Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат сельскохозяйственных наук Зонтиков, Дмитрий Николаевич

• Зонтиков, Дмитрий Николаевич
• кандидат сельскохозяйственных наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат сельскохозяйственных наук Зонтиков, Дмитрий Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ГАПЛОИДИЯ. СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНЫХ 13 РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР BRASSICA OLERACEA L.

1.1. Гаплоидия и её значение для селекции растений

1.2. Культура микроспор Brassica olerace L.

1.3. Некоторые ботанические и биологические особенности Bras- 22 sic a oleraceae L.

1.3.1. Развитие пыльника и микроспор

1.4 Изменение программы развития микроспор под действием фак- 28 торов влияющих на андрогенез in vitro

1.4.1. Оптимальная стадия развития пыльцы для введения в 28 культуру

1.4.2. Условия выращивания растений-доноров

1.4.3. Влияние генотипа на андрогенез in vitro

1.4.4. Влияние температурной предобработки на андрогенез in 32 vitro

1.4.5. Влияние регуляторов роста на морфогенез микроспор ка- 37 пусты белокочанной

1.4.6. Другие факторы, влияющие на андрогенез in vitro

1.5. Способы получения удвоенных гаплоидов

ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, 48 СХЕМА И МЕТОДИКИ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ

2.1. Цель, задачи и схема исследований

2.1.1. Схема исследований

2.2. Условия проведения исследований

2.2.1. Почвенные и агрохимические условия проведения иссле- 56 дований

2.2.2. Погодные условия вегетационных периодов 2007 — 2009 58 гг.

2.3. Материал и методика проведения исследований

2.3.1. Исходный материал

2.3.2. Методика лабораторных опытов 60 2зз Проведение оценки исходного и полученного в ходе исследо- ^ ваний материала

ГЛАВА 3. Усовершенствование элементов технологии получения уд- 67 военных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор

3.1. Влияние наночастиц серебра на донорные растения капусты 67 белокочанной

3.2. Влияние температуры на эмбриоидогенез капусты белокочан- 69 ной в культуре микроспор

3.3. Определение зависимости стадии развития микроспоры от 71 длинны бутона

3.4. Определение зависимости эмбриоидогенеза от стадии развития 75 микроспор

3.5. Определение зависимости эмбриоидогенеза от плотности сус- 77 пензии микроспор

3.6. Влияние питательной среды на эмбриоидо-и каллусогенез

3.7. Влияние регуляторов роста на эмбриоидогенез

3.8. Влияние сахарозы на эмбриоидогенез

3.9. Влияния кислотности среды на эмбриоидогенез

3.10. Влияние аскорбиновой кислоты на эмбриоидогенез

3.11. Влияния питательных сред, регуляторов роста и сахарозы на 91 рост и развитие эмбриоидов

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА РАСТЕНИЙ-РЕГНЕРАНТОВ КАПУСТЫ 95 БЕЛОКОЧАННОЙ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР

4.1. Цитологический анализ растений-регенерантов капусты бело- 95 кочанной поколения R0 по количеству хромосом

4.2. Оценка растений-регенерантов капусты белокочанной поколе- 97 ния R0 по количеству устьиц и числу хлоропластов в них

4.3. Подтверждение гаплоидной природы растений-регенерантов 100 методом ПЦР

4.4. Характеристика удвоенных гаплоидов капусты белокочанной 103 полученных в культуре микроспор по морфологическим признакам

4.5. Биохимический анализ растений-регенерантов капусты белоко- 104 чанной, полученных в культуре микроспор

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор»

Актуальность темы. Капуста была введена в культуру более 5000 лет назад. Родиной всех возделываемых видов капусты считают Средиземноморье. На протяжении тысячелетий из дикой капусты человеку удалось получить большое разнообразие форм. В результате отбора растений и укорачивания междоузлий были получены кочанные формы. — белокочанная, краснокочанная и савойская'(Пивоваров В.Ф., Старцев В.И., 2006).

В кочанах капусты в обилии содержатся витамины Р, К, Bl} В2, РР, С, инозит, фолиевая кислота, биотин. Все эти вещества и витамины полезны и необходимы для> организма человека. Зеленые листья капусты служат источником каротина, переходящего в организме человека в витамин А. В капусте был также обнаружен витамин U, который употребляют в качестве эффективного быстродействующего средства для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Капуста богата полезными минеральными солями. Особенно много в ней калия, фосфора, есть кальция железо, марганец. Капуста является так же источником Сахаров и легкоусвояемых белков. По содержанию азотистых веществ она превышает брюкву, репу, морковь, свеклу. Клетчатка капусты способствует выведению из организма жироподобных веществ - холестерина (Петрушко Ю.Н., 2003).

Немаловажное значение капуста имеет в качестве кормового растения для сельскохозяйственных животных и птиц, для чего в свежем или силосованном виде используют отходы от столовых сортов и специально культивируют кормовые сорта, но главным образом листья капусты (Петрушко Ю.Н., 2003).

Капуста белокочанная является перекрёстноопыляемым растением, имеющим двухлетний цикл развития. В связи с этим селекционный процесс этой культуры является длительным и трудоемким и основан преимущественно на внутривидовой гибридизации с последующим многократным отбором, использовании инфекционно-провокационных фонов для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды (Поляков А.В., 2000).

Основные направление в селекции капусты белокочанной, это скороI спелость, устойчивость к болезням (кила, сосудистый бактериоз, фузариоз и др.) и вредителям (Пивоваров В.Ф., Старцев В.И., 2006).

Использование удвоенных гаплоидов в овощеводстве особенно актуально в связи с тем, что в последние годы в производстве особое внимание стали уделять технологиям, сортам и гибридам, приводящим к получению высокой выравненное™, и урожайности (Литвинов С.С., 2003). В связи с этим роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет существенно повысить эффективность селекционного процесса, ускорить получение генетически стабильных линий и облегчить поиск редких признаков, контролируемых рецессивными генами (Поляков А.В., 2000).

В настоящее время гаплоиды можно получать различными способами, однако искусственным путем с использованием методов культуры изолированных тканей удается получать большее их количество. На сегодняшний день разработаны и наиболее часто применяются следующие способы получения гаплоидов с использованием методов in vitro:

- культура изолированных пыльников и микроспор;

- культура семяпочек;

- метод гаплоиндуктора, при котором из-за несовместимости родителей происходит элиминация отцовских хромосом. Однако, метод гаплоиндуктора и культура семяпочек очень трудоёмки, а в культуре пыльников происходит развитие диплоидов из соматических тканей. Наиболее эффективным и технологичным является использование метода культуры микроспор. Но в данном направлении остаётся ещё много проблемных вопросов.

Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований является усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор для использования их в селекционном процессе.

Объект исследований — технология получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор.

Предмет исследований — бутоны, пыльники, микроспоры, эмбриоиды, растения - регенераты капусты белокочанной.

Научная новизна работы. Впервые в России усовершенствованы компоненты и технологические элементы, позволяющие получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды капусты белокочанной в культуре микроспор. В результате проведённых исследований усовершенствованы элементы технологии культуры микроспор: установлена оптимальная длина бутона капусты белокочанной - 3-5 мм, содержащая невакуолизированные микроспоры, обладающие морфогенетической активностью. Выявлены эффективные концентрации 6-бензиламинопуриа (БАП) - 4 мг/л, а-нафтилуксусной кислоты (НУК) - 0,3 мг/л для индуцирования эмбриоидогенеза Показана эффективность температурной предобработки бутонов повышенной (+32°С) температурой в течение 1 суток. В результате оптимизации условий культивирования микроспор (соотношение и концентрация регуляторов роста, состава питательной среды, концентрации сахарозы) повышена эффективность эмбриоидогенеза до 0,164±0,04%. Проведена оценка с помощью RAPD-анализа полученных растений-регенерантов, в результате которой установлена их генетическая гетерогенность в сравнении с исходным материалом. С помощью цитологического анализа доказана гаплоидная природа растений-регенерантов капусты белокочанной, полученных в культуре микроспор.

Впервые в России усовершенствованы технологические элементы культуры микроспор капусты белокочанной, позволяющие получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды. Выявлены эффективные концентрации 6-бензиламинопуриа (БАП) - 4 мг/л, а-нафтилуксусной кислоты (НУК) - 0,3 мг/л для индуцирования эмбриоидогенеза, показана эффективность температурной предобработки бутонов повышенной (+32°С) температурой в течение 1 суток, установлено высокая эффективность использования наночастиц серебра в концентрации 0,12 л*М для снижения бактериальной и грибной инфекции у донорных растений.

Практическая ценность. Установлено, что использование питательной среды Мурасиге - Скуга (Murashige Т., Skoog F., 1962) (MS), содержащей БАЛ в концентрации 4 мг/л, НУК — 0,3 мг/л, аскорбиновую кислоту— 1 мг/л, сахарозу — 120 г/л, и режима температурной предобработки бутонов капусты белокочанной +32°0 в течение 1 суток, индуцирует эмбриоидогенез микроспор с частотой 0;164±0,04% и позволяет получить гаплоиды и удвоенные гаплоиды.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями^ статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы, и предложения были доложены и представлены на IV конференции; РАЕН Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты (Москва, 2007); VIII и IX Молодежной научной конференции, посвященной памяти F.C. Муромцева (Москва, 2008, 2009); на IX Международной научной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на Международной научно-практической конференции, посвящённой памяти Б.В. Квасникова (Верея, 2009):

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• применение наночастиц серебра в концентрации 0,12 жМ в качестве стерилизующего агента для предобработки донорных растений капусты белокочанной позволяет снизить инфицированность эксплан-тов бактериальными и грибными инфекциями;

• лучшая стадия для получения гаплоидных растений является ранняя невакуолизированная микроспора; при введении в культуру, плотность суспензии микроспор составляет 50000 шт./мл в жидкой питательной среде;

• культивирование микроспор на питательной среде-MS, содержащей БАЛ в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, сахарозу-120 г/л, рН-5,6, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л, плант агар-5 г/л, при температуре +25°С и фотопериоде 16/8, позволяет получить эмбриоиды;

• культивирование эмбриоидов на питательной среде MS, содержащей БАЛ в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л, сахарозу 30 - г/л, рН 5,6, плант агар 5 г/л, при температуре +25°С и фотопериоде 16/8 позволяет получить растения-регенеранты;

• линии, полученные на основе удвоенных гаплоидов капусты белокочанной сорта Подарок и линии 33, характеризуются высокой вы-равненностью, повышенным содержанием витамина С и Сахаров.

Публикации результатов исследований

По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе одна в журнале «Картофель и овощи», рекомендованном ВАК РФ.

1. Зонтиков Д.Н. Культура микроспор: состояние и- перспективы //А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, Р.В Сергеев //Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. Сб. науч. трудов. Москва: РАЕН, 2007, вып. 16. - С. 172 - 187.

2. Зонтиков, Д.Н. Культура микроспор Brassica oleracea L. /Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова //Сб. науч. трудов VIII- Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2 апреля 2008 г.). — М.: ГНУ ВНИИСБ, 2008. —С. 17-18.

3. Зонтиков, Д.Н. Эмбриоидогенез капусты белокочанной (.Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова //Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 812 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 306-307.

4. Зонтиков, Д.Н. Регенерационная способность капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) /С.А. Зонтикова, А.В. Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, Г.Н. Ралдугина //Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 136-137.

5. Зонтиков, Д.Н. Влияние температурного стресса и борной кислоты на эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /Д.Н. Зонтиков, А.В. Поляков //Сб. науч. трудов по овощеводству и бахчеводству к 110-летию со дня рождения Б.В. Квасникова. —Верея, 2009. — С. 191-193.

6. Зонтиков, Д.Н. Генетический и морфофизиологический полиморфизм овощных культур и использование его в селекции на устойчивость к стрессам /А.В.Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова, Н.Н. Давыдова, К. Рабей //Сб. науч. трудов V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 1 (Москва, 16-20 марта 2009 г.). — М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. — С. 258-259.

7. Зонтиков, Д.Н. Влияние температурного стресса и кислотности среды на эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /Д.Н. Зонтиков //Сб. науч. трудов IX Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 8 апреля 2009 г.). — М.: ГНУ ВНИИСБ, 2009: — С. 13-14.

8. Зонтиков, Д.Н. Температурный стресс повышает выход эмбриои-дов капусты белокочанной в культуре микроспор /А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков //Картофель и овощи. — 2009. — №7. — С. 25.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 124 наименование, в том числе 67 иностранных авторов.

Заключение диссертации по теме «Селекция и семеноводство», Зонтиков, Дмитрий Николаевич

выводы

1. Оптимизированы условия, влияющие на снижение инфицированности и морфогенетическую активность микроспор капусты белокочанной. Установлено, что:

• применение наночастиц серебра в качестве стерилизующего агента для предобработки донорных растений капусты белокочанной в концентрации 0,12 ./иМ позволяет снизить инфици рованность эксплантов от бактерий на 19-39% и от грибов на 25-31% соответственно;

• проведение температурной предобработки (+32°С, в течение 1 суток) позволяет повысить интенсивность эмбриоидогенеза у сорта Подарок на 34%, линии 33 на 33%, линии 34 на 25%.

2. Морфогенетическая активность микроспор капусты белокочанной зависит от стадии развития бутона, плотности суспензии культивируемых микроспор, вида питательной среды, концентрации регуляторов роста и сахарозы, кислотности среды и наличия в питательной среде аскорбиновой кислоты. Установлено, что:

• оптимальная длинна бутона, при которой микроспоры преимущественно находятся на невакуолизированной стадии развития, для сорта Подарок и линий 33, 34 составляет — от 3 до 4 мм;

• плотность суспензии микроспор следует доводить до 50000 шт. в 1 мл питательной среды, что позволяет получить частоту эмбриоидогенеза на уровне 0,134-0,164%;

• для повышения эмбриоидогенеза культивирование микроспор капусты белокочанной следует проводить на питательной среде MS, обогащенной БАП в концентрации 4 мг/л и НУК - 0,3 мг/л, позволяющей получить 0,152-0,174% эмбриоидов;

• оптимальная концентрация сахарозы, составляющая 120 г/л, позволяет получить на 37% эмбриоидов больше чем в контрольном варианте с использованием 140 г/л;

• культивирование микроспор капусты белокочанной на питательной среде с кислотностью 5,6 позволяет получать более 80 эмбриоидов на чашку Петри, что соответствует частоте эм-бриоидогенеза 0,126-0,164%;

• использование аскорбиновой кислоты в концентрации 1,0 мг/л позволяет повышать интенсивность эмбриоидогенеза на 26%.

3. Культивирование эмбриоидов на питательной среде MS, содержащей БАП в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л и сахарозу — 30 г/л и имеющая рН 5,6, позволяет получать около 25% растений-регенерантов от числа культивируемых эмбриоидов. При использовании этой среды было получено 27 растений-регенерантов, из них — 12 растений сорта Подарок, 11 растений линии 33 и 4 растения линии 34.

4. RAPD-анализ растений-регенерантов капусты белокочанной сорта Подарок, полученных в культуре микроспор, показал значительное снижение гетерогенности в спектрах их ДНК в сравнении с исходным образцом. Проведенный цитологический анализ (подсчёт устьиц, числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и хромосом) подтвердил их гаплоидную природу.

5. Среди растений-регенерантов, полученных из микроспор сорта Подарок, был выделен образец, превышающий контроль (исходный сорт) по содержанию сухого вещества, витамина С, глюкозы и дисахаров на 26,9%, 46,7%, 16,5% и 31,7% соответственно.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКЕ

На основании полученных нами данных предложена усовершенствованная схема получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор капусты белокочанной предусматривающая:

- двукратную обработку донорных растений водным раствором наночастиц серебра за 7 и 2 суток до изоляции бутонов;

- стерилизацию бутонов капусты белокочанной в течение 1 минуты в 70% растворе этанола, 10 минут в 1 % растворе гипохлорита кальция, трёхкратную промывку стерильной водой в течение 5 минут;

- предобработку бутонов температурой +32°С, в течение 1 суток;

- механическое выделение микроспор в жидкой питательной среде MS, содержащей БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, сахарозу - 120 г/л, рН 5,6;

- культивирование микроспор на питательной среде MS содержащей БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, сахарозу - 120 г/л, рН 5,6, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л; плант агар - 5 г/л, при температуре +25°С и фотопериоде 16/8 до образования эмбриоидов;

- пересадку образовавшихся эмбриоидов на среду MS, содержащую БАП в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л, сахарозу - 30 г/л, рН 5,6, плант агар -5 г/л, культивирование при температуре +25°С и фотопериоде 16/8 до получение хорошо развитых растений-регенерантов;

- контроль плоидности: подсчёт хромосом, устьиц и хлоропластов в них, ПЦР-анализ;

- пересадку растений-регенерантов в почву в возрасте 60 суток, яровизацию, самоопыление, получение семян.

При использовании этой технологии, выход эмбриоидов составляет 0,164%, а выход растений-регенерантов 0,024%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные экспериментальные данные по морфогенезу микроспор капусты белокочанной сорта Подарок и линий 33 и 34 в культуре in vitro, позволили разработать систему получения гаплоидных растений-регенерантов из микроспор путём прямого эмбриоидогенеза и гемморизогенеза на основе каллусов.

Проведённые исследования позволили идентифицировать именно невакуолизированной микроспору как клетку, морфогенетически компетентную к переключению программы развития с гаметофитной на спорофитную. Одним из факторов переключения на спорофитный путь развития, является стрессовое воздействие повышенной температурой. Фактором индуцирующим эмбриоидогенез, приводящим к регенерации растения, является баланс регуляторов роста БАП и НУК в питательной среде. Нормальное развитие растений регенерантов, происходит на питательной среде MS, с содержанием сахарозы на разных этапах органогенеза от 120 г/л, до 30 г/л, а так же аскорбиновой кислоты, снижающей фенольную нагрузку на эмбриоиды.

Таким образом, полученные данные позволяют уже в настоящее время сделать сложный процесс морфогенеза микроспоры капусты белокочанной по спорофитной программе in vitro управляемым и получать полноценные андроклинные гаплоидные растения-регенеранты полученные в культуре микроспор в большом количестве для внедрения их в селекционную практику.

Список литературы диссертационного исследования кандидат сельскохозяйственных наук Зонтиков, Дмитрий Николаевич, 2009 год

1. Анапияев, Б.Б. Гаплоидная биотехнология и перспективы её использования в генетической инженерии растений /Б.Б. Анапияев //Изучение генома и генетической трансформации растений.- Новосибирск, 2001- С. 174184.

2. Атанасов, А. Биотехнология в растениеводстве /А. Атанасов Новосибирск: Институт цитологии и генетики СО РАН, 1993.- 241с.

3. Батыгина, Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro. Эмбриогенез у покрытосеменных растений /Т.Б. Батыгина, В.А. Васильева, Т.Б. Маметь-ева. //Бот. Журн.69, №1, 1978. С.- 32-34.

4. Батыгина, Т.Б. Эмбриоидогенез злаков /Т.Б. Батыгина //Эмбриология цветковых растений: Терминология и концепции. Т.2: Семя /Ред. Т.Б. Батыгина. — СПб.: Мир и семья, 1997. — С. 528-538.

5. Бельская, Г.Б. Получение гаплоидов белокочанной капусты с помощью культуры пыльников для создания гетерозисных гибридов интенсивного типа /Г.Б. Бельская, Т.В. Семашко //Проблемы селекции овощных культур, Минск. 1997. С. 17-20.

6. Бобков, С.В. Влияние температурного стресса на эффективность каллусо-генеза в культуре пыльников проса и гороха /С.В. Бобков //III Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития". М, 2005. - С.231.

7. Бутенко, Р.Г. Перспективы исследований в культуре клеток и тканей растений. /Р.Г. Бутенко. В кн.: Культура клеток растений. Труды II Всесо-юзн. Конф. Киев, Наук. Думка, 1978. - с. 5-11.

8. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных тканей как метод изучения процессов роста и морфогенеза растений. /Р.Г. Бутенко М.: Наука. - 1964. -256 с.

9. Градова, Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии. /Н.Б. Градова. М.: ДеЛи принт, 2001. - 131 с.

10. Грибова, Т.Н. Создание трансгенных линий белокочанной капусты с но-вымиагротехническими свойствами: Автореф. дисс. канд. биол. наук / РАН, 2006. 16 с.

11. Дворядкина, А.Г. Гаплоидия у клещевины как метод создания гомозиготных форм в целях селекции: Автореф. дис .канд биол. наук. -/ВНИИМК.- Краснодар, 1972.-25 с.

12. Домблидес, Е.А. Развитие пыльников капусты брокколи in vivo и при культивировании in vitro. /Е.А. Домблидес, Н.А. Шмыкова. //Сб. науч. труд. Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур.-2002 г.- Выпуск 37.- С. 82-92.

13. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / под ред. Б.А. Доспехова -М.: Агропромиздат, 1985.

14. Еленевский, А.Г. Ботаника высших, или наземных растений. /А.Г. Еле-невский — М.: «Академия», 2000. — 432 с.

15. Ермаков, А.И. Биохимия льна. В кн.: Биохимия культурных растений./ А.И. Ермаков. - Сельхозгиз, 1972. - Т. 3. - С. 67-132.

16. Ермаков, И.П. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников и микроспор./ И.П. Ермаков //Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16, Биология. — 1986. № 3. - С. 28-40.

17. Жамбакин, К.Ж. Гаплоидная биотехнология растений. /К.Ж Жамбакин -Алматы, 2004.-186с.

18. Зайцев, B.C. Идентификация генотипов растений с помощью ПЦР-анализа рассеянных повторяющихся последовательностей R173. /B.C. Зайцев Э.Е., Хавкин// Докл. РАСХН, 2001, 2: 3-5.

19. Калашникова, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехноло-гии./Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева, О.Ю. Миронова. М. - Колосс, 2006. - 144 с.

20. Калинин, Ф.П. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений /Ф.П. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев. - Наук, думка, 1980.-488с.

21. Круглова, Н.Н. Эмбриологические основы метода культуры пыльников пшеницы, как биотехнологического приема. /Н.Н. Круглова //В кн.: II съезд ВОГИС (1-5 февраля 2000 г.). Тез. докл. С.-П., 2000, т.1, с.151

22. Калинин, Ф.П. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений /Ф.П. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. — Киев. — Наук, думка, 1980.-488с.

23. Круглова, Н.Н. Пыльник in vitro как модель для изучения путей морфогенеза растений in vivo /Н.Н Круглова //The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology — Саратов.: Сарат. губерн. торгово-промыш. Палаты, 2003. 160с.

24. Круглова, Н.Н. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы /Н.Н. Круглова, Т.Б. Батыгина, В.Ю. Горбунова, Г.Е. Титова, О.А. Сельдими-рова. М.: Наука, 2005. - 97 с.

25. Лизгунова, Т.В. Культурная флора СССР. /Т.В. Лизгунова. Т.П. Капуста. Л.: Колос. Ленингр. Отд. 1984. - С.5

26. Литвинов, С.С. Научные основы овощеводства /С.С. Литвинов. —М.: Россельхозакадемия, 2008.—776 с.

27. Маруненко, И.М. Каллусогенез и эмбриогенез в культуре пыльников картофеля /И.М. Маруненко, А.А. Кучко //Цитолог, и генет. 1989 — Т.23 №3. С. 48-51.

28. Муромцев, Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. /Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.Н. Тихоненко. М.: Наука, 1990.- 176с.

29. Ницше, В. Гаплоиды в селекции растений. /В. Ницше, Г. Венцель М.: Колос, 1980.- 128с.

30. Пацурия Д.В. Биологическое и технологическое обоснование семеноводства F1 гибридов капусты белокочанной: Автореф. дис. докт. с.-х. наук. // М.: МСХА, 2008.-24 с.

31. Поддубная-Арнольди, В.А. Общая эмбриология покрытосеменных растений./В.А. Поддубная-Арнольди -М.: Наука, 1964.-257 с.

32. Поляков, А.В. Усовершенствование селекционного процесса льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) на основе использования биотехнологических методов: Автореф. дисс. д-ра биол. Наук / РАСХН, 1998. 50 с.

33. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна. /А.В. Поляков — Тверь, 2000 С.78-95.

34. Поляков, А.В. Получение регенерантов овощных культур и их размножение in vitro. Методические рекомендации. /А.В. Поляков — М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, 2005. — 36 с.

35. Поляков, А.В. Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увядянию методами in vitro. Методические рекомендации /А.В. Поляков, А.А. Ткачева, И.И. Тарасенков, Н.К. Бирюкова. — М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, 2006. — 28 с.

36. Попадьин, П.В. Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням: Автореф. дис. канд. биолог, наук // М.: МСХА, 2002. 24 с.

37. Пухальский, В.А. Цитология и цитогенетика растений /В.А. Пухальский, А.А. Соловьев, В.Н. Юрцев. М.: Издат-во МСХА, 2004. 118с.

38. Рахинбаев, И.Р. Биотехнология зерновых культур. /И.Р. Рахинбаев, Ж. Тивари, Н.К. Бишимбаева, С.В. Кушнаренко, Е.Д. Азимов. Алма-ата: Гылым, -1992. С.- 40.

39. Ревина, А.А. Синтез и свойства стабильных наночастиц металлов /А.А. Ревина //Наночастицы в природе. Нанотехнологии их создание в приложение к биологическим системам: Материалы 1-ого научно-методологического семинара. -М.: РАЕН-МААНОИ, 2003. С.61-68.

40. Резникова, С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника. /С.А. Резникова. М.: Наука, 1984.- 272с.

41. Резникова, С.А. Мейоз в культуре изолированных пыльников /С. А. Резникова, Ю.Ф.Богданов//Генетика. 1972.- 8 №9. С.30-41.

42. Романов, И.Д. Особенности развития пыльцы злаков и значение их для некоторых генетических исследований /И.Д. Романов //Генетика. — 1970. Т.6.- №10.- С.11-25.

43. Справочник по климату СССР. — 1964. — Вып.8. — 4.2.

44. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. /B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дягтерев и др.: под ред. B.C. Шевелухи //М.: Высшая Школа, 1998. С.69-70.

45. Тюкавин, Г.Б. Биотехнологические основы селекционной технологии моркови (Daucus carota L.): Автореф. дис. докт. биолог, наук. / М., 2007. - 27с.1

46. Шамина, З.Б. //В кн.: Культура клеток растений. /З.Б. Шамина. М.: Наука. 1981.- С.124-136.

47. Шеррер, Н.В. Влияние условий выращивания донорных растений пшеницы на эффективность пыльниковой гаплопродукции /Н.В. Шеррер //Материалы научной конференции. По с.-х. биотехнологии. Целиноград. 1991. С.57.

48. Шмыкова, Н.А. Диморфизм пыльцы и оценка эмбриогенной способности микроспор различных генотипов моркови /Н.А. Шмыкова, Г.Б. Тюкавин //Сельскохозяйственная биотехнология. №5. 2001. С.53-60.

49. Шмыкова, Н.А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на укоренение селекционного процесса овощных культур: Автореф. дис. докт. с.-х. наук. /ВНИИССОК М., 2006. - 20 с.

50. Хохлов, С.С. Гаплоидия и селекция. /С.С. Хохлов, B.C. Тырнов. М.: Наука. 1976.-С. 99- 105.

51. Хржановский В.Г. Практикум по курсу общей ботаники /В.Г. Хржанов-ский, С.Ф. Пономаренко. М.: Агропромиздат, 1989. — 416 с.

52. Цыренов, В.Ж. Основы биотехнологии: Культивирование изолированных клеток и тканей растений /В.Ж Цыренов //Учебно-методическое пособие. Улан-Удэ: ВСГТУ, 2003 С. 21-24.

53. Arnison, P.F. Genotype specific response of cultured broccoli anther to cyto-kinins /P.F.Arnison, P. Donaldson, A. Jackson, C. Sempel, W. Keller // Plant Gell, Tissue and Organ Culture 1990. №3 P. 217-222.

54. Bajaj, Y.P.S. In vitro production of haploids /Y.P.S. Bajaj //Handbook of plant cell culture: Techniques for propagation and breeding (Eds D.A. Evans) New York, London: Macmillam. -1983. -V. 1, P.228-287.

55. Batygina, T.B. Morhogenesis of somatic embryos developing in natural conditions // Biologija.-1998, N 3.-P. 61-64.

56. Bedinger, P.A. The remarkable biology of pollen. /Р.А. Bedinger //Plant Cell. 1992. - V.4. P.879-887.

57. Biddington, N.L. Variation in response to high temperature treatmens in anther culture of Brussels sprouts. /N.L. Biddington, H.T. Robinson. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture 22.- 1990. P.48-54.

58. Brooks, J. Chemical structure of the exine of pollen walls and a new function for carotenoids in nature /J. Brooks, G. Shaw //Nature. — 1978. V. 219. -P.532-533.

59. Bhattacharya, N.M. Production of plantlets through somatic embryo-genesis in Brassica campestris. //N.M. Bhattacharya, S.K. Sen //Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie. 1980. - V. 99.-P. 357-361.

60. Bullock, P. Anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) F-ls and their reciprocal crosses /Р. Bullock// Theor. Appl. Genet. -1982.- V. 62.-P. 155-159

61. Cao, M.Q. Embryogenese et regenerationdeplantesde choucroute /Brassica oleracea L. ssp. Capitata) par culture in vitro de microspores .isolees. / M. Q. Cao, F. Chariot, C.C. Dore. Ж Acad. Sci. Paris t. 310; serie 3.-1990. P. 203f 209.

62. Chase, S.S. Monoploid frequencies in a commercial double crass hybrid maize and its components single cross hybrids and: inbred lines. /S.S; Chase //Genetics. 1949- Vol.34 P.328-332.

63. Chu, C.C. The N6 Medium and its Applications for Anther Culture of Cereal Crops /С.С. Chu//Proc. Plant. Tissue culture bening Geience Press. 1978. -P. 43-50.

64. Chuang, C.C. A set of Potato medium for wheat anther culture /С.С. Chuang, J.W. Ouyang //Proc. Symp. Plant Tissue Culture. Science Press: Peking. -1978.- P.51-56.

65. Constantin, M.J. Propagation of Higher Plants; througt Tissue Culture: Emerging Technique and Strategies/M.J: Constantin, R:R^ Henke,K.W.

66. Hughes, B.V. Conger Envir. and Exper Botany. Special issue., 1981. - P. 452.

67. Dunwell, J.M. Anther culture of Solatium tuberosum L / J.M Dunwell, N. Sunderland //Euphytica- 1973 V.22 P. 317-323.

68. Dunwell, J.M. Embriogenesis from pollen in vitro. Biotechnology in plant science. Relevance to agriculture in the eighties. /J.M. Dunwell. //Acad. Press. — 1985. P.44-49.

69. Dunwell, J.M. Pollen, ovule and embryo culture as a tool in plant breeding /J.M. Dunwell //Whither L.A. Anderson P.G. (eds) Plant. Tissue culture and its Agricultural Applications Butterworths. London. - 1986. P.375-404.

70. Duijs, J.G. Highly regenerative cultivars in microspore culture in Brassica oleraseae L. var. Capitata. / J.G. Duijs, R.E. Voorrips. // Euphytica 60. 1992.- P. 45-55.

71. Finnie, S.J. The effect of carbohydrate composition and concentration on anther culture response in barley (.Hordeum vulgare L.) /S.J. Finnie, W. Powell, A.F. Dyer //Plant Breed., 1989.-V.10.- P. 110-118.

72. Gamborg, O.L. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells /O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima //Exp. Cell. Res. 21. 1968. P. 359-368.

73. Green, C.E. Prospects for crop improvement in the field of cell culture. /С.Е. Green.//Hort. Sci. 1977.-V. 12.-P. 131-134.

74. Guha, S. In vitro production of embryos from anthers of Datura. /S. Guha, S.C Maheshwari. //Nature, 204, 1964. P. 497.

75. Guo, J.D. Maintenance of male sterile germ-plasm in Brassica rapa by in vitro propagation. /J.D. Guo, T. Niemela, U. Talisalo, S. Pulli. //Agr, And Food Scince in Finland. 2000. - V. 9. -P. 231-238.

76. Engvild, K.C. Plantlet ploidy and flower bud size in tobacco anther cultures /К.С. Engvild //Hereditas. - 1974. - V.76. - P. 320 - 322.

77. Engvild, K.C. Anther cultures of Datura innoxia: Flower bud stage and em-bryoid level of ploidy. /К.С. Engvild, I. Linde -Laursen, A. Lundquist. //Hereditas. 1972. - V.72. - P. 331 - 332.

78. Evans D.A. Somaclonal and gametoclonal variation / D.A. Evans, W.R. Sharp, M.P. Medina-Filho American Journal of Botany, 1984, V.71, N 6, P.759-774.

79. Hu, Han. Wheat: improvement through anther culture /Ни Han //Biotechnology in agriculture and forestry. (Ed. By Y.P.S. Bajaj) Springer-Velag: Berlin Heidelber. - 1986. - V. 2. - P.55-71.

80. Hunter, C.R. The effect of anther orientation on the production of microspore — derived embryoids and plants of Hordeus Vulgarie Salarlis. /C.R. Hunter. //Plant CelL-1985, 4. P.267-268.

81. Qin, X. Chloroplast namber in Guard cells as ploidy indicator of in vitro grown androgenic peper plantlets /X. Qin, G.L. Rotino //Plant Cell, Tissue Organ Cult. 1995.-V. 41. P. 153-160.

82. Kao K.N. Induction of pollen plant formation in barley anther culture /K.N Kao, D.C. Horn //Int. Symp. On genetic manipulation in crops. Abstracts. Beijing. China. 1984. P.64.

83. Keller, W. A. In vitro production of plants from pollen in Brassica campre-stris. /W.A. Keller, R. Rajhathy, J. Lacapra. //Can. Genet Cytol 17, 1975: P. 655- 666.

84. Kozai, T. Photoautotrophic micropropagation in vitro. /Т Kozai. //Cellular and Developmental Biology Plant. 1991. - V. 27. -P. 47-51.

85. Kuginuki, Y. Varietal differences in embryogenic and regenerativ ability in microspore culture of Chinese cabbage {Br. Camperstris spp. Rekinesis). /Y. Kuginuki, K. Nacamura, K-I. Hida, H. Yosicawa. //Breeding Scince -1997- 47 -P.341-346.

86. Lazar, M.D. Combining abilities and heritability of callus formation and plantley regeneration in wheat (Triticum aestivum) anther culture /M.D. Lazar //Theor. Appl. Genet., 1984a.- V.68. - P. 131-134.

87. Mercy, S.T. Chromosomal behavior of anther culture derived plants of rice / S.T. Mercy, F.J. Zapata //Plant Cell Repts 1986. V. 5 №3 P.215-218.

88. Mukherjee, S.K. Low sugar and osmotic requirements for shoot regeneration from leaf pieces of Solanum melongena L. /S.K. Mukherjee, B. RathinasaEAIIathi, N, Gupta. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. - V. 25.-P. 13-16.

89. Murashige T. A. Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures /Т. Murashige, F. Skoog //Physiologia Plantarum. -1962. V. 15. -P.473-497.

90. Nichterlein, K. Genotypic and exogenous factors affecting shoot regeneration from anther callus of linseed (Linnum usitatissimum L.). /К. Nichterlein, H. Umbach, W. Friedt //Institute of Agronomy and Plant Breeding, Giessen, 1991,,-P. 125-128.

91. Nitsch, J.P. Experemental Androgenesis in Nicotiana /J.P. Nitsch //Phytomorphology. 1969. - Vol. 19. P. 389-404.

92. Nitsch, P.C. Effect dun choc termigue sur lepouvoir embryogenis pollen de Duture in noxia culture dans lanthereon isole de lantoure /Р.С. Nitsch, B. Noreel //C.R. Acad. Sci. 1973, 276D,3 -P.305-306.

93. Nitsch, P.C. Proceedings of the 18th International Horticulture Congress /Р.С. Nitsch //Tel Ariv. 1972. V.2 - P. 19-58.

94. Ockendon, D.J. Utilization of anther culture in Breeding Brussels sprouts. /D.J. Ockendon. //Genetic Manipulation in plant Plant Breeding. Walter & Gruyter CO. Berlin New York Printed in Germany: 1986. P. 256-271.

95. Oono, К. Production of haploid plantlets of rice (Oryza sativa) by anther culture and their use for breeding. /К. Oono. //Bull. Nat. Inst. Agric. Sci.- 1975 -Series D.-26-P. 139-222.

96. Ouyang, J.W. The response of anther culture to culture temperature in Triti-cum aestivum /J.W. Ouyang, S.M. Zhou, S.E. Jia //Theor. and App. Genet. — 1983., V66, №2, P.101-109.

97. Pechan, P.M. W. A. Identification of potentially embryogenic in Brassica napus /Р.М Pechan, W.A. Keller //Physiologia Plantarum. 1988. - V.74. P.377-384.

98. Phippen, C. Genotype plant, bud size and media factors affecting anther culture of califlowers (В. Oleraceae var. botrytis). /С. Phippen, D.J. Ockendon // Theor. Appi. Genet.-1990.-79.-№l.-P.33-38.

99. Purahauser L. Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestivum and Nicotiana plumbaginifo-lia in tissue culture using the ethylene inhibitor AgNOs PL. Purahauser, M. Medgyesy, P.J. Czenko, L. Marton //Plant Cell Reports, 1987. Vol. 6.-P. 1 -4.

100. Shu, W. Secondary embryogenesis from thin cell layers of Brassica napus ssp. oleifera /W. Shu, C.S. Loh //New Phytologist. 1991. - V. 119. -P. 427-432.

101. Singh, B. Heterosis in radish {Raphanus sativus L.). / B. Singh, V.P. Gupta, P.K. Gupta. //Indian J. Hort. 1986. - V. 43. 3-4. -P. 242-247.

102. Sorvari, S. Influence of sucrose and milibiose on barley anther culture in starch media. // S. Sorvari, O. Schieder // Plant Breeding. -1982, 99.- P. 1-24.

103. Sunderland, N. The consept of morfogenic competence with reference to anther and pollen culture. / N. Sunderland. // Plant Cell Culture Crop. Proc. Int. Symp., Calcutta., 6-10 Dec.,1981. N.Y.; L.P.- 1983.-P. 125-139.

104. Telmer, T. A. Cellular changes During heat shock induction and embryo development of cultured microspores of Brassica napus sv. Topas / T. A. Telmer,

105. W. Newcomb, D.H. Simmonds //Protoplasma. 1995. V.l85. - P. 106 - 112

106. Thomas, E. Embryogenesis from microspores of Brassica napus. / E. Thomas, G. Wenzel. //Z. Planzenzucht 74, 1975: p77-81.

107. Thurling, N. The influence of donor plant genotype and environment on production of multicellular microspores in cultured anther of Brassica napus ssp oleifera /N. Thurling, P.M. Chay //Ann. Bot. 1984. V/54 №5. P.681-693

108. Vagera, T. Regulation of in vitro androgenesis of tobacco: relationship between concertration of iron ions and kinetin. // T. Vagera, T. Havranek, Z. Opatrny. //Biohem U. Physiol. Pflanzen.- 1979 -P.759-760.

109. Yang, O. A study of factors affecting anther culture of cauliflower Brassica oleracea var. botrytis. // O. Yang, J. E. Chauvin, Y. Herve. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28, 1992.: 289-296

110. Zagorsca, N. A. Morfogenesis and plant differentiation in anther cultures of the genus Lucopersicon Mill. / N. A. Zagorsca, M. Abadjieva, C.Georgiev, R. Georgieva. //Plant Tissue Cult., Tokio and lake Yamanaka, July 11-16, Tokyo-1982-P. 539-540.

111. Zaki M.A.M. Microspore derived embryos in Brassica: the signiflcanceof division symmetry in pollen mitosis I to embryogenic development / M.A.M. Zaki, H.G. Dickenson //Sexual Plant Reproduction. -1991. V.4. — P.48-55