Структура полноразмерного L1-выступа бактериальной рибосомы. Влияние изменений поверхности контакта рибосомного белка L1 Thermus thermophilus с РНК на его РНК-связывающие свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Сарских, Алена Витальевна

• Сарских, Алена Витальевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Сарских, Алена Витальевна

СОДЕРЖАНИЕ

Содержание

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1.1 Кристаллизация рибосом и их субчастиц, кристаллографические исследования и определение структур

1.2 Малая рибосомная субчастица рибосомы

1.2.1 Структурные и функциональные особенности малой субчастицы

1.2.2 Декодирующий центр

1.2.3 Морфологические элементы малой субчастицы

1.2.4 Структура 3 0S субчастицы в комплексе с антибиотиками

1.3 Большая рибосомная субчастица

1.3.1 Структура и функциональные центры большой субчастицы рибосомы

1.3.2 Структура РНК большой рибосомной субчастицы

1.3.3 Пептидилтрансферазный центр

1.3.4 ПТЦ - проторибосома

1.3.5 Центр, ассоциированный с ГТФазной активностью (ГАЦ)

1.3.6 Белки большой субчастицы

1.3.7 Структура 50S субчастицы в комплексе с антибиотиками

1.4 Структура 70S рибосомы

1.4.1 Межсубъединичные мостики

1.5 Элонгационный цикл и функциональные центры рибосомы

1.5.1 тРНК-связывающие сайты

1.5.1.1 А-сайт

1.5.1.2 Р-сайт

1.5.1.3 Е-сайт

1.5.2 Инициация

1.5.3 Элонгация и декодирующий центр

1.5.4 Формирование пептидной связи

1.5.5 Транслокация

1.5.6 Терминация

1.5.7 Рибосома - молекулярная машина

1.6 Рибосомный белок LI как составная часть Ll-выступа и регулятор синтеза белков своего оперона

1.6.1 Белок LI, как составная часть Ll-выступа

1.6.2 Белок LI - репрессор, ингибирующий трансляцию мРНК своего оперона

Материалы и методы

2.1 Материалы

2.1.1 Химические реактивы и ферменты

2.1.2 Буферы

2.1.3 Среды

2.1.4 Бактериальные штаммы и плазмиды

2.1.5 Приборы

2.2 Методы

2.2.1 Методы генной инженерии и микробиологии

2.2.1.1 Полимеразная цепная реакция

2.2.1.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.2.1.3 Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами

2.2.1.4 Очистка фрагментов ДНК

2.2.1.5 Лигирование ДНК

2.2.1.6 Получение компетентных клеток

2.2.1.7 Трансформация клеток Е. coli

2.2.1.8 ПЦР-анализ клонов

2.2.1.9 Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.2.1.10 Рестрикция плазмидной ДНК для транскрипции и ее последующая очистка

2.2.1.11 Экспрессия генов белка L1 и его мутантных форм в клетках Е. coli

2.2.2 Выделение и очистка белков

2.2.2.1 Выделение белка L1 из клеток Е. coli

2.2.2.2 Катионообменная хроматография на смоле CM-Sepharose

2.2.2.3 Аффинная хроматография на смоле Heparin- Sepharose

2.2.2.4 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН

2.2.2.5 Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях

2.2.2.6 Проверка наличия/отсутствия РНКазной активности в полученном препарате белка

2.2.3 Выделение и очистка РНК

2.2.3.1 Получение специфических фрагментов рРНК

2.2.3.2 Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях

2.2.3.3 Электрофорез нуклеиновых кислот в ПААГ в неденатурирующих условиях

2.2.4 Получение и кристаллизация мутантных форм белка L1 и РНК-белкового комплекса

2.2.5 Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса

2.2.5.1 Биотинилирование фрагментов РНК

2.2.5.2 Модификация поверхности чипа

2.2.5.3 Определение констант ассоциации и диссоциации методом поверхностного плазмонного резонанса

Результаты и их обсуждение

3.1 Пространственная структура изолированного полноразмерного Ы-выступа рибосомы

3.1.1 Получение и кристаллизация комплекса TthLl-pPHK

3.1.1.1 Клонирование гена специфического фрагмента рРНК

3.1.1.2 Получение фрагмента рРНК

4

3.1.1.3 Выделение и очистка рибосомного белка L1

3.1.1.4 Электрофоретический анализ комплексов белка L1 с фрагментами рРНК

3.1.1.5 Кристаллизация полноразмерного Ll-выступа

3.1.2 Анализ структуры комплекса TthLl-pPHK

3.1.2.1 Структура фрагмента 23S рРНК

3.1.2.2 Взаимодействие белка L1 и рРНК в полноразмерном L1-выступе рибосомы

3.1.2.3 Вероятная роль спирали Н78 23S рРНК и домена II рибосомного белка L1 в функционировании рибосомы

3.1.2.4 Кинетический анализ комплексов белка L1 с фрагментами рРНК

3.1.2.5 Влияние неконсервативных взаимодействий на сродство L1 к РНК

3.2 Структурно-кинетические исследования влияния замен консервативного Thr217 на РНК-связывающие свойства белка и его структуру, как в свободном состоянии, так и в комплексе с РНК

3.2.1 Кинетический анализ взаимодействий мутантных форм белка L1 со специфическим фрагментм РНК

3.2.2 Кристаллизация белка TthLl с заменой Thr217Val иего комплекса с РНК

3.2.3 Анализ структур TthLl Thr217V и TthLl Thr217V-pPHK

3.2.4 Кристаллизация TthL 1 с заменой Thr217Ala в комплексе с РНК

3.2.5 Анализ структуры TthLl Thr217Ala-pPHK

3.3 Роль N-копцевой спирали al TthLl во взаимодействии белка с РНК

3.4. Влияние С-концевых положительно заряженных аминокислотных остатков архейного белка L1 на взаимодействие белка с РНК

3.4 Влияние электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 с РНК

ВЫВОДЫ:

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

мРНК -матричная РНК

тРНК - транспортная РНК

тыс. об/мин - тысяч оборотов в минуту;

нт - нуклеотиды;

ДТТ - дитиотриэтол;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

МБА - метиленбисакриламид;

PMSF - фенилметилсульфонилфлуорид (бензилсульфонилфлуорид);

TEMED - М,Н,К',М',-тетраметилэтилендиамин;

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан;

ИПТГ - изопропил-тио-р-Б-галактозид;

ДСН- додецилсульфат натрия;

ЭДТА — этилендиаминтетраацетат;

CM-sepharose - катионобменная хроматографическая смола карбоксиметил-сефароза; ДЕАЕ-sepharose - анионообменная хроматографическая смола диэтиламиноэтил-сефароза;

SacLl — рибосомный белок LI Sulfolobus acidocaldarius;

TthLl - рибосомный белок LI Thermus thermophilus',

MjaLl — рибосомный белок LI Methanococcus jannaschii',

MthLl-рибосомный белок LI Methanococcus thermolitotrophicus;

H76 -спираль 76 23S pPHK, далее по аналогии для всех спиралей 23 S рРНК;

h44 - спираль 44 16S рРНК, далее по аналогии для всех спиралей 16 S рРНК.

ПТЦ - пептидилтрансферазный центр.

Микроорганизмы

Е. coli — Escherichia coli; М. jannaschii—Methanococcus jannaschii; M. vannielii - Methanococcus vannielii; S. acidocaldarius - Sulfolobus acidocaldarius; T. thermophilus — Thermus thermophilus.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура полноразмерного L1-выступа бактериальной рибосомы. Влияние изменений поверхности контакта рибосомного белка L1 Thermus thermophilus с РНК на его РНК-связывающие свойства»

ВВЕДЕНИЕ

Рибосома - это универсальная клеточная органелла, функция которой заключается в синтезе белков, в соответствии с генетической информацией, закодированной в матричной РНК. Изучение рибосомы ведется уже несколько десятилетий, однако существенный прогресс в понимании механизма ее действия и детальной организации произошел в 90-е годы XX века. С помощью методов криоэлектронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа были получены модели структур рибосомы в комплексе с тРНК, мРНК и различными факторами трансляции, а также структуры изолированных субчастиц. В 2009 году А. Йонат, В. Рамакришнану и Т. Стейтцу была вручена Нобелевская премия по химии за достижения в исследовании структуры и функций рибосомы.

Несмотря на определение структуры рибосомы, исследование детальной структуры ее отдельных подвижных функционально важных элементов и тщательный анализ рибосомных РНК-белковых взаимодействий не утратили своей актуальности и в настоящее время.

Одним из наиболее подвижных элементов рибосомы является L1-выступ, его мобильность в процессе функционирования рибосомы затрудняет определение структуры. Подвижность L1-выступа важна для высвобождения деацилированной тРНК из Е-сайта в процессе трансляции.

В 2009 году в группе Рамакришнана была определена структура рибосомы из Thermus thermophilus в комплексе с фактором элонгации EF-G с разрешением 3,6 А, в которой структуры мобильных элементов более упорядочены. Тем не менее, довольно низкое разрешение данной структуры не позволило детально проанализировать взаимодействие рибосомного белка L1 с рРНК.

Компонентами L1-выступа являются двухдоменный рибосомный белок L1 и спирали Н76, Н77 и Н78 23 S рРНК. В лаборатории структурных исследований аппарата трансляции, Института Белка в течение длительного времени ведутся работы по исследованию РНК-связывающих свойств рибосомного белка L1. Определены структуры бактериального и архейного белка L1 как в свободном виде, так и в комплексе со специфическими фрагментами РНК. Кроме структурной роли в рибосоме, белок L1 выполняет функцию регулятора синтеза белков LI 1 оперона Escherichia coli и L1 оперона у некоторых архей.

Целью данной работы является определение структуры полноразмерного изолированного Ll-выступа рибосомы Т. thermophilus с атомным разрешением,

7

углубленное исследование РНК-белковых взаимодействий в изолированном Ы -выступе бактериальной рибосомы, изучение роли отдельных структурных элементов белка во взаимодействии с РНК, а также определение структурной основы регуляторных свойств рибосомного белка Ы.

Основные экспериментальные задачи:

1) Получение 80-нуклеотидного специфического фрагмента 23Б рРНК ТЪегтш ЖегторНИш, содержащего спирали Н76, Н77 и Н78, для структурных и кинетических исследований.

2) Получение пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов рибосомного белка Ы Т. ЛегторкНш и его мутантных форм в комплексе с данным специфическим фрагментом рРНК.

3) Кинетический анализ взаимодействия ТШЫ и его мутантных форм со специфическим фрагментом рРНК.

4) Исследование влияния электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка Ы с РНК.

В рамках данной работы были получены кристаллы и определена с высоким разрешением (2 А) структура полноразмерного изолированного Ы-выступа из термофильной бактерии Т. ЖегторМЫз. Показано наличие в рибосомном комплексе, по сравнению с комплексом ТЧЫЛ-мРНК, двух дополнительных участков РНК-белкового взаимодействия. Один участок образован аминокислотными остатками спирали а1 домена I, а второй - петлями а5-р6 домена II НЫЛ. Структурные элементы, образующие дополнительные участки Ь1-связывания на рРНК (спираль Н78 и петля В), отсутствуют в структуре мРНК, что обусловливает меньшее сродство белка Ы к мРНК и, соответственно, его регуляторные свойства. Наличие спирали а1 в белке "ПЫЛтакже увеличивает дискриминацию между мРНК и рРНК за связывание с белком, повышая его регуляторные способности.

Для детального исследования РНК-белковых взаимодействий в Ы-РНК комплексе были получены кристаллы и определены структуры нескольких мутантных форм белка ТЛЫ как в изолированном состоянии, так и в комплексе с тем же фрагментом 23Б рРНК Т. Агегторкйт, что использовался при кристаллизации комплекса с белком дикого типа. Показано, что, несмотря на изменения в структуре белков ТЧЫЛ с мутациями в участке связывания, комплементарность поверхностей РНК и белка и их взаимное положение в комплексе полностью сохраняется.

Полученные в данной работе результаты вносят существенный вклад в понимание особенностей структурной организации рибосомы и дают возможность выявить детали и принципы специфического РНК-белкового взаимодействия.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Впервые рибосомы были обнаружены около 60 лет назад биологом Дж. Паладе (Palade, G. Е., 1955), и охарактеризованы как плотные, обогащенные РНК частицы, ассоциированные с эндоплазматическим ретикулумом. В 1958 году Робертсом был предложен термин «рибосома» (Roberts, R. В., 1958).

Рибосомы состоят из РНК, составляющей 2/3 их массы (за исключением митохондриальных рибосом), и различных рибосомных белков. Они образованы двумя рибосомными субчастицами, малой и большой, которые ассоциируют при инициации белкового синтеза и диссоциируют при окончании процесса. У прокариот малая субчастица имеет коэффициент седиментации 30S, большая - 50S. Ассоциация двух субъединиц образует каталитически активную рибосому, которая седиментирует как 70S частица. Большая субчастица играет ключевую роль в формировании пептидной связи, а малая - в процессе инициации трансляции и декодировании генетической информации. Каждая субъединица имеет 3 сайта для связывания тРНК: А-сайт (аминоацил-тРНК), Р-сайт (пептидил-тРНК) и Е-сайт, который содержит деацилированную тРНК.

1.1 Кристаллизация рибосом и их субчастиц, кристаллографические

исследования и определение структур

Работа по кристаллизации рибосом и их субчастиц была начата более трех десятилетий назад. Рибосома считалась плохо кристаллизуемым объектом из-за внутренней неупорядоченности и подвижности ее отдельных элементов, функциональной гетерогенности и сложного химического состава.

Первые трехмерные микрокристаллы рибосом были получены в начале 80-х годов. Для кристаллизации были выбраны рибосомы бактерий и архей, которые обитают в экстремальных условиях окружающей среды (высокая концентрация соли, высокая температура). В 1980 году А. Йонат (Институт Вейцмана, Израиль), Виттману (Институт Макса Планка, Германия) и сотрудникам удалось получить первые кристаллы большой рибосомной субчастицы умеренно термофильной бактерии Bacillus stearothermophilus (Bst50S) (Yonath, et al., 1980), a позднее - кристаллы 50S рибосомной субчастицы галофильной археи Halobacterium marismortui (Hma50S) (Makowski et al., 1987). Первые кристаллы 30S субчастиц (Tth30S) и рибосом из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilus (Tth70S) были получены в лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Института белка (Trakhanov et al., 1987; Yusupov et al., 1987; Trakhanov et al., 1989) и в лаборатории Йонат (Yonath et al., 1988).

Несмотря на большой размер кристаллов рибосом и их субчастиц (до 2 мм длиной у Bst50S) (Yonath et al., 1983; Yonath et al., 1986; Hansen et al., 1989; von Bohlen et al., 1991), они довольно плохо отражали рентгеновские лучи. Кроме того, мощности существующих генераторов не хватало для получения удовлетворительной дифракционной картины. Когда стало доступным использование синхротронного излучения высокой интенсивности, сильное радиационное воздействие на кристаллы рибосом стало причиной их быстрого разрушения при съемке. Для решения этой проблемы был применен новаторский подход набора данных с охлажденных до температуры жидкого азота кристаллов, что позволило значительно улучшить дифракционную картину.

Другой подход заключался в использовании ионов металлов при кристаллизации или посткристаллизационной обработке рибосом и их субчастиц. Добавление небольшого количества ионов металлов (Cd2+) при кристаллизации Hma50S позволило улучшить предел разрешения кристаллов с 6 до 2,8 А. Нестабильность 30S субчастиц долгое время была причиной низкого (10 А) разрешения кристаллов (Yonath et al., 1988; Trakhanov et al., 1989). Получение тяжелоатомных производных с кристаллов Tth30S с помощью вымачивания их в растворе соединения, содержащего 18 атомов вольфрама, привело к повышению предела разрешения с 7-9 до 3,3 A (Schluenzen et al. 2000). Схожий результат был получен при использовании гексаминхлорида осмия (demons et al., 1999). По всей видимости, при связывании ионов тяжелых металлов с рРНК и/или белками происходило уменьшение подвижности некоторых элементов рибосомы.

Период конца 90-х годов - начала 2000-х отмечен получением первых структур рибосом и их субчастиц с достаточно высоким разрешением. При определении структур широко использовалось синхротронное излучение и метод многоволнового аномального рассеяния (MAD) с использованием солей лантаноидов, осмия и иридия. Таким образом, усовершенствование условий роста кристаллов и методов сбора данных привело к быстрому прогрессу в определении структуры рибосомы. Кристаллизация рибосом с лигандами (тРНК, мРНК и факторами трансляции) также позволила улучшить качество кристаллов (Yonath, 2009).

Первая модель структуры 50S субчастицы Н. marismortui с разрешением 9 A (Ban et al., 1998) была определена в 1998 году в группе Стейца, а уже год спустя было сделано уточнение структуры до 5 A (Ban et al., 1999). На картах электронной плотности с разрешением 9 А была четко видна лишь плотность, соответствующая 23 S рРНК. В модель были вписаны определенные ранее кристаллические структуры 10 рибосомных белков, сарцин-рициновой петли (СРП) 23 S РНК, участка РНК, связывающегося с белком L11 и фрагмента 5S рРНК. В уточненной модели структуры Hma50S с разрешением 5А

11

нанесены как крупные, легко узнаваемые структурные элементы большой субчастицы, так и отдельные фрагменты рРНК и белки. Кроме того, в рамках данной структуры, была предложена модель взаимодействия факторов трансляции с рибосомой.

В 2000 г. опубликована первая структура рибосомной субчастицы с высоким (2,4 А) разрешением (Ban et al., 2000). При этом разрешении удалось увидеть молекулы воды, металлов, модификации оснований рРНК. В группах Томаса Стейтца и Питера Мура была определена структура большой субчастицы в изолированном состоянии и в комплексе с аналогами 3'-концевой части тРНК (Ban et al., 2000; Nissen et al., 2000). В группе А. Йонат определена структура 50S субчастицы из мезофильного организма Deinococcus radiodurans (Dra50S) с разрешением 3,1 Ä (Harms et al., 2001).

В это же время в группе В. Рамакришнана была определена структура Tth30S с разрешением 5,5 А (Clemons et al., 1999), а в группе А. Йонат получена структура 30S субчастицы с разрешением 4,5 Ä (Tocilj et al., 1999).

Первые модели структуры малой субчастицы рибосомы позволили увидеть узнаваемую морфологию субчастицы, некоторые белки, а также обозначить область 16S рРНК, с которой связывается мРНК при формировании инициаторного комплекса. Год спустя были опубликованы структуры 30S субчастицы с высоким разрешением - 3,3 А (Schiuenzen et al., 2000) и 3 A (Wimberly et al., 2000, Clemons et al., 2001). Данные структуры содержали все упорядоченные области 16S рРНК и 20 рибосомных белков. Показано, что отсутствие белка S1 способствует получению упорядоченных кристаллов 30S субчастиц, отражающих рентгеновские лучи с высоким разрешением. Получение структур с атомным разрешением позволило суммировать биохимические и структурные данные и получить интересную информацию о структуре и функции 30S субчастицы.

В группе Г. Ноллера была определена структура 70S рибосомы Т. thermophilics (Tth70S) в комплексе с тРНК и мРНК с разрешением 7,8 А (Cate et al., 1999). Позднее была получена модель структуры 70S рибосомы, содержащей 3 молекулы тРНК и мРНК, с разрешением 5,5 А (Yusupov et al., 2001). В данной работе были также определены структурные свойства РНК-РНКовых и РНК-белковых мостиков, соединяющих субчастицы. В 2005 была представлена модель структуры рибосомы Е. coli без лигандов с разрешением 3,5 А (Schuwirth et al., 2005), которая значительно улучшила понимание взаимодействий внутри рибосомы и ее конформационной подвижности на молекулярном уровне. Следующим шагом было определение структуры рибосом Т. thermophilus и Е. coli с аналогом мРНК и двумя тРНК с разрешением 3,7 А и 2,8 А, соответственно (Korostelev et al., 2006; Selmer et al., 2006).

Структурные исследования рибосомы были направлены на понимание ключевых аспектов ее функционирования, таких как связывание тРНК, декодирование мРНК, формирование пептидной связи, связывание с антибиотиками. Были получены модели структуры 70S рибосомы с различными факторами трансляции (Gao et al., 2009; Schmeing et al., 2009), детально описан механизм формирования пептидной связи (Gindulyte et al., 2006), прояснен механизм выбора тРНК, соответствующей кодону мРНК в А-сайте (Ogle et al., 2001) и многое другое.

Рассмотрим более детально структуру рибосомы и ее субчастиц, а также некоторые аспекты механизма биосинтеза белка.

1.2 Малая рибосомная субчастица рибосомы

Малая субчастица прокариотической рибосомы имеет массу 0,85 мДа и состоит из 21-го белка и одной цепи РНК с коэффициентом седиментации 16S и длиной приблизительно 1500 нуклеотидов. 30S субчастица играет важную роль в декодировании генетической информации и участвует в инициации трансляции.

1.2.1 Структурные и функциональные особенности малой субчастицы

Форма 30S субчастицы была схожа с моделями, полученными методами электронной микроскопии (ЕМ) и реконструкции с помощью криоэлектронной микроскопии (криоЕМ). Форма субчастицы определяется, в основном, 16S рРНК.

В структуре 30S субчастицы традиционно выделяют несколько основных морфологических элементов: «головку», боковой выступ или «платформу» и «тело». Каждый из этих элементов образован отдельным доменом 16S рРНК (Woese et al., 1983) и связанными с ним рибосомными белками (Schluenzen et al., 2000; Wimberly et al., 2000; Schuwirth et al., 2005) (Рис. 1).

Вторичная структура 16S рРНК, которая содержит 45 спиралей, представлена на рисунке 1А. 5'-домен формирует «тело», центральный домен - «платформу», а 3'-концевой минорный домен - «головку» и «тело» в межсубъединичном пространстве. Четыре домена рибосомной РНК радиально расходятся от центральной точки, расположенной в области «шеи» субчастицы. В этой области РНК упакована наиболее плотно, поскольку она является очень важной для функционирования частью субчастицы (Wimberly et al., 2000). При рассмотрении трехмерной структуры 30S субчастицы видны три продольные спирали РНК (h44, h7 и hi6/17), идущие вдоль длинной оси субчастицы. Две из них h44 и hi6/17 расположены на относительно плоской поверхности, обращенной

к большой субчастице. Продольные спирали объединены между собой поперечными спиралями (ЗЫиепгеп ег а1, 2000).

Рис. 1. А. Модель вторичной структуры 16S рРНК T.thermophilus. Разными цветами отмечены 5'-концевой (синий), центральный (малиновый), 3'-концевой (зеленый) и малый 3'-концевой (оранжевый) домены 16S рРНК. Б. Модель пространственной структуры 30S субчастицы Т. thermophilics. Основные морфологические элементы 30S субчастицы окрашены в те же цвета, что и соответствующие им домены 16S рРНК на рисунке 1 А. Положение белков указано более темными цветами. Рисунок взят из работы (Wilson and Nierhaus, 2005).

1.2.2 Декодирующий центр

Центр декодирования 308 субчастицы расположен на верхней части тела и нижней части «головки» малой субчастицы. Наиболее известной частью центра декодирования является спираль Ь44, которая изгибается по направлению к «шее» ЗОБ субчастицы. Эта спираль формирует большую часть из межсубъединичных контактов в полной рибосоме, формирует А- и Р-сайты. Концевая часть спирали Ь45, расположенная между спиралями Ь44 и Ь24, ведет к подвижному 3'-концу 16Б рРНК, который содержит последовательность, комплементарную последовательности Шайно-Дальгарно мРНК

,тело

спираль 44

золовка

„платформа"

(Рис. 2). Структурные элементы декодирующего центра образуют между «головкой» и отелом» протяженный и искривленный канал, в котором находится мРНК. Матричная РНК должна попадать в этот канал через пору, образованную нековалентным взаимодействием между «телом» и «головкой» малой субчастицы. Стоит отметить, что в декодирующем центре, ни антикодоновые петли тРНК в А- и Р-сайтах, ни мРНК практически не контактируют с рибосомными белками.

Точность доставки правильной аминоацил-тРНК в А-сайт рибосомы определяется фактором EF-Tu и осуществляется, как минимум, в две стадии. На первом этапе формируются кодон-антикодоновые взаимодействия между тРНК и кодоном мРНК, расположенным в А-сайте рибосомы. Затем, в случае доставки тРНК с антикодоном, соответствующим кодону мРНК, происходит гидролиз ГТФ на факторе EF-Tu и освобождение последнего с рибосомы. Далее следует позиционирование акцепторного стебелька тРНК А-сайта в пептидилтрансферазном центре и формирование пептидной связи.

1.2.3 Морфологические элементы малой субчастицы

«Тело» 30S субчастицы имеет относительно компактную нижнюю часть («стопу») и более широкую и подвижную верхнюю часть, в которую входят «платформа», «плечо» и часть центра декодирования (Рис. 2). «Стопа» служит для контроля и ориентации основных элементов малой субчастицы в межсубъединичном пространстве. «Платформа» является частью Р-сайта и сдвигается при ассоциации субчастиц.

«Головка» содержит основную часть 3'-конца 16S рРНК (кроме спиралей h44 и h45). Эта часть взаимодействует с мРНК, фактором элонгации G (EF-G), тРНК и некоторыми антибиотиками. Белки стабилизируют укладку этой области 16S рРНК, которая содержит короткие спирали и несколько многоспиральных комплексов со сложной архитектурой.

«Головка» 30S субчастицы содержит наибольшее количество белков (S2, белковый кластер S3-S10-S14, S3, S7, S9, S10, S14, S13, S19), вероятно, для стабилизации третичной структуры РНК (Brodersen et al., 2002). В организации центрального домена малой субчастицы участвуют белки S8, S15, комплекс S6-S18, S11. По сравнению с «головкой» и «платформой», относительно немного белков связаны с большим 5'-доменом 16S рРНК — это S4, S5,S16, S17 и S20. Рядом с функциональным центром рибосомы, который содержит связывающие сайты тРНК и мРНК, находится кластер белков - S4, S5, S12. Белок S12 уникален, поскольку находится на интерфейсе 30S субчастицы и расположен очень близко к декодирующему центру. Высоко консервативные аминокислотные остатки

петли белка S12 стабилизируют основания 16S рРНК, которые вовлечены в кодон-антикодоновое узнавание (Ogle et al. ,2001). Кроме того, мутации в белке S12 приводят к устойчивости к стрептомицину.

Общие особенности белков малой субчастицы сходны с таковыми у большой субчастицы. Белки расположены на субчастице ассиметрично, многие из них состоят из расположенного на поверхности субчастицы глобулярного домена и длинной петли, проникающей вглубь массы рРНК, позволяющей одному белку контактировать с несколькими доменами рРНК. Поверхность, обращенная к 50S субчастице, практически не содержит белков, они также практически отсутствуют в важных для функционирования рибосомы элементах (Wimberly et al., 2000).

Элементы А-, Р- и Е-сайтов, определяемые в 30S субчастице состоят из рРНК, входящей в состав, как минимум, двух доменов. А-сайт значительно шире Р- и Е-сайтов, но менее глубокий. Его незначительная глубина может отражать необходимость вращения кодон-антикодоновой спирали во время или после гидролиза ГТФ на факторе элонгации Tu (EF-Tu). В отличие от А- и Р-сайтов, Е-сайт состоит в основном из белков (Shluenzen et al., 2000).

1.2.4 Структура 30S субчастицы в комплексе с антибиотиками

Анализ модели структуры малой субчастицы с антибиотиками (стрептомицином, паромомицином), уменьшающими точность трансляции, показал, что стрептомицин, связываясь с 30S субчастицей, увеличивает сродство А-сайта к тРНК, таким образом, повышая частоту связывания неверной тРНК и увеличивая частоту ошибок рибосомы. Паромомицин, типичный представитель ряда аминогликозидов, связывается со спиралью Ь44, которая является частью центра декодирования, также повышая сродство А-сайта к тРНК. Антибиотик спектиномицин, препятствующий транслокации, связывается со спиралью h34. При транслокации «головка» малой субчастицы движется и, возможно, в этом движении принимает участие спираль h34. Молекула спектиномицина связывается с опорной точкой «головки» 30S субчастицы и либо стерически блокирует движение, либо предотвращает изменения конформации спирали h34 (Carter et al., 2000).

Рис. 2. Некоторые структурные элементы малой рибосомной субчастицы. Для каждой области представлены рРНК и белки, входящие в ее состав. Также для каждого элемента сделано его наложение на общую структуры 30S субчастицы (отмечено серым). Центр декодирования расположен на рисунке так, что мРНК будет входить в него справа сзади, а выходить слева, спереди. «Головка» - вид со стороны большой субчастицы в 70S рибосоме. «Плечо» показано со стороны большой субчастицы в 70S рибосоме. «Стопа» расположена на рисунке таким образом, что часть малой субчастицы, контактирующая с 50S субчастицей, будет слева, а области, доступные растворителю - справа. «Платформа» изображена со стороны растворителя (Shluenzen et al., 2000)

1.3 Большая рибосомная субчастица

В бактериях 50S субчастица состоит из 23S рРНК (около 2900 нуклеотидов), 120-нуклеотидной 5S рРНК и 31-35 белков, молекулярная масса субчастицы составляет около 1,45х106 Да.

Большая рибосомная субчастица связывает акцепторный черешок тРНК и катализирует пептидилтрансферазную реакцию при синтезе белка на рибосоме (образование пептидной связи между аминокислотой, приносимой А-сайтовой тРНК, и пептидной цепью, присоединенной к Р-сайтовой тРНК).

1.3.1 Структура и функциональные центры большой субчастицы рибосомы

50S субчастица обладает более компактной, по сравнению с малой субчастицей, структурой. На ее относительно сферической основной части можно выделить три выступа. Три протуберанца, видимые со стороны 30S субчастицы, были названы (слева на право): Ll-выступ (спирали Н76-Н78 и связанный с ними белок L1), центральный протуберанец и L7/L12 выступ (белки L10 и L12). Анализ структуры 50S субчастицы с разрешением 5 Á показал, что форма частицы осталась такой же, как и при разрешении 20 Á, но видно, что крупные домены субчастицы разделяют глубокие борозды. Одной из заметных особенностей является большая борозда (карман), которая формирует вход в пептидилтрансферазный активный центр. Стенки этого кармана в значительной степени состоят из длинных спиралей рРНК, на дне кармана находится тоннель, который идет через всю субчастицу и служит для выхода растущего полипептида.

Было показано, что РНКовая часть 50S субчастицы образована длинными стержнями рРНК, состоящими из двойных спиралей (A-форма) и неспиральных участков, принадлежащих к разным доменам 23 S рРНК. Некоторые контакты между различными элементами рРНК образованы рибозными группами сахаро-фосфатного остова. Еще одним хорошо известным повторяющимся структурным мотивом является петля из четырех нуклеотидов; ее последовательность: гуанин — любой нуклеотид — пурин — аденин, которая часто обнаруживается на концах шпилек РНК.

1.3.2 Структура РНК большой рибосомной субчастицы

При более высоком разрешении (Ban et al., 2000) была определена вторичная структура рРНК. Было показано, что вторичная структура 23 S рРНК очень близка к структуре, определенной ранее теоретическими методами. 23 S рРНК разделена на 6 доменов, каждый из которых имеет очень асиметричную структуру (Рис. 3).

Домен I лежит сзади и чуть ниже, чем L1-выступ. Его малая часть начинается вблизи от домена VI; спирали HI и Н25 охватывают субчастицу и переходят в большую и более глобулярную структуру ниже и сзади от белка L1.

Домен II - наибольший из шести доменов 23 S рРНК. Он имеет три выступа, которые тянутся вдоль межсубъединичной стороны субчастицы. Один из этих выступов (спирали Н42-Н44) является компонентом L7/L12-протуберанца. Второй выступ - это спираль Н38 «А-сайтовый палец» (АСП), которая является самой длинной, неразветвленной шпилькой в субчастице. Она начинается сзади 50S субъединицы, изгибается под углом 90° и выступает вперед, к малой субчастице, между доменом V 23 S рРНК и 5S рРНК. Третий выступ лежит прямо перед малой субчастицей и состоит из спиралей Н32-Н35, концевая петля спирали Н34 взаимодействует непосредственно с 30S субчастицей. Эта петля появляется в межсубъединичном пространстве между доменами III и IV 23 S рРНК.

Домен III - это компактный глобулярный домен, который находится снизу, как бы на дне, с левой стороны субчастицы (вид со стороны, взаимодействующей с 30S субчастицей). По форме он напоминает четырехконечную звезду, где спирали Н48, Н52, Н57 и Н58 формируют лучи. Наиболее протяженные контакты домен III образует с доменом II. Однако, он также взаимодействует с доменами I, IV и VI. В отличие от других доменов, он почти не взаимодействует с доменом V, единственным контактом является Ван-дер-Ваальсово взаимодействие, в котором участвуют по одному основанию из каждого домена.

Домен IV составляет основную часть межсубъединичной поверхности 50S субчастицы. Он образует большую диагональную «заплатку» на поверхности платформы большой субъединицы. Это один из немногих регионов 23 S рРНК, который не стабилизируется рибосомными белками.

Домен V, который зажат между доменами IV и II в центре субчастицы, участвует в пептидилтрансферазной активности рибосомы. Структурно этот домен может быть разделен на три области. Первая область начинается от спирали Н75 и образует сайт связывания белка L1. Второй участок, который состоит из спиралей с Н80 по Н88, образует большую часть центрального протуберанца и снизу «поддерживается» 5S рРНК, а также доменом II23 S рРНК. Последняя область, которая включает в себя спирали с Н89 по Н93, располагается по направлению к домену VI и помогает стабилизировать область связывания факторов элонгации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сарских, Алена Витальевна, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Никонова Е.Ю., Волчков С.А., Кляшторный В.Г., Тищенко С.В., Костарева О.С., Невская Н.А., Никонов О.С., Габдулхаков А.Г., Никулин А.Д., Давыдова H.JL, Стрельцов В.А., Гарбер М.Б., Никонов С.В. Кристаллические структуры мутантных форм рибосомного белка Ь1//Мол. Биол. - 2007. - Т. 41(4). - С. 688-696.

2. Никонова Е.Ю., Тищенко С.В., Габдулхаков А.Г., Шкляева А.А., Гарбер М.Б., Никонов С.В., Невская Н.А. Кристаллическая структура рибосомного белка L1 из бактерии Aquifex аео/гсм5//Кристаллография. - 2011. - Т. 56(4). - С. 648-652.

3. Спирин А. С. Молекулярная биология. Рибосомы и биосинтез белка. - М: Высшая школа. - 2008.

4. Спирин А.С. Молекулярная биология. Рибосомы и биосинтез белка. - М: Академия. -2011.

5. Сарских А.В., Костарева О.С., Балобанов В.А., Тищенко С.В. Влияние электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 с РНК//Вест. УДГУ. Биология. Науки о земле. - 2013. - Т. 6. -С.90-95.

6. Agirrezabala X., Lei J., Brunelle J., Ortiz-Meoz R., Green R., Frank J. Visualization of the hybrid state of tRNA binding promoted by spontaneous ratcheting of the ribosome// Mol. Cell. - 2008. - V. 32(2). - P. 190-195.

7. Aitken C., Petrov A., Puglisi J. Single ribosome dynamics and the mechanism of translation//Annu. Rev. Biophys. - 2010. - V. 39. - P. 491-513.

8. Ahmad S, Sarai A. Analysis of electric moments of RNA-binding proteins: implications for mechanism and prediction.// BMC. Struct. Biol. - 2011. - V. 11. - P. 8.

9. Auweter S., Oberstrass F., Allain F. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition?// Nucleic. Acids. Res. 2006. - V. 34(17). - P. 4943-495.

10. Baier G., Piendl W., Redl В., Stoffler G. Structure, organization and evolution of LI equivalent ribosomal protein gene of the archaebacteriom Methanococcus vannielii II Nucleic. Acids. Res. - 1990. - V. 18. - P. 719-724.

11. Ballin J., Prevas J., Ross C., Toth E., Wilson G., Record M. Contributions of the histidine side chain and the N-terminal alpha-amino group to the binding thermodynamics of oligopeptides to nucleic acids as a function ofpHII Biochemistry. - 2010. - V. 49(9). - P. 2018-30.

12. Ban N., Freeborn B., Nissen P., Penczek P., Grassucci R., Sweet R., Frank J., Moore P., Steitz T., 9 A resolution X-ray crystallographic map of the large ribosomal subunit//Cell. -1998.-V. 93(7).-P. 1105-1115.

13. Ban N., Nissen P., Hansen J., Capel M., Moore P.B., Steitz T.A. Placement of protein and RNA structures into a 5 A-resolution map of the 50S ribosomal subunit// Nature. - 1999. — V. 400(6747).-P. 841-847.

14. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P., Steitz T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution// Science. - 2000. - V. 289(5481). - P. 905920.

15. Barat C., Datta P., Raj V., Sharma M., Kaji H., Kaji A., Agrawal R. Progression of the ribosome recycling factor through the ribosome dissociates the two ribosomal subunits//Mol. Cell. - 2007. - V. 27(2). - P. 250-261.

16. Barta A., Steiner G., Brosius J., Noller H., Kuechler E. Identification of a site on 23S ribosomal RNA located at the peptidyl transferase center//Proc. Nat. Acad. Sci. - 1984. -V. 81(12).-P. 3607-3611.

17. Blaha G., Stanley R., Steitz T. Formation of the first peptide bond: the structure of EF-P bound to the 70S ribosome//Science. - 2009. - V. 325(5943). - P. 966-70.

18. Blanchard S., Kim H., Gonzalez R., Puglisi J., Chu S. tRNA dynamics on the ribosome during translation//Proc. Nat. Acad. Sci. - 2004. - V. 101(35). - P. 1289312898.

19. Bokov K., Steinberg S. A hierarchical model for evolution of 23 S ribosomal RNA//Nature. - 2009. - V. 457(7232). - P. 977-980.

20. Brodersen D., demons W., Carter A., Wimberly B., Ramakrishnan V. Crystal structure of the 30 S ribosomal subunit from Thermus thermophilus: structure of the proteins and their interactions with 16 S RNA//J. Mol. Biol. - 2002. - V. 316(3). - P. 725-768.

21. Carter A., demons W., Brodersen D., Morgan-Warren R., Wimberly B., Ramakrishnan V. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics//Nature. - 2000. - V. 407(6802). - P. 340-348.

22. Cate J., Yusupov M., Yusupova G., Earnest T., Noller H. X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes//Science. - 1999. - V. 285(5436). - P. 2095-2104.

23. Clemons W., May J., Wimberly B., McCutcheon J., Capel M., Ramakrishnan V. Structure of a bacterial 30S ribosomal subunit at 5.5 A resolution// Nature. - 1999. -V. 400(6747). -P. 833-840.

24. Clemons M., Brodersen D., McCutcheon J., May J., Carter A., Morgan-Warren R., Wimberly B., Ramakrishnan V. Crystal structure of the 30 S ribosomal subunit from

107

Thermus thermophilics: purification, crystallization and structure determination//.!. Mol. Biol. - 2001. - V. 310(4). - P. 827-843.

25. Cornish P., Ermolenko D., Noller H., Ha T. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes//Mol. Cell. - 2008. - V. 30(5). - P. 578-588.

26. Cornish P., Ermolenko D., Staple D., Hoang L., Hickerson R., Noller H., Ha T. Following movement of the LI stalk between three functional states in single ribosomes//Proc. Nat. Acad. Sci. - 2009. - V. 106(8). - P. 2571-2576.

27. Eliseikina I., Avliiakulov N., Grishkovskaia I., Muranova T., Sedel'nikova S., Garber M. RNA-binding properties of ribosomal protein LI from Thermus thermophilus //Biokhimiia. - 1996. - V. 61(11). - P. 2040-2044.

28. Frank J., Verschoor A., Li Y., Zhu J., Lata R., Radermacher M., Penczek P., Grassucci R., Agrawal R., Srivastava S. A model of the translational apparatus based on a three-dimensional reconstruction of the Escherichia coli ribosome//Biochem. Cell. Biol. - 1995. -V. 73(11-12).-P. 757-765.

29. Frank J., Agrawal R. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation//Nature. - 2000. - V. 406(6793). - P. 318-322.

30. Frank J. Electron microscopy of functional ribosome complexes//Biopolymers. - 2003. -V. 68(2).-P. 223-233.

31. Fei J., Kosuri P., MacDougall D., Gonzalez R. Coupling of ribosomal LI stalk and tRNA dynamics during translation elongation//Mol. Cell. - 2008. - V. 30(3). - P. 348-59.

32. Feng S., Chen Y., Gao Y. Crystal structure of 70S ribosome with both cognate tRNAs in the E and P sites representing an authentic elongation complex//PLoS. One. - 2013. - V. 8(3).

33. Fu Y., Deiorio-Haggar K., Anthony J., Meyer M. Most RNAs regulating ribosomal protein biosynthesis in Escherichia coli are narrowly distributed to Gammaproteobacteria// Nucleic. Acids. Res. -2013. -V. 41(6). - P. 3491-3503.

34. Gabashvili I., Agrawal R., Spahn C., Grassucci R., Svergun D., Frank J., Penczek P. Solution structure of the E. coli 70S ribosome at 11.5 A resolution//Cell. - 2000. - V. 100(5).-P. 537-49

35. Gabdulkhakov A., Nikonov S., Garber M. Revisiting the Haloarcula marismortui 50S ribosomal subunit model//Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. - 2013. - V. 69. - P. 997-1004.

36. Gao Y., Selmer M., Dunham C., Weixlbaumer A., Kelley A., Ramakrishnan V. The structure of the ribosome with elongation factor G trapped in the posttranslocational state// Science. - 2009. - V. 326(5953). - P. 694-699.

37. Gindulyte A., Bashan A., Agmon I., Massa L., Yonath A., Karl J. The transition state for formation of the peptide bond in the ribosome// Proc. Nat. Acad. Sci. - 2006. — V. 103(36).-P. 13327-13332.

38. Gourse R., Thurlow D., Gerbi S. and Zimmermenn R. Specific binding of a procaryot ribosomal protein to an eukaryotic ribosomal RNA: Implications for evolution and autoregulation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1981. - V. 78. - P. 2722-2726.

39. Gourse R., de Boer H., Nomura M. DNA determinants of rRNA synthesis in E. coli: growth rate dependent regulation, feedback inhibition, upstream activation, antitermination// Cell. - 1986. - V. 44(1). - P. 197-205.

40. GuhaThakurta D., Draper D.. Contributions of basic residues to ribosomal protein Lll recognition of RNA// J. Mol. Biol. - 2000. - V. 295(3). - P. 569-80.

41. Hansen H., Volkmann N., Piefke J., Glotz C., Weinstein S., Makowski I., Meyer S., Wittmann H., Yonath A. Crystals of complexes mimicking protein biosynthesis are suitable for crystallographic studies// Biochim. Biophys. Acta. - 1990. - V. 1050. - P. 1-7.

42. Harms J., Schluenzen F., Zarivach R., Bashan A., Gat S., Agmon I., Bartels H., Franceschi F., Yonath A. High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium// Cell. - 2001. - V. 107(5). - P. 679-688.

43. Harms J., Wilson D., Schluenzen F., Connell S., Stachelhaus T., Zaborowska Z., Spahn C., Fucini P. Translational regulation via Lll: molecular switches on the ribosome turned on and off by thiostrepton and micrococcin//Mol. Cell. - 2008. - V. 30(1). - P. 26-38.

44. Hanner M., Mayer C., Kohrer C., Golderer G., Grobner P., Piendl W. Autogenous translational regulation of the ribosomal MvaLl operon in the archaebacterium Methanococcus vannielii//3. Bacteriol. - 1994. - V. 176(2). - P. 409-18.

45. Hoffman D., Davies C., Gerchman S., Kycia J., Porter S., White S., Ramakrishnan V. Crystal structure of prokaryotic ribosomal protein L9: a bi-lobed RNA-binding protein//EMBO J. - 1994,-V. 13(1).-P. 205-212.

46. Julián P., Milon P., Agirrezabala X., Lasso G., Gil D., Rodnina M., Valle M. The Cryo-EM structure of a complete 30S translation initiation complex from Escherichia co////PLoS. Biol.-2011.-V. 9(7).

47. Jenner L., Demeshkina N., Yusupova G., Yusupov M. Structural rearrangements of the ribosome at the tRNA proofreading step//Nat. Struct. Mol. Biol. - 2010. - V. 17(9). - P. 1072-1078.

48. Jin H., Kelley A., Ramakrishnan V. Crystal structure of the hybrid state of ribosome in complex with the guanosine triphosphatase release factor 3//Proc. Nat. Acad. Sci. — 2011.— V. 108(38).-P. 15798-15803.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55,

56.

57.

58,

59,

60,

61.

Kazemie M. Binding of aminoacyl-tRNA to reconstituted subparticles of Escherichia coli

large ribosomal subunits//Eur. J. Biochem. - 1976. - V. 67(2). - P. 373-378.

Krepl M., Reblova К., Коса J., Sponer J. Bioinformatics and molecular dynamics

simulation study of LI stalk non-canonical rRNA elements: kink-turns, loops, and

tetraloops//J. Phys. Chem. B. - 2013. - V. 117(18). - P. 5540-5555.

Khade P., Joseph S. Functional interactions by transfer RNAs in the ribosome//FEBS. Lett.

- 2010. - V. 584(2). P. 420-426.

Kohrer C.,Mayer C., Neumair O., Grobner P., Piendl W. Interaction of ribosomal LI proteins from mesophilic and thermophilic Archaea and Bacteria with specific LI-binding sites on 23S rRNA and mRNA//Eur. J. Biochem. - 1998. - V. 256(1). - P. 97-105. Korostelev A., Trakhanov S., Laurberg M., Noller H. Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements// Cell. — 2006.-V. 126(6). - P. 1065-1077.

Korostelev A., Noller H. The ribosome in focus: new structures bring new insights//Trends. Biochem. Sci. - 2007. - V. 32(9). - P. 434-441.

Katsamba P., Bayramyan M., Haworth I., Myszka D., Laird-Offringa I.. Complex role of the beta 2-beta 3 loop in the interaction of U1A with U1 hairpin II RNA//J. Biol. Chem. — 2002. - V. 277(36). - P. 33267-33274.

Kostareva O., Tishchenko S., Nikonova E., Kljashtorny V., Nevskaya N., Nikulin A., Sycheva A., Moshkovskii S., Piendl W., Garber M., Nikonov S. Disruption of shape complementarity in the ribosomal protein Ll-RNA contact region does not hinder specific recognition of the RNA target site.//J. Mol. Recognit. - 2011. - V. 24(4). - P. 524-532. Laemmli U. Cleveage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

Laurberg M., Asahara H., Korostelev A., Zhu J., Trakhanov S., Noller H. Structural basis for translation termination on the 70S ribosome//Nature. - 2008. - V. 454(7206). - P. 852857.

Lieberman K., Firpo M., Herr A., Nguyenle Т., Atkins J., Gesteland R., Noller H. The 23 S rRNA environment of ribosomal protein L9 in the 50S ribosomal subunit//J. Mol. Biol. -2000. - V. 297(5). - P. 1129-1143.

Lee K., Lee D., Park Y., Kang D., Shin S., Hahm K., Kim Y. Interactions between the plasma membrane and the antimicrobial peptide HP (2-20) and its analogues derived from HelicobacterpylorillBiochem. J. - 2006. - V. 394. - P. 105-14.

Lee DJ. Correlation forces between helical macro-ions in the weak coupling limit//J. Phys. Condens. Matter. - 2011. - V. 23(10). - P. 105-102.

62. Makowski I., Frolow F., Saper M.A., Shoham M., Wittmann H.G., Yonath A. Single crystals of large ribosomal particles from Halobacterium marismortui diffract to 6 A// J. Mol. Biol. - 1987. - V. 193. - P. 819-822.

63. Mayer C., Kohrer C., Grobner P., Piendl W. MvaLl autoregulates the synthesis of the three ribosomal proteins encoded on the MvaLl operon of the archaeon Methanococcus vannielii by inhibiting its own translation before or at the formation of the first peptide bond//Mol. Microbiol. - 1998. - V. 27(2). - P. 455-468.

64. Merianos H., Wang J., Moore P. The structure of a ribosomal protein S8/spc operon mRNA complex//RNA. - 2004. - V. 10(6). - P. 954-964.

65. Mougel M., Ehresmann B., Ehresmann C. Binding of Escherichia coli ribosomal protein S8 to 16S rRNA: kinetic and thermodynamic characterization//Biochemistry. - 1986. - V. 25(10).-P. 2756-2765.

66. Munro J., Sanbonmatsu K., Spahn C., Blanchard S. Navigating the ribosome's metastable energy landscape//Trend. Biochem. Sci. - 2009. - V. 34(8). - P. 390-400.

67. Munro J., Altman R., Tung C., Cate J., Sanbonmatsu K., Blanchard S. Spontaneous formation of the unlocked state of the ribosome is a multistep process//Proc. Nat. Acad. Sci. - 2010. - V. 107(2). - P. 709-714.

68. Nevskaya N., Tishchenko S., Fedorov R., Al-Karadaghi S., Liljas A., Kraft A., Piendl W., Garber M. and Nikonov S. Archaeal ribosomal protein LI: the structure provides new insights into RNA binding of the LI protein family//Structure. - 2000. - V. 8. - P. 363371.

69. Nevskaya N., Tishchenko S., Gabdoulkhakov A., Nikonova E., Nikonov O., Nikulin A., Platonova O., Garber M., Nikonov S. and Piendl W. Ribosomal protein LI recognizes the same specific structural motif in its target sites on the autoregulatory mRNA and 23 S rRNA // Nucleic Acid Res. - 2005. - V. 33(2). - P. 478-85.

70. Nevskaya N., Tishchenko S., Paveliev M., Smolinskaya Y., Fedorov R., Piendl W., Nakamura Y., Toyoda T., Garber M. and Nikonov S. Structure of ribosomal protein LI from Methanococcus thermolithotrophicus. Functionally important structural invariants on the LI surface//Acta. Crystalogr. D Biol. Crystallogr. - 2002. - V. 58. - P. 1023-1029.

71. Nevskaya N., Tishchenko S., Volchkov S., Kljastorny V., Nikonova E., Nikonov O., Nikulin A., Kohrer C., Piendl W., Zimmermann R., Stockley P., Garber M. and Nikonov S. New insights into the interaction of ribosomal protein LI with RNA // J. Mol. Biol. - 2006. -V. 355(4).-P. 747-759.

72. Nikonov S., Nevskaya N., Eliseikina I., Fomenkova N., Nikulin A., Ossina N., Garber M., Jinsson B., Briand C., Al-Karadaghi S.', Svensson A., AEvarsson A. and Liljas A. Crystal

111

structure of the RNA binding ribosomal protein LI from Thermus thermophilusf/EMBO. J. — 1996. — V. 15(6).-P. 1350-1356.

73. Nikulin A., Eliseikina I., Tishchenko S., Nevskaya N., Davydova N., Platonova O., Piendl W., Selmer M., Liljas A., Drygin D., Zimmermann R., Garber M. and Nikonov S. Structure of the LI protuberance in the ribosome//Nat. Struct. Biol. - 2003. - V. 10(2). - P. 104-108.

74. Nissen P., Hansen J., Ban N., Moore P., Steitz T. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis//Science. - 2000. - V. 289(5481). - P. 920-930.

75. Nierhaus K., Dohme F. Total reconstitution of functionally active 50S ribosomal subunits from Escherichia colif/Proc. Nat. Acad. Sci. - 1974. - V. 71(12). - P. 4713-4717.

76. Nierhaus K., Teraoka H. Proteins from Escherichia coli ribosomes involved in the binding of erythromycin//J. Mol. Biol. - 1978. -V. 126(2). - P. 185-193.

77. Nishimura M., Yoshida T., Shirouzu M., Terada T., Kuramitsu S., Yokoyama S., Ohkubo T., Kobayashi Y. Solution structure of ribosomal protein LI 6 from Thermus thermophilus HB8//J. Mol. Biol. - 2004. - V. 344(5). - P. 1369-1383.

78. Noller H., Hoffarth V., Zimniak L. Unusual resistance of peptidyl transferase to protein extraction procedures//Science. - 1992. - V. 256(5062). - P. 1416-9.

79. Noller H., Yusupov M., Yusupova G., Baucom A., Lieberman K., Lancaster L., Dallas A., Fredrick K., Earnest T., Cate J. Structure of the ribosome at 5.5 A resolution and its interactions with functional ligands//Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. - 2001. - V. 66.-P. 57-66.

80. Ogle J., Brodersen D., demons W., Tarry M., Carter A., Ramakrishnan V. Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit// Science. - 2001. - V. 292(5518). - P. 897-902.

81. Ogle J., Murphy F., Tarry M., Ramakrishnan V. Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form//Cell. - 2002. - V. 111(5). - P. 721732.

82. Ogle J., Ramakrishnan V. Structural insights into translational fidelity//Annu. Rev. Biochem. - 2005. - V. 74. - P. 129-177.

83. Orengo C., Thornton J. Alpha plus beta folds revisited: some favoured motifs//Structure. -1993.-V. 1(2).-P. 105-120.

84. Pai R., Zhang W., Schuwirth B., Hirokawa G., Kaji H., Kaji A., Cate J. Structural Insights into ribosome recycling factor interactions with the 70S ribosome//J. Mol. Biol. - 2008. -V. 376(5).-P. 1334-1347.

85. Palade G. A small particulate component of the cytoplasm// J. Biophys. Biochem. Cytol. -1955.-V. 1(1).-P. 59-68.

86. Petry S., Weixlbaumer A., Ramakrishnan V. The termination of translation//Curr. Opin. Struct. Biol. - 2008. -V. 18(1). - P. 70-77.

87. Petrov A., Kornberg G., O'Leary S., Tsai A., Uemura S., Puglisi J. Dynamics of the translational machinery//Curr. Opin. Struct. Biol. - 2011. - V. 21. - P.137-145.

88. Rao S., Rossmann M. Comparison of super-secondary structures in proteins//J. Mol. Biol. - 1973. - V. 76(2). - P. 241-256.

89. Roberts R. Introduction in Microsomal Particles and Protein Synthesis. - NY. - Pergamon Press. Inc. -1958.

90. Rodnina M., Wintermeyer W. The ribosome goes Nobel//Tren. Biochem. Sci. - 2010. - V. 35(1).-P. 1-5.

91. Rodnina M. Quality control of mRNA decoding on the bacterial ribosome//Adv. Protein. Chem. Struct. Biol. - 2012. - V.86. - 95-128.

92. Reblova K., Sponer J., Lankas F. Structure and mechanical properties of the ribosomal LI stalk three-way junction/ZNucleic. Acids. Res. - 2012. - V. 40(13). - P. 6290-6303.

93. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. - NY. -Cold. Spring. Harbor. - 1989.

94. Serganov A., Rak A., Garber M., Reinbolt J., Ehresmann B., Ehresmann C., Grunberg-Manago M., Portier C. Ribosomal protein S15 from Thermus thermophilus—cloning, sequencing, overexpression of the gene and RNA-binding properties of the protein//Eur. J. Biochem. - 1997. -V. 246(2). - P. 291-300.

95. Simonovic M., Steitz T. A structural view on the mechanism of the ribosome-catalyzed peptide bond formation//Biochim. Biophys. Acta. - 2009. - V. 1789(9-10). - P. 612-623.

96. Simonetti A., Marzi S., Jenner L., Myasnikov A., Romby P., Yusupova G., Klaholz B., Yusupov M. A structural view of translation initiation in bacteria// Cell. Mol. Life. Sci. -2009. - V. 66(3). - P. 423-436.

97. Selmer M., Dunham C., Murphy F., Weixlbaumer A., Petry S., Kelley A., Weir J., Ramakrishnan V. Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA// Science. - 2006. -V. 313(5795). - P. 1935-42.

98. Selmer M., Gao Y., Weixlbaumer A., Ramakrishnan V. Ribosome engineering to promote new crystal forms//Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. - 2012. - V. 68(5). - P. 578-583.

99. Schluenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann M., Janell D., Bashan A., Bartels H., Agmon I., Franceschi F., Yonath A. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 A resolution//Cell. - 2000. - V. 102(5). - P. 615-623.

100. Sehuwirth B., Borovinskaya M., Hau C., Zhang W., Vila-Sanjmjo A., Holton J., Cate J. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Á resolution//Seience. - 2005. - V. 310(5749).-P. 827-834.

101. Schmcing T., Voorhees R., Kelley A., Gao Y., Murphy F., Weir J., Ramakrishnan V. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA// Science. - 2009. - V. 326(5953). - P. 688-694.

102. Schnieing T., Ramakrishnan V. What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation//Nature. -2009. - V. 461(7268). - P. 1234-1242.

103. Steitz T. A structural understanding of the dynamic ribosome machine//Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. - 2008. - V. 9(3). - P. 242-253.

104. Studier F., Rosenberg A., Dunn J. and Dubendorff J. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes//J. Methods. Enzimol. - 1990. - V. 185. - P. 60-89

105. Teraoka H., Nierhaus K. Protein L16 induces a conformational change when incorporated into a LI 6-deficient core derived from Escherichia coli ribosomes//FEBS. Lett. - 1978. — V. 88(2).-P. 223-226.

106. Tishchenko S., Nikonova E., Nikulin A., Nevskaya N., Volchkov S., Piendl W., Garber M. and Nikonov S. Structure of the ribosomal protein Ll-mRNA complex at 2.1 A resolution: common features of crystal packing of Ll-RNA complexes//Acta Crystalogr. D Biol. Crystallogr.-2006.- V. 62(12).-P. 1545-1554.

107. Tishchenko S., Kljashtorny V., Kostareva O., Nevskaya N., Nikulin A., Gulak P., Piendl W., Garber M., Nikonov S. Domain II of Thermus thermophilus ribosomal protein LI hinders recognition of its mRNA//J. Mol. Biol. -2008. - V. 383(2). - P. 301-305.

108. Tishchenko S., Nikonov S., Garber M„ Kraft A., Kohrer C., Piendl W. Crystals of ribosomal protein LI from a hyperthermophilic archaeon Methanococcus jannaschz7//Bíochem. Mol. Biol. Int. - 1998. - V. 45(2). - P. 349-354.

109. Tishchcnko S., Gabdulkhakov A., Nevskaya N., Sarskikh A., Kostareva O., Nikonova E., Syclieva A., Moshkovskii S., Garber M., Nikonov S. High-resolution crystal structure of the isolated ribosomal LI stalk//Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. -2012. -V. 68. -P. 1051-1057.

110. Tocilj A., Schlünzen F., Janell D., Glühmann M., Hansen H., Harms J., Bashan A., Bartels H., Agmon I., Franceschi F., Yonath A. The small ribosomal subunit from Thermus thermophilus at 4.5 Á resolution: pattern fittings and the identification of a functional site//Proc. Nat. Acad. Sci. - 1999. -V. 96(25).-P. 14252-14257.

111. Tourigny D., Fernández I., Kelley A., Ramakrishnan V. Elongation factor G bound to the ribosome in an intermediate state of translocation//Science. - 2013. - V. 340(6140).

112. Trakhanov S., Yusupov M., Shirokov V., Garber M., Mitschler A., Ruff M., Thierry J.C,. Moras D. Preliminary X-ray investigation of 70 S ribosome crystals from Thermus thermophilusll J. Mol. Biol. - 1989. - V.209(2). - P. 327-328.

113. Trakhanov S., Yusupov M., Agalarov S., Garber M., Ryazantsev S., Tischenko S., Shirokov V. Crystallization of 70S ribosome and 30S ribosomal subunits from Thermus thermophilusll FEBS Lett. - 1987. - V. 220. - P. 319-322.

114. Trabuco L., Schreiner .E, Eargle J., Cornish P., Ha T., Luthey-Schulten Z., Schulten K. The role of LI stalk-tRNA interaction in the ribosome elongation cycle//J. Mol. Biol. -2010. - V. 402(4). - P. 741-760.

115. Unge J., AI-Karadaghi S., Liljas A., Jonsson B., Eliseikina I., Ossina N., Nevskaya N., Fomenkova N., Garber M., Nikonov S. A mutant form of the ribosomal protein LI reveals conformational flexibility//FEBS. Lett. - 1997. -V. 411(1). - P. 53-59.

116. Valle M., Zavialov A., Sengupta J., Rawat U., Ehrenberg M., Frank J. Locking and unlocking of ribosomal motions//Cell. - 2003. -V. 114(1). - P. 123-134.

117. von Bohlen K., Makowski I., Hansen H.A., Battels H., Berkovitch-Yellin Z., Zaytzev-Bashan A., Meyer S., Paulke C., Franceschi F., Yonath A. Characterization and preliminary attempts for derivatization of crystals of large ribosomal subunits from Haloarcula marismortui diffracting to 3 A resolution// J. Mol. Biol. - 1991. - V. 222(1). -P. 11-15.

118. Voorhees R., Weixlbaumer A., Loakes D., Kelley A., Ramakrishnan V. Insights into substrate stabilization from snapshots of the peptidyl transferase center of the intact 70S ribosome//Nat. Struct. Mol. Biol. - 2009. - V. 16(5). - P. 528-533.

119. Vysotskaya V., Tischenko S., Garber M., Kern D., Mougel M., Ehresmann C., Ehresmann

B. The ribosomal protein S8 from Thermus thermophilus VK1. Sequencing of the gene, overexpression of the protein in Escherichia coli and interaction with rRNA//Eur. J. Biochem. - 1994. - V. 223(2). - P. 437-445.

120. Wimberly B., Brodersen D., demons W., Morgan-Warren R., Carter A., Vonrhein

C., Hartsch T., Ramakrishnan V. Structure of the 30S ribosomal subunit// Nature. -2000. -V. 407(6802). - P. 327-339.

121. Woese C., Gutell R., Gupta R., Noller H. Detailed analysis of the higher-order structure of 16S-like ribosomal ribonucleic acids//Microbiol. Rev. - 1983. - V. 47(4). - P. 621-669.

122. Wilson D., Nierhaus K. Ribosomal proteins in the spotlight//Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. - 2005. - V. 40(5). - P.243-267.

123. Wower I., Wower J., Zimmermann R. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction//J. Biol. Chem. - 1998. - V. 273(31).-P. 19847-19852.

124. Wekselman I., Davidovich C., Agmon I., Zimmerman E., Rozenberg H„ Bashan A., Berisio R., Yonath A. Ribosome's mode of function: myths, facts and recent results//J. Pept. Sci. - 2009. - V. 15(3). - P. 122-130.

125. Weixlbaumer A., Jin H., Neubauer C., Voorhees R., Petry S., Kelley A., Ramakrishnan V. Insights into translational termination from the structure of RF2 bound to the ribosomc//Science. - 2008. - V. 322(5903). - P. 953-956.

126. Yatime L., Schmitt E., Blanquet S., Mechulam Y. Functional molecular mapping of archneal translation initiation factor 2//J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279(16). - P. 1598415993.

127. Yonath A., Muessig J., Tesche B., Lorenz S., Erdmann V.A., Wittmann H.G. Crystallization of the large ribosomal subunit from B. stearothermophilusf/Biochem. Int. -1980.-V. l.-P. 428-435.

128. Yonath A., Wittmann H.G. Approaching the molecular structure of ribosomes//Biophys. Chem. - 1988. - V. 29. - P. 17-29.

129. Yonath A., Glotz C., Gewitz H.S., Bartels K.S., von Bohlen K., Makowski I. and Wittmann H.G. Characterization of crystals of small ribosomal subunits//J. Mol. Biol. -1988.-V. 203.-P. 831-834.

130. Yonath A. The search and its outcome: high-resolution structures of ribosomal particles from mesophilic, thermophilic, and halophilic bacteria at various functional states//Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. - 2002. - V. 31. - P. 257-273.

131. Yonath A., Bashan A. Ribosomal crystallography: initiation, peptide bond formation, and amino acid polymerization are hampered by antibiotics//Annu. Rev. Microbiol. - 2004. -V. 58.-P. 233-251.

132. Yonath A. Large facilities and the evolving ribosome, the cellular machine for genetic-code translation// J. R. Soc. Interface. - 2009. - V. 6.

133. Yusupov, M. M. et al. Crystallization of the 30S subunitsof Thermus thermophilus ribosomes. Dokl. Akad. Nauk (USSR). - 1987. - V. 292. - P. 1271-1274

134. Yusupov M., Yusupova G., Baucom A., Lieberman K., Earnest T., Cate J., Noller H. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution// Science.-2001.-V. 292(5518).-P. 883-896.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я бы хотела поблагодарить моего научного руководителя Марину Борисовну Гарбер за внимание к моей работе, неизменно важные и ценные замечания и рекомендации, сделанные в ходе подготовки диссертации.

Хотелось бы поблагодарить Светлану Викторовну Тищенко за обсуждение, советы, замечания, помощь и поддержку в ходе выполнения и написания работы.

Мне бьт хотелось выразить мою признательность сотрудникам группы структурных исследований рибосомных белков Станиславу Владимировичу Никонову, Наталье Александровне Невской за их советы, а также обсуждение полученных результатов. Кроме того, мне бы хотелось поблагодарить Азата Габдулхакова, при участии которого была выполнена структурная часть работы.

Я очень благодарна Ольге Костаревой и Алисе Михайлиной за их помощь и поддержку но время подготовки диссертации.

Хочу сказать спасибо всем сотрудникам лаборатории структурных исследований аппарата трансляции за их помощь, хорошее отношение и за веселую компанию частью которой я стала, работая с вами.

Хотелось бы сказать большое спасибо Валентине Егоровне Бычковой за ее помощь в подготовке рукописи.

Отдельно хотелось бы сказать большое спасибо всем мои близким, которые терпели меня в ходе подготовки диссертации, а особенно моему супругу - СПАСИБО.