Видовой состав и свойства биопленкообразующих бактерий при хронических отитах у собак и совершенствование методов лечения больных животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Карабанов Сергей Юрьевич

• Карабанов Сергей Юрьевич
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Карабанов Сергей Юрьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биопленки - одна из основных проблем при лечении животных с хроническими отитами

1.2. Биопленки - как эффективный способ выживания микроорганизмов в окружающей среде

1.2.1. Стадии формирования биопленок

1.2.2. Матрикс биопленки

1.2.3. Взаимодействие микроорганизмов в биопленке

1.3. Роль биопленок в инфекционной патологии животных

1.4. Методы лечения собак при хронических отитах

1.5. Стратегия борьбы с инфекциями, осложненными биопленками

1.5.1. Антимикробные препараты, препятствующие адгезии бактерий на эпителиальных покровах

1.5.2. Средства, обеспечивающие разрушение матрикса

биопленки

1.5.3. Действие бактериофагов, антибиотиков и аналогов сигнальных молекул на биопленки

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. Материалы и методы исследований

2.1. Материалы исследований

2.2. Методы исследований

2.2.1. Микробиологические методы исследований

2.2.1.1. Выделение и идентификация микроорганизмов

2.2.1.2. Выращивание биопленок

2.2.1.3. Получение биопленок на предметных стеклах

2.2.1.4. Получение биопленок на покровных стеклах

2.2.1.5. Определение антибиотикочувствительности микроорганизмов

2.2.1.6. Определение жизнеспособности биопленок

2.2.2. Клинические методы исследований

2.2.3. Гематологические методы исследований

2.2.4. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Состав микрофлоры, выделенной при отитах собак

3.2. Результаты изучения антибиотикочувствительности микроорганизмов, выделенных из слухового канала от больных

отитом собак

3.3. Создание и испытание биологических моделей отита

3.4. Определение эффективности различных схем антибиотикотерапии на биологической модели отитов

3.5. Результаты изучения эффективности антибиотикотерапии при отитах собак с использованием ферментных препаратов

3.5.1. Оценка эффективности лечения собак с отитами по микробиологическим показателям

3.5.2. Динамика клинической картины у собак, больных

отитами, в процессе лечения

3.5.3. Гематологические показатели крови у собак с отитами при лечении по различным схемам

4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1. ВЫВОДЫ

5.2. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБП - антибактериальный препарат. В - выделения. Г - гиперемия. З - зуд. ЗП - запах.

КОЕ - колониеобразующая единица.

МБЭК - минимальная биопленко-элиминирующая концентрация. МПК - минимальная подавляющая концентрация. О - отечность. ОП - оптическая плотность.

ФГБОУ ВО МГУПП - ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств».

ФКМ - фазово-контрастная микроскопия.

MBEC - от англ. «Minimum biofilm eliminating concentrations» - минимальная биопленко элиминирующая концентрация.

MDT - от англ. «Multidrug tolerance» - мультитолерантность. MRSA - от англ. «Methicillin resistant Staphylococcus aureus» - метицил-лин-устойчивые Staphylococcus aureus.

MSSA - от англ. «Methicillin sensitive Staphylococcus aureus» - метицил-лин-чувствительные Staphylococcus aureus.

QS - от англ. «quorum sensing» - система бактериального сигналинга.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Видовой состав и свойства биопленкообразующих бактерий при хронических отитах у собак и совершенствование методов лечения больных животных»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Хронические отиты собак представляют существенную проблему для ветеринарной медицины в результате широкого распространения болезни и сложностей лечения животных (Усевич В.М., 2010; Плешакова В.И., 2014; Scott D.W., 2001; Zur G., 2013).

В 60 - 80% случаев возникновения у животных инфекционных болезней бактериальной этиологии основную роль играют микроорганизмы, находящиеся в фенотипе биопленки (Мальцев С.В., 2011; Голуб А.В., 2012; Bjarnsholt Т., 2013).

У собак при хронических отитах в 80% случаев выявляются биопленкообразующие бактерии, обладающие множественной лекарственной устойчивостью (Грязнева Т.Н., 2018).

Биопленки - это сообщества микроорганизмов, которые окружены мат-риксом, состоящим из полимерных внеклеточных веществ, синтезируемых бактериями и прикрепленных к какой-либо биотической или абиотической поверхности.

Важным свойством биопленок является высокая устойчивость находящихся в них микроорганизмов к различным факторам внешней среды, самым значимым из которых является антибиотикоустойчивость (Бехало В.А., 2010; Чеботарь И.В., 2012; Costerton J.W., 2015).

В последние два десятилетия в нарастающих масштабах в медицине проводятся исследования роли биопленочных инфекций при различных патологиях (Сидоренко С.В., 2003; Божкова С.А., 2013; Trautner W.B., 2004; Stoodley P., 2011).

В отечественной ветеринарии научные работы в данном направлении единичны (Плешакова В.И., 2013; Уткина Т.М., 2014; Карабанов С.Ю., 2015; Грязнева Т.Н., 2018 и др.).

Недостаточно изучена этиология биопленочной инфекции, не разработаны методические подходы к разрушению биопленок и эффективные мето-

ды лечения собак с хроническими отитами, вызванными биопленкообразующими бактериями.

Поэтому, актуальным в научном и практическом аспектах является изучение видового состава и биологических свойств биопленкообразующих бактерий при хронических отитах у собак и разработка и усовершенствование методов лечения больных животных.

Степень разработанности проблемы. Теоретической базой для исследования послужили работы таких ученых, как Хмель И.А., 2011; Гостев В.В., Сидоренко С.В., Лямин А.В., Чеботарь И.В., Голуб А.В., Окулич В.К., Скородумов Д.И., 2012; Тец В.В., Чернявский В.И., 2013; Donlan R.M., 2002; Pace J.L., Rupp M.E., Finch R.G., 2006; Proal A., 200S; Percival S.L., Knottenbelt D.C., Cochrane C.A., Cruz H., Williams D.W. 2011 и др.

В отечественной ветеринарии имеются отдельные работы по этиологии и специфике лечения животных с биопленочной инфекцией (Скородумов Д.И., 2012), которые не затрагивают проблему хронических отитов у собак.

Тема работы является составной частью научных исследований, проводимых кафедрой микробиологии ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина».

Цель исследований - изучить видовой состав и свойства биопленкообразующих бактерий ушных каналов собак при хронических отитах и усовершенствовать методы лечения больных животных.

Для решения были поставлены следующие задачи:

1. Изучить видовой состав микрофлоры, а также различные ассоциации микроорганизмов в слуховом канале собак при хронических отитах.

2. Определить in vitro способность этиологически наиболее значимых и часто обнаруживаемых при отитах собак микроорганизмов к формированию биопленки.

3. Определить антибиотикочувствительность выделенных из слухового канала собак микроорганизмов, входящих в состав биопленки.

4. Создать биологические модели отитов с биопленочной инфекцией и определить на их основе эффективность различных схем антибиотикотера-пии в сравнительном аспекте.

5. Разработать эффективный метод повышения антибиотикочувстви-тельности бактерий в составе биопленки.

6. Определить бактерицидное действие антибиотиков и ферментного комплекса «Вобэнзим» в отношении биопленкообразующих бактерий, выделенных при хронических отитах у собак.

7. Провести клинические испытания нового метода лечения собак при хронических отитах с использованием антибиотиков и ферментного препарата «Вобэнзим» и внедрить его в ветеринарную практику.

Научная новизна.

1. Впервые определены виды микроорганизмов, способных формировать биопленки при отитах собак, дана количественная оценка интенсивности образования ими биопленки в слуховом канале собак при воспалительных процессах.

2. Впервые проведено сравнительное изучение бактерицидного действия различных антимикробных препаратов на культуры S. aureus, S. intermedius и P. aeruginosa, находящиеся в «планктонном виде» и в составе биопленки.

3. Созданы биологические модели отитов с биопленочной инфекцией и определена эффективность различных схем антибиотикотерапии.

4. Впервые визуализировано разрушение биопленки под действием антибиотиков и ферментов.

5. Установлено in vitro снижение резистентности бактерий в фенотипе биопленки к антибиотикам в присутствии ферментного препарата «Вобэн-зим».

6. Предложен новый методический подход по повышению эффективности терапии собак при хронических отитах с использованием антибиотиков и ферментных препаратов.

Теоретическая и практическая значимость. На основе проведенных исследований определен состав микрофлоры, ассоциирующийся с хроническими отитами собак и способность отдельных ее представителей формировать биопленки, что послужило обоснованием для разработки нового метода лечения животных при данной патологии как биопленочной инфекции.

В опытах на созданных биологических моделях отитов изучен патогенез болезни, выявлена высокая антибиотикорезистентность бактерий, находящихся в составе биопленки, определена в сравнительном аспекте эффективность различных схем антибиотикотерапии животных.

Получен комплект фотографий, на которых поэтапно зафиксирован процесс разрушения биопленки антибиотиками и ферментами.

Разработана схема лечения собак при отитах с использованием антибиотиков в сочетании с ферментным препаратом «Вобэнзим». Данная схема лечения животных прошла клинические испытания в ветеринарных клиниках Москвы, что подтверждено актами, утвержденными в установленном порядке, и внедрена в практику ветеринарии специалистами клиник «ВетТал» и «Крошка Ру» (г. Москва).

Установлена безвредность и эффективнось применения ферментного препарата «Вобэнзим» при хронических отитах собак с биопленочной инфекцией, что подтверждено результатами исследований клинических, микробиологических и гематологических показателей организма экспериментальных животных.

По результатам исследований составлен и утвержден отчет о научно-исследовательской работе «Изучение видового состава биопленкообразующих бактерий, выделенных от собак, больных хроническим отитом».

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре микробиологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина при преподавании студентам дисциплины «Ветеринарная микробиология и микология» и аспирантам - дисциплины «Экология бактерий».

Методология и методы исследований. Объектами количественных и качественных клинических, гематологических, микробиологических исследований выступали собаки разных пород и возрастов с поражением слухового канала, обусловленного биопленкообразующими микроорганизмами, а также лабораторные животные - биологические модели отита и разные виды бактерий и грибов, выделенные от животных.

В качестве лабораторно-клинических методов использовались бактериологический и микологический методы исследований микрофлоры слухового канала больных хроническим отитом собак и биологических моделей, биохимический и гематологический методы анализа крови животных, а также иммунобиологический метод при изучении свойств биопленкообразующих бактерий.

Степень достоверности. Результаты работы были получены при использовании сертифицированного оборудования и приборов, прошедших поверку средств измерений, согласно ГОСТ 8.513-84, и определяются достаточным количеством проведенных исследований.

Микробиологические исследования биоматериала проводились на базе лицензированной и аккредитованной лаборатории отдела санитарной и клинической микробиологии ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Полученные экспериментальные данные определяются достаточным количеством проведенных микробиологических и клинических исследований, на большой выборке животных. Результаты исследований обработаны методом статистического анализа.

Соответствие паспорту специальности. Диссертационная работа выполнена в следующих областях исследований:

- природа и происхождение, структура, химический состав, морфологические, биологические, физико-химические свойства патогенных бактерий и грибов;

- теоретические и прикладные проблемы экологии микроорганизмов;

- культивирование бактерий и грибов;

- природа патогенности, явления, процессы и механизмы взаимодей-

ствия микро- и макроорганизмов на клеточном, тканевом, организменном, популяционном уровнях в условиях воздействия экзогенных факторов;

- методы выделения микроорганизмов из патологического материала, индикация патогенных микроорганизмов;

- средства и методы лечения и лекарственной профилактики инфекционных болезней животных.

Работа соответствует паспорту специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологи-ей и иммунология.

Апробация работы. Основные результаты работы изложены в отчетах НИР и доложены:

- на XIII Международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2014);

- на международной конференции «Современные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» (Москва, 2016);

- на заседаниях ученых советов ветеринарно-санитарного факультета ФГБОУ ВО МГУПП (Москва, 2014, 2015) и факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина (Москва, 2018), где получили положительную оценку.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 научные статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ (Ветеринария; Российский ветеринарный журнал; Ветеринария Кубани; Ветеринария, зоотехния и биотехнология), 1 статья опубликована в материалах международной научно-практической конференции.

Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автору принадлежат организация и непосредственное осуществление микробиологических, гематологических и клинических исследований; создание биологических моделей отита с биопленочной инфекцией; разработка нового метода лечения собак с использованием антибиотиков и комплекса ферментов; проведение клинических испытаний препаратов в условиях ветеринарных клиник; анализ результатов исследований и обработ-

ка полученных данных.

В ходе выполнения диссертационной работы консультативную помощь оказывали доктор ветеринарных наук, профессор кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы и биологической безопасности ФГБОУ ВО МГУПП Скородумов Д.И. и заведующий лабораторией ветеринарной клиники «Вет-Тал» Тютюнников А.В., которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 146 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, заключение, список использованной литературы (206 источников, из них 70 отечественных и 136 иностранных авторов) и 10 страниц приложений. Работа содержит 29 таблиц и 30 рисунков.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту.

1. Видовой состав и свойства биопленкообразующих бактерий, выделенных из ушных каналов собак, больных хроническими отитами.

2. Результаты сравнительного изучения бактерицидного действия различных антибактериальных препаратов на культуры биопленкообразующих бактерий.

3. Результаты изучения патогенеза хронического отита, вызванного биопленкообразующими бактериями, на биологических моделях.

4. Новый метод лечения собак с хроническими отитами, обусловленными биопленкообразующими бактериями, с использованием антибиотиков и комплексного ферментного препарата «Вобэнзим».

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биопленки - одна из основных проблем при лечении животных с хроническими отитами

В настоящее время в ветеринарной практике отиты - это одна из наиболее часто встречающихся патологий у собак.

По данным отечественных и зарубежных авторов, среди которых Ершов П.П. и др. [15], Scott D.W. et al [184], на долю отитов приходится до 20% случаев обращений владельцев животных в ветеринарные клиники.

Учитывая большое количество домашних, а также служебных собак, проживающих в мегаполисах, проблема отитов является наиболее актуальной.

Условия, приводящие к данной патологии разнообразны. Сюда следует отнести аллергические заболевания, нарушения обмена веществ, паразитозы, аутоиммунные заболевания, инородные тела, опухоли [21, 33, 147].

Немалую роль оказывают условия содержания животного. Огромное значение имеют предрасполагающие факторы, и в первую очередь, различные аномалии строения слуховых каналов, механические травмы наружных слуховых проходов. Также, большое значение могут оказывать сопутствующие системные заболевания [135].

В целом, влияние данных факторов приводит к интенсивному инфицированию слуховых каналов патогенными и условно-патогенными микроорганизмами [19, 50].

Авторы Миронова Л.П. и др. [23], Scott D.W. [184], а также Saridomichelakis M.N. et al [74] отмечают определенные породы собак, имеющие анатомические особенности строения ушной раковины, и как следствие обладающие предрасположенностью к отитам.

К породам, имеющим предрасположенность к отиту, относят шарпеев, у которых ушной канал часто от рождения стенозирован, породы с тяжелыми висячими ушами (спаниели) или наличием густой шерсти (пудели). Наличие

данных факторов подразумевает благоприятную среду для размножения микроорганизмов и как следствие возникновения отитов. При этом микроорганизмы считают вторичной причиной отитов, зачастую препятствующих полному выздоровлению и способствующие хронитизации процесса [74].

Согласно Коновалову С.А. и др. [66], Овчинникову Р.С. и др. [11, 12], Guedeja-Marron J. [133], возбудителями хронических отитов являются бактерии и микроскопические грибы. Но в большинстве случаев выделяют бактериальные или грибково-бактериальные ассоциации.

По мнению авторов Little C.J. et al [152], Cole et al L.K. [160], хронический отит - одна из наиболее часто встречающихся форм отита у собак. При этом большую роль на хронитизацию процесса оказывает ослабленный иммунный статус организма вкупе с патогенной бактериально-грибковой микрофлорой. Широкое применение, а подчас и нерациональное использование антибактериальных препаратов при лечениях хронических бактериальных отитов способствует повышению резистентности микрофлоры.

Учитывая известную на сегодняшний день способность большинства микроорганизмов и грибов образовывать биопленку, таким образом, приобретая повышенную устойчивость к факторам внешней среды, только усугубляет течение патологического процесса [49].

Исходя из данных Чеботарь И.В. [2], O'Toole G.A. [165], Kiran S. [121], возникает порочный круг - устойчивая микрофлора начинает образовывать биопленку, таким образом, в разы снижая эффективность антибактериальной терапии, что в свою очередь заставляет использовать все больше новых антибиотиков, которые приводят к появлению новых устойчивых штаммов в составе биопленки.

Бактериальные инфекции, осложненные биопленками, в настоящее время актуальная проблема не только в медицине, но и в ветеринарии. Главная особенность бактериальных биопленок - это высокая устойчивость к антибактериальным препаратам. При терапии животных с хроническими отитами необходимо учитывать фактор способности микробных ассоциаций к образо-

ванию биопленки [14, 20, 49].

В результате повсеместной распространенности данной отоларингологической патологии среди собак, проблема остается достаточно актуальной.

1.2. Биопленки - как эффективный способ выживания микроорганизмов в окружающей среде

По мнению ряда зарубежных авторов Costerton J.W. et al [111], Watnick P. et al [203] Bjarnsholt T. et al [87], на сегодняшний день известно, что большинство популяций бактерий в природных экосистемах существуют не в виде свободно плавающих (планктонных) клеток, а в состоянии специфически организованных образований - биопленок.

По сообщениям Costerton J.W. [112] и Donlan R.M. [119] биопленки представляют собой сообщества бактерий, прикрепленных к субстрату или поверхности друг друга и окруженные матриксом, состоящим из полимерных внеклеточных субстанций.

Хмель И.А. и др. [64] определяет биопленки как физические структуры, образуемые микробными сообществами на поверхности раздела следующих фаз: жидкость - твердая поверхность, жидкость - воздух, две несмешиваю-щиеся жидкости и твердая поверхность - воздух. Зрелые биопленки могут содержать покоящиеся и некультивируемые формы бактерий.

Определение биопленок как совокупность микроколоний, образованными бактериями одного или нескольких видов, а также объединенным матрик-сом, продуцируемым клетками, поддерживает большинство авторов, таких как Тец В.В. и др. [58, 59, 60], Percival S.L. [172].

Таким образом, биопленки - это высокоорганизованные, подвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества, состоящие как из активно функционирующих клеток, так из покоящихся форм, заключенных в экзополимерный матрикс. Поверхность, на которой происходит первичная адгезия, а затем и рост собственно биопленки - называют субстратом [5, 16, 134].

Биопленки могут состоять из одного - моновидовые биопленки, или, что встречается более часто, из нескольких видов микроорганизмов - мультиви-довые биопленки [17].

Неоспоримым является тот факт, что организация бактерий в виде биопленок дает им конкурентные преимущества перед бактериями, неспособными образовывать биопленку. Ввиду сложности бактерий в составе пленки в сравнении с одиночными колониями, стоит рассматривать биопленки как отдельные микробные сообщества, в которых иначе происходят многочисленные физиологические процессы. Реакция на разнообразные факторы внешней среды у таких микробных сообществ существенно отличается от единичных бактерий, что дает первым неоспоримое конкурентное преимущество и высокую выживаемость в экологической нише, что подтверждают Лямин А.В. [28], Чеботарь И.В. [53], Тец В.В. [60].

1.2.1. Стадии формирования биопленок

Считается, что условием для образования биопленки является наличие плотной и увлажненной поверхности неорганического или органического происхождения.

В формировании биопленки выделяются несколько этапов [175].

На первом этапе в этом процессе принимают участие поверхностные структуры бактерий: выросты клеточной поверхности, жгутики, пили, обеспечивающие адгезию микроорганизмов. Бактерии, имеющие дефекты механизмов подвижности не способны к формированию биопленки [54].

С помощью факторов адгезии - микробы «прилипают» к поверхности, обеспечивая начальные процессы образования биопленки. При этом следует отметить, что эта стадия является обратимой, вследствие чего адгезировав-шиеся клетки могут вернуться в исходное (планктонное) состояние [119, 120, 195].

Далее начинается формирование микроколоний как отправная точка об-

разования сложной структуры биопленки. На этом этапе происходит транскрипция генов, необходимых для синтеза внеклеточных полисахаридов, образующих так называемый матрикс. На этапе созревания биопленки, начинаются процессы, требующие наличия особых коммуникативных сигналов, способных регулировать внутри биопленки экспрессию генов и белков. Затем, из зрелой биопленки происходит выделение (дисперсия) планктонных микроорганизмов в окружающую среду [112, 139, 150].

Биопленка является сложной трехмерной биологической структурой высшей организации жизнедеятельности микробов, в чем-то напоминающей многоклеточный организм, обладающий способностью противостоять внешним факторам агрессии.

Согласно Lewis K. [151], Marques N.H. [107], большинство находящихся в биопленке бактерий находится преимущественно в неактивной фазе жизненного цикла. Тем не менее, с поверхностных слоев биопленки происходит постоянная дисперсия свободных планктонных форм микроорганизмов, мигрирующих и колонизирующихся на других участках организма животных. По данным ряда исследователей, клетки, потерявшие связь с биопленкой, представляют большую опасность в связи с приобретением новых свойств, включая устойчивость к антибиотикам.

1.2.2. Матрикс биопленки

После необратимой адгезии к поверхности микроорганизмы начинают делиться с образованием многоклеточных слоев и синтезировать компоненты экзополимерного матрикса (Extracellular Polymeric Substance), это один из ключевых моментов образования биопленок [58, 111, 120, 135].

Благодаря наличию ферментов внеклеточный матрикс может рассматриваться как внешняя пищеварительная система, в которой также обнаруживается аккумуляция воды и питательных веществ, что позволяет проживать микроорганизмам, находящимся в фазе низкой метаболической активности

Матрикс неоднороден в разных слоях, более того, содержит в своем составе структуры, создающие своеобразную проводящую систему, по которой могут мигрировать бактерии, а также перемещаются вещества по градиентам концентрации. Через структуры, похожие на транспортные каналы, наполненные жидкостью, происходит приток питательных веществ и кислорода и выведение продуктов обмена [127].

Состав матричной слизи варьирует в зависимости от микроорганизмов в нем присутствующих и включает полисахариды, белки, гликолипиды и бактериальную ДНК [128]. При этом основным компонентом являются полисахариды (декстран, гиалуроновая кислота, целлюлоза и другие).

По данным разных авторов эта фракция составляет от 40 до 95 % от общей массы биопленки; содержание других химических веществ значительно варьирует и зависит от таксономической принадлежности бактерии, образующей биопленку [137, 182].

Доля белков в биопленке может составлять до 60 %, липидов до 40 % и нуклеиновых кислот 1-20 % [2, 10, 168].

Порядка 80 - 90 % объема биопленок занимает вода, поэтому все ее составляющие находятся в гидратированном состоянии.

Основная функция биопленки - защита находящихся в ней микроорганизмов от неблагоприятных физических, химических и биологических факторов внешней среды, таких, как температурное воздействие, высушивание, ультрафиолетовое излучение, всевозможные химикаты, гуморальные и клеточные факторы защиты макроорганизмов [81].

1.2.3. Взаимодействие микроорганизмов в биопленке

Помимо абсолютного биологического синергизма, когда продукты жизнедеятельности одного вида служат питательной средой для другого, в биопленках наблюдается и четко выстроенное взаимодействие между микроба-

ми, принадлежащими к одному или разным видам, с помощью специальных сигнальных систем [56].

По мнению James G.A. et al [91], Roberts M.E., Stewart P.S. [179], микроорганизмы в биопленке взаимодействуют между собой, демонстрируя взаимодействие или антагонизм. Например, стрептококки и Candida albicans взаимодействуют друг с другом, демонстрируя мутуалистические отношения. Микроорганизмы с малоинвазивным потенциалом могут действовать синер-гически с более вирулентными видами.

Исследования показали, что в биопленке по-иному, чем в чистых культурах бактерий, происходят многочисленные физиологические процессы, в том числе продукция метаболитов и биологически активных веществ. Микробные сообщества способны минимизировать воздействие факторов внешней среды путем создания (в результате метаболизма) мозаики микросред, обеспечивающей выживание и рост видов. Сообщество организует единую генетическую систему в виде плазмид - кольцевых ДНК, определяющих поведенческий код для членов биопленки, их пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и с внешним миром. Последнее получило специальное определение - социальное поведение (quorum sensing) микроорганизмов [4].

Такое понятие, как социальное поведение (QS), т.е. микробная связь с помощью «химических сообщений» рассматривается как ключ к регулированию колонизации и вирулентности бактерий в биопленке [121, 139, 140].

1.3. Роль биопленок в инфекционной патологии животных

Известно, что определенный количественный уровень и состав бактериальной флоры у здоровых животных является нормой и не вызывает патологического процесса. Тем не менее, когда популяции бактерий увеличиваются или когда бактерии получают доступ к зоне, где они обычно не присутствуют, и, где они получают возможность формировать патогенную биопленку,

бактериальная колонизация и пролиферация становится угрозой для здоровья животного [172].

Данные о частоте выявления биопленок при бактериальных инфекциях у животных отсутствуют, но вполне вероятно, что процент их возникновения аналогичен тому, который наблюдался при подобных исследованиях в медицине, а возможно и больше. По мнению Harvey R.G. [136], Paterson S. [171] отличие от планктонных бактериальных инфекций, которые, как правило, характеризуются быстрым развитием и острым течением, инфекции, связанные с биопленками, имеют сглаженные симптомы, часто имеют рецидивы и протекают хронически.

Ранее считалось, что биопленки образуются только на изделиях медицинского назначения, таких как катетеры, эндотрахеальные трубки, внутри-маточные спирали, контактные линзы и др. [58, 173, 196].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Карабанов Сергей Юрьевич, 2018 год

Список Б.

В сухом темном месте при температуре от 15 до 25°С, в недоступном для детей месте. Срок годности

Срок 2,5 года. Не использовать после истечения указанного срока годности.

Условия отпуска из аптек

Без рецепта.

Изготовитель

МУКОС Фарма ГмбХ и Ко, Германия, произведено МУКОС Эмульсионс ГмбХ, Германия

УТВЕРЖ, Главный Т.Б. Го]

« 41 »

бактериаль

иники «ВетТап»

201 &

г.

АКТ

дования содержимого слуховых каналов собак при отитах

Мы, нижеподписавшиеся, специалисты ветеринарной клиники ВетТал -ведущий ветеринарный врач Марюшина Т.О., ветеринарный врач Оленин P.A., а также аспирант кафедры микробиологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина, составили настоящий акт о том, что на базе данной ветеринарной клиники были проведены бактериологические исследования содержимого ушных каналов собак при хронических отитах.

Объектом изучения служили материалы от 50 собак, разных пород и возрастных групп. Каждое животное подвергали клиническому осмотру с последующим отбором материала для микробиологического исследования. За все время исследований нами было выделено и идентифицировано на уровне рода или вида 188 культур микроорганизмов, в том числе 134 штамма бактерий и 54 культуры микроскопических грибов. Качественный состав микрофлоры представлен в таблице 1.

Таблица 1. Микрофлора, выделенная от собак с явлениями отита

Наименование микроорганизма Выделено культур микроорганизмов Количество животных, от которых был выделен микроорганизм (%)

абс. %

S. aureus 37 19,69 74

S. intermedius 31 16,49 62

P. mirabilis 15 7,98 30

P. aeruginosa 10 5,32 20

E. coli 10 5,32 20

E. faecalis 11 5,85 22

S. pyogenes 20 10,63 40

Candida spp 12 6,38 24

Malassezia spp 42 22,34 84

Микроорганизмы в виде монокультуры у собак с явлениями наружного отита изолировали в 20% случаев, в виде микробных ассоциаций - в 80%. Стоит отметить, что наиболее часто обнаруживались и количественно преобладали в микробных ассоциациях стафилококки (S. aureus, S. intermedius), а также грибы

микробных ассоциациях стафилококки (S. aureus, S. intermedius), а также грибы рода Malassezia. Культуры P. aeruginosa, Malassezia spp, Candida spp как правило, выделяли от животных, которых, по анамнестическим данным до исследования достаточно долго подвергали антибиотикотерапии.

Ведущий ветеринарный врач

ветеринарной клиники «ВетТал»

Т.О. Марюшина

Ветеринарный врач ветеринарной клиники «ВетТал»

Р.А. Оленин

Аспирант кафедры

микробиологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ -МВА имени К.И. Скрябина

С.Ю. Карабанов

Главный врач ветеринарной клиники

Исаханян ft.gl ^^-^X^v'íf

« 0£_ »__ g^K- -áoffi-.

АКТ

испытаний эффективности антимикробной терапии с использованием ферментного препарата

«Вобэнзим»

Нижеподписавшиеся сотрудники ветеринарной клиники «КрошкаРу» ведущий петсринарный врач Носикова О.И., ассистент ветеринарного врача Иванов A.C., аспирант кафедры микробиологии ФГБОУ ВО Ml АВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина Карабанов С.Ю. провели успешное испытание оценки эффективности антибиотикотерапии с использованием ферментного препарата «Вобэнзим».

В опыте были задействованы собаки обоих полов и различных пород, в возрасте 4-9 лет, с отитом от 2 лет в анамнезе, проходивших лечение в ветеринарной клинике «КрошкаРу». Всего было исследовано 24 собаки, среди них голден ретривер - 2 гол, немецкая овчарка - 2 гол, шарпей - 4 гол, русский спаниель - 5 гол, беспородные особи - 2 гол, американский кокер спаниель - 7 гол, бассет хаунд - 2 гол.

Животных разделили на 2 экспериментальные группы в зависимости от состава микробных ассоциаций, по 10 и 14 голов.

В 1-ой группе присутствовали животные, у которых в микробных ассоциациях было установлено наличие P. aeruginosa, во 2-ой - S. aureus. Животные обеих групп были разбиты на подгруппы, одну из которых лечили по обычной схеме без использования ферментов, 2-ю лечили с применением ферментного комплекса Вобэнзим.

Схема лечения собак с отитами включала ежедневные местные обработки антисептическими растворами (3% раствор перекиси водорода или 0,05% раствор хлоргексидина), удаление экссудата (ватно-марлевым тампоном), использовании средств разжижающих ушную серу (отифри или лосьон для ушей 8 в 1 Excel), лечение сопутствующего заболевания при наличии в анамнезе такового. Из антибиотиков препаратом выбора служил ципрофлоксацин, так как выделенные штаммы микроорганизмов проявили к нему выраженную чувствительность. Антибиотик применяли подкожно из расчета 5 мг/кг массы тела животного.

Собакам 2-ой группы помимо изложенной выше схемы лечения давали per os ферментный комплекс «Вобэнзим» (Mucos Pharma, Германия) по 1 таблетке на 10 кг массы животного 3 раза в сутки на протяжении всего курса лечения.

При использовании схемы лечения только с применением ципрофлоксацина у животных 1 -ой группы первые клинические симптомы исчезли на 3 сутки (1 собака), полностью симптомы исчезли на 13 сутки у 1 собаки. У 4 из 5 собак на 21 сутки оставались некоторые симптомы, среди них 75% занимали гиперкератоз, 25% - мацерация.

При использовании в схеме лечения Вобэнзима первые клинические симптомы также исчезли на 3 сутки (1 собака), а полное исчезновение клиники отита наблюдалось на 9 сутки у 1 /кинотного. На 21-ые сутки картина не изменилась. На 21 сутки оставались симптомы отита, из них 75% гиперкератоз и 25% - мацерация.

По-другому динамика симптомокомплекса отита представлена во 2-ой группе экспериментальных животных. Впервые симптомы начали исчезать на 2-ые сутки лечения у 1 собаки, полностью симптомы исчезли на 11 -ые - у 1 собаки, на 13-ые - у 2, на 15-ые - у 3, на 21 сутки - у 5 собак. При использовании во время лечения ферментного комплекса «Вобэнзим» впервые симптомы начали исчезать на 2-ые сутки лечения у 1 собаки, полностью симптомы исчезли на 9-ые сутки у 1 собаки, на 11 -ые - у 3, на 13-ые - у 4, на 15-ые - у 5, на 17-ые - у 6, на 21 сутки - в группе все 7 собак не имели клинических симптомов отита.

Клинический контроль за собаками опытных групп показал эффективность лечения хронических отитов с применением ферментного комплекса «Вобэнзим». Данные подтверждаются микробиологическими исследованиями.

Данная схема лечения собак с хроническими отитами рекомендована к применению врачами ветеринарной клиники «Крошка Ру».

/

Ведущий ветеринарный врач ветеринарной клиники «Крошка Ру»

О.И. Носикова

Ассистент ветеринарного врача ветеринарной клиники «Крошка Ру»

А.С. Ива юва

Аспирант кафедры

микробиологии ФГБОУ ВО МГ'АВМиБ -МВА имени К.И. Скрябина

С.Ю. Карабанов