Вклад рибосомного белка S1 в структуру и функцию Qβ-репликазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Кутлубаева, Зарина Шаймуратовна

• Кутлубаева, Зарина Шаймуратовна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Кутлубаева, Зарина Шаймуратовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Матрицы Qß-репликазы

1.1.1 Реплицирующиеся РНК

1.1.2 Нереплицирующиеся РНК

1.1.3 «Законные» и «незаконные» матрицы

1.2 Репликационный цикл Qß-репликазы

1.3 Субъединичный состав Qß-репликазы

1.3.1 Каталитическая ß-субъединица

1.3.2 Факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts

1.3.3 Рибосомный белок S1

1.4 Структурные исследования Qß-репликазы

1.5 Структурные исследования рибосомного белка S1

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Микробиологические методы

2.1.1 Штаммы Escherichia coli

2.1.2 Микробиологические среды

2.1.3 Трансформация

2.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами

2.2.1 Плазмиды

2.2.2 Аналитическое выделение плазмидной ДНК

2.2.3 Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.2.4 Транскрипция in vitro

2.2.5 Очистка РНК с помощью электрофореза и последующей элюции из геля

2.2.6 Фенольная обработка нуклеиновых кислот

2.2.7 Осаждение нуклеиновых кислот этанолом

2.3 Методы работы с белками

2.3.1 Получение коровой части QP-репликазы дикого типа

2.3.2 Получение коровой части QP-репликазы, содержащей слитые субъединицы

2.3.3 Получение рибосомного белка и его №концевых фрагментов

2.3.4 Получение комплекса коровой части QP-репликазы с белком или его фрагментами

2.4 Реакции с участием QP-репликазы

2.4.1 Репликация РНК

2.4.2. Проверка матричной активности QP(-)-РНК

2.5 Кристаллизация комплекса кора слитой QP-репликазы и фрагмента ОВ1-2 или ОВ1-3

2.5.1 Условия кристаллизации

2.5.2 Исследование кристаллов

2.6 Определение структуры комплекса кора QP-репликазы и фрагмента ОВ1-2

2.7 Анализ взаимодействия РНК и фрагмента ОВ1-2 с помощью ЯМР

2.8 Электрофоретические методы

2.8.1 Электрофорез нуклеиновых кислот

2.8.2 Денатурирующий электрофорез белков

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Цели и экспериментальные задачи

3.2 Роль рибосомного белка в репликации РНК

3.2.1 Влияние белка на инициацию репликации РНК

3.2.2 Белок стимулирует накопление одноцепочечной РНК

3.2.3 Эффект белка на элонгацию и терминацию репликации РНК

3.2.4 Встраивание белка в состав QP-репликазы во время элонгации

3.3 Поиск ОВ-фрагмента Б1, являющегося функциональным аналогом полноразмерного белка

3.4 Влияние белка на копирование QP(-)-РНК

3.5 Влияние белка на репликацию RQ РНК

3.6 Кристаллизация комплекса коровой части QP-репликазы и фрагмента белка

3.6.1 Выбор варианта Qß-репликазы для кристаллизации

3.6.2 Выделение белков

3.6.3 Получение комплексов коровой части Qß-репликазы и фрагмента ОВ1-2 или ОВ1-3

3.6.4 Подбор условий кристаллизации комплекса коровой части Qß-репликазы и фрагмента ОВ1-2 или ОВ1-3

3.6.5 Решение пространственной структуры

3.7 Структура комплекса коровой части Qß-репликазы и фрагмента ОВ1-2

3.8 Анализ равновесного взаимодействия фрагмента ОВ1-2 и РНК с помощью ЯМР

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Рибосомный белок S1 выполняет две разные функции при синтезе РНК Qß-репликазой

4.1.1 Антисолевая защита инициации копирования Qß(+)-?HK

4.1.2 Роль фактора терминации при размножении законных матриц Qß-репликазы

4.2 Фрагменты S1, являющиеся функциональными аналогами полноразмерного белка S1

4.3 Структурные исследования роли S1 в составе Qß-репликазы

4.4 Сравнение с другой опубликованной структурой комплекса коровой части Qß-репликазы и фрагмента белка S1

4.5 Сходство взаимодействий белка S1 с Qß-репликазой и рибосомой

4.6 Перспективы

ВЫВОДЫ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вклад рибосомного белка S1 в структуру и функцию Qβ-репликазы»

ВВЕДЕНИЕ

Белок S1, в отличие от большинства других рибосомных белков, выполняет множество различных функций в клетках E. coli. Помимо того, что этот белок принимает участие в трансляции и ее регуляции, он также вовлечен в процессы транскрипции, транс-трансляции, авторегуляции собственного синтеза и контроля стабильности мРНК. Способность S1 связывать и белки и РНК лежит в основе его функционирования не только в нормальных, но и в инфицированных клетках. В частности, рибосомный белок S1 входит в состав РНК-зависимых РНК-полимераз вирусов семейства Leviviridae, в том числе - в состав репликазы фага Qß. Бактериофаг Qß - один из наиболее просто устроенных вирусов, паразитирующих на клетках E. coli, образующих F-пили. Геном фага представлен одноцепочечной РНК (4217 нуклеотидов), амплификация которой осуществляется Qß-репликазой. Qß-репликаза - РНК-зависимая РНК-полимераза, в состав которой, помимо рибосомного белка S1, входят факторы элонгации трансляции EF-Tu и EF-Ts, а также кодируемая геномом фага каталитическая ß-субъединица.

Qß-репликаза имеет уникальную способность экспоненциально размножать РНК in vitro. Фермент обладает высокой матричной специфичностью и амплифицирует только РНК бактериофага Qß и короткие сателлитные RQ РНК (Replicable by Qß-replicase), при этом клеточные РНК или геномные РНК фагов близкородственных семейств не реплицируются. Важно отметить, что матрицей Qß-репликазы может служить только одноцепочечная РНК, на которой синтезируется комплементарная цепь. Двуцепочечная РНК не может быть использована ферментом в качестве матрицы.

Известно, что рибосомный белок S1 можно относительно легко отделить от остальных субъединиц Qß-репликазы, составляющих коровую часть фермента. Долгое время считалось, что белок S1 строго необходим для синтеза на Qß(+)-РНК и не нужен для репликации других матриц Qß-репликазы (Qß(-)-РНК и RQ РНК). При этом из литературных данных следовало, что белок S1 нужен только на стадии инициации на Qß(+)-РНК, облегчая связывание Qß-репликазы с матрицей, и не влияет на элонгацию и терминацию репликации.

Однако недавно в нашей лаборатории было показано, что белок S1 многократно усиливает экспоненциальный синтез сателлитных RQ РНК. В связи с этим возникла необходимость в прямом исследовании влияния S1 на различные стадии репликации РНК (инициацию, элонгацию и терминацию). RQ РНК из-за своей относительно небольшой длины (от нескольких десятков до нескольких сотен нуклеотидов) реплицируются очень быстро, что не позволяет использовать их для изучения отдельных этапов репликационного цикла. Для решения этой проблемы в качестве матрицы для репликации можно использовать Qß РНК, длина которой составляет 4217 нуклеотидов.

Анализ структуры холофермента помог бы понять механизм действия S1 в составе QP-репликазы. Однако к началу выполнения данной работы получена кристаллическая структура лишь коровой части фермента, т. е. QP-репликазы без S1. Объясняется это тем, что белок S1 слабо связан с коровой частью QP-репликазы и присутствует не во всех молекулах фермента, что приводит к гетерогенности препарата. К тому же известно, что рибосомный белок S1 состоит из шести доменов, подвижных относительно друг друга, из-за чего не имеет жесткой компактной структуры. Все это препятствует кристаллизации, а вместе с тем и выяснению механизма действия S1. Решить проблему можно было бы, используя для кристаллизации укороченные фрагменты белка S1, способные функционально замещать полноразмерный белок при репликации РНК.

Таким образом, целью данной работы было выяснение вклада рибосомного белка S1 в структуру и функцию QP-репликазы. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) выяснить, как и на какую стадию репликационного цикла действует рибосомный белок

S1;

2) сравнить действие белка S1 на копирование плюс и минус цепочек QP РНК, а также коротких реплицирующихся РНК;

3) выяснить, какой минимальный фрагмент белка S1 способен функционально замещать полноразмерный белок в репликации РНК;

4) получить пригодные для рентгеноструктурного анализа кристаллы комплекса коровой части QP-репликазы и минимального функционального фрагмента белка S1.

Положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Рибосомный белок S1 не является абсолютно необходимым компонентом для инициации копирования QP(+)-РНК в буфере с низкой ионной силой, и однократное копирование QP(+)-РНК может идти и в отсутствие белка S1. Зависимость инициации от белка S1 появляется только в буфере с физиологической концентрацией соли.

2. Белок S1 не влияет на скорость элонгации репликации QP РНК. Белок S1 не влияет на состояние РНК в репликативном комплексе в процессе всей элонгации. После завершения элонгации белок S1 ускоряет выход одноцепочечной РНК из репликативного комплекса, и, следовательно, является фактором терминации.

3. Белок S1 одинаково влияет на репликацию обеих цепей QP РНК, а также коротких реплицирующихся РНК, на стадии терминации, стимулируя выход одноцепочечной РНК.

4. В составе QP-репликазы полноразмерный белок S1 может быть заменен фрагментом ОВ1-2 на стадии терминации и фрагментом ОВ1-3 как на стадии терминации, так и на стадии

инициации на QP(+)-PHK в буфере с физиологической концентрацией соли.

5. Определена структура комплекса коровой части QP-репликазы и фрагмента ОВ1-2 с разрешением 3,2 А.

Полученные в данной работе результаты являются для науки новыми, имеют теоретическую и практическую значимость. Изучение механизмов функционирования белка S1 в составе QP-репликазы необходимо не только для ответа на вопрос о том, что S1, в норме участвующий в трансляции, делает при репликации РНК. Эти данные могут способствовать разгадке механизма матричной специфичности фермента, что может дать возможность использования его для решения разнообразных фундаментальных и прикладных задач. Кроме того, полученные результаты могут быть важны для понимания роли рибосомного белка S1 в неинфицированной клетке.

Методология диссертационного исследования включает классические методы молекулярной биологии (методы генной инженерии, выделение и очистка белков, in vitro РНК синтез и репликация, электрофорез белков и нуклеиновых кислот).

Результаты работы изложены на российских и международных конференциях: на ежегодной научной конференции Института белка РАН (Пущино, 2012, 2016), на XXVI Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2014) и на конференции «the XXIII IUCr Congress» (Монреаль, 2014). По результатам, представленным в данной диссертации, опубликовано 6 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых международных и отечественных научных журналах, входящих в перечень ВАК РФ, и 3 тезиса конференций. Публикации в рецензируемых журналах подтверждают достоверность полученных результатов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Матрицы Qß-репликазы

Qß-репликаза - РНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага Qß, специфичного к грамотрицательным бактериям, имеющим F-пили. Фермент интересен прежде всего тем, что он способен амплифицировать РНК in vitro, не используя при этом праймеры. Обнаруженное 50 лет назад это его свойство открывало перспективы использования Qß-репликазы для решения многих прикладных и фундаментальных задач. Но оказалось, что Qß-репликаза обладает строгой матричной избирательностью, и, хотя фермент способен однократно копировать все РНК, амлифицирует он только небольшую группу матриц. При этом Qß-репликаза в качестве матрицы может использовать только одноцепочечную РНК, на которой синтезируется одноцепочечная комплементарная цепь [Feix et al., 1967], дуплексы не могут узнаваться ферментом [Weissmann et al., 1967; Biebricher et al., 1982]. Разгадать полностью механизм матричной специфичности Qß-репликазы не удалось и по сей день.

1.1.1 Реплицирующиеся РНК

Из-за высокой матричной специфичности Qß-репликаза экспоненциально размножает только так называемые реплицирующиеся РНК, к которым относятся фаговая Qß РНК и короткие «сателлитные» РНК (6S или RQ РНК). Экспоненциальный синтез возможен за счет того, что и матричная и новосинтезированная цепочки РНК могут использоваться Qß-репликазой в последующих циклах синтеза до тех пор, пока РНК не будет в молярном избытке над ферментом [Kamen, 1975; Biebricher et al., 1983].

Общей чертой всех реплицирующихся матриц Qß-репликазы является наличие олиго(0-последовательности (обычно - СССА, реже - ССА) на 3'-конце и олиго^)-последовательности на 5'-конце РНК [Kuppers and Sumper, 1975]. Интересно, что 3'-концевой аденозин не кодируется матрицей, а включается на стадии терминации репликации и не нужен для репликации [Rensing and August, 1969]. К тому же, внутри цепи реплицирующихся РНК характерно наличие C/U-богатого участка [Brown and Gold, 1995], большая часть молекулы состоит из прочных шпилек [Axelrod et al., 1991], и для эффективной репликации необходимо взаимодействие между 3'- и 5'-концами матрицы [Ugarov end Chetverin, 2008]. Предполагается, что важную роль в поддержании одноцепочечного состояния РНК играет стабильная вторичная структура матриц [Ugarov et al., 2003].

1.1.1.1 Геномная РНК бактериофага Qß

Геномная РНК бактериофага Qß состоит из 4217 нуклеотидов (рис. 1) и содержит ген белка созревания (А2), ген белка оболочки (СР), стоп-кодон которого (UGA) в 3-5% случаев прочитывается рибосомой путем встраивания триптофана (кодон UGG) с образованием белка А1 [Weiner and Weber, 1973], и ген, кодирующий каталитическую субъединицу Qß-репликазы [Mekler, 1981]. Белок созревания капсида (А2) ингибирует синтез пептидогликанов клеточной стенки и таким образом индуцирует лизис клеток хозяев [Nishihara et al., 2004]. Белок А1 необходим для инфекционности фага [Axelrod et al., 1968]. Репликазная каталитическая ß-субъединица играет центральную роль в амплификации фаговой РНК.

PO 'ij- LO OOCM^J" to t— N

СМ т}- СОЮСМ 1Л С\| «—

ГГ сл m N. сого-ф ю г- см

I \ II 1

maturation/lysis (А2) ] 1 coat replicase (ß-subunit)

¡ read-through (AI ) |

1

Рисунок l. Схематическое изображение геномной РНК бактериофага Qß. Показано расположение цистронов белка созревания (А2), белка оболочки (coat) и белка Al, а также цистрона ß-субъединицы РНК-зависимой РНК-полимеразы (ß-subunit). Изображение взято из [Nishihara et al., 2004].

Геномная РНК фага Qß представлена (+)-цепочкой. (+)-цепочкой РНК принято считать ту цепь, с которой будет считываться информация при синтезе белков вируса [Kozak and Nathans, 1972]. Молекула РНК, комплементарная (+)-цепи, обозначается как (-)-цепь. Обе цепи являются полноценными матрицами при репликации, хотя механизм узнавания этих цепочек Qß-репликазой различается. В то время как (+)-цепочка является эффективной матрицей только в присутствии всех субъединиц репликазы и еще одного клеточного белка E. coli - «хозяйского фактора» (Hfq) [Franze de Fernandez et al., 1968], для синтеза на (-)-цепочке не нужны рибосомный белок S1 и Hfq [Kamen et al., 1972].

Qß-репликаза взаимодействует, главным образом, с двумя внутренними сайтами Qß(+)-РНК: S (от слова "salt", т. к. связывание с этим сайтом зависит от присутствия 100-150 мМ соли моновалентного катиона) и М (от слова "magnesium", т. к. для связывания с этим сайтом необходим 10-12 мМ Mg2+) [Meyer et al., 1981]. Связывание с S-сайтом (нуклеотиды 1247-1346, перекрывается с сайтом инициации рибосом на цистроне белка оболочки) позволяет Qß-репликазе участвовать в регуляции трансляции белка оболочки [Weber et al., 1972; Kolakofsky and Weissmann, 1971; Boni et al., 1991]. При этом с помощью делеционного анализа показано, что способность (+)-цепочки Qß РНК прочитываться репликазой не зависит от наличия S-сайта [Meyer et al., 1981]. Напротив, взаимодействие с М-сайтом, находящимся внутри цистрона каталитической субъединицы Qß-репликазы (нуклеотиды 2545-2867), важно

для инициации синтеза Qß(-)-PHK. При удалении М-сайта репликация РНК ухудшается на 7590% в условиях низкой ионной силы, а в условиях высокой ионной силы синтез РНК останавливается полностью [Miranda et al., 1997].

Детальный мутационный анализ показал, что основную роль во взаимодействии с Qß-репликазой играет участок последовательности М-сайта Qß(+)-PHK, который имеет длину 59 нуклеотидов и может быть уложен в две стабильные шпильки, завершающиеся однотяжным пуриновым гептануклеотидом [Schuppli et al., 1998]. При этом эффективное узнавание матрицы определяется именно трехмерной структурой этого участка: изменение последовательности М-сайта, не влияющее на эту структуру, практически не оказывает никакого эффекта на способность РНК реплицироваться. Считается, что взаимодействие с М-сайтом происходит на стадии инициации и необходимо для корректного расположения 3'-конца геномной РНК в активном центре Qß-репликазы. При этом связывание Qß-репликазы с З'-концом (+)-цепочки едва заметно, если оно не опосредовано «хозяйским фактором» Hfq [Meyer et al., 1981; Barrera et al., 1993].

Анализ связывания репликазного комплекса с (-)-цепочкой Qß РНК показал, что репликаза взаимодействует с внутренним сайтом матрицы, а также с ее 3'- и 5'-концами [Barrera et al., 1993; Schuppli et al., 1994]. Неодинаковые механизмы связывания разных цепочек Qß РНК объясняются тем, что (+)- и (-)-цепочки имеют различную третичную структуру.

Известно, что in vivo на ранних стадиях репликации образуется одинаковое количество (+)- и (-)-цепочек Qß РНК, однако финальный продукт репликации представлен в основном (+)-цепочками [Weissmann et al., 1968, Biebricher et al. 1984]. Считается, что главной причиной асимметричного синтеза является участие (+)-цепочек в трансляции. Так как репликаза и рибосома прочитывают (+)-цепочку Qß РНК в разных направлениях, трансляция препятствует использованию (+)-цепочки в качестве матрицы для синтеза (-)-цепочек Qß РНК [Kolakofsky and Weissmann, 1971].

1.1.1.2 RQ РНК

Как уже говорилось, in vitro Qß-репликаза способна размножать экспоненциально молекулы одноцепочечных РНК небольшой длины (30-220 нуклеотидов), называемые 6S РНК или RQ РНК от англ. «Replicable by Qß-replicase» [Munishkin et al., 1991; Moody et al., 1994]. Впервые такие РНК были обнаружены в лаборатории С. Шпигельмана [Levisohn and Spiegelman, 1968]. Первоначально эти РНК называли «вариантами» Qß РНК и считали, что они появляются в результате дегенеративной эволюции фаговой РНК, так как при многократных

пересевах продуктов репликации количество полноразмерной Qß РНК падало, а количество низкомолекулярных РНК возрастало.

Через некоторое время было обнаружено, что эти реплицирующиеся РНК образуются и в отсутствии Qß РНК. В связи с этим происхождение таких РНК стали объяснять способностью Qß-репликазы синтезировать РНК безматрично de novo из нуклеотидов, присутствующих в реакционной смеси [Sumper and Luce, 1975]. Однако позже все же удалось установить, что матрицами служили примесные реплицирующиеся РНК, содержащиеся в препарате Qß-репликазы или в лабораторном воздухе, загрязненном RQ РНК [Chetverin et al., 1991]. При этом для образования большого количества продуктов было достаточно даже единичных молекул матриц, попавших в реакционную смесь. Так, показано, что при синтезе in vitro в присутствии очищенной Qß-репликазы и всех четырех рибонуклеозидтрифосфатов образуется более 1010 копий RQ РНК за 10 минут при комнатной температуре [Chetverin and Spirin, 1995].

Кроме того, когда несколько RQ РНК было клонировано и секвенировано, оказалось, что некоторые из них образовались не в результате синтеза de novo из нуклеотидов, а в результате рекомбинации Qß РНК и клеточных РНК E. coli [Munishkin et al., 1991; Moody et al., 1994].

Qß-репликаза обладает высокой селективностью и безошибочно узнает все RQ РНК, хотя последовательности этих РНК не проявляют высокой гомологии. Единственное, все они, как и Qß РНК, имеют на 5'-конце GGG-последовательность и CCCA-последовательность на 3'-конце. Но показано, что наличие этих 3'- и 5'-концевых кластеров недостаточно для узнавания, т. к. только небольшая часть из 1012 уникальных РНК длиной 50-77 нуклеотидов амплифицируется Qß-репликазой [Brown and Gold, 1995]. Поэтому считается, что матричная специфичность Qß-репликазы обусловлена, главным образом, вторичной и третичной структурой самих РНК [Axelrod et al., 1991]. Было предположено, что за счет комплементарного взаимодействия 5'- и З'-концов, реплицирующиеся РНК приобретают тРНК-подобную структуру, которая и узнается Qß-репликазой [Voronin, 1992].

Стоит отметить, что многие RQ РНК являются более эффективными матрицами, чем Qß РНК. С момента открытия RQ РНК делались многократные попытки использовать их в бесклеточных системах амплификации для решения различных прикладных задач молекулярной биологии: в системах диагностики [Shah et al., 1994], для прямого секвенирования РНК [Lizardi and Kramer, 1991], в сопряженной репликации-трансляции рекомбинантных RQ-мРНК [Morozov et al., 1993; Chetverin and Spirin, 1995]. Однако, RQ РНК с большими (порядка мРНК) чужеродными вставками не размножались экспоненциально и прочитывались всего один раз. Кроме того, реакционную смесь часто загрязняли примесные нецелевые сателлитные РНК. В итоге, применение RQ РНК для решения прикладных задач до сих пор не получило широкого распространения.

1.1.2 Нереплицирующиеся РНК

Qß-репликаза способна копировать не только Qß и RQ РНК, но и другие матрицы, не способные к экспоненциальной амплификации, например, фрагменты RQ РНК [Ugarov et al., 2003; Ugarov and Chetverin, 2008] и синтетические полирибонуклеотиды, содержащие остатки цитидина [Blumenthal, 1980]. При этом синтез полигуаниловой кислоты на поли^), обычно используемый для определения активности Qß-репликазы [Kamen, 1972]. Прочитывание С-богатых синтетических матриц [Blumenthal and Carmichael, 1979] и фрагментов RQ РНК ограничивается однократным копированием матрицы с образованием отожженной с матрицей комплементарной цепи [Palmenberg and Kaesberg, 1974]. То есть такие матрицы не способны к экспоненциальному размножению Qß-репликазой из-за образования дуплексов [Ugarov et al., 2003; Ugarov and Chetverin, 2008].

1.1.3 «Законные» и «незаконные» матрицы

Интересно, что, несмотря на высокую матричную избирательность, Qß-репликаза обладает высокой аффинностью к клеточным РНК и РНК родственных фагов и проявляет лишь ненамного большее сродство к одноцепочечным РНК, чем к двуцепочечным. Более того, показано, что в определенных условиях (при определенной концентрации GTP и в присутствии ионов Mn2+) Qß-репликаза может провести однократное копирование РНК, чьи инициаторные последовательности (3'-концы) отличаются от канонической ССА-последовательности [Ugarov et al., 2003; Ugarov and Chetverin, 2008]. Такое отсутствие избирательности при однократном копировании РНК наряду с высокой матричной специфичностью при экспоненциальном размножении удалось объяснить наличием разных механизмов узнавания Qß-репликазой так называемых «законных» и «незаконных» матриц [Ugarov et al., 2003].

К законным матрицам относятся описанные ранее Qß РНК и RQ РНК, а также 3'-концевые фрагменты RQ РНК [Ugarov et al., 2003; Ugarov and Chetverin, 2008], т. е. все реплицирующиеся и некоторые нереплицирующиеся РНК. К незаконным матрицам Qß-репликазы относятся 5'-концевые фрагменты RQ РНК [Ugarov and Chetverin, 2008], а также некоторые другие РНК.

Отличительным свойством законных матриц является то, что инициация синтеза РНК на этих матрицах строго зависима от GTP и приводит к образованию закрытого репликативного комплекса, устойчивого к ауринтрикарбоновой кислоте [Ugarov et al., 2003], которая, как известно, ингибирует связывание многих белков с нуклеиновыми кислотами [Gonzalez et al., 1980] и полностью останавливает синтез РНК Qß-репликазой, если добавлена перед инициацией [Blumenthal and Landers, 1973; Brown and Blumenthal, 1976]. В закрытом

репликативном комплексе Qß-репликаза синтезирует полноразмерную комплементарную цепочку РНК без диссоциации от матрицы, т. е. фермент становится высокопроцессивным. Кроме того, как уже упоминалось, важной чертой законных матриц является наличие кооперации между 5'- и З'-концами на стадии инициации [Ugarov and Chetverin, 2008].

Копирование незаконных матриц может идти и без наличия олиго(С)-последовательности, инициация на них GTP-независима, и с этими матрицами никогда не образуется закрытый репликативный комплекс, устойчивый к ауринтрикарбоновой кислоте [Ugarov et al., 2003].

На основании существования разных механизмов копирования законных и незаконных матриц был сделан вывод, что узнавание РНК Qß-репликазой происходит в два этапа [Ugarov and Chetverin, 2008]: сначала фермент неспецифически связывается с РНК, затем на втором этапе включение двух или более молекул GTP на законной матрице приводит к конформационному переходу и образованию закрытого комплекса РНК*репликаза. При узнавании незаконных матриц такого конформационного перехода репликационного комплекса не происходит, поэтому матрица и растущая цепь могут преждевременно диссоциировать или отжечься с образованием дуплекса, что делает невозможным экспоненциальное размножение РНК.

1.2 Репликационный цикл Qß-репликазы

Как и другие полимеразы, Qß-репликаза прочитывает матрицу в направлении 3'^5' [Spiegelman et al., 1968; Weissmann et al., 1968], нуждается в ионах Mg2+ и использует в качестве субстратов рибонуклеозидтрифосфаты - АТР, СТР, GTP и UTP [Haruna and Spiegelman,1965]. Репликационный цикл Qß-репликазы делится на три стадии - инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация включает в себя узнавание матрицы и синтез начального GGG-участка. Первый З'-концевой адениловый нуклеотид всегда пропускается, и считывание начинается со второго цитидилового остатка. Инициация происходит de novo без использования праймеров. При этом, как уже было сказано ранее, для законных матриц инициаторным нуклеотидом всегда должен быть GTP в относительно высокой концентрации [Ugarov et al., 2003]. Нужно отметить, что если GTP заменить нуклеотидами GDP, dGTP или ITP на стадии инициации, то синтеза РНК не будет. И только в присутствии GTP образуется стабильный инициаторный комплекс, далее способный к элонгации даже при добавлении ауринтрикарбоновой кислоты [Ugarov et al., 2003; Четверин, 2011].

Во время элонгации происходит рост цепи РНК в направлении 5'—^3' [Spiegelman et al., 1968; Weissmann et al., 1968]. На этой стадии GTP уже может быть заменен ITP [Ugarov et al., 2003]. Как было сказано ранее, Qß-репликаза является высокопроцессивным ферментом, т. е. репликативный комплекс сохраняется до завершения синтеза полноразмерного продукта [Dobkin, 1979]. На стадии элонгации матричная и новосинтезированная цепи РНК находятся в однотяжевой форме, что было показано по их чувствительности к РНКазе А, расщепляющей одноцепочечные РНК, и устойчивости к РНКазе III, расщепляющей двуцепочечные РНК [Feix et al., 1967; Weissmann et al., 1968]. При обработке репликативного комплекса любым депротеинизирующим агентом происходит отжиг матричной и новосинтезированной РНК и образование дуплекса. Из этого был сделан вывод, что именно Qß-репликаза обеспечивает разделение дуплекса, который образуется в области активного центра фермента, и участвует в поддержании матрицы и продукта в одноцепочечном состоянии [Weissmann et al., 1968]. Считается, что матрица и растущая цепочка в процессе элонгации занимают разные центры связывания в составе Qß-репликазы, и это способствует сохранению РНК в одноцепочечной форме [Brown and Gold, 1996; Takeshita and Tomita, 2012]. В дополнение считается, образованию дуплекса препятствует то, что матричная и новосинтезированная цепочки во время элонгации приобретают вторичную структуру [Mills et al., 1978].

Терминация - самая длительная стадия репликационного цикла; так, на примере коротких РНК было показано, что при экспоненциальном синтезе на терминацию репликации приходится около 90% времени [Biebricher et al., 1983]. На этой стадии происходит синтез последнего ССС-участка, нематричное аденилирование З'-конца новосинтезированной цепи и освобождение РНК из репликативного комплекса [Weber and Weissmann, 1970; Blumenthal and Carmichael, 1979]. Выход новосинтезированной цепи из комплекса происходит раньше, чем репликаза диссоциирует от матричной цепи. И в следующем цикле репликации Qß-репликаза чаще использует матричную цепь, нежели новосинтезированную РНК [Dobkin et al., 1979].

Роль З'-концевого аденилирования до конца не ясна. Известно, что при удалении З'-концевого аденилата не происходит снижения матричной активности Qß РНК. Но при этом все новосинтезированные РНК будут нести на своем З'-конце нематрично добавленный аденозин, т. е. этот нуклеотид не нужен даже для собственного воспроизведения [Kamen, 1975]. Репликаза включает З'-концевой аденилат только в РНК, находящуюся в репликативном комплексе, и не может включать его в свободную цепь РНК, искусственно лишенную этого остатка. Биохимические исследования с использованием различных вариантов РНК в качестве матрицы показали, что на аденилирование З'-конца РНК на стадии терминации репликации влияет последовательность 5'-конца матрицы, и что РНК-матрицы с последовательностью

5'-GG является наиболее подходящими для нематричного добавления аденозина на З'-конец [Tomita, 2014].

Согласно последним данным кристаллографического анализа комплекса Qß-репликазы с РНК, З'-концевой аденозин матричной РНК может служить платформой для создания стабильного инициаторного комплекса и для de novo инициации [Takeshita and Tomita, 2012]. Кроме того, предполагается, что безматричное аденилирование З'-конца РНК может быть необходимо для выхода Qß-репликазы из закрытой конформации [Четверин, 2011].

1.3 Субъединичный состав Qß-репликазы

Qß-репликаза состоит из четырех белковых субъединиц, только одна из которых -каталитическая ß-субъединица - кодируется геномом бактериофага, а три остальные поставляются клеткой E. coli [Kondo et al., 1970]: это рибосомный белок S1 [Kamen et al., 1972; Wahba et al., 1974] и факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts, которые в норме необходимы для синтеза клеточных белков [Blumenthal et al., 1972]. Первоначально субъединицы Qß-репликазы были обозначены буквами греческого алфавита в соответствии с увеличением их электрофоретической подвижности в ПААГ: субъединица а - белок S1, ß - каталитическая субъединица, у и 5 - факторы EF-Tu и EF-Ts, соответственно. Каталитическая субъединица и факторы элонгации составляют коровую часть фермента, которая обладает полимеразной активностью [Hill and Blumenthal, 198З]. Белок S1 связан непрочно с коровой частью репликазы и часто присутствует не во всех молекулах фермента [Blumenthal and Carmichael, 1979].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кутлубаева, Зарина Шаймуратовна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Асеев Л.В., Бони И.В. 2011. Внерибосомные функции бактериальных рибосомных белков. Мол. биол. 45 (5): 805-816.

2. Васильев, Н.Н., Дженнер, Л., Юсупов, M.M., Четверин, А.Б. 2010. Выделение и кристаллизация химерной Qß-репликазы, содержащей фактор элонгации EF-Ts из Thermus thermophilus. Биохимия. 75: 1091-1097.

3. Васильев, Н.Н. 2011. Структура шровой части репликазы фага Qß. Диссертация на соискание ученой степени к.б.н. Москва, Институт белка РАН.

4. Четверин, А.Б. 2011. Парадоксы репликации РНК бактериального вируса. Мол. Биология. 45: 160-172.

5. Aliprandi, P., Sizun, C., Perez. J, Mareuil, F., Caputo, S., Leroy, JL., Odaert, B., Laalami, S., Uzan, M., Bontems, F. 2008. S1 ribosomal protein functions in translation initiation and ribonuclease RegB activation are mediated by similar RNA-protein interactions: an NMR and SAXS analysis. J. Biol. Chem. 9: 13289-13301.

6. Axelrod, V.D., Brown, E., Priano, C., Mills, DR. 1991. Coliphage Qß RNA replication: RNA catalytic for single-stranded release. Virology. 184: 595-608.

7. Barrera, I. 1993. Different mechanisms of recognition of bacteriophage Qß plus and minus strand RNAs by Qß replicase. J. Mol. Biol. 232: 512-521.

8. Berestowskaya, N.H, Vasiliev, V.D, Volkov, A.A, Chetverin, A.B.1988. Electron microscopy study of Q beta replicase. FEBS Lett. 228: 263-267.

9. Biebricher, C.K., Diekmann, S., Luce, R. 1982. Structural analysis of self-replicating RNA synthesized by Qß replicase. J. Mol. Biol. 154: 629-648.

10. Biebricher, C.K., Eigen, M., Gardiner, W.C. 1983. Kinetics of RNA replication. Biochemistry. 22: 2544-2559.

11. Blumenthal, T. 1980. Qß replicase template specificity: different templates require different GTP concentrations for initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 2601-2605.

12. Blumenthal, T., Carmichael, G.G. 1979. RNA replication: function and structure of Qß-replicase. Annu. Rev. Biochem. 48: 525-548.

13. Blumenthal, T., Landers, T.A. 1973. The inhibition of nucleic acid-binding proteins by aurintricarboxylic acid. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55: 680-688.

14. Blumenthal, T., Landers, T.A. 1976. Renaturation of a multisubunit multiactivity enzyme complex: recovery of phage Qß RNA replicase, EF-Tu, and EF-Ts activities after denaturation in urea. Biochemistry. 15: 422-425.

15. Boni, I.V., Artamonova, V.S., Tzareva, N.V., Dreyfus, M. 2001. Non-canonical mechanism for

translational control in bacteria: synthesis of ribosomal protein S1. EMBO J. 20: 4222-4232.

16. Boni, I.V., Isaeva, D.M., Musychenko, M.L., Tzareva, N.V. 1991. Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein S1. Nucleic Acids Res.19: 155-162.

17. Boni, I.V., Zlatkin, I.V., Budowsky, E.I. 1982. Ribosomal protein S1 associates with Escherichia coli ribosomal 30-S subunit by means of protein-protein interactions. Eur. J. Biochem. 121: 371376.

18. Brown, D., Gold, L. 1995. Template recognition by an RNA-dependent RNA polymerase: identification and characterization of two RNA binding sites on Q beta replicase. Biochemistry. 45: 14765-14774.

19. Brown, D., Gold, L. 1996. RNA replication by Qß replicase: a working model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 11558-11562.

20. Brown, S., Blumenthal, T. 1976a. Function and structure in ribonucleic acid phage Qß ribonucleic acid replicase. Effect of inhibitors of EF-Tu on ribonucleic acid synthesis and renaturation of active enzyme. J. Biol. Chem. 251: 2749 -2753.

21. Brown, S., Blumenthal, T. 1976b. Reconstitution of Qß RNA replicase from a covalently bonded elongation factor Tu-Ts complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73: 1131-1135.

22. Bycroft, M., Hubbard, T.J., Proctor, M., Freund, S.M., Murzin, AG. 1997. The solution structure of the S1 RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid-binding fold. Cell. 88: 235242.

23. Byrgazov, K., Manoharadas, S., Kaberdina, A.C, Vesper, O., Moll, I. 2012. Direct Interaction of the N-Terminal Domain of Ribosomal Protein S1 with Protein S2 in Escherichia coli. PLoS One. 7: e32702.

24. Byrgazov, K., Grishkovskaya, I., Arenz, S., Coudevylle, N., Temmel, H., Wilson, D.N., Djinovic-Carugo, K., Moll, I. 2015. Structural basis for the interaction of protein S1 with the Escherichia coli ribosome. 43: 661-673.

25. Carmichael, G.G., Landers, T.A., Weber, K. 1976. Immunochemical analysis of the functions of the subunits of phage Qß ribonucleic acid replicase. J. Biol. Chem. 251: 2744-2748.

26. Chetverin, A.B., Chetverina, H.V., Munishkin, A.V. 1991. On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qß replicase. J. Mol. Biol. 222: 3-9.

27. Chetverin, A.B., Spirin, A.S. 1995. Replicable RNA Vectors: Prospects for Cell-free Gene Amplification, Expression, and Cloning. In: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Academic Press. 225-270.

28. Cole, P.E., Sawchyn, I., Guerrier-Takada, C. 1982. Qß replicase containing altered forms of ribosomal protein S1. J. Biol. Chem. 257: 12929 -12934.

29. de Fernandez, M.T.F., Hayward, W.S., August, J.T. 1972. Bacterial Proteins Required for

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

Replication of Phage Qß Ribonucleic Acid. J. Biol. Chem. 247: 824 -831.

Dobkin, C., Mills, D.R., Kramer, F.R., Spiegelman, S. 1979. RNA replication: required

intermediates and the dissociation of template, product, and Qß replicase. Biochemistry. 18:

2038-2044.

Draper, D.E, von Hippel, P.H. 1978a. Nucleic acid binding properties of Escherichia coli ribosomal protein S1. I. Structure and interactions of binding site I. J Mol Biol. 122: 321-338. Draper, D.E, von Hippel, P.H. 1978b. Nucleic acid binding properties of Escherichia coli ribosomal protein S1. II. Co-operativity and specificity of binding site II. J Mol Biol. 122: 339359.

Duval, M., Korepanov, A., Fuchsbauer, O., Fechter, P., Haller, A., Fabbretti, A., Choulier, L., Micura, R., Klaholz, B.P., Romby, P., Springer, M., Marzi, S. 2013. Escherichia coli ribosomal protein S1 unfolds structured mRNAs onto the ribosome for active translation initiation. PLoS Biol. 11: e1001731.

Feix, G., Slor, H., Weissmann, C. 1967. Replication of viral RNA. 13. The early product of

phage RNA synthesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 57: 1401-1408.

Giraud, P., Crechet, J.B., Uzan, M., Bontems, F., Sizun, C. 2015. Resonance assignment of the

ribosome binding domain of E. coli ribosomal protein S1. Biomol NMR Assign. 9: 107-111.

Gonzalez, R.G., Haxo, R.S., Schleich, T. 1980. Mechanism of action of polymeric

aurintricarboxylic acid, a potent inhibitor of protein-nucleic acid interactions. Biochemistry. 19:

4299-4303.

Gribskov, M. 1992. Translational initiation factors IF-1 and eIF-2 alpha share an RNA-binding motif with prokaryotic ribosomal protein S1 and polynucleotide phosphorylase. Gene. 119: 107111.

Groner, Y., Scheps, R., Kamen, R., Kolakofsky, D., Revel, M. 1972. Host subunit of Q replicase is translation control factor i. Nat. New Biol. 239: 19-20.

Guerrier-Takada, C., Subramanian, A.R., Cole, P.E. 1983. The activity of discrete fragments of ribosomal protein S1 in Qß replicase function. J. Biol. Chem. 258: 13649-13652. Hajnsdorf, E., Boni, I. 2012. Multiple activities of RNA-binding proteins S1 and Hfq. Biochimie. 94: 1544-1553.

Haruna, I., Spiegelman, S. 1965. Recognition of size and sequence by an RNA replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 54: 1189-1193.

Hill, D., Blumenthal, T. 1983. Does Qß replicase synthesize RNA in the absence of template? Nature. 301: 350-352.

Inokuchi, Y., Hirashima, A. 1987. Interference with viral infection by defective RNA replicase. J. Virol. 61: 3946-3949.

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

Inokuchi, Y., Kajitani, M. 1997. Deletion Analysis of Qß Replicase. Participation of the carboxyl-terminal region of the ß-subunit protein in template recognition. J. Biol. Chem. 272: 15339-15345.

Jacobson, A. 1991. Secondary structure of colifage Qß RNA. Analysis by electron microscopy. J. Mol. Biol. 221: 557-570.

Kalapos M.P., Paulus, H., Sarkar, N. 1997. Identification of ribosomal protein S1 as a poly(A)binding protein in Escherichia coli. Biochimie. 79: 493-502.

Kamen, R. 1972. A new method for the purification of Qß RNA-dependent RNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 262: 88-100.

Kamen, R.I. 1975. Structure and function of the Qß RNA replicase. RNA Phages: 203-234. Kamen, R., Kondo, M., Romer, W., Weissmann, C. 1972. Reconstitution of Qß Replicase Lacking Subunit a with Protein-Synthesis-Interference Factor i. Eur. J. Biochem. 31: 44-51. Kamer, G., Argos, P. 1984. Primary structural comparison of RNA-dependent polymerases from plant, animal and bacterial viruses. Nucleic Acids Res. 12: 7269-7282.

Kidmose, R.T., Vasiliev, N.N., Chetverin, A.B., Knudsen, C.R. 2010. Structure of the Qß replicase, an RNA-dependent RNA polymerase consisting of viral and host proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107: 10884-10889.

Kita, H., Cho, J., Matsuura, T., Nakaishi, T., Taniguchi, I., Ichikawa, T., Shima, Y., Urabe, I., Yomo, T. 2006. Functional Qß replicase genetically fusing essential subunits EF-Ts and EF-Tu with ß-subunit. J. Biosci. Bioeng. 101: 421-426.

Kolakofsky, D., Weissmann, C. 1971. Possible mechanism for transition of viral RNA from polysome to replication complex. Nature New Biol. 231: 42-46.

Kolb, A., Hermoso, J.M., Thomas, J.O., Szer, W. 1977. Nucleic acid helix-unwinding properties of ribosomal protein S1 and the role of S1 in mRNA binding to ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 2379-2383.

Kondo, M., Gallerani, R., Weissmann, C. 1970. Subunit Structure of Qß Replicase. Nature. 228: 525-527.

Kozak, M., Nathans, D. 1972. Translation of the genome of a ribonucleic acid bacteriophage. Bacteriol. Rev. 36: 109-134.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

Landers, T.A., Blumenthal, T., Weber, K. 1974. Function and Structure in Ribonucleic Acid Phage Qß Ribonucleic Acid Replicase. J. Biol. Chem. 249: 5801-5808.

Lauber, M.A, Rappsilber, J, Reilly, J.P. 2012. Dynamics of ribosomal protein S1 on a bacterial ribosome with cross-linking and mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 11: 1965-1976.

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

Levisohn, R., Spiegelman, S. 1968. The cloning of a self-replicating RNA molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 60: 866-872.

Lindner, A.J., Glaser, S.J., Biebricher, C.K., Hartmann, G.R. 1991. Self-catalysed affinity labeling of Qß replicase. Eur. J. Biochem. 202: 249-254.

Lizardi, P.M., Kramer, F.R. 1991. Exponential amplification of nucleic acids: new diagnostics using DNA polymerases and RNA replicases. Trend. Biotech. 9: 53-58.

Mathu, S.G., Knudsen, C.R., van Duin, J., Kraal, B. 2003. Isolation of Qbeta polymerase complexes containing mutant species of elongation factor Tu. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786: 279-286.

McGinness K.E., Sauer, R.T. 2004. Ribosomal protein S1 binds mRNA and tmRNA similarly but plays distinct roles in translation of these molecules Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101: 13454-13459.

Mekler, P. 1981. Determination of nucleotide sequences of the bacteriophage Qß genome: organization and evolution of anRNA virus. PhD thesis. University of Zurich. Meyer, F., Weber, H., Weissmann, C. 1981. Interactions of Qß replicase with Qß RNA. J. Mol. Biol. 153: 631-660.

Miele, E.A., Mills, D.R., Kramer, F.R. 1983. Autocatalytic replication of a recombinant RNA. J. Mol. Biol. 171: 281-295.

Milligan, J.F, Uhlenbeck, O.C., 1989. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180: 51-62.

Mills, D.R., Kramer, F.R., Dobkin, C., Nishihara, T., Spiegelman, S. 1975. Nucleotide sequence of microvariant RNA: Another small replicating molecule. Proc. Nat. Acad. Scd. USA.72: 42524256.

Mills, D.R., Priano, C., DiMauro, P., Binderow, B.D. 1989. Qß replicase: mapping the functional

domains of an RNA-dependent RNA polymerase. J. Mol. Biol. 205: 751-764.

Miranda, G., Schuppli, D., Barrera, I., Hausherr, C., Sogo, J.M., Weber, H. 1997. Recognition of

bacteriophage Qbeta plus strand RNA as a template by Qbeta replicase: role of RNA interactions

mediated by ribosomal proteins S1 and host factor. J. Mol. Biol. 267: 1089-1103.

Moll, I., Grill, S., Gründling, A., Bläsi, U. 2002. Effects of ribosomal proteins S1, S2 and the

DeaD/CsdA DEAD-box helicase on translation of leaderless and canonical mRNAs in

Escherichia coli. Mol Microbiol. 44: 1387-1396.

Moody, M.D., Burg, J.L., DiFrancesco, R., Lovern, D., Stanick, W., Lin-Goerke, J., Mahdavi, K., Wu, Y., Farrell, MP. 1994. Evolution of host cell RNA into efficient template RNA by Qß replicase: the origin of RNA in untemplated reactions. Biochemistry. 33: 13836-13847. Morozov, I.Y., Ugarov, V.I., Chetverin, A.B., Spirin, A.S. 1993. Synergism in replication and

translation of messenger RNA in a cell-free system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 93259329.

75. Munishkin, A.V., Voronin, L.A., Ugarov, V.I., Bondareva, L.A., Chetverina, H.V., Chetverin, A.B. 1991. Efficient templates for Qß replicase are formed by recombination from heterologous sequences. J. Mol. Biol. 221: 463-472.

76. Murzin AG. 1993. OB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences. EMBO J. 12: 861-867.

77. Nishihara, T., Morisawa, H., Ohta, N., Atkins, J.F., Nishimura, Y. 2004. A cryptic lysis gene near the start of the Qß replicase gene in the +1 frame. Genes Cells. 9: 877-889.

78. Okada, T.O., Wower, I. K., Wower, J., Wieb, C. W. Z., Kimura, M. 2004. Contribution of the Second OB Fold of Ribosomal Protein S1 from Escherichia coli to the Recognition of TmRNA. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68: 2319-2325.

79. Palmenberg, A., Kaesberg, P. 1974. Synthesis of Complementary Strands of Heterologous RNAs with Qß Replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71: 1371-1375.

80. Potapov, A.P, Subramanian, A.R. 1992. Effect of E. coli ribosomal protein S1 on the fidelity of the translational elongation step: reading and misreading of poly(U) and poly(dT). Biochem Int. 27: 745-753.

81. Richey, B., Cayley, D.S., Mossing, M.C., Kolka, C., Anderson, C.F., Farrar, T.C., Record, M.T. Jr. 1987. Variability of the intracellular ionic environment of Escherichia coli. Differences between in vitro and in vivo effects of ion concentrations on protein-DNA interactions and gene expression. J Biol Chem. 262: 7157-7164.

82. Ringquist S, Jones T, Snyder EE, Gibson T, Boni I, Gold L. 1995. High-affinity RNA ligands to Escherichia coli ribosomes and ribosomal protein S1: comparison of natural and unnatural binding sites. Biochemistry. 34: 3640-3648.

83. Salah, P., Bisaglia, M., Aliprandi, P., Uzan, M., Sizun, C., Bontems, F. 2009. Probing the relationship between Gram-negative and Gram-positive S1 proteins by sequence analysis. Nucleic Acids Res. 37: 5578-5588.

84. Sambrook, J. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3e. Cold Spring Harbor N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

85. Schuppli, D., Barrera, I., Weber, H. 1994. Identification of recognition elements on bacteriophage Q beta minus strand RNA that are essential for template activity with Q beta replicase. J Mol Biol. 243: 811-815.

86. Schuppli, D., Miranda, G., Qiu, S., Weber, H. 1998. A branched stem-loop structure in the M-site of bacteriophage Qbeta RNA is important for template recognition by Qbeta replicase holoenzyme. J Mol Biol. 283: 585-593.

87. Schuwirth, B.S., Borovinskaya, M.A., Hau, C.W., Zhang, W., Vila-Sanjurjo, A., Holton, J.M., Cate, J.H.D. 2005. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Ä resolution. Science. 310: 827834.

88. Selivanova, O.M, Shiryaev, V.M, Tiktopulo, E.I, Potekhin, S.A, Spirin, A.S. 2003. Compact globular structure of Thermus thermophilus ribosomal protein S1 in solution: sedimentation and calorimetric study. J Biol Chem. 278: 36311-36314.

89. Senear, A.W., Steitz, J.A. 1976. Site-specific interaction of Qß host factor and ribosomal protein S1 with Qß and R17 bacteriophage RNAs. J. Biol. Chem. 251: 1902-1912.

90. Sengupta, J., Agrawal, R.K., Frank, J. 2001. Visualization of protein S1 within the 30S ribosomal subunit and its interaction with messenger RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 11991-11996.

91. Sorensen, M.A., Fricke, J., Pedersen, S. 1998. Ribosomal protein S1 is required for translation of most, if not all, natural mRNA in Escherichia coli in vivo. J. Mol. Biol. 280: 561-569.

92. Spiegelman, S., Pace, N.R., Mills, D.R., Levisohn, R., Eikhom, T.S., Taylor, M.M., Peterson, R.L., Bishop, D.H. 1968. The mechanism of RNA replication. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 33: 101-124.

93. Strauss, J., H., and Sinsheimer, R., L. 1967. Characterization of an Infectivity Assay for the Ribonucleic Acid of Bacteriophage MS2. Journal of Virology: 711-716.

94. Studier, F.W. 2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41: 207-234.

95. Sumper, M., and Luce, R. 1975. Evidence for de novo production of self-replicating and environmentally adapted RNA structures by bacteriophage Qbeta replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72: 162-166.

96. Subramanian, A.R. 1983. Structure and functions of ribosomal protein S1 Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 28: 102-138.

97. Subramanian, A.R, Rienhardt P., Kimura, M., Suryanarayana, T. 1981. Fragments of ribosomal protein S1 and its mutant form m1-S1. Localization of nucleic-acid-binding domain in the middle region of S1. Eur. J. Biochem. 119: 245-249.

98. Sukhodolets, M.V., Garges, S., Adhya, S. 2006. Ribosomal protein S1 promotes transcriptional cycling. RNA. 12: 1505-1513.

99. Szer, W., Hermoso, J.M., Boublik, M. 1976. Destabilization of the secondary structure of RNA by ribosomal protein S1 from Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun. 70: 957-964.

100. Takeshita, D., Tomita, K. 2010. Assembly of Qß viral RNA polymerase with host translational elongation factors EF-Tu and -Ts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107: 15733-15738.

101. Takeshita, D., Tomita, K. 2012. Molecular basis for RNA polymerization by Qß replicase. Nat.

Struct. Mol. Biol. 19: 229-237.

102. Takeshita, D., Yamashita, S., and Tomita, K. 2014. Molecular insights into replication initiation by Qß replicase using ribosomal protein S1. Nucleic Acids Res. 42: 10809-10822.

103. Thomas, J.O., Kolb, A., Szer, W. 1978. Structure of single-stranded nucleic acids in the presence of ribosomal protein S1. J. Mol. Biol. 123: 163-176.

104. Tomita, K. 2014. Structures and Functions of Qß Replicase: Translation Factors beyond Protein Synthesis. Int. J. Mol. Sci. 15: 15552-15570.

105. Ugarov, V.I., Samatov, T.R., Chetverina, H.V., Chetverin, A.B. 1999. Plasmid purification using hot Mg2+ treatment and no RNase. BioTechniques 26: 194-196, 198.

106. Ugarov, V.I., Demidenko, A.A., Chetverin, A.B. 2003. Qß Replicase Discriminates between Legitimate and Illegitimate Templates by Having Different Mechanisms of Initiation. J. Biol. Chem. 278: 44139-44146.

107. Ugarov, V.I., Chetverin, A.B. 2008. Functional circularity of legitimate Qß replicase templates. J. Mol. Biol. 379: 414-427.

108. Van Dieijen, G., Van Knippenberg, P.H., Van Duin, J. 1976. The specific role of ribosomal protein S1 in the recognition of native phage RNA. Eur. J. Biochem. 64: 511-518.

109. Wahba, A.J., Miller, M.J., Niveleau, A., Landers, T.A., Carmichael, G.G., Weber, K., Hawley, D A., Slobin, L.I. 1974. Subunit I of Qß Replicase and 30 S Ribosomal Protein S1 of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 249: 3314-3316.

110. Weber, H., Billeter, M.A., Kahane, S., Weissmann, C., Hindley, J., Porter, A. 1972. Molecular basis for repressor activity of Qß replicase. Nature New Biol. 237: 166-170.

111. Weber, H., Weissmann, C. 1970. The 3'-termini of bacteriophage Qß plus and minus strands. J. Mol. Biol. 51: 215-224.

112. Weiner, A.M, Weber, K. 1973. A single UGA codon functions as a natural termination signal in the coliphage q beta coat protein cistron. J. Mol. Biol. 80: 837-855.

113. Weissmann, C., Billeter, M.A., Goodman, H.M., Hindley, J., Weber, H. 1973. Structure and function of phage RNA. Ann. Rev. Biochem. 42: 303-328.

114. Weissmann, C., Feix, G., Slor, H. 1968. In vitro synthesis of phage RNA: The nature of the intermediates. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 33: 83-100.

115. Weissmann, C., Feix, G., Slor, H., Pollet, R. 1967. Replication of viral RNA. XIV. Single-stranded minus strands as template for the synthesis of viral plus strand in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 57: 1870-1877.

116. Yokota, T., Arai, K., Kaziro, Y. 1977. Involvement of 30S Ribosomal Protein SI in Poly(U)-Directed Polyphenylalanine Synthesis. J. Biochem. 82: 1485-1489.

117. Yoshinari, S., Dreher, T.W. 2000. Internal and 3' RNA initiation by Qß replicase directed by

CCA boxes. Virology. 271: 363-370. 118. Young, R.A., Blumenthal, T. 1975. Phage Qß ribonucleic acid replicase. Subunit relationships determined by intramolecular cross-linking. J. Biol. Chem. 250: 1829-1832.