Сопряжение инициации и терминации эукариотической трансляции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Согорин, Евгений Анатольевич

• Согорин, Евгений Анатольевич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Согорин, Евгений Анатольевич

Содержание

1 Введение

2 Обзор литературы

2.1 Удлинение полипептидной цепи (элонгация)

2.2 Инициация трансляции и её регуляция: классический механизм инициации трансляции у эукариот

2.2.1 Регуляция эукариотической инициации трансляции

2.2.2 Движущая сила однонаправленного движения малой субъединицы рибосомы во время сканирования

2.2.3 Нестандартные способы установки инициаторной тРНК в Р-участке эукариотической рибосомы на стартовом кодоне мРНК

2.3 Терминация трансляции у эукариот

2.4 Связь инициации и терминации трансляции: участие белковых факторов

2.4.1 Поли(А)-связывающий белок в терминации трансляции

2.4.2 Белок ABCE1

2.5 Особые случаи прекращения синтеза белка

3 Материалы исследования

3.1 Химические реагенты и ферменты

3.2 Буферные растворы и микробиологические среды

3.3 Штамм клеток, плазмидные вектора, конструкции мРНК

4 Методы исследования

4.1 Процедура депротеинизации и осаждения нуклеиновых кислот

4.2 Получение Rb-Cl компетентных клеток Escherichia coli

и трансформация плазмидными векторами

4.3 Препаративное выделение плазмидной ДНК

4.4 Электрофорез нуклеиновых кислот

4.5 Обработка плазмид эндонуклеазами рестрикции (гидролиз ДНК)

4.6 Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразой цепной реакции (ПЦР)

4.7 In vitro транскрипция

4.8 Очистка мРНК с помощью спин-колонок

4.9 Мечение мРНК флуоресцентной меткой по 5'-концу

4.9.1 Получение флуоресцентно-меченной полиуридиловой кислоты

4.9.2 Получение флуоресцентно-меченного фрагмента мРНК люциферазы

4.10 Мечение мРНК флуоресцентной меткой по 3'-концу

4.11 Кэпирование мРНК

4.12 In vitro трансляция

4.13 Центрифугирование рибосомных комплексов в градиенте концентрации сахарозы и их детекция

4.14 Измерение свечения синтезируемого GFP в трансляционной смеси

4.15 In situ мониторинг синтеза люциферазы

5 Результаты и обсуждение результатов работы

5.1 Детекция флуоресцентно-меченной мРНК в рибосомных комплексах

5.2 Образование новых и частичная разборка прежде сформированных полирибосом в трансляционной системе после добавления новой порции мРНК

5.3 Сопряжение инициации и терминации трансляции в процессе синтеза белка в эукариотической бесклеточной системе

5.3.1 Эффект, вызываемый добавлением новой мРНК, не зависит от ее специфичности

5.3.2 Индуцированное освобождение завершённого белка строго зависит от трансляционной активности добавляемой мРНК

5.3.3 Немедленный выход активного белка при добавлении новой мРНК не происходит на матрице, лишенной стоп-кодона

5.3.4 Сопряжение инициации и терминации трансляции не зависит от способа инициации

5.3.5 Сопряжение инициации и терминации не происходит в прокариотической системе трансляции

6 Заключение

7 Выводы

8 Благодарности

9 Приложение Список литературы

94

95

97

98

Список иллюстраций

1 Получение флуоресцентно-меченной ро1уИ

2 Зависимость синтеза полифенилаланина от времени на ро1уИ матрице

3 Связывание прокариотическими рибосомами флуоресцентно-меченной ро1уИ

4 Получение флуоресцентно-меченного фрагмента мРНК люциферазы

5 Связывание эукариотическими рибосомами флуоресцентно-меченного по 5'-концу фрагмента мРНК люциферазы

6 Динамика образования полирибосом

7 Образование новых полирибосом

8 Частичная разборка ранее сформированных полирибосом

9 Динамика синтеза люциферазы

10 Вновь добавленная мРНК стимулирует немедленное освобождение полноразмерной люциферазы из транслирующих рибосом

11 Стимуляция освобождения белка из транслирующих рибосом не зависит от кодовой специфичности вновь добавляемой мРНК

12 Трансляционная активность вновь добавляемой мРНК определяет величину эффекта стимуляции освобождения полноразмерной люциферазы из транслирующих рибосом

13 Только трансляционно-активная вновь добавляемая мРНК способна немедленно стимулировать освобождение полноразмерного белка

14 Синтез люциферазы и формирование полирибосом на мРНК без стоп-кодона

15 Стимуляция освобождения активного белка зависит от наличия стоп-кодона на транслируемой мРНК

16 Кэп/фактор независимая инициация трансляции по механизму внутренней посадки рибосомы способна стимулировать терминацию трансляции

17 Фактор инициации eIF4A не участвует в сопряжении инициации

и терминации

18 Сопряжение инициации и терминации не происходит в прокариотической системе трансляции

19 Частота встречаемости в заголовках статей словосочетаний

20 Моделирование в бесклеточной системе ситуации доставки новых молекул мРНК из ядра в цитоплазму живой клетки

Список таблиц

1 Последовательность олигонуклеотидов

2 Плазмидные вектора

3 ДНК-матрицы для транскрипции in vitro

4 Описание используемых мРНК

5 Использованные в работе лидеры мРНК и способ их инициации трансляции

Список сокращений и условных обозначений

сек секунда

мин минута

ч час

об/мин оборотов за минуту

г/л грамм на литр

о/о объём к объёму (объёмная доля)

М моль

г грамм

нм нанометр

мл миллилитр

V volume (объём)

УФ ультрафиолет

ед еденица

о.е оптические единицы

отн.ед относительные единицы

В вольт

см сантиметр

g гравитационная постоянная

РНК (RNA) рибонуклеиновая кислота

ДНК (DNA) дезоксирибонуклеиновая кислота

UTR untranslated region

НТО нетранслируемая область

GFP green fluorescent protein

TBE Tris/Borate/EDTA

ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная кислота

MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid

ПААГ полиакриламидный гель

dNTP deoxynucleotide

WGE wheat germ extract

ATP adenosine triphosphate

GTP guanosine triphosphate

CTP cytidine triphosphate

UTP uridine triphosphate

АТФ аденозинтрифосфат

ГТФ гуанозинтрифосфат

CPM counts per minute

IRES Internal Ribosome Entry Site

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сопряжение инициации и терминации эукариотической трансляции»

1 Введение

В живой клетке информация, закодированная в последовательности нуклеотидов ДНК, переводится в последовательность аминокислот белка через трансляцию матричной РНК (мРНК). Все ныне живущие организмы используют для этого рибонуклеопротеидную молекулярную машину — рибосому. Рибосома это массивный комплекс молекул РНК и белков (2.5 — 4.5 миллиона дальтон в зависимости от вида организма), который протаскивает относительно себя цепь мРНК.

За последние полвека научное сообщество сделало значительный прорыв в понимании молекулярного механизма синтеза белка. Вскоре после выдвижения Криком и Уотсоном модели двойной спирали ДНК [1] был расшифрован генетический код. Результаты электронной микроскопии, а затем и мощный аппарат рентгеноструктурного анализа рибосомных частиц раскрыл структурные принципы устройства этой сложной молекулярной машины [2]. Вместе с результатами биохимических экспериментов удалось понять, каким образом происходит катализ реакции образования пептидной связи. Современные методы секвенирования транслируемой мРНК позволили оценить какие мРНК, в какой момент времени и при каких условиях транслируются чаще или реже [3]. Очень впечатляют результаты современных методов одновременной визуализации транспорта мРНК и её трансляции в живой единичной клетке [4].

В процессе трансляции считывается записанная на мРНК информация о последовательности аминокислот закодированного белка, и одновременно катализируется реакция образования полипептидной цепи синтезируемого белка. Так как трансляция это последний рубеж между хранением и реализацией генетической информации, работа рибосомы чётко регулируется клеткой.

Фундаментальность биосинтеза белка подчёркивается развитием вирусной инфекции: зачастую, после проникновения в клетку вирусу достаточно подчинить себе только лишь этот процесс жизнедеятельности клетки, чтобы инфекция закончилась размножением вирусных частиц и гибелью клетки [5]. Кроме того, многие заболевания, в том числе человека, происходят из-за сбоя работы трансляционного аппарата [6—8].

Весь процесс биосинтеза белка разделяют на три основных этапа:

инициацию (определение места старта синтеза на мРНК), элонгацию (наращивание полипептидной цепи, собственно синтез белка) и терминацию (окончание синтеза). В последнее время в отдельный четвёртый этап выделяют так называемый рециклинг (recycling) — диссоциация терминировавшей рибосомы на субъединицы и уход малой субъединицы с мРНК. Считается, что регуляция трансляции осуществляется в основном на уровне инициации. Если сделать простой анализ заголовков всех статей базы данных PubMed на наличие словосочетаний «translation initiation», «translation elongation» или «translation termination», можно обнаружить, что больше всего внимания со стороны научного сообщества обращено к регуляции инициации трансляции (см. Приложение рис. 19). Действительно, живой клетке логично регулировать именно самый первый этап трансляции, чтобы избежать ненужных энергетических и сырьевых затрат впоследствии. В то же время существуют ситуации, когда время реакции на изменения окружающей среды должно быть короче времени, затраченного на инициацию трансляции и элонгацию: некоторые изменения условий требуют моментального ответа, который выражается в работе активных (полностью синтезированных) белковых молекул. Это означает, что должны существовать механизмы постинициаторной регуляции на более поздних этапах синтеза белка, в частности, на уровне терминации. Поэтому изучение регуляции терминации трансляции также заслуживает внимания, и актуальность этого направления подтверждает растущий интерес со стороны исследователей в последние несколько лет.

Актуальность темы исследования. Важно отметить, что в процессе трансляции разные рибосомы находятся на различных этапах синтеза белка, причём не только в рамках одной молекулы мРНК, но и параллельно транслируемых молекул. Вопрос о том, могут ли процессы трансляции, идущие на разных мРНК, влиять друг на друга, недостаточно хорошо изучен. Например, до данной работы не было известно, будет ли трансляция одной мРНК оказывать влияние на процесс терминации на другой мРНК. Вероятно, слабая изученность проблемы была связана с определёнными трудностями проведения экспериментов, в условиях которых можно было бы одновременно следить за инициацией и терминацией трансляции на двух разных мРНК.

Применённый нами подход позволил провести соответствующие эксперименты и решить поставленные цели и задачи.

Цели и задачи. Целью данной работы являлось изучение влияния одной транслируемой мРНК на трансляцию другой мРНК. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

(1) Проверить, будут ли образовываться новые полирибосомы на вновь добавленной мРНК в работающей бесклеточной системе трансляции с уже сформированными полирибосомами.

(2) Установить, как влияет добавление новой мРНК на ранее сформированные полирибосомы.

(3) Выяснить, будет ли добавление новой мРНК стимулировать терминацию трансляции на мРНК, с помощью которой запускалась система.

(4) Определить, как влияет на стимуляцию терминации трансляционная активность добавляемой мРНК.

(5) Проверить, будет ли происходить стимуляция терминации трансляции в отсутствие стоп-кодона на исходно транслируемой мРНК.

(6) Установить, зависит ли сопряжение инициации и терминации трансляции от способа инициации добавляемой мРНК.

Научная новизна и практическая значимость работы. Исследование связи инициации на одной мРНК с терминацией трансляции на другой мРНК является оригинальным. Основные результаты работы не имеют аналогов в мировой литературе и вносят значительный вклад в понимание процесса трансляции у эукариот. Так, описано новое явление, наблюдаемое в процессе трансляции в эукариотической бесклеточной системе, названное нами «сопряжение инициации и терминации трансляции»: быстрое освобождение полноразмерного белка из транслирующих рибосом при добавлении в работающую систему трансляции новой трансляционно-активной мРНК. Показано, что эффект сопряжения зависит от трансляционной активности мРНК, на которой происходит инициация, с одной стороны, и от наличия

стоп-кодона на мРНК, на которой происходит терминация, с другой. Сделано предположение, что именно процесс инициации трансляции на вновь добавленной мРНК стимулирует терминацию на мРНК, с помощью которой запускалась система. Кроме того, продемонстрировано, что сопряжение инициации и терминации не зависит от способа инициации.

Так как терминация трансляции является неотъемлемой частью биосинтеза белка, то результаты данных фундаментальных исследований могут лечь в основу дальнейших прикладных разработок по оптимизации реактора биосинтеза белка в бесклеточной системе на основе экстракта зародышей пшеницы. Данная система синтеза часто используется для производства белков в коммерческих целях.

Методология и методы исследования. В работе использовались два основных метода исследования: седиментация рибосомных комплексов в градиенте концентрации сахарозы и in situ мониторинг синтеза белка люциферазы.

В первом методе анализировалось распределение оптической плотности седиментационного профиля рибосом, полученного в результате центрифугирования трансляционной смеси в градиенте концентрации сахарозы. Для решения поставленных задач данный классический метод был дополнен ещё и детектированием флуоресцентно-меченной мРНК в полирибосомах. Для этого непрерывное измерение флуоресценции седиментационного профиля проводили, используя проточную кювету.

Второй метод основывается на in situ мониторинге синтеза люциферазы. Люцифераза — фотоактивный белок, который осуществляет энзиматическую реакцию окисления субстрата люциферина. Важно, что реакция окисления сопровождается испусканием кванта света (570 нм). Таким образом, чем активнее синтезируется люцифераза, тем больше свечения детектируется в трансляционной смеси люминометром. Принципиальными для данной работы являются два свойства люциферазы. Во-первых, последние 12 С-концевых аминокислот люциферазы необходимы для проявления её активности. Во-вторых, люцифераза становится активной только после освобождения белка из рибосомы. Суммируя, можно сказать, что только полноразмерная и свободная от рибосом люцифераза способна генерировать свечение, то есть

белок, прошедший стадию терминации трансляции. Трансляцию мРНК люциферазы проводили в бесклеточной системе трансляции на основе экстракта зародышей пшеницы. Экстракт не содержит эндогенных мРНК, но содержит все остальные необходимые компоненты трансляции. Кроме того, данная бесклеточная система трансляции обладает высокой продуктивностью синтеза белка.

Основные положения выносимые на защиту:

(1) В работающей бесклеточной системе трансляции с преформированными полирибосомами происходит формирование новых полирибосом на вновь добавленной в систему мРНК.

(2) Параллельно с образованием новых полирибосом происходит частичная разборка ранее сформированных полирибосом.

(3) Добавление новой мРНК в работающую систему трансляции приводит к быстрому освобождению полноразмерного белка из рибосомы.

(4) Освобождение белка из рибосомы не зависит от транслируемой области добавляемой мРНК.

(5) Эффект освобождения белка пропорционален трансляционной активности добавляемой мРНК.

(6) Освобождение белка не происходит, если на начально транслируемой мРНК отсутствует стоп-кодон.

(7) Сопряжение инициации и терминации трансляции не зависит от способа инициации.

Личный вклад соискателя. Личный вклад соискателя заключается в планировании и проведении экспериментов, в обработке и анализе полученных данных, подготовке публикаций.

Степень достоверности. Достоверность полученных данных подтверждается воспроизводимостью и многочисленностью проведённых экспериментов, а так же наличием положительных и отрицательных контролей.

Апробация результатов. Работа апробирована на ежегодных конференциях Института белка РАН (2015 г., 2016 г.) и на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ — НАУКА XXI ВЕКА» (2017 г.).

2 Обзор литературы

2.1 Удлинение полипептидной цепи (элонгация)

В процессе синтеза полипептидной цепи рибосома использует два субстрата катализируемой ею реакции: аминоацил-тРНК и пептидил-тРНК. Молекулы тРНК располагаются в межсубъединичном пространстве параллельно относительно друг друга и перпендикулярно границе раздела субъединиц таким образом, что антикодоновые петли тРНК находятся на малой субъединице, а акцепторные петли — в углублении большой субъединицы рибосомы. Соответственно, как в декодирующей области малой субъединицы различают А- и Р-участки, так и в пептидил-трансферазном центре (PTC) большой субъединицы — а- и р-участки связывания этих субстратов. Также различают Е-участок (от слова «exit»), через который деацилированная тРНК покидает рибосому. Таким образом, в элонгирующей рибосоме могут находиться сразу три молекулы тРНК, что подтверждает кристаллическая структура рибосомы с молекулами тРНК в составе [9].

В целом, удлинение растущего полипептида (элонгация) является очень консервативным процессом среди всех изученных эукариот [10, 11]. Например, основные факторы элонгации дрожжей (eEF1A и eEF2) могут обеспечивать элонгацию рибосомами млекопитающих; обратная ситуация тоже приводит к эффективному синтезу белка [12].

После присоединения большой субъединицы к малой на инициаторном кодоне 80S рибосома содержит в Р-участке аминоацилированную инициаторную тРНК, в то время как А-участок остаётся вакантным. Следующий шаг — кодон-специфическое связывание аминоацилированной тРНК с А-участком. Эта тРНК доставляется в рибосому в составе аминоацил-тРНК•eEF1A•GTP комплекса. В случае правильного кодон-антикодонового соответствия фактор элонгации eEF1A гидролизует связанный с ним ГТФ. Комплекс eEF1A^GDP и ортофосфат покидают рибосому из-за низкой аффинности к рибосоме в таком состоянии. После этого элонгаторная аминоацил-тРНК занимает прочное положение в А-участке, находясь бок о бок с инициаторной тРНК, связанной в Р-участке. При этом, акцепторные части двух тРНК, находящиеся в РТС большой субъединицы, оказываются пространственно сближены. Перпендикулярное

расположение двух аминоацилированных тРНК в А- и в Р-участках до образования новой пептидной связи между двумя аминокислотами принято обозначать как P/р и А/а. Это обеспечивает необходимые условия транспептидации в PTC большой субъединицы: С-конец пептидного остатка, который связан с тРНК, находящейся в P-участке, переносится на свободный N-конец (аминогруппа) аминоацил-тРНК А-участка. После реакции транспептидации в P-участке находится деацилированная тРНК, а в А-участке — тРНК с удлинённым на одну аминокислоту пептидом. Акцепторный конец деацилированной тРНК проявляет особое сродство к е-участку, а акцепторный конец тРНК с пептидом — к р-участку большой субъединицы. То есть, происходит смещение акцепторных концов тРНК. При этом антикодоновые петли тРНК остаются на месте. Такое состояние принято называть P/е и A/р промежуточным, или «гибридным». Флуктуирующее гибридное состояние молекул тРНК стабилизируется с помощью второго фактора элонгации eEF2, связанного с ГТФ. С одной стороны, установка eEF2^GTP в рибосому запускает быстрый гидролиз ГТФ, а с другой — внутри рибосомы наблюдаются дополнительные перемещения тРНК: происходит транслокация. В результате транслокации деацилированная тРНК из Р-участка полностью переходит в Е-участок, а тРНК с растущим пептидом из А-участка переходит в Р-участок. То есть мРНК протягивается на один кодон вперёд. После этого в E-участке находится деацилированная тРНК, в P-участке — пептидил-тРНК, а А-участок рибосомы снова вакантен для связывания новой аминоацилированной тРНК следующего кодона в соответствии с генетическим кодом. Цикл повторяется.

Чтобы рекрутировать eEFIA обратно в процесс трансляции нуклеотид GDP в комплексе eEFlA^GDP должен быть удалён. Эту функцию выполняет eEFlB. Этот фактор может служить регулятором трансляции на этапе элонгации, например, при митозе [13]. eEFlB фосфорилируется циклин-зависимой киназой, что существенно снижает его активность. Важно отметить, что регуляция на этапе элонгации позволяет быстро возобновить синтез белка на уровне сформированных полирибосом сразу после окончания митоза [14]. Активность транслоказы eEF2 также регулируется фосфорилированием Ca2+-зависимой киназой eEF2K [15]. Фосфорилированное состояние eEF2 проявляет низкую аффинность к рибосоме [16]. Достаточно

часто стрессовые состояния клетки, такие как голодание, запускают сигнальный каскад, который приводит к ингибированию биосинтеза белка именно на уровне элонгации [17].

2.2 Инициация трансляции и её регуляция: классический механизм инициации трансляции у эукариот

Классический механизм инициации трансляции у эукариот включает в себя три основные этапа. Первый этап — формируется 43S преинициаторный рибосомный комплекс: фактор инициации eIF2, GTP и Met-тРНК1Met образуют тройственный комплекс, который вместе с факторами eIF3, eIF1 и eIF1A связывается с 40S рибосомной субъединицей. Опционально, в этот комплекс также может входить фактор eIF5. Комплекс 43S связывается с мРНК посредством взаимодействия с кэп-структурой на 5'-конце мРНК при участии группы факторов инициации eIF4. Второй этап — фактор/АТФ-зависимое однонаправленное движение малой субъединицы вдоль 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) мРНК по направлению от 5'-конца к 3'-концу мРНК. Этот процесс перемещения малой субъединицы сопровождается сканированием нуклеотидной последовательности 5'-НТО мРНК с целью обнаружить стартовый кодон — чаще всего первый попавшийся AUG кодон. С помощью спаривания азотистых оснований кодона AUG мРНК и антикодона Met-тРНКMet происходит распознавание места старта трансляции. Комплекс малой субъединицы, связанной с мРНК, принято называть 48S инициаторным комплексом. Когда сканирующий комплекс достигает инициаторного кодона, начинается третий этап инициации: гидролиз GTP и присоединение большой 60S субъединицы к малой при участии белков eIF5 и eIF5В. После чего сформированная 80S рибосома приступает к элонгации. По такому механизму происходит инициация трансляции большей части клеточных мРНК. Каждый этап описанного механизма строго обязателен и сопровождается работой более десятка белковых факторов [18—21], работа которых регулируется в зависимости от условий жизни клетки.

2.2.1 Регуляция эукариотической инициации трансляции

Одной из главных химических модификаций мРНК является добавление кэп-структуры (кэп) к её 5'-концу. Этот процесс происходит в ядре клетки во время синтеза транскрипта будущей мРНК, то есть котранскрипционно. Кэп-структура в контексте цепи мРНК представляет из себя перевёрнутый в направлении 3/-5/ нуклеотид-трифосфат (7-метилгуанозин), который соединён с первым нуклеотидом транскрипта 5/-5/-трифосфатным мостиком [22, 23]. Зачастую в процессе кэпирования первые два нуклеотида транскрипта подвергаются метилированию по 2'-гидроксильной группе рибозы. Кэп играет принципиальную роль в защите мРНК от деградации, он важен для транспортировки мРНК в цитоплазму, но главная его функция — подготовка мРНК к трансляции (активация мРНК). С кэп-структурой прочно связывается белковый фактор инициации е1Р4Е. Этот белок входит в состав гетеротримерного комплекса е1Р4Р, который включает в себя кроме е1Р4Е ещё е1Р4А и е1Р4С. Белок е1Р4А обладает АТФазной и хеликазной активностью. Он плавит вторичную структуру РНК и, как считается, тем самым подготавливает место посадки рибосомы на мРНК. Белок е1Р4С, с одной стороны, является площадкой для связывания е1Р4Е и е1Р4А в один комплекс, а с другой — е1Р4С млекопитающих привлекает инициаторный рибосомный комплекс к мРНК с помощью связывания с мультисубъединичным белком е1Р3 [24, 25], который входит в состав 43Б комплекса. е1Р4С дрожжей не способен взаимодействовать с е1Р3, однако в этом случае е1Р4С может взаимодействовать с е1Р5 [26], обеспечивая связь 40Б с активированной мРНК. Таким образом, е1Р4С через е1Р4Е и е1Р3 является посредником между кэпированной мРНК и рибосомным преинициаторным комплексом. Кроме каркасной функции е1Р4С повышает сродство е1Р4Е к кэп-структуре [27], а также вместе с дополнительным факторам инициации е1Р4Б (или его гомологом е1Р4Н) стимулирует АТФазную и хеликазную активность е1Р4А в составе е1Р4Р [28, 29]. Интересно отметить, что е1Р4Е и поли(А) связывающий белок (РАБР) через взаимодействие с е1Р4С также могут стимулировать хеликазную активность е1Р4А в составе е1Р4Р [30, 31]. Таким образом, активность е1Р4А изменяется через прямое и непрямое взаимодействие с другими факторами трансляции, что, по-видимому, может определять какая мРНК (с какой степенью выраженности вторичной структуры на 5'-конце)

будет транслироваться при определённом уровне хеликазной активности eIF4А.

Первый этап инициации — присоединение 43S комплекса к кэпированному 5'-концу мРНК — достигается через образование цепи взаимодействий между участниками этого процесса:

мРНК-cap•eIF4E•eIF4G•eIF3•40S. Общая регуляция синтеза белка может осуществляться на уровне связей между разными звеньями этой цепочки. Разрушение ковалентной связи между мРНК и кэп-структурой приводит к временному подавлению трансляции декэпированной мРНК или запускает процесс её деградации [32, 33]. Гипофосфорилированное состояние eIF4E-связывающего белка (eIF4E-BP) повышает его сродство к eIF4E и тем самым исключает этот кэп-связывающий белок из процесса инициации трансляции [34, 35]. Необходимо отметить, что в отличие от животных и дрожжей, в растениях не существует белка, гомологичного eIF4E-BP, но найдены другие белки — потенциальные конкуренты кэп-структуры мРНК за связывание с eIF4E [36].

Хорошо изучен пример общей регуляции инициации трансляции на уровне образования тройственного комплекса eIF2•GTP•Met-тРНКMet. Связывание 40S субъединицы рибосомы с мРНК может не состояться по причине блокировки формирования этого комплекса. После узнавания стартового кодона инициаторной тРНК и гидролиза GTP, фактор инициации eIF2 покидает инициаторный рибосомный комплекс в неактивной форме eIF2^GDP. Для того, чтобы вернуть этот фактор в процесс инициации трансляции, связанный GDP должен быть заменён на GTP. Эту функцию выполняет eIF2В. В условиях стресса, таких как вирусная инфекция, тепловой шок, недостаток железа или голодание по аминокислотам, включаются киназы PKR, PERK, HRI или GCN2, соответственно. Эти киназы фосфорилируют а-субъединицу eIF2 по 51-ому аминокислотному остатку (серин). Такое фосфорилирование никак не влияет на способность свободного eIF2aP участвовать в инициации, однако когда комплекс eIF2oP^GDP покидает рибосому и взаимодействует с eIF2В, формируется стабильный комплекс eIF2aP•eIF2В. Это приводит к тому, что ограниченное количество молекул белка eIF2В выводится из оборота, и в клетке накапливается неактивная форма eIF2^GDP. Дефосфорилирование eIF2aP осуществляется

фосфатазами клетки [37]. Растительный eIF2 тоже подвергается фосфорилированию по а субъединице [38]. Однако в данном случае фосфорилирование eIF2a никак не влияет на инициацию трансляции. Кроме того, до сих пор в растениях не обнаружен eIF2B (см. База данных — «Factors in Arabidopsis translation»*). Это может быть связано с тем, что, в отличие от других эукариот, у растений комплекс eIF2^GDP менее прочный и, по-видимому, способен к спонтанной диссоциации, не требуя для этого фактор eIF2B [39].

Регуляция инициации трансляции у эукариот на конкретной мРНК основывается в большинстве случаев на особенностях первичной и вторичной структуры её 5'-НТО [40]. После того как рибосома связалась с мРНК в области 5'-конца, происходит процесс сканирования — однонаправленное движение рибосомы вдоль лидерной последовательности мРНК до момента узнавания места старта трансляции. Почти всегда местом старта является первый попавшийся AUG кодон, находящийся в правильном нуклеотидном контексте — 5/-(A/G)NNAUGG-3/ [41]. Необходимость в строгом нуклеотидном

составе в позиции —3 и +4 относительно AUG (где A — позиция +1, U--Ъ2,

G — +3) можно объяснить контактами этих нуклеотидов с а-субъединицей eIF2 и 18S РНК малой субъединицы рибосомы, которые, вероятно, важны во время структурных перестроек в момент кодон-антикодоновых взаимодействий в P-участке рибосомы [42]. В случае неоптимизированного («слабого») контекста часть сканирующих рибосом может пропустить AUG, продолжить своё движение и определить место старта на следующем AUG кодоне, находящемся в «сильном» контексте. В этой ситуации мРНК эукариот становится как бы полицистронной. Правильное кодон-антикодоновое взаимодействие между мРНК и инициаторной тРНК координируется факторами инициации eIF1 и eIFIA, которые с самого начала образования 43S преинициторного комплекса связаны с малой субъединицей. eIF1 контролирует правильное кодон-антикодоновое спаривание в P-участке, а eIF1A располагается со стороны А-участка и тем самым закрывает этот участок от взаимодействия с другими тРНК [43]. Как только сканирующая рибосома обнаруживает стартовый кодон, в инициаторном комплексе происходят структурные перестроения, затрудняющие процесс дальнейшего

*http : //browning.cm.utexas.edu/arabidopsis/fiat

движения рибосомы, eIF1 покидает рибосому, eIF5 катализирует необратимый гидролиз GTP в составе eIF2•GTP•Met-тРНКMet, остаток фосфорной кислоты (Pi) и eIF2^GDP покидают инициаторный комплекс, и фактор инициации eIF5B через гидролиз GTP в его составе присоединяет большую 60S субъединицу c образованием 80S рибосомы. Комплекс eIF5B^GDP теряет сродство к рибосоме и покидает её вместе с другими факторами инициации. В таком состоянии 80S рибосома заряжена аминоацилированной инициаторной тРНК в P-участке и готова принять соответствующую аминоацилированную тРНК в А-участке, чтобы приступить к элонгации.

Интересно, что eIF5 может стимулировать гидролиз GTP на eIF2 ещё до достижения AUG кодона [44, 45]: нуклеотид находится в состоянии частичного гидролиза (GDP^Pi), и реакция является обратимой. Правильное кодон-антикодоновое взаимодействие сдвигает реакцию в сторону необратимого расщепления GTP на GDP и Pi. Несмотря на то, что eIF5 не является строго необходимым компонентом инициаторного комплекса, по-видимому, именно eIF5-индуцируемый гидролиз GTP (с высвобождением Pi из 48S комплекса) запускает процесс присоединения 60S субъединицы. Это следует из наблюдения, что если в инициаторном комплексе вместо GTP находится его негидролизуемый аналог (GMP-PNP), или комплекс собран без eIF5B, то сканирующая рибосома после небольшой паузы («пробуксовки») на AUG кодоне (даже если он находится в «сильном» контексте) продолжает своё движение дальше [46]. В ситуации обратной, например, когда в клетке происходит гиперэкспрессия гена белка eIF5B, сканирующая рибосома менее щепетильна к контексту и даже выбирает в качестве старта кодон, отличный от AUG, что лежит, например, в основе авторегуляции экспрессии гена eIF5B [47].

Так как сканирование предполагает физическое движение малой субъединицы рибосомы вдоль всей лидерной последовательности мРНК, то на этом пути рибосомный инициаторный комплекс может быть остановлен сильно выраженной вторичной структурой РНК, и в итоге процесс инициации может застопориться на этом этапе [48, 49]. Если слабый инициаторный участок будет располагаться непосредственно перед такой вторичной структурой, то это может повысить его шанс стать местом старта трансляции за счёт существенной временной паузы сканирующей рибосомы на этом

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Согорин, Евгений Анатольевич, 2017 год

Список литературы

1. Molecular structure of nucleic acids. Watson, J. D. & Crick, F. H. Nature 171, 737—738 (1953).

2. High-resolution structure of the eukaryotic 80S ribosome. Yusupova, G. & Yusupov, M. Annual review of biochemistry 83, 467—486 (2014).

3. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Ingolia, N. T., Lareau, L. F. & Weissman, J. S. Cell 147, 789—802 (2011).

4. Eyes on translation. Chekulaeva, M. & Landthaler, M. Molecular Cell 63, 918—925 (2016).

5. Tinkering with translation: protein synthesis in virus-infected cells. Walsh, D., Mathews, M. B. & Mohr, I. Cold Spring Harbor perspectives in biology 5 (2013).

6. Emerging links between initiation of translation and human diseases. Kozak, M. Mammalian Genome 13, 401 (2002).

7. Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease. Boczonadi, V. & Horvath, R. The international journal of biochemistry & cell biology 48, 77—84 (2014).

8. Translation initiation factors: reprogramming protein synthesis in cancer. Chu, J., Cargnello, M., Topisirovic, I. & Pelletier, J. Trends in Cell Biology 26, 918—933 (2016).

9. Crystal structure of 70S ribosome with both cognate tRNAs in the E and P sites representing an authentic elongation complex. Feng, S., Chen, Y. & Gao, Y.-G. PLoS One 8, e58829 (2013).

10. Recent mechanistic insights into eukaryotic ribosomes. Rodnina, M. V. & Wintermeyer, W. Current opinion in cell biology 21, 435—443 (2009).

11. Молекулярная биология. Рибосомы и биосинтез белка Спирин, А. С. (ред. Пирогова, И. В.) ISBN: 978-5-7695-6668-4 (Издательский центр «Академия», Москва, 2011).

12. Dissimilarity in protein chain elongation factor requirements between yeast and rat liver ribosomes. Skogerson, L. & Engelhardt, D. Journal of Biological Chemistry 252, 1471—1475 (1977).

13. Mitotic modulation of translation elongation factor 1 leads to hindered tRNA delivery to ribosomes. Sivan, G., Aviner, R. & Elroy-Stein, O. Journal of Biological Chemistry 286, 27927—27935 (2011).

14. Ribosomal Slowdown Mediates Translational Arrest during Cellular Division. Sivan, G., Kedersha, N. & Elroy-stein, O. Molecular and cellular biology 27, 6639—6646 (2007).

15. Regulation of protein synthesis at the elongation stage. New insights into the control of gene expression in eukaryotes. Ryazanov, A. G., Rudkin, B. B. & Spirin, A. S. FEBS letters 285, 170—175 (1991).

16. Functional properties of phosphorylated elongation factor 2. Carlberg, U., Nilsson, A. & Nygard, O. European journal of biochemistry 191, 639—645 (1990).

17. Regulation of peptide-chain elongation in mammalian cells. Browne, G. J. & Proud, C. G. The FEBS Journal 269, 5360—5368 (2002).

18. By Jackson, R., Hunt, S., Reynolds, J. & Kaminski, A. in Cap-Independent Translation 1-29 (Springer, 1995).

19. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Jackson, R. J., Hellen, C. U. & Pestova, T. V. Nature reviews Molecular cell biology 11, 113—127 (2010).

20. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Sonenberg, N. & Hinnebusch, A. G. Cell 136, 731—745 (2009).

21. The Scanning Mechanism of Eukaryotic Translation Initiation. Hinnebusch, A. G. Annual review of biochemistry 83 (2014).

22. Modified nucleosides and bizarre 5'-termini in mouse myeloma mRNA. Adams, J. M. & Cory, S. Nature 255, 28 (1975).

23. Methylated nucleotides block 5' terminus of HeLa cell messenger RNA. Wei, C.-M., Gershowitz, A. & Moss, B. Cell 4, 379—386 (1975).

24. Korneeva, N. L., Lamphear, B. J., Hennigan, F. L. C. & Rhoads, R. E. Mutually cooperative binding of eukaryotic translation initiation factor (elF) 3 and eIF4A to human eIF4G-1. Journal of Biological Chemistry 275, 41369—41376 (2000).

25. Translation initiation factor eIF4G-1 binds to eIF3 through the eIF3e subunit. LeFebvre, A. K. et al. Journal of Biological Chemistry 281, 22917—22932 (2006).

26. Multiple roles for the C-terminal domain of eIF5 in translation initiation complex assembly and GTPase activation. Asano, K. et al. The EMBO journal 20, 2326—37 (2001).

27. Ribosome loading onto the mRNA cap is driven by conformational coupling between eIF4G and eIF4E. Gross, J. D. et al. Cell 115, 739—750 (2003).

28. Modulation of the Helicase Activity of eIF4A by eIF4B, eIF4H, and eIF4F. Rogers, G. W., Richter, N. J., Lima, W. F. & Merrick, W. C. Journal of Biological Chemistry 276, 30914—30922 (2001).

29. Topology and Regulation of the Human eIF4A/4G/4H Helicase Complex in Translation Initiation. Marintchev, A. et al. Cell 136, 447—460 (2009).

30. Human eIF4E promotes mRNA restructuring by stimulating eIF4A helicase activity. Feoktistova, K., Tuvshintogs, E., Do, A. & Fraser, C. S. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 13339—44 (2013).

31. Wheat germ poly(A)-binding protein increases the ATPase and the RNA helicase activity of translation initiation factors eIF4A, eIF4B, and eIF-iso4F. Bi, X. & Goss, D. J. The Journal of biological chemistry 275, 17740—17746 (2000).

32. Eukaryotic mRNA Decapping. Coller, J. & Parker, R. Annual Review of Biochemistry 73, 861—890 (2004).

33. Structural and functional insights into eukaryotic mRNA decapping. Ling, S. H. M., Qamra, R. & Song, H. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA 2, 193—208 (2011).

34. Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N. & Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of elF4G. Molecular Cell 3, 707—716 (1999).

35. Gingras, A. C., Kennedy, S. G., O'Leary, M. A., Sonenberg, N. & Hay, N. 4E-BP1, a repressor of mRNA translation, is phosphorylated and inactivated by the Akt(PKB) signaling pathway. Genes and Development 12, 502—513 (1998).

36. Control of cytoplasmic translation in plants. Muench, D. G., Zhang, C. & Dahodwala, M. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA 3, 178—194 (2012).

37. eIF2 Phosphorylation in Cellular Stress Responses and Disease. Ron, D. & Harding, H. Translational Control in Biology and Medicine 48, 349—372 (2007).

38. Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components. Dennis, M. D., Person, M. D. & Browning, K. S. Journal of Biological Chemistry 284, 20615—20628 (2009).

39. Interaction of wheat germ translation initiation factor 2 with GDP and GTP. Shaikhin, S., Smailov, S., Lee, A., Kozhanov, E. & Iskakov, B. Biochimie 74, 447—454 (1992).

40. Translational control by 5'-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Hinnebusch, A. G., Ivanov, I. P. & Sonenberg, N. Science 352, 1413—1416 (2016).

41. Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. Kozak, M. Journal of Biological Chemistry 266, 19867—19870 (1991).

42. Specific functional interactions of nucleotides at key —3 and +4 positions flanking the initiation codon with components of the mammalian 48S translation initiation complex. Pisarev, A. V. et al. Genes & Development 20, 624—636 (2006).

43. The initiation of mammalian protein synthesis and mRNA scanning mechanism. Lomakin, I. B. & Steitz, T. A. Nature 500, 307—11 (2013).

44. Release of initiation factors from 48S complexes during ribosomal subunit joining and the link between establishment of codon-anticodon base-pairing and hydrolysis of eIF2-bound GTP. Unbehaun, A., Borukhov, S. I., Hellen, C. U. T. & Pestova, T. V. Genes & Development 18, 3078—3093 (2004).

45. Pi release from eIF2, not GTP hydrolysis, is the step controlled by start-site selection during eukaryotic translation initiation. Algire, M. A., Maag, D. & Lorsch, J. R. Molecular cell 20, 251—262 (2005).

46. Sliding of a 43S ribosomal complex from the recognized AUG codon triggered by a delay in eIF2-bound GTP hydrolysis. Terenin, I. M. et al. Nucleic Acids Research 44, 1882—1893 (2016).

47. Stringency of start codon selection modulates autoregulation of translation initiation factor eIF5. Loughran, G., Sachs, M. S., Atkins, J. F. & Ivanov, I. P. Nucleic Acids Research 40, 2898—2906 (2012).

48. Insertion mutagenesis to increase secondary structure within the 5' noncoding region of a eukaryotic mRNA reduces translational efficiency. Pelletier, J. & Sonenberg, N. Cell 40, 515—526 (1985).

49. Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes. Kozak, M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 83, 2850—2854 (1986).

50. Downstream secondary structure facilitates recognition of initiator codons by eukaryotic ribosomes. Kozak, M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87, 8301—8305 (1990).

51. Translation Initiation on Mammalian mRNAs with Structured 5'UTRs Requires DExH-Box Protein DHX29. Pisareva, V. P., Pisarev, A. V., Komar, A. A., Hellen, C. U. T. & Pestova, T. V. Cell 135, 1237—1250 (2008).

52. Bypassing of stems versus linear base-by-base inspection of mammalian mRNAs during ribosomal scanning. Abaeva, I. S., Marintchev, A., Pisareva, V. P., Hellen, C. U. T. & Pestova, T. V. The EMBO journal 30, 115—29. ISSN: 1460-2075 (2011).

53. 10 cis-Regulatory Sequences and trans-Acting Factors in Translational Control. Hentze, M. W., Gebauer, F. & Preiss, T. Cold Spring Harbor Monograph Archive 48, 269—295 (2007).

54. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. & Spirin, A. S. Nucleic Acids Research 39, 5555—5567 (2011).

55. How does a scanning ribosomal particle move along the 5'-untranslated region of eukaryotic mRNA? Brownian ratchet model. Spirin, A. S. Biochemistry 48, 10688—10692 (2009).

56. The DEAD box protein eIF4A. 1. A minimal kinetic and thermodynamic framework reveals coupled binding of RNA and nucleotide. Lorsch, J. R. & Herschlag, D. Biochemistry 37, 2180—2193 (1998).

57. The DEAD box protein eIF4A. 2. A cycle of nucleotide and RNA-dependent conformational changes. Lorsch, J. R. & Herschlag, D. Biochemistry 37, 2194—2206 (1998).

58. eIF4A: the godfather of the DEAD box helicases. Rogers, G. W., Komar, A. A. & Merrick, W. C. Progress in nucleic acid research and molecular biology 72, 307—331 (2002).

59. Wheat germ translation initiation factor eIF4B affects eIF4A and eIFiso4F helicase activity by increasing the ATP binding affinity of eIF4A. Bi, X., Ren, J. & Goss, D. J. Biochemistry 39, 5758—5765 (2000).

60. Free Initiation Factors eIF4A and eIF4B Are Dispensable for Translation Initiation on Uncapped mRNAs. Sakharov, P. A. & Agalarov, S. C. Biochemistry (Moscow) 81, 1198—1204 (2016).

61. Structural roles for human translation factor eIF3 in initiation of protein synthesis. Siridechadilok, B., Fraser, C. S., Hall, R. J., Doudna, J. A. & Nogales, E. Science 310, 1513—1515 (2005).

62. Nucleotide sequences of 5'-terminal ribosome-protected initiation regions from two reovirus messages. Kozak, M. Nature 269, 391—394 (1977).

63. Initiator regions from the small size class of reovirus messenger RNA protected by rabbit reticulocyte ribosomes. Lazarowitz, S. & Robertson, H. Journal of Biological Chemistry 252, 7842—7849 (1977).

64. mRNA helicase activity of the ribosome. Takyar, S., Hickerson, R. P. & Noller, H. F. Cell 120, 49—58 (2005).

65. 5' UTR m6A Promotes Cap-Independent Translation. Meyer, K. D. et al. Cell 163, 999—1010 (2015).

66. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Linder, B. et al. Nat Methods 12, 767—772 (2015).

67. Resource Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and near Stop Codons. Meyer, K. D. et al. Cell 149, 1635—1646 (2012).

68. The Eukaryotic Translation Initiation Factors eIF1 and eIF1A Induce an Open Conformation of the 40S Ribosome. Passmore, L. A. et al. Molecular Cell 26, 41—50 (2007).

69. Structure and dynamics of the mammalian ribosomal pretranslocation complex. Budkevich, T. et al. Molecular cell 44, 214—224 (2011).

70. Crystal structure of the eukaryotic ribosome. Ben-Shem, A., Jenner, L., Yusupova, G. & Yusupov, M. Science 330, 1203—1209 (2010).

71. By RajBhandary, U. & Chow, C. in tRNA Structure, Biosynthesis, and Function (eds Soll, D. & RajBhandary, U.) 511-28 (Am. Soc. Microbiol., Washington, 1995).

72. A prokaryotic-like mode of cytoplasmic eukaryotic ribosome binding to the initiation codon during internal translation initation of hepatitis C and classical swine fever virus RNAs. Pestova, T. V., Shatsky, I. N., Fletcher, S. P., Jackson, R. J. & Hellen, C. U. T. Genes & development 12, 67—83 (1998).

73. Eukaryotic translation initiation machinery can operate in a bacterial-like mode without eIF2. Terenin, I. M., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E. & Shatsky, I. N. Nature structural & molecular biology 15, 836—841 (2008).

74. GTP-independent tRNA Delivery to the Ribosomal P-site by a Novel Eukaryotic Translation Factor. Dmitriev, S. E. et al. Journal of Biological Chemistry 285, 26779—26787 (2010).

75. Translation initiation in Archaea: conserved and domain-specific features. Benelli, D. & Londei, P. Biochemical Society Transactions 39, 89—93 (2011).

76. Distinctive features of the 5'-terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs. Montoya, J., Ojala, D. & Attardi, G. (1981).

77. The Giardia genome project database. McArthur, A. G. et al. FEMS Microbiology Letters 189, 271—273 (2000).

78. Unusual gene organization in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Bruchhaus, I., Leippe, M., Lioutas, C. & Tannich, E. DNA and cell biology 12, 925—933 (1993).

79. Four translation initiation pathways employed by the leaderless mRNA in eukaryotes. Akulich, K. A. et al. Scientific Reports 6 (2016).

80. Unusual ribosome binding properties of mRNA encoding bacteriophage X repressor. Balakin, A. G., Skripkin, E. A., Shatsky, I. N. & Bogdanov, A. A. Nucleic Acids Research 20, 563—571 (1992).

81. A Leaderless mRNA Can Bind to Mammalian 80S Ribosomes and Direct Polypeptide Synthesis in the Absence of Translation Initiation Factors. Andreev, D. E., Terenin, I. M., Dunaevsky, Y. E., Dmitriev, S. E. & Shatsky, I. N. Molecular and cellular biology 26, 3164—3169 (2006).

82. Accuracy of in vitro protein synthesis: Translation of polyuridylic acid by cellfree extracts of human fibroblasts. Buchanan, J. H., Bunn, C. L., Lappin, R. I. & Stevens, A. Mechanisms of ageing and development 12, 339—353 (1980).

83. Внутренняя инициация трансляции на полиуридиловой последовательности матричного полирибонуклеотида в бактериальной бесклеточной системе. Согорин, Е. А., Агаларов, С. Ч. & Спирин, А. С. Биохимия (Москва) 78, 1710—1714 (2013).

84. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? Kiselev, L. & Frolova, L. The EMBO journal 22, 175—182 (2003).

85. Structural basis for stop codon recognition in eukaryotes. Brown, A., Shao, S., Murray, J., Hegde, R. S. & Ramakrishnan, V. Nature 524, 493—496 (2015).

86. The crystal structure of human eukaryotic release factor eRF1—mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis. Song, H. et al. Cell 100, 311—321 (2000).

87. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Dever, T. E. & Green, R. Cold Spring Harbor perspectives in biology 4 (2012).

88. Exploring contacts of eRF1 with the 3'-terminus of the P site tRNA and mRNA stop signal in the human ribosome at various translation termination steps. Bulygin, K. N., Graifer, D. M., Hountondji, C., Yu, L. & Karpova, G. G. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms 1860, 782—793. ISSN: 1874-9399 (2017).

89. The role of ABCE1 in eukaryotic posttermination ribosomal recycling. Pisarev, A. V. et al. Molecular Cell 37, 196—210 (2010).

90. Termination and post-termination events in eukaryotic translation 1st ed. By Jackson, R. J., Hellen, C. U. T. & Pestova, T. V., 45-93 (Elsevier Inc., 2012).

91. In Vitro Reconstitution of Eukaryotic Translation Reveals Cooperativity between Release Factors eRF1 and eRF3. Alkalaeva, E. Z., Pisarev, A. V., Frolova, L. Y., Kisselev, L. L. & Pestova, T. V. Cell 125, 1125—1136 (2006).

92. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRF1-and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. Frolova, L. et al. Rna 2, 334 (1996).

93. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Shirokikh, N. E. et al. Nucleic acids research 38, e15—e15 (2009).

94. Two-step model of stop codon recognition by eukaryotic release factor eRF1. Kryuchkova, P. et al. Nucleic acids research 41, 4573—4586 (2013).

95. Stabilization of eukaryotic ribosomal termination complexes by deacylated tRNA. Susorov, D., Mikhailova, T., Ivanov, A., Sokolova, E. & Alkalaeva, E. Nucleic acids research 43, 3332—3343 (2015).

96. Structure of a human translation termination complex. Matheisl, S., Berninghausen, O., Becker, T. & Beckmann, R. Nucleic Acids Research 43, 8615—8626 (2015).

97. Reassigning stop codons via translation termination: How a few eukaryotes broke the dogma. Alkalaeva, E. & Mikhailova, T. BioEssays (2016).

98. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Graber, T. E. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 16205—10 (2013).

99. Co-Translational Folding: A Novel Modulator of Local Protein Expression in Mammalian Neurons? Schieweck, R., Popper, B. & Kiebler, M. A. Trends in Genetics 32, 788—800 (2016).

100. Регуляция синтеза белка в бесклеточной системе при тепловом шоке. Денисенко, О. Н. Доклады Академии наук СССР 297, 725—727 (1987).

101. Detecting and measuring cotranslational protein degradation in vivo. Turner, G. C. & Varshavsky, A. Science 289, 2117—2120 (2000).

102. In vivo aspects of protein folding and quality control. Balchin, D., Hayer-Hartl, M. & Hartl, F. U. Science 353 (2016).

103. Co-translational protein folding: progress and methods. Thommen, M., Holtkamp, W. & Rodnina, M. V. Current Opinion in Structural Biology 42, 83—89 (2017).

104. eIF5A functions globally in translation elongation and termination. Schuller, A. P., Wu, C. C.-C., Dever, T. E., Buskirk, A. R. & Green, R. Molecular Cell 66, 194—205 (2017).

105. eIF5A promotes translation of polyproline motifs. Gutierrez, E. et al. Molecular cell 51, 35—45 (2013).

106. Crystal structure of hypusine-containing translation factor eIF5A bound to a rotated eukaryotic ribosome. Melnikov, S. et al. Journal of molecular biology 428, 3570—3576 (2016).

107. Structure of the hypusinylated eukaryotic translation factor eIF-5A bound to the ribosome. Schmidt, C. et al. Nucleic acids research 44, 1944—1951 (2016).

108. A comparison of mammalian and yeast pre-mRNA 3'-end processing. Keller, W. & Minvielle-Sebastia, L. Current opinion in cell biology 9, 329—336 (1997).

109. The role of the poly(A) binding protein in the assembly of the Cap-binding complex during translation initiation in plants The role of the poly(A) binding protein in the assembly of the Cap-binding complex during translation initiation in plants. Gallie, D. R. Translation 2 (2014).

110. A single domain of yeast poly (A)-binding protein is necessary and sufficient for RNA binding and cell viability. Sachs, A. B., Davis, R. & Kornberg, R. Molecular and cellular biology 7, 3268—3276 (1987).

111. Translation Initiation Factors eIF-iso4G and eIF-4B Interact with the Poly(A)-binding Protein and Increase Its RNA Binding Activity. Le, H. et al. Journal of Biological Chemistry 272, 16247—16255 (1997).

112. Multiple functions for the poly (A)-binding protein in mRNA decapping and deadenylation in yeast. Caponigro, G. & Parker, R. Genes & Development 9, 2421—2432 (1995).

113. The cap and poly(A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency. Gallie, D. R. Genes & development 5, 2108—2116 (1991).

114. Cap-poly(A) synergy in mammalian cell-free extracts. Investigation of the requirements for poly(A)-mediated stimulation of translation initiation. Michel, Y. M., Poncet, D., Piron, M., Kean, K. M. & Borman, A. M. Journal of Biological Chemistry 275, 32268—32276 (2000).

115. Circularization of mRNA by Eukaryotic Translation Initiation Factors. Wells, S. E., Hillner, P. E., Vale, R. D. & Sachs, A. B. Molecular Cell 2, 135—140 (1998).

116. Haemoglobin synthesis and polysomes in intact reticulocytes. Philipps, G. R. Nature 205, 567—570 (1965).

117. Wheat Germ Poly(A) Binding Protein Enhances the Binding Affinity of Eukaryotic Initiation Factor 4F and (iso)4F for Cap Analogues. Wei, C.-c., Balasta, M. L., Ren, J. & Goss, D. J. Biochemistry 37, 1910—1916 (1998).

118. Translation initiation factor (eIF) 4B affects the rates of binding of the mRNA m7G cap analogue to wheat germ eIFiso4F and eIFiso4F-PABP. Khan, M. A. & Goss, D. J. Biochemistry 44, 4510—4516 (2005).

119. A newly identified N-terminal amino acid sequence of human eIF4G binds poly(A)-binding protein and functions in poly(A)- dependent translation. Imataka, H., Gradi, A. & Sonenberg, N. EMBO Journal 17, 7480—7489 (1998).

120. Mammalian poly(A)-binding protein is a eukaryotic translation initiation factor, which acts via multiple mechanisms. Kahvejian, A., Svitkin, Y. V., Sukarieh, R., Boutchou, M.-n. M. & Sonenberg, N. Genes and Development 19, 104—113 (2005).

121. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Tarun, S. & Sachs, A. Genes & development 9, 2997 (1995).

122. The yeast poly(A)-binding protein Pab1p stimulates in vitro poly(A)-dependent and cap-dependent translation by distinct mechanisms. Otero, L. J., Ashe, M. P. & Sachs, A. B. EMBO Journal 18, 3153—3163 (1999).

123. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A. & Jacobson, A. Nature 453, 1276—1280 (2008).

124. Poly(A)-Binding Protein Acts in Translation Termination via Eukaryotic Release Factor 3 Interaction and Does Not Influence [ PSI + ] Propagation. Cosson, B. et al. Molecular and cellular biology 22, 3301—3315 (2002).

125. Roque, S. et al. Interaction between the poly(A)-binding protein Pab1 and the eukaryotic release factor eRF3 regulates translation termination but not mRNA decay in Saccharomyces cerevisiae. RNA 21, 124—134 (2015).

126. The Eukaryotic Polypeptide Chain Releasing Factor (eRF3/GSPT) Carrying the Translation Termination Signal to the 3'-Poly(A) Tail of mRNA. Direct association of eRF3/GSPT with polyadenylate-binding protein. Hoshino, S.-i., Imai, M., Kobayashi, T., Uchida, N. & Katada, T. Journal of Biological Chemistry 274, 16677—16680 (1999).

127. A novel role of the mammalian GSPT/eRF3 associating with poly(A)-binding protein in Cap/Poly(A)-dependent translation. Uchida, N., Hoshino, S.-i., Imataka, H., Sonenberg, N. & Katada, T. Journal of Biological Chemistry 277, 50286—50292 (2002).

128. PABP enhances release factor recruitment and stop codon recognition during translation termination. Ivanov, A. et al. Nucleic Acids Research 44, 7766—7776 (2016).

129. Prediction of protein function and pathways in the genome era. Gabaldon, T. & Huynen, M. A. Cellular and molecular life sciences 61, 930—944 (2004).

130. The Essential Vertebrate ABCE1 Protein Interacts with Eukaryotic Initiation Factors. Chen, Z.-q. et al. The Journal of biological chemistry 281, 7452—7457 (2006).

131. X-ray structure of RLI, an essential twin cassette ABC ATPase involved in ribosome biogenesis and HIV capsid assembly. Karcher, A., Bu, K., Martens, B., Jansen, R.-P., Hopfner, K.-P. et al. Structure 13, 649—659 (2005).

132. Functional link between ribosome formation and biogenesis of iron-sulfur proteins. Yarunin, A. et al. The EMBO journal 24, 580—588 (2005).

133. The Essential ATP-binding Cassette Protein RLI1 Functions in Translation by Promoting Preinitiation Complex Assembly. Dong, J. et al. The Journal of biological chemistry 279, 42157—42168 (2004).

134. eIF3 peripheral subunits rearrangement after mRNA binding and start-codon recognition. Simonetti, A. et al. Molecular cell 63, 206—217 (2016).

135. ABCE1 A special factor that orchestrates translation at the crossroad between recycling and initiation. Mancera-Martinez, E., Brito Querido, J., Valasek, L. S., Simonetti, A. & Hashem, Y. RNA biology, 00—00 (2017).

136. The iron-sulphur protein RNase L inhibitor functions in translation termination. Khoshnevis, S. et al. EMBO reports 11, 214—219 (2010).

137. Kinetic analysis reveals the ordered coupling of translation termination and ribosome recycling in yeast. Shoemaker, C. J. & Green, R. 108 (2011).

138. Cryoelectron microscopic structures of eukaryotic translation termination complexes containing eRF1-eRF3 or eRF1-ABCE1. Preis, A. et al. Cell reports 8, 59—65 (2014).

139. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Warner, J. R., Knopf, P. M. & Rich, A. Proceedings of the National Academy of Sciences 49, 122—129 (1963).

140. Slow peptide bond formation by proline and other N-alkylamino acids in translation. Pavlov, M. Y. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 50—54 (2009).

141. Electrostatics in the ribosomal tunnel modulate chain elongation rates. Lu, J. & Deutsch, C. Journal of molecular biology 384, 73—86 (2008).

142. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3' UTRs In Vivo. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G. & Green, R. Cell 162, 872—884 (2015).

143. Exosome-mediated recognition and degradation of mRNAs lacking a termination codon. Van Hoof, A., Frischmeyer, P. A., Dietz, H. C. & Parker, R. Science 295, 2262—2264 (2002).

144. Nonsense-mediated mRNA decay splicing, translation and mRNP dynamics. Maquat, L. E. Nature reviews Molecular cell biology 5, 89—99 (2004).

145. Endonucleolytic cleavage of eukaryotic mRNAs with stalls in translation elongation. Doma, M. K. & Parker, R. Nature 440, 561—564 (2006).

146. Mechanisms of endonuclease-mediated mRNA decay. Schoenberg, D. R. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA 2, 582—600 (2011).

147. Dom34:Hbs1 promotes subunit dissociation and peptidyl-tRNA drop-off to initiate no-go decay. Shoemaker, C. J., Eyler, D. E. & Green, R. Science 330, 369—372 (2010).

148. Dissociation by Pelota, Hbs1 and ABCE1 of mammalian vacant 80S ribosomes and stalled elongation complexes. Pisareva, V. P., Skabkin, M. A., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. & Pisarev, A. V. The EMBO Journal 30, 1804—1817 (2011).

149. Translation of nonSTOP mRNA is repressed post-initiation in mammalian cells. Akimitsu, N., Tanaka, J. & Pelletier, J. The EMBO journal 26, 2327—2338 (2007).

150. A ribosome-bound quality control complex triggers degradation of nascent peptides and signals translation stress. Brandman, O. et al. Cell 151, 1042—1054 (2012).

151. Cdc48-associated complex bound to 60S particles is required for the clearance of aberrant translation products. Defenouillere, Q. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 110, 5046—5051 (2013).

152. Structural basis for mRNA surveillance by archaeal Pelota and GTP-bound EF1a complex. Kobayashi, K. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 17575—17579 (2010).

153. Structure of the Dom34-Hbs1 complex and implications for no-go decay. Chen, L. et al. Nature structural & molecular biology 17, 1233—1240 (2010).

154. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. Van Den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R. & Seraphin, B. The EMBO journal 33, 1—12 (2014).

155. Dom34 Rescues Ribosomes in 3' Untranslated Regions. Guydosh, N. R. & Green, R. CELL 156, 950—962 (2014).

156. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Kervestin, S. & Jacobson, A. Nature Reviews Molecular Cell Biology 13, 700—712 (2012).

157. A faux 3'-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsense-mediated mRNA decay. Amrani, N. et al. Nature 432, 112—118 (2004).

158. mRNA destabilization triggered by premature translational termination depends on at least three cis-acting sequence elements and one trans-acting factor. Stuart, W. P., Brown, H. & Jacobson, A. Genes & development 7, 1737—1754 (1993).

159. Mechanism and regulation of the nonsense-mediated decay pathway. Hug, N., Longman, D. & Caceres, J. F. Nucleic acids research 44, 1483—1495 (2016).

160. Nonsense-mediated mRNA decay in health and disease. Frischmeyer, P. A. & Dietz, H. C. Human molecular genetics 8, 1893—1900 (1999).

161. A meta-analysis of nonsense mutations causing human genetic disease. Mort, M., Ivanov, D., Cooper, D. N. & Chuzhanova, N. A. Human mutation 29, 1037—1047 (2008).

162. Antisense oligonucleotide-directed inhibition of nonsense-mediated mRNA decay. Nomakuchi, T. T., Rigo, F., Aznarez, I. & Krainer, A. R. Nature biotechnology 34, 164—166 (2016).

163. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Woodcock, D. et al. Nucleic acids research 17, 3469—3478 (1989).

164. Translation of non-capped mRNAs in a eukaryotic cell-free system: acceleration of initiation rate in the course of polysome formation. Alekhina, O. M., Vassilenko, K. S. & Spirin, A. S. Nucleic acids research 35, 6547—6559 (2007).

165. Step-wise formation of eukaryotic double-row polyribosomes and circular translation of polysomal mRNA. Kopeina, G. S. et al. Nucleic Acids Research 36, 2476—2488 (2008).

166. YB-1 Synthesis Is Regulated by mTOR Signaling Pathway. Lyabin, D. N., Eliseeva, I. A. & Ovchinnikov, L. P. PLoS ONE 7, 1—11 (2012).

167. Amicoumacin A induces cancer cell death by targeting the eukaryotic ribosome. Prokhorova, I. V. et al. Nature Publishing Group, 1—10 (2016).

168. In vitro transcription: preparative RNA yields in analytical scale reactions. Pokrovskaya, I. D. & Gurevich, V. V. Analytical biochemistry 220, 420—423 (1994).

169. By Shirokov, V. A., Kommer, A., Kolb, V. A. & Spirin, A. S. in In Vitro Transcription and Translation Protocols (ed Grandi, G.) 19-55 (Humana Press, Totowa, NJ, 2007).

170. A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes. Madin, K., Sawasaki, T., Ogasawara, T. & Endo, Y. Proceedings of the National Academy of Sciences 97, 559—564 (2000).

171. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Erickson, A. H. & Blobel, G. Methods in enzymology 96, 38—50 (1983).

172. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Zubay, G. Annual review of genetics 7, 267—287 (1973).

173. Migration of 40S ribosomal subunits on messenger RNA in the presence of edeine. Kozak, M. & Shatkin, A. J. The Journal of biological chemistry 253, 6568—6577 (1978).

174. Regulation of mRNA entry into polysomes. Parameters affecting polysome size and the fraction of mRNA in polysomes. Nelson, E. M. & Winkler, M. M. Journal of Biological Chemistry 262, 11501—11506 (1987).

175. A cross-kingdom internal ribosome entry site reveals a simplified mode of internal ribosome entry. Terenin, I. M. et al. Molecular and cellular biology 25, 7879—88 (2005).

176. Functional characterization of IRESes by an inhibitor of the RNA helicase eIF4A. Bordeleau, M.-E. et al. Nature chemical biology 2, 213—220 (2006).

177. Лидерные последовательности эукариотических мРНК могут быть связанными одновременно с инициирующей 80S рибосомой и 40S рибосомной субъединицей. Согорин, Е. А. et al. Биохимия (Москва) 77, 437—441 (2012).

178. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Nirenberg, M. W. & Matthaei, J. H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 47, 1588—602 (1961).

179. Zum Mechanismus der Proteinbiosynthese I. Die Bindung von Matrizen-RNS und Aminoacyl-RNS an Ribosomen. Matthaei, H., Amelunxen, F., Eckert, K. & Heller, G. Berichte der Bunsengesellschaft für physikalische Chemie 68, 735—742 (1964).

180. Effective non-viral leader for cap-independent translation in a eukaryotic cell-free system. Shaloiko, L. A. et al. Biotechnology and Bioengineering 88, 730—739 (2004).

181. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. Wolin, S. L. & Walter, P. The EMBO journal 7, 3559—3569 (1988).

182. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Myasnikov, A. G. et al. Nature communications 5, 5294 (2014).

183. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P. & Spirin, A. S. Nucleic Acids Research 43, 618—628 (2015).

184. COTTON EMBRYOGENESIS. Polysome Formation in the Zygote. Jensen, W. A. The Journal of cell biology 36, 403—406 (1968).

185. Formation of helical polyribosomes in poliovirus-infected cells of the 37 RC line. Djaczenko, W., Benedetto, A. & Pezzi, R. The Journal of cell biology 45, 173—177 (1970).

186. Comparison of trophozoite helical polysomes with cyst ribosomogen microcrystals in axenic Entamoeba sp. Barker, D. C. & Swales, L. S. Cell Differentiation 1, 307—315 (1972).

187. The Three-Dimensional Organization of Polyribosomes in Intact Human Cells. Brandt, F., Carlson, L. A., Hartl, F. U., Baumeister, W. & Griinewald, K. Molecular Cell 39, 560—569 (2010).

188. Purification and properties of firefly luciferase. Deluca, M. & McElroy, W. Methods in enzymology 57, 3—15 (1978).

189. Folding of firefly luciferase during translation in a cell-free system. Kolb, V. A., Makeyev, E. V. & Spirin, A. S. The EMBO journal 13, 3631—7 (1994).

190. Removal of twelve C-terminal amino acids from firefly luciferase abolishes activity. Sala-Newby, G., Kalsheker, N. & Campbell, A. K. Biochemical and biophysical research communications 172, 477—482 (1990).

191. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Craggs, T. D. Chemical Society reviews 38, 2865—75 (2009).

192. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M. & Funatsu, T. Analytical Biochemistry 414, 173—178 (2011).

193. Termination and post-termination events in eukaryotic translation. Jackson, R. J., Hellen, C. & Pestova, T. V. Adv Protein Chem Struct Biol 86, 45—93 (2012).

194. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Dever, T. E. & Green, R. Cold Spring Harbor perspectives in biology 4 (2012).

195. The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Pestova, T. V. & Kolupaeva, V. G. Genes & Development 16, 2906—2922 (2002).

196. Internal translation initiation and eIF4F/ATP-independent scanning of mRNA by eukaryotic ribosomal particles. Agalarov, S. C., Sakharov, P. A., Fattakhova, D. K., Sogorin, E. A. & Spirin, A. S. Scientific reports 4, 4438 (2014).

197. The 5'-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo. Gallie, D. R., Sleat, D. E., Watts, J. W., Turner, P. C. & Wilson, T. M. A. Nucleic Acids Research 15, 3257—3273 (1987).

198. Deletion analysis of the 5'-untranslated leader sequence of tobacco mosaic virus RNA. Takamatsu, N. et al. Journal of virology 65, 1619—1622 (1991).

199. 5'-poly (A) sequence as an effective leader for translation in eukaryotic cellfree systems. Gudkov, A. T., Ozerova, M. V., Shiryaev, V. M. & Spirin, A. S. Biotechnology and bioengineering 91, 468—473 (2005).

200. Naturally occurring dicistronic cricket paralysis virus RNA is regulated by two internal ribosome entry sites. Wilson, J. E., Powell, M. J., Hoover, S. E. & Sarnow, P. Molecular and cellular biology 20, 4990—4999 (2000).

201. Initiation of Protein Synthesis from the A Site of the Ribosome. Wilson, J. E., Pestova, T. V., Hellen, C. U. & Sarnow, P. Cell 102, 511—520 (2000).

202. Translation elongation after assembly of ribosomes on the Cricket paralysis virus internal ribosomal entry site without initiation factors or initiator tRNA. Pestova, T. V. & Hellen, C. U. T. Genes & Development 17, 181—186 (2003).

203. Multiple Parallel Pathways of Translation Initiation on the CrPV IRES. Petrov, A., Grosely, R., Chen, J., O'Leary, S. E. & Puglisi, J. D. Molecular Cell 62, 92—103 (2016).

204. Position of the CrPV IRES on the 40S subunit and factor dependence of IRES/80S ribosome assembly. Pestova, T. V., Lomakin, I. B. & Hellen, C. U. EMBO reports 5, 906—913 (2004).