгированных с FITC (зелёный) ядра окрашены DAPI (синий), увеличение х40. Уровень флуоресценции посчитан вручную (среднее для 100 клеток).

Наблюдалась высокая корреляция между уровнем экспрессии гена N0X4, уровнем синтеза активных форм кислорода в МСК и уровнем окислительных модификаций ядер МСК, что свидетельствует об образовании разрывов ДНК.

Таким образом, малые дозы радиации стимулируют синтез АФК в МСК в результате активации гена N0X4. Активация гена N0X4 приводит к

5

0

окислительной модификации и повреждению ДНК ядер клеток, а также может активировать антиокислительные системы в клетках.

3.1.6. Малые дозы радиации активируют антиоксидантные системы в МСК Активация генов репарации, про- и антиапоптотических генов в МСК после облучения дозами ИИ 3, 10 и 50 сГр.

Повышение уровня АФК вызывает окислительный стресс и может активировать антиокислительный ответ. Центральным медиатором системы антиоксидантного ответа является стресс-активированный транскрипционный фактор NRF2. В норме белок KEAP1 связывает в цитоплазме NRF2, за счет чего последний оказывается в неактивном состоянии. Окислительный стресс способствует конформационным изменениям в KEAP1, нарушая взаимодействие с NRF2. Свободный NRF2 перемещается в ядро и активирует ARE сигнальный путь, участвующий в детоксикации и антиокислительном ответе [248, 290].

Ill

20 минут 2 часа

■ контроль ■ 10 сГр

Рисунок 17. Анализ уровня экспрессии гена NRF2 при действии 10 сГр радиации. * - пробы достоверно отличаются от контроля.

Через 20 минут и 2 часа после действия радиации в дозе 10 сГр на МСК уровень экспрессии гена NRF2 повышается в 2,4 раза и становится сопоставимым с контрольными значениями соответственно (Рисунок 17).

ct

си

2,5

о

Й о:

(И X

си

1,5

си а. с и а: m л х си m

О

р

>

0,5

3

2

1

0

2,5

20 минут 2 часа

■ контроль В3 сГр ■ 10 сГр И50 сГр

Рисунок 18. Уровень экспрессии белка NRF2 в МСК при действии радиации в дозе 10 сГр, метод проточной цитометрии. * - пробы достоверно отличаются от контроля.

Уровень белка транскрипционного фактора NRF2 также возрастает в 2,2 раза через 20 минут после воздействия 10 сГр (Рисунок 18).

Данные флуоресцентной микроскопии показывают, что в контроле культивируемых МСК транскрипционный фактор локализован в ядре это свидетельствует, об активной антиоксидантной защите. Экспрессия NRF2 возрастает при действии радиации в дозе 10 сГр и в цитоплазме, и в ядре клеток. Четко очерченные ядрышки наблюдаются в ядре клеток (Рисунок 19). Спустя 2 часа уровень экспрессии №£2 в клетке падает (Рисунок 19), но он способен продолжать активацию антиоксидантных генов так как остается в ядре клеток [237].

Уровень экспрессии гена белка транскрипционного фактора N^2 не изменяется после действия радиации в дозе 3 Гр ни через 20 минут, ни через 2 часа после облучения, и повышается незначительно при действии радиации в дозе 50 сГр через 20 минут, снижаясь до контроля через 2 часа после облучения (Рисунок 19).

контроль N(^2 МИР2 + РАР1

10 сГр, 20 мин

Рисунок 19. Локализация №£2 при воздействии на клетки радиацией в дозе 10 сГр. Окраска клеток антителами к №£2 конъюгированных Е1ТС (зелёный), окраска ядер DAPI (синий). Увеличение х40.

Таким образом, окислительная модификация ДНК клеток, вызываемая действием малых доз радиации, приводит к активации антиокислительного ответа в МСК. При этом, несмотря на активацию антиокислительного ответа, окислительные модификации могут приводить к образованию разрывов ДНК клеток.

3.1.7. Малые дозы радиации (3 сГр и 0,1 Гр) вызывают образование быстрорепарируемых разрывов ДНК стволовых клеток.

Усиленный синтез АФК приводит к окислительному стрессу, который, в свою очередь, вызывает образование окислительных модификаций ДНК, накопление которых приводит к однонитевым и двунитевым разрывам ДНК.

Методом комет (гель-электрофорез одиночных клеток) измеряли повреждения ДНК ядер клеток на уровне отдельных клеток, визуализацию которых проводили с помощью флуоресцентной микроскопии. Флуоресцирующая ДНК в «хвосте кометы» отражает степень повреждения ДНК (длиннее хвост - больше разрывов ДНК).

показано, что через 15-20 мин после воздействия малых доз радиации (3 сГр, 10 сГр, 50 сГр) образуется большое количество разрывов ДНК, в дозах радиации 3 и 10 сГр уровень разрывов снижается до контрольных значений через 2 часа (Рисунок 20). Наиболее выраженный «хвост кометы» в культуре клеток, подвергавшихся действию радиации в дозе 10 сГр. Снижение ДНК в «хвосте комет» может быть обусловлено как гибелью клеток, так и усилением процесса репарации.

15 мин

Рисунок 20. Визуализация метода комет. Измерения повреждений ДНК ядер клеток на уровне отдельных клеток при воздействии малых доз радиации 3, 10 и 50 сГр через 15 минут и 2 часа.

Однонитевые разрывы ДНК могут способствовать увеличению двунитевых разрывов ДНК и одним из маркеров двунитевых разрывов ДНК является белок Н2АХ. Данный белок является представителем гистонов и фосфорилируется за счёт серина 139 в сайте разрыва ДНК, образуя гамма-

фокусы, которые визуализируются в клеточном ядре методами проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии.

В контроле фракция R, содержащая клетки с большим количеством маркера гамма-Н2АХ, составляет 6 ± 1% от всей популяции. Воздействие ИИ в дозе 3 сГр, 10 сГр и 50 сГр приводит к увеличению количества клеток через 30 минут, попадающих в R фракцию, и уровень флуоресценции таких клеток возрастает в 2 раза, в 6 раз и в 9,5 раз, соответственно. ИИ в дозе 3 сГр и 10 сГр через 2 часа не влияет на уровень флуоресценции гамма-Н2АХ фракции R, а при действии радиации в дозе 50 сГр уровень флуоресценции снижается в 1,6 раза (рис. 1). Через 3 часа уровень флуоресценции гамма-Н2АХ фракции R достигает контрольных значений после действия радиации в дозе 3 сГр и 10 сГр.

Воздействие радиации через 20-30 минут в дозе 10 сГр увеличивает уровень флуоресценции гамма-Н2АХ (в фракции R с высоким уровнем флуоресценции - эта фракция содержит множественные разрывы, а также в фракции с низким уровнем флуоресценции - эта основная клеточная фракция) в 3,8 раза, через 2 часа уровень флуоресценции уменьшается до контрольных значений.

Воздействие радиации в дозе 3 сГр через 3 часа способствует увеличению флуоресценции в 3 раза за счет слабо флуоресцирующей основной клеточной фракции (данная фракция почти не содержит разрывов), через 3 часа уровень флуоресценции уменьшается и становится статистически неотличимым от контрольных значений.

Воздействие радиации в дозе 50 сГр от 30 минут до 2 часов незначительно увеличивает уровень флуоресценции гистонов гамма-Н2АХ, что сходится с данными МТТ-теста и свидетельствует о том, что клетки гибнут. Также ИИ вызывает множественные разрывы ДНК в первые несколько минут после воздействия радиации в дозе 50 сГр (Рисунок 21).

4,5 4 3,5

ш 3

5 >

X 2,5

С

гм

Пг 2

_I

и_

1,5 1

0,5

Й II I

15 минут 2 часа

■ контроль ИЗ сГр ■ 10 сГр ■ 50 сГр

Рисунок 21. Влияние малых доз радиации в дозах 3, 10 и 50 сГр на уровень двунитевых разрывов ДНК при культивировании МСК. Метод проточной цитофлуориметрии. Антитела к гистону гамма-Н2АХ конъюгировали с FITC. * - пробы достоверно отличаются от контроля.

Метод проточной цитометрии не всегда точно показывает реальное повреждение клеточной ДНК, так как он оценивает среднее содержание гистонов гамма-Н2АХ в клетке [148]. Поэтому результаты, полученные методом проточной цитометрии, подтвердили методом флуоресцентной микроскопии (Рисунок 22). Количество гамма-фокусов в клетках возрастает в 2 раза через 20 минут после воздействия радиации в дозах 3 сГр и 10 сГр и снижается через 2 часа (при действии 10 сГр наблюдается более выраженный эффект). Радиация в дозе 3 сГр и 10 сГр запускают адаптивные механизмы, тогда как действие радиации в дозе 50 сГр приводит к накоплению нерепарируемых ДР ДНК, вследствие чего происходит увеличение апоптотических телец, содержащих значительное количество, гамма-фокусов.

0

контроль 10 сГр ю сГр 50 сГр

15 минут 2 часа 15 минут

Рисунок 22. Визуализация методом флуоресцентной микроскопии. Определение уровня DSB (фокусов у-Н2АХ). Ядра клеток (Р1 - красный) у -фокусы (зеленый). Фотографии клеток с-фокусами (зеленый) для популяций МСК (контроль) и МСК (10 сГр).

Таким образом, показано, что ИИ в дозе 10 сГр вызывает наиболее выраженный эффект в культуре МСК, вызывая многочисленные двунитевые разрывы ДНК через 20 минут, а их снижение через 2 часа, что может свидетельствовать как об активации системы репарации и адаптивного ответа, так и о гибели клеток.

3.1.8. Малые дозы радиации (3 сГр, 10 сГр) активируют системы

репарации ДНК в МСК.

При действии малых доз радиации в МСК повышается число двунитевых разрывов, но одновременно происходит активация репарации ДНК, что приводит к снижению числа разрывов в клетке.

BRCA1 и BRCA2 принимают участие в репарации поврежденной ДНК или, если ДНК не может быть восстановлена, разрушают клетки. Они участвуют в восстановлении хромосомного повреждения и играют важную роль в безошибочном восстановлении двухцепочечных разрывов ДНК [266].

Через 30 минут после воздействия на МСК малыми дозами радиации в дозе 3 сГр и 10 сГр повышается уровень экспрессии гена БЯСЛ1 - в 2,2 и 3,5 раз, соответственно. Через 2 часа уровень экспрессии гена остается повышенным в 2 и 2,5 раза, соответственно.

Уровень экспрессии гена БЯСА2 изменяется аналогичным образом. После действия 3 и 10 сГр радиации через 30 минут уровень экспрессии гена БЯСА2 возрастает в 2,2 и 3,5 раза. После действия радиации в дозе 3 сГр уровень экспрессии гена БЯСА2 повышен в 1,8 раз через 2 часа по отношению к контролю. Действие радиации в 10 сГр через 2 часа вызывает статистически неотличимое от контрольных значений повышение уровня экспрессии гена БЯСА2 (в 1,9 раз). Доза радиации в 50 сГр не оказывает значимого результата на уровень экспрессии генов БЯСА1 и БЯСА2.

Результаты, полученные исследованием уровня экспрессии генов, также подтверждали и на уровне белков. Уровни экспрессии белка BRCA2 показаны на гистограммах распределения (Рисунок 23).

А

Б

В

3,5

ш ^

и >

гС С и

ОС

со

2,5

1,5

0,5

15 минут

2 часа

■ контроль 13 сГр ■ 10 сГр ■ 50 сГр

Рисунок 23. Анализ уровня экспрессии белка BRCA2 в МСК во время культивирования при действии радиации в дозах 3, 10, 50 сГр. Метод проточной цитофлуорометрии. Антитела к BRCA2, коньюгированные с FITC. R - субпопуляция клеток с высоким уровнем флуоресценции FITC, Б -

3

2

1

0

уровень экспрессии белка BRCA2. В - зависимость между уровнем BRCA2 и уровнем двунитевых разрывов в клетке (H2AX) при действии радиации в дозе 10 сГр. * -достоверно отличаются от контроля.

Сильно флуоресцирующая субпопуляция клеток - R. После действия 3 и 10 сГр радиации через 30 минут уровень белка BRCA2 субпопуляции R увеличивается в 1,5 и 2,7 раз (Рисунок 23 Б). После действия 3 сГр радиации через 2 часа уровень экспрессии BRCA2 всё ещё повышен в 2-2,3 раза, после действия ИИ в дозе 10 сГр через 2 часа общий уровень экспрессии снижается, но все еще остается повышенным в 1,5 раз (Рисунок 23 Б). Доза радиации 50 сГр не оказывает значимого эффекта на уровень экспрессии BRCA2.

Мы показали, что между уровнем BRCA2 и образованием двунитевых разрывов в клетке (уровнем гамма-Н2АХ-фокусов) существует корреляция. Полученные данные демонстрируют эффективность репарации ДНК при воздействии малых доз радиации (Рисунок 23 В).

Таким образом, можно сделать выводы, что в клетке повышается число двунитевых разрывов при действии малых доз радиации (3 сГр и 10 сГр) и одновременно происходит активация репарации ДНК, что способствует уменьшению числа разрывов ДНК в клетке. Действие радиации в дозе 10 сГр наиболее сильно демонстрирует образование быстро репарируемых разрывов в то время, как доза радиации 50 сГр не активирует репарацию ДНК, что может быть причиной гибели части клеток с множественными повреждениями. 3.1.9. Снижение пролиферативной активности и блокировка клеточного цикла МСК, вызванные малыми дозами радиации

Вызванный вследствие облучения клеток окислительный стресс повреждает хроматин ядер клеток, сопровождающийся впоследствии остановкой клеточного цикла и блокированием пролиферации. Методом проточной цитофлуориметрии проведен анализ влияния радиации в малых дозах на количество пролиферирующих МСК с использованием антител к

маркерам пролиферации Кь67 и РСКА (которые экспрессируются на протяжении всего клеточного цикла всеми типами клеток).

Уровень экспрессии Кь67 при действии малых доз радиации снижается через 30 минут на 40-50%; и возрастает через 2 часа после действия радиации, все еще оставаясь сниженным на 20-30% (Рисунок 24).

А

Б

1,2

Ч

* 1 х

I-

о

гС ю £ 0,8

<и ю

0,6

и <и о.

| 0,4

т

л

х

<и

ей

о 0,2

.

>

20 минут 2 часа

I контроль ИЗ сГр ■ 10 сГр ■ 50 сГр

Рисунок 24. Анализ пролиферативной активности МСК при действии малых доз радиации методом проточной цитофлуометрии. А - Содержание ДНК в популяции МСК: соответствует G1-, Б- и G2/M- фазам клеточного цикла. Б -Уровень экспрессии Кь67 при действии 3, 10 и 50 с Гр радиации. * -достоверное отличие от контроля.

0

Воздействие радиации в дозе 3 сГр приводит к падению уровня РСКА в МСК на 15-20%. При действии радиации в дозах 10 сГр и 50 сГр на МСК, получены результаты экспрессии белка РСКА отличные от белка Кь67. Через 20 минут после воздействия радиации в дозе 10 сГр и 50 сГр наблюдалось повышение уровня экспрессии белка РСКА на 40-60 %. РСКА является фактором транскрипции полимеразы дельта, принимающей участие и в репарации ДНК, полученные различия при действии радиации в малых дозах объясняются тем, что идёт усиление процесса репарации на фоне падения пролиферативной активности клеток в результате ареста клеточного цикла. После действия радиации 10 сГр и 50 сГр через 2-6 часов данные об изменении экспрессии маркеров пролиферации Кь67 и РСКА совпадали.

Далее провели сравнительный анализ содержания ДНК в ядрах клеток и уровня белка Ю-67 (Рисунок 24 А, Б). МСК на стадии субконфлуэнтности можно разделить на 4 типа: гиподиплоидные клетки (subG1); клетки с диплоидным количеством ДНК ^0Ю1); клетки, содержащие >2п количества ДНК клетки, имеющие удвоенное количество ДНК 4п ^2/М). Через 30 минут в облученных малыми дозами радиации МСК повышается количество клеток в фазе G1 и G2, то есть наблюдается G1-, и G2/M-арест клеточного цикла., наиболее ярко выраженный при действии 50 сГр радиации (Рисунок 24). Повреждение ДНК может запускать регуляторные механизмы, которые регулируют арест клеточного цикла, необходимый для обеспечения репарации повреждений.

Во время инициирования клеточного цикла происходит активация белка циклина D1, кодируемого геном CCND1. Циклин D1 запускает фазу G1 и регулирует смену фазы G1 на фазу S. Экспрессия генов CDKN1A и CDKN2 может приводить к остановке клеточного цикла на фазе G1.

Снижение уровня экспрессии гена CCND1 в МСК при действии малых доз радиации (3, 10 и 50 сГр) происходит на 30-40%, а повышение уровня экспрессии генов CDKN1A и CDKN2 - в 1,5-2 раза, что также свидетельствует

о кратковременной остановке клеточного цикла. Через 2 часа после действия малыми дозами радиации на МСК уровень экспрессии гена CCND1 повышается на 10-20% относительно контроля, а уровень экспрессии генов CDKN1A и CDKN2 снижается, достигая контрольных значений, что свидетельствует о продолжении клеточного цикла.

Таким образом, воздействие малых доз радиации в значительной части ранее пролиферирующих клеток кратковременно блокирует клеточный цикл в G1- и G2-фазе, что обеспечивает время для репарации повреждений, затем прогрессия клеточного цикла возобновляется.

3.1.10. Активация антиапоптотического ответа в МСК, вследствие воздействия малых доз радиации (3 сГр и 10 сГр)

Апоптоз оценивают на разных стадиях с помощью маркеров апоптоза. Аннексин-5 - один из таких маркеров, он относится к маркерам раннего апоптоза. С его помощью оценивали количество клеток с признаками апоптоза после воздействия радиации в малых и средних дозах (Рисунок 25). Через 20 минут после действия малых (3 сГр, 10 сГр) и средних (50 сГр) доз радиации в МСК наблюдаются признаки апоптоза - фракция апоптотических клеток возрастает в 2-2,5 раза. После действия малых доз радиации через 2 часа в МСК снижается уровень апоптоза до контрольных значений (при действии 3 сГр) и статистически значимо ниже контрольных значений (при действии 10 и 50 сГр) (Рисунок 25).

Показали, что результаты, полученные при измерении уровня апоптоза счетчиком клеток, такие же, как и при окраске клеток пропидий йодидом и анексином 5 - FITC. Через 10 минут после воздействия 10 сГр радиации количество апоптотических клеток в популяции МСК возрастает в 3 раза, количество погибших клеток - в 4 раза; после действия на МСК 10 сГр радиации через 3 часа уровень апоптотических клеток снижается в 3 раза по сравнению с контролем.