Особенности реакции расщепления РНК и регуляции активности у РНК-полимераз Deinococcus radiodurans, Thermus aquaticus и Thermus thermophilus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Есюнина, Дарья Михайловна

• Есюнина, Дарья Михайловна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Есюнина, Дарья Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Введение

1.2. Строение кор-фермента бактериальной РНКП

1.3. Механизмы инициации транскрипции

1.3.1. Формирование открытого промоторного комплекса

1.3.2. Структура промоторного комплекса

1.4. Механизмы элонгации транскрипции

1.4.1. Структура элонгационного комплекса

1.4.2. Реакции, катализируемые РНКП

1.4.3. Пути поступления нуклеотидов в активный центр РНКП

1.4.4.Структурные перестройки активного центра РНКП в ходе синтеза РНК

1.4.4.1. Механизм включения нуклеотидов

1.4.4.2. Механизм транслокации РНКП

1.4.5. Механизмы, обеспечивающие высокую точность синтеза РНК

1.4.6. Обратное смещение РНКП и механизм расщепления РНК

1.4.7. Регуляции элонгации транскрипции с помощью транскрипционных

факторов

1.5. Терминация трапскрипции

1.6. Белки бактериофагов, влияющие на функционирование РНКП

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.2. Питательные среды и антибиотики

2.3. Компетентные клетки и трансформация бактерий

2.4. Манипуляции с ДНК

2.5. Получение промоторных фрагментов ДНК и матрицы для измерения скорости элонгации

2.6. Получение генов, кодирующих белки GreA и мутантные РНКП Е. coli и D. radiodurans

2.7. Электрофорез белков и анализ взаимодействия белков в геле

2.8.0пределение концентрации белка

2.9. Выделение белков

2.9.1. Суперпродукция рекомбинантных белков

2.9.2. Выделение рекомбинантных РНКП Е. coli, содержащих гистидиновый якорь (6His-tag)

2.9.3. Выделение рекомбинантных РНКП D. radiodurans и Т. aquaticus, содержащих 6His-tag

2.9.4. Выделение РНКП из штамма Е. coli с делецией Gre-факторов

2.9.5. Выделение РНКП из штамма Thermus thermophilus HB8rpoC::10H

2.9.6. Выделение белков GreA

2.9.7. Выделение а-субъединицы и белка gp39 из тел включения

2.10. Электрофорез нуклеиновых кислот в денатурирующем геле

2.11. Транскрипция in vitro

2.11.1. Тест по синтезу полноразмерных РНК-продуктов

2.11.2. Тест по синтезу абортивных РНК-продуктов

2.11.3. Транскрипция на аптамерных матрицах

2.11.4. Определение кинетики диссоциации промоторных комплексов в присутствии гепарина

2.11.5. Получение искусственных элонгационных комплексов для исследования расщепления РНК

2.11.5.1. Тест по определению эффективности связывания каталитических ионов Mg2+ в активном центре РНКП

2.11.5.2. Тест по определению зависимости скорости расщепления РНК РНКП

от pH реакционного буфера

2.11.5.3. Тест по определению скорости расщепления РНК РНКП в присутствии белковых факторов

2.11.6. Определение скорости включения нуклеотидов в искусственных элонгационных комплексах

2.11.7. Определение скорости пирофосфоролиза

2.11.8. Измерение эффективности ст-зависимой паузы с использованием искусственных ЭК

2.12. Определение влияния мутаций в РНКП на выживаемость клеток

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование особенностей реакции расщепления РНК РНК-полимеразами

D. radiodurans и Е. coli

3.1.1 Оптимизация условий выделения РНКП для анализа реакции расщепления

3.1.2. Измерение скоростей синтеза РНК РНКП Е. coli и D. radiodurans

3.1.3. Сравнение скоростей расщепления РНК РНКП Е. coli и D. radiodurans и

поиск различий в протекании данной реакции

3.1.4. Поиск районов, определяющих межвидовые различия в реакции расщепления РНК РНКП Е. coli и D. radiodurans

3.1.5. Исследование влияния мутаций в G-петле на выживаемость клеток

3.1.6. Исследование делеций G-петли в РНКП Е. coli и D. radiodurans

3.1.7. Изучение влияния факторов GreA на реакцию расщепления РНК РНК-полимеразами Е. coli и D. radiodurans и их мутантными вариантами

3.2. Исследование особенностей реакции расщепления РНК РНКП Т. aquaticus

по сравнению с РНКП D. radiodurans

3.2.1. Анализ структурных элементов РНКП, определяющих различия в скорости расщепления РНК РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans

3.2.2. Влияние Gre-факторов на расщепление РНК мутантными вариантами РНКП

Т. aquaticus

3.3 Механизмы регуляции транскрипции РНК-полимеразы Т. thermophilus

белком gp39 бактериофага Р23-45

3.3.1. Анализ влияния белка gp39 бактериофага Р23-45 на инициацию транскрипции на разных промоторах

3.3.2. Поиск сайта связывания белка gp39

3.3.3. Анализ механизма подавления инициации транскрипции белком gp39 фага Р23-45

3.3.4. Влияние белка gp39 на элонгацию транскрипции

3.3.5. Механизм действия белка gp39 на терминацию транскрипции

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

ПРИЛОЖЕНИЕ 4

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БТТ- дитиотреитол

сШТР - дезоксирибонуклеозидтрифосфат

БЭТА - этилендиаминтетраацетат

1РТО - изопропил-Р-тио-Б-галактопиранозид

ИТР - рибонуклеозидтрифосфат

РМБР - фенилметилсульфонилфторид

БОБ - додецилсульфат натрия

а.к. - аминокислотный остаток

НК - нуклеиновые кислоты

нт - нуклеотид

п.н. - пар нуклеотидов

оцДНК - одноцепочечная ДНК

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНКП - РНК-полимераза

ЭК - элонгационный комплекс

ЭКЗ'С - элонгационный комплекс со спаренным 3'-концевым нуклеотидом РНК с матричной цепью ДНК

ЭКЗ'Н - элонгационный комплекс с некомплементарным (неспаренным) 3'-концевым нуклеотидом РНК с матричной цепью ДНК

АЦ - активный центр

НАЦ - настройка активного центра

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности реакции расщепления РНК и регуляции активности у РНК-полимераз Deinococcus radiodurans, Thermus aquaticus и Thermus thermophilus»

ВВЕДЕНИЕ

РНК-полимераза (РНКП) - высоко консервативный фермент, осуществляющий процесс транскрипции в клетках всех организмов. У бактерий транскрипция всех генов осуществляется единственной РНКП, которая является одной из основных моделей для изучения фундаментальных механизмов транскрипции, а также может служить перспективной мишенью для действия антибиотиков. Процесс транскрипции разделяют на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию, которые сопровождаются сложными структурными перестройками РНКП. На стадии элонгации РНКП может осуществлять не только синтез, но и эндонуклеолитическое расщепление РНК, которое происходит в том же активном центре фермента. Предполагается, что реакция расщепления РНК играет важную роль в исправлении ошибок транскрипции и в преодолении транскрипционных пауз, возникающих в ходе элонгации. Было показано, что расщеплению РНК предшествует обратное смещение элонгационного комплекса (ЭК), при этом в активном центре оказывается внутренняя часть транскрипта. Следует сказать, что, хотя биохимические и структурные исследования последних лет позволили предположить детальный молекулярный механизм синтеза РНК бактериальной РНКП, про механизм расщепления РНК известно гораздо меньше. Непонятно, какие районы РНКП важны для осуществления расщепления РНК и каковы механизмы структурных перестроек активного центра РНКП, происходящих в ходе данной реакции.

В последние годы активно ведутся работы по расшифровке пространственных структур РНКП и транскрипционных комплексов, что вместе с биохимическими данными обеспечивает понимание молекулярных механизмов работы РНКП на разных стадиях транскрипции. К настоящему времени наиболее полная структурная информация получена для РНКП термофильных бактерий рода Thermus (Т. thermophilus и Т. aquaticus). РНКП этих бактерий обладают рядом уникальных особенностей, связанных с адаптацией к высоким температурам, и при этом являются неродственными РНКП мезофильной бактерии Escherichia coli, которая очень хорошо изучена биохимическими методами. С этой точки зрения, большой интерес представляет исследование РНКП мезофильной бактерии Deinococcus radiodurans, которая филогенетически родственна бактериям рода Thermus. Существующие данные показывают, что РНКП Т. aquaticus, Т. thermophilus и D. radiodurans обладают гораздо большей скоростью расщепления РНК (в своих температурных оптимумах), чем РНКП Е. coli, что делает сравнительное исследование этих РНКП актуальным с точки зрения понимания механизмов реакции расщепления РНК и температурной адаптации катализа.

В связи с консервативностью структуры активного центра РНКП у бактерий и эукариот, исследование механизмов действия различных факторов (белков, низкомолекулярных соединений, некодирующих нуклеиновых кислот и антибиотиков) на работу бактериальной РНКП позволяет понять общие принципы регуляции транскрипции. Важнейшей группой факторов являются регуляторные молекулы, способные непосредственно воздействовать на активный центр РНКП. К таким факторам относятся универсальные для всех организмов белки, стимулирующие реакцию расщепления РНК. У бактерий эта функция выполняется Оге-белками. Многие детали взаимодействия данных белков с РНКП и их физиологическая роль у разных бактерий понятны не до конца. Другой очень разнообразной группой факторов являются регуляторные белки бактериофагов, изменяющие активность хозяйской РНКП в процессе инфекции. Многообразие механизмов действия белков бактериофагов делает исследование каждого нового фагового регулятора хозяйской транскрипции уникальным. Исследование механизма действия данных белков с привлечением современных данных о структуре РНКП (прежде всего, термофильных бактерий) может дать ценную информацию о различных способах регуляции активности РНКП. С этой точки зрения очень интересной моделью являются регуляторные белки бактериофагов, заражающих бактерии рода Ткегтт, в частности, открытый недавно белок £р39 бактериофага Р23-45, который взаимодействует с РНКП Т. 1кегторЫ1и$.

Понимание молекулярного механизма транскрипции и основных принципов регуляции активности РНКП представляет не только фундаментальный интерес, но имеет и важное практическое значение, так как РНКП является перспективной мишенью для создания новых антибиотиков. Кроме того, изучение факторов, играющих ключевую роль в регуляции активности РНКП, необходимо для разработки новых подходов для высокоэффективной экспрессии целевых генов. Исследование взаимодействий регуляторных белков бактериофагов с РНКП может быть также использовано для разработки новых тест-систем для поиска и характеристики различных лигандов РНКП, в том числе, имеющих медицинское значение.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цели работы:

1. Выявить районы РНКП D. radiodurans, Т. aquaticus и Е. coli, участвующие в реакции расщепления РНК и определяющие межвидовые различия в данной реакции.

2. Исследовать механизм регуляции транскрипции РНКП Thermus thermophilus белком gp39 бактериофага Р23-45.

Задачи:

1. Исследовать особенности реакции расщепления РНК РНКП D. radiodurans.

2. Методами сайт-направленного мутагенеза и транскрипции in vitro выявить участки активного центра РНКП, определяющие различия в скорости реакции расщепления РНК у РНКП Е. coli и D. radiodurans.

3. Изучить влияние мутаций в активном центре РНКП Т. aquaticus на расщепление РНК в реакциях по транскрипции in vitro и выявить связанные с температурной адаптацией различия в реакции расщепления между РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans.

4. Методами транскрипции in vitro исследовать влияние белка gp39 бактериофага Р23-45 на транскрипционные свойства РНКП Т. thermophilus. Найти районы РНКП, ответственные за связывание белка gp39.

t

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНК-

ПОЛИМЕРАЗЫ

1.1. Введение

Транскрипция (от лат. transcriptio - переписывание) - процесс синтеза молекулы РНК на матрице ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой (РНКП). Данный процесс является первой стадией реализации генетического материала у всех живых организмов. Все РНКП за исключением ферментов, кодируемых в геномах бактериофагов и участвующих в транскрипции в митохондриях, являются мультисубъединичными комплексами. У бактерий и архей в геноме содержится единственная РНКП, а у эукариот имеется несколько ферментов, ответственных за синтез разных типов РНК. Однако в структуре всех известных многосубъединичных РНКП можно найти гомологии в последовательностях основных субъединиц.

Бактериальная РНКП состоит из пяти субъединиц - двух а, Р, Р' и ю, которые образуют кор-фермент, обладающий каталитической активностью. Для узнавания промотора и начала синтеза РНК необходимо наличие а-субъединицы, образующей вместе с кор-ферментом холофермент РНКП. В клетках бактерий, как правило, имеется одна главная о-субъединица и несколько альтернативных: у Escherichia coli в геноме закодировано 6 альтернативных ст-субъединиц, однако у некоторых бактерий их число может доходить до нескольких десятков и даже превышать сотню. Наличие альтернативных а-субъединиц позволяет переключать экспрессию различных наборов генов в зависимости от внешних и внутренних условий, что имеет важнейшее адаптивное значение. Исследование процесса транскрипции играет ключевую роль в понимании механизмов функционирования живой клетки и экспрессии генетической информации.

1.2. Строение кор-фермента бактериальной РНКП

Большой прогресс в исследовании механизмов транскрипции был достигнут благодаря расшифровке пространственных структур РНКП термофильных бактерий рода Thermus. В конце XX века была расшифрована пространственная структура кор-фермента РНКП Т. aquaticus (Zhang et al., 1999). Затем появились данные о структуре холоферментов РНКП Т. aquaticus и Т. thermophilus (Murakami et al., 2002a; Murakami et al., 2002b; Vassylyev et al., 2002). Первой эукариотической РНКП, пространственную

структуру которой удалось расшифровать, стала РНКП II дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Cramer et al., 2001). Также был достигнут большой прогресс в кристаллизации элонгационных комплексов РНКП Т. thermophilus и S. cerevisiae (Gnatt et al., 2001; Vassylyev et al., 2007a; Vassylyev et al., 2007b). Сравнительно недавно были опубликованы работы со структурами смещенного элонгационного комплекса РНКП II дрожжей S. cerevisiae (Saecker et al., 2011). Также была получена пространственная структура инициаторного комплекса РНКП Т. thermophilus (Zhang et al., 2012). Кроме того, имеется большое количество структурных данных о взаимодействии РНКП с различными ингибиторами и регуляторными белками: миксопиронином (Belogurov et al., 2008; Mukhopadhyay et al., 2008), стрептолидигином (Temiakov et al., 2005; Tuske et al., 2005), a-аманитином (Brueckner and Cramer, 2008; Bushnell et al., 2002), тагетитоксином (Vassylyev et al., 2005), рифампицином (Artsimovitch et al., 2005; Campbell et al., 2001), сорангицином (Campbell et al., 2005), Gfhl (Tagami et al., 2010b). Полученные структурные данные вместе с результатами биохимических и биоинформатических исследований сыграли большую роль в понимании механизма функционирования РНКП, который сходен у всех изучаемых ферментов.

По форме РНКП напоминает клешню краба (см. рисунок 1.1). Верхняя половина "клешни" главным образом сформирована Р'-, а нижняя - Р-субъединицей. Сзади, со стороны, противоположной главному каналу, находятся две а-субъединицы, причем одна из них большей частью контактирует с Р', а вторая - с р-субъединицей. со-субъединица взаимодействует с Р'-субъединицей. В РНКП выделяют три основных канала - главный, вторичный и канал выхода РНК. Главный канал образован р и Р'-субъединицами. В этом канале в процессе транскрипции связывается ДНК и РНК-ДНК гибрид, который помещается в глубине главного канала, между доменами clamp (зажим) Р'-субъединицы и доменами pi и Р2 Р-субъединицы. Домен clamp может изменять свое положение, регулируя таким образом ширину главного канала. Сбоку РНКП имеется вторичный канал, который соединяется с главным в области активного центра. Предполагается, что вторичный канал служит основным путем поступления нуклеотидов в активный центр, кроме того, через вторичный канал проникают некоторые регуляторные факторы, такие как Gre, DksA, Gfh (Hogan et al., 2002; Laptenko et al., 2003; Paul et al., 2004a). Канал выхода РНК в основном образован доменом flap (заслонка) Р-субъединицы. Данный домен также является подвижным и с ним связываются некоторые регуляторные факторы.

Другими важными структурными элементами РНКП являются элементы Р'-субъединицы: домен jaw (челюсть), контактирующий с передним ДНК-дуплексом и G-

P'clamp

P'CC1

(3 rudder

Главный канал

P'CC2

(31

F-спираль

Вторичный канал

• al

• all

P P'

со

гомология

Рисунок 1.1. Схема строения РНКП и ЭК. (А) Кор-фермент РНКП Т. thermophilus, вид сбоку (слева) и со стороны главного канала (справа) (по данным (Vassylyev et al., 2002)). Цветовые обозначения субъединиц показаны справа от рисунка. На рисунке показаны главный и вторичный каналы РНКП, обозначены некоторые структурные элементы фермента. Красной сферой показан ион Mg2+ в активном центре РНКП. (Б) Распределение консервативных участков р- и Р'-субъединиц по поверхности РНКП. Низкоконсервативные участки изображены белым, высококонсервативные - красным (по данным (Zhang et al., 1999)). (В) Схема строения бактериальной (слева) и эукариотической (справа, на примере S. cerevisiae) РНКП II. Цифрами справа обозначены различные субъединицы РНКП II (Rpbl, Rpb2 и т.д.). Одинаковыми цветами отмечены гомологичные субъединицы. Схемы воспроизведены из (Cramer, 2002).

петлей (см. ниже); домен zipper (застежка), который, предположительно, участвует в «закрывании» заднего дуплекса ДНК при движении РНКП вперед; домен rudder (шип) ответственный за удержание РНК-ДНК гибрида и контактирующий с его задней границей; домен lid (крышка), необходимый для разделения задней части РНК-ДНК дуплекса (Пупов и Кульбачинский, 2010). Еще одним важным элементом является также район fork-loop2, сформированный Р-субъединицей, который контактирует с нематричной цепью ДНК спереди от активного центра (Zhang et al., 2012).

Активный центр фермента образован в основном элементами Р'-субъединицы. Непосредственное участие в катализе принимают два иона Mg2+, связанные остатками аспарагиновой кислоты абсолютно консервативного мотива NADFDGD Р'-субъединицы (Sosunov et al., 2003; Zaychikov et al., 1996). Основными подвижными элементами активного центра РНКП, необходимыми для катализа, являются F-спираль, G-петля и F-петля, также образованные Р'-субъединицей. Последовательные структурные перестройки этих трех элементов обеспечивают позиционирование нуклеотида в активном центре и транслокацию фермента после включения данного нуклеотида в цепь РНК (см. ниже).

1.3. Механизмы инициации транскрипции 1.3.1. Формирование открытого промоторного комплекса

Процесс транскрипции разделяют на три стадии - инициацию, элонгацию и терминацию. На каждой стадии РНКП претерпевает ряд структурных перестроек, формируя различные комплексы с ДНК и РНК. Все перестройки транскрипционного комплекса РНКП с нуклеиновыми кислотами подвергаются тонкой регуляции за счет транскрипционных факторов, малых регуляторных молекул и специальных сигналов в последовательности РНК и ДНК. Ниже различные стадии транскрипции рассмотрены более подробно.

Инициация транскрипции осуществляется холоферментом РНКП. В клетке ни свободная о-субъединица, ни кор-фермент не способны по отдельности специфически узнавать и связывать промоторные последовательности в ДНК. с-субъединица в составе холофермента РНКП претерпевает ряд структурных перестроек, что приводит к правильному позиционированию ее ДНК-связывающих участков на поверхности холофермента, благодаря чему РНКП становится способна специфически узнавать и связывать промоторы.

Все главные а-субъединицы имеют 4 эволюционно-консервативных района, каждый из которых в свою очередь делится на подрайоны (1.1-1.2; 2.1-2.5; 3.1-3.2; 4.1-4.2). Пространственная структура свободной а-субъединицы до сих пор не расшифрована, но имеются данные о структуре отдельных районов (Campbell et al., 2002; Malhotra et al., 1996). Оказалось, что структура индивидуальных доменов а-субъединицы, находящейся в свободном состоянии вне комплекса с кор-ферментом, очень сходна с их структурой в составе холофермента РНКП (Campbell et al., 2002). Было высказано предположение, что в структуре свободной а-субъединицы район 1.1 принимает участие в маскировании районов 2 и 4 а-субъединицы, отвечающих за специфическое узнавание и связывание с

12

промоторной ДНК (Schwartz et al., 2008). Кроме того, отсутствие взаимодействия свободной ст-субъединицы с промоторной ДНК может частично объясняться более компактной конформацией данного белка, в то время как в составе холофермента расстояния между районами 2 и 4 а-субъединицы, принимающими участие во взаимодействии с промоторной ДНК, увеличивается до необходимых для этого пределов (Callaci et al., 1999).

Бактериальный промотор, узнаваемый главной сигма-субъединицей, состоит из нескольких элементов: -35 (консенсусная последовательность - TTGACA), TG, -10 (консенсусная последовательность - ТАТААТ), которые контактируют с районами 4.2, 2.5 и 2.4 ст-субъединицы в составе холофермента, соответственно (Barne et al., 1997) (рисунок 1.2). Некоторые промоторы содержат так называемый up-элемент - АТ-богатый участок, располагающийся примерно на расстоянии 60-ти нуклеотидов левее старта транскрипции (Gourse et al., 1998). Данный элемент узнается С-концевыми доменами а-субъединиц РНКП. Кроме того, существуют и другие дополнительные промоторные элементы, эффективность узнавания которых варьирует для РНКП из различных бактерий. Так, на стабильность промоторных комплексов значительно влияет последовательность участка между -10 элементом и стартом транскрипции (так называемый участок дискриминатора) (Travers, 1980). Как правило, в промоторах, подвергающихся «строгому контролю» (stringent response), отсутствуют взаимодействия РНКП с участком дискриминатора, что приводит к дестабилизации таких промоторных комплексов РНКП (Gourse et al., 1998). Наоборот, наличие специфических взаимодействовий РНКП с участком дискриминатора в других промоторах, за счет аминокислотных остатков района 1.2 ст-субъединицы, приводит к стабилизации промоторных комплексов (Haugen et al., 2006). В случае РНКП бактерий из рода Thermus оптимальной для взаимодействия с РНКП последовательностью дискриминатора является идущая вслед за -10 элементом последовательность GGGA; РНКП Е. coli узнает сходную последовательность (Barinova et al., 2008; Feklistov et al., 2006; Haugen et al., 2006; Haugen et al., 2008).

Необходимо отметить, что слишком сильные взаимодействия РНКП с промотором при наличии нескольких консенсусных элементов делает невозможным эффективный переход от стадии инициации к стадии элонгации (Hsu, 2002). Поэтому ни один из известных промоторов не имеет полностью консенсусной последовательности. Как правило, в одном промоторе помимо -10 элемента (его присутствие является совершенно необходимым) присутствует либо дополнительный -35 элемент, либо динуклеотид TG. В последнем случае -10 элемент называется «удлиненным» и имеет консенсусную последовательность TGnTATAAT (где п - любой нуклеотидный остаток). Для

13

эффективного узнавания РНКП промоторов, содержащих удлиненный -10 элемент, не требуется наличия в нем последовательности -35 элемента (Kumar et al., 1993); примером таких промоторв может служить классический промотор ga/Pl.

Взаимодействие РНКП с промотором можно разделить на несколько стадий. Было получено большое количество биохимических данных о взаимодействии РНКП Е. coli с сильными модельными промоторами (lac\JV5, XPr, Т7А1) (Вис and McClure, 1985; Craig et al., 1998; Kovacic, 1987; Record et al., 1996; Saecker et al., 2002; Schickor et al., 1990). Ha основе этих данных была предложена кинетическая модель образования промоторного комплекса (deHaseth et al., 1998; Hatoum and Roberts, 2008; Saecker et al., 2011):

R + p RPC RP, 1-3 ^ RP0 ^ RPinit-► EC

Буквами R и P на схеме обозначены РНКП и промотор; RPc - закрытый комплекс (от RNA polymerase-Promoter Closed Complex); RPi -промежуточный комплекс (Intermediate Complex); RPo - открытый комплекс (Open Complex); RPinit - инициаторный комплекс, синтезирующий короткие абортивные РНК-продукты; ЕС - элонгационный комплекс (Elongation Complex). В закрытом промоторном комплексе одна из цепей ДНК взаимодействует с РНКП на участке от -55 до -5 позиций относительно стартовой точки транскрипции. Изомеризация закрытого комплекса в промежуточный является лимитирующей стадией всего процесса образования открытого комплекса (Craig et al., 1998; Saecker et al., 2002). На рисунке 1.2. показана схема изомеризации промоторного комплекса. RPb в свою очередь, подразделяется на несколько промежуточных комплексов, обозначаемых 11-3 (Saecker et al., 2011). И представляет собой комплекс с частично изогнутой ДНК, помещенной в клешню РНКП. II медленно переходит в комплекс 12, который содержит открытый транскрипционный пузырь около стартовой точки транскрипции. 12 быстро переходит в комплекс 13, при этом заканчивается загрузка расплавленных цепей ДНК в РНКП. Затем происходит схлопывание доменов clamp и jaw, при этом транскрипционный пузырь приобретает полностью расплавленную форму и начинается синтез РНК, знаменующий переход в RPinit. Но, как правило, РНКП не способна сразу перейти к элонгации и осуществляет процесс абортивного синтеза, когда синтезируемая короткая РНК диссоциирует из РНКП и синтез начинается заново.

Необходимо отметить, что для РНКП разных бактерий равновесие данных реакций может быть разным. Так, РНКП В. subtilis характеризуется крайне нестабильными открытыми промоторными комплексами на большинстве промоторов. Эти комплексы

=[ (А/Т) п — TTGÄC А UP -35

TGr TATAAT D TG -10

загрузка открывание позиционирование clamp и инициация ДНК IHK* jaw на переднем дуплексе синтеза РНК

RPC ^

быстро

медленно быстро

I, 12 +=*

медленно

NTP

fblCTpO Ч быстро

+=± RP0 RPinit

абс

^у^с ^УЯР

' Мо'-

> Uq"

Рисунок 1.2. Узнавание промоторов бактериальной РНКП и инициация синтеза РНК. (А) Схема взаимодействия холофермента РНКП с промоторными элементами. Показаны основные промоторные элементы в составе двуцепочечной ДНК, дискриминатора (О), а-субъединица РНКП изображена желтым, кор-фермент - синим цветом. Обозначены консервативные районы а-субъединицы и С-концевые домены а-субъединиц РНКП. Стартовая точка транскрипции обозначена стрелкой. (Б). Стадии изомеризации закрытого промоторного комплекса (ЯРс) в инициаторный (ЯРтк). Черным цветом обозначена матричная цепь ДНК, единичным штрихом на ней выделен +1 нуклеотид. Голубым цветом обозначена нематричная цепь ДНК, единичным штрихом на ней выделен -11 нуклеотид. РНК показана красным цветом. Элементы РНКП с1атр и jaw выделены розовым и пурпурным цветом, соответственно. Рисунок взят из (Баескег е1 а1., 2011).

находятся в равновесии с закрытыми промоторными комплексами, а те в свою очередь, со свободной РНКП и сигма-субъединицей (Artsimovitch et al., 2000). Также нестабильны промоторные комплексы, формируемые РНКП термофильных бактерий рода Thermus, особенно при субоптимальных температурах. РНКП Е. coli, напротив, образует на большинстве промоторов очень стабильные открытые комплексы, образование которых является практически необратимым. Однако такая стабильность открытых промоторных комплексов РНКП Е. coli затрудняет в процесс ухода фермента с промотора. Количество абортивных продуктов, синтезируемых на одном и том же промоторе РНКП Е. coli заметно выше того же показателя для РНКП Т. thermophilus. Недавно были обнаружены причины различной стабильности промоторных комплексов, формируемых РНКП Е. coli и

T. thermophilus, оказалось, что и кор-фермент, и сигма-субъединица вносят свой вклад в данные различия (Miropolskaya et al., 2012). В частности, было показано, что РНКП Е. coli взаимодействует с UP-элементом и передним дуплексом ДНК гораздо сильнее, чем РНКП Т. thermophilus (Mekler et al., 2012). Говоря о стабильности промоторных комплексов, нельзя не отметить тот факт, что РНКП Е. coli также может образовывать нестабильные комплексы на некоторых промоторах, в частности, промоторах оперонов генов рибосомальных РНК (Gourse et al., 1998), биосинтеза нуклеотидов (например, ругВГ), некоторых аминокислот, а также на промоторах генов некоторых тРНК (Donahue and Turnbough, 1990; Figueroa-Bossi et al., 1998; Pemberton et al., 2000). Все эти промоторы, как правило, довольно сильно отличаются от консенсусных последовательностей.

Инициация транскрипции регулируется малыми молекулами (алармоны ppGpp и pppGpp), регуляторными РНК (6 S РНК), белковыми факторами клеточного и фагового происхождения (главными регуляторами здесь являются альтернативные а-субъединицы и анти-а-факторы, а также транскрипционные активаторы и репрессоры). На стадии инициации помимо регуляции количества синтезируемой РНК с данного промотора возможна смена специфичности узнавания промоторов РНКП. Это достигается путем ингибирования главной а-субъединицы (Mitchell et al., 2007) и появлением альтернативных а-факторов. Так, 6S РНК ингибирует транскрипцию генов РНКП, содержащими а в стационарной фазе роста культуры^азэагтап and Storz, 2000), не действуя при этом на фермент, содержащий одну из альтернативных а-субъединиц (as) (Trotochaud and Wassarman, 2004). Говоря о функциях алармона ppGpp стоит упомянуть про регуляцию «строгого контроля» (stringent control, или stringent response) (Gourse et al., 1998; Potrykus and Cashel, 2008; Wagner, 2002), которая заключается в опосредованном ppGpp изменении уровня транскрипции генов в ответ на нехватку аминокислот в среде, причем уровень синтеза одних РНК повышается (опероны синтеза аминокислот), а других - понижается (рРНК и тРНК) (Chatterji et al., 1998; Hogg et al., 2004; Jores and Wagner, 2003; Paul et al., 2004b; Toulokhonov et al., 2001a). Также на стадию инициации, как правило, ингибирующее действие оказывают многие регуляторные белки бактериофагов, переключая транскрипцию с хозяйских генов на свои собственные (см. раздел 1.6).

1.3.2. Структура промоторного комплекса

В настоящее время точная структура всех промежуточных комплексов, формирующихся в ходе образования промоторного комплекса и переходе к элонгации транскрипции, неизвестна. Наиболее полно инициаторный комплекс описан со

структурной точки зрения в работе группы Р. Эбрайта (Zhang et al., 2012). В данной работе с достаточно высоким разрешением (3.0 и 2.9 А) были расшифрованы структуры комплекса холофермента РНКП Т. thermophilus с фрагментом промоторной ДНК, соответствующим по расплавленному транскрипционному пузырю и переднему ДНК-дуплексу. Основные структурные данные приведены на рисунке 1.3. Полученные данные свидетельствуют о наличии контактов сигма-субъединицы с нематричной цепью ДНК от -12 до -4 положений относительно точки старта транскрипции (в области -10 элемента и с 3'-конца от него). В полном согласии с имеющимися биохимическими данными о важности второго и шестого остатков -10 элемента (-11А и -7Т относительно старта транскрипции) (Shultzaberger et al., 2007), полученная структура демонстрирует, как азотистые основания этих нуклеотидых остатков помещаются в специальные карманы района 2.4 с-субъединицы (рисунок 1.3 А и Б). Следующая за -10 элементом последовательность, называемая дискриминатором, содержит остаток -6G, который также выворачивается в карман, образованный районом 1.2 ст-субъединицы. Кроме того, полученная структура РНКП показывает наличие прямых контактов между шестью нуклеотидами нематричной цепи ДНК (от -4 до +2 положений относительно старта транскрипции) и кор-ферментом, этот участок в составе нематричной цепи получил название CRE (core recognition element). С пятью из шести азотистых оснований CRE взаимодействуют аминокислотные остатки района fork-loop2 Р-субъединицы РНКП. Наиболее интересно, что взаимодействия с нуклеотидным остатком в +2 положении носят специфический характер. Остаток гуанина в этом положении (+2G) выворачивается в специальный карман Р-субъединицы РНКП, 6 аминокислотных остатков которого формируют Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия с +2G, а остатки D446 и R451 -водородные связи. По утверждению авторов (Zhang et al., 2012), гуанин в +2 положении относительно старта транскрипции узнается в 5 раз лучше, чем остальные нуклеотиды. Кроме того триптофан в 183-ем положении р-субъединицы формирует стэкинг-взаимо действия с тимином в +1 положении. Наличие сиквенс-специфических взаимодействий между нуклеотидом в нематричной цепи ДНК и кор-ферментом РНКП может играть важную роль не только на стадии инициации транскрипции, но и в процессе элонгации синтеза РНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Есюнина, Дарья Михайловна, 2013 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Alic, N., Ayoub, N., Landrieux, E., Favry, E., Baudouin-Cornu, P., Riva, M. and Carles, C., 2007. Selectivity and proofreading both contribute significantly to the fidelity of RNA polymerase III transcription. Proc Natl Acad Sci USA, 104(25): 10400-10405.

2. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Anthony, L., Burgess, R.R. and Landick, R., 2000. RNA polymerases from Bacillus subtilis and Escherichia coli differ in recognition of regulatory signals in vitro. J. Bacteriol., 182(21): 6027-6035.

3. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K.S. and Landick, R., 2003. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem., 278(14): 12344-12355.

4. Artsimovitch, I., Vassylyeva, M.N., Svetlov, D,, Svetlov, V., Perederina, A., Igarashi, N., Matsugaki, N., Wakatsuki, S., Tahirov, T.H. and Vassylyev, D.G., 2005. Allosteric modulation of the RNA polymerase catalytic reaction is an essential component of transcription control by rifamycins. Cell, 122(3): 351-363.

5. Awrey, D.E., Shimasaki, N., Koth, C., Weilbaecher, R., Olmsted, V., Kazanis, S., Shan, X., Arellano, J., Arrowsmith, C.H., Kane, C.M. and Edwards, A.M., 1998. Yeast transcript elongation factor (TFIIS), structure and function. II: RNA polymerase binding, transcript cleavage, and read-through. J Biol Chem, 273(35): 22595-22605.

6. Bailey, M.J., Hughes, C. and Koronakis, V., 1996. Increased distal gene transcription by the elongation factor RfaH, a specialized homologue of NusG. Mol Microbiol, 22(4): 729-737.

7. Bailey, M.J., Hughes, C. and Koronakis, V., 1997. RfaH and the ops element, components of a novel system controlling bacterial transcription elongation. Mol Microbiol, 26(5): 845-851.

8. Bailey, M.J., Hughes, C. and Koronakis, V., 2000. In vitro recruitment of the RfaH regulatory protein into a specialised transcription complex, directed by the nucleic acid ops element. Mol Gen Genet, 262(6): 1052-1059.

9. Bar-Nahum, G., Epshtein, V., Ruckenstein, A.E., Rafikov, R., Mustaev, A. and Nudler, E., 2005. A ratchet mechanism of transcription elongation and its control. Cell, 120(2): 183-193.

10. Bar-Nahum, G. and Nudler, E., 2001. Isolation and characterization of sigma(70)-retaining transcription elongation complexes from Escherichia coli. Cell, 106(4): 443-451.

11. Barik, S., Ghosh, B., Whalen, W., Lazinski, D. and Das, A., 1987. An antitermination protein engages the elongating transcription apparatus at a promoter-proximal recognition site. Cell, 50(6): 885-899.

12. Barinova, N., Kuznedelov, K., Severinov, K. and Kulbachinskiy, A., 2008. Structural modules of RNA polymerase required for transcription from promoters containing downstream basal promoter element GGGA. J Biol Chem, 283(33): 22482-22489.

13. Barne, K.A., Bown, J.A., Busby, S.J. and Minchin, S.D., 1997. Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended-10' motif at promoters. EMBO J, 16(13): 4034-4040.

14. Batada, N.N., Westover, K.D., Bushnell, D.A., Levitt, M. and Kornberg, R.D., 2004. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proc Natl Acad Sci USA, 101(50): 17361-17364.

15. Belogurov, G.A., Mooney, R.A., Svetlov, V., Landick, R. and Artsimovitch, I., 2009. Functional specialization of transcription elongation factors. EMBO J, 28(2): 112-122.

16. Belogurov, G.A., Vassylyeva, M.N., Sevostyanova, A., Appleman, J.R., Xiang, A.X., Lira, R., Webber, S.E., Klyuyev, S., Nudler, E., Artsimovitch, I. and Vassylyev, D.G., 2008. Transcription inactivation through local refolding of the RNA polymerase structure. Nature, 457(7227): 332-335.

17. Berdygulova, Z., Westblade, L.F., Florens, L., Koonin, E.V., Chait, B.T., Ramanculov, E., Washburn, M.P., Darst, S.A., Severinov, K. and Minakhin, L., 2011. Temporal regulation of gene expression of the Thermus thermophilus bacteriophage P23-45. J Mol Biol, 405(1): 125142.

18. Blank, A., Gallant, J.A., Burgess, R.R. and Loeb, L.A., 1986. An RNA polymerase mutant with reduced accuracy of chain elongation. Biochemistry, 25(20): 5920-5928.

19. Blankschien, M.D., Potrykus, K., Grace, E., Choudhary, A., Vinella, D., Cashel, M. and Herman, C., 2009. TraR, a homolog of a RNAP secondary channel interactor, modulates transcription. PLoS Genet, 5(1): el000345.

20. Borukhov, S., Polyakov, A., Nikiforov, V. and Goldfarb, A., 1992. GreA protein: a transcription elongation factor from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 89(19): 8899-8902.

21. Borukhov, S., Sagitov, V. and Goldfarb, A., 1993. Transcript cleavage factors from E. coli. Cell, 72(3): 459-466.

22. Brodolin, K., Zenkin, N., Mustaev, A., Mamaeva, D. and Heumann, H., 2004. The sigma 70 subunit of RNA polymerase induces lacUV5 promoter-proximal pausing of transcription. Nat Struct Mol Biol, 11(6): 551-557.

23. Brueckner, F. and Cramer, P., 2008. Structural basis of transcription inhibition by alpha-amanitin and implications for RNA polymerase II translocation. Nat Struct Mol Biol, 15(8): 811-818.

24. Brueckner, F., Ortiz, J. and Cramer, P., 2009. A movie of the RNA polymerase nucleotide addition cycle. Curr Opin Struct Biol, 19(3): 294-299.

25. Buc, H. and McClure, W.R., 1985. Kinetics of open complex formation between Escherichia coli RNA polymerase and the lac UV5 promoter. Evidence for a sequential mechanism involving three steps. Biochemistry, 24(11): 2712-2723.

26. Burmann, B.M., Knauer, S.H., Sevostyanova, A., Schweimer, K., Mooney, R.A., Landick, R., Artsimovitch, I. and Rosch, P., 2012. An alpha helix to beta barrel domain switch transforms the transcription factor RfaH into a translation factor. Cell, 150(2): 291-303.

27. Burmann, B.M., Schweimer, K., Luo, X., Wahl, M.C., Stitt, B.L., Gottesman, M.E. and Rosch, P., 2010. A NusE:NusG Complex Links Transcription and Translation. Science, 328: 501-504.

28. Bushnell, D.A., Cramer, P. and Kornberg, R.D., 2002. Structural basis of transcription: alpha-amanitin-RNA polymerase II cocrystal at 2.8 A resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 99(3): 1218-1222.

29. Callaci, S., Heyduk, E. and Heyduk, T., 1999. Core RNA polymerase from E. coli induces a major change in the domain arrangement of the sigma 70 subunit. Mol. Cell, 3(2): 229-238.

30. Campbell, E.A., Korzheva, N., Mustaev, A., Murakami, K., Nair, S., Goldfarb, A. and Darst, S.A., 2001. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial rna polymerase. Cell, 104(6): 901-912.

31. Campbell, E.A., Muzzin, O., Chlenov, M., Sun, J.L., Olson, C.A., Weinman, O., Trester-Zedlitz, M.L. and Darst, S.A., 2002. Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit. Mol Cell, 9(3): 527-539.

32. Campbell, E.A., Pavlova, O., Zenkin, N., Leon, F., Irschik, H., Jansen, R., Severinov, K. and Darst, S.A., 2005. Structural, functional, and genetic analysis of sorangicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Embo J, 24(4): 674-682.

33. Cardinale, C.J., Washburn, R.S., Tadigotla, V.R., Brown, L.M., Gottesman, M.E. and Nudler, E., 2008. Termination factor Rho and its cofactors NusA and NusG silence foreign DNA in E. coli. Science, 320(5878): 935-938.

34. Chakraborty, A., Wang, D., Ebright, Y.W., Korlann, Y., Kortkhonjia, E., Kim, T., Chowdhury, S., Wigneshweraraj, S., Irschik, H., Jansen, R., Nixon, B.T., Knight, J., Weiss, S. and Ebright, R.H., 2012. Opening and closing of the bacterial RNA polymerase clamp. Science, 337(6094): 591-595.

35. Chatterji, D., Fujita, N. and Ishihama, A., 1998. The mediator for stringent control, ppGpp, binds to the beta-subunit of Escherichia coli RNA polymerase. Genes Cells, 3(5): 279-287.

36. Cheung, A.C. and Cramer, P., 2011. Structural basis of RNA polymerase II backtracking, arrest and reactivation. Nature, 471(7337): 249-253.

37. Churchman, L.S. and Weissman, J.S., 2011. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature, 469(7330): 368-373.

38. Cohen, S.E. and Walker, G.C., 2010. The transcription elongation factor NusA is required for stress-induced mutagenesis in Escherichia coli. Curr Biol, 20(1): 80-85.

39. Craig, M.L., Tsodikov, O.V., McQuade, K.L., Schlax, P.E., Jr., Capp, M.W., Saecker, R.M. and Record, M.T., Jr., 1998. DNA footprints of the two kinetically significant intermediates in formation of an RNA polymerase-promoter open complex: evidence that interactions with start site and downstream DNA induce sequential conformational changes in polymerase and DNA. J. Mol. Biol., 283(4): 741-756.

40. Cramer, P., 2002. Multisubunit RNA polymerases. Curr Opin Struct Biol, 12(1): 89-97.

41. Cramer, P., Bushnell, D.A. and Kornberg, R.D., 2001. Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science, 292(5523): 1863-1876.

42. Damsma, G.E., Alt, A., Brueckner, F., Carell, T. and Cramer, P., 2007. Mechanism of transcriptional stalling at cisplatin-damaged DNA. Nat Struct Mol Biol, 14(12): 1127-1133.

43. deHaseth, P.L., Zupancic, M.L. and Record, M.T., Jr., 1998. RNA polymerase-promoter interactions: the comings and goings of RNA polymerase. J. Bacterid., 180(12): 3019-3025.

44. Deighan, P., Diez, C.M., Leibman, M., Hochschild, A. and Nickels, B.E., 2008. The bacteriophage lambda Q antiterminator protein contacts the beta-flap domain of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 105(40): 15305-15310.

45. Deighan, P., Pukhrambam, C., Nickels, B.E. and Hochschild, A., 2011. Initial transcribed region sequences influence the composition and functional properties of the bacterial elongation complex. Genes Dev, 25(1): 77-88.

46. Donahue, B.A., Yin, S., Taylor, J.S., Reines, D. and Hanawalt, P.C., 1994. Transcript cleavage by RNA polymerase II arrested by a cyclobutane pyrimidine dimer in the DNA template. Proc Natl Acad Sci USA, 91(18): 8502-8506.

47. Donahue, J.P. and Turnbough, C.L., Jr., 1990. Characterization of transcriptional initiation from promoters PI and P2 of the pyrBI operon of Escherichia coli K12. J Biol Chem, 265(31): 1909119099.

48. Doublie, S., Tabor, S., Long, A.M., Richardson, C.C. and Ellenberger, T., 1998. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution. Nature, 391(6664): 251258.

49. Dutta, D., Shatalin, K., Epshtein, V., Gottesman, M.E. and Nudler, E., 2011. Linking RNA polymerase backtracking to genome instability in E. coli. Cell, 146(4): 533-543.

50. Epshtein, V. and Nudler, E., 2003. Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation. Science, 300(5620): 801-805.

51. Erie, D.A., Hajiseyedjavadi, O., Young, M.C. and von Hippel, P.H., 1993. Multiple RNA polymerase conformations and GreA: control of the fidelity of transcription. Science, 262(5135): 867-873.

52. Erie, D.A. and Kennedy, S.R., 2009. Forks, pincers, and triggers: the tools for nucleotide incorporation and translocation in multi-subunit RNA polymerases. Curr Opin Struct Biol, 19(6): 708-714.

53. Feklistov, A., Barinova, N., Sevostyanova, A., Heyduk, E., Bass, I., Vvedenskaya, I., Kuznedelov, K., Merkiene, E., Stavrovskaya, E., Klimasauskas, S., Nikiforov, V., Heyduk, T., Severinov, K. and Kulbachinskiy, A., 2006. A basal promoter element recognized by free RNA polymerase sigma subunit determines promoter recognition by RNA polymerase holoenzyme. Mol. Cell, 23(1): 97-107.

54. Figueroa-Bossi, N., Guerin, M., Rahmouni, R., Leng, M. and Bossi, L., 1998. The supercoiling sensitivity of a bacterial tRNA promoter parallels its responsiveness to stringent control. EMBO J., 17(8): 2359-2367.

55. Fish, R.N. and Kane, C.M., 2002. Promoting elongation with transcript cleavage stimulatory factors. Biochim Biophys Acta, 1577(2): 287-307.

56. Foster, J.E., Holmes, S.F. and Erie, D.A., 2001. Allosteric binding of nucleoside triphosphates to RNA polymerase regulates transcription elongation. Cell, 106(2): 243-252.

57. Fouqueau, T., Zeller, M.E., Cheung, A.C., Cramer, P. and Thomm, M., 2013. The RNA polymerase trigger loop functions in all three phases of the transcription cycle. Nucleic Acids Res, 41(14): 7048-7059.

58. Furman, R., Tsodikov, O.V., Wolf, Y.I. and Artsimovitch, I., 2013. An insertion in the catalytic trigger loop gates the secondary channel of RNA polymerase. J Mol Biol, 425(1): 82-93.

59. Geiduschek, E.P., Nakamoto, T. and Weiss, S.B., 1961. The enzymatic synthesis of RNA: complementary interaction with DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 47: 1405-1415.

60. Gnatt, A.L., Cramer, P., Fu, J., Bushnell, D.A. and Kornberg, R.D., 2001. Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science, 292(5523): 1876-1882.

61.Goff, C.G., 1984. Coliphage-induced ADP-ribosylation of Escherichia coli RNA polymerase. Methods Enzymol, 106: 418-429.

62. Gong, X.Q., Zhang, C., Feig, M. and Burton, Z.F., 2005. Dynamic error correction and regulation of downstream bubble opening by human RNA polymerase II. Mol Cell, 18(4): 461470.

63. Gordon, A.J., Halliday, J.A., Blankschien, M.D., Burns, P.A., Yatagai, F. and Herman, C., 2009. Transcriptional infidelity promotes heritable phenotypic change in a bistable gene network. PLoS Biol, 7(2): e44.

64. Gourse, R.L., Gaal, T., Aiyar, S.E., Barker, M.M., Estrem, S.T., Hirvonen, C.A. and Ross, W., 1998. Strength and regulation without transcription factors: lessons from bacterial rRNA promoters. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology, 63: 131-139.

65. Gourse, R.L., Gaal, T., Bartlett, M.S., Appleman, J.A. and Ross, W., 1996. rRNA transcription and growth rate-dependent regulation of ribosome synthesis in Escherichia coli. Annu Rev Microbiol, 50: 645-677.

66. Guajardo, R. and Sousa, R., 1997. A model for the mechanism of polymerase translocation. J Mol Biol, 265(1): 8-19.

67. Gusarov, I. and Nudler, E., 1999. The mechanism of intrinsic transcription termination. Mol Cell, 3(4): 495-504.

68. Gusarov, I. and Nudler, E., 2001. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell, 107(4): 437-449.

69. Ha, K.S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D.G. and Landick, R., 2010. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J Mol Biol, 401(5): 708-725.

70. Hatoum, A. and Roberts, J., 2008. Prevalence of RNA polymerase stalling at Escherichia coli promoters after open complex formation. Mol Microbiol, 68(1): 17-28.

71. Haugen, S.P., Berkmen, M.B., Ross, W., Gaal, T., Ward, C. and Gourse, R.L., 2006. rRNA promoter regulation by nonoptimal binding of sigma region 1.2: an additional recognition element for RNA polymerase. Cell, 125(6): 1069-1082.

72. Haugen, S.P., Ross, W., Manrique, M. and Gourse, R.L., 2008. Fine structure of the promoter-sigma region 1.2 interaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(9): 3292-3297.

73. Hogan, B.P., Hartsch, T. and Erie, D.A., 2002. Transcript cleavage by Thermus thermophilus RNA polymerase. Effects of GreA and anti-GreA factors. J Biol Chem, 277(2): 967-975.

74. Hogg, T., Mechold, U., Malke, H., Cashel, M. and Hilgenfeld, R., 2004. Conformational antagonism between opposing active sites in a Afunctional RelA/SpoT homolog modulates (p)ppGpp metabolism during the stringent response [corrected]. Cell, 117(1): 57-68.

75. Holmes, S.F. and Erie, D.A., 2003. Downstream DNA sequence effects on transcription elongation. Allosteric binding of nucleoside triphosphates facilitates translocation via a ratchet motion. J Biol Chem, 278(37): 35597-35608.

76. Hsu, L.M., 2002. Promoter clearance and escape in prokaryotes. Biochim. Biophys. Acta, 1577(2): 191-207.

77. Hsu, L.M., Vo, N.V. and Chamberlin, M.J., 1995. Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB stimulate promoter escape and gene expression in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 92(25): 11588-11592.

78. Imashimizu, M., Oshima, T., Lubkowska, L. and Kashlev, M., 2013. Direct assessment of transcription fidelity by high-resolution RNA sequencing. Nucleic Acids Res, 41(19): 90909104.

79. Ishikawa, S., Oshima, T., Kurokawa, K., Kusuya, Y. and Ogasawara, N., 2010. RNA polymerase trafficking in Bacillus subtilis cells. J Bacteriol, 192(21): 5778-5787.

80. Izban, M.G. and Luse, D.S., 1992. The RNA polymerase II ternary complex cleaves the nascent transcript in a 3'—5' direction in the presence of elongation factor SII. Genes Dev, 6(7): 13421356.

81. James, E., Liu, M., Sheppard, C., Mekler, V., Camara, B., Liu, B., Simpson, P., Cota, E., Severinov, K., Matthews, S. and Wigneshweraraj, S., 2012. Structural and mechanistic basis for the inhibition of Escherichia coli RNA polymerase by T7 Gp2. Mol Cell, 47(5): 755-766.

82. Jeon, C. and Agarwal, K., 1996. Fidelity of RNA polymerase II transcription controlled by elongation factor TFIIS. Proc Natl Acad Sci USA, 93(24): 13677-13682.

83. Jeon, C., Yoon, H. and Agarwal, K., 1994. The transcription factor TFIIS zinc ribbon dipeptide Asp-Glu is critical for stimulation of elongation and RNA cleavage by RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sei USA, 91(19): 9106-9110.

84. Johnson, R.S., Strausbauch, M., Cooper, R. and Register, J.K., 2008. Rapid kinetic analysis of transcription elongation by Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol, 381(5): 1106-1113.

85. Jores, L. and Wagner, R., 2003. Essential steps in the ppGpp-dependent regulation of bacterial ribosomal RNA promoters can be explained by substrate competition. J Biol Chem, 278(19): 16834-16843.

86. Kaczanowska, M. and Ryden-Aulin, M., 2007. Ribosome biogenesis and the translation process in Escherichia coli. Microbiol Mol Biol Rev, 71(3): 477-494.

87. Kamiya, H., Suzuki, A., Yamaguchi, Y., Handa, H. and Harashima, H., 2009. Incorporation of 8-hydroxyguanosine (8-oxo-7,8-dihydroguanosine) 5-triphosphate by bacterial and human RNA polymerases. Free Radic Biol Med, 46(12): 1703-1707.

88. Kapanidis, A.N., Margeat, E., Ho, S.O., Kortkhonjia, E., Weiss, S. and Ebright, R.H., 2006. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science, 314(5802): 1144-1147.

89. Kaplan, C.D., Larsson, K.M. and Kornberg, R.D., 2008. The RNA polymerase II trigger loop functions in substrate selection and is directly targeted by alpha-amanitin. Mol Cell, 30(5): 547556.

90. Kashkina, E., Anikin, M., Brueckner, F., Pomerantz, R.T., McAllister, W.T., Cramer, P. and Temiakov, D., 2006. Template misalignment in multisubunit RNA polymerases and transcription fidelity. Mol Cell, 24(2): 257-266.

91. Kashlev, M., Nudler, E., Goldfarb, A., White, T. and Kutter, E., 1993. Bacteriophage T4 Ale protein: a transcription termination factor sensing local modification of DNA. Cell, 75(1): 147154.

92. Kennedy, S.R. and Erie, D.A., 2011. Templated nucleoside triphosphate binding to a noncatalytic site on RNA polymerase regulates transcription. Proc Natl Acad Sei USA, 108(15): 6079-6084.

93. Kettenberger, H., Armache, K.J. and Cramer, P., 2003. Architecture of the RNA polymerase II-TFIIS complex and implications for mRNA cleavage. Cell, 114(3): 347-357.

94. Kettenberger, H., Armache, K.J. and Cramer, P., 2004. Complete RNA polymerase II elongation complex structure and its interactions with NTP and TFIIS. Mol. Cell, 16(6): 955-965.

95. Kiefer, J.R., Mao, C., Braman, J.C. and Beese, L.S., 1998. Visualizing DNA replication in a catalytically active Bacillus DNA polymerase crystal. Nature, 391(6664): 304-307.

96. Kireeva, M., Kashlev, M. and Burton, Z.F., 2010. Translocation by multi-subunit RNA polymerases. Biochim Biophys Acta, 1799(5-6): 389-401.

97. Kireeva, M.L., Nedialkov, Y.A., Cremona, G.H., Purtov, Y.A., Lubkowska, L., Malagon, F., Burton, Z.F., Strathern, J.N. and Kashlev, M., 2008. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Mol Cell, 30(5): 557-566.

98. Komissarova, N. and Kashlev, M., 1997a. RNA polymerase switches between inactivated and activated states By translocating back and forth along the DNA and the RNA. J. Biol. Chem., 272(24): 15329-15338.

99. Komissarova, N. and Kashlev, M., 1997b. Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94(5): 1755-1760.

100. Korzheva, N., Mustaev, A., Kozlov, M., Malhotra, A., Nikiforov, V., Goldfarb, A. and Darst, S.A., 2000. A structural model of transcription elongation. Science, 289(5479): 619-625.

101. Koulich, D., Orlova, M., Malhotra, A., Sali, A., Darst, S.A. and Borukhov, S., 1997. Domain organization of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB. J Biol Chem, 272(11): 7201-7210.

102. Kovacic, R.T., 1987. The 0 degree C closed complexes between Escherichia coli RNA polymerase and two promoters, T7-A3 and lacUV5. J Biol Chem, 262(28): 13654-13661.

103. Koyama, H., Ito, T., Nakanishi, T., Kawamura, N. and Sekimizu, K., 2003. Transcription elongation factor S-II maintains transcriptional fidelity and confers oxidative stress resistance. Genes Cells, 8(10): 779-788.

104. Koyama, H., Ito, T., Nakanishi, T. and Sekimizu, K., 2007. Stimulation of RNA polymerase II transcript cleavage activity contributes to maintain transcriptional fidelity in yeast. Genes Cells, 12(5): 547-559.

105. Koyama, H., Ueda, T., Ito, T. and Sekimizu, K., 2010. Novel RNA polymerase II mutation suppresses transcriptional fidelity and oxidative stress sensitivity in rpb9Delta yeast. Genes Cells, 15(2): 151-159.

106. Krummel, B. and Chamberlin, M.J., 1992. Structural analysis of ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase. Deoxyribonuclease I footprinting of defined complexes. J Mol Biol, 225(2): 239-250.

107. Kulish, D., Lee, J., Lomakin, I., Nowicka, B., Das, A., Darst, S., Normet, K. and Borukhov, S., 2000. The functional role of basic patch, a structural element of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB. J Biol Chem, 275(17): 12789-12798.

108. Kumar, A., Malloch, R.A., Fujita, N., Smillie, D.A., Ishihama, A. and Hayward, R.S., 1993. The minus 35-recognition region of Escherichia coli sigma 70 is inessential for initiation of transcription at an "extended minus 10" promoter. J Mol Biol, 232(2): 406-418.

109. Kusuya, Y., Kurokawa, K., Ishikawa, S., Ogasawara, N. and Oshima, T., 2011. Transcription factor GreA contributes to resolving promoter-proximal pausing of RNA polymerase in Bacillus subtilis cells. J Bacteriol, 193(12): 3090-3099.

110. Kuznedelov, K., Korzheva, N., Mustaev, A. and Severinov, K., 2002a. Structure-based analysis of RNA polymerase function: the largest subunit's rudder contributes critically to elongation complex stability and is not involved in the maintenance of RNA-DNA hybrid length. EMBO J., 21(6): 1369-1378.

111. Kuznedelov, K., Minakhin, L., Niedziela-Majka, A., Dove, S.L., Rogulja, D., Nickels, B.E., Hochschild, A., Heyduk, T. and Severinov, K., 2002b. A role for interaction of the RNA polymerase flap domain with the sigma subunit in promoter recognition. Science, 295(5556): 855-857.

112. Laemmli, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259): 680-685.

113. Lamour, V., Rutherford, S.T., Kuznedelov, K., Ramagopal, U.A., Gourse, R.L., Severinov, K. and Darst, S.A., 2008. Crystal structure of Escherichia coli Rnk, a new RNA polymerase-interacting protein. J Mol Biol, 383(2): 367-379.

114. Landick, R., 2001. RNA polymerase clamps down. Cell, 105(5): 567-570.

115. Landick, R., 2005. NTP-entry routes in multi-subunit RNA polymerases. Trends Biochem Sci, 30(12): 651-654.

116. Lange, U. and Hausner, W., 2004. Transcriptional fidelity and proofreading in Archaea and implications for the mechanism of TFS-induced RNA cleavage. Mol Microbiol, 52(4): 11331143.

117. Laptenko, O., Kim, S.S., Lee, J., Starodubtseva, M:, Cava, F., Berenguer, J., Kong, X.P. and Borukhov, S., 2006. pH-dependent conformational switch activates the inhibitor of transcription elongation. Embo J, 25(10): 2131-2141.

118. Laptenko, O., Lee, J., Lomakin, I. and Borukhov, S., 2003. Transcript cleavage factors GreA and GreB act as transient catalytic components of RNA polymerase. EMBO J., 22(23): 6322-6334.

119. Lee, J.H., Lennon, C.W., Ross, W. and Gourse, R.L., 2012. Role of the coiled-coil tip of Escherichia coli DksA in promoter control. J Mol Biol, 416(4): 503-517.

120. Li, K., Jiang, T., Yu, B., Wang, L., Gao, C„ Ma, C., Xu, P. and Ma, Y., 2013. Escherichia coli transcription termination factor NusA: heat-induced oligomerization and chaperone activity. Sci Rep, 3:2347.

121. Magnusson, L.U., Gummesson, B., Joksimovic, P., Farewell, A. and Nystrom, T., 2007. Identical, independent, and opposing roles of ppGpp and DksA in Escherichia coli. J Bacteriol, 189(14): 5193-5202.

122. Malhotra, A., Severinova, E. and Darst, S.A., 1996. Crystal structure of a sigma 70 subunit fragment from E. coli RNA polymerase. Cell, 87(1): 127-136.

123. Malinen, A.M., Turtola, M., Parthiban, M., Vainonen, L., Johnson, M.S. and Belogurov, G.A., 2012, Active site opening and closure control translocation of multisubunit RNA polymerase. Nucleic Acids Res, 40(15): 7442-7451.

124. Marr, M.T. and Roberts, J.W., 2000. Function of transcription cleavage factors GreA and GreB at a regulatory pause site. Mol Cell, 6(6): 1275-1285.

125. Martinez-Rucobo, F.W., Sainsbury, S., Cheung, A.C. and Cramer, P., 2011. Architecture of the RNA polymerase-Spt4/5 complex and basis of universal transcription processivity. EMBO J, 30(7): 1302-1310.

126. Mekler, V., Minakhin, L., Kuznedelov, K., Mukhamedyarov, D. and Severinov, K., 2012. RNA polymerase-promoter interactions determining different stability of the Escherichia coli and Thermus aquaticus transcription initiation complexes. Nucleic Acids Res, 40(22): 1135211362.

127. Mekler, V., Minakhin, L., Sheppard, C., Wigneshweraraj, S. and Severinov, K., 2011a. Molecular mechanism of transcription inhibition by phage T7 gp2 protein. J Mol Biol, 413(5): 1016-1027.

128. Mekler, V., Pavlova, O. and Severinov, K., 2011b. Interaction of Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit with promoter elements in the context of free sigma70, RNA polymerase holoenzyme, and the beta'-sigma70 complex. J Biol Chem, 286(1): 270-279.

129. Minakhin, L., Goel, M., Berdygulova, Z., Ramanculov, E., Florens, L., Glazko, G., Karamychev, V.N., Slesarev, A.I., Kozyavkin, S.A., Khromov, I., Ackermann, H.W., Washburn, M., Mushegian, A. and Severinov, K., 2008. Genome comparison and proteomic characterization of Thermus thermophilus bacteriophages P23-45 and P74-26: siphoviruses with triplex-forming sequences and the longest known tails. J Mol Biol, 378(2): 468-480.

130. Minakhin, L., Niedziela-Majka, A., Kuznedelov, K., Adelman, K., Urbauer, J.L., Heyduk, T. and Severinov, K., 2003. Interaction of T4 AsiA with its target sites in the RNA polymerase sigma70 subunit leads to distinct and opposite effects on transcription. J Mol Biol, 326(3): 679-690.

131. Miropolskaya, N., Artsimovitch, I., Klimasauskas, S., Nikiforov, V. and Kulbachinskiy, A., 2009. Allosteric control of catalysis by the F loop of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A, 106(45): 18942-18947.

132. Miropolskaya, N., Ignatov, A., Bass, I., Zhilina, E., Pupov, D. and Kulbachinskiy, A., 2012. Distinct functions of regions 1.1 and 1.2 of RNA polymerase sigma subunits from Escherichia coli and Thermus aquaticus in transcription initiation. J Biol Chem, 287(28): 2377923789.

133. Miropolskaya, N., Nikiforov, V, Klimasauskas, S., Artsimovitch, I. and Kulbachinskiy, A., 2010. Modulation of RNA polymerase activity through trigger loop folding. Transcr, 1(2): 89-94.

134. Mitchell, J.E., Oshima, T., Piper, S.E., Webster, C.L., Westblade, L.F., Karimova, G., Ladant, D., Kolb, A., Hobman, J.L., Busby, S.J. and Lee, D.J., 2007. The Escherichia coli regulator of sigma 70 protein, Rsd, can up-regulate some stress-dependent promoters by sequestering sigma 70. Journal of bacteriology, 189(9): 3489-3495.

135. Mooney, R.A., Davis, S.E., Peters, J.M., Rowland, J.L., Ansari, A.Z. and Landick, R., 2009. Regulator trafficking on bacterial transcription units in vivo. Mol Cell, 33(1): 97-108.

136. Mukhopadhyay, J., Das, K., Ismail, S., Koppstein, D., Jang, M., Hudson, B., Sarafianos, S., Tuske, S., Patel, J., Jansen, R., Irschik, H., Arnold, E. and Ebright, R.H., 2008. The RNA polymerase "switch region" is a target for inhibitors. Cell, 135(2): 295-307.

137. Mukhopadhyay, J., Kapanidis, A.N., Mekler, V, Kortkhonjia, E., Ebright, Y.W. and Ebright, R.H., 2001. Translocation of sigma(70) with RNA polymerase during transcription: fluorescence resonance energy transfer assay for movement relative to DNA. Cell, 106(4): 453463.

138. Murakami, K.S., Masuda, S., Campbell, E.A., Muzzin, O. and Darst, S.A., 2002a. Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science, 296(5571): 1285-1290.

139. Murakami, K.S., Masuda, S. and Darst, S.A., 2002b. Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution. Science, 296(5571): 1280-1284.

140. Naryshkina, T., Kuznedelov, K. and Severinov, K., 2006. The role of the largest RNA polymerase subunit lid element in preventing the formation of extended RNA-DNA hybrid. J. Mol. Biol, 361(4): 634-643.

141. Nechaev, S, Imburgio, D. and Severinov, K, 2003. Purification and characterization of bacteriophage-encoded inhibitors of host RNA polymerase: T-odd phage gp2-like proteins. Methods Enzymol, 370: 212-225.

142. Nechaev, S, Kamali-Moghaddam, M, Andre, E., Leonetti, J.P. and Geiduschek, E.P, 2004. The bacteriophage T4 late-transcription coactivator gp33 binds the flap domain of Escherichia coli RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 101(50): 17365-17370.

143. Nechaev, S. and Severinov, K, 1999. Inhibition of Escherichia coli RNA polymerase by bacteriophage T7 gene 2 protein. J Mol Biol, 289(4): 815-826.

144. Nechaev, S. and Severinov, K., 2003. Bacteriophage-induced modifications of host RNA polymerase. Annu Rev Microbiol, 57: 301-322.

145. Nechaev, S, Yuzenkova, Y, Niedziela-Majka, A., Heyduk, T. and Severinov, K., 2002. A novel bacteriophage-encoded RNA polymerase binding protein inhibits transcription initiation and abolishes transcription termination by host RNA polymerase. J Mol Biol, 320(1): 11-22.

146. Nedialkov, Y.A., Gong, X.Q., Hovde, S.L., Yamaguchi, Y., Handa, H., Geiger, J.H., Yan, H. and Burton, Z.F., 2003. NTP-driven translocation by human RNA polymerase II. J Biol Chem, 278(20): 18303-18312.

147. Nickels, B.E., Mukhopadhyay, J., Garrity, S.J., Ebright, R.H. and Hochschild, A., 2004. The sigma 70 subunit of RNA polymerase mediates a promoter-proximal pause at the lac promoter. Nat Struct Mol Biol, 11(6): 544-550.

148. Nickels, B.E., Roberts, C.W., Sun, H., Roberts, J.W. and Hochschild, A., 2002. The sigma(70) subunit of RNA polymerase is contacted by the (lambda)Q antiterminator during early elongation. Mol Cell, 10(3): 611-622.

149. Nudler, E., 2012. RNA polymerase backtracking in gene regulation and genome instability. Cell, 149(7): 1438-1445.

150. Nudler, E., Kashlev, M., Nikiforov, V. and Goldfarb, A., 1995. Coupling between transcription termination and RNA polymerase inchworming. Cell, 81(3): 351-357.

151. Nudler, E., Mustaev, A., Lukhtanov, E. and Goldfarb, A., 1997. The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase. Cell, 89(1): 33-41.

152. Opalka, N., Chlenov, M., Chacon, P., Rice, W.J., Wriggers, W. and Darst, S.A., 2003. Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase. Cell, 114(3): 335-345.

153. Orlova, M., Newlands, J., Das, A., Goldfarb, A. and Borukhov, S., 1995. Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 92(10): 4596-4600.

154. Orsini, G., Ouhammouch, M., Le Caer, J.P. and Brody, E.N., 1993. The asiA gene of bacteriophage T4 codes for the anti-sigma 70 protein. J Bacteriol, 175(1): 85-93.

155. Ouhammouch, M., Orsini, G. and Brody, E.N., 1994. The asiA gene product of bacteriophage T4 is required for middle mode RNA synthesis. J Bacteriol, 176(13): 3956-3965.

156. Pande, S., Makela, A., Dove, S.L., Nickels, B.E., Hochschild, A. and Hinton, D.M., 2002. The bacteriophage T4 transcription activator MotA interacts with the far-C-terminal region of the sigma70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Bacteriol, 184(14): 3957-3964.

157. Park, J.S., Marr, M.T. and Roberts, J.W., 2002. E. coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation. Cell, 109(6): 757-767.

158. Pasman, Z. and von Hippel, P.H., 2000. Regulation of rho-dependent transcription termination by NusG is specific to the Escherichia coli elongation complex. Biochemistry, 39(18): 5573-5585.

159. Paul, B.J., Barker, M.M., Ross, W., Schneider, D.A., Webb, C., Foster, J.W. and Gourse, R.L., 2004a. DksA: a critical component of the transcription initiation machinery that potentiates the regulation of rRNA promoters by ppGpp and the initiating NTP. Cell, 118(3): 311-322.

160. Paul, B.J., Ross, W., Gaal, T. and Gourse, R.L., 2004b. rRNA transcription in Escherichia coli. Annu Rev Genet, 38: 749-770.

161. Pemberton, I.K., Muskhelishvili, G., Travers, A.A. and Buckle, M., 2000. The G+C-rich discriminator region of the tyrT promoter antagonises the formation of stable preinitiation complexes. J Mol Biol, 299(4): 859-864.

162. Perederina, A., Svetlov, V., Vassylyeva, M.N., Tahirov, T.H., Yokoyama, S., Artsimovitch, I. and Vassylyev, D.G., 2004. Regulation through the secondary channel-structural framework for ppGpp-DksA synergism during transcription. Cell, 118(3): 297-309.

163. Peters, J.M, Mooney, R.A, Grass, J.A, Jessen, E.D, Tran, F. and Landick, R, 2012. Rho and NusG suppress pervasive antisense transcription in Escherichia coli. Genes Dev, 26(23): 2621-2633.

164. Peters, J.M., Mooney, R.A, Kuan, P.F, Rowland, J.L, Keles, S. and Landick, R, 2009. Rho directs widespread termination of intragenic and stable RNA transcription. Proc Natl Acad SciUS A, 106(36): 15406-15411.

165. Pomerantz, R.T. and O'Donnell, M, 2010. Direct restart of a replication fork stalled by a head-on RNA polymerase. Science, 327(5965): 590-592.

166. Poteete, A.R, 2011. Recombination phenotypes of Escherichia coli greA mutants. BMC Mol Biol, 12: 12.

167. Potrykus, K. and Cashel, M, 2008. (p)ppGpp: still magical? Annu Rev Microbiol, 62: 35-51.

168. Potrykus, K, Murphy, H, Chen, X, Epstein, J.A. and Cashel, M, 2010. Imprecise transcription termination within Escherichia coli greA leader gives rise to an array of short transcripts, GraL. Nucleic Acids Res, 38(5): 1636-1651.

169. Proshkin, S, Rahmouni, A.R, Mironov, A. and Nudler, E, 2010. Cooperation between translating ribosomes and RNA polymerase in transcription elongation. Science, 328(5977): 504508.

170. Record, M.T, Jr., Reznikoff, W.S, Craig, M.L, McQuade, K.L. and Schlax, P.J, 1996. Escherichia coli RNA polymerase (Es70), promoters, and the kinetics of the steps of transcription initiation, Escherichia coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology, pp. 792-821.

171. Rees, W.A, Weitzel, S.E, Das, A. and von Hippel, P.H, 1997. Regulation of the elongation-termination decision at intrinsic terminators by antitermination protein N of phage lambda. J Mol Biol, 273(4): 797-813.

172. Reines, D, 1992. Elongation factor-dependent transcript shortening by template-engaged RNA polymerase II. J Biol Chem, 267(6): 3795-3800.

173. Reppas, N.B, Wade, J.T, Church, G.M. and Struhl, K, 2006. The transition between transcriptional initiation and elongation in E. coli is highly variable and often rate limiting. Mol Cell, 24(5): 747-757.

174. Revyakin, A, Liu, C, Ebright, R.H. and Strick, T.R, 2006. Abortive initiation and productive initiation by RNA polymerase involve DNA scrunching. Science, 314(5802): 11391143.

175. Richardson, J.P, 1996. Structural organization of transcription termination factor Rho. J Biol Chem, 271(3): 1251-1254.

176. Ring, B.Z, Yarnell, W.S. and Roberts, J.W, 1996. Function of E. coli RNA polymerase sigma factor sigma 70 in promoter-proximal pausing. Cell, 86(3): 485-493.

177. Roghanian, M, Yuzenkova, Y. and Zenkin, N, 2011. Controlled interplay between trigger loop and Gre factor in the RNA polymerase active centre. Nucleic Acids Res, 39(10): 4352-4359.

178. Ross, W, Vrentas, C.E, Sanchez-Vazquez, P, Gaal, T. and Gourse, R.L, 2013. The magic spot: a ppGpp binding site on E. coli RNA polymerase responsible for regulation of transcription initiation. Mol Cell, 50(3): 420-429.

179. Rozovskaia, T.A., Chenchik, A.A. and Bibilashvili, R., 1981. [Reaction of pyrophosphorolysis catalyzed by Escherichia coli RNA polymerase]. Mol Biol (Mosk), 15(3): 636-652.

180. Rozovskaya, T.A., Rechinsky, V.O., Bibilashvili, R.S., Karpeisky, M., Tarusova, N.B., Khomutov, R.M. and Dixon, H.B., 1984. The mechanism of pyrophosphorolysis of RNA by RNA polymerase. Endowment of RNA polymerase with artificial exonuclease activity. Biochem J, 224(2): 645-650.

181. Rudd, M.D., Izban, M.G. and Luse, D.S., 1994. The active site of RNA polymerase II participates in transcript cleavage within arrested ternary complexes. Proc Natl Acad Sci USA, 91(17): 8057-8061.

182. Rutherford, S.T., Lemke, J.J., Vrentas, C.E., Gaal, T., Ross, W. and Gourse, R.L., 2007. Effects of DksA, GreA, and GreB on transcription initiation: insights into the mechanisms of factors that bind in the secondary channel of RNA polymerase. J Mol Biol, 366(4): 1243-1257.

183. Saecker, R.M., Record, M.T., Jr. and Dehaseth, P.L., 2011. Mechanism of bacterial transcription initiation: RNA polymerase - promoter binding, isomerization to initiation-competent open complexes, and initiation of RNA synthesis. J Mol Biol, 412(5): 754-771.

184. Saecker, R.M., Tsodikov, O.V., McQuade, K.L., Schlax, P.E., Jr., Capp, M.W. and Record, M.T., Jr., 2002. Kinetic studies and structural models of the association of E. coli sigma(70) RNA polymerase with the lambdaP(R) promoter: large scale conformational changes in forming the kinetically significant intermediates. J. Mol. Biol., 319(3): 649-671.

185. Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989. Molecular cloning: Cold spring harbor press.

186. Sambrook, F., Maniatis, 1989. Molecular cloning. Cold spring harbor press.

187. Santangelo, T.J. and Artsimovitch, I., 2011. Termination and antitermination: RNA polymerase runs a stop sign. Nat Rev Microbiol, 9(5): 319-329.

188. Schickor, P., Metzger, W., Werel, W., Lederer, H. and Heumann, H., 1990. Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli. Embo J, 9(7): 2215-2220.

189. Schwartz, E.C., Shekhtman, A., Dutta, K., Pratt, M.R., Cowburn, D„ Darst, S. and Muir, T.W., 2008. A full-length group 1 bacterial sigma factor adopts a compact structure incompatible with DNA binding. Chem Biol, 15(10): 1091-1103.

190. Sevostyanova, A. and Artsimovitch, I., 2010. Functional analysis of Thermus thermophilus transcription factor NusG. Nucleic Acids Res, 38(21): 7432-7445.

191. Shankar, S., Hatoum, A. and Roberts, J.W., 2007. A transcription antiterminator constructs a NusA-dependent shield to the emerging transcript. Mol Cell, 27(6): 914-927.

192. Shultzaberger, R.K., Chen, Z., Lewis, K.A. and Schneider, T.D., 2007. Anatomy of Escherichia coli sigma70 promoters. Nucleic Acids Res, 35(3): 771-788.

193. Sigurdsson, S., Dirac-Svejstrap, A.B. and Svejstrup, J.Q., 2010. Evidence that transcript cleavage is essential for RNA polymerase II transcription and cell viability. Mol Cell, 38(2): 202-210.

194. Sosunov, V., Sosunova, E., Mustaev, A., Bass, I., Nikiforov, V. and Goldfarb, A., 2003. Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J, 22(9): 2234-2244.

195. Sosunov, V., Zorov, S., Sosunova, E., Nikolaev, A., Zakeyeva, I., Bass, I., Goldfarb, A., Nikiforov, V., Severinov, K. and Mustaev, A., 2005. The involvement of the aspartate triad of the active center in all catalytic activities of multisubunit RNA polymerase. Nucleic Acids Res, 33(13): 4202-4211.

196. Sosunova, E, Sosunov, V, Epshtein, V, Nikiforov, V. and Mustaev, A, 2013. Control of transcriptional fidelity by active center tuning as derived from RNA polymerase endonuclease reaction. J Biol Chem, 288(9): 6688-6703.

197. Sosunova, E, Sosunov, V, Kozlov, M, Nikiforov, V, Goldfarb, A. and Mustaev, A, 2003a. Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(26): 15469-15474.

198. Sosunova, E, Sosunov, V, Kozlov, M, Nikiforov, V, Goldfarb, A. and Mustaev, A, 2003b. Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc Natl Acad Sci USA, 100(26): 15469-15474.

199. Stebbins, C.E, Borukhov, S, Orlova, M, Polyakov, A., Goldfarb, A. and Darst, S.A, 1995. Crystal structure of the Gre A transcript cleavage factor from Escherichia coli. Nature, 373(6515): 636-640.

200. Steinberg, T.H. and Burgess, R.R, 1992. Tagetitoxin inhibition of RNA polymerase III transcription results from enhanced pausing at discrete sites and is template-dependent. J Biol Chem, 267(28): 20204-20211.

201. Steitz, T.A, 1998. A mechanism for all polymerases. Nature, 391(6664): 231-232.

202. Stepanova, E, Lee, J, Ozerova, M, Semenova, E, Datsenko, K, Wanner, B.L., Severinov, K. and Borukhov, S, 2007. Analysis of promoter targets for Escherichia coli transcription elongation factor GreA in vivo and in vitro. J Bacteriol, 189(24): 8772-8785.

203. Stepanova, E.V, Shevelev, A.B, Borukhov, S.I. and Severinov, K.V., 2009. [Mechanisms of action of RNA polymerase-binding transcription factors that do not bind to DNA]. Biofizika, 54(5): 773-790.

204. Stevens, A. and Henry, J, 1964. Studies on the Ribonucleic Acid Polymerase from Escherichia Coli. I. Purification of the Enzyme and Studies of Ribonucleic Acid Formation. J Biol Chem, 239: 196-203.

205. Surratt, C.K, Milan, S.C. and Chamberlin, M.J, 1991. Spontaneous cleavage of RNA in ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase and its significance for the mechanism of transcription. Proc Natl Acad Sci USA, 88(18): 7983-7987.

206. Svetlov, V. and Nudler, E, 2009. Macromolecular micromovements: how RNA polymerase translocates. Curr Opin Struct Biol, 19(6): 701-707.

207. Svetlov, V. and Nudler, E, 2011. Clamping the clamp of RNA polymerase. EMBO J, 30(7): 1190-1191.

208. Svetlov, V, Vassylyev, D.G. and Artsimovitch, I, 2004. Discrimination against deoxyribonucleotide substrates by bacterial RNA polymerase. J. Biol. Chem, 279(37): 3808738090.

209. Sydow, J.F, Brueckner, F., Cheung, A.C, Damsma, G.E, Dengl, S, Lehmann, E, Vassylyev, D. and Cramer, P, 2009. Structural basis of transcription: mismatch-specific fidelity mechanisms and paused RNA polymerase II with frayed RNA. Mol Cell, 34(6): 710-721.

210. Sydow, J.F. and Cramer, P, 2009. RNA polymerase fidelity and transcriptional proofreading. Curr Opin Struct Biol, 19(6): 732-739.

211. Symersky, J, Perederina, A, Vassylyeva, M.N, Svetlov, V, Artsimovitch, I. and Vassylyev, D.G, 2006. Regulation through the RNA polymerase secondary channel. Structural and functional variability of the coiled-coil transcription factors. J Biol Chem, 281(3): 13091312.

212. Taddei, F., Hayakawa, H., Bouton, M., Cirinesi, A., Matic, I., Sekiguchi, M. and Radman, M., 1997. Counteraction by MutT protein of transcriptional errors caused by oxidative damage. Science, 278(5335): 128-130.

213. Tadigotla, V.R., D, O.M., Sengupta, A.M., Epshtein, V., Ebright, R.H., Nudler, E. and Ruckenstein, A.E., 2006. Thermodynamic and kinetic modeling of transcriptional pausing. Proc Natl Acad Sci USA, 103(12): 4439-4444.

214. Tagami, S., Sekine, S., Kumarevel, T., Hino, N., Murayama, Y., Kamegamori, S., Yamamoto, M., Sakamoto, K. and Yokoyama, S., 2010a. Crystal structure of bacterial RNA polymerase bound with a transcription inhibitor protein. Nature, 468(7326): 978-982.

215. Tagami, S., Sekine, S., Kumarevel, T., Yamamoto, M. and Yokoyama, S., 2010b. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of Thermus thermophilus transcription elongation complex bound to Gfhl. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 66(Pt 1): 64-68.

216. Temiakov, D., Patlan, V., Anikin, M., McAllister, W.T., Yokoyama, S. and Vassylyev,

D.G., 2004. Structural basis for substrate selection by t7 RNA polymerase. Cell, 116(3): 381391.

217. Temiakov, D., Zenkin, N., Vassylyeva, M.N., Perederina, A., Tahirov, T.H., Kashkina,

E., Savkina, M., Zorov, S., Nikiforov, V., Igarashi, N., Matsugaki, N., Wakatsuki, S., Severinov, K. and Vassylyev, D.G., 2005. Structural basis of transcription inhibition by antibiotic streptolydigin. Mol. Cell, 19(5): 655-666.

218. Thomas, M.J., Platas, A.A. and Hawley, D.K., 1998. Transcriptional fidelity and proofreading by RNA polymerase II. Cell, 93(4): 627-637.

219. Toulokhonov, II, Shulgina, I. and Hernandez, V.J., 2001a. Binding of the transcription effector ppGpp to Escherichia coli RNA polymerase is allosteric, modular, and occurs near the N terminus of the beta'-subunit. J Biol Chem, 276(2): 1220-1225.

220. Toulokhonov, I., Artsimovitch, I. and Landick, R., 2001b. Allosteric control of RNA polymerase by a site that contacts nascent RNA hairpins. Science, 292(5517): 730-733.

221. Toulokhonov, I., Zhang, J., Palangat, M. and Landick, R., 2007. A central role of the RNA polymerase trigger loop in active-site rearrangement during transcriptional pausing. Mol Cell, 27(3): 406-419.

222. Travers, A. A., 1980. Promoter sequence for stringent control of bacterial ribonucleic acid synthesis. J. Bacterid., 141(2): 973-976.

223. Trotochaud, A.E. and Wassarman, K.M., 2004. 6S RNA function enhances long-term cell survival. J Bacteriol, 186(15): 4978-4985.

224. Tuske, S., Sarafianos, S.G., Wang, X., Hudson, B., Sineva, E., Mukhopadhyay, J., Birktoft, J.J., Leroy, O., Ismail, S., Clark, A.D., Jr., Dharia, C., Napoli, A., Laptenko, O., Lee, J., Borukhov, S., Ebright, R.H. and Arnold, E., 2005. Inhibition of bacterial RNA polymerase by streptolydigin: stabilization of a straight-bridge-helix active-center conformation. Cell, 122(4): 541-552.

225. Twist, K.A., Campbell, E.A., Deighan, P., Nechaev, S., Jain, V., Geiduschek, E.P., Hochschild, A. and Darst, S.A., 2011. Crystal structure of the bacteriophage T4 late-transcription coactivator gp33 with the beta-subunit flap domain of Escherichia coli RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 108(50): 19961-19966.

226. Vassylyev, D.G., Sekine, S., Laptenko, O., Lee, J., Vassylyeva, M.N., Borukhov, S. and Yokoyama, S., 2002. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature, 417(6890): 712-719.

227. Vassylyev, D.G, Svetlov, V., Vassylyeva, M.N, Perederina, A, Igarashi, N, Matsugaki, N, Wakatsuki, S. and Artsimovitch, I, 2005. Structural basis for transcription inhibition by tagetitoxin. Nat Struct Mol Biol, 12(12): 1086-1093.

228. Vassylyev, D.G, Vassylyeva, M.N, Perederina, A, Tahirov, T.H. and Artsimovitch, I, 2007a. Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase. Nature, 448(7150): 157-162.

229. Vassylyev, D.G, Vassylyeva, M.N, Zhang, J, Palangat, M, Artsimovitch, I. and Landick, R, 2007b. Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase. Nature, 448(7150): 163-168.

230. Vassylyeva, M.N, Svetlov, V, Dearborn, A.D, Klyuyev, S, Artsimovitch, I. and Vassylyev, D.G, 2007. The carboxy-terminal coiled-coil of the RNA polymerase beta'-subunit is the main binding site for Gre factors. EMBO Rep, 8(11): 1038-1043.

231. Wagner, R, 2002. Regulation of ribosomal RNA synthesis in E. coli: effects of the global regulator guanosine tetraphosphate (ppGpp). J Mol Microbiol Biotechnol, 4(3): 331-340.

232. Walmacq, C, Kireeva, M.L, Irvin, J, Nedialkov, Y, Lubkowska, L, Malagon, F, Strathern, J.N. and Kashlev, M, 2009. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. J Biol Chem, 284(29): 19601-19612.

233. Wang, D, Bushnell, D.A, Huang, X, Westover, K.D, Levitt, M. and Kornberg, R.D, 2009. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science, 324(5931): 1203-1206.

234. Wang, D, Bushnell, D.A, Westover, K.D, Kaplan, C.D. and Kornberg, R.D., 2006, Structural basis of transcription: role of the trigger loop in substrate specificity and catalysis. Cell, 127(5): 941-954.

235. Wang, D. and Hawley, D.K, 1993. Identification of a 3'—>5' exonuclease activity associated with human RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci USA, 90(3): 843-847.

236. Washburn, R.S. and Gottesman, M.E, 2011. Transcription termination maintains chromosome integrity. Proc Natl Acad Sci USA, 108(2): 792-797.

237. Wassarman, K.M. and Storz, G, 2000. 6S RNA regulates E. coli RNA polymerase activity. Cell, 101(6): 613-623.

238. Weilbaecher, R.G, Awrey, D.E, Edwards, A.M. and Kane, C.M, 2003. Intrinsic transcript cleavage in yeast RNA polymerase II elongation complexes. J Biol Chem, 278(26): 24189-24199.

239. Werner, F, 2012. A nexus for gene expression-molecular mechanisms of Spt5 and NusG in the three domains of life. J Mol Biol, 417(1-2): 13-27.

240. Westover, K.D., Bushnell, D.A. and Kornberg, R.D, 2004. Structural basis of transcription: nucleotide selection by rotation in the RNA polymerase II active center. Cell, 119(4): 481-489.

241. Yu, M.X, Slater, M.R. and Ackermann, H.W, 2006. Isolation and characterization of Thermus bacteriophages. Arch Virol, 151(4): 663-679.

242. Yuan, A.H, Nickels, B.E. and Hochschild, A, 2009. The bacteriophage T4 AsiA protein contacts the beta-flap domain of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 106(16): 65976602.

243. Yuzenkova, Y, Roghanian, M, Bochkareva, A. and Zenkin, N, 2013. Tagetitoxin inhibits transcription by stabilizing pre-translocated state of the elongation complex. Nucleic Acids Res, 41(20): 9257-9265.

244. Yuzenkova, Y. and Zenkin, N, 2010. Central role of the RNA polymerase trigger loop in intrinsic RNA hydrolysis. Proc Natl Acad Sci USA, 107(24): 10878-10883.

245. Yuzenkova, Y, Zenkin, N. and Severinov, K, 2008. Mapping of RNA polymerase residues that interact with bacteriophage XplO transcription antitermination factor p7. J Mol Biol, 375(1): 29-35.

246. Zakharova, N, Bass, I, Arsenieva, E, Nikiforov, V. and Severinov, K, 1998. Mutations in and monoclonal antibody binding to evolutionary hypervariable region of Escherichia coli RNA polymerase beta' subunit inhibit transcript cleavage and transcript elongation. J Biol Chem, 273(38): 24912-24920.

247. Zaychikov, E., Martin, E, Denissova, L, Kozlov, M, Markovtsov, V, Kashlev, M, Heumann, H., Nikiforov, V, Goldfarb, A. and Mustaev, A, 1996. Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science, 273(5271): 107-109.

248. Zenkin, N, Naryshkina, T, Kuznedelov, K. and Severinov, K, 2006a. The mechanism of DNA replication primer synthesis by RNA polymerase. Nature, 439(7076): 617-620.

249. Zenkin, N, Yuzenkova, Y. and Severinov, K, 2006b. Transcript-assisted transcriptional proofreading. Science, 313(5786): 518-520.

250. Zhang, G., Campbell, E.A, Minakhin, L, Richter, C, Severinov, K. and Darst, S.A, 1999. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell, 98(6): 811-824.

251. Zhang, J, Palangat, M. and Landick, R, 2010. Role of the RNA polymerase trigger loop in catalysis and pausing. Nat Struct Mol Biol, 17(1): 99-104.

252. Zhang, Y„ Feng, Y, Chatterjee, S, Tuske, S„ Но, M.X., Arnold, E. and Ebright, R.H., 2012. Structural basis of transcription initiation. Science, 338(6110): 1076-1080.

253. Zuo, Y., Wang, Y. and Steitz, T.A., 2013. The mechanism of E. coli RNA polymerase regulation by ppGpp is suggested by the structure of their complex. Mol Cell, 50(3): 430-436.

254. Лаптенко O.A., Борухов С.И. , 2000. Gre-гомологичные факторы транскрипции GreA-1 и GreA-2 из Thermus thermophilus: клонирование, очистка и анализ функциональной активности. Биологический вестник, 4(1-2): 3-14.

255. Пупов, Д.В., Баринова, Н.А. и Кульбачинский, А.В., 2008. Анализ РНК-расщепляющей активности РНК-полимераз Е. coli и D. radiodurans. Биохимия, 73: 903 -908.

256. Пупов, Д.В. и Кульбачинский, А.В., 2010. Структурная динамика активного центра многосубъединичных РНК-полимераз в процессе синтеза и редактирования РНК. Молекулярная биология, 44: 573-590.

ВЕКТОРЫ, КОДИРУЮЩИЕ РНКП

His6

rpoZ

ampR

rpoZ

rpoC

rpoB

ampR

rpoC

laclQ

rpoA

rpoB

His6

f1 origin

ori

Kan

\

pET 28ABCZ 15108 п.н.

His6

(А) Плазмида pVSlO. Данная плазмида кодирует все гены РНКП Е. coli, His6 на С-конце гена rpoC, кодирующем ß'-субъединицу. Для экспрессии РНКП с мутантной ß'-субъединицей. (Б) Плазмида р1А679МХ. Данная плазмида кодирует все гены РНКП Е. coli, His6 на N-конце гена rpoB, кодирующем ß-субъединицу. Для экспрессии РНКП с мутантной ß-субъединицей. (В) Плазмида рЕТ 28 ABCZ Dra. Данная плазмида кодирует все гены РНКП D. radiodurans, His6 на С-конце гена rpoC, кодирующем ß'-субъединицу. Для экспрессии РНКП D. radiodurans в клетках Е. coli. Везде отмечены длины плазмид и гены, закодированные в них.

ПРОМОТОРНЫЕ И ТЕРМИНАТОРНЫЕ ФРАГМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В РАБОТЕ

Промоторы:

Т7А1 (без Т 20-мер подчеркнут, при использовании праймера АрИ)

С АОТС ААТТСТАТТТСОАТСС АОАТСССОААААТТТАТС АА АААОАСТА ЩШШ ТА

ААОТСТААССТАТАСОАТАСТТАСАОССАТСОАОАОООАСАСООСОААТАО ХРя (без С 26-мер подчеркнут)

соттааатстатсассосааоооатааататстаасассотосото^^ИАТТТТ

АССТСТООСООТ^^^ИООТТССАТОТАОТААООАООТТОТАТООААОАССАТСА

Са1?\ (без Т 20-мер подчеркнут, при использовании праймера Ари)

тотсасасттттсосатсттттттаИСТАТАА1ТАТТТСАТСОАОАОООАСАСООСО

ААТАв

Серым цветом отмечен старт транскрипции (+1), красным цветом обозначен -10 элемент, синим -35 элемент.

Терминатор:

оссатсссаатсоасассоооотссоооатстсоатстооатсостаатаасаоос стостоотаатсосаоосстттт|атттооатсс

желтым отмечены фрагменты шпильки, сиреневым - место терминации

ВЫРАВНИВАНИЯ

Taq 1228

Tth 1228

Dra 1245

Eco 922

See 1071

<-----G-петля------>

sigepgtqlt|rtfH|

HBr/GTDITQGLPRVIELFE

....................GAA..............

..................I.G.G.. .M..........

...............I. .A.SRA. . .G.....ad. . .

.....a. .m.ln. ..fa.. .sk-kv.s.v. .lk.iln

Выравнивание G-петли и окружающих элементов РНКП Т. aquaticus, Т. thermophilus, D. radiodurans, Е. coli, S. cerevisiae. Красным цветом отмечены наиболее неконсервативные аминокислоты. Голубым отмечены аминокислоты, верхушка двух а-спиралей, зеленым -аминокислоты, наиболее важные для катализа. Красной точкой отмечено место вставки SD-петли, рисунок взят из (Miropolskaya et al., 2009).

Р ' F - спираль Eco 783 ARKG§ADT Dra 1099____

p-1

Eco 565 TPEGfUIGL Dra 494 ____|____

lid

Taq lrpmvqvdggrfats

Dra ...............

Eco

rudder

I

Taq i"jkgrrgspvtxpgserpläs:

Dra ...............D.S....

Eco l..a...rai.gsxk-...к.,

i

Taq QVIQLWTETTEKVTQAVFKNF------------EENYPFNPLYVKAQSGARGNPQOIROL

Dra . .V. . .HH. .DA.KS. . .E. .------------SK.......WI.S............

Eco К. . Ol. AAANDR. SK .№D. LQTETVINRDGQE .KQVS . .SI.K. .D.....SAA.....

.....AR.D.S.I...1.

.....X. .o.sii.T.n

ВИ

ШЛ

1SSHGARKGGADTALRTADSCYLTRKL'

,.*......L. ....*. .*

HHH^BlE I WREADCGT7NY I SVFLFQMDEVTR' ,V. . .DV. . .S.DSTVM. .GAT. . P. G ......*. . JqDL. .T.D. . . .KEG.MMTPVIEGGDV-

T

Выравнивание различных элементов РНКП Т. aquaticus, D. radiodurans, E. coli. Красным цветом отмечена F-петля, сиреневым — F-спираль. Места замен показаны стрелками либо выделенными цветом буквами. Нумерация а.к. приведена в материалах и методах. Рисунок частично взят из (Miropolskaya et al., 2010).

flap Tth flap Eco

SIHIERYEIE ARDTKLGPER ilß^MiiSEL^L.^^RBEG VVRIGAEVKP -IHIQELACV SRDTKLGPEE ITADIPNVGE AALSKLDESG IVYIGAEVTG

GDILVGRTSF KGESEPTPEE RLLRSIFGEK ARDVKDTSLR VPPGEGGIVV GDILVGKVTP KGETQLTPEE KLLRAIFGEK ASDVKDSSLR VPNGVSGTVI

RT------------------------------------------------

DVQVFTRDGV EKDKRALEIE EMQLKQAKKD LSEELQILEA GLFSRIRAVL

VAGGVEAEKL DKLPRDRWLE LGLTDEEKQN QLEQLAEQYD ELKHEFEKKL

-VRLRRGDPG VELKPGVREV VRVYVAQKRK L EAKRRKITQG DDLAPGVLKI VKVYLAVKRR I

Выравнивание flap элемента РНКП Т. thermophilus (а.к. 702-833) и E. coli (а.к. 831-1060). Серым цветом выделен участок 723-740, подчеркнут аспартат 725. Длинная вставка в flap Е. coli - SO-петля.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ, И СТАДИИ КЛОНИРОВАНИЯ

Подчеркнуты места рестрнктных сайтов, обозначенные в названии праймера или соответствующие внесенные мутации, дополнительные пояснения внесены по необходимости.

Название плазмиды использованные праймеры стадии

р1А679МХ Р567А ЕВ Р567А-(1 5'- ОСОТАТОТССААТТОАААССССТОААООТОСОАА САТСО-З' ЕВБрЕ-г 5'-ООАОАОСОСАОСТТСАСССАСО-3' 1. ПЦР: ЕВ Р567А-с1 + ЕВзрЕ-г на матрице р1А545 2. клонирование ПЦР-продукта в гроВ в р1А545 по МГе1/ВзрЕ1 3. клонирование мутантного гена гроВ в р1А679 по Мсо1/8ЬЯ

рУ810Ь7830 ЕБаН-г 5' -ОТСООТОТС АС ААОАТАС-3' ЕС Ь7830-(1 5'-ОСТСГСАААООТООООСООАТАССОС -3' ЕВзЮМ 5 '-ОАССАОАТСАТОТАСАССООСТТСО -3' 1. ПЦР1: ЕС Ь7830-с1 + ЕБа1-г на матрице рЕТ29 гроС 2. ПЦР2: ПЦР1 + ЕВб^-С! 3. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ29 гроС по БаИ/ВвгО! 4. клонирование мутантного гена гроС в рУБ 10 по 8ас11/8Ы1

рУБЮСЮга ЕС_ТЬ1ейпеШе1813-г 5'- 1. ПЦР 1: ЕС_ ТЫеМвЫОе^В-г + Е8асИ-с1 на матрице рУ814 (плазмида рУ810 с делецией 813-

GAACAGTTCTATAACGCGCGGCAGACCCATGGT GATGTCCCCACCACCTGCCATACCACCGGTGTG GAACG-3' петли и заменой 3 окружающих делецию а.к., предоставлена И. Арцимович ) 2. ПЦР2: ПЦР1 + Е8а11-г 3. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ29 гроС по БаИ/БасИ 4. клонирование мутантного гена гроС в рУБЮ по БасИ/ЗЬЯ

pVSlO ÄSI3 EC_TLdelSI3WT-r 5'-CGGTGATGTCCGCTCGAGATGCCGC AC-3' (подчеркнуто место стыковки правой и левой частей) 1. ПЦР1: EC_TLdelSIЗ WT-г + ЕБасН^ на матрице рУ814 (плазмида рУБЮ с делецией 813-петли и заменой 3 окружающих делецию а.к., предоставлена И. Арцимович ) 2. ПЦР2: ПЦР1 + Е8а11-г 3. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ29 гроС по 8а11/8ас11 4. клонирование мутантного гена гроС в рУ810 по БасП/вЬЯ

pVSlO G1136M ASI3 EC-G1136М-г 5'-GGCAGACCCATGGTGATGTC-3' 1. ПЦР1: ЕС-01136М-г + ЕвасП-ё на матрице рУ810 А813 2. ПЦР2: ПЦР1 + Е8а11-г 3. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ29 гроС по БаШвасП 4. клонирование мутантного гена гроС в рУ810 по 8ас11/8ЬП

pVSlO 1937T ASI3 EC_I937TdelSI3_r 5'- GGTGATGTCCGCTCGAGATGCCGCACCACCGGT GTGGA -3' ESall-r 5'-GTCGGTGTCАСAAGATAC-3' (Sali) 1. ПЦР1: ЕС 1937Тае1813 г + Е8ас1Ы на матрице рУ810 А813 2. ПЦР2: ПЦР1 + Е8а11-г 3. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ29 гроС по ЗаШБасП 4. клонирование мутантного гена гроС в рУ810 по 8ас11/8ЬЯ

pVSlO AI 1421ASI3 EC_ AI 142I_r 5'- CGAACAGATCGATAACGCGCGGCAG-3' 1. ПЦР1: ЕС А11421 г + Е8ас1Ы на матрице рУ810 А813 2. ПЦР2: ПЦР1 +Е8а11-г

3. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ29 гроС по ЗаН/БасИ 4. клонирование мутантного гена гроС в рУБ 10 по БасИ/БЬЯ

рУБКШШЗЕ ДБВ ЕС_В1143Е_г 5'- ОСТТСОААОАОСТССОСААСОСОС-З' 1. ПЦР1: ЕС В1143Е г + ЕБасН-с! на матрице рУБ 10 ДБВ 2. ПЦР2: ПЦР1 + ЕБаН-г 3. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ29 гроС по БаИ/БасИ 4. клонирование мутантного гена гроС в рУБ 10 по БасН/БЬЯ

рУБЮДв ЕС-ёеЮ19-ЗА_ё 5'- ОТСААССОООТАСАСАОСТООСАОСАОСАСТСС СОСССОГГССООАССТС-З' (подчеркнуты кодоны 3 аланинов на месте делеции в петли) 1. ПЦР 1: ЕС-(1еЮ19-3А с! + ЕБаП-г на матрице рУБ 10 АБГЗ 2. ПЦР2: ПЦР1 + ЕБасП-с! 3. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ29 гроС по БаП/БасН 4. клонирование мутантного гена гроС в рУБ 10 по 8ас11/8ЬП

рЕТ28 АВСг Бга 1. Переклонирование генов Д. га<Ио(1ига№ из плазмид рЕТ29 в плазмиду рЕТ28 (гроС по Ше1/ЕсоЮ, гроВ -ХЬа1/ЕсоМ) 2. обработка рЕТ29 гроА Бга ХЬо1, рЕТ28 гроС эндонуклеазами рестрикции Бга BglIL Обработка рестрицированных фрагментов ферментом Кленова с соответствующими нуклеотидами, переосаждение. Рестрикция обоих фрагментов БрЫ и лигирование -> рЕТ28 гроАС Бга 3. обработка рЕТ28 гроАС Бга N011, рЕТ29 гроВ эндонуклеазами рестрикции Бга В£1П. Обработка рестрицированных фрагментов ферментом Кленова с соответствующими нуклеотидами, переосаждение. Рестрикция обоих фрагментов М1и1 и лигирование -> рЕТ28 гроАСВ Бга 4. обработка рЕТ28 гроАСВ Бга, рЕТ28 2(N011) Бга эндонуклеазой рестрикции N011 и лигирование -> рЕТ28 гроАВСг Бга

рЕТ28 г^оИ) Вта Бг^со-а 5' 1. ПЦР1 Ог-№о-а+ Бг-ХЬо^ог-г на матрице геномной ДНК Д. гасИос1ига№

ОАТАТАССАТСОТСОТТАТСОСАОАААААО 3' Рг-ХЬоТ-ЩГ-г 5'- ТСАСТСОАСТОШШШОТСАОТСОСОТТСССОС ТСО-З' ре128-В§1И-Н^-(15'- АТСОАОАТСТШШ£Ш6СОАААТТААТАСО-З' 2. клонирование ПЦР1 -продукта в рЕТ28 по Мсо1/ХЬо1 -> рЕТ28 Ъ Бга 3. ПЦР2 рег28-В§1-Ко1-а + Ог-ХЬо-Ко^г на матрице рЕТ28 Z Эга 4. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ28 по Вё1И/Х11о1 -> рЕТ28 г^оИ) Бга

рЕТ28 АВСг Бга Ав ОС-ЗйЛ-с! 5'- ОСТТССОСОААООССТСАССОТОСТСО-З' БС-ВвКИ-г 5'- СООТСТССТТСТАС АТС АОСАООТСО-З' БС-с1еЮ19-ЗА-с1 5'- ООСОААСССООСАСОСАОСТСОСАОСАОСАСТО ССССОСОТОАТСОАССТО-З' (подчеркнуты кодоны 3 аланинов на месте делеции в петли) 1. ПЦР1: БС-(1еЮ19-ЗА-с1 + БС-ВзгИ-г на матрице рЕТ28 АВСг Вта 2. ПЦР2: ПЦР1 + ОС-БМ-с! 3. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ28 гроС Бга по БшУВзгСН 4. клонирование мутантного гена гроС в рЕТ28 ABCZ по В8Ю1/ВЬуС1

р!А679МХ Б1ар ТЛ ЕС-В-Х1ю1-(1 5'-САААСТОССОСССОАТСССТОССТСОАОСТ-3' ЕС-В-ААП-г 1. ПЦР1: ЕС-В-ВашШЗ 177-г + ЕС-В-ХЬоЫ на матрице р1А545 2. ПЦР2: ПЦР1 + ЕС-В-ААП-г на матрице р1А545 3. клонирование ПЦР2-продукта в гроВ в р1А545 по ВатН1 / АШ1 -> появление сайта ВатШ в положении 3177 4. ПЦРЗ: ТТЕСАарЫ-В-с! + ТТ-В-ВатН12495-г на

5'-CGTCGACCAGGTGGTTCGCCTTAAGCATG-3' EC-B-BamHI3177-r 5'-C ACC AGGCTGGATCCGGCGTTTAACCG-3' TTECflapN-B-d 5'- CCATCCACATTGAGCGCTACGAGATTGAGGCCC pET28 ABC Т. thermophilus 5. ПЦР4: ПЦРЗ + EB-Mfel-d на матрице pIA545 6. клонирование ПЦР4-продукта в гроВ в pIA545_BamHI3177 по Mfel/BamHI 7. клонирование мутантного гена фоВ в р1А679 по Ncol/Sbfí

G-3' (серый - фрагмент E. coli, бесцветный- Т. thermophilus, подчеркнут перекрывающийся фрагмент) TT-B-BamHI2495-r 5'- GCTTGTCCCCCACCTGGATCCTGCGCTTCTGGGC -3' EB-Mfel-d 5 '-CGCGTATGTCCAATTGAAACCCCTG-3'

pIA679MX 723-740 Tth EC-B-723-740TT-d 5'- GACACCAAGCTGGGTCCGGAAGAGATCACCCGG GACATCCCGCACCTGTCCGAAGCTGCGCTCAGG GACCTGGATGAAGAGGGTATCGTTTACATTGG-3' (BspEI) 1. ПЦР EC-B-723-740TT-d + EB-Xhol-r на матрице р1А545 2. клонирование ПЦР-продукта в гроВ в р1А545 по BspEI/Xhol 3. клонирование мутантного гена гроВ в р1А679 по Ncol/Sbfl

EB-XhoI-r 5'-GTCAGGCCCAGCTCGAGCCAGCGATCG-3'

pIA679MX Flap Tth D725W Ec-B-Hpa2208-d 5'- CGTTATC AAAGTTAACGAAGACG-3 ' Ec-BflapT-D725W-d 5-CGGATCACCCGGTGGATCCCCCACCTC-3' Ec-BflapT-BamHI-r 5'- CACC AGGCTGGATCCTGCGCTTC-3 ' 1. ПЦР1 Ec-BflapT-D725W-d + Ec-BflapT-BamHI-r на матрице pIA679MX Flap Tth 2. ПЦР2: ПЦР1 + Ec-B-Hpa2208-d на матрице pIA679MX Flap Tth 3. клонирование ПЦР2-продукта в гроВ в pIA545_BamHI3177 по Hpal/BamHI с кинетикой недорестрикции ПЦР-продукта (замена D725W приводит к появлению дополнительного сайта ВашШ) 4. клонирование мутантного гена гроВ в р1А679 по Ncol/Sbfl

pBAD rpoC Eco EC-NcoI-start+Xbal -d 5'- TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAG AAGG AG AT АТАССЛ JGGTG AA AG ATTT-3 ' (жирным и курсивом выделен старт-кодон гена rpoC) 1. ПЦР EC-BsrGI-r + EC-NcoI-start+Xbal -d на матрице рЕТ29 rpoC 2. клонирование ПЦР-продукта в рЕТ29 гроС по BsrGI/Xbal 3. клонирование rpoC по Ncol/Xhol (включая старт и стоп кодоны) в pBAD HisB

pBAD rpoC Eco AS 13 клонирование фрагмента SacII/Sall из рЕТ29 rpoC ASI3 в pBAD rpoC Eco

pBAD rpoC Eco G Dra клонирование фрагмента SacII/Sall из рЕТ29 rpoC G Dra в pBAD rpoC Eco

pBAD rpoC Eco G1136M AS 13 клонирование фрагмента SacII/Sall из pET29 rpoC Gl 136M ASI3 в pBAD rpoC Eco

pBAD HisB rpoC Eco G1136M EC-G1136M-r 5'- GGCAGACCCATGGTGATGTC-3' 1. ПЦР1 : EC-G1136М-Г + ESacII-d на матрице pVS 10 2. ПЦР2: ПЦР1 + ESall-r 3. клонирование ПЦР-продукта в pBAD rpoC Eco по SacII/Sall

pET 28 GreA Dra Dr_GreA_r 5'- GTGGTGCTCGAGGGGATACTCGACGCTGATG -3 ' DrGreAd 5'- GATATACCATGGTGACCAGAGAACCCGTCCGC-3' ПЦР с использованием праймеров, соответствующих 5'- и 3'-концам гена, в качестве матрицы использовалась геномная ДНК D. radiodurans (препарат получен Богдановой Е.С.). Клонирование ПЦР-продукта в плазмиду рЕТ 28 по соответствующим сайтам.

pET 28 GreA Eco Ec_GreA_r 5 '-GTGGTGCTCGAGCAGGTATTCCACCTTAA-3 ' Ec_GreA_d 5'- GATATACC ATGGTGCAAGCTATTCCGATGACC-3 ' ПЦР с использованием праймеров, соответствующих 5'- и 3'-концам гена, в качестве матрицы использовалась геномная ДНК Е. coli (препарат получен Щербатовой H.A.). Клонирование ПЦР-продукта в плазмиду рЕТ 28 по соответствующим сайтам.