Влияние экзогенных и эндогенных факторов на продукцию цитокинов клетками крови и Human Leukemia Differentiation Factor на дифференцировку злокачественных клеток при заболеваниях молочной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Давлетова Кристина Игоревна

• Давлетова Кристина Игоревна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Давлетова Кристина Игоревна

Введение

1. Регуляторы функциональной активности клеток в патогенезе злокачественных новообразований (обзор литературы)

1.1.1. Функциональные характеристики и механизмы действия цитокинов

1.1.2. Биологические эффекты цитокинов и модели иммунного ответа при злокачественных новообразованиях

1.2. Функциональные характеристики поликлональных активаторов

1.3. Human Leukemia Differentiation Factor и его роль в патологических процессах

1.4. Раково-эмбриональный антиген и его влияние на клетки при злокачественных новообразованиях

1.5. Внеклеточный матрикс в патогенезе злокачественной прогрессии

1.6. Современные возможности и перспективы дифференцирующей терапии

2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Определение уровня продукции цитокинов IL-1ß, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, IFN-y, G-CSF, GM-CSF, VEGF и MCP-1 в супернатантах клеток крови

2.2.2. Оценка влияния Human Leukemia Differentiation Factor на дифференцировку клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы

2.2.3. Оценка патогистологических параметров внеклеточного матрикса

2.2.4. Статистический анализ данных

3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1.1. Влияние поликлональных активаторов на цитокин-продуцирующую активность клеток крови больных инвазивной карциномой неспецифического типа и незлокачественными заболеваниями молочной железы

3.1.2. Влияние Human Leukemia Differentiation Factor на цитокин-продуцирующую активность клеток крови больных инвазивной карциномой неспецифического типа

и незлокачественными заболеваниями молочной железы

3.1.3. Влияние раково-эмбрионального антигена на цитокин-продуцирующую активность клеток крови больных инвазивной карциномой неспецифического типа

и незлокачественными заболеваниями молочной железы

3.2. Влияние Human Leukemia Differentiation Factor на дифференцировку и митотическую активность клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы

3.3. Взаимосвязь между дифференцировкой клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы под влиянием Human Leukemia Differentiation Factor и показателями продукции цитокинов клетками крови

3.4. Взаимосвязь между показателями продукции цитокинов клетками крови и патогистологическими параметрами внеклеточного матрикса при инвазивной карциноме неспецифического типа и незлокачественных заболеваниях молочной

железы

Заключение

4. Выводы

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Рак молочной железы является самой распространенной злокачественной патологией среди женщин [1]. Несмотря на современные диагностические и фармакотерапевтические достижения в раннем выявлении и лечении рака молочной железы, метастатическая прогрессия остается основной причиной смерти у этих больных [2,3]. Установлено, что в 25-50% случаев неметастатического рака молочной железы, даже на фоне адъювантной (послеоперационной) терапии, в дальнейшем развивается диссеминированная форма заболевания, спустя десятилетия после постановки диагноза и хирургического удаления первичной опухоли [4-6]. Считается, что метастазы в лимфатические узлы служат, своего рода, маркерами агрессивного характера рака молочной железы, а также предикторами возникновения отдаленных метастазов [4,7,8].

Между тем, рак молочной железы, являясь гетерогенным заболеванием, включает в себя множество молекулярно-генетических, иммунологических и морфологических подтипов [1,9]. Большинство случаев возникновения рака молочной железы (около 70%) считают спорадическими [6,10]. Генетически детерминированный рак молочной железы связан с мутациями в генах высокой (BRCA1, BRCA2, PTEN и TP53), средней (CHEK2, ATM, BRIP1, PALB2 и RAD51C) и низкой (более 180 идентифицированных локусов) пенетрантности [10-12]. В то же время, для большинства случаев семейного рака молочной железы, генетический фон остается неясным [10].

Злокачественные и незлокачественные заболевания молочной железы имеют общие этиологические факторы и патогенетические механизмы, что обуславливает идентичность факторов риска для развития этих заболеваний [13,14]. Образ жизни, факторы окружающей среды, гормональный фон и наследственная предрасположенность непосредственно связаны с риском возникновения как злокачественных, так и незлокачественных заболеваний молочной железы [15,16].

Согласно литературным данным, незлокачественные заболевания молочной железы существенно повышают риск развития злокачественного новообразования, на основании чего их можно разделить на две группы [17-20]. Первая группа - заболевания с низким риском злокачественной трансформации: непролиферативная форма фиброзно-кистозной болезни и фиброаденома [17,18]. Вторая группа - заболевания с высоким риском злокачественной трансформации: пролиферативная форма фиброзно-кистозной болезни, склерозирующий аденоз, радиальный рубец, атипичная протоковая и атипичная дольковая гиперплазия [19,20]. Стоит отметить, что формулировка «заболевания с низким/высоким риском злокачественной

трансформации» является весьма условной, так как не установлено, действительно ли происходит малигнизация имеющихся незлокачественных заболеваний молочной железы, или же данные патологии являются фоном, способствующим возникновению злокачественной опухоли [15]. Что касается предраковых заболеваний молочной железы, то по классификации опухолей молочной железы Всемирной организации здравоохранения 2012 года, к ним относят только две нозологии: протоковая карцинома in situ и дольковая карцинома in situ, однако их своевременная диагностическая выявляемость составляет, по разным данным, от 3% до 25% [21,22].

Одним из важнейших регуляторов опухолевой прогрессии считают иммунную систему, а факторами, отражающими ее функциональное состояние, являются цитокины [23,24]. Именно через цитокиновую сеть атипичные клетки перепрограммируют иммунную систему, способствуя их ускользанию от иммунного надзора [25]. Основным компонентом опухолевого микроокружения и резервуаром для цитокинов с матрикринным типом действия является внеклеточный матрикс [24]. Цитокины, продуцируемые клетками опухоли и ее микроокружения, в частности - клетками иммунной системы, связываются с протеогликанами внеклеточного матрикса и сохраняются в неактивной форме до момента воздействия металлопротеиназ [23]. При разрушении белков внеклеточного матрикса происходит выброс накопленных цитокинов, которые могут способствовать или препятствовать злокачественной прогрессии [24].

Биологические эффекты цитокинов во многом зависят от воздействия на них экзогенных и эндогенных факторов [26-28]. К эндогенным факторам относятся: Human Leukemia Differentiation Factor (HLDF) и раково-эмбриональный антиген. HLDF был получен в институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН из культуральной среды клеток острого промиелоцитарного лейкоза человека HL-60. HLDF индуцирует дифференцировку исходной клеточной линии по гранулоцитарному пути [29]. Поскольку нарушение дифференцировки клеток является центральным аспектом онкогенеза, изучение факторов, обладающих дифференцирующей активностью, представляет значительный интерес. Согласно концепции дифференцирующей терапии, факторы, влияющие на процессы клеточной дифференцировки, могут обеспечить реверсию злокачественного фенотипа в незлокачественный [26,29]. Учитывая вышесказанное, актуальным является изучение влияния HLDF на клетки злокачественного новообразования и цитокин-продуцирующую активность клеток крови.

Механизмы, обеспечивающие ускользание атипичных клеток от иммунного надзора, обладают структурно-функциональными сходствами с процессами, происходящими в эмбриональном периоде [30]. Во многом это сходство обусловлено схожим антигенным составом злокачественных опухолей и эмбриона [31]. Одним из опухоль-ассоциированных антигенов, который также относится к онкофетальным антигенам, является раково-эмбриональный антиген [30,31]. Поскольку формирование клеточной атипии начинается еще при незлокачественных заболеваниях молочной железы, особый интерес представляет изучение влияния раково-эмбрионального антигена на продукцию цитокинов клетками крови не только у больных раком молочной железы, но и у больных незлокачественными заболеваниями молочной железы с различным риском злокачественной трансформации.

К экзогенным факторам относятся поликлональные активаторы, представляющие собой комплекс митогенов, в состав которых входят: фитогемагглютинин Р, фитогемагглютинин М, конканавалин А и липополисахарид из Escherichia coli. Данный комплекс митогенов обеспечивает наиболее эффективную неспецифическую стимуляцию продукции цитокинов клетками цельной периферической крови [32].

Учитывая вышесказанное, акутальным является изучение функциональной активности клеток крови, в частности, их способности к продукции цитокинов под влиянием экзогенных и эндогенных факторов, а также оценка влияния HLDF на клетки злокачественного новообразования при заболеваниях молочной железы.

Цель исследования

Изучить in vitro влияние поликлональных активаторов, Human Leukemia Differentiation Factor и раково-эмбрионального антигена на продукцию цитокинов клетками крови и Human Leukemia Differentiation Factor на дифференцировку злокачественных клеток при инвазивной карциноме неспецифического типа и незлокачественных заболеваниях молочной железы.

Задачи исследования

1. Определить уровень продукции цитокинов IL-1ß, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, IFN-y, G-CSF, GM-CSF, VEGF и MCP-1 в супернатантах клеток крови, инкубированных с поликлональными активаторами, Human Leukemia Differentiation Factor и раково-эмбриональным антигеном у больных инвазивной карциномой неспецифического типа и незлокачественными заболеваниями молочной железы в зависимости от возраста, наличия лимфогенных метастазов и молекулярно-генетического подтипа опухоли.

2. Оценить влияние Human Leukemia Differentiation Factor на дифференцировку клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы.

3. Изучить взаимосвязь между показателями продукции цитокинов клетками крови и влиянием Human Leukemia Differentiation Factor на дифференцировку клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы.

4. Изучить взаимосвязь между показателями продукции цитокинов клетками крови и патогистологическими параметрами внеклеточного матрикса при инвазивной карциноме неспецифического типа и незлокачественных заболеваниях молочной железы.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что при заболеваниях молочной железы после 60 лет снижается индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-2 и IL-17 клетками крови у больных инвазивной карциномой неспецифического типа и индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-2, IL-10, IL-17 и IFN-y у больных незлокачественными заболеваниями. Показано, что при метастазировании в регионарные лимфатические узлы инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы снижается индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1ß клетками крови у больных в возрастной группе до 60 лет, индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1Ra, IL-6, IL-8, G-CSF и GM-CSF у больных в возрастной группе 60 лет и старше, а также индекс влияния Human Leukemia Differentiation Factor на продукцию IL-1ß, IL-6, TNF-a и G-CSF независимо от возраста больных. Впервые установлены особенности, характерные только для люминального B НЕЯ^-позитивного молекулярно-генетического подтипа. Этот молекулярно-генетический подтип характеризуется наиболее высокими значениями индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1Ra, IL-6, IL-8 и IFN-y клетками крови, по сравнению с другими молекулярно-генетическими подтипами. Показано, что у больных незлокачественными заболеваниями молочной железы с высоким риском злокачественной трансформации снижается индекс влияния раково-эмбрионального антигена на продукцию IL-6 и IL-8 клетками крови и повышается индекс влияния раково-эмбрионального антигена на продукцию IL-10, по сравнению с больными незлокачественными заболеваниями с низким риском злокачественной трансформации.

Впервые установлено, что Human Leukemia Differentiation Factor приводит к снижению относительного содержания низкодифференцированных клеток и увеличению относительного содержания высокодифференцированных клеток инвазивной карциномы неспецифического

типа молочной железы in vitro. Показано, что значения индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию VEGF клетками крови можно использовать для оценки реакции злокачественных клеток на воздействие Human Leukemia Differentiation Factor in vitro.

Впервые показано, что при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы значения индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1ß, IL-1Ra, IL-6 и G-CSF клетками крови находятся в прямой корреляционной связи с относительной площадью дегенеративно-измененных коллагеновых волокон. Впервые показано, что при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы относительная площадь дегенеративно-измененных коллагеновых волокон и коллагеновых волокон с измененными тинкториальными свойствами соответствуют наличию метастазов в регионарных лимфатических узлах.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют расширить современные представления о продукции цитокинов клетками крови под влиянием экзогенных факторов - поликлональных активаторов, и эндогенных факторов - Human Leukemia Differentiation Factor и раково-эмбрионального антигена в зависимости от заболевания молочной железы, возраста больных, а также молекулярно-генетического подтипа опухоли. Установлено, что влияние Human Leukemia Differentiation Factor in vitro заключается в снижении относительного содержания низкодифференцированных клеток и увеличении относительного содержания высокодифференцированных клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы.

Полученные результаты могут использоваться в качестве основы для создания дополнительных методов дооперационной диагностики наличия метастазов инвазивной карциномы неспецифического типа в регионарных лимфатических узлах и диагностики незлокачественного заболевания молочной железы с высоким риском злокачественной трансформации. Влияние Human Leukemia Differentiation Factor на дифференцировку клеток in vitro позволяет рассматривать этот фактор в качестве кандидата для дифференцирующей терапии инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы.

Методология и методы исследования

Объект исследования - периферическая кровь и образцы опухоли больных инвазивной карциномой неспецифического типа и незлокачественными заболеваниями молочной железы. Предмет исследования - продукция цитокинов клетками крови под влиянием поликлональных

активаторов, Human Leukemia Differentiation Factor и раково-эмбрионального антигена при заболеваниях молочной железы; дифференцировка клеток инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы под влиянием Human Leukemia Differentiation Factor; состояние патогистологических параметров внеклеточного матрикса при заболеваниях молочной железы. Методы исследования: твердофазный иммуноферментный анализ, гистохимический метод, морфометрический анализ, статистический анализ. Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации. Все лица, участвующие в исследовании, дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование одобрено комитетом по этике Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики подразделения Федерального исследовательского центра фундаментальной и трансляционной медицины (протокол №3, 2016).

Положения, выносимые на защиту

1. При заболеваниях молочной железы в возрастной группе 60 лет и старше, по сравнению с больными до 60 лет, снижается индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-2 и IL-17 клетками крови больных инвазивной карциномой неспецифического типа и индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-2, IL-10, IL-17 и IFN-y клетками крови больных незлокачественными заболеваниями.

2. Больные инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы с метастазами в регионарных лимфатических узлах, по сравнению с больными без метастазов, характеризуются снижением индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1ß клетками крови в возрастной группе до 60 лет, снижением индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1Ra, IL-6, IL-8, G-CSF и GM-CSF в возрастной группе 60 лет и старше, а также снижением индекса влияния Human Leukemia Differentiation Factor на продукцию IL-1ß, IL-6, TNF-a и G-CSF независимо от возраста больных.

3. Люминальный B HER2-позитивный молекулярно-генетический подтип инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы характеризуется наиболее высокими значениями индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1Ra, IL-6, IL-8 и IFN-y клетками крови, по сравнению с другими молекулярно-генетическими подтипами.

4. У больных незлокачественными заболеваниями молочной железы с высоким риском злокачественной трансформации снижается индекс влияния раково-эмбрионального антигена на продукцию IL-6 и IL-8 клетками крови и повышается индекс влияния раково-

эмбрионального антигена на продукцию IL-10, по сравнению с больными незлокачественными заболеваниями с низким риском злокачественной трансформации.

5. Влияние Human Leukemia Differentiation Factor in vitro заключается в снижении относительного содержания низкодифференцированных клеток и увеличении относительного содержания высокодифференцированных клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы.

6. При инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы значения индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1P, IL-1Ra, IL-6 и G-CSF клетками крови находятся в прямой корреляционной связи с относительной площадью дегенеративно-измененных коллагеновых волокон, которая вместе с относительной площадью коллагеновых волокон с измененными тинкториальными свойствами соответствует наличию метастазов в регионарных лимфатических узлах.

Степень достоверности и апробация результатов

Высокая достоверность полученных результатов определяется достаточным объемом материала исследования, использованием стандартизованных наборов реагентов, а также методами статистической обработки полученных результатов. По материалам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах включенных в Перечень ВАК, из которых 2 статьи входят в базу данных Scopus и 1 статья в базу данных Web of Science. Получен 1 патент на изобретение. Основные положения работы доложены в виде устных и стендовых докладов и обсуждены на российских и международных конференциях: Пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (Москва, Россия, 2019); «Актуальные проблемы клеточной биологии и клеточных технологий» (Санкт-Петербург, Россия 2019); «Авиценна» (Новосибирск, Россия, 2019); «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology» (Novosibirsk, Russia, 2020).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние экзогенных и эндогенных факторов на продукцию цитокинов клетками крови и Human Leukemia Differentiation Factor на дифференцировку злокачественных клеток при заболеваниях молочной железы»

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 10 рисунков и 36 таблиц. Библиография содержит 280 литературных источников.

Вклад автора

Результаты, представленные в диссертационном исследовании, получены самим автором или при его непосредственном участии. Автор выражает особую признательность своему научному руководителю профессору, д.б.н. Аутеншлюсу А.И. за идеологическое планирование работы и конструктивное обсуждение полученных результатов. Отдельную благодарность автор выражает д.м.н. Жураковскому И.П. и Михайловой Е.С. за помощь в основении методов исследования.

1. Регуляторы функциональной активности клеток в патогенезе злокачественных

новообразований (обзор литературы)

1.1.1. Функциональные характеристики и механизмы действия цитокинов

Цитокины представляют собой полипептидные регуляторы биологической активности клеток, имеющие молекулярную массу от 5 до 30 кДа [33,34,35]. В настоящее время идентифицировано около 300 подобных веществ, участвующих в широком спектре биологических процессов как эмбрионального, так и постэмбрионального периода, основными из которых являются процессы пролиферации, дифференцировки, миграции, адгезии и клеточной гибели, а также реакции клеточного и гуморального иммунного ответа [35,36]. Эффекты, оказываемые цитокинами, можно подразделить на следующие группы: генотропные (регуляция экспрессии генов), метаботропные (регуляция метаболических процессов), ионотропные (регуляция потока ионов через плазматическую мембрану), редоксотропные (регуляция окислительно-восстановительного потенциала клетки), митотропные (регуляция клеточного цикла, в частности пролиферативной активности клеток), морфогенные (регуляция пролиферации и дифференцировки клеток), мотогенные (регуляция активности цитоскелета, в частности миграции клеток), трофотропные (обеспечение клеток и тканей питательными веществами), цитопротективные (регуляция механизмов репарации ДНК и регенерации клеток), а также эффекты, опосредующие программы клеточной гибели [37,38].

Одними из важнейших функциональных характеристик цитокинов являются плейотропность (полифункциональность) и избыточность биологического действия, в результате которых многие цитокины обладают сходными регуляторными эффектами [35,38]. Одни и те же цитокины в зависимости от концентрации и наличия острого или хронического воспалительного процесса могут оказывать по отношению друг к другу как антагонистическое или синергическое, так и модуляционное воздействие, что увеличивает разнообразие биологических ответов и обеспечивает универсальность цитокиновой сигнальной системы, каскадность ее действия и функционирование по принципу сети [39-42]. Большинство цитокинов являются индуцибельными, другие же производятся конститутивно [40,41]. Некоторые продуцируются в виде процитокинов и требуют воздействия ферментного комплекса для их активации [39,42]. Участвуя в формировании иммунного ответа, цитокины не обладают антигенной специфичностью [39].

Несмотря на то, что основными продуцентами цитокинов являются клетки иммунной системы, к их производству способны эпителиальные, мезенхимальные, эндотелиальные, мышечные и нервные клетки, а также злокачественные клетки различных новообразований

[39,43]. Было установлено, что в крови дополнительными динамическими резервуарами цитокинов являются тромбоциты и эритроциты [44,45]. При злокачественных новообразованиях, имеющиеся в крови, циркулирующие опухолевые клетки, также влияют на уровень цитокинов, способствуя злокачественной прогрессии [46,47]. Интересным, хотя и дискутабельным является тот факт, что активированные тромбоциты осуществляют не только секрецию, но и продукцию цитокинов, несмотря на отсутствие ДНК (биологически активные вещества синтезируются на матрицах мРНК) [44,45]. Что касается эритроцитов, то они не являются продуцентами цитокинов, однако их инкубация в кондиционной среде существенно повышает секрецию цитокинов (как и для тромбоцитов) [44,45]. Показано, что комплекс поликлональных активаторов, применяемый для индукции цитокинообразования в цельной периферической крови, оказывает влияние лишь на мононуклеарные и полинуклеарные клетки крови [32]. Таким образом, оценивая продукцию цитокинов клетками периферической крови по индексу влияния поликлональных активаторов, удается получить результат, отражающий функциональную активность основных продуцентов цитокинов (лейкоцитов), нивелируя влияние клеток, являющихся цитокиновыми резервуарами [32,48]. Также определение индекса влияния поликлональных активаторов позволяет избежать ошибок, связанных с различным количеством цитокин-продуцирующих клеток и их функциональной активностью, которые сопутствуют возрастным изменениям и хроническим заболеваниям с вялотекущими воспалительными процессами [32,49,50].

Действие цитокинов может реализовываться различными путями взаимодействия (Рисунок 1): интракринно (внутри клетки-продуцента через внутриклеточные рецепторы), аутокринно (внутри клетки-продуцента через поверхностные клеточные рецепторы) или интеркринно (на расстоянии от клетки-продуцента локально или дистально) [34,37,38,51]. К интеркринному пути относятся следующие подтипы. Паракринный - клетки-мишени находятся в непосредственной близости от клеток-продуцентов и могут взаимодействовать через растворимые или мембранно-связанные рецепторы (последний вариант известен как юкстакринный) [38,51]. Также возможна секреция и транспортировка цитокинов путем обмена фрагментов клеточных мембран и мембранных белков между соседними клетками [37,38]. Матрикринный - цитокины, связываясь с протеогликанами внеклеточного матрикса, сохраняются в неактивной форме до момента воздействия металлопротеиназ, разрушающих белки внеклеточного матрикса [52-54]. И наконец, эндокринный - цитокины действуют на расстоянии от клеток-продуцентов, транспортируясь к клеткам-мишеням через кровеносное или лимфатическое русло [27,34,38].

Рисунок 1 - Основные механизмы клеточного взаимодействия [38]

Спорным остается вопрос классификации цитокинов [35,38,55-60]. На данный момент не существует единой номенклатуры, полностью отражающей с биохимической точки зрения их многочисленные структурные и функциональные особенности [35,56]. Существующие в настоящее время классификации базируются на строении самих цитокинов, их рецепторов или на функциональной активности семейств, что будет изложено в разделе 1.1.2 в отношении цитокинов, продукция которых была исследована.

1.1.2. Биологические эффекты цитокинов и модели иммунного ответа при злокачественных новообразованиях

Важнейшая роль отводится цитокинам в процессах злокачественной трансформации клеток [61-63]. В зависимости от состояния иммунобиологической среды цитокины могут оказывать как стимулирующее, так и супрессирующее влияние на атипичные клетки (Рисунок 2) [28,61,62,64].

Рисунок 2 - Иммунное микроокружение инвазивной карциномы неспецифического типа

молочной железы [28]

Основным фактором, способствующим возникновению, а также препятствующим уничтожению атипичных клеток является наличие хронического воспалительного процесса, сопровождающего дисфункциональными иммунными ответами, в частности дисбалансом цитокиновой регуляции [23,27,44,49]. Продуцируемые во время хронического воспаления IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-18, TNF-a, VEGF и MCP-1 оказывают преимущественно провоспалительное действие, способствуя устойчивой канонической (классической) гиперактивации транскрипционных факторов NF-kB и STAT3, стимулирующих пролиферативную и уменьшающих апоптотическую активность клеток, инициируя тем самым образование и накопление клеточной атипии [27,63-65]. Данные факторы в дальнейшем способствуют реализации инвазивного и метастатического потенциала злокачественных клеток, в частности, за счет индукции ангиогенеза и эпителиально-мезенхимального перехода III типа [52,59,66-68]. Стоит отметить, что наличие системного хронического воспалительного процесса слабой степени является характерным для пожилых людей [49,69,70]. Реализация заложенной генетически программы старения является причиной иммуносенесценции - физиологической дисфункции иммунной системы, ассоциированной с возрастом [69-72]. Возрастная дисфункция иммунной системы проявляется уменьшением функциональной активности и снижением

количества различных субпопуляций Т-клеток, а также КК-клеток, дендритных клеток и макрофагов, которые играют ключевую роль в реализации противоопухолевого иммунного ответа [69,70,72,73]. Еще одним процессом, непосредственно связанным с иммуносенесценцией и хроническим воспалением является индукция секреторного фенотипа, ассоциированного со старением - SASP, который проявляется повышенной секрецией около 75 цитокинов, основными из которых являются ГЬ-1р, ГЬ-6, ГЬ-8, ГЬ-10, G-CSF и GM-CSF, что поддерживает низкую степень адаптивного иммунного ответа (Рисунок 3) [49,69,74,75]. Фенотип SASP, индуцируемый преимущественно транскрипционным фактором КР-кБ, может способствовать опухолевой прогрессии, перепрограммируя опухолевое микроокружение в иммуносупрессивное состояние, которое является благоприятным для роста злокачественного новообразования (Рисунок 4) [49,76]. SASP-ассоциированные фибробласты способствуют ремоделированию внеклеточного матрикса, обеспечивая инвазию и миграцию опухолевых клеток [69,77,78].

Рисунок 3 - Регуляция секреторного фенотипа, ассоциированного со старением (SASP) [75]

Примечание: Путь cGAS-STING является основным регулятором SASP. Различные повреждающие агенты, например ROS, вызывают накопление фрагментов цитоплазматического хроматина в стареющих клетках. Поврежденные митохондрии выделяют мтДНК в цитоплазму. Ряд последовательных реакций приводит к фосфорилированию IRF3 и активации NF-kB. Эти факторы транскрипции проникают в ядро и вызывают экспрессию ряда цитокинов с воспалительным действием.

Рисунок 4А

Рисунок 4Б

Рисунок 4 - Противоопухолевые и проопухолевые эффекты факторов секреторного фенотипа,

ассоциированного со старением (SASP) [76] Примечание: А) В реализации противоопухолевого иммунного ответа факторы SASP способствуют миграции клеток врожденного иммунитета в микроокружение опухоли, чтобы обеспечить лизис стареющих и атипичных клеток; Б) Проопухолевое и иммуносупрессирующее действие факторов SASP, проявляется в привлечении в микроокружение опухоли MDSC для ослабления цитотоксического действия КК-клеток и Т-клеток. Кроме того, ГЬ-10 и PGE2, секретируемые клетками опухоли и клетками ее микроокружения, усиливают состояние иммуносупрессии в опухолевой микросреде.

Еще одним физиологическим процессом, вовлеченным в комплекс происходящих с макроорганизмом возрастных изменений, является наступление менопаузального и постменопаузального периода [79-83]. В настоящее время имеется большое количество данных, свидетельствующих об увеличении количества цитокинов с провоспалительным действием на фоне снижения функции яичников [79,80]. Наибольшее внимание уделяется ГЬ-1, ГЬ-6, ГЬ-8,

Т№-а и МСР-1 [84-86]. Дефицит эстрогена повышает чувствительность клеток молочной железы к некоторым из этих цитокинов, особенно к ГЬ-6 и ГЬ-8, которая обусловлена увеличением количества рецепторов к цитокинам и усилением действия их кофакторов [59,84,85]. Механизмы, с помощью которых эстроген вмешивается в активность цитокинов, до сих пор неизвестны, но потенциально они могут включать взаимодействие эстрогена с другими факторами транскрипции, модуляцию активности оксида азота и антиоксидантные эффекты [79,85].

Хронический воспалительный процесс хоть и является основным пусковым фактором возникновения атипичных клеток, но далеко не единственным [13,14,64,86]. Соматические мутации, возникающие спонтанно или под влиянием различных эндогенных и экзогенных биологически активных веществ (канцерогенов, вирусных онкогенов и др.) наряду с предрасполагающим генетическим фоном, особенностями гормонального и иммунного статуса, вносят существенный вклад в возникновение как злокачественных, так и незлокачественных новообразований [6,10,71]. На протяжении всей жизни молочная железа подвергается гормонально-опосредованным непрерывным циклам ремоделирования тканей, которые сопровождаются кратковременными воспалительными процессами [88-90]. Эти процессы также опосредуются различными цитокиновыми эффектами [90,91]. Происходящие во время лютеиновой фазы менструального цикла процессы пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток молочной железы, могут способствовать увеличению количества атипичных клеток, если таковые имеются [90,92]. При состоянии иммунологической толерантности данная фаза будет существенно увеличивать риск возникновения злокачественного новообразования молочной железы [61,92,93]. Поэтому, имеющиеся физиологические особенности, являются одной из причин наиболее быстрой злокачественной прогрессии рака молочной железы у женщин доменопаузального возраста [49,89].

Так или иначе, все вышеперечисленные процессы участвуют в патогенезе злокачественной трансформации, хотя в каждом индивидуальном случае вклад их различен, а первопричина практически никогда не бывает установлена (за исключением генетически детерминированных форм рака молочной железы, обусловленных мутациями в генах BRCA1 и BRCA2) [4,11,28,76]. На Рисунке 5 представлена последовательная схема малигнизации незлокачественного заболевания молочной железы.

Рисунок 5 - Малигнизация незлокачественного заболевания молочной железы [17]

Но как именно происходит отбор атипичных клеток, с прогрессивно увеличивающейся пролиферативной, противоапоптотической, инвазивной и метастатической способностью? На первом этапе взаимодействия иммунной системы с атипичными клетками возникает острый воспалительный ответ, инициируемый клеточными факторами врожденного иммунитета, что, в частности, проявляется выработкой ^N-7 и ГЬ-12, которые, запуская каскад событий, способствуют выработке реагирующих на антигены опухоли Т-клеток (Рисунок 6) [91,94,95]. Непосредственно развитие событий может происходить в двух направлениях - это либо полное уничтожение, либо эволюция и селективный отбор атипичных клеток, избегающих воздействия противоопухолевого иммунитета [61,91,94,96]. В последнем случае воспаление постепенно переходит от острого к хроническому, а атипичные клетки окончательно выходят из-под иммунного надзора [23,64,94]. С этого момента уклонившиеся от иммунного ответа атипичные клетки перепрограммируют клетки своего микроокружения с помощью цитокинов, способствуя, тем самым, злокачественной прогрессии [40,61,94].

Рисунок 6 - Концепция иммуноредактирования злокачественных новообразований [91]

Иммунный ответ определяется совокупностью внутриклеточных и внеклеточных взаимодействий между клетками опухоли и клетками ее микроокружения, обуславливая существование сложной цитокиновой сети [28,39,53]. Как известно, гетерогенное строение злокачественных опухолей молочной железы основано на наличии выраженного внутриопухолевого разнообразия, обеспечивающего различную степень иммуногенности для каждой отдельно взятой опухоли [96-98]. Существующие в настоящее время молекулярно-генетические подтипы рака молочной железы хоть и определяют тактику лечения, однако не дают возможности интерпретировать имеющуюся иммуногенность [9,36,99]. Долгое время рак молочной железы считался неиммуногенным новообразованием, чем также объяснялся низкий ответ на проводимую иммунотерапию [99,100]. Опубликованное в 2018 году исследование, проведенное ^о^оп et а1., содержит информацию о наличии 6 иммунных подтипов, характерных для большинства солидных новообразований, в том числе и для рака молочной железы [25]. Исследователи оценивали экспрессионные профили иммунных клеток, составляющих опухолевое микроокружение [25,101]. Иммуногеномный анализ более 10000 опухолей 33 различных типов рака представляет 6 моделей иммунного ответа, не зависящих от

гистологического строения опухоли, но влияющих на прогноз и являющихся потенциальными мишенями для иммунотерапии [25,102]. Для рака молочной железы наиболее распространенными считаются следующие подтипы: ранозаживляющий (C1), IFN-y доминирующий (C2) и воспалительный (C3). Наиболее благоприятным подтипом, связанным с общей выживаемостью оказался воспалительный (C3), к менее благоприятным отнесли ранозаживляющий (C1) и IFN-y доминирующий (C2), а к самым неблагоприятным - с недостатком лимфоцитов (C4), иммунологически неактивный (C5) и TGF-P доминирующий (C6) [25,103].

C1 - подтип ранозаживляющий (Wound Healing). Характеризуется повышенной экспрессией генов, определяющих высокую ангиогенную и пролиферативную активность [25,103]. Лимфоцитарный инфильтрат смещен в сторону Т-хелперов 2 типа, продуцирующих следующие цитокины: IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 и IL-13 [25,55]. Наиболее часто встречается в генетически-детерминированных случаях раках молочной железы, обусловленных мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, а также в случаях люминального А молекулярно-генетического подтипа. Встречаемость при раке молочной железы 20-25% [25,55,104,105].

C2 - подтип IFN-y доминирующий (IFN-y Dominant). Для данного подтипа характерно преобладание активированных макрофагов 1 типа, над активированными макрофагами 2 типа [25,20,103]. Фенотип макрофагов 1 типа активируется IFN-y и TNF-a, а также молекулярными фрагментами, ассоциированными с неинфекционными (DAMP) и патоген-ассоциированными повреждениями (PAMP) [105,109,110]. Активированные макрофаги 1 типа характеризуются высокой продукцией IL-12, IL-18, TNF-a и низкой продукцией IL-10, а также стимулирующим эффектом на продукцию IL-1P, IL-6 и TNF-a другими клетками иммунной системы [108,110,111]. При C2 подтипе наблюдается высокая степень разнообразия Т-клеточных рецепторов (TCR) и выраженная передача сигналов через трансмембранный гликопротеин CD8. Влияние на пролиферативную активность опухолевых клеток аналогично ранозаживляющему подтипу [25]. IFN-y доминирующий подтип встречается при наличии мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, но в отличие от C1, в данном случае имеется более высокая мутационная нагрузка [25,55]. Что касается молекулярно-генетических подтипов, то около 60% случаев тройного негативного рака молочной железы и 45% случаев с гиперэкспрессией HER2 характеризуются IFN-y доминирующим иммунным ответом, встречаемость которого при раке молочной железы составляет 30-35% [25,102-104].

C3 - подтип воспалительный (Inflammatory). Определяется повышенной экспрессией генов, ассоциированных с Т-хелперами 1 и 17 типа, которые продуцируют IL-2, IL-10, IFN-y,

TNF-a, TGF-P и IL-17, IL-21, IL-22 соответственно [25,60,112]. Уровень пролиферации опухолевых клеток колеблется от низкой до умеренной. Наряду с подтипом C5 имеет наименьшее количество мутаций в злокачественных клетках [25]. Встречается преимущественно при люминальных А и В молекулярно-генетических подтипах. Общая встречаемость при раке молочной железы 15-20% [25,102-104].

C4 - подтип с недостатком лимфоцитов (Lymphocyte Depleted). Ассоциирован со снижением количества Т-хелперов 1 типа и преобладанием активированных макрофагов 2 типа, продуцирующих высокие уровни IL-10, TGF-P и низкие уровни IL-12 [25,113]. Общая встречаемость при раке молочной железы около 10-15% [25,102-104].

C5 - подтип иммунологически неактивный (Immunologically Quiet). Наряду с подтипом C4, отличается повышенной экспрессией генов, отвечающих за реализацию иммунного ответа, связанного с активированными макрофагами 2 типа [25]. Данному подтипу соответствует самый низкий лимфоцитарный и самый высокий макрофагальный иммунный ответ. Встречаемость при раке молочной железы менее 1% [25,102-104].

C6 - подтип TGF-P доминирующий (TGF-P Dominant). Объединяет самые разнообразные иммунологические подтипы, которые невозможно отнести ни к одному из вышеперечисленных [25]. В этом подтипе часто встречается повышенная экспрессия генов ассоциированных с TGF-Р, а также усиленная лимфоцитарная инфильтрация опухоли Т-хелперами 1 и 2 типа. Общая встречаемость при раке молочной железы 5-10% [25,102-104].

IL-1P является членом семейства IL-1 и синтезируется индуцибельно в форме неактивного белка-предшественника, называемого пре-Ш-1р [58,114]. Пре-1Ь-1Р расщепляется ферментом-инициатором воспалительного ответа - цитозольной каспазой 1 с образованием зрелого IL-1P, имеющего молекулярную массу 17,5 кДа [114]. Белок-предшественник продуцируется различными типами клеток, но преимущественно моноцитами и макрофагами [58]. К его синтезу способны лимфоциты, дендритные клетки, NK-клетки, эндотелиальные, мезенхимальные и эпителиальные клетки, а также клетки злокачественных новообразований [114, 115]. IL-1P играет ключевую роль в модуляции как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа, в частности, способствует индукции иммуносупрессивных клеток, что непосредственно связано с патогенезом аутоиммунных и онкологических заболеваний [58, 115]. Известно, что IL-1P влияет на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз иммунных клеток, за счет чего способен как стимулировать (в случае острого воспалительного процесса), так и супрессировать (при хроническом воспалительном процессе) противоопухолевый иммунитет [116]. Интересным представляется тот факт, что дефицит IL-1P способствует злокачественной

трансформации значительно сильнее, нежели его спонтанно высокий уровень [115,117]. С другой стороны, IL-1 стимулируя супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) и поддерживая иммуносупрессивную активность опухоль-ассоциированных макрофагов, способствует подавлению эффективного адаптивного противоопухолевого иммунного ответа [118]. Уровни экспрессии IL-1ß значительно повышаются при злокачественных новообразованиях и регулируются несколькими факторами транскрипции, наиболее важными из которых, при раке молочной железы являются: RAR, AP-1 и NF-kB [114-121]. IL-1ß, секретируемый опухоль-ассоциированными макрофагами, запускает цикл количественного усиления, что приводит к сверхэкспрессии IL-1ß как клетками рака молочной железы, так и клетками микроокружения [114,122]. Активируя путь ROS ^ Src ^ MAPK ^ AP-1 в злокачественных клетках, IL-1ß приводит к повышению уровня COX-2 с последующим синтезом PGE2 [117,119,122]. IL-1ß стимулирует продукцию IL-6, TNF-a и TGF-ß клетками рака молочной железы, а также продукцию IL-8, VEGF и TNF-a опухоль-ассоциированными макрофагами [114-117,123]. IL-1ß индуцирует экспрессию матриксных металлопротеиназ, проангиогенных белков и факторов роста, способствует реализации эпителиально-мезенхимального перехода III типа, содействуя неоваскуляризации и инвазии рака молочной железы [115,120-123]. В настоящее время IL-1ß прицельно рассматривается в качестве мишени для фармакологического вмешательства [114,124]. Блокаторы IL-1 - анакинра и канакинумаб, проходят клинические испытания, как терапевтические агенты для лечения метастатического рака молочной железы [125,126].

IL-1Ra является членом семейства IL-1 и естественным рецепторным антагонистом IL-1ß, регулирует его биологические эффекты [58,114]. IL-1Ra имеет молекулярную массу 25 кДа и продуцируется моноцитами, макрофагами, нейтрофилами, лимфоцитами, эпителиальными, мезенхимальными, нервными клетками, адипоцитами и клетками злокачественных новообразований [115,117]. IL-1Ra не оказывает прямого влияния на опухолевые клетки, реализуя свои биологические эффекты через регуляцию продукции других цитокинов [115,117,118]. IL-1Ra супрессирует продукцию IL-6, IL-8 и VEGF, что приводит к уменьшению пролиферативной активности злокачественных и эндотелиальных клеток [121,123]. В частности, регулируя продукцию IL-6, IL-1Ra учувствует в патогенезе эстроген-зависимого рака молочной железы, оказывая антиметастатическое действие [41,59,115].

IL-2 имеет молекулярную массу 15,42 кДа и относится к семейству цитокинов, в составе которых имеется четыре a-спиральных пучка [127]. IL-2 продуцируется преимущественно активированными Т-клетками, и в меньшей степени - NK-клетками, моноцитами и макрофагами [127,128]. Для рака молочной железы показано, что IL-2 продуцируется

злокачественными клетками, и его продукция значительно возрастает при метастатических формах рака, по сравнению с карциномой is situ [129]. Для высокоаффинного связывания IL-2 с клетками-мишенями необходимы три субъединицы общего рецепторного комплекса: IL-2Ra, IL-2RP и IL-2Ry, для промежуточноаффинного - две субъединицы: IL-2RP и IL-2Ry, в то время как для низкоаффинного - достаточно даже одной субъединицы IL-2Ra, IL-2RP или IL-2Ry, однако низкоаффинное связывание с IL-2Ra не приводит к трансдукции сигнала из-за его короткой внутриклеточной цепи [127,128]. При взаимодействии IL-2 с IL-2RP на мембране клетки образуется комплекс IL-2 с JAK1, а при взаимодействии IL-2 с IL-2Ry - комплекс IL-2 с JAK3. Что касается IL-2Ra, то a-цепь не участвует в передаче сигналов, но способствует значительному увеличению аффинности IL-2RP и IL-2Ry [127-129]. При взаимодействии IL-2 с клеткой-мишенью могут инициироваться следующие сигнальные пути: JAK-STAT, PI3K/Akt/mTOR и MAPK/ERK [128]. IL-2 обладает широким спектром биологической активности: аутокринно и паракринно активирует пролиферацию Т-клеток, В-клеток и NK-клеток, способствует дифференцировке Т-клеток в эффекторные Т-клетки и Т-клетки памяти, а также усиливает секрецию IFN-y Т-клетками, вместе с которым препятствует пролиферативной активности атипичных клеток [130,131]. IL-2 усиливает запрограммированную клеточную гибель, вызванную взаимодействием Fas-рецепторов и Fas-лиганда (AICD), которая обеспечивает поддержку периферической иммунологической толерантности, за счет негативной регуляции активированных Т-клеток [131,132]. Совместно с IL-10, IL-2 проявляет противоопухолевую активность, усиливая выживание и пролиферацию цитотоксических T-клеток [56,128,133,134]. За счет своего иммуномодулирующего и противоопухолевого действия IL-2 используется при лечении меланомы и почечно-клеточного рака, однако его применение при раке молочной железы, в сочетании с другими неоадъювантными и адъювантными лекарственными средствами, не оказало ожидаемого лечебного эффекта [130]. Предполагалось, что терапия рекомбинантной формой IL-2, с учетом его влияния на сохранение гормональной чувствительности, будет полезна для комплексного лечения люминальных форм рака молочной железы [129,130].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Давлетова Кристина Игоревна, 2021 год

• (г

г •

х

< 1,1 • # ц

. • ; т.« г » ' ? . ^ ' '

Г > »•» « *

* • . »• ч.л» - " ' • ¿. - - ; ^

Рисунок 9А

Рисунок 9Б

Рисунок 9 - Микрофотографии образцов инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы, культивирование которых осуществлялось без добавления и с добавлением

HLDF

Примечание: Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400

А) Инвазивная карцинома неспецифического типа молочной железы, культивирование которой осуществлялось без добавления в среду HLDF: патогистологическое строение характеризовалось формированием гнезд, кластеров и трабекул, выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом, среди злокачественных клеток встречалось большое количество низкодифференцированных клеток - крупных клеток с полиморфными ядрами и заметными ядрышками, которые указаны стрелками; Б) Инвазивная карцинома неспецифического типа молочной железы, культивирование которой осуществлялось с добавлением в среду HLDF: патогистологическое строение характеризовалось формированием гнезд, кластеров и трабекул, менее выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом, среди злокачественных клеток встречалось меньшее количество низкодифференцированных клеток и большее количество

высокодифференцированных клеток - мелкие клетки с мономорфными мелкими ядрами с четким контуром и равномерным распределением хроматина, которые указаны стрелками.

результаты морфометрического анализа образцов ИКНТ МЖ, культивирование которых осуществлялось в питательной среде DMEM-F12 с добавлением и без добавления HLDF представлены в Таблице 25.

Таблица 25 - Влияние HLDF на дифференцировку и митотическую активность клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы

Признак Без добавления HLDF п = 36 С д о б авлением HLDF п = 36

1 2

Абсолютное количество злокачественных клеток на тестируемой площади 1626 (1216; 2891) 1857 (1482; 2777)

Относительное количество низкодифференцированных клеток на тестируемой площади 13,7 (5,4; 21,9) 3,2 (1,4; 5,3) Р1,2 = 0,000001

Относительное количество умереннодифференцированных клеток на тестируемой площади 70,0 (64,0; 78,4) 67,6 (60,4; 76,4)

Относительное количество высокодифференцированных клеток на тестируемой площади 14,2 (7,2; 20,1) 27,2 (16,9; 36,5) Р1,2 = 0,00025

Относительное количество митозов на 1000 злокачественных клеток 5,7 (3,0; 9,8) 5,3 (2,1; 7,6)

Относительное количество физиологических митозов на 1000 злокачественных клеток 3,9 (2,1; 6,3) 4,2 (1,7; 6,5)

Относительное количество патологических митозов на 1000 злокачественных клеток 2,0 (0,4; 3,7) 0,9 (0,0; 2,7)

Примечание: Ме ^0,25; Qo,75) в у.е.; сравнение проводилось с помощью W-критерия Вилкоксона

При морфометрическом анализе образцов ИКНТ МЖ было установлено, что культивирование опухоли в среде с добавлением HLDF приводит к снижению относительного содержания низкодифференцированных клеток и увеличению относительного содержания высокодифференцированных клеток. Учитывая, что культивирование опухоли в среде с

добавлением HLDF не вызывает изменения абсолютного количества клеток ИКНТ МЖ, а также не влияет на количество физиологических и патологических митозов, то можно предположить, что влияние HLDF непосредственно связано только с его дифференцирующей активностью.

При разделении больных ИКНТ МЖ на группы больных с метастазами в регионарных лимфатических узлах и без метастазов было установлено, что культивирование опухоли в среде с добавлением HLDF приводит к снижению относительного содержания низкодифференцированных клеток и увеличению относительного содержания высокодифференцированных клеток, как у больных ИКНТ МЖ с метастазами, так и у больных без метастазов (Таблица 26). Следует отметить, что в образцах ИКНТ МЖ, культивирование которых осуществлялось в среде без добавления HLDF, относительное количество низкодифференцированных клеток было выше у больных с метастазами, чем у больных без метастазов.

Таблица 26 - Влияние HLDF на дифференцировку и митотическую активность клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы в зависимости от наличия

метастазов в регионарных лимфатических узлах

Признак Без метастазов С метастазами

Без добавления HLDF п = 22 С добавлением п = 22 Без добавления п = 14 С добавлением HLDF п = 14

1 2 3 4

Абсолютное количество злокачественных клеток на тестируемой площади 1529 (1286; 3238) 1738 (1185; 2762) 1817 (1159; 2545) 1828 (1582; 3168)

Относительное количество низкодифференцированных клеток на тестируемой площади 9,6 (4,4; 19,6) 4,0 (1,9; 5,3) Р1,2 = 0,0003 20,5 (7,9; 25,1) Р1,з = 0,047 1,8 (0,9; 7,8) рз,4 = 0,0001

Относительное количество умереннодифференцированных клеток на тестируемой площади 70,3 (65,8; 79,9) 67,9 (64,4; 76,4) 69,8 (60,1; 76,3) 66,0 (49,8; 78,5)

Относительное количество высокодифференцированных клеток на тестируемой площади 15,6 (8,7; 23,4) 26,7 (18,3; 30,6) Р1,2 = 0,007 8,6 (5,3; 15,2) 33,2 (12,1; 44,2) рз,4 = 0,011

Относительное количество митозов на 1000 злокачественных клеток 6,1 (2,7; 11,1) 5,7 (2,3; 10,5) 5,3 (3,4; 8,1) 5,3 (1,7; 7,5)

Относительное количество физиологических митозов на 1000 злокачественных клеток 4,4 (2,4; 8,2) 4,5 (1,6; 7,6) 3,9 (1,8; 6,3) 3,5 (1,5; 5,8)

Относительное количество патологических митозов на 1000 злокачественных клеток 2,0 (0,0; 3,7) 1,7 (0,0; 3,2) 1,9 (1,0; 3,3) 1 ,9 (0,0; 2,2)

Примечание: Ме ^0,25; Qo,75) в у.е.; сравнение 1-2 и 3-4 проводилось с помощью W-критерия Вилкоксона, сравнение 1-3 и 2-4 с помощью и-критерия Манна-Уитни

Также, оказалось, что влияние HLDF на снижение относительного содержания низкодифференцированных клеток и увеличение относительного содержания высокодифференцированных клеток ИКНТ МЖ проявляется во всех исследуемых возрастных группах (Таблица 27).

Таблица 27 - Влияние HLDF на дифференцировку и митотическую активность клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы в различных возрастных

группах

Признак Без добавления HLDF < 60 лет п = 26 С добавлением < 60 лет п = 26 Без добавления > 60 лет п = 10 С добавлением HLDF > 60 лет п = 10

1 2 3 5

Абсолютное количество злокачественных клеток на тестируемой площади 1626 (1200; 2974) 1828 (1215; 3094) 1619 (1351; 2567) 1526 (1239; 1857)

Относительное количество низкодифференцированных клеток на тестируемой площади 13,4 (4,4; 23,7) 2,4 (1,3; 4,5) Р1,2 = 0,00004 14,1 (5,6; 20,1) 5,1 (1,5; 8,9) рз,4 = 0,007

Относительное количество умереннодифференцированных клеток на тестируемой площади 69,7 (61,6; 76,1) 67,1 (59,6; 74,9) 71,0 (66,6; 80,2) 74,4 (64,4; 76,5)

Относительное количество высокодифференцированных клеток на тестируемой площади 15,0 (7,6; 20,0) 30,3 (17,5; 38,3) Р1,2 = 0,003 10,3 (5,1; 23,4) 21,8 (14,8; 30,0) рз,4 = 0,017

Относительное количество митозов на 1000 злокачественных клеток 5,7 (2,7; 9,4) 5,5 (2,0; 7,6) 5,6 (3,3; 11,7) 5,4 (2,0; 12,2)

Относительное количество физиологических митозов на 1000 злокачественных клеток 3,9 (2,0; 6,3) 4,5 (1,6; 6,4) 3,9 (2,4; 9,1) 3,1 (1,6; 7,8)

Относительное количество патологических митозов на 1000 злокачественных клеток 1,8 (0,0; 3,8) 1,8 (0,0; 2,5) 2,1 (0,6; 3,7) 2,0 (0,0; 3,4)

Примечание: Ме ^0,25; Qo,75) в у.е.; сравнение 1-2 и 3-4 проводилось с помощью W-критерия Вилкоксона, сравнение 1-3 и 2-4 с помощью и-критерия Манна-Уитни

Что касается больных ИКНТ МЖ с различными молекулярно-генетическими подтипами, то при люминальном А и при люминальном В НЕЯ2-негативном молекулярно-генетических подтипах наблюдалось уже установленное влияние HLDF, проявляющееся в снижении относительного содержания низкодифференцированных клеток и увеличении относительного содержания высокодифференцированных клеток (Таблица 28). Ввиду небольших размеров выборок больных с люминальным В НЕЯ2-позитивным подтипом, с тройным негативным подтипом и подтипом с гиперэкспрессией НЕЯ2, установить влияние HLDF на дифференцировку и митотическую активность злокачественных клеток при данных молекулярно-генетических подтипах не представлялось возможным.

Таблица 28 - Влияние HLDF на дифференцировку и митотическую активность клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы при различных молекулярно-

генетических подтипах

Признак Люм. А Люм. В НЕЯ2-

Без добавления HLDF п = 14 С добавлением п = 14 Без добавления п = 12 С добавлением HLDF п = 12

1 2 3 4

Абсолютное количество злокачественных клеток на тестируемой площади 1546 (1344; 3008) 1762 (1212; 3015) 1535 (1008; 2306) 1762 (1416; 2308)

Относительное количество низкодифференцированных клеток на тестируемой площади 10,5 (5,1; 19,4) 4,0 (2,0; 5,2) Р1,2 = 0,006 17,7 (3,6; 21,0) 1,6 (0,9; 4,95) рз,4 = 0,005

Относительное количество умереннодифференцированных клеток на тестируемой площади 70,7 (63,1; 78,3) 68,1 (62,6; 75,0) 71,3 (65,1; 80,9) 66,0 (54,8; 76,9)

Относительное количество высокодифференцированных клеток на тестируемой площади 14,6 (7,7; 22,3) 24,0 (21,2; 32,6) Р1,2 = 0,019 8,7 (6,9; 16,5) 33,2 (16,3; 41,0) рз,4 = 0,028

Относительное количество митозов на 1000 злокачественных клеток 7,3 (2,8; 11,3) 5,9 (3,0; 11,6) 7,0 (2,7; 11,7) 7,5 (2,5; 12,9)

Относительное количество физиологических митозов на 1000 злокачественных клеток 4,4 (2,3; 7,5) 4,3 (1,9; 7,4) 3,4 (1,6; 9,1) 5,8 (2,1; 10,2)

Относительное количество патологических митозов на 1000 злокачественных клеток 2,6 (0,5; 4,0) 1,6 (0,5; 4,1) 2 , 1 (0,3; 3,9) 1,9 (0,3; 3,1)

Примечание: Ме ^0,25; Qo,75) в у.е.; сравнение проводилось с помощью W-критерия Вилкоксона

С учетом того, что показатель ядерного полиморфизма является одним из гистологических критериев, определяющих степень злокачественности ИКНТ МЖ [255], было решено обратить более пристальное внимание именно на низкодифференцированные клетки, обладающие более выраженными признаками, как ядерного полиморфизма, так и нарушения структурообразования. Для этой цели нами был определен индекс влияния HLDF на относительное содержание низкодифференцированных клеток (ИВнLDF НДК), который представляет собой соотношение относительного содержания низкодифференцированных клеток в образцах ИКНТ МЖ, культивирование которых осуществлялось в среде без добавления HLDF, к относительному содержанию низкодифференцированных в образцах ИКНТ МЖ, культивирование которых осуществлялось в среде с добавлением HLDF.

На основании определенного ИВнLDF НДК, все больные ИКНТ МЖ были разделены на две группы - больные с реакцией на HLDF, у которых значение ИВнLDF НДК > 1,6 у.е. и больные без реакции на HLDF, у которых значение ИВнLDF НДК < 1,6 у.е. В группу больных с реакцией на HLDF вошло 29 больных, ИВнLDF НДК у которых составил 5,8 (2,8; 11,1). В группу больных без реакции на HLDF вошло 7 больных, ИВнLDF НДК у которых составил 1,1 (0,8; 1,2). Также, стоит отметить, что у больных без реакции на HLDF не было получено статистически значимых различий между патогистологическими параметрами в образцах ИКНТ МЖ, культивирование которых осуществлялось в среде без добавления HLDF и в среде с добавлением HLDF (Таблица 29). Больные без реакции на HLDF характеризовались изначально более низким содержанием низкодифференцированных клеток, нежели больные с реакцией на HLDF. Следовательно, реакция клеток ИКНТ МЖ на HLDF была связана с более высоким

количеством низкодифференцированных клеток, что характерно для более злокачественных вариантов ИКНТ МЖ.

Таблица 29 - Влияние HLDF на дифференцировку и митотическую активность клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы при различной реакции клеток опухоли на дифференцирующую активность HLDF

Признак С реакцией на HLDF Без реакции на HLDF

Без добавления HLDF n = 29 С добавлением HLDF n = 29 Без добавления HLDF n = 7 С добавлением HLDF n = 7

1 2 3 4

Абсолютное количество злокачественных клеток на тестируемой площади 1595 (1188; 2390) 1857 (1500; 2931) 1562 (1102; 3395) 1688 (1454; 2762)

Относительное количество низкодифференцированных клеток на тестируемой площади 15,5 (6,8; 23,0) 1,9 (1,1; 4,3) pi,2 = 0,0000026 5,3 (2,5; 8,7) pi,3 = 0,048 5,3 (4,5; 8,7) p2,4 = 0,005

Относительное количество умереннодифференцированных клеток на тестируемой площади 70,0 (62,9; 80,1) 67,6 (57,1; 77,1) 71,4 (65,6; 74,6) 72,9 (67,5; 76,4)

Относительное количество высокодифференцированных клеток на тестируемой площади 11,3 (7,3; 16,7) 3 0 , 6 (16,9; 40,3) pi,2 = 0,00017 23,1 (4,8; 32,1) 23,0 (14,8; 26,7)

Относительное количество митозов на 1000 злокачественных клеток 5,6 (2,7; 9,9) 5,3 (2,1; 7,6) 6,3 (3,9; 10,0) 6,3 (2,8; 12,2)

Относительное количество физиологических митозов на 1000 злокачественных клеток 3,9 (2,0; 6,8) 4,2 (1,7; 6,1) 4,2 (2,7; 6,1) 4,5 (1,9; 7,8)

Относительное количество патологических митозов на 1000 злокачественных клеток 1,7 (0,0; 3,7) 1,9 (0,0; 2,5) 2,9 (0,9; 4,1) 2,3 (0,0; 4,1)

Примечание: Me (Qo,25; Qo,75) в у.е.; сравнение 1-2 и 3-4 проводилось с помощью W-критерия Вилкоксона, сравнение 1-3 и 2-4 с помощью U-критерия Манна-Уитни

При персонализированном рассмотрении больных ИКНТ МЖ удалось установить, что у всех 14 больных с метастазами в регионарных лимфатических узлах наблюдалась реакция на HLDF, то есть образцы наиболее агрессивных форм ИКНТ МЖ показали более сильную ответную реакцию на воздействие изучаемого фактора дифференцировки. Особенностей,

связанных с реакцией на HLDF, с учетом возраста больных или молекулярно-генетическим подтипом опухоли получено не было.

3.3. Взаимосвязь между дифференцировкой клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы под влиянием Human Leukemia Differentiation Factor и показателями продукции цитокинов клетками крови

При изучении взаимосвязи между дифференцировкой клеток ИКНТ МЖ под влиянием HLDF и показателями продукции цитокинов клетками крови, корреляционные связи были установлены только по ИВпа. Так, прямые корреляционные связи были установлены между ИВпа на продукцию IL-4 и относительным количеством низкодифференцированных клеток, между ИВпа на продукцию IL-10 и относительным количеством высокодифференцированных клеток, а также между ИВпа на продукцию IL-17 и относительным количеством высокодифференцированных клеток (Таблица 30). Обратная корреляционная связь была установлена между ИВпа на продукцию IL-17 и относительным количеством низкодифференцированных клеток.

Таблица 30 - Корреляционные связи индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию цитокинов клетками крови с относительным количеством низкодифференцированных и высокодифференцированных клеток инвазивной карциномы

неспецифического типа молочной железы

ИКНТ МЖ n = 36

Исследуемые параметры Коэффициент корреляции r (p)

ИВпа IL-4 - Относительное количество низкодифференцированных клеток при добавлении HLDF 0,492 (0,015)

ИВпа IL-17 - -0,426 (0,038)

ИВпа IL-10 - Относительное количество высокодифференцированных клеток при добавлении HLDF 0,468 (0,021)

ИВпа IL-17 - 0,430 (0,036)

Примечание: коэффициент ранговой корреляции рассчитывался по Спирмену

Известно, что ГЬ-4 является одним из ключевых регуляторов гуморального и адаптивного иммунного ответа [136,139]. В зависимости от своего происхождения, ГЬ-4 может оказывать как активирующее (эндогенный по отношению к опухоли, продуцируемый клетками опухоли и клетками ее микроокружения), так и супрессирующее (экзогенный по отношению к опухоли, продуцируемый клетками крови) влияние на злокачественную прогрессию [136,142]. Поэтому, полученная корреляционная связь, связанная с увеличением ГЬ-4-продуцирующего потенциала клеток крови (который отражает низкую спонтанную продукцию ГЬ-4), при

увеличении относительного количества низкодифференцированных клеток у больных ИКНТ МЖ, свидетельствует о снижении противоопухолевых эффектов, опосредованных ГЬ-4. Что касается 1Ь-17, то более высокие значения ИВпа на его продукцию были сопряжены с более низким относительным количеством низкодифференцированных клеток и более высоким относительным количеством высокодифференцированных клеток, то есть более высокая спонтанная продукция 1Ь-17 клетками крови была связана с высоким количеством низкодифференцированных клеток при культивировании ИКНТ МЖ с добавлением HLDF. Полученные результаты согласуются с литературными данными, согласно которым ГЬ-17 является цитокином с выраженным проонкогенным действием, стимулирует инвазию и метастазирование злокачественных клеток за счет индукции матриксных металлопротеиназ и проангиогенных факторов, а также ингибирует активацию противоопухолевого иммунного ответа, как такового [60,169]. Увеличение ГЬ-10-продуцирующего потенциала клеток крови сопровождается увеличением относительного количества высокодифференцированных клеток при культивировании ИКНТ МЖ с добавлением HLDF. То есть, более низкая спонтанная продукция ГЬ-10 клетками крови связана с увеличением количества высокодифференцированных клеток при воздействии HLDF на ИКНТ МЖ, однако, в виду широкого спектра биологической активности ГЬ-10, достаточно сложно оценить, с какими именно эффектами ГЪ-10 связана найденная закономерность [164].

Для более тщательного анализа выявленных закономерностей дальнейшее сравнение проводилось с учетом выраженности реакции клеток ИКНТ МЖ на дифференцирующую активность HLDF. Так, оказалось, что выявленные корреляционные связи ИВпа на продукцию цитокинов клетками крови с относительным количеством низкодифференцированных и высокодифференцированных клеток ИКНТ МЖ были характерны только для больных с реакцией на HLDF (Таблица 31). Помимо ранее установленных корреляционных связей, оказалось, что значение ИВпа на продукцию имеет обратную корреляцию с

относительным количеством низкодифференцированных клеток, и прямую корреляцию с относительным количеством высокодифференцированных клеток при культивировании ИКНТ МЖ с добавлением HLDF.

Таблица 31 - Корреляционные связи индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию цитокинов клетками крови с относительным количеством низкодифференцированных и высокодифференцированных клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы при реакции на дифференцирующую активность

HLDF

ИКНТ МЖ с реакцией на HLDF п = 29

Исследуемые параметры Коэффициент корреляции г (р)

ИВпа Ш-4 - Относительное количество низкодифференцированных клеток при добавлении HLDF 0,522 (0,018)

ИВпа ГЫ7 - -0,531 (0,016)

ИВпа ^N-7 - -0,535 (0,015)

ИВпа ГЫ0 - Относительное количество высокодифференцированных клеток при добавлении HLDF 0,496 (0,026)

ИВпа ГЫ7 - 0,594 (0,006)

ИВпа ^N-7 - 0,665 (0,001)

Примечание: коэфс шциент ранговой корреляции рассчитывался по Спирмену

Таким образом, более высокая спонтанная продукция №N-7 и, зависящие от нее более низкие значения ИВпа на продукцию ^N-7, сопровождаются более низким относительным количеством низкодифференцированных клеток и более высоким относительным количеством высокодифференцированных клеток при культивировании ИКНТ МЖ с добавлением HLDF. Учитывая биологические эффекты №N-7, а также тот факт, что опухоли с более высоким относительным количеством низкодифференцированных клеток более сильно реагируют на культивирование образцов ИКНТ МЖ с добавлением HLDF, полученные закономерности могут отражать проонкогенные эффекты ^N-7 [186,189,190].

При изучении значений ИВ на продукцию цитокинов клетками крови у больных ИКНТ МЖ в зависимости от реакции клеток опухоли на дифференцирующую активность HLDF, различия были получены только по ИВпа, что представлено в Таблице 32. Оказалось, что у больных с реакцией на HLDF ИВпа на продукцию ^N-7, VEGF и МСР-1 был ниже, чем у больных без реакции на HLDF. Более низкие значения ИВпа на продукцию этих цитокинов, свидетельствуют о том, что при более высокой реакции клеток опухоли на HLDF, клетки крови спонтанно продуцируют большее количество ^N-7, VEGF и МСР-1, за счет чего слабее реагируют на поликлональные активаторы. Известно, что как проонкогенный фактор ГКЫ-7 индуцирует экспрессию PD-L1 на НЕЯ2-позитивных клетках рака молочной железы, а также способствует продукции ГО01, который позволяет злокачественным клеткам избегать противоопухолевого иммунного ответа [191]. VEGF является основным индуктором неоангиогенеза при злокачественных новообразованиях, что приводит к формированию к аномальной внутриопухолевой сосудистой сети [198,200]. МСР-1 опосредует процессы

клеточной инвазии и проявляет хемотаксическую активность в отношении моноцитов и гранулоцитов [203,206].

Таблица 32 - Индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию цитокинов клетками крови у больных инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы при различной реакции клеток опухоли на дифференцирующую активность HLDF

Цитокин С реакцией на HLDF п = 29 Без реакции на HLDF п = 7

1 2

гыр 21,1 (5,3; 150) 40,0 (17,4; 323)

ГЫИа 5,7 (3,7; 7,8) 6,0 (5,6; 11,6)

Ш-2 6,1 (4,1; 10,0) 8,2 (2,6; 11,3)

Ш-4 2,1 (1,6; 4,3) 3,0 (1,6; 11,4)

Ш-6 6,8 (2,9; 19,3) 10,5 (6,0; 21,1)

Ш-8 1,9 (1,1; 5,4) 3,5 (1,3; 39,5)

ГЪ-10 32,9 (10,2; 84,9) 33,9 (13,3; 64,0)

Ш-17 50,6 (22,4; 121) 46,3 (17,5; 155)

Ш-18 1,3 (1,3; 1,7) 1,5 (1,3; 2,1)

Т№-а 285 (96,8; 573) 314 (156; 650)

109 (76,3; 274) Р1,2 = 0,036 341 (286; 416)

G-CSF 73,1 (25,0; 118) 68,2 (2,1; 165)

GM-CSF 15,7 (6,9; 26,9) 15,8 (3,3; 39,5)

VEGF 2,7 (1,4; 4,4) Р1,2 = 0,011 20,9 (4,8; 52,2)

МСР-1 1,7 (1,5; 5,6) Р1,2 = 0,030 10,5 (4,5; 18,0)

Примечание: Ме ^0,25; Qo,75) в у.е.; сравнение проводилось с помощью и-критерия Манна-

Уитни

На основании полученных различий было установлено, что у больных ИКНТ МЖ значение ИВпа на продукцию VEGF < 30 у.е. соответствовало наличию реакции на HLDF в 100,0% случаев (чувствительность), а значение ИВпа на продукцию VEGF > 30 у.е. -отсутствию реакции на HLDF в 85,7% случаев (специфичность). Значение площади под кривой в ЯОС-анализе свидетельствовало об отличном качестве модели (АиС = 0,913).

3.4. Взаимосвязь между показателями продукции цитокинов клетками крови и патогистологическими параметрами внеклеточного матрикса при инвазивной карциноме неспецифического типа и незлокачественных заболеваниях молочной железы

При оценке взаимосвязи между показателями продукции цитокинов клетками крови и состоянием волокнистого компонента внеклеточного матрикса корреляционные связи были установлены только по ИВпа. Оказалось, больные ИКНТ МЖ имеют прямые корреляционные связи между ИВпа между ИВпа на продукцию 1Е-1Р, 1Ъ-Жа Ш-6, G-CSF и относительной площадью дегенеративно-измененных коллагеновых волокон, что представлено в Таблице 33.

Таблица 33 - Корреляционные связи индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию цитокинов клетками крови с состоянием волокнистого компонента внеклеточного матрикса у больных инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы

ИКНТ МЖ п = 115

Исследуемые параметры Коэффициент корреляции г (р)

ИВпа Ш-1Р - Относительная площадь дегенеративно-измененных коллагеновых волокон 0,343 (0,047)

ИВпа Ш-Жа - 0,394 (0,027)

ИВпа Ш-6 - 0,372 (0,034)

ИВпа G-CSF - 0,333 (0,049)

Примечание: коэффициент ранговой корреляции рассчитывался по Спирмену

Что касается взаимосвязи между показателями продукции цитокинов клетками крови и состоянием волокнистого компонента внеклеточного матрикса у больных ИКНТ МЖ без метастазов, то были установлены следующие прямые корреляционные связи: между ИВпа на продукцию 1Е-1Р, Ш-Жа Ш-6, G-CSF и относительной площадью дегенеративно-измененных коллагеновых волокон (Таблица 34). Корреляционных связей между показателями продукции цитокинов клетками крови и состоянием волокнистого компонента внеклеточного матрикса у больных ИКНТ МЖ с метастазами в регионарных лимфатических узлах установлено не было. Также, не было установлено особенностей, связанных с возрастом больных ИКНТ МЖ и молекулярно-генетическими подтипами опухоли.

Таблица 34 - Корреляционные связи индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию цитокинов клетками крови с состоянием волокнистого компонента внеклеточного матрикса у больных инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы без

метастазов в регионарных лимфатических узлах

ИКНТ МЖ без метастазов п = 75

Исследуемые параметры Коэффициент корреляции г (р)

ИВпа 1Ъ-1Р - Относительная площадь дегенеративно-измененных коллагеновых волокон 0,359 (0,042)

ИВпа Ш-Жа - 0,476 (0,004)

ИВпа Ш-6 - 0,394 (0,016)

ИВпа G-CSF - 0,392 (0,016)

Примечание: коэффициент ранговой корреляции рассчитывался по Спирмену

Полученные результаты согласуются с ранее установленными различиями между ИВпа на продукцию этих цитокинов у больных ИКНТ МЖ с метастазами и без метастазов. Таким образом, выявленные корреляционные связи еще раз подчеркивают важную патогенетическую роль 1Ъ-1Р, Ш-Жа, 1Ъ-6 и G-CSF в реализации злокачественной прогрессии.

У больных НЗЗ МЖ была установлена прямая корреляционная связь между ИВпа на продукцию Т№-а и относительной площадью дегенеративно-измененных коллагеновых волокон, а также обратная корреляционная связь между ИВпа на продукцию ^N-7 и относительной площадью коллагеновых волокон с измененными тинкториальными свойствами (Таблица 35).

Таблица 35 - Корреляционные связи индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию цитокинов клетками крови с состоянием волокнистого компонента внеклеточного матрикса у больных незлокачественными заболеваниями молочной железы

НЗЗ МЖ п = 37

Исследуемые параметры Коэффициент корреляции г (р)

ИВпа Т№-а - Относительная площадь дегенеративно-измененных коллагеновых волокон 0,418 (0,037)

ИВпа ^N-7 - Относительная площадь коллагеновых волокон с измененными тинкториальными свойствами -0,437 (0,029)

Примечание: коэффициент ранговой корреляции рассчитывался по Спирмену

Стоить отметить, что корреляционные связи были установлены только с теми цитокинами, значения ИВпа на продукцию которых различались при сравнении больных НЗЗ

МЖ в зависимости от возраста и риска злокачественной трансформации. При разделении больных НЗЗ МЖ по возрастным группам, оказалось, что взаимосвязь между ИВпа на продукцию №N-7 и относительной площадью коллагеновых волокон с измененными тинкториальными свойствами характерна только для больных в возрастной группе до 60 лет ^ = -0,604, Р = 0,005). Полученные данные свидетельствуют о сопряженности состояния цитокин-продуцирующего потенциала клеток крови и состояния волокнистого компонента внеклеточного матрикса, как при ИКНТ, так и при НЗЗ МЖ.

При морфологическом изучении волокнистого компонента внеклеточного матрикса у больных ИКНТ МЖ с метастазами в регионарных лимфатических узлах отмечались обширные участки с деградацией коллагеновых волокон и изменением их сродства к пикрофуксину (Рисунок 10).

Рисунок 10А Рисунок 10Б Рисунок 10В

Рисунок 10 - Микрофотографии образцов инвазивной карциномы неспецифического типа и незлокачественного заболевания молочной железы

Примечание: Окраска по методу ван Гизона, увеличение х 400

А) Незлокачественное заболевание молочной железы с низким риском злокачественной трансформации (фиброаденома): отсутствие деградации и изменения тинкториальных свойств коллагеновых волокон; Б) Инвазивная карцинома неспецифического типа молочной железы без метастазов: участки деградации коллагеновых волокон (сплошная стрелка) с небольшими участками изменения их тинкториальных свойств (пунктирная стрелка); В) Инвазивная карцинома неспецифического типа молочной железы с метастазами: обширные участки деградации коллагеновых волокон (сплошная стрелка) с изменением их тинкториальных свойств (пунктирная стрелка).

При морфометрической оценке состояния волокнистого компонента внеклеточного матрикса различия были получены по всем исследуемым параметрам между больными ИКНТ и НЗЗ МЖ, между больными ИКНТ МЖ с метастазами в регионарных лимфатических узлах и без метастазов, а также между больными НЗЗ МЖ с НРЗТ и ВРЗТ (Таблица 36). Что касается суммы баллов, полученной при оценке исследуемых патогистологических параметров, то более высокая сумма баллов наблюдалась у больных ИКНТ МЖ по сравнению с больными НЗЗ МЖ, а также у больных ИКНТ МЖ с метастазами по сравнению с больными без метастазов. Особенностей, связанных с молекулярно-генетическим подтипом опухоли или возрастом больных получено не было.

Таблица 36 - Состояние волокнистого компонента внеклеточного матрикса у больных инвазивной карциномой неспецифического типа и незлокачественными заболеваниями

молочной железы

Признак ИКНТ МЖ п = 115 НЗЗ МЖ п = 37 ИКНТ МЖ НЗЗ МЖ

Без метастазов п = 75 С метастазами п = 40 НРЗТ п = 19 ВРЗТ п = 18

1 2 3 4 5 6

Относительная площадь дегенеративно-измененных коллагеновых волокон 2 (1; 2) 0 (0; 1) 1 (1; 2) 3 (2; 3) 0 (0; 0) 0 (0; 1)

Р1,2 = 0,000000001 рэ,4 = 0,00000004 Р5,6 = 0,037

Относительная площадь коллагеновых волокон с измененными тинкториальными свойствами 2 (1; 3) 0 (0; 1) 1 (1; 1) 3 (2; 3) 0 (0; 0) 0 (0; 1)

Р1,2 = 0,00000008 Р3,4 = 0,0000006 Р5,6 = 0,045

Сумма баллов 3 (2; 5) 0 (0; 1) 2 (2; 3) 6 (4; 7) 0 (0; 1) 1 (0; 2)

Р1,2 = 0,000000000001 Р3,4 = 0,00000000001

Примечание: Ме ^0,25; Qo,75) в баллах; сравнение проводилось с помощью и-критерия Манна-Уитни

Таким образом, сумма баллов > 2 соответствовала ИКНТ МЖ в 100,0% случаев (чувствительность), а сумма баллов < 2 - НЗЗ МЖ в 97,3% случаев (специфичность). Значение площади под кривой в ROC-анализе свидетельствовало об отличном качестве модели (АиС = 0,975). У больной НЗЗ МЖ, имеющей сумму баллов 3, заболевание характеризовалось высоким

риском злокачественной трансформации. Что касается больных ИКНТ МЖ, то сумма баллов > 4 соответствовала наличию метастазов в регионарных лимфатических узлах в 100,0% случаев (чувствительность), а сумма баллов 2-3 - отсутствию метастазов 84,0% случаев (специфичность). Значение площади под кривой в ROC-анализе свидетельствовало об отличном качестве модели (АиС = 0,943). При персонализированном рассмотрении больных ИКНТ МЖ, у которых не было диагностировано метастазов в регионарных лимфатических узлах, но сумма баллов соответствовала больным ИКНТ МЖ с метастазами, было установлено, что у 11 из 12 больных значение соотношения ИВпа ГЬ-1р х ГЬ-6 / ГЬ-Жа соответствовало наличию метастазов.

Заключение

В реализации злокачественной прогрессии можно выделить два фундаментальных события, которые определяют наличие и выраженность онкогенного потенциала клеток, а также состояние иммунобиологической среды организма [96,97,252,259]. Первым событием является момент ускользания атипичных клеток от иммунного надзора, что способствует беспрепятственному накоплению ими генетических мутаций и фенотипической изменчивости, которые в конечном итоге приводят к потере клеточной дифференцировки (не что иное, как малигнизация) и формированию пула раковых стволовых клеток, что согласуется с моделью обратимой клеточной пластичности [61,94-96]. Модель обратимой клеточной пластичности объединяет в себе модель клональной клеточной эволюции и модель раковых стволовых клеток, что предполагает возможность перехода атипичных клеток в раковые клетки, а раковых клеток в стволовые раковые клетки и наоборот [96,252,259]. Вторым событием становится реализация метастатического потенциала клеток опухоли, непосредственно вытекающего из пластичности раковых клеток и ремоделирования локальной микросреды опухоли, основным компонентом которой является внеклеточный матрикс [246,247]. В конечном итоге заболевание приобретает диссеминированную форму, которая, на данный момент времени, плохо поддается лечению существующими онкотерапевтическими агентами [97,260].

Механизмы, обеспечивающие ускользание атипичных клеток от иммунного надзора, обладают структурно-функциональными сходствами с процессами, происходящими в эмбриональном периоде [30,94-96,230]. Во многом это сходство обусловлено схожим антигенным составом злокачественных опухолей и антигенным составом человека в период эмбрионального развития [230,235,236]. К одним из опухоль-ассоциированных антигенов, который также является онкофетальным антигеном, относят раково-эмбриональный антиген, к которому обнаруживаются аутоантитела как у условно-здоровых людей, так и у больных злокачественными новообразованиями, что свидетельствует о наличии иммунного ответа на

раково-эмбриональный антиген, как такового [229,231]. При реактивации экспрессии раково-эмбрионального антигена в атипичных клетках происходит включение сложившихся еще в эмбриональном периоде механизмов, обеспечивающих существование иммунологической толерантности к опухоль-ассоциированным антигенам [30,31,230,240]. В результате проведенного исследования, было установлено, что больные ИКНТ и НЗЗ МЖ различались по продукции цитокинов клетками крови под влиянием раково-эмбрионального антигена in vitro, хотя различий в уровне спонтанной продукции цитокинов в исследуемых группах получено не было. Такие различия наблюдались по ИВрэа на продукцию IL-1P, IL-1Ra, IL-6, IL-8, GM-CSF и MCP-1. У больных НЗЗ МЖ ИВрэа на продукцию этих цитокинов был выше, чем у больных ИКНТ МЖ. Обратная ситуация наблюдалась с ИВрэа на продукцию IL-10, так ИВрэа на продукцию этого цитокина был выше у больных ИКНТ МЖ, по сравнению с больными НЗЗ МЖ. Полученные результаты согласуются с литературными данными о том, что IL-10 ингибирует продукцию клетками иммунной системы большого количества цитокинов, в число которых входят IL-ip, IL-1Ra, IL-6, IL-8, GM-CSF и MCP-1 [56,160,162]. Вероятно, увеличение продукции IL-10 клетками крови под влиянием раково-эмбрионального антигена у больных ИКНТ МЖ может быть связано с биологическими эффектами раково-эмбрионального антигена - его митогенной активностью, участием в межклеточной адгезии и иммуносупрессивными эффектами IL-10 [30,31,161-165]. Известно, что IL-10 снижает адгезию клеток к внеклеточному матриксу, а также адгезию клеток иммунной системы к эндотелиальным клеткам in vitro [161,163]. Вероятно, подобное влияние раково-эмбрионального антигена на продукцию IL-10 в эмбриональном периоде способствует миграции клеток, которая необходима на всех этапах органогенеза, а в постэмбриональном периоде играет существенную роль в реализации злокачественной прогрессии [160,164,230]. Стоит отметить, что формирование клеточной атипии начинается еще при НЗЗ МЖ и, согласно литературным данным, представляет риск для развития злокачественной патологии в будущем. На основании исследований, в которых был проведен мета-анализ клинических данных у больных различными НЗЗ МЖ и оценен риск развития рака молочной железы с течением времени [17-20], в нашей работе больные НЗЗ МЖ были разделены на две группы. Первую группу составили больные НЗЗ МЖ с низким риском злокачественной трансформации: непролиферативной формой фиброзно-кистозной болезни и фиброаденомой [17,18]. А вторую группу - больные НЗЗ МЖ с высоким риском злокачественной трансформации: пролиферативной формой фиброзно-кистозной болезни, склерозирующим аденозом, радиальным рубцом и атипичной протоковой гиперплазией [19,20]. При сравнении этих групп оказалось, что больные НЗЗ МЖ с низким риском злокачественной трансформации отличались от больных НЗЗ МЖ с высоким риском злокачественной трансформации по ИВрэа на продукцию IL-6, IL-8 и IL-10. У больных НЗЗ МЖ с низким

риском злокачественной трансформации ИВрэа на продукцию ГЬ-6 и ГЬ-8 был выше, а ИВрэа на продукцию ГЬ-10 был ниже, чем у больных НЗЗ МЖ с высоким риском злокачественной трансформации. Также, оказалось, что больные НЗЗ МЖ с высоким риском злокачественной трансформации не отличались от больных злокачественными заболеваниями по ИВрэа на продукцию этих цитокинов. То есть, снижение реакции клеток крови на раково-эмбриональный антиген развивается уже при некоторых незлокачественных патологиях и соответствует таковому при раке молочной железы. Таким образом, принимая во внимание полученные различия и биологические эффекты ГЬ-10, было установлено пороговое значение ИВрэа на продукцию ГЬ-10 (> 2 у.е.), которое позволяет еще в дооперационном периоде выявить наличие НЗЗ МЖ с высоким риском злокачественной трансформации в 73,3% случаев. Не исключено, что внедрение в клиническую практику диагностического подхода, оценивающего влияние раково-эмбрионального антигена на продукцию ГЬ-10 клетками крови, в качестве дополнения к уже существующим клинико-диагностическим методам, позволит отслеживать динамику изменения продукции ГЬ-10 клетками крови под влиянием раково-эмбрионального антигена у больных НЗЗ МЖ.

С момента ускользания от иммунного надзора, атипичные клетки, постепенно теряя структурную и функциональную дифференцировку, перепрограммируют клетки своего микроокружения с помощью цитокинов, способствуя, тем самым, злокачественной прогрессии [25,61,230]. С одной стороны, клетки злокачественного новообразования оказывают системное воздействие на организм и влияют на функциональную активность клеток крови, а с другой стороны, лейкоциты крови, составляют функциональный резерв для клеток микроокружения опухоли [24,27,33]. Таким образом, формируется цитокиновая сеть, регулирующая опухолевую прогрессию. Для оценки функционального резерва клеток крови по продукции цитокинов, в нашем исследовании были использованы поликлональные активаторы, представляющие собой комплекс митогенов. В результате проведенного исследования было установлено, что ИВпа на продукцию цитокинов зависит не только от установленного диагноза, но и от возраста больных. Оказалось, что у больных ИКНТ МЖ после 60 лет снижается ИВпа на продукцию ГЬ-2 и ГЬ-17. Полученные результаты свидетельствуют о снижении функциональной активности Т-клеток, которые являются основными продуцентами этих цитокинов [131,133,166,278]. Установленные различия также характерны для больных НЗЗ МЖ, однако, помимо снижения ИВпа на продукцию ГЬ-2 и ГЬ-17, у больных в возрастной группе 60 лет и старше отмечалось снижение ИВпа на продукцию ГЬ-10 и №N-7. Полученные различия объясняются существованием иммуносенесценции - физиологической дисфункции иммунной системы, ассоциированной с возрастом [69-73]. Известно, что большинство Т-клеток продуцируя ГЬ-10 и ГКМ-у, обладают

сильной иммуносупрессирующей активностью и демонстрируют преобладание иммуномодулирующей активности над ТЫ-опосредованным механизмом иммуноактивации и способствуют индукции и/или распространению иммунологической толерантности [94-96, 160,164]. Таким образом, анализировать продукцию цитокинов клетками крови под влиянием поликлональных активаторов необходимо с учетом возрастных особенностей больных ИКНТ и НЗЗ МЖ. У больных ИКНТ МЖ с метастазами в регионарных лимфатических узлах в возрастной группе до 60 лет отмечалось снижение ИВпа только на продукцию ГЬ-1р, по сравнению с больными без метастазов в этой же возрастной группе. Что касается больных ИКНТ МЖ в возрастной группе 60 лет и старше, то у больных с метастазами в регионарных лимфатических узлах отмечалось снижение ИВпа на продукцию ряда цитокинов: ГЬ-Жа, ГЬ-6, ГЬ-8, G-CSF и GM-CSF, по сравнению с больными без метастазов. Снижение функционального резерва клеток крови по продукции ГЬ-Жа, ГЬ-6, ГЬ-8, G-CSF и GM-CSF у больных ИКНТ МЖ связано не только с метастатической прогрессией, но и возрастной индукцией провоспалительного фенотипа SASP - еще одного процесса, обусловленного иммуносенесценцией [49,69,74-76]. Повышенная спонтанная продукция этих цитокинов у больных ИКНТ МЖ с метастазами в регионарных лимфатических узлах поддерживает низкую степень адаптивного иммунного ответа, а также способствует опухолевой прогрессии, перепрограммируя опухолевое микроокружение в иммуносупрессивное состояние [28,49,64,148]. Поэтому, на основании биологических эффектов ГЬ-1р, ГЬ-Жа и ГЬ-6, а именно -супрессирующего влияния ГЬ-Жа на ГЬ-1-индуцированную продукцию ГЬ-6, а также стимулирующего влияния комбинации ГЬ-1р и ГЬ-6 на продукцию растворимой формы ГЬ-Жа [120,123,148,279] было предложено соотношение ИВпа ГЬ-1р х ГЬ-6 / ГЬ-Жа. Значение соотношения ИВпа ГЬ-1р х ГЬ-6 / ГЬ-Жа < 80,0 у.е. у больных ИКНТ МЖ соответствует наличию метастазов в 72,5% случаев и может быть использовано для диагностики метастазирования ИКНТ МЖ в регионарные лимфатические узлы еще в дооперационном периоде и, следовательно, повлиять на выбор неоадьювантной терапии у этих больных. Составленное соотношение с одной стороны применимо к больным ИКНТ МЖ вне зависимости от их возраста, а с другой - только для больных с люминальными молекулярно-генетическими подтипами опухолей: люминальным А, люминальным В НЕЯ2-негативным и люминальным В НЕЯ2-позитивным. Известно, что ГЬ-1р и ГЬ-6 учувствуют в патогенезе эстроген-зависимого рака молочной железы, способствуя переходу фенотипа люминальных клеток в базальные, что является одним из механизмов, определяющих резистентность к таргетной терапии люминальных подтипов опухолей [41,59,146]. Кроме того, известно, что ГЬ-6 регулирует биологическую активность ферментов, участвующих в синтезе эстрогена и прогестерона - 17P-HSD и 3P-HSD, что может способствовать пролиферации и выживанию

люминальных злокачественных клеток [59]. Также, при анализе ИВпа на продукцию цитокинов клетками крови у больных ИКНТ МЖ при различных молекулярно-генетических подтипах были установлены особенности, характерные только для люминального В НЕЯ^-позитивного молекулярно-генетического подтипа. Этот подтип характеризовался наиболее высокими показателями ИВпа на продукцию ГЬ-Жа, 1Ь-6, 1Ь-8 и №N-7 во всех исследуемых возрастных группах. На основании полученных результатов, и с учетом того, что ГЬ-6 и ГЬ-8 потенцируют биологические эффекты друг друга [150,151,280], был предложен коэффициент, представляющий собой произведение ИВпа ГЬ-6 х ГЬ-8. У больных ИКНТ МЖ значение коэффициента ИВпа ГЬ-6 х ГЬ-8 > 250 у.е. соответствовало люминальному В НЕК2 позитивному молекулярно-генетическому подтипу в 75,0% случаев.

При изучении влияния HLDF на продукцию цитокинов клетками крови было установлено, что у больных ИКНТ МЖ с метастазами в регионарных лимфатических узлах ИBнLDF на продукцию ГЬ-1р, ГЬ-6, Т№-а и G-CSF ниже, чем у больных без метастазов. Известно, что ГЬ-1р, ГЬ-6, Т№^а и G-CSF являются плейотропными цитокинами, регулирующими пролиферацию и дифференцировку многих типов клеток-предшественников [123,147,177,194]. ГЬ-1р и ГЬ-6 стимулируют дифференцировку и пролиферацию лимфоцитов, а также эпителиальных, мезенхимальных, эндотелиальных, мышечных, нервных и злокачественных клеток [56,114,146]. Т№^а влияет на процессы нейрональной и остеогенной дифференцировки, а G-CSF инициирует дифференцировку миелоидных клеток-предшественников в фенотипически зрелые нейтрофилы [177,193,194]. Применимость предложенного соотношения ГЬ-1р х ГЬ-6 / ГЬ-Жа, была проверена для HLDF. Оказалось, что значение соотношения ИBнLDF ГЬ-1р х ГЬ-6 / ГЬ-Жа < 10 у.е. у больных ИКНТ МЖ соответствовало наличию метастазов в 75,0% случаев, что еще раз подчеркивает значимость предложенного соотношения с диагностической точки зрения.

Процессом, регулируемым эффектами цитокиновой сети и непосредственно связанным с реализацией метастатического потенциала злокачественного новообразования, является процесс аберрантного ремоделирования внеклеточного матрикса [242,244,246]. Структурно-функциональные изменения внеклеточного матрикса обеспечивают рекрутирование лейкоцитов крови в преметастатическую нишу [244,247,248]. Таким образом, цитокины индуцируют секрецию и способствуют активации матриксных металлопротеиназ и адамализинов, которые, при деградации внеклеточного матрикса обеспечивают высвобождение цитокинов с матрикринным типом действия, участвующих в процессах пролиферации, дифференцировки, миграции и клеточной гибели как иммунных, так и злокачественных клеток [53,207,241]. При оценке взаимосвязи между показателями продукции цитокинов клетками крови и

патогистологическими параметрами внеклеточного матрикса, оказалось, что больные ИКНТ МЖ имеют следующие прямые корреляционные связи: между ИВпа на продукцию ГЬ-1р, ГЬ-1Яа ГЬ-6, G-CSF и относительной площадью дегенеративно-измененных коллагеновых волокон. Полученные результаты согласуются с ранее установленными различиями между ИВпа на продукцию этих цитокинов у больных ИКНТ МЖ с метастазами в регионарных лимфатических узлах и без метастазов. Таким образом, выявленные корреляционные связи еще раз подчеркивают важную патогенетическую роль ГЬ-1р, ГЬ-1Яа, ГЬ-6 и G-CSF в реализации злокачественной прогрессии. При оценке патогистологических параметров внеклеточного матрикса больные ИКНТ и НЗЗ МЖ различались по всем исследуемым признакам. Также, выраженные различия были получены между больными ИКНТ МЖ с метастазами в регионарных лимфатических узлах и больными без метастазов. Основываясь на статистически значимых различиях между исследуемыми патогистологическими параметрами внеклеточного матрикса ИКНТ МЖ, был выявлен порог, который в 100,0% случаев показал соответствие состояния внеклеточного матрикса наличию метастазов в регионарных лимфатических узлах. Сумма баллов > 4 свидетельствовала о наличии метастазов в регионарных лимфатических узлах в 100,0% случаев, а сумма баллов 2-3 об их отсутствии в 84,0% случаев. При персонализированном рассмотрении больных ИКНТ МЖ, у которых не было диагностировано метастазов в регионарных лимфатических узлах, но сумма баллов, полученная при оценке патогистологических параметров внеклеточного матрикса, соответствовала больным ИКНТ МЖ с метастазами, было установлено, что у 11 из 12 больных значение соотношения ИВпа ГЬ-1Р х ГЬ-6 / ГЬ-1Яа соответствовало наличию метастазов. Согласно литературным данным, у 2550% больных неметастатическим раком молочной железы, после хирургического лечения, даже на фоне адъювантной терапии, развивается или рецидив данного заболевания или новый злокачественный очаг, сопровождающийся, чаще всего, метастатическим поражением [4-6]. Поэтому, не исключено, что именно те больные ИКНТ МЖ, которые по состоянию внеклеточного матрикса и предложенному соотношению ИВпа ГЬ-1р х ГЬ-6 / ГЬ-1Яа показали соответствие наличию метастазов в регионарных лимфатических узлах, могут составить группу риска по лимфогенному метастазированию в послеоперационном периоде.

Согласно теории обратимой клеточной пластичности, некоторые злокачественные клетки способны обратимо переходить между состояниями различной степени дифференцировки [96,252]. На основании этого возникла концепция дифференцирующей терапии, обеспечивающая реверсию злокачественного фенотипа в незлокачественный [251,253,257]. С учетом того, что нарушение дифференцировки является важнейшим этапом онкогенеза, интерес представляет изучение факторов, обладающих дифференцирующей

активностью, к числу которых относится HLDF. В результате проведенного исследования, было установлено, что культивирование образцов ИКНТ МЖ в среде с добавлением HLDF приводит к снижению относительного содержания низкодифференцированных клеток и увеличению относительного содержания высокодифференцированных клеток, причем без изменения абсолютного количества клеток и количества физиологических и патологических митозов. Полученные результаты непосредственно связаны с дифференцирующей активностью HLDF, и демонстрируют отсутствие цитотоксических эффектов у данного фактора in vitro. В зависимости от выраженности дифференцирующего влияния HLDF на клетки ИКНТ МЖ, все больные были разделены на две группы - больные с реакцией на HLDF и больные без реакции на HLDF. Больные без реакции на HLDF характеризовались изначально более низким количеством низкодифференцированных клеток в опухоли, нежели больные с реакцией на HLDF. Известно, что опухоли, в которых преобладают низкодифференцированные клетки, имеют более высокую степень злокачественности и склонны к раннему метастазированию и к высокой частоте возникновения рецидивов [252,255]. При персонализированном рассмотрении больных ИКНТ МЖ удалось установить, что у всех 14 больных с метастазами в регионарных лимфатических узлах наблюдалась реакция на HLDF, то есть образцы наиболее агрессивных форм ИКНТ МЖ показали более сильную ответную реакцию на воздействие изучаемого фактора дифференцировки. При оценке ИВпа на продукцию цитокинов клетками крови у больных ИКНТ МЖ, в зависимости от реакции клеток опухоли на дифференцирующую активность HLDF, было установлено пороговое значение ИВпа на продукцию VEGF (< 30 у.е.), которое в 100,0% случаев соответствовало наличию реакции клеток опухоли на воздействие изучаемого фактора дифференцировки. Больные с реакцией на HLDF характеризовались более низким функциональным резервом клеток крови по продукции VEGF, что соответствовало более низкодифференцированным и, следовательно, более злокачественным вариантам ИКНТ МЖ у этих больных. Высокая спонтанная продукция VEGF у больных с более низкодифференцированными вариантами опухолей обусловлена биологическими эффектами этого цитокина. Известно, что VEGF является основным индуктором неоангиогенеза и неолимфангиогенеза, а также способствует увеличению химиорезистентности при злокачественных новообразованиях [201,202,260]. Не исключено, что оценка ИВпа на продукцию VEGF клетками крови, может стать критерием, отражающим эффективность применения HLDF у больных ИКНТ МЖ.

Таким образом, дифференцирующая терапия ИКНТ МЖ на основе HLDF является перспективным направлением для дальнейших исследований. Не исключено, что данный подход к лечению ИКНТ МЖ позволит остановить или даже реверсировать злокачественную

прогрессию, а также увеличить чувствительность злокачественных клеток к современным онкотерапевтическим препаратам.

102 4. Выводы

1. Обнаружена возрастная специфика, заключающаяся в том, что при заболеваниях молочной железы в возрастной группе 60 лет и старше, по сравнению с больными до 60 лет, снижается индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-2 и IL-17 клетками крови больных инвазивной карциномой неспецифического типа и индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-2, IL-10, IL-17 и IFN-y клетками крови больных незлокачественными заболеваниями.

2. У больных инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы с метастазами в регионарных лимфатических узлах, по сравнению с больными без метастазов, снижается индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1ß клетками крови в возрастной группе до 60 лет и индекс влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1Ra, IL-6, IL-8, G-CSF и GM-CSF в возрастной группе 60 лет и старше, а также индекс влияния Human Leukemia Differentiation Factor на продукцию IL-1ß, IL-6, TNF-a и G-CSF независимо от возраста больных. Полученные результаты могут использоваться в качестве дополнительных методов дооперационной диагностики наличия метастазов в регионарных лимфатических узлах.

3. Для люминального B НЕЯ^-позитивного молекулярно-генетического подтипа инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы характерна особенность -наиболее высокие значения индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1Ra, IL-6, IL-8 и IFN-y клетками крови по сравнению с другими молекулярно-генетическими подтипами.

4. Для больных незлокачественными заболеваниями молочной железы с высоким риском злокачественной трансформации характерно снижение индекса влияния раково-эмбрионального антигена на продукцию IL-6 и IL-8 клетками крови и его повышение на продукцию IL-10, по сравнению с больными незлокачественными заболеваниями с низким риском злокачественной трансформации. Полученные результаты могут использоваться в качестве дополнительного метода дооперационной диагностики незлокачественного заболевания с высоким риском злокачественной трансформации.

5. Human Leukemia Differentiation Factor влияет на снижение относительного содержания низкодифференцированных клеток и увеличение относительного содержания высокодифференцированных клеток инвазивной карциномы неспецифического типа молочной

железы in vitro, что позволяет рассматривать этот фактор дифференцировки в качестве кандидата для дифференцирующей терапии инвазивной карциномы неспецифического типа.

6. Оценка индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию VEGF клетками крови может явиться критерием отбора больных инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, для которых будет эффективна дифференцирующая терапия на основе Human Leukemia Differentiation Factor.

7. Значения индекса влияния поликлональных активаторов на продукцию IL-1ß, IL-1Ra, IL-6 и G-CSF клетками крови у больных инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы находятся в прямой корреляционной связи с относительной площадью дегенеративно-измененных коллагеновых волокон, что подчеркивает важную патогенетическую роль этих цитокинов в реализации злокачественной прогрессии.

8. Относительная площадь дегенеративно-измененных коллагеновых волокон и относительная площадь коллагеновых волокон с измененными тинкториальными свойствами, сопряжены с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах и могут использоваться для составления группы риска по лимфогенному метастазированию в послеоперационном периоде.

Список сокращений и условных обозначений

ВРЗТ - Высокий Риск Злокачественной Трансформации ДНК - Дезоксирибонуклеиновая Кислота ИВ - Индекс Влияния

ИКНТ - Инвазивная Карцинома Неспецифического Типа

кДа - Килодальтон

МЖ - Молочная Железа

НЗЗ - Незлокачественные Заболевания

НРЗТ - Низкий Риск Злокачественной Трансформации

ПА - Поликлональные Активаторы

РНК - Рибонуклеиновая Кислота

РЭА - Раково-эмбриональный Антиген

AGIF - Adipogenesis Inhibitory Factor

AICD - Activation-Induced Cell Death

AP-1 - Activator Protein 1

ATM - Ataxia-Telangiectasia Mutated

Bcl-2 - B-cell Lymphoma 2

Bcl-xL - B-cell Lymphoma-extra Large

BCSCs - Breast Cancer Stem Cells

BRCA1 - Breast Cancer Type 1 Susceptibility Protein

BRCA2 - Breast Cancer Type 2 Susceptibility Protein

BRIP1 - BRCA1 Interacting Protein C-Terminal Helicase 1

CEACAM5 - Carcinoembryonic Antigen-Related Cell Adhesion Molecule 5

cFLIP - Cellular FLICE-like Inhibitory Protein

CHEK2 - Checkpoint Kinase 2

CIML - Cytokine-Induced Memory-Like

ConA - Concanavalin A

COX-2 - Cyclooxygenase-2

CSIF - Human Cytokine Synthesis Inhibitory Factor CYP19 - Aromatase Cytochrome P450

DAMP - Damage-Associated Molecular Patterns

DMEM-F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12

FASN - Fatty-acid Synthase Gene

FGF2 - Fibroblast Growth Factor 2

GP130 - Glycoprotein 130

GPCR - G Protein-Coupled Receptors

G-CSF - Granulocyte-colony Stimulating Factor

G-CSFR - Granulocyte-colony Stimulating Factor Receptor

GM-CSF - Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor

GM-CSFR - Granulocyte-macrophage Colony-stimulating Factor Receptor

GPI - Glycosylphosphatidylinositol

HDACi - Histone Deacetylase Inhibitors

HER2 - Human Epidermal Growth Factor Receptor 2

HL-60 - Human Promyelocytic Leukemia Cell Line

HLDF - Human Leukemia Differentiation Factor

HNRNPM - Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein M

IDO1 - Indoleamine-Pyrrole 2,3-Dioxygenase

IFNGR1 - IFN-y Receptor 1

IFNGR2 - IFN-y Receptor 2

IFN-y - Interferon y

IGF-1 - Insulin-like Growth Factor 1

IGF-1R - Insulin-like Growth Factor Type 1 Receptor

IL - Interleukin

IL-10Ra - IL-10 Receptor a

IL-10RP - IL-10 Receptor p

IL-17RA - IL-17 Receptor A

IL-17RC - IL-17 Receptor C

IL-2Ra - IL-2 Receptor a

IL-2RP - IL-2 Receptor p

IL-2Ry - IL-2 Receptor y

IL-4Ra - IL-4 Receptor a IL-4Ry - IL-4 Receptor у IL-6Ra - IL-6 Receptor a IL-8Ra - IL-8 Receptor a IL-8Rß - IL-8 Receptor ß IRF3 - Interferon Regulatory Factor 3

JAK/STAT - Janus Kinase/Signal Transducers and Activators of Transcription

JAK1 - Janus Kinase 1

JAK3 - Janus Kinase 3

LIF - Leukemia Inhibitory Factor

LPS - Lipopolysaccharide

MAPK/ERK - Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular Signal-Regulated Kinase MCP-1 - Monocyte Chemoattractant Protein-1 MDSC - Myeloid-Derived Suppressor Cells

NF-kB - Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B Cells

NK-клетки - Натуральные Киллеры (Natural killer cells)

OSM - Oncostatin M

PALB2 - Partner and Localizer of BRCA2

PAMP - Pathogen-Associated Molecular Pattern

PD-1/PD-L1 - Programmed Death-Ligand 1

PED - Phosphoprotein Enriched in Diabetes

PGE2 - Prostaglandin E2

PI3K/Akt/mTOR - Phosphatidylinositol-3-Kinase/Akt/Mammalian Target of Rapamycin

PPARy - Peroxisome Proliferator-activated Receptor у

PTEN - Phosphatase and Tensin Homolog

RAD51C - RAD51 Paralog C

RAR - Retinoic Acid Receptor

ROS - Reactive Oxygen Species

SASP - Senescence-Associated Secretory Phenotype

Src - Non-Receptor Tyrosine Kinase Src

sTNF - Soluble Tumor Necrosis Factor

TACE - Tumor Necrosis Factor-a-Converting Enzyme

TCTP - Translationally Controlled Tumour Protein

TIMP - Tissue Inhibitor of Metalloproteinase

TNFR1 - Tumor Necrosis Factor Receptor 1

TNFR2 - Tumor Necrosis Factor Receptor 2

TNF-a - Tumor Necrosis Factor a

TP53 - Tumor Protein p53

TRAFs - TNF Receptor Associated Factors

VCAM-1 - Vascular Cell Adhesion Molecule 1

VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor

VEGFR - Vascular Endothelial Growth Factor Receptor

MHC-II - Major Histocompatibility Complex class II

PHA-M - Phytohemagglutinin M

PHA-P - Phytohemagglutinin P

3ß-HSD - 3ß-Hydroxysteroid Dehydrogenase

17ß-HSD - 17ß-Hydroxysteroid Dehydrogenases

1. Merino Bonilla, J.A. Breast cancer in the 21st century: from early detection to new therapies / J.A. Merino Bonilla, M. Torres Tabanera, L.H. Ros Mendoza // Radiologia. - 2017. - V. 59. - № 5. -P. 368-379.

2. Peart, O. Metastatic Breast Cancer / O. Peart // Radiol. Technol. - 2017. - V. 88 - № 5. - P. 519-539.

3. Spano, D. Molecular networks that regulate cancer metastasis / D. Spano, C. Heck, P. De Antonellis et al. // Semin. Cancer Biol. - 2012. - V. 22. - № 3. - P. 234-249.

4. Lorusso, G. New insights into the mechanisms of organ-specific breast cancer metastasis / G. Lorusso, C. Ruegg // Semin. Cancer Biol. - 2012. - V. 22. - № 3. - P. 226-233.

5. Barinoff, J. Clinicopathological differences between breast cancer in patients with primary metastatic disease and those without: a multicentre study / J. Barinoff, R. Hils, A. Bender et al. // Eur. J. Cancer. - 2013 - V. 49. - № 2. - P. 305-311.

6. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials / Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG) // Lancet. - 2005. -V. 365. - № 9472. - P. 1687-1717.

7. Sopik, V. The relationship between tumour size, nodal status and distant metastases: on the origins of breast cancer / V. Sopik, S.A. Narod // Breast Cancer Res. Treat. - 2018. - V. 170. - № 3. -P. 647-656.

8. Hosseini, H. Early dissemination seeds metastasis in breast cancer / H. Hosseini, M.S. Obradovic, M. Hoffmann et al. // Nature. - 2016. - V. 540. - № 7634. - P. 552-558.

9. Provenzano, E. Molecular Classification of Breast Cancer / E. Provenzano, G.A. Ulaner, S.F. Chin // PET Clin. - 2018. - V. 13. - № 3. - P. 325-338.

10. Filippini, S.E. Breast cancer genes: beyond BRCA1 and BRCA2 / S.E. Filippini, A.Vega // Front. Biosci. - 2013. - V. 18. - P. 1358-1372.

11. Takaoka, M. BRCA1 gene: function and deficiency / M. Takaoka, Y. Miki // Int. J. Clin. Oncol. - 2018. - V. 23. - № 1. - P. 36-44.

12. Wendt, C. Identifying breast cancer susceptibility genes - a review of the genetic background in familial breast cancer / C. Wendt, S. Margolin // Acta Oncol. - 2019. - V. 58. - № 2. -P. 135-146.

13. Sun, Y.S. Risk Factors and Preventions of Breast Cancer / Y.S. Sun, Z. Zhao, Z.N. Yang et al. // Int. J. Biol. Sci. - 2017. - V. 13. - № 11. - P. 1387-1397.

14. Rojas, K. Breast Cancer Epidemiology and Risk Factors / K. Rojas, A. Stuckey // Clin. Obstet. Gynecol. - 2016. - V. 59. - № 4. - P. 651-672.

15. Samson, M. Progestin and breast cancer risk: a systematic review / M. Samson, N. Porter, O. Orekoya et al. // Breast Cancer Res. Treat. - 2016. - V. 155. - № 1. - P. 3-12.

16. Kotwal, A.A. Cancer Screening Among Older Adults: a Geriatrician's Perspective on Breast, Cervical, Colon, Prostate, and Lung Cancer Screening / A.A. Kotwal, L.C. Walter // Curr. Oncol. Rep. - 2020. - V. 22. - № 11. - P. 108.

17. Dyrstad, S.W. Breast cancer risk associated with benign breast disease: systematic review and meta-analysis / S.W. Dyrstad, Y. Yan, A.M. Fowler et al. // Breast Cancer Res. Treat. - 2015. - V. 149. - № 3. - P. 569-575.

18. Zendehdel, M. Subtypes of Benign Breast Disease as a Risk Factor of Breast Cancer: A Systematic Review and Meta Analyses / M. Zendehdel, F. Salamat, B. Niakan et al. // Iran J. Med. Sci. - 2018. - V. 43. - № 4. - P. 1-8.

19. Nassar, A. Ki-67 expression in sclerosing adenosis and adjacent normal breast terminal ductal lobular units: a nested case-control study from the Mayo Benign Breast Disease Cohort / A. Nassar, TL. Hoskin, M L. Stallings-Mann // Breast Cancer Res. Treat. - 2015. - V. 151. - № 1. - P. 89-97.

20. Salamat, F. Subtypes of Benign Breast Disease as a Risk Factor of Breast Cancer: A Systematic Review and Meta Analyses / F. Salamat, B. Niakan, A. Keshtkar et al. // Iran J. Med. Sci. -

2018. - V. 43. - № 4. - P. 355-364.

21. Vajpeyi, R. WHO Classification of Tumours: Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs / R. Vajpeyi // J. Clin. Pathol. - 2005. - V. 58. - № 6. - P. 671-672.

22. Cutuli, B. Ductal carcinoma in situ in 2019: Diagnosis, treatment, prognosis / B.Cutuli // Press. Med. - 2019. - V. 48. - № 10. - P. 1112-1122.

23. Wieder, T. Cytokine-induced senescence for cancer surveillance / T. Wieder, E. Brenner, H. Braumüller et al. // Cancer Metastasis Rev. - 2017. - V. 36. - № 2. - P. 357-365.

24. Lu, P. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression / P. Lu, V.M. Weaver, Z. Werb // J. Cell Biol. - 2012. - V. 196. - № 4. - P. 395-406.

25. Thorsson, V. The Immune Landscape of Cancer / V. Thorsson, D.L. Gibbs, S.D. Brown et al. // Immunity. - 2018. - V. 48. - № 4. - P. 812-830.

26. Hutmacher, C. Antibody-cytokine fusion proteins: Biopharmaceuticals with immunomodulatory properties for cancer therapy / C. Hutmacher, D. Neri // Adv. Drug. Deliv. Rev. -

2019. - V. 141. - P. 67-91.

27. Kaur, R.P. Analysis of pro- and anti-inflammatory cytokine gene variants and serum cytokine levels as prognostic markers in breast cancer / R.P. Kaur, K. Vasudeva, H. Singla et al. // J. Cell Physiol. - 2018. - V. 233. - № 12. - P. 9716-9723.

28. Tower, H. The Immune Microenvironment of Breast Cancer Progression / H. Tower, M. Ruppert, K. Britt // Cancers. - 2019. - V. 11. - № 9. - P. 1375.

29. Kostanyan, I.A. A biologically active fragment of the differentiation factor of the HL-60 line cells: Identification and properties / I.A. Kostanyan, M.V. Astapova, S.M. Dranitsyna, et al. // Rus. J. Bio. Chem. - 2000. - V. 26. - № 7. - P. 450-456.

30. Liu, C.C. Tumour-associated antigens and their anti-cancer applications / C.C. Liu, H. Yang, R. Zhang et al.// Eur. J. Canc. Care. - 2017. - V. 26. - № 5. - P. 1-2.

31. Lee, J.H. The Roles of Carcinoembryonic Antigen in Liver Metastasis and Therapeutic Approaches / J.H. Lee, S.W. Lee // Gastr. Res. and Prac. - 2017. - № 13. - P. 1-11.

32. Рыжикова, С.Л. Стандартизация методики определения продукции цитокинов клетками крови ex vivo / С.Л. Рыжикова, Ю.Г. Дружинина, Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин // Клин. Лаб. Диагн. - 2011. - № 11. C. 49-53.

33. Mehdipour, F. The significance of cytokine-producing B cells in breast tumor-draining lymph nodes / F. Mehdipour, M. Razmkhah, Z. Faghih et al. // Cell Oncol. - 2019. - V. 42. - № 3. - P. 381-395.

34. Hosokawa, H. Cytokines, Transcription Factors, and the Initiation of T-Cell Development /

H. Hosokawa, E.V. Rothenberg // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2018. - V. 10. - № 5. - P. 028621.

35. Yu, S.L. Immunopathological roles of cytokines, chemokines, signaling molecules, and pattern-recognition receptors in systemic lupus erythematosus / S.L. Yu, W.P. Kuan, C.K. Wong et al. // Clin. Dev. Immunol. - 2012. - V. 2012 - P. 715190.

36. Yoshimura, A. Negative Regulation of Cytokine Signaling in Immunity / A. Yoshimura, M. Ito, S. Chikuma et al. // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2018. - V. 10. - № 7. - P. 028571.

37. Palomino, D.C. Chemokines and immunity / D.C. Palomino, L.C. Marti // Einstein. - 2015. - V. 13. - № 3. - P. 469-73.

38. Garcia Moran, G.A. Cytokines, chemokines and growth factors / G.A. Garcia Moran, R. Parra-Medina, A G. Cardona et al. // El Rosario University Press. - 2013. - № 9 - P. 120-145.

39. Nagarsheth, N. Chemokines in the cancer microenvironment and their relevance in cancer immunotherapy / N. Nagarsheth, M.S. Wicha, W. Zou // Nat. Rev. Immunol. - 2017. - V. 17. - № 9. -P. 559-572.

40. Chen, W. Cytokines, breast cancer stem cells (BCSCs) and chemoresistance / W. Chen, Y. Qin, S. Liu // Clin. Transl. Med. 2018. - V. 7. - № 1. - P. 27.

41. Uciechowski, P. Interleukin-6: A Masterplayer in the Cytokine Network / P. Uciechowski, W.C. Dempke // Oncology. - 2020. - V. 98. - № 3. - P. 131-137.

42. Ungefroren, H. Signaling Crosstalk of TGF-ß/ALK5 and PAR2/PAR1: A Complex Regulatory Network Controlling Fibrosis and Cancer / H. Ungefroren, F. Gieseler, R. Kaufmann et al. // Int. J. Mol. Sci. - 2018. - V. 19. - № 6. - P. 1568.

43. Spangler, J.B. Insights into cytokine-receptor interactions from cytokine engineering / J.B. Spangler, I. Moraga, J.L. Mendoza et al. // Ann. Rev. Immunol. - 2015. - V. 33. - P. 139-167.

44. Yasmin, R. Epigenetic regulation of inflammatory cytokines and associated genes in human malignancies / R. Yasmin, S. Siraj, A. Hassan et al. // Mediators Inflamm. - 2015. - V. 2015. - P. 201703.

45. Karsten, E. Red blood cells are dynamic reservoirs of cytokines / E. Karsten, E. Breen, B.R. Herbert // Sci. Rep. - 2018. - V. 8. - № 1. - P. 3101.

46. Paoletti, C. Circulating Tumor Cells / C. Paoletti, D.F. Hayes // Adv. Exp. Med. Biol. -2016. - V. 882. - P. 235-258.

47. Bidard, F.C. Circulating tumor cells in breast cancer / F.C. Bidard, C. Proudhon, J.Y. Pierga // Mol. Oncol. - 2016. - V. 10. - № 3. - P. 418-30.

48. Rathinam, V.A. Innate immunity to intracellular LPS / V.A. Rathinam, Y. Zhao, F. Shao // Nat. Immunol. - 2019. - V. 20. - № 5. - P. 527-533.

49. Rea, I.M. Age and Age-Related Diseases: Role of Inflammation Triggers and Cytokines /

I.M. Rea, D.S. Gibson, V. McGilligan et al. // Front. Immunol. - 2018. - V. 9. - № 9. - P. 586.

50. Rossol, M. LPS-induced cytokine production in human monocytes and macrophages / M. Rossol, H. Heine, U. Meusch et al. // Crit. Rev. Immunol. - 2011. - V. 31. - № 5. - P. 379-446.

51. Sun, X. Exploring the Metabolic Vulnerabilities of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer / X. Sun, M. Wang, M. Wang et al. // Front. Cell Dev. Biol. - 2020. - V. 8. - P. 655.

52. Kotiyal, S. Breast cancer stem cells, EMT and therapeutic targets / S. Kotiyal, S. Bhattacharya // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2014. - V. 453. - № 1. - P. 112-116.

53. Boyd, D.F. Towards integrating extracellular matrix and immunological pathways / D.F. Boyd, Thomas P.G. // Cytokine. - 2017. - V. 98. - P. 79-86.

54. Monboisse, J.C. Matrikines: a new anticancer therapeutic strategy / J.C. Monboisse, K. Sénéchal, J. Thevenard et al. // Biol. Aujourdhui. - 2012. - V. 206. - № 2. - P. 111-123.

55. Lin, J.X. The Common Cytokine Receptor y Chain Family of Cytokines / J.X. Lin, W.J. Leonard // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2018. - V. 10. - № 9. - P. 028449.

56. Wei, H. Interleukin-10 Family Cytokines Immunobiology and Structure / H. Wei, B. Li, A. Sun et al. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2019. - V. 1172. - P. 79-96.

57. Dougan, M. GM-CSF, IL-3, and IL-5 Family of Cytokines: Regulators of Inflammation / M. Dougan, G. Dranoff, S.K. Dougan // Immunity. - 2019. - V. 50. - № 4. - P. 796-811.

58. Dinarello, C.A. The IL-1 family of cytokines and receptors in rheumatic diseases / C.A. Dinarello // Nat. Rev. Rheumatol. - 2019. - V. 15. - № 10. - P. 612-632.

59. Rose-John, S. Interleukin-6 Family Cytokines / S. Rose-John // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2018. - V. 10. - № 2. - P. 028415.

60. Fabre, J.S. The Interleukin-17 Family of Cytokines in Breast Cancer / J.S. Fabre, J. Giustinniani, C. Garbar et al. // Int. J. Mol. Sci. - 2018. - V. 19. - № 12. - P. 3880.

61. Lippitz, B.E. Cytokine patterns in patients with cancer: a systematic review / B.E. Lippitz // Lancet Oncol. - 2013. - V. 14. - № 6. - P. 218-228.

62. Edwardson, D.W. Chemotherapy and Inflammatory Cytokine Signalling in Cancer Cells and the Tumour Microenvironment / D.W. Edwardson, A.M. Parissenti, A.T. Kovala // Adv. Exp. Med. Biol. - 2019. - V. 1152. - P. 173-215.

63. Banerjee, K. Constitutive activation of STAT3 in breast cancer cells: A review / K. Banerjee, H. Resat // Int. J. Cancer. - 2016. - V. 138. - № 11. - P. 2570.

64. Lim, B. Inflammatory breast cancer biology: the tumour microenvironment is key / B. Lim, W.A. Woodward, X. Wang et al. // Nat. Rev. Cancer. - 2018. - V. 18. - № 8. - P. 485-499.

65. Srivastava, J. Non-canonical Stat3 signaling in cancer / J. Srivastava, J. DiGiovanni // Mol. Carcinog. - 2016. - V. 55. - № 12. - P. 1889-1898.

66. Suarez-Carmona, M. EMT and inflammation: inseparable actors of cancer progression / M. Suarez-Carmona, J. Lesage, D. Cataldo et al. // Mol. Oncol. - 2017. - V. 11. - № 7. - P. 805-823.

67. Markopoulos, G.S. Epigenetic Regulation of Inflammatory Cytokine-Induced Epithelial-To-Mesenchymal Cell Transition and Cancer Stem Cell Generation / G.S. Markopoulos, E. Roupakia, K.B. Marcu et al. // Cells. - 2019. - V. 8. - № 10. - P. 1143.

68. Karlsson, M.C. Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis through the lymphatic system / M.C. Karlsson, S.F. Gonzalez, J. Welin et al. // Mol. Oncol. - 2017. - V. 11. - № 7. - P. 781-791.

69. Fane, M. How the ageing microenvironment influences tumour progression / M. Fane, A.T. Weeraratna // Nat. Rev. Cancer. - 2020. - V. 20. - № 2. - P. 89-106.

70. Milan-Mattos, J.C. Effects of natural aging and gender on pro-inflammatory markers / J.C. Milan-Mattos, F.F. Anibal, N.M. Perseguini et al. // Braz. J. Med. Biol. Res. - 2019. - V. 52. - № 9. -P. 8392.

71. Weyand, C.M. Aging of the Immune System. Mechanisms and Therapeutic Targets / C.M. Weyand, J.J. Goronzy // Ann. Am. Thorac. Soc. - 2016. - V. 13. - № 5.- P. 422-428.

72. Calcinotto, A. Cellular Senescence: Aging, Cancer, and Injury / A. Calcinotto, J. Kohli, E. Zagato et al. // Physiol. Rev. - 2019. - V. 99. - № 2. - P. 1047-1078.

73. Pawelec, G. Immunosenescence and cancer / G. Pawelec // Biogerontology. - 2017. - V. 18. - № 4. - P. 717-721.

74. Rao, S.G. SASP: Tumor Suppressor or Promoter? Yes! / S.G. Rao, J.G. Jackson. // Trends Cancer. - 2016. - V. 2. - № 11. - P. 676-687.

75. Loo, T.M. Cellular senescence and senescence-associated secretory phenotype via the cGAS-STING signaling pathway in cancer / T.M. Loo, K. Miyata, Y. Tanaka et al. // Cancer Sci. -2020. - V. 111. - № 2. - P. 304-311.

76. Faget, D.V. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. D.V. Faget, Q. Ren, S.A. Stewart // Nat. Rev. Cancer. - 2019. - V. 19. - № 8. - P. 439-453.

77. Kim, Y.H. Cellular senescence in cancer / Y.H. Kim, T.J. Park // BMB. Rep. - 2019. - V. 52. - № 1. - P. 42-46.

78. Gonzalez-Meljem, J.M. Paracrine roles of cellular senescence in promoting tumourigenesis / J.M. Gonzalez-Meljem, J R. Apps, H.C. Fraser et al. // Br. J. Cancer. - 2018. - V. 118. - № 10. - P. 1283-1288.

79. Rubin, J.B. Sex differences in cancer mechanisms / J.B. Rubin, J.S. Lagas, L. Broestl et al. // Biol. Sex. Differ. - 2020. - V. 11. - № 1. - P. 17.

80. Özdemir, B.C. Sex Hormones and Anticancer Immunity / B.C. Özdemir, G.P. Dotto // Clin. Cancer Res. - 2019. - V. 25. - № 15. - P. 4603-4610.

81. Sestak, I. Risk stratification in early breast cancer in premenopausal and postmenopausal women: integrating genomic assays with clinicopathological features / I. Sestak // Curr. Opin. Oncol. -2019. - V. 31. - № 1. - P. 29-34.

82. Wilson, C. The endocrine influence on the bone microenvironment in early breast cancer / C. Wilson, H. Brown, I. Holen // Endocr. Relat. Cancer. - 2016. - V. 23. - № 12. - P. 567-576.

83. Parida, S. The Microbiome-Estrogen Connection and Breast Cancer Risk / S. Parida, D. Sharma // Cells. - 2019. - V. 8. - № 12. - P. 1642.

84. Coppe, J.P. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression / J.P. Coppe, P.Y. Desprez, A. Krtolica et al. // Annu. Rev. Pathol. - 2010. - V. 5. - P. 99118.

85. Salminen, A. Emerging role of NF-kB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP) / A. Salminen, A. Kauppinen, K. Kaarniranta // Cell Signal. - 2012. - V. 24. - № 4. - P. 835-845.

86. Ortiz-Montero, P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line / P. Ortiz-Montero, A. Londono-Vallejo, J.P. Vernot // Cell Commun. Signal. - 2017. -V. 15. - № 1. - P. 17.