Особенности инициации и терминации синтеза РНК Qβ-репликазой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Лободин Кирилл Владимирович

• Лободин Кирилл Владимирович
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Лободин Кирилл Владимирович

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 QP-репликаза

1.1.2 Репликационный цикл QP-репликазы

1.1.2.1 Инициация

1.1.2.2 Элонгация

1.1.2.3 Терминация

1.1.3 Незаконные матрицы QP-репликазы

1.1.4 Субъединичный состав QP-репликазы

1.1.4.1 Каталитическая субъединица

1.1.4.2 Рибосомный белок S1

1.1.4.3 Факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts

1.2 Сходства и различия QP-репликазы и других РНК-полимераз

1.2.1 РНК-зависимые РНК-полимеразы вирусов с одноцепочечной (+) РНК

1.2.1.1 Полимеразы флавивирусов

1.2.1.2 Полимеразы пикорнавирусов

1.2.2 РНК-зависимые РНК-полимеразы вирусов с одноцепочечной (-) РНК

1.2.3 РНК-зависимые РНК-полимеразы вирусов с двуцепочечной РНК

1.2.4 ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага Т7

1.3 Заключение

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Микробиологические методы

2.1.1 Штаммы Escherichia coli

2.1.2 Микробиологические среды

2.1.3 Трансформация

2.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами

2.2.1 Плазмиды

2.2.2 Выделение плазмидной ДНК

2.2.3 Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.2.4 Фенольная обработка нуклеиновых кислот

2.2.5 Осаждение нуклеиновых кислот этанолом

2.2.6 Транскрипция in vitro

2.2.7 Очистка РНК с помощью электрофореза и последующей элюции из геля

2.2.8 РНК, использованные в работе

2.2.9 Олигонуклеотиды

2.2.10 Дефосфорилирование RQ87-3(+) РНК

2.2.11 Мечение 5'-конца RQ87-3(+) РНК радиоактивным фосфатом

2.2.12 Отжиг РНК

2.3. Методы работы с белками

2.3.1 Получение слитого кора QP-репликазы

2.3.1.1 Наращивание продуцента слитого кора QP-репликазы

2.3.1.2 Получение клеточного лизата

2.3.1.3 Металл-хелатная хроматография

2.3.1.4 Гидрофобная хроматография

2.3.1.5 Гель-фильтрация

2.3.2 Получение коровой части QP-репликазы дикого типа

2.3.2.1 Наращивание продуцента QP-репликазы дикого типа

2.3.2.2 Получение клеточного лизата

2.3.2.3 Анионообменная хроматография

2.3.2.4 Гидрофобная хроматография

2.3.3 Получение ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7

2.3.3.1 Наращивание продуцента РНК-полимеразы бактериофага Т7

2.3.3.2 Получение клеточного лизата

2.3.3.3 Анионообменная хроматография

2.3.3.4 Катионообменная хроматография

2.3.3.5 Гель-фильтрация

2.3.4 Получение белка ОВ1-3

2.3.4.1 Наращивание продуцента белка ОВ1-3

2.3.4.2 Получение клеточного лизата

2.3.4.3 Металл-хелатная хроматография

2.3.4.4 Анионообменная хроматография

2.4 Электрофоретические методы

2.4.1 Электрофорез нуклеиновых кислот

2.4.2 Окрашивание нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле серебром

2.4.3 Электрофорез белков в денатурирующих условиях

2.5 Эксперименты по синтезу РНК

2.5.1 Анализ комплексов QP-репликазы и RQ РНК с помощью гель-фильтрации

2.5.2 Оценка периода полураспада элонгационного комплекса

2.5.3 Однократное копирование RQ РНК

2.5.4 Репликация RQ87-3(+) РНК

2.5.5 Синтез поли^)

2.5.6 Синтез поли^) ДНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага Т7

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Цели и экспериментальные задачи

3.2 Зависимость стабильности комплекса от набора нуклеотидов и используемой матрицы

3.3 Оценка периода полураспада элонгационного комплекса

3.4 Оценка гомогенности элонгационного комплекса

3.5 Механизм синтеза поли^)

3.6 Оценка длины синтезируемых цепочек поли^)

3.7 Устойчивость синтеза поли^) к присутствию ауринтрикарбоновой кислоты

3.8 Сравнение поли^)-продуктов, синтезируемых на различных матрицах QP-репликазы

3.9 Роль атома азота в седьмом положении гуанина в синтезе поли^)

3.10 Влияние белка S1 на синтез поли^)

3.11 Использование олигонуклеотидов в качестве праймеров для инициации

3.12 Влияние ионов Mg2+ и фосфатных групп на 5'-конце олигонуклеотида на его праймерную активность

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Получение элонгационного комплекса в присутствии неполного набора нуклеотидов

4.2 Формирование репликативного комплекса с помощью олигонуклеотидного праймера

4.3 Роль ионов Mg2+ и фосфатных групп на 5'-конце праймера в его связывании

4.4 Выявленные особенности инициации синтеза РНК QP-репликазой

4.5 Синтез поли^)

4.6 Возможный механизм действия белка S1

4.7 Особенности терминации синтеза РНК QP-репликазой

4.8 Перспективы

4.8.1 Структурные исследования инициаторных комплексов

4.8.2 Исследование взаимодействия белка S1 с G-квадруплексами

4.8.3 Сравнение механизмов синтеза РНК QP-репликазой и РНК-полимеразой бактериофага Т7

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

[а-32Р]УТФ - уридинтрифосфат, меченный радиоактивным фосфатом в альфа-положении [у-32Р]АТФ - аденозинтрифосфат, меченный радиоактивным фосфатом в гамма-положении CIAP - щелочная фосфатаза из кишечника телёнка

OB1-2 - двудоменный N-концевой фрагмент рибосомного белка S1 (1-171 аминокислота)

OB1-3 - трёхдоменный N-концевой фрагмент рибосомного белка S1 (1-260 аминокислота)

RQ РНК - РНК, реплицируемые QP репликазой (от англ. Replicable by QP replicase)

SLA - вторичная структура, образуемая на 5'-конце генома флавивирусов (от англ. Stem-Loop

A), узнаваемая РНК-полимеразой при инициации

TEV - вирус гравировки табака (от англ. Tobacco Etch Virus)

VPg - геном-связывающий белок

а.о. - аминокислотный остаток

АТК - ауринтрикарбоновая кислота

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

ГДФ - гуанозин-5'-дифосфат

ГМФ - гуанозин-5'-монофосфат

ГТФ - гуанозин-5'-трифосфат

ДНК - 2'-дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ДТТ - дитиотрейтол

дц - двуцепочечная РНК

ИПТГ - изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид

ИТФ - инозин-5'-трифосфат

ЛПАА - линейный полиакриламид

мРНК - матричная РНК

нт - нуклеотид

НТО - нетранслируемая область оц - одноцепочечная РНК п.н. - пара нуклеотидов ПААГ - полиакриламидный гель РНК - рибонуклеиновая кислота Трис - трис(оксиметил)аминометан тРНК - транспортная РНК УТФ - уридин-5'-трифосфат

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ЦТФ - цитидин-5'-трифосфат

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат, натриевая соль

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности инициации и терминации синтеза РНК Qβ-репликазой»

ВВЕДЕНИЕ

QP-репликаза является РНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага QP, паразитирующего на клетках Escherichia coli [Watanabe, 1964; Haruna and Spiegelman, 1965a]. Она способна осуществлять полный цикл репликации РНК in vitro, делая это с рекордной скоростью, производя до 1010 копий РНК за 10 мин инкубации при 37 °С [Chetverin and Spirin, 1995]. Столь высокая скорость возможна благодаря тому, что процесс размножения происходит экспоненциально: пока репликаза остаётся в молярном избытке, в каждом новом цикле число молекул РНК удваивается, поскольку как исходная РНК, так и её копия являются эффективными матрицами QP-репликазы [Haruna and Spiegelman, 1965b].

Такая высокая эффективность фермента сочетается с не менее высокой специфичностью. Экспоненциально реплицировать QP-репликаза способна лишь очень узкий класс РНК, к которому относятся геномная РНК бактериофага QP и короткие RQ РНК (от англ. Replicable by QP replicase), образующиеся случайным образом за счёт рекомбинации фаговых РНК и/или РНК E. coli. Реплицируемые РНК не имеют общих гомологичных последовательностей, за исключением концевых 5'-GGG и 3'-CCC кластеров [Chetverin and Spirin, 1995]. Однако их наличие не является достаточным условием для репликации РНК QP-репликазой. Из примерно 1012 уникальных случайных последовательностей РНК, длиной 50 и 77 нуклеотидов и содержащих указанные кластеры, с помощью процедуры SELEX удалось отобрать лишь единичные молекулы, которые в некоторой степени реплицировались QP-репликазой [Brown and Gold, 1995a].

Однако, несмотря на высокую избирательность в репликации РНК, QP-репликаза крайне неизбирательно проводит однократное копирование [Ugarov et al., 2003]. Те матрицы, которые QP-репликаза копирует лишь однократно, получили название незаконные. Те же, что могут быть реплицированы - законные. Несмотря на долгие годы исследований QP-репликазы, в настоящий момент нет понимания того, какой структурой должна обладать РНК, чтобы являться законной матрицей. Это существенно ограничивает использование фермента в генной инженерии. Имеющиеся данные говорят о том, что дискриминация происходит на стадии инициации [Ugarov et al., 2003]. Во время инициации на законных матрицах репликаза переходит в закрытую конформацию, что позволяет ей проводить дальнейший синтез в присутствии ауринтри-карбоновой кислоты (АТК) - конкурентного ингибитора РНК-белковых взаимодействий. При инициации копирования незаконных матриц конформационного перехода не происходит, и синтез протекает в базовой, открытой, конформации, что делает его невозможным в присутствии АТК [Ugarov et al., 2003].

В настоящий момент известна пространственная структура только открытой конформации QP-репликазы [Kidmose et al., 2010; Takeshita and Tomita, 2010; Takeshita and Tomita, 2012]. Но

8

для понимания механизма экспоненциального синтеза, а также механизма дискриминации законных и незаконных матриц, необходима расшифровка пространственной структуры закрытой конформации. Проведение подобных структурных исследований требует получения стабильного гомогенного репликативного комплекса Qß-репликазы, образованного на законной матрице. Два наиболее очевидных подхода для их получения - это инкубация репликазы и матрицы в присутствии неполного набора нуклеотидов или олигонуклеотидного праймера. Проблема с последним подходом заключается в отсутствии данных о том, может ли Qß-репликаза связать в своём активном центре заранее синтезированный олигонуклеотид, если она находится в закрытой конформации.

При элонгации законная матрица и растущая цепь поддерживаются Qß-репликазой в од-ноцепочечном состоянии [Weissmann et al., 1968]. При терминации происходит высвобождение новосинтезированной цепи из активного центра в одноцепочечной форме [Feix et al., 1967]. Поскольку Qß-репликаза способна реплицировать только одноцепочечные РНК [Biebricher et al., 1982], корректная терминация является важным аспектом экспоненциального синтеза.

Qß-репликаза включает в себя четыре субъединицы - каталитическую ß-субъединицу [Kamen, 1972, Landers et al., 1974], рибосомный белок S1 (а-субъединица) [Wahba et al., 1974] и факторы элонгации трансляции EF-Tu и EF-Ts (у- и 5-субъединицы, соответственно) [Blumenthal et al., 1972]. Только первая из перечисленных кодируется геномом бактериофага [Kamen, 1970; Kondo et al., 1970]. Остальные три вирус заимствует у клетки-хозяина. Функцию фактора терминации выполняет белок S1, катализируя выход синтезированной копии в одноце-почечном состоянии [Vasilyev et al., 2013]. Даже в том случае, когда белок S1 ассоциирован с репликазой с самого начала синтеза, высвобождения недосинтезированной копии он не осуществляет. Что является сигналом для осуществления терминации данным белком, на сегодняшний день остаётся неизвестным.

О функции факторов элонгации в экспоненциальном синтезе нет достоверных сведений помимо того, что они поддерживают функционально активную пространственную структуру ß-субъединицы [Kamen, 1970; Landers et al., 1974].

Целью настоящей работы было исследование механизма синтеза РНК Qß-репликазой на законной матрице. Исходной задачей было найти способ получения закрытого репликативного комплекса Qß-репликазы, пригодного для структурных исследований. Остальные задачи сформулированы в процессе работы, по мере обнаружения неизвестных раньше фактов.

При выполнении настоящей работы, мы неожиданно обнаружили, что инкубация Qß-репликазы в присутствии законной матрицы и ГТФ (инициаторного нуклеотида) приводит к синтезу цепочек поли^), длина которых достигает нескольких десятков нуклеотидов, за счёт проскальзывания растущей цепи относительно матрицы. Зависимость выхода цепей поли^) от

9

их длины носит периодический характер, а причиной периодичности служит, вероятно, формирование ими G-квадруплекс-подобной структуры. Кроме того, оказалось, что синтезируемые цепи поли^) длиной 15 нуклеотидов ^15) прочно связываются в активном центре репликазы и образуют вместе с матрицей структуру, специфично узнаваемую рибосомным белком S1, который катализирует терминацию синтеза этих цепей так же, как и терминацию репликации РНК QP-репликазой. Последний результат позволяет предположить, что структура комплекса Gl5 с матрицей имитирует сигнал терминации нормального репликативного цикла.

Наконец, оказалось, что для образования закрытого репликативного комплекса можно использовать заранее синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные 3'-концу законной матрицы. Допустимая длина праймера ограничивается вторичной структурой 3'-концевой части законной матрицы, из чего можно предположить, что она сохраняется в процессе инициации.

Методология исследования включает классические методы молекулярной биологии: методы генной инженерии, выделение белков из бактериальной массы, хроматографические, электрофоретические методы и др.

Автор искренне благодарен всему научному коллективу лаборатории биохимии вирусных РНК ИБ РАН, в которой была выполнена настоящая работа, а также техническому персоналу за поддержку, помощь в планировании и проведении экспериментов, плодотворное обсуждение хода работы, постоянное предложение новых идей. В частности, автор выражает благодарность А.А. Гордееву, Е.А. Сыроегину, М.Д. Барановской, А.И. Афремовой, Л.В. Шутовой. Отдельно автор хотел бы выделить В.И. Угарова и З.Ш. Кутлубаеву за непосредственное чуткое руководство и обучение основным методам исследования.

Автор глубоко признателен Е.В. Четвериной, принимавшей непосредственное участие в настоящей работе, за плодотворное обсуждение результатов и предложение оригинальных идей, существенно продвинувших ход настоящей работы, за внимательное руководство в освоении методик и проведении экспериментов. Все представленные в работе модели вторичных структур РНК являются непосредственно её заслугой.

Также автор благодарен Н.В. Леконцевой, сотруднице института, в котором проводилась работа, за любезно предоставленный препарат Hfq, Т. Йомо из Университета г. Осаки (Япония) за любезно предоставленный препарат плазмиды, кодирующей слитую коровую часть QP-репликазы, и Ф.В. Штудиеру из брукхейвенской национальной лаборатории (США) за любезно предоставленный препарат плазмиды, кодирующей РНК-полимеразу бактериофага Т7.

Особую признательность автор выражает своему научному руководителю, А.Б. Четвери-ну, без которого настоящая работа не могла состояться, за большой искренний интерес, постоянное чуткое внимание к работе, свежие и оригинальные идеи и подходы, а также прекрасную школу научной работы.

Положения, выносимые на защиту

1. Гомогенный закрытый инициаторный комплекс образуется в результате инкубации QP-репликазы с законной матрицей и коротким олигонуклеотидом определённой длины, комплементарным 3'-концу матрицы.

2. При инициации синтеза РНК участок законной матрицы, подлежащий копированию, не разворачивается.

3. QP-репликаза удерживает 5'-конец растущей цепи за его трифосфатную группу.

4. В связывании инициаторного нуклеотида (ГТФ) участвует атом азота в седьмом положении его азотистого основания (гуанина).

5. При инкубации с законной матрицей и ГТФ QP-репликаза синтезирует, в результате проскальзывания относительно 3'-концевого олиго(С) матрицы, цепи поли^) разной длины, выход которых периодически изменяется в зависимости от размера.

6. Наблюдаемая периодичность является результатом формирования структур РНК, образующихся при участии атомов азота в седьмом положении гуанина и прочно связывающихся в активном центре репликазы.

7. Структура, образуемая с участием 3'-концевого олиго(С) матрицы и поли^) длиной 15 нуклеотидов имитирует сигнал терминации, формирующийся в активном центре по завершении синтеза цепи РНК, комплементарной законной матрице.

Степень достоверности и апробация результатов

По результатам исследования опубликовано 2 статьи в международных рецензируемых научных изданиях:

1. Lobodin, K.V., Chetverina, H.V., Chetverin, A.B. 2023. Slippage at the initiation of RNA synthesis by QP replicase results in a periodic polyG pattern. FEBS Lett. 597: 458-471. DOI: 10.1002/1873-3468.

2. Lobodin, K.V., Chetverina, H.V., Chetverin, A.B. 2024. Probing the legitimate initiation of RNA synthesis by QP replicase with oligonucleotide primers. FEBS Lett. 598: 579-586. DOI: 10.1002/1873-3468.14833.

Помимо этого, результаты работы были представлены в виде докладов:

1. Лободин К.В., Угаров В.И., Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2020. Получение элонгаци-онного комплекса, образующегося при репликации РНК QP-репликазой. Биология -наука XXI века: 24-я международная Пущинская Школа-конференция, Пущино, тезисы конференции, С. 64.

2. Lobodin, K., Chetverina, H. and Chetverin, A. 2022. Formation of a G-quadruplex-like structure may trigger the ribosomal protein S1-promoted termination of the RNA synthesis by QP replicase. 46th FEBS Congress, Lisbon, Portugal, FEBS Open Bio 12 (Suppl. S1), p. 276.

3. Lobodin, K., Chetverina, H. and Chetverin, A. 2022. Ribosomal protein S1 may recognize G-quadruplex as a signal for termination of the RNA synthesis by QP replicase. Viruses of Microbes, Guimaraes, Portugal. Program and abstract book of a biennial conference of the International Society for Viruses of Microorganisms, p. 212.

4. Лободин К.В, Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2023. Рибосомный белок S1 может узнавать G-квадруплекс-подобную структуру в качестве сигнала для терминации синтеза РНК QP-репликазой. Ежегодная научная конференция Института белка РАН, Пущино.

5. Lobodin, K., Chetverina, H. and Chetverin, A. 2023. QP replicase initiates RNA synthesis without disturbing the secondary structure of the template. Viruses of Microbes, Tbilisi, Georgia, Program and abstract book of a biennial conference of the International Society for Viruses of Microorganisms.

6. Лободин К.В, Четверина Е.В., Четверин А.Б. 2023. Сигналом для терминации синтеза РНК QP-репликазой, вероятно, служит квадруплекс-подобная структура. Конкурс на лучшую научную работу среди молодых ученых ИБ РАН, Пущино.

7. Четверина Е.В., Лободин К.В., Четверин А.Б. 2024. Олигонуклеотиды помогают выяснить механизм размножения РНК QP-репликазой. Ежегодная научная конференция Института белка РАН, Пущино.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Qp-репликаза

QP-репликаза является РНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага QP, поражающего клетки E. coli [Watanabe, 1964; Haruna and Spiegelman, 1965a]. Геном бактериофага представлен одноцепочечной (+) РНК длиной 4217 нт [Nathans et al., 1962; Garwes et al., 1969; Van Duin and Tsareva, 2006]. Фермент проявляет высокую специфичность в отношении генома бактериофага QP и не реплицирует клеточные РНК E. coli или РНК близкородственных вирусов [Haruna and Spiegelman, 1965a].

Матрицами QP-репликазы и продуктами репликации являются одноцепочечные молекулы РНК [Feix et al., 1967]. Очищенная QP-репликаза способна осуществлять полный цикл репликации in vitro (Рис. 1) [Haruna and Spiegelman, 1965a]. При условии молярного избытка фермента над матрицей, репликация осуществляется в экспоненциальном режиме [Haruna and Spiegelman, 1965b]. То есть, число молекул РНК в каждом следующем цикле удваивается. Это возможно в результате того, что и матричная, и новосинтезированная цепи обладают одинаково высокими матричными активностями [Spiegelman et al., 1965; Haruna and Spiegelman, 1965b; Pace and Spiegelman, 1966]. Благодаря этому QP-репликаза осуществляет размножение генетического материала в бесклеточной системе с рекордной скоростью и способна синтезировать до 10 млрд копий РНК за 10 мин инкубации при 37 °С [Chetverin and Spirin, 1995].

Это свойство фермента привело к открытию группы матриц, носящей название RQ РНК (от англ. Replicable by QP replicase) [Munishkin et al., 1991]. Это очень узкая группа молекул, реплицируемых QP-репликазой, длина которых обычно не превышает 250 нт [Chetverin, 2004]. Впервые они были обнаружены при многократном пересеве продуктов репликации генома [Levisohn and Spiegelman, 1968] и были названы РНК-вариантами, так как, по мнению авторов, в эксперименте происходила эволюция геномной QP РНК, сопровождающаяся уменьшением её длины. Позже такие молекулы были обнаружены и в инфицированных клетках E. coli [Banerjee et al., 1969] в виде 6S фракции РНК (и отсюда получили своё новое название), а затем и непосредственно в вирусных частицах [Chetverin et al., 1991]. Ещё позже они получили своё окончательное название [Munishkin et al., 1991; Moody et al., 1994].

Высокая эффективность размножения QP-репликазой приводит к тому, что даже одиночные молекулы RQ РНК, попадающие в реакционную смесь из воздуха, довольно быстро размножаются до детектируемых количеств [Chetverin et al., 1991]. В результате, зачастую, даже когда в реакционную смесь специально не добавлялась матрица, наблюдался синтез РНК [Kacian et al., 1972; Schaffner et al., 1977]. В связи с этим даже высказывалась гипотеза о том,

что QP-репликаза способна синтезировать РНК безматрично [Sumper and Luce, 1975]. RQ120 РНК и RQ135 РНК, в частности, были впервые обнаружены именно как продукты такого «безматричного» синтеза [Munishkin et al., 1988; Munishkin et al., 1991]. Номер в названии RQ указывает длину в нуклеотидах разновидности, которая была впервые секвенирована. Верхний индекс, где он присутствует, показывает отклонение длины конкретного клона от указанной. (+) означает цепь РНК, которая синтезируется при репликации QP-репликазой в больших количествах, чем комплементарная (-) цепь.

RQ РНК или QPPHK

GGG-

I

■СССА

Qp-репликаза,

открытая конформация

инициация

I о

I элонгация ^^^^

Qp-репликаза,

закрытая конформация

I

3'

СССА матрица

GGG^, копия

нематричноеаденилирование и терминация

3'

АССС—«ч. _

СССА матрица

•GGG

5'

копия

Рис. 1. Схема репликационного цикла (ЗР-репликазы. Матрица окрашена чёрным цветом, комплементарная копия красным, (^Р-репликаза синим. Инициация сопровождается синтезом олиго^)-кластера и переходом репликазы в закрытую конформацию. З'-концевой А матрицы не читается. При элонгации матрица и растущая цепь поддерживаются репликазой в одноцепо-чечной форме. Терминация сопровождается безматричным аденилированием копии и её выходом из активного центра в одноцепочечной форме.

Первой RQ РНК, у которой была расшифрована первичная структура, стала RQ223 РНК, носящая название MDV-1 (мидивариант) на тот момент [Mills et al., 1973; Kramer and Mills, 1978]. Её расшифровка показала, что эта РНК может формировать жёсткую вторичную структуру [Mills et al., 1973]. Позже были расшифрованы первичные структуры других RQ РНК, в том числе RQ87 РНК (MNV-11, минивариант) [Biebricher, 1987], RQ120 [Munishkin et al., 1988], RQ135 РНК [Munishkin et al., 1991] и др. Из анализа их последовательностей также следовало, что они могут формировать жёсткую вторичную структуру, и это подтверждалось доступностью к РНКазам, специфичным к одноцепочечным и двуцепочечным участкам [Biebricher, 1987; Munishkin et al., 1988; Munishkin et al., 1991].

Многие RQ РНК имеют участки, гомологичные геномной РНК бактериофага, что первоначально могло восприниматься доказательством того, что RQ РНК являются продуктами эволюции генома [Nishihara et al., 1983]. Однако обнаружение и расшифровка первичной структуры RQ120 РНК показали, что она является продуктом рекомбинации Qß РНК и аспарагиновой тРНК E. coli [Munishkin et al., 1988]. Это был первый случай обнаружения рекомбинации РНК в бактериальной клетке. Расшифровка нуклеотидных последовательностей других RQ РНК и их сравнительный анализ показали, что их происхождение тоже имеет рекомбиногенную природу. В частности, было обнаружено, что RQ223 РНК является продуктом рекомбинации геномных РНК фагов Qß и фб, а также неизвестной РНК, а RQ87 РНК является продуктом рекомбинации Qß РНК или RQ223 РНК и ещё одной неизвестной РНК [Chetverin and Spirin, 1995].

До обнаружения и расшифровки первичной структуры RQ135 РНК предполагалось, что Qß-репликаза может реплицировать RQ РНК благодаря наличию в них участков, гомологичных Qß РНК, которые выступают в качестве промотора [Nishihara et al., 1983]. Однако анализ последовательности RQ135 РНК показал, что она является продуктом рекомбинации 23S рРНК E. coli и мРНК О-белка фага X и не имеет участков, гомологичных Qß РНК, что опровергало данную гипотезу [Munishkin et al., 1991].

Единственными обнаруженными общими последовательностями, которыми обладают все RQ РНК и Qß РНК, являются концевые тринуклеотиды 5'-GGG и 3'-CCC [Chetverin and Spirin, 1995]. Однако этого явно недостаточно для объяснения матричной специфичности фермента. Так, в эксперименте с использованием процедуры SELEX, в котором из стартового набора около 1012 случайных последовательностей длиной 50 и 77 нуклеотидов, заранее снабжённых 5'-GGG и 3'-CCC концами, удалось отобрать лишь единичные реплицируемые РНК [Brown and Gold, 1995a].

Вероятно, ключевую роль в матричной специфичности играет вторичная и третичная

структура РНК. На сегодняшний день неизвестно, какую именно структуру распознаёт

Qß-репликаза. Одно из первых предположений заключалось в том, что она узнаёт одновремен-

15

но 5'- и З'-концевые участки РНК [Spiegelman et al., 1968]. Подобное наблюдается, например, в случае флавивирусов [Choi, 2021] и ортомиксовирусов [Hsu et al., 1987]. Анализ вторичных структур RQ РНК с помощью РНКаз показал, что их 5'-GGG и З'-CCC последовательности спариваются друг с другом [Munishkin et al., 1988; Munishkin et al., 1991]. Кроме того, было показано, что замена 2-го и/или 3-го G RQ135-1(-) РНК на A снижает скорость и выход инициации и дестабилизирует закрытую конформацию QP-репликазы [Ugarov and Chetverin, 2008]. Замена также приводила к тому, что требовались более высокие концентрации инициаторного нуклео-тида, ГТФ. Всё это говорит в пользу данной гипотезы.

1.1.2 Репликационный цикл QP-репликазы 1.1.2.1 Инициация

Схема репликационного цикла QP-репликазы представлена на Рис. 1. Все известные RQ РНК и QP РНК оканчиваются на З'-конце последовательностью CCCA [Chetverin and Spirin, 1995]. Последний нуклеотид - аденилат - не читается при инициации и его удаление не приводит к потере матричной активности [Rensing and August, 1969]. Инициация происходит без использования праймера, а инициаторным нуклеотидом всегда выступает ГТФ [Banerjee et al., 1967]. Инициация требует более высоких концентраций этого нуклеотида, нежели элонгация [Ugarov et al., 2003].

При связывании RQ РНК или QP РНК QP-репликаза переходит в закрытую конформацию. Это можно обнаружить по её способности к синтезу РНК в присутствии ауринтрикарбоновой кислоты (АТК) [Ugarov et al., 2003], полимерная фракция которой является конкурентным ингибитором РНК-белковых взаимодействий [Blumenthal and Landers, 1973; Gonzalez et al., 1980]. Формирование комплекса, устойчивого к АТК, с QP РНК приводит к изменению ориентации субъединиц QP-репликазы, что было показано по изменению характера сшивок между ними диметил суберимедатом [Blumenthal et al., 1976]. Стабильность комплекса репликазы и матрицы, устойчивого к АТК, довольно невысокая, однако она повышается в присутствии ГТФ благодаря синтезу 5'-pppGGG, комплементарного 3'-CCC матрицы [Ugarov et al., 2003]. Но даже в этом случае комплекс распадается в течение нескольких минут и лишь переход на стадию элонгации приводит к высокой стабильности комплекса [Ugarov and Chetverin, 2008]. Устойчивость к АТК означает, что матрица и растущая цепь не могут покинуть активный центр репликазы и, следовательно, элонгация происходит процессивно.

На сегодняшний день определена лишь пространственная структура QP-репликазы в базовой, открытой конформации, в которой она находится, когда не связана с RQ РНК или QP РНК

[Kidmose et al., 2010; Takeshita and Tomita, 2010; Takeshita and Tomita, 2012]. Поэтому структурные особенности закрытой конформации остаются неизвестными.

1.1.2.2 Элонгация

В процессе элонгации матрица и растущая цепь находятся в одноцепочечной форме [Feix et al., 1967]. В разделении дуплекса и поддержании одноцепочечного состояния цепей непосредственное участие принимает репликаза [Weissmann et al., 1968]. Это следует из факта, что в процессе элонгации обе цепи нечувствительны к рибонуклеазе III, которая расщепляет двуце-почечную РНК, но расщепляются РНКазой А, активной в отношении одноцепочечных молекул. Если же перед рибонуклеазной обработкой провести инактивацию репликазы фенолом, иным денатурирующим агентом или протеазой, наблюдается обратное. Продукты репликации становятся нечувствительными к РНКазе А и расщепляются РНКазой III. Это говорит о том, что при инактивации репликазы происходит отжиг комплементарных цепей РНК, входящих в состав репликативного комплекса.

В настоящий момент неизвестно, каким образом достигается поддержание матричной и растущей цепей в однотяжном состоянии. С самого начала было высказано 3 гипотезы [Weissmann et al., 1968]. Первая: репликаза разделяет цепи подобно молнии, а в одноцепочеч-ном состоянии они поддерживаются благодаря образованию вторичных структур; вторая: с цепями связываются клеточные факторы или дополнительные молекулы репликазы; третья: ре-пликаза, помимо З'-конца растущей цепи, находящегося в активном центре, удерживает 5'-конец растущей цепи и З'-конец матрицы, как это изображено на Рис. 2А, что накладывает топологические ограничения на образование длинной двойной спирали. Предположение, что репликаза разделяет цепи подобно молнии, находит подтверждение в структурных исследованиях [Takeshita and Tomita, 2012]. О важности стабильной вторичной структуры для эффективного размножения РНК QP-репликазой говорит ряд публикаций [Mills et al., 1978; Priano et al., 1987; Axelrod et al., 1991], однако это не может быть основной причиной предотвращения отжига цепей, поскольку они образуют дуплекс при обработке протеазами и детергентами, которые не влияют на стабильность вторичной структуры РНК [Chetverin et al., 2019]. Следовательно, в предотвращении отжига главную роль играет не РНК, а репликаза. Вторая гипотеза опровергается тем фактом, что при репликации in vitro, когда, помимо QP-репликазы, других белков не содержится, матрица и растущая цепь поддерживаются в одноцепочечном состоянии даже при низком соотношении репликазы к РНК [Vasilyev et al., 2013]. Третей гипотезе противоречит тот факт, что одна цепь РНК может прочитываться несколькими молекулами репликазы одновременно [Spiegelman et al., 1968]; в этом случае, удержание З'-конца ограничивало бы связывание

с ним других молекул репликазы. Кроме того, позже было показано, что репликаза способна прочно связывать 5'-, но не З'-конец реплицируемой РНК [Schaffner et al., 1977; Ugarov and Chetverin, 2008].

Рис. 2. Модели предотвращения отжига матричной и растущей цепи Qß-репликазой в процессе элонгации. Матрица окрашена чёрным цветом, растущая цепь красным, Qß-реплнказа синим. А - модель, согласно которой репликаза удерживает 5'-конец растущей цепи и З'-конец матричной цепи [Weissmann et al., 1968; Robertson, 1975]. Б - модель, согласно которой матрица и растущая цепь удерживаются в виде колец, соответственно, концевой шпилькой и Qß-репликазой [Chetverin, 2018].

Все эти противоречия учитываются в модели, предложенной А.Б. Четвериным [Chetverin, 2018]. Согласно ей, репликаза удерживает лишь 5'- и 3'-концы растущей цепи, а матрица самостоятельно образует кольцевую структуру благодаря взаимодействию её 5'- и 3'-концов (Рис. 2Б). Это позволяет прочитывать одну молекулу РНК нескольким молекулам репликазы. Данную гипотезу подтверждает наблюдение, что все RQ РНК способны к образованию концевой спирали, состоящей из короткого «черешка», образованного концевыми 5'-олиго^) и 3'-олиго(С) последовательностями, и прилегающей длинной шпильки [Chetverin, 2018]. Похожим образом устроена акцепторная спираль тРНК, которая образуется акцепторным черешком и прилегающей T^C-шпилькой [Rich and RajBhandary, 1976]. Анализ вторичной структуры RQ РНК в денатурирующих условиях с помощью РНКаз показывает, что их концевая спираль чрезвычайно стабильна и сохраняется даже при 50 °С в присутствии 7 М мочевины [Munishkin et al., 1988]. Согласно модели Четверина, эта концевая спираль могла бы выполнять функцию «зам-

А

Б

5'

Концевая шпилька

ка», запирающего реплицирующуюся матрицу в подобие кольцевой структуры [Chetverin, 2018]. Несмотря на перечисленные экспериментальные данные, говорящую в пользу данной модели, необходимы более прямые данные, подтверждающие или опровергающие её.

Другая гипотетическая модель предполагает, что матрица и растущая цепочка могут оставаться в одноцепочечной форме за счёт того, что в процессе элонгации занимают разные центры связывания [Brown and Gold, 1996]. В её пользу говорят результаты ультрафиолетовой сшивки РНК с репликазой, свидетельствующие о наличии нескольких центров связывания РНК в составе Qß-репликазы [Brown and Gold, 1996].

1.1.2.3 Терминация

Корректная терминация синтеза является одним из ключевых аспектов экспоненциальной репликации, поскольку Qß-репликаза может использовать в качестве матрицы только одноце-почечные РНК. Если терминация пройдёт некорректно, то образуется дуплекс и на этом репликация матрицы остановится. В 2013 году в нашей лаборатории было продемонстрировано, что катализ выхода нововсинтезированной копии из активного центра в одноцепочечном состоянии осуществляется рибосомным белком S1, который является одной из субъединиц Qß-репликазы [Vasilyev et al., 2013]. Эта функция осуществляется первыми двумя N-концевыми доменами белка. Механизм действия белка S1 как фактора терминации в настоящее время неизвестен. Известно лишь то, что процесс терминации достаточно медленный и в случае коротких RQ РНК эта стадия занимает около 90 % времени репликационного цикла [Biebricher et al., 1983].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лободин Кирилл Владимирович, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Васильев, Н.Н. 2011. Структура коровой части репликазы фага Qß. Диссертация на соискание учёной степени к.б.н. Москва, Институт белка РАН.

2. Abdullah, S.W., Wu, J., Wang, X., Guo, H., Sun, S. 2023. Advances and breakthroughs in IRES-directed translation and replication of picornaviruses. mBio. 14: e0035823.

3. Amroun, A., Priet, S., de Lamballerie, X., Quérat, G. 2017. Bunyaviridae RdRps: structure, motifs, and RNA synthesis machinery. Crit. Rev. Microbiol. 43: 753-778.

4. Arai, K., Nakamura, S., Arai, T., Kawakita, M., Kaziro, Y. 1976. Limited hydrolysis of the polypeptide chain elongation factor Tu by trypsin. Isolation and characterization of the poly-peptide fragments. J. Biochem. 79: 69-83.

5. Arnold, J.J., Cameron, C.E. 2000. Poliovirus RNA-dependent RNA polymerase (3D(pol)). Assembly of stable, elongation-competent complexes by using a symmetrical primer-template substrate (sym/sub). J. Biol. Chem. 275: 5329-5336.

6. Arragain, B., Durieux Trouilleton, Q., Baudin, F., Provaznik, J., Azevedo, N., Cusack, S., Schoehn, G., Malet, H. 2022. Structural snapshots of La Crosse virus polymerase reveal the mechanisms underlying Peribunyaviridae replication and transcription. Nat. Commun. 13: 902.

7. Axelrod, V.D., Brown, E., Priano, C., Mills, DR. 1991. Coliphage Qß RNA replication: RNA catalytic for single-strand release. Virology. 184: 595-608.

8. Banerjee, A.K., Eoyang, L., Hori, K., August, J.T. 1967. Replication of RNA viruses, IV. Initiation of RNA synthesis by the Qß RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 57: 986-993.

9. Banerjee, A.K., Rensing, U., August, J.T. 1969. Replication of RNA viruses. X. Replication of a natural 6S RNA by the Qß RNA polymerase. J. Mol. Biol. 45: 181-193.

10. Bausch, J.N., Kramer, F.R., Miele, E.A., Dobkin, C., Mills, D R. 1983. Terminal adenylation in the synthesis of RNA by Qß replicase. J. Biol. Chem. 258: 1978 -1984.

11. Beaton, A.R., Krug, R.M. 1981. Selected host cell capped RNA fragments prime influenza viral RNA transcription in vivo. Nucleic Acids Res. 9: 4423-4436.

12. Beekwilder, J., Nieuwenhuizen, R., Poot, R., van Duin, J. 1996. Secondary structure model for the first three domains of Qß RNA. Control of A-protein synthesis. J. Mol. Biol. 256: 8-19.

13. Bertani, G. 1951. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. J. Bacteriol. 62: 293-300.

14. Biebricher, C.K. 1987. Replication and evolution of short-chained RNA species replicated by Qß replicase. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52: 299-306.

15. Biebricher, C.K., Diekmann, S., Luce, R. 1982. Structural analysis of self-replicating RNA synthesized by Qß replicase. J. Mol. Biol. 154: 629-648.

96

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

Biebricher, C.K., Eigen, M. 2006. What is a quasispecies? Curr. Top. Microbiol. Immunol. 299: 1-31.

Biebricher, C.K., Eigen, M., Gardiner, W.C. Jr. 1983. Kinetics of RNA replication. Biochemistry. 22: 2544-2559.

Biebricher, C.K., Luce, R. 1992. In vitro recombination and terminal elongation of RNA by Qß replicase. EMBO J. 11: 5129-5135.

Biebricher, C.K., Luce, R. 1996. Template-free generation of RNA species that replicate with bacteriophage T7 RNA polymerase. EMBO J. 15: 3458-3465.

Birnboim, H.C., Doly, J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523.

Blumenthal, T. 1980. Qß replicase template specificity: different templates require different GTP concentrations for initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 2601-2605. Blumenthal, T., Carmichael, G.G. 1979. RNA replication: function and structure of Qß-replicase. Annu. Rev. Biochem. 48: 525-548.

Blumenthal, T., Douglass, J., Smith, D. 1977. Conformational alteration of protein synthesis elongation factor EF-Tu by EF-Ts and by kirromycin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 32643267.

Blumenthal, T., Landers, T.A. 1973. The inhibition of nucleic acid-binding proteins by aurin-tricarboxylic acid. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55: 680-688.

Blumenthal, T., Landers, T.A. 1976. Renaturation of a multisubunit multiactivity enzyme complex: recovery of phage Qß RNA replicase, EF-Tu, and EF-Ts activities after denaturation in urea. Biochemistry 15: 422-425.

Blumenthal, T., Landers, T.A., Weber, K. 1972. Bacteriophage Qß replicase contains the protein biosynthesis elongation factors EF Tu and EF Ts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 69: 13131317.

Blumenthal, T., Young, R.A., Brown, S. 1976. Function and structure in phage Qß RNA replicase. Association of EF-Tu-Ts with the other enzyme subunits. J. Biol. Chem. 251: 2740-2743. Brown, D., Gold, L. 1995a. Selection and characterization of RNAs replicated by Qß replicase. Biochemistry. 34: 14775-82.

Brown, D., Gold, L. 1995b. Template recognition by an RNA-dependent RNA polymerase: identification and characterization of two RNA binding sites on Qß replicase. Biochemistry. 34: 14765-14774.

Brown, D., Gold, L. 1996. RNA replication by Qß replicase: a working model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 11558-11562.

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

Brown, S., Blumenthal, T. 1976a. Function and structure in ribonucleic acid phage Qß ribonucleic acid replicase. Effect of inhibitors of EF-Tu on ribonucleic acid synthesis and renaturation of active enzyme. J. Biol. Chem. 251: 2749 -2753.

Brown, S., Blumenthal, T. 1976b. Reconstitution of Qß RNA replicase from a covalently bonded elongation factor Tu-Ts complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73: 1131-1135. Bujalowski, P.J., Bujalowski, W., Choi, K.H. 2017. Interactions between the Dengue Virus Polymerase NS5 and Stem-Loop A. J. Virol. 91: e00047-17.

Butcher, S.J., Grimes, J.M., Makeyev, E.V., Bamford, D.H., Stuart, D.I. 2001. A mechanism for initiating RNA-dependent RNA polymerization. Nature. 410: 235-240. Carmichael, G.G., Landers, T.A., Weber, K. 1976. Immunochemical analysis of the functions of the subunits of phage Qß ribonucleic acid replicase. J. Biol. Chem. 251: 2744 -2748. Carter, T., Iqbal, M. 2024. The Influenza A Virus Replication Cycle: A Comprehensive Review. Viruses. 16: 316.

Chen, Y., Bopda-Waffo, A., Basu, A., Krishnan, R., Silberstein, E., Taylor, D.R., Talele, T.T., Arora, P., Kaushik-Basu, N. 2009. Characterization of aurintricarboxylic acid as a potent hepatitis C virus replicase inhibitor. Antivir. Chem. Chemother. 20: 19-36. Chetverin, A.B. 2004. Replicable and recombinogenic RNAs. FEBS Lett. 567: 35-41. Chetverin, A.B. 2018. Thirty years of studies of Qß replicase: what have we learned and what is yet to be learned? Biochemistry (Mosc). 83: S19-S32.

Chetverin, A.B., Chetverina, H.V., Demidenko, A.A., Ugarov, V.I. 1997. Nonhomologous RNA Recombination in a Cell-Free System: Evidence for a Transesterification Mechanism Guided by Secondary Structure. Cell 88: 503-513.

Chetverin, A.B., Chetverina, H.V., Munishkin, A.V. 1991. On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qß replicase. J. Mol. Biol. 222: 3-9.

Chetverin, A.B., Spirin, A.S. 1995. Replicable RNA Vectors: Prospects for Cell-free Gene Amplification, Expression, and Cloning. In: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Academic Press, p 225-270.

Chetverin, A.B., Ugarov, V.I., Chetverina, H.V. 2019. Unsolved puzzles of Qß replicase. Mol Biol (Moscow). 53: 791-801.

Choi, K.H. 2021. The role of the stem-loop A RNA promoter in flavivirus replication. Viruses. 13: 1107.

Choi, K.H., Rossmann, M.G. 2009. RNA-dependent RNA polymerases from Flaviviridae. Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 746-751.

Cole, P.E., Sawchyn, I., Guerrier-Takada, C. 1982. Qß replicase containing altered forms of ribosomal protein S1. J. Biol. Chem. 257: 12929 -12934.

98

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

Davanloo, P., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., Studier, F.W. 1984. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 2035-2039. de Fernandez, M.T.F., Hayward, W.S., August, J.T. 1972. Bacterial Proteins Required for Replication of Phage Qß Ribonucleic Acid. J. Biol. Chem. 247: 824 -831.

Domingo-Calap, P., Cuevas, J.M., Sanjuan, R. 2009. The fitness effects of random mutations in single-stranded DNA and RNA bacteriophages. PLoS Genet. 5: e1000742. Dos Santos, R.F., Arraiano, C.M., Andrade, J.M. 2019. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Curr. Genet. 65: 1313-1319.

Dou, D., Revol, R., Östbye, H., Wang, H., Daniels, R. 2018. Influenza A virus cell entry, replication, virion assembly and movement. Front. Immunol. 9: 1581.

Draper, D.E., Pratt C.W., von Hippel, P.H. 1977. Escherichia coli ribosomal protein S1 has two polynucleotide binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 4786-4790. Draper, D.E., von Hippel, P.H. 1978. Nucleic acid binding properties of Escherichia coli ribosomal protein S1. I. Structure and interactions of binding site I. J. Mol. Biol. 122: 321-338. Dunn, J.J., Studier, F.W. 1983. Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7 DNA and the locations of T7 genetic elements. J. Mol. Biol. 166: 477-535.

D'Urso, G., Chat, S., Gillet, R., Giudice, E. 2023. Structural insights into the binding of bS1 to the ribosome. Nucleic Acids Res. 51: 3410-3419.

Duval, M., Korepanov, A., Fuchsbauer, O., Fechter, P., Haller, A., Fabbretti, A., Choulier, L., Micura, R., Klaholz, B.P., Romby, P., Springer, M., Marzi, S. 2013. Escherichia coli ribosomal protein S1 unfolds structured mRNAs onto the ribosome for active translation initiation. PLoS Biol. 11: e1001731.

Feix, G. 1976. Primer-dependent copying of rabbit globin mRNA with Qß replicase. Nature. 259: 593-594

Feix, G., Hake, H. 1975. Primer directed initiation of RNA synthesis catalysed by Qß replicase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 65: 503-509.

Feix, G., Sano, H. 1975. Initiation specificity of the poly(cytidylic acid)-dependent Qß replicase activity. Eur. J. Biochem. 58: 59-64.

Feix, G., Sano, H. 1976. Polydeoxyribonucleotides as templates for RNA synthesis catalysed by Qß replicase. FEBS Lett. 63: 201-204.

Feix, G., Slor, H., Weissmann, C. 1967. Replication of viral RNA. 13. The early product of phage RNA synthesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 57: 1401-1408. Ferrero, D., Ferrer-Orta, C., Verdaguer, N. 2018. Viral RNA-Dependent RNA Polymerases: A Structural Overview. Subcellular Biochemistry. 88: 39-71.

63. Filomatori, C.V., Iglesias, N.G., Villordo, S.M., Alvarez, D.E., Gamarnik, A.V. 2011. RNA sequences and structures required for the recruitment and activity of the dengue virus polymerase. J. Biol. Chem. 286: 6929-6939.

64. Friedman, S.D., Genthner, F.J., Gentry, J., Sobsey, M.D., Vinje, J. 2009. Gene mapping and phylogenetic analysis of the complete genome from 30 single-stranded RNA male-specific coliphages (family Leviviridae). J. Virol. 83: 11233-11243.

65. Garrett, R.A., Wittmann, H.G. 1973. Structure of bacterial ribosomes. Adv. Protein Chem. 27: 277-347.

66. Garwes, D., Sillero, A., Ochoa, S. 1969. Virus-specific proteins in Escherichia coli infected with phage Qß. Biochim. Biophys. Acta 186: 166-172.

67. Gellert, M., Lipsett, M.N., Davies, D.R. 1962. Helix formation by guanylic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48: 2013-2018.

68. Gong, P., Peersen, O.B. 2010. Structural basis for active site closure by the poliovirus RNA-dependent RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107: 22505-22510.

69. Gonzalez, R.G., Haxo, R.S., chleich, T. 1980. Mechanism of action of polymeric aurintricar-boxylic acid, a potent inhibitor of protein-nucleic acid interactions, Biochemistry. 19: 4299-4303.

70. Gopal, V., Brieba, L.G., Guajardo, R., McAllister, W.T., Sousa, R. 1999. Characterization of structural features important for T7 RNAP elongation complex stability reveals competing complex conformations and a role for the non-template strand in RNA displacement. J. Mol. Biol. 290: 411-431.

71. Gruber, A R., Lorenz, R., Bernhart, S.H., Neuböck, R., Hofacker, I L. 2008. The Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Res. 36 (Web Server issue): W70-W74.

72. Guerrier-Takada, C., Johnson, A.E., Miller, D.L., Cole, P.E. 1981. Transfer RNA cross-linked to the elongation factor Tu subunit of Qß replicase does not inhibit Qß RNA replication. J. Bi-ol. Chem. 256: 5840 -5844.

73. Gullberg, R.C., Jordan Steel, J., Moon, S.L., Soltani, E., Geiss, B.J. 2015. Oxidative stress influences positive strand RNA virus genome synthesis and capping. Virology. 475: 219-229.

74. Gytz, H., Mohr, D., Seweryn, P., Yoshimura, Y., Kutlubaeva, Z., Dolman, F., Chelchessa, B., Chetverin, A.B., Mulder, F.A., Brodersen, D.E., Knudsen, C.R. 2015. Structural basis for RNA-genome recognition during bacteriophage Qß replication. Nucleic Acids Res. 43: 1089310906.

75. Haruna, I., Spiegelman, S. 1965a. Specific template requirments of RNA replicases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54: 579-587.

76. Haruna, I., Spiegelman, S. 1965b. Autocatalytic synthesis of a viral RNA in vitro. Science 150: 884-886.

77. Hill, D., Blumenthal, T. 1983. Does Qß replicase synthesize RNA in the absence of template? Nature 301: 350-352.

78. Hobdey, S.E., Kempf, B.J., Steil, B.P., Barton, D.J., Peersen, O.B. 2010. Poliovirus polymerase residue 5 plays a critical role in elongation complex stability. J. Virol. 84: 8072-8084.

79. Holder, I.T., Hartig, J.S. 2014. A matter of location: influence of G-quadruplexes on Escherichia coli gene expression. Chem Biol. 21: 1511-21.

80. Hori, K., Eoyang, L., Banerjee, A.K., August, J.T. 1967. Replication of RNA viruses. V. Template activity of synthetic ribopolymers in the Qß RNA polymerase reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 57: 1790-1797.

81. Hori, K., Harada, K., Kuwano, M. 1974. Function of bacteriophage Qß replicase containing an altered subunit IV. J. Mol. Biol. 86: 699-708.

82. Hsu, M.T., Parvin, J.D., Gupta, S., Krystal, M., Palese, P. 1987. Genomic RNAs of influenza viruses are held in a circular conformation in virions and in infected cells by a terminal panhandle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 8140-8144.

83. Iba, H., Watanabe, T., Emori, Y., Okada, Y. 1982. Three double-stranded RNA genome segments of bacteriophage 96 have homologous terminal sequences. FEBS Lett. 141: 111-115.

84. Igloi, G.L. 1983. A silver stain for the detection of nanogram amounts of tRNA following two-dimentional electrophoresis. Anal. Biochem. 134: 184-188.

85. Inokuchi, Y., Hirashima, A. 1987. Interference with viral infection by defective RNA replicase. J. Virol. 61: 3946-3949.

86. Inokuchi, Y., Kajitani, M. 1997. Deletion Analysis of Qß Replicase. Participation of the car-boxyl-terminal region of the ß-subunit protein in template recognition. J. Biol. Chem. 272: 15339-15345.

87. Johansen, J.S., Kavaliauskas, D., Pfeil, S.H., Blaise, M., Cooperman, B.S., Goldman, Y.E., Thirup, S.S., Knudsen, C.R. 2018. E. coli elongation factor Tu bound to a GTP analogue displays an open conformation equivalent to the GDP-bound form. Nucleic Acids Res. 46: 86418650.

88. Jumper, J., Evans, R., Pritzel, A., Green, T., Figurnov, M., Ronneberger, O., Tunyasuvunakool, K., Bates, R., Zídek, A., Potapenko, A., Bridgland, A., Meyer, C., Kohl, S.A.A., Ballard, A.J., Cowie, A., Romera-Paredes, B., Nikolov, S., Jain, R., Adler, J., Back, T., Petersen, S., Reiman, D., Clancy, E., Zielinski, M., Steinegger, M., Pacholska, M., Berghammer, T., Bodenstein, S., Silver, D., Vinyals, O., Senior, A.W., Kavukcuoglu, K., Kohli, P., Hassabis, D. 2021. Highly

accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596: 583-589.

101

89. Jurnak, F. 1985. Structure of the GDP domain of EF-Tu and location of the amino acids homologous to ras oncogene proteins. Science. 230: 32-36.

90. Kacian, D.L., Mills, D.R., Kramer, F.R., Spiegelman, S. 1972. A replicating RNA molecule suitable for a detailed analysis of extracellular evolution and replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 3038-42.

91. Kamen, R. 1970. Characterization of the Subunits of Qß Replicase. Nature 228: 527-533.

92. Kamen, R. 1972. A new method for the purification of Qß RNA-dependent RNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta 262: 88-100.

93. Kamen, R., Kondo, M., Römer, W., Weissmann, C. 1972. Reconstitution of Qß Replicase Lacking Subunit a with Protein-Synthesis-Interference Factor i. Eur. J. Biochem. 31: 44-51.

94. Kamen, R.I. 1975. Structure and function of the Qß RNA replicase. RNA Phages: 203-234.

95. Kamer, G., Argos, P. 1984. Primary structural comparison of RNA-dependent polymerases from plant, animal and bacterial viruses. Nucleic Acids Res. 12: 7269-7282.

96. Kao, C.C., Del Vecchio, A.M., Zhong, W. 1999. De novo initiation of RNA synthesis by a recombinant flaviviridae RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 253: 1-7.

97. Kao, C.C., Singh, P., Ecker, D.J. 2001. De novo initiation of viral RNA-dependent RNA synthesis. Virology. 287: 251-260.

98. Kao, C.C., Sun, J.H. 1996. Initiation of minus-strand RNA synthesis by the brome mosaic virus RNA-dependent RNA polymerase: use of oligoribonucleotide primers. J. Virol. 70: 6826-6830.

99. Kao, C.C., Yang, X., Kline, A., Wang, Q.M., Barket, D., Heinz, B.A. 2000. Template requirements for RNA synthesis by a recombinant hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase. J. Virol. 74: 11121-11128.

100. Kashiwagi, A., Sugawara, R., Sano Tsushima, F., Kumagai, T., Yomo, T. 2014. Contribution of silent mutations to thermal adaptation of RNA bacteriophage Qß. J. Virol. 88: 11459-11468.

101. Kawakami, K., Ishihama, A., Ohtsuka, E., Tanaka, T., Takashima, H., Ikehara, M. 1981. RNA polymerase of influenza virus. II. Influence of oligonucleotide chain length on the priming activity of RNA synthesis by virion-associated RNA polymerase. J. Biochem. 89: 1759-1768.

102. Kawashima, T., Berthet-Colominas, C., Wulff, M., Cusack, S., Leberman, R. 1996. The structure of the Escherichia coli EF-TuEF-Ts complex at 2.5 Ä resolution. Nature. 379: 511-518.

103. Kettani, A., Kumar, R.A., Patel, D.J. 1995. Solution structure of a DNA quadruplex containing the fragile X syndrome triplet repeat. J. Mol. Biol. 254: 638-656.

104. Khromykh, A.A., Meka, H., Guyatt, K.J., Westaway E.G. 2001. Essential role of cyclization sequences in flavivirus RNA replication. J. Virol. 75: 6719-6728.

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

Kidmose, R.T., Vasiliev, N.N., Chetverin, A.B., Knudsen, C R. 2010. Structure of the Qß replicase, an RNA-dependent RNA polymerase consisting of viral and host proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107: 10884-10889.

Kimura, M., Foulaki, K., Subramanian, A.R., Wittmann-Liebold, B. 1982. Primary structure of Escherichia coli ribosomal protein S1 and features of its functional domains. Eur. J. Biochem. 123: 37-53.

Kita, H., Cho, J., Matsuura, T., Nakaishi, T., Taniguchi, I., Ichikawa, T., Shima, Y., Urabe, I., Yomo, T. 2006. Functional Qß replicase genetically fusing essential subunits EF-Ts and EF-Tu with ß-subunit. J. Biosci. Bioeng. 101: 421-426.

Kolb, A., Hermoso, J.M., Thomas, J.O., Szer, W. 1977. Nucleic acid helix-unwinding properties of ribosomal protein S1 and the role of S1 in mRNA binding to ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 2379-2383.

Konarska, M.M., Sharp, P.A. 1989. Replication of RNA by the DNA-dependent RNA polymerase of phage T7. Cell. 57: 423-431.

Konarska, M.M., Sharp, P.A. 1990. Structure of RNAs replicated by the DNA-dependent T7 RNA polymerase. Cell. 63: 609-618.

Kondo, M., Gallerani, R., Weissmann, C. 1970. Subunit Structure of Qß Replicase. Nature 228: 525-527.

Kramer, F.R., Mills, D.R. 1978. RNA sequencing with radioactive chain-terminating ribonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 5334-5338.

Kuzmine, I., Gottlieb, P.A., Martin, C.T. 2001. Structure in nascent RNA leads to termination of slippage transcription by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 29:2 601-606. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

Landers, T.A., Blumenthal, T., Weber, K. 1974. Function and Structure in Ribonucleic Acid Phage Qß Ribonucleic Acid Replicase. The roles of the different subunits in transcription of synthetic templates. J. Biol. Chem. 249: 5801-5808.

Levisohn, R., Spiegelman, S. 1968. The cloning of a self-replicating RNA molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60: 866-872.

Li, X., Palese, P. 1994. Characterization of the polyadenylation signal of influenza virus RNA. J. Virol. 68: 1245-1249.

Lodeiro, M.F., Filomatori, C.V., Gamarnik, A.V. 2009. Structural and functional studies of the promoter element for dengue virus RNA replication. J. Virol. 83: 993-1008. Lorenz, R., Bernhart, S.H., Höner zu Siederdissen, C., Tafer, H., Flamm, C., Stadler, P.F., Hofacker, I L. 2011. Vienna RNA package 2.0. Algorithms Mol Biol. 6: 26.

103

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

Lund, P.E., Chatterjee, S., Daher, M., Walter, N.G. 2020. Protein unties the pseudoknot: S1-mediated unfolding of RNA higher order structure. Nucleic. Acids. Res. 48: 2107-2125. Macaya, R.F., Schultze, P., Smith, F.W., Roe, J A, Feigon, J. 1993. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3745-3749.

Makeyev, E.V., Bamford, D.H. 2000. The polymerase subunit of a dsRNA virus plays a central role in the regulation of viral RNA metabolism. EMBO J. 19: 6275-6284. Makeyev, E.V., Bamford, D.H. 2001. Primer-independent RNA sequencing with bacteriophage 96 RNA polymerase and chain terminators. RNA. 7: 774-781

Malet, H., Williams, H.M., Cusack, S., Rosenthal, M. 2023. The mechanism of genome replication and transcription in bunyaviruses. PLoS Pathog. 19: e1011060.

Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Martin, C.T., Coleman, J.E. 1989. T7 RNA polymerase does not interact with the 5'-phosphate of the initiating nucleotide. Biochemistry. 282: 2760-2762.

McGeoch, D., Kitron, N. 1975. Influenza virion RNA-dependent RNA polymerase: stimulation by guanosine and related compounds. J. Virol. 15: 686-695.

Miller, D.L., Weissbach, H. 1970. Studies on the purification and properties of factor Tu from E. coli. Arch Biochem Biophys. 141: 26 -37.

Milligan, J.F., Groebe, D.R., Witherell, G.W., Uhlenbeck, O.C. 1987. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res. 15: 87838798.

Mills, D.R., Dobkin, C., Kramer, F.R. 1978. Template-determined, variable rate of RNA chain elongation. Cell. 15: 541-550.

Mills, D.R., Kramer, F.R., Spiegelman, S. 1973. Complete nucleotide sequence of a replicating RNA molecule. Science. 180: 916-927.

Mills, D.R., Priano, C., DiMauro, P., Binderow, B.D. 1989. Qß replicase: mapping the functional domains of an RNA-dependent RNA polymerase. J. Mol. Biol. 205: 751-764. Moody, M.D., Burg, J.L., DiFrancesco, R., Lovern, D., Stanick, W., Lin-Goerke, J., Mahdavi, K., Wu, Y., Farrell, MP. 1994. Evolution of host cell RNA into efficient template RNA by Qß replicase: the origin of RNA in untemplated reactions. Biochemistry 33: 13836-13847. Munishkin, A.V., Voronin, L.A., Chetverin, A.B. 1988. An in vivo recombinant RNA capable of autocatalytic synthesis by Qß replicase. Nature 333: 473-475.

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

Munishkin, A.V., Voronin, L.A., Ugarov, V.I., Bondareva, L.A., Chetverina, H.V., Chetverin, A.B. 1991. Efficient templates for Qß replicase are formed by recombination from heterologous sequences. J. Mol. Biol. 221: 463-472.

Nathans, D., Notani, G., Schwartz, J.H., Zinder, N.D. 1962. Biosynthesis of the coat protein of coliphage f2 by E. coli extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48: 1424-1431. Nevskaya, N., Tishchenko, S., Gabdoulkhakov, A., Nikonova, E., Nikonov, O., Nikulin, A., Platonova, O., Garber, M., Nikonov, S., Piendl, W. 2005. Ribosomal protein L1 recognizes the same specific structural motif in its target sites on the autoregulatory mRNA and 23S rRNA. Nucleic. Acids. Res. 33: 478-485.

Nishihara, T., Mills, D.R., Kramer, F.R. 1983. Localization of the Qß replicase recognition site in MDV-1 RNA. J. Biochem. 93: 669-674.

Ojala, P.M., Bamford, D.H. 1995. In vitro transcription of the double-stranded RNA bacteriophage 96 is influenced by purine NTPs and calcium. Virology. 207: 400-408. Osawa, T., Aoki, M., Ehara, H., Sekine, S.I. 2023. Structures of dengue virus RNA replicase complexes. Mol. Cell. 83: 2781-2791.e4.

Pace, N.R., Spiegelman, S. 1966. In vitro synthesis of an infectious mutant RNA with a normal RNA replicase. Science 153: 64-67.

Paul, A.V., Rieder, E., Kim, D.W., van Boom, J.H., Wimmer, E. 2000. Identification of an RNA hairpin in poliovirus RNA that serves as the primary template in the in vitro uridylylation of VPg. J. Virol. 74: 10359-10370.

Paul, A.V., Wimmer, E. 2015. Initiation of protein-primed picornavirus RNA synthesis. Virus Res. 206: 12-26.

Peersen, O.B. 2017. Picornaviral polymerase structure, function, and fidelity modulation. Virus Res. 234: 4-20.

Pflug, A., Guilligay, D., Reich, S., Cusack, S. 2014. Structure of influenza A polymerase bound to the viral RNA promoter. Nature. 516: 355-360.

Place, C., Oddos, J., Buc, H., McAllister, W.T., Buckle, M. 1999. Studies of contacts between T7 RNA polymerase and its promoter reveal features in common with multisubunit RNA polymerases. Biochemistry. 38: 4948-4957.

Plotch, S.J., Bouloy, M., Krug, R.M. 1979. Transfer of 5'-terminal cap of globin mRNA to influenza viral complementary RNA during transcription in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76: 1618-1622.

Plotch, S.J., Krug, R.M. 1977. Influenza virion transcriptase: synthesis in vitro of large, poly-adenylic acid-containing complementary RNA. J. Virol. 21: 24-34.

149. Poon, L.L.M., Pritlove, D.C., Fodor, E., Brownlee, G.G. 1999. Direct evidence that the poly(A) tail of influenza A virus mRNA is synthesized by reiterative copying of a U track in the virion RNA template. J. Virol. 73: 3473-3476.

150. Poranen, M.M., Bamford, D.H. 2012. Assembly of large icosahedral double-stranded RNA viruses. Adv. Exp. Med. Biol. 726: 379-402.

151. Poranen, M.M., Salgado, P.S., Koivunen, M.R., Wright, S., Bamford, D.H., Stuart, D.I., Grimes, J.M. 2008. Structural explanation for the role of Mn2+ in the activity of 96 RNA-dependent RNA polymerase. Nucleic. Acids. Res. 36: 6633-6644.

152. Priano, C., Kramer, F.R., Mills, D.R. 1987. Evolution of the RNA coliphages: the role of secondary structures during RNA replication. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52: 321330.

153. Pritlove, D C., Poon, L.L.M., Devenish, L.J., Leahy, M.B., Brownlee, G.G. 1999. A hairpin loop at the 5' end of influenza A virus virion RNA is required for synthesis of poly(A)+ mRNA in vitro. J. Virol. 73: 2109-2114.

154. Pritlove, D C., Poon, L.L.M., Fodor, E., Sharps, J., Brownlee, G.G. 1998. Polyadenylation of influenza virus mRNA transcribed in vitro from model virion RNA templates: Requirement for 5' conserved sequences. J. Virol. 72: 1280-1286.

155. Puglisi, J.D., Tinoco, I., Jr. 1989. Absorbance melting curves of RNA. Methods Enzymol. 180: 304-325.

156. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H.F., Bustamante, C., Tinoco, I.Jr. 2012. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109: 1445814463.

157. Rensing, U., August, J.T. 1969. The 3'-terminus and the replication of phage RNA. Nature. 224: 853-856.

158. Rich, A., RajBhandary, U.L. 1976. Transfer RNA: molecular structure, sequence, and properties. Annu. Rev. Biochem. 45: 805-860.

159. Ringquist, S., Jones, T., Snyder, E.E., Gibson, T., Boni, I., Gold, L. 1995. High-affinity RNA ligands to Escherichia coli ribosomes and ribosomal protein S1: comparison of natural and unnatural binding sites. Biochemistry. 34: 3640-3648.

160. Robertson, H.D. 1975. Functions of replicating RNA in cells infected by RNA bacteriophages. In: RNA Phages. Ed. Zinder N.D. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, pp. 113-145.

161. Rodriguez-Wells, V., Plotch, S.J., DeStefano, J.J. 2001. Primer-dependent synthesis by poliovirus RNA-dependent RNA polymerase (3Dpo1). Nucleic Acids Res. 29: 2715-2724.

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

Rohde, N., Daum, H., Biebricher, C.K. 1995. The mutant distribution of an RNA species replicated by Qß replicase. J. Mol. Biol. 249: 754-762.

Salah, P., Bisaglia, M., Aliprandi, P., Uzan, M., Sizun, C., Bontems, F. 2009. Probing the relationship between Gram-negative and Gram-positive S1 proteins by sequence analysis. Nucleic Acids Res. 37: 5578-5588.

Salgado, P.S., Makeyev, E.V., Butcher, S.J., Bamford, D.H., Stuart, D.I., Grimes, J.M. 2004. The structural basis for RNA specificity and Ca2+ inhibition of an RNA-dependent RNA polymerase. Structure. 12: 307-316.

Schäffner, W., Rüegg, K.J., Weissmann, C. 1977. Nanovariant RNAs: nucleotide sequence and interaction with bacteriophage Qß replicase. J. Mol. Biol. 117: 877-907. Schnier, J., Kimura, M., Foulaki, K., Subramanian, A.R., Isono, K., Wittmann-Liebold, B. 1982. Primary structure of Escherichia coli ribosomal protein S1 and of its gene rpsA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 1008-1011.

Schultze, P., Macaya, R.F, Feigon, J. 1994. Three-dimensional solution structure of the throm-

bin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG). J. Mol. Biol. 235: 1532-1547.

Seela, F., Tran-Thi, Q.H., Franzen, D. 1982. Poly(7-deazaguanylic acid), the homopolynu-

cleotide of the parent nucleoside of queuosine. Biochemistry. 21: 4338-4343.

Shao, X., Zhang, W., Umar, M.I., Wong, H.Y., Seng, Z., Xie, Y., Zhang, Y., Yang, L., Kwok,

C.K., Deng, X. 2020. RNA G-quadruplex structures mediate gene regulation in bacteria. mBio.

11: e02926-19.

Shaw, M.W., Lamb, R.A. 1984. A specific sub-set of host-cell mRNAs prime influenza virus mRNA synthesis. Virus Res.1: 455-467.

Shim, J.H., Larson, G., Wu, J.Z., Hong, Z. 2002. Selection of 3'-template bases and initiating nucleotides by hepatitis C virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase. J. Virol. 76: 70307039.

Sousa, R., Chung, Y.J., Rose, J.P., Wang, B.C. 1993. Crystal structure of bacteriophage T7 RNA polymerase at 3.3 Ä resolution. Nature. 364: 593-599.

Sousa, R., Mukherjee, S. 2003. T7 RNA polymerase. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 73:1-41.

Spiegelman, S., Haruna, I., Holland, I.B., Beaudreau, G., Mills, D. 1965. The synthesis of a self-propagating and infectious nucleic acid with a purified enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 54:919-927.

Spiegelman, S., Pace, N.R., Mills, D.R., Levisohn, R., Eikhom, T.S., Taylor, M.M., Peterson, R.L., Bishop, D.H. 1968. The mechanism of RNA replication. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 33: 101-124.

176

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

Steitz, TA. 1998. A mechanism for all polymerases. Nature 391: 231-232.

Steitz, T.A. 2009. The structural changes of T7 RNA polymerase from transcription initiation

to elongation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 683-690.

Studier, F.W. 2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41: 207-234.

Subramanian, A.R. 1983. Structure and functions of ribosomal protein S1. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 28: 101-142.

Sumper, M., Luce, R. 1975. Evidence for de novo production of self-replicating and environmentally adapted RNA structures by bacteriophage Qß replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 162-166.

Tabor, S., Richardson, C.C. 1985. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 1074-1078. Takeshita, D., Tomita, K. 2010. Assembly of Qß viral RNA polymerase with host translational elongation factors EF-Tu and -Ts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107: 15733-15738. Takeshita, D., Tomita, K. 2012. Molecular basis for RNA polymerization by Qß replicase. Nat. Struct. Mol. Biol. 19: 229-237.

Takeshita, D., Yamashita, S., Tomita, K. 2012. Mechanism for template-independent terminal adenylation activity of Qß replicase. Structure. 20: 1661-1669.

Takeshita, D., Yamashita, S., Tomita, K. 2014. Molecular insights into replication initiation by Qß replicase using ribosomal protein S1. Nucleic Acids Res. 42: 10809-10822. Tomescu, A.I., Robb, N.C., Hengrung, N., Fodor, E., Kapanidis, A.N. 2014. Single-molecule FRET reveals a corkscrew RNA structure for the polymerase-bound influenza virus promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111: E3335-E3342.

Ugarov, V.I., Chetverin, A.B. 2008. Functional circularity of legitimate Qß replicase templates. J. Mol. Biol. 379: 414-427.

Ugarov, V.I., Demidenko, A.A., Chetverin, A.B. 2003. Qß Replicase Discriminates between Legitimate and Illegitimate Templates by Having Different Mechanisms of Initiation. J. Biol. Chem. 278: 44139-44146.

Ugarov, V.I., Samatov, T.R., Chetverina, H.V., Chetverin, A.B. 1999. Plasmid purification using hot Mg2+ treatment and no RNase. BioTechniques 26: 194-196, 198. Van Duin, J., Tsareva, N. 2006. Single-stranded RNA phages. In Calendar R (ed), The bacteriophages. Oxford University Press. P. 175- 196.

Vasilyev, N., Serganov, A. 2016. Preparation of short 5'-triphosphorylated oligoribonucleotides for crystallographic and biochemical studies. Methods. Mol. Biol. 1320: 11-20.

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

Vasilyev, N.N., Kutlubaeva, Z.S., Ugarov, V.I., Chetverina, H.V., Chetverin, A.B. 2013. Ribo-somal protein S1 functions as a termination factor in RNA synthesis by Qß phage replicase. Nat. Commun. 4: 1781.

Vournakis, J.N., Carmichael, G.G., Efstratiadis, A. 1976. Synthesis of RNA complementary to rabbit globin mRNA by Qß replicase. Biochem. Biophys. Res. Commun.70: 774-782. Wahba, A.J., Miller, M.J., Niveleau, A., Landers, T.A., Carmichael, G.G., Weber, K., Hawley, D.A., Slobin, L.I. 1974. Subunit I of Qß Replicase and 30 S Ribosomal Protein S1 of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 249: 3314 -3316.

Wandzik, J.M., Kouba, T., Karuppasamy, M., Pflug, A., Drncova, P., Provaznik, J., Azevedo, N., Cusack, S. 2020. A structure-based model for the complete transcription cycle of influenza polymerase. Cell. 181: 877-893.e21.

Watanabe, I. 1964. Persistent infection with an RNA bacteriophage. Nihon. Rinsho. 22: 243251.

Weber, H., Weissmann, C. 1970. The 3'-termini of bacteriophage Qß plus and minus strands. J. Mol. Biol. 51: 215-224.

Weissmann, C., Feix, G., Slor, H. 1968. In vitro synthesis of phage RNA: the nature of the intermediates. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 33: 83-100.

Wengler, G., Wengler, G., Gross, H.J. 1978. Studies on virus-specific nucleic acids synthesized in vertebrate and mosquito cells infected with flaviviruses. Virology. 89: 423-437. Wittinghofer, A., Leberman, R. 1976. Elongation factor T from Bacillus stearothermophilus and Escherichia coli. Purification and some properties of EF-Tu and EF-Ts from Bacillus stearothermophilus. Eur. J. Biochem. 62: 373-82.

Wlodzimierz, S., Hermoso, J.M., Boublik, M. 1976. Destabilization of the secondary structure of RNA by ribosomal protein S1 from Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 70: 957-964.

Wright, S., Poranen, M.M., Bamford, D.H., Stuart, D.I., Grimes, J.M. 2012. Noncatalytic ions direct the RNA-dependent RNA polymerase of bacterial double-stranded RNA virus ^6 from de novo initiation to elongation. J. Virol. 86: 2837-2849.

Young, R.A., Blumenthal, T. 1975. Phage Qß ribonucleic acid replicase. Subunit relationships determined by intramolecular cross-linking. J. Biol. Chem. 250: 1829-1832. Yu, L., Nomaguchi, M., Padmanabhan, R., Markoff, L. 2008. Specific requirements for elements of the 5' and 3' terminal regions in flavivirus RNA synthesis and viral replication. Virology. 374:170-185.

Zhang, N., Gorin, A., Majumdar, A., Kettani, A., Chernichenko, N., Skripkin, E., Patel, D.J.

2001. Dimeric DNA quadruplex containing major groove-aligned A-T-A-T and G-C-G-C tet-

109

rads stabilized by inter-subunit Watson-Crick A-T and G-C pairs. J. Mol. Biol. 312: 10731088.

206. Zhong, W., Uss, A.S., Ferrari, E., Lau, J.Y.N., Hong, Z. 2000. De Novo Initiation of RNA Synthesis by Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 5B Polymerase. J. Virol. 74: 2017-2022.