Оптимизация культуры изолированных микроспор и оценка комбинационной способности линий удвоенных гаплоидов капусты белокочанной тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат наук Байдина Анастасия Васильевна

• Байдина Анастасия Васильевна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Байдина Анастасия Васильевна

Введение

Актуальность темы исследования и ее разработанность

Цели и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

Апробация результатов

Связь работы с научными проектами и программами

Публикация результатов исследований

Личный вклад соискателя

Структура и объем диссертации

1 Обзор литературы

1.1 Предпосылки получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор рода Brassica

1.2 Влияние генотипа на формирование эмбриоидов в культуре микроспор

1.3 Подготовка растений-доноров микроспор

1.4 Стадия развития культивируемых микроспор

1.5 Маркерные признаки перехода микроспор от гаметофитного пути развития к спорофитному

1.6 Активация перехода к спорофитному пути развития

1.6.1 Тепловой и холодовой шок

1.6.2 Углеводное голодание

1.6.2.1 Альтернативные источники углеводного питания

1.6.2.2 Влияние уровня рН среды на эмбриогенез в культуре микроспор

1.7 Использование буфера для стабилизации уровня рН

1.8 Использование гуммиарабики для увеличения выхода эмбриоидов

1.9 Использование антиокислителей

1.10 Формирование эмбриоидов

1.11 Формирование растений из эмбриоидов

1.12 Спонтанное удвоение числа хромосом

1.13 Удвоенные гаплоиды в селекции и генетике растений

1.14 Особенности линий удвоенных гаплоидов

1.15 Состояние и перспективы селекции раннеспелой белокочанной капусты

1.16 Биологические особенности капусты белокочанной

1.17 Цитоплазматическая мужская стерильность у капустных культур

1.18 Комбинационная способность раннеспелой белокочанной капусты

1.19 Особенности наследования признаков капусты белокочанной

2 Материалы и методы

2.1 Создание удвоенных гаплоидов

2.1.1 Растительный материал

2.1.2 Условия выращивания и подготовки растений - доноров

2.1.3 Определение стадии развития микроспор

2.1.4 Выделение и культивирование микроспор, получение эмбриоидов

2.1.5 Факторы, влияющие на эмбриогенез культивируемых микроспор

2.1.6 Регенерация/проращивание эмбриоидов

2.1.7 Укоренение и адаптация сеянцев и проростков в субстрате

2.1.8 Определение плоидности растений-регенерантов

2.2 Оценка хозяйственно-ценных признаков линий УГ и выделение перспективных гибридных комбинаций

2.2.1 Растительный материал

2.2.2 Размножение удвоенных гаплоидов

2.2.3 Оценка степени проявления самонесовместимости

2.2.4 Полевые испытания гибридных комбинаций. Выделение перспективных гибридных комбинаций

2.2.5 Условия проведения полевых испытаний

2.2.5.1 Характеристика почвы опытного участка

2.2.5.2 Температура воздуха в период вегетации

2.2.5.3 Атмосферные осадки в период вегетации

2.3 Статистическая обработка

3 Результаты и обсуждение

3.1 Влияние генотипа донорного растения на формирование и выход эмбриоидов в культуре изолированных микроспор Brassica oleracea L.

var. capitata

3.2 Изучение влияния различных факторов на частоту эмбриогенеза в культуре микроспор

3.2.1 Влияние рН среды на эмбриогенез в культуре микроспор

3.2.2 Влияние МББ и гуммиарабики на эмбриогенез капусты белокочанной

3.2.3 Влияние базовой концентрации питательной среды МЬК-13 на эмбриогенез в культуре микроспор

3.2.4 Влияние концентрации макроэлементов в питательной среде на эмбриогенез в культуре микроспор

3.2.5 Влияние высокого рН среды (8,0) и теплового шока на эмбриогенез в культуре микроспор

3.3 Особенности интеграции технологии культуры изолированных микроспор в селекционный процесс у капусты белокочанной

3.4 Изучение проявления хозяйственно-ценных признаков УГ и ЛУГ

3.5 Анализ комбинационной способности линий УГ по признаку «скороспелость»

3.5.1 Анализ ОКС ЛУГ в системе топкросс

3.5.2 Анализ комбинационной способности линий УГ по признаку «скороспелость» в системе диаллельных скрещиваний

3.6 Оценка комбинационной способности линий по признаку «масса кочана»

3.6.1 Оценка общей комбинационной способности (ОКС) в системе топкросс, 2015- 2016 гг

3.6.2 Анализ комбинационной способности линий УГ в системе диаллельных скрещиваний

3.7 Оценка и выделение перспективных гибридных комбинаций, 2015 г

3.8 Оценка и выделение перспективных гибридных комбинаций, 2016 г

Заключение

Выводы

Рекомендации производству

Список сокращений

Библиографический список

Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация культуры изолированных микроспор и оценка комбинационной способности линий удвоенных гаплоидов капусты белокочанной»

Введение

Актуальность темы исследования и ее разработанность

Удвоенные гаплоиды (УГ) находят все более широкое применение в различных направлениях генетики, селекции и фундаментальных исследованиях (Dwivedi et al., 2015). Возможность быстро создать полностью гомозиготное растение привлекает исследователей различных направлений (Forster et al., 2007; Ferrie, 2011a, 2011b). Технологии УГ традиционно используются для фиксации аллелей признаков генетических коллекций растений, производства родительских линий в селекции F1-гибридов, создания популяций для молекулярного картирования. Также УГ используют в генетической трансформации, в технологиях направленного мутагенеза, для упрощения секвенирования генома за счет устранения гетерозиготности и «обратной» селекции (Dirks et al., 2009; Ferrie, 2011a).

Усовершенствованию технологии производства удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор (КИМ) у культур рода Brassica посвящены работы ряда российских и зарубежных ученых (Lichter, 1989; Takahata, 1991; Duijs et al., 1992; Cao et al., 1994; Zhang et al., 2008; Winarto, 2011; Yuan et al., 2012, Монахос, 2015; Шмыкова, 2006 и др.), в том числе у капусты белокочанной (Brassia oleracea var. capitata) (Duijs et al., 1992; Hansen et al., 1994; Rudolf et al., 1999, Yuan et al., 2012, Cristea et al., 2013b и др.). Однако, несмотря на то, что капуста белокочанная является одной из основных овощных культур в мире, проблема низкой отзывчивости к культуре микроспор остается нерешенной и актуальной. Применение культуры микроспор в селекции у культур рода Brassica ограничивается в основном тремя факторами: низкой частотой эмбриогенеза большинства генотипов, низкой частотой прямого прорастания эмбриоидов и регенерации проростков, низкой частотой спонтанного удвоения числа хромосом гаплоидных эмбриоидов.

Кроме того, практически отсутствуют работы, посвященные изучению эффективности использования линий удвоенных гаплоидов в селекции капусты белокочанной. Пивоваров и др. (2017) пишут о получении перспективного гибрида позднеспелой капусты белокочанной. Монахос (2015) сообщает о передаче F1-гибрида Краут среднепоздней капусты белокочанной в Госкомиссию, включенный в Госреестр селекционных достижений, допущенных к использованию в 2017 г.

В иностранной литературе представлены результаты исследований линий УГ, полученных в культуре пыльников (Kaminski et al., 2010), исследователи отмечают низкую завязываемость семян у полученных ЛУГ (Chauvin et al., 1993).

Таким образом, при производстве и использовании в селекции удвоенных гаплоидов капусты белокочанной остаются нерешенными ряд вопросов: повышение выхода эмбриодов в культуре микроспор, повышение частоты регенерации/проращивания УГ из эмбриоидов, особенности размножения и оценка линий удвоенных гаплоидов по хозяйственно-ценным признакам и комбинационной способности.

Цели и задачи исследования

Цель исследования - изучение влияния факторов на частоту эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор, оценка биологических особенностей, проявления хозяйственно-ценных признаков и комбинационной способности линий удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (B. oleracea L.).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение влияния факторов, генотип растения-донора, рН среды, состав и концентрация питательной среды, на частоту эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор, и оптимизация элементов технологии КИМ для достижения наибольшего выхода эмбриоидов.

2. Изучение биологических особенностей и комбинационной способности по признакам «средняя масса кочана» и «скороспелость» коллекции линий удвоенных гаплоидов раннеспелой капусты белокочанной.

3. Оценка проявления признаков гибридных комбинаций полученных с участием линий удвоенных гаплоидов и выявление перспективных гибридов для передачи в Государственную комиссию Российской Федерации по испытанию и охране селекционных достижений.

Научная новизна

Показано, что при культивировании изолированных микроспор высокий уровень рН среды NLN-13 индуцирует переход микроспор капусты белокочанной (культур рода Brassica) с гаметофитного на спорофитный путь развития. Повышение уровня рН среды NLN-13 до рН 8,0 во время теплового шока микроспор (32,5±0,1 °C в течение 48 ч) значимо увеличивает частоту эмбриогенеза по сравнению с рН 5,8.

Показано, что во время культивирования микроспор происходит волнообразное изменение рН среды: рН среды снижается к 14 дню культивирования, и это снижение совпадает с преобладающим процессом гибели микроспор; рН среды возрастает к 21 дню культивирования, когда начинают преобладать процессы деления и формирования эмбриоидов.

Показано, что добавление в питательную среду буфера MES в концентрации 3 ^M уменьшает пределы изменения рН среды в 2 раза, по сравнению со средой без добавок, добавление гуммиарабика влияния на рН среды во время культивирования микроспор не оказывало.

Впервые показано, что при размножении растений-регенерантов поколения R0 до линий УГ (поколения R2, R3) у 15 % генотипов возможно разнонаправленное изменение степени проявления самонесовместимости.

Впервые у линий УГ в системе диаллельных скрещиваний изучены генетические эффекты, обуславливающие признак «средняя масса кочана», и показано, что в контроле данного признака преобладают неаллельные

взаимодействия генов по принципу комплементарного эпистаза и неполного доминирования.

Теоретическая и практическая значимость

Анализ частоты эмбриогенеза у 200 генотипов капусты белокочанной показал, что в среднем 75% генотипов имеют низкую отзывчивость или неотзывчивы в культуре изолированных микроспор. Использование технологии культуры изолированных микроспор для фиксации аллелей у линий поздних поколений инбридинга не целесообразно, т.к. 85% низкоотзывчивы или неотзывчивы в культуре микроспор. Использование в качестве растений-доноров микроспор селекционного материала (различные поколения беккроссов, расщепляющиеся популяции, Б1-гибриды) наиболее перспективно ввиду его достаточно высокой отзывчивости и гетерозиготности.

На основании проведенных исследований выявлен оптимальный уровень рН среды (6,4) для культивирования микроспор большинства генотипов капусты белокочанной.

Показано, что использование среды ^N-13 с рН 8,0 во время теплового шока (инкубирование при 32,5±0,1 °С в течение 48 ч.) позволяет увеличить частоту эмбриогенеза микроспор в среднем в 3-4 раза.

При исследовании влияния разбавления базовой концентрации питательной среды NLN-13 в 2, 3, 4 на частоту эмбриогенеза у генотипов капусты белокочанной показано, что увеличение частоты эмбриогенеза происходит при культивировании на среде с разбавлением в 3 или 4 раза и реакция на уменьшение концентрации нутриентов генотипспецифична.

Изменение рН среды связано с культивированием микроспор. Во время культивирования микроспор уровень рН среды снижается к 14 дню культивированию, что связано преобладающим процессом гибели микроспор и возрастает к 21 дню культивирования, когда начинают преобладать процессы деления и формирования эмбриоидов. Добавление в питательную

среду MES в концентрации 3 ^M снижает пределы изменения рН среды в 2 раза.

При изучении степени проявления самонесовместимости у растений-регенерантов (R0) полученных в культуре микроспор и линий удвоенных гаплоидов, полученных последующим размножением УГ (R2, R3), обнаружено 15% линий УГ, у которых в процессе размножения изменяется степень самонесовместимости.

Положения, выносимые на защиту

1. Уровень рН питательной среды является фактором индукции эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор.

2. В процессе культивирования изолированных микроспор происходит волнообразное колебание рН среды.

3. Снижение амплитуды колебания рН среды в 2 раза, не оказывает существенного влияния на частоту эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор.

4. Варьирование хозяйственно-ценных признаков линий удвоенных гаплоидов проявляется в разной степени.

5. Степень проявления самонесовместимости УГ и ЛУГ разнонаправлено изменяется в поколениях.

6. Генетическое разнообразие линий удвоенных гаплоидов позволяет создавать Fl-гибриды, превосходящие лучшие коммерческие гибриды.

Апробация результатов

Результаты исследований доложены и обсуждены на 10 конференциях: Международная научная конференция «Научное и кадровое обеспечение продовольственной безопасности России» (Москва, 2014 г.); 15-я научная конференция молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2015); Всероссийский конкурс на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства Российской

Федерации (Курск, 2015); Международная научная конференция молодых учёных и специалистов, посвящённой 150-летию РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2015); Международная научно-практическая конференция «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК» (Пенза, 2015); Международная научная конференция молодых учёных и специалистов «Наука молодых - агропромышленному комплексу» (Москва, 2016); Научная конференция с международным участием «Современное состояние, проблемы и перспективы развития аграрной науки» (Ялта, 2016); II всероссийская научная конференция молодых ученых с международным участием «Современное состояние, проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса» (Симферополь, 2016); 7 th International Symposium on Brassicas (Испания, Понтеведра, 2017); Международная научная конференция молодых учёных и специалистов, посвящённая 100-летию И.С. Шатилова (Москва, 2017); Международная научная конференция молодых учёных и специалистов, посвящённая 150-летию со дня рождения В.П. Горячкина (Москва, 2018).

Связь работы с научными проектами и программами

Грант (субсидии) Министерства сельского хозяйства РФ, 2014 г., тема «Создание конкурентоспособных сортов зерновых и овощных культур на основе использования современных методов биотехнологии для обеспечения импортозамещения на агропродовольственном рынке России» (доп. соглашение №1 от 21.04.2014 №559/13 к соглашению № 3112/13 от 30.12.2013); Грант Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, 2015 г., тема «Создание F1-гибрида белокочанной капусты на основе линий удвоенных гаплоидов» (контракт № 9345ГУ/2015 от 28.12.2015).

Публикация результатов исследований

По теме исследования опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 10 статей в сборниках докладов и тезисов, в т.ч. 1 на иностранном языке;

получено 2 авторских свидетельства и 1 патент на F1-гибрид капусты белокочанной.

Личный вклад соискателя

Результаты экспериментальных и теоретических исследований получены автором лично и совместно со студентами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежат разработка программы исследования, и проведение основных экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 143 страницах, состоит из введения, основной части, представленной 3 главами, и заключения. Включает 20 таблиц, 17 рисунков, 19 приложений. Библиографический список включает 183 источника, в том числе 140 на иностранных языках.

l Обзор литературы

1.1 Предпосылки получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор рода Brassica

Впервые гаплоидное растение было найдено в популяции растений дурмана (Datura stramonium) в 1921 году (Blakeslee, 1922). Эта находка послужила толчком для поиска гаплоидов у других видов, а также разработкам методов экспериментального получения гаплоидов.

Первые гаплоиды в условиях in vitro были получены в культуре пыльников Datura в 60-х гг. прошлого столетия (Guha, 1964, 1966), позже эксперименты по получению удвоенных гаплоидов (УГ) в культуре пыльников начали проводить и у других культур. У культур рода Brassica первые удвоенные гаплоиды были получены в культуре пыльников рапса в начале 1970-х гг. (Thompson, 1972, Thomas, 1975, Keller et al. 1975). Основным недостатком технологии культуры пыльников являлся низкий выход эмбриоидов и удвоенных гаплоидов (Siebel, 1989).

В 1982 г. Lichter предложил альтернативный способ получения удвоенных гаплоидов - культивирование изолированных микроспор. Позже была разработана и опубликована базовая методика культуры микроспор для рапса, которая стала основой получения удвоенных гаплоидов у культур рода Brassica (Huang, 1989). В 90-х гг. технологию культуры микроспор стали использовать для получения удвоенных гаплоидов у капусты цветной (B. oleracea var. botrytis), брокколи (B. oleracea var. italica), капусты португальской (B. oleracea var. costata), кольраби (B. oleracea var. gongylodes), капусты декоративной (B. oleracea var. acephala), капусты белокочанной (B. oleracea var. capitata) и капусты китайской (B. rapa ssp. chinensis) (Lichter, 1989; Takahata, 1991; Duijs et al., 1992; Cao et al., 1994; Zhang et al., 2008; Winarto, 2011; Yuan et al., 2012).

Культура микроспор предполагает больше манипуляций с тканями и клетками in vitro и использование более сложных питательных сред, однако

обладает рядом несомненных преимуществ перед культурой пыльников. Так как микроспоры изолированы, исключено получение диплоидных соматических регенерантов. Культура микроспор позволяет получить высокий выход эмбриоидов за 2-3 недели у большего числа генотипов (Cao et al., 1994). За счет работы с одиночными клетками технология представляет интерес для генетической инженерии и фундаментальных исследований (Takahata et al., 2005). К недостаткам технологии можно отнести ограниченное число видов, для которых разработана методика получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор, однако у видов, для которых технология оптимизирована, эффективность получения удвоенных гаплоидов гораздо выше, чем в культуре пыльников (Forster et al., 2007; Segui-Simarro, 2010).

Над проблемой оптимизации методики получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор рода Brassica работали многие исследователи Lichter (1989), Takahata (1991), Duijs et al. (1992), Cao et al. (1994), Zhang et al. (2008), Winarto (2011), Yuan et al. (2012) и др., однако универсальной технологии разработать не удалось, так как на процессы получения растений УГ влияют многочисленные факторы: условия выращивания растений доноров микроспор, их генотип, стадия развития микроспор, тип предобработки бутонов и микроспор, состав питательных сред, условия культивирования. При этом оптимальное значение перечисленных факторов является необходимым условием для успешного эмбриогенеза (Шмыкова, 2015).

1.2 Влияние генотипа на формирование эмбриоидов в культуре микроспор

Среди факторов, влияющих на успех эмбриогенеза, генотип считается наиболее важным (Xu et al., 2007). Влияние генотипа было описано во всех исследованиях, изучающих развитие гаплоидного растения в культуре пыльников или микроспор у Brassica (Arnison, 1990; Baillie et al., 1992; Thurling, 1984; Wang et al., 2004 и др.). Исследователи отмечают, что

эмбриогенез в культуре микроспор и пыльников наиболее успешен у брокколи (Arnison, 1990; Takahata, 1991; Duijs et al., 1992), брюссельской (Ockendon, 1987) и цветной капусты (Chauvin et al., 1993; Stipic, 1997), в то время как у белокочанной капусты эмбриогенез и получение растений-регенерантов в целом проходит менее успешно (Rudolf et al., 1999). Низкий выход эмбриоидов у всех исследованных генотипов капусты белокочанной отмечали в своих работах Cao et al. (1990), Tuncera et al. (2016). Высокий выход эмбриоидов у отдельных генотипов капусты белокочанной показан в работах Duijs et al. (1992), Hansen et al. (1994), Rudolf et al. (1999), Yuan et al. (2012). Несмотря на высокую склонность к эмбриогенезу у отдельных образцов, в целом генотипы белокочанной капусты не склонны к формированию эмбриоидов или частота образования эмбриоидов низка. Помимо вышеуказанных различий, в пределах одного генотипа растения могут отличаться способностью к эмбриогенезу, особенно ярко такие различия проявляются у самонесовместимых линий (Ferrie et al.,1995).

Многие авторы указывают, что способность растения формировать эмбриоиды контролируется генетически, однако нет единого мнения о количестве генов, участвующих в контроле данного признака (Rudolf et al., 1999; Palmer et al., 1996; Zhang, 2001; Ferrie, 2004; Weber et al., 2005). При скрещивании высокоотзывчивых и низкоотзывчивых генотипов белокочанной капусты, показано либо проявление промежуточного значения признака у потомства, либо превышение признака эмбриогенной отзывчивости у гибридного потомства по сравнению с лучшим родителем (Rudolf et al., 1999). Palmer et al. (1996) на основании проведенных реципрокных скрещиваний, указывает возможность предопределяющего влияния цитоплазмы на отзывчивость к эмбриогенезу. Zhang и Takahata (2001) при анализе наследования отзывчивости к эмбриогенезу в системе диаллельных скрещиваний у рапса и капусты пекинской выявили достоверное влияние аддитивных и доминантных эффектов генов на наследование признака.

1.3 Подготовка растений-доноров микроспор

Склонность к эмбриогенезу обусловлена не только наследственными факторами, но и физиологическими факторами, такими как возраст растения, возраст соцветия, условия выращивания. Проведенные исследования на рапсе (B. napus) показали параболическую зависимость частоты эмбриогенеза от возраста растения-донора микроспор, при этом снижение эмбриогенной компетентности микроспор связано с наступлением физиологической старости растения (Burnett et al., 1992), однако начало цветения растения не гарантирует наступление оптимального времени для выделения микроспор. Burnett et al. (1992) показали, что микроспоры рапса, выделенные в начале цветения, не способны к формированию эмбриоидов. Custers (2003) указывает, что оптимально собирать бутоны с соцветий, на которых раскрылось 1-3 цветка.

Условия окружающей среды, в которых выращивается растение, обладают модифицирующим влиянием на отзывчивость к эмбриогенезу (Dunwell et al., 1985; Roulund et al., 1990; Thurling, 1984). Aslani et al. (2005) сообщают, что температура во время роста донорного растения играет решающую роль в формировании эмбриогенной компетентности микроспор. Aslani et al. (2005) показали, что у B. napus при выращивании летом при температуре 25-30 °С отсутствовал эмбриогенез, однако при выращивании тех же генотипов осенью при температуре 15-20 °С эмбриоиды формировались. Повышенный выход эмбриоидов при выращивании растений-доноров микроспор при пониженных температурах отмечали Keller et al. (1987), Takahata et al. (1991), Ferrie (2003), Монахос (2014а). Считается, что влияние низкой температуры во время стеблевания и цветения увеличивает количество микроспор, способных к формированию эмбриоидов, из-за медленного развития пыльцы, а также продлевает сроки введения микроспор в культуру (Ferrie, 2011b; Монахос, 2014а).

Подготовку растений-доноров осуществляют в открытом грунте, в теплице или климатической комнате. Введение в культуру микроспор,

выделенных из растений, выращенных в открытом грунте, может осложняться контаминацией микроорганизмами и низкой эмбриогенной компетентностью микроспор (Dias, 2003). В целом растения доноры, выращенные в контролируемых условиях, имеют более высокую частоту эмбриогенеза, чем растения, выращенные в поле или теплице (Ferrie, 2004). Так Prem et al. (2012) показали, что отзывчивость к эмбриогенезу у донорных растений рапса, выращиваемых в ростовой камере, была 7 раз выше, чем у растений, выращиваемых в теплице. Однако следует учитывать, что некоторые генотипы могут иметь специфические требования к условиям роста для повышения выхода эмбриоидов (Roulund et al., 1990). В любом случае во время выращивания растений доноров на всех этапах не рекомендуются обработки ядохимикатами, т.к. это снижает жизнеспособность микроспор (Custers, 2003).

1.4 Стадия развития культивируемых микроспор

По данным Pechan and Keller (1988) в пыльниках Brassica napus содержится от 0,05% до 0,12% морфогенных микроспор. У культур Brassica для изоляции используют микроспоры, находящиеся на стадии развития от одноядерной до ранней двуядерной (Pratap, 2009). Известно, что стадия развития микроспор коррелирует с размером бутона, в частности с его длиной, которая варьирует в зависимости от вида и условий роста растений. Например, у капусты брокколи коэффициент корреляции между длиной бутона и стадией развития мужского гаметофита составляет 0,85 - 0,94 (Шмыкова, 2006). При исследовании различных видов капустных культур также было показано, что микроспоры, находящиеся на поздней одноядерной стадии развития, различаются по величине: самые маленькие у B. nigra, средние у B. napus и самые крупные у B. oleracea (Lichter, 1989).

1.5 Маркерные признаки перехода микроспор от гаметофитного пути развития к спорофитному

Обобщив данные разных авторов, 8Иапа1рапаЫ е1 а1. (2006) выделили следующие признаки перехода микроспор от гаметофитного пути развития к спорофитному:

— Фрагментация вакуолей, путем образования цитоплазматических нитей;

— Перемещение ядра в центр микроспоры;

— Увеличение размеров клетки;

— Формирование новой клеточной стенки под экзиной;

— Уменьшение размеров ядрышка;

— Компактизация хроматина;

— Появление зоны с большим количеством пузырьков, похожих на лизосомы и деградация пластид;

— Уменьшение размеров и количества крахмальных зерен;

— Симметричное деление с формированием клеточной стенки вместо ассиметричного деления и др.

Однако среди этих маркеров не обнаружено универсального, характерного для всех видов растений. Тем не менее, звездообразная структура, образуемая цитоплазматическими нитями вокруг ядра, характерна для многих видов, в частности для табака, пшеницы, яблони, риса (8Иапа1рапаЫ е1 а1., 2006). Второй распространенный маркер - симметричное деление микроспоры. Те1тег е1 а1. (1993) и Ргет et а1. (2012) считают симметричное деление клетки микроспоры признаком начала формирования эмбриоидов у рапса В. парш, хотя есть данные, что микроспора с двумя клетками одинакового размера может развиваться гаметофитным путем (Тоигаеу е1 а1., 1996).

1.6 Активация перехода к спорофитному пути развития

Инициирующий стресс - необходимый фактор перехода микроспор с гаметофитного пути развития на спорофитный у всех изученных культур (Sendra, 2017). Широко распространены такие стрессовые предобработки, как тепловой или холодовой шок, углеводное или азотное голодание, которые применяют как по отдельности, так и совместно (Shariatpanahi et al., 2006). Другие виды стресса, упоминаемые в работах разных авторов, - пониженное атмосферное давление, колхицин, высокий уровень рН, гамма-облучение, применение абсцизовой кислоты, ауксинов, феминизирующих агентов, тяжелых металлов, каррагинановых олигосахаридов, маннита, спиртов, таких как этанол, бензиловый спирт или н-бутанол и др. (Maraschin et al., 2005; Shariatpanahi et al., 2006).

1.6.1 Тепловой и холодовой шок

Custers et al. (1994) впервые показал возможность стимулировать переход к спорофитному или гаметофитному пути развития микроспор у B. napus, контролируя температуру культивирования в условиях in vitro. Сейчас температурный шок самый распространенный способ индукции эмбриогенеза. Температура теплового шока, как правило, соответствует сублетальным температурам и в зависимости от культуры варьирует от 31 до 37 °C в течение нескольких часов или дней. У белокочанной капусты (B. oleracea) чаще всего используют температуру теплового шока 30-33 °C в течение 1-3 дней (Rudolf et al.,1999; Yuan et al., 2012; Cristea, 2013б; Yuan, 2015)

Холодовую обработку изолированных микроспор, пыльников, бутонов, соцветий или целых растений-доноров проводят при 4-10 °C от нескольких дней до нескольких недель до изоляции (Islam, 2012; Shariatpanahi et al., 2006; Osolnik, 1993). Кроме инициирующего стресса холодовой шок замедляет процессы деградации и увеличивает выживаемость микроспор (Shariatpanahi et al., 2006).

1.6.2 Углеводное голодание

Sangwan и Sangwan-Noreel (1987) предположили, что виды, в которых наблюдался эмбриогенез (Solanaceae, Gramineae, Cruciferae, Ranunculaceae, Liliaceae), характеризовались отсутствием крахмальных зерен в микроспорах до середины двуядерной стадии микроспор, в то время как, у неотзывчивых видов, таких как львиный зев, зерна крахмала были обнаружены очень рано на стадии мейоза. Позже было показано, что усвоение углеводов и накопление крахмала в микроспорах пшеницы и Antirrhiunum majus сильно зависит от источника углерода и pH среды (Indrianto et al., 1999; Barinova et al., 2002). Таким образом, углеводное голодание можно вызвать двумя способами: изменяя источник углевода и регулируя рН среды.

1.6.2.1 Альтернативные источники углеводного питания

Углеводы необходимый компонент питательных сред при индукции эмбриогенеза, который играет значительную роль в питании эксплантов, а также в регуляции осмотического давления. Высокая концентрация углеводов на этапе индукции эмбриогенеза оказывает положительное действие, однако ингибирует дальнейшее развитие эмбриоидов в сеянцы (Keller et al., 1975), поэтому на этапе регенерации эмбриоидов в сеянцы концентрацию углеводов снижают.

Наиболее часто используемым источником углерода в культуральной среде является сахароза. Растения, принадлежащие к разным семействам, по-разному реагируют на концентрацию сахарозы в питательной среде: для индукции эмбриогенеза у семейств Rosaceae и Brassicacea требуется концентрация сахарозы на уровне 6-17% (Dunwell et al., 1985), а для видов семейства Solanaceae достаточно 2-5% (Dunwell, 2010).

С недавнего времени в качестве основного источника углерода у злаковых культур используется мальтоза (Wedzony et al., 2009). Мальтоза медленнее расщепляется при культивировании и при гидролизе дает только глюкозу, в то время как сахароза разлагается на глюкозу и фруктозу. Известно, что фруктоза оказывает вредное влияние на образование

эмбриоидов в культуре пыльников пшеницы (Navarro-Alvarez et al., 1994), риса (Bishnoi et al., 2000), капусты белокочанной (Cristea et al., 2013а). Кроме мальтозы, сахарозы и фруктозы на капусте белокочанной Cristea et al. (2013а) в качестве источника углевода использовали глюкозу, однако выход эмбриоидов был невысоким.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Байдина Анастасия Васильевна, 2018 год

Библиографический список

1. Артемьева, А.М. Коллекция капусты ВИР: этапы формирования и изучения / А.М. Артемьева, Ю.В. Чесноков // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2012. - Т. 16. - № 4/2. - С.1047-1060.

2. Артемьева, А.М. Новые поступления капусты огородной Brassica oleracea L. в коллекцию ВИР. / А.М. Артемьева // Овощи России. - 2017. - № 1. - С.3-8.

3. Байдина, А.В. F1 Настя - новый гибрид капусты / А.В. Байдина, С.Г. Монахос // Картофель и овощи. - 2017. - № 11. - С. 32-34.

4. Байдина, А.В. Влияние рН среды на эмбриогенез в культуре микроспор у капустных культур / А.В. Байдина // Международная научная конференция молодых учёных и специалистов «Наука молодых -агропромышленному комплексу», г. Москва, 1-3 июня 2016 : сборник статей. - М. : Изд-во РГАУ-МСХА, 2016. - С.241-242.

5. Байдина, А.В. Методы активации перехода микроспор Brassica oleracae L. с гаметофитного на спорофитный путь развития / А.В. Байдина // Материалы международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвященной 150-летию со дня рождения

B.П. Горячкина. - М. : Издательство РГАУ-МСХА, 2018. - С.116-119.

6. Байдина, А.В. Селекция капусты на базе удвоенных гаплоидов / А.В. Байдина, С.Г. Монахос // Картофель и овощи. - 2015. - № 11. -

C. 39-40.

7. Безбожная, А.В. Культура изолированных микроспор в производстве удвоенных гаплоидов капустных овощных культур : магистр. дис. : 110500.68 / А.В. Безбожная. - М., 2014. - 61 с.

8. Бриггс, Ф. Научные основы селекции растений / Ф. Бриггс, П. Ноулз // пер. с англ. Л.И. Вайсфельд, Ю.И. Лашкевич; ред., Г.В. Гуляев. - М. : Колос, 1972. - 400 с.

9. Бунин, М.С. Производство гибридных семян овощных культур / М.С. Бунин, Г.Ф. Монахос, В.И. Терехова. - М. : РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2011. - 181 с.

10. Бюллетени о состоянии сельского хозяйства [Электронный ресурс] : федеральная служба государственной статистики - Режим доступа: http://www.gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat main/rosstat/ru/statistics/publicati ons/catalog/doc 1265196018516 - Заглавие с экрана. - (Дата обращения : 07.03.2018).

11. Готовцева, И.П. Изучение комбинационной способности при подборе гетерозисных комбинаций (на примере тепличного томата) : дис. канд. ... биол. наук : 06.01.05 / И.П. Готовцева. - М., 1978. - 246 с.

12. Давлетбаева, О.Р. Оценка инбредных линий и создание гетерозисных F1-гибридов среднеспелой капусты белокочанной для нечерноземной зоны России : автореф. дис. ... канд. с.-х. наук : 06.01.05 / О.Р. Давлетбаева. -М., 2016. - 21 с.

13. Даскалов, Х. Гетерозис и его использование в овощеводстве / Х. Даскалов, А. Михов, И. Минков. - М. : Колос, 1978. - 310 с.

14. Дыдив, И. Ранний урожай капусты белокочанной в пленочных теплицах [Электронный ресурс] / И. Дыдив, О. Дыдив, А. Дыдив // Овощеводство. - 2014. - № 2. - Режим доступа : http://www.ovoschevodstvo.com/journal/browse/201402/article/1038/ (дата обращения : 07.03.2018)

15. Ирков, И.И. Технология производства белокочанной капусты / И.И. Ирков, Г.А. Костенко, Г.Ф. Монахос // Картофель и овощи. - 2014. -№ 1. - С 3-9.

16. Китаева, И.Е. Белокочанная капуста. / И.Е. Китаева, В.И. Орлова. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Росагропромиздат, 1988. - 45 с.

17. Костенко, Г.А.. Создание и оценка исходного материала капусты белокочанной в гетерозисной селекции на скороспелость : автореферат дис. ... кандидата с.-х. наук : 06.01.05 / Г.А. Костенко. - М., 2005. - 18 с.

18. Крючков, А.В. Значение гетерозисных гибридов в повышении эффективности механизированной уборки капусты / А.В. Крючков // Сб. тр. Пермского СХИ. - 1980. - т. 136. - С.57-58.

19. Крючков, А.В. Итоги селекции гибридов капусты в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева / А.В. Крючков, Г.Ф. Монахос, Д.В. Пацурия // Известия ТСХА. - 1997. - Вып. 1. - С. 4255.

20. Крючков, А.В. Основные принципы получения гибридных семян на основе самонесовместимости / А.В. Крючков // Известия ТСХА. - 1972. -Вып. 1. - С. 124-131.

21. Крючков, А.В. Селекция Б1-гибридов кочанной капусты на основе спорофитной самонесовместимости : автореф. дис... д.-ра с.-х. наук : 06.01.05 / А.В. Крючков. - М., 1990. - 61 с.

22. Крючков, А.В. Схема выведения четырехлинейных гибридов капусты на основе самонесовместимости / А.В. Крючков // Известия ТСХА. - 1977. -Вып.1. - С.124-131.

23. Кулиев, Ш.Б. Выведение гибридов ранней кочанной капусты на основе самонесовместимости : автореф. дис. ... канд. с.-х. наук : 06.01.05 / Ш.Б. Кулиев. - М., 1980. - 20 с.

24. Лежнина, А.А. Особенности получения семян самонесовместимых инбредных линий и промежуточных гибридов белокочанной капусты : автореф. дис. ... канд. с.-х. наук : 06.01.05 / А.А. Лежнина. - Москва, 1984. - 20 с.

25. Лизгунова, Т.В. Белокочанная капуста / Т.В. Лизгунова. - Л. : Колос, 1967. - 79 с.

26. Лизгунова, Т.В. Состояние, перспективы и методы селекции белокочанной капусты / Т.В. Лизгунова // Методы ускорения селекции сортов и гетерозисных гибридов овощных культур. - Л. : Колос, 1975. -С. 6-10.

27. Монахос, Г.Ф. Капуста пекинская / Г.Ф. Монахос, С.Г. Монахос // Биологические особенности, генетика, селекция и семеноводство. - М. : РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2009. - 98 с.

28. Монахос, Г.Ф. Схема селекции F1-гибридов капусты кочанной на основе линий с цитоплазматической мужской стерильностью / Г.Ф. Монахос // Сб. тр. 3-ей международной конференции посвященной памяти Б.В.Квасникова. - Москва, 2003. - С.341-345.

29. Монахос, Г.Ф. Схема создания двухлинейных гибридов капустных овощных культур на основе самонесовместимости / Г.Ф. Монахос // Известия ТСХА. - 2007. - Вып.2. - С.86-93.

30. Монахос, С.Г. Интеграция современных биотехнологических и классических методов в селекции овощных культур: дис. ...доктора. с.-х. наук : 06.01.05, 03.02.07 / С.Г. Монахос. - М., 2015. - 335 с.

31. Монахос, С.Г. Создание чистых линий - удвоенных гаплоидов капусты в культуре изолированных микроспор и селекция F1-гибридов на основе современных методов биотехнологии: метод. Рекомендации / С.Г. Монахос. - Москва : Изд-во РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева, 2014. - 44 с.

32. Монахос, С.Г. Число хлоропластов замыкающих клеток устьиц в определении плоидности растений Brassica / С.Г. Монахос, М.Л. Нгуен, Г.Ф. Монахос, А.В. Безбожная // Сельскохозяйственная биология. - 2014. - № 5. - С. 44-54.

33. Пацурия, Д.В. Биологическое и технологическое обоснование семеноводства F1-гибридов капусты белокочанной: автореферат дис. ... доктора с.-х. наук: 06.01.05 / Д.В. Пацурия. - М., 2008. - 40 с.

34. Пивоваров, В.Ф. Селекция и семеноводство овощных культур / В.Ф. Пивоваров. - М. : ВНИИССОК, 2007. - 816 с.

35. Пивоваров, В.Ф. Создание гибридов капусты белокочанной (Brassica oleracea L. convar. Capitata var. Alba DC) нового поколения с использованием линий удвоенных гаплоидов / В.Ф. Пивоваров, Л.Л. Бондарева, Н.А. Шмыкова, Д.В. Шумилина, А.И. Минейкина // Сельскохозяйственная биология. - 2017. - Т. 52. - № 1. - С. 143-151.

36. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна / А.В. Поляков ; рец. : Е.А. Калашникова, Н.Б. Брач ; Российская академия сельскохозяйственных наук. - Изд. 2-е. - М. : [б. и.], 2010. - 201 с.

37. Прокопов, В.А. Подбор и оценка исходного материала для создания F1-гибридов капусты белокочанной для юга России : дис. ... канд. с.-х. наук : 06.01.05 / В.А. Прокопов. - М., 2016. - 126 с.

38. Прохоров, И.А. Селекция и семеноводство овощных культур/ И.А. Прохоров, А.В. Крючков, В.А. Комиссаров. - М. : Колос, 1997. -480 с.

39. Пухальский, В.А. Практикум по цитологии и цитогенетике растений / В.А. Пухальский, А.А, Соловьев, Е.Д. Бадаева, В.Н. Юрцев. - М. : КолосС, 2007. - 198 с.

40. Савченко, В.К. Многоцелевой метод количественной оценки комбинационной способности в селекции на гетерозис / В.К. Савченко // Генетика. - 1978. - № 5. - С. 793-804.

41. Фам, Х.К. Оценка комбинационной способности самонесовместимых инбредных линий скороспелой белокочанной капусты : автореф. дис. ... канд. с.-х. наук : 06.01.05 / Х.К. Фам. // - М., 1986. - 12 с.

42. Шмыкова, Н.А. Получение удвоенных гаплоидов у видов рода Brassica L. / Н.А. Шмыкова, Д.В. Шумилина, Т.П. Супрунова // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2015. - № 19(1). - С. 111-120.

43. Шмыкова, Н.А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур: автореф. дис. ... д-ра с.-х. наук : 06.01.05, 03.00.23. / Н.А. Шмыкова. - М., 2006. - 44 с.

44. Adamson, R.M. Self-and cross-incompatibility in early in early roundheaded cabbage/ R.M. Adamson // Canad. J. Plant Sci. - 1965. - Vol. 45. - № 5. -Р. 493-498.

45. Ahmadi, B. Proline and chitosan enhanced efficiency of microspore embryogenesis induction and plantlet regeneration in Brassica napus L. / B. Ahmadi, M.E. Shariatpanahi // Plant Cell Tissue and Organ Culture. - 2015. - № 123. - P. 57-65.

46. Akiyama, Y. An extracellular arabinogalactan-protein from Nicotiana tabacum. / Y. Akiyama, K. Kato // Phytochemistry. - 1981. - № 20 - P. 2507-2510.

47. Anderson, R.L., A carbohydrate-binding arabinogalactan-protein from liquid suspension cultures of endosperm from Lolium multiflorum. / R.L. Anderson, A.E. Clarke, M.A. Jermyn, R.B. Knox, B.A. Stone //Aust J Plant Physiol. -1977. - № 4. - P.143-158.

48. Arnison, P.G. A survey of the anther culture response of Brassica oleracea L. cultivars grown under field conditions. / P.G. Arnison, W.A. Keller // Plant Breeding. - 1990. - № 104. - P. 125-133.

49. Asif, M. Organelle antioxidants improve microspore embryogenesis in wheat and triticale / M. Asif, F. Eudes, A. Goyal, E. Amundsen, H. Randhawa, D. Spaner // In Vitro Cellular & Developmental Biology : Plant. - 2013. -№ 49. - P. 489-497.

50. Aslani, E. Microspore culture for producing haploid plants in different rapeseed (Brassica napus) cultivare / E. Aslani, J. Mozaffari, M.R. Ghannadha, A.A. Attari // Iranian J. Agrie. Sci. - 2005. - № 36. - P. 331-339.

51. Babbar, S. Isolated microspore culture of Brassica : an experimental tool for developmental studies and crop improvement / S. Babbar, P. Agarwal // Indian J.- 2004. - № 3 - P. 185-202.

52. Baillie, A.M.R. In vitro culture of isolated microspores and regeneration of plants in Brassica campestris / A.M.R. Baillie, D.J. Epp, D. Hutcheson, W.A. Keller // Plant Cell Rep. - 1992. - № 11. - P. 234-237.

53. Barinova, I. Antirrhinum majus microspore maturation and transient transformation in vitro. / I. Barinova, M. Zhexembekova, E. Barsova, S. Lukyanov, E. Heberle-Bors, A. Touraev // J. Exp. Bot. 53. - 2002. - № 11. - P. 19-29.

54. Barinova, J. Regulation of developmental pathways in cultured microspores of tobacco and snapdragon by medium pH. / J. Barinova, C. Clement, L. Marting, F. Baillieul, H. Soukupova, E. Heberle-Bors, A. Touraev // Planta. - 2004. -№ 219. - P. 141-146.

55. Bateman, A.J. Self-incompatibility systems in angiosperm. Cruciferae / A.J. Bateman // Heredity. - 1955. - V.9. - №1. - P.53-68.

56. Belmonte, M.F. Applications of dl-buthionine-[S, R]-sulfoximine deplete cellular glutathione and improve white spruce (Picea glauca) somatic embryo evelopment. / M.F. Belmonte, C. Stasolla // Plant Cell Reports - 2007. -№ 26. - P. 517-523.

57. Belmonte, M.F. Improved development of microspore derived embryo cultures of Brassica napus cv Topaz following changes in glutathione metabolism / M.F. Belmonte, S.J. Ambrose, A.R.S.Ross, S.R. Abrams, C. Stasolla // Physiologia Plantarum. - 2006. - № 127. - P. 690-700.

58. Bishnoi, U. Anther culture of recalcitrant indica x Basmati rice hybrids./ U. Bishnoi, R.K. Jain, J.S. Rohilla, V.K. Chowdhury, K. Gupta, R. and J.B. Chowdhury // Euphytica. - 2000. - № 114. - P. 93-101.

59. Blakeslee, A.F. A haploid mutant in the Jimson weed, Datura stramonium/ A.F. Blakeslee [et al.] // Science. - 1922. - № 55 - P. 646-647

60. Boutilier, K. Biochemical and molecular aspects of haploid embryogenesis. / K. Boutilier, M. Fiers, C.M. Liu, A.H.M. van Der Geest // Biotechnology in agriculture and forestry. - 2005. - Vol. 56. - P. 73-95.

61. Burnett, L. Embryogenesis and plant regeneration from isolated microspores of Brassica rapa L. ssp Oleifera / L. Burnett, S. Yarrow, B. Huang // Plant Cell Rep - 1992. - № 11 - P. 215-218.

62. Cao, M.Q. Embryogenesis and plant regeneration in sauerkraut cabbage (Brassica oleracea L. subsp. capitata) by in vitro culture of isolated microspores / M.Q. Cao, F. Chariot, C. Dore'// C R Acad Sci Paris Ser III. -1990. - № 310. - P. 203-209.

63. Cao, M.Q. Embryogenesis and plant regeneration of pakchoi (Brassica rapa L. ssp. chinensis) via in vitro isolated microspore culture / M.Q. Cao, Y. Li, F. Liu // Dore Plant Cell Rep. - 1994. - № 13 - P. 447-450.

64. Capataz-Tafur, J. Arabinogalactan proteins are involved in cell aggregation of cell suspension cultures of Beta vulgaris L. / J. Capataz-Tafur, G. Trejo-Tapia, M. Rodri'guez-Monroy, G. Sepu'lvedaJime'nez // Plant Cell Tiss Org. Cult. -2011. - № 106. - P. 169-177.

65. Caredda, S. Plastid differentiation during androgenesis in albino and nonalbino producing cultivars of barley (Hordeum vulgare L.). / S. Caredda, C. Doncoeur, P. Devaux, R.S. Sangwan, C.Clement // Sexual Plant Reproduction. - 2000. - № 13. - P. 95-104.

66. Castillo, A. Chromosome doubling in monocots. / A. Castillo [et al.] In: A. Touraev, B.P.Forster, S.M. Jain, editors. Advances in haploid production in higher plants. - Dordrecht : Springer, 2009. - P. 329-338.

67. Cegielska-Taras, T. Direct plant development from microspore-derived embryos of winter oilseed rape Brassica napus L. ssp. oleifera (DC.) / T. Cegielska-Taras, T. Tykarska, T. Szala, M. Kuras, J. Krzymansky // Metzger Euphytica. - 2002. - № 124. - P. 341-347.

68. Chauvin, J.E. Androgenic embryos obtained by anther culture of Brassica oleracea (ssp. italica and ssp. Botrytis) and estimation of the value of regenerated material in plant breeding programs/ J.E. Chauvin, Q. Yang, B. le Jeune, Y. Herve // Agronomie - 1993. - № 13. - P. 579-590.

69. Chen, J.L. A comparison of traditional and haploid-derived breeding populations of oilseed rape (Brassica napus L.) for fatty acid composition of the seed oil / J.L. Chen, W.D. Beversdorf // Euphytica. - 1990. - Vol. 51. -№ 1. - P. 59-65.

70. Chen, J.L. Evaluation of microspore-derived embryos as models for studying lipid biosynthesis in seed of rapessed (Brassica napus L.) / J.L. Chen, W.D. Beversdorf // Euphytica. - 1991. - Vol. 58. - № 2. - P. 145-155.

71. Chinnusamy, V. Cold stress regulation of gene expression in plants. / V. Chinnusamy, J. Zhu, J-K. Zhu // Trends Plant Sci - 2007. - № 12. - P. 444451.

72. Chuong, P.V. Effects of donor genotype and bud sampling on microspore culture of Brassica napus / P.V. Chuong, C. Deslauriers, L.S. Kott, W.D. Beversdorf // Can. J. Bot. - 1988. - Vol. 66. - P. 1653-1657.

73. Coventry, J. Manual for microspore culture technique for Brassica napus. / J. Coventry, L. Kott, W.D. Beversdorf // In Technical bulletin (Ontario Agricultural College. Dept. of Crop Science); O.A.C. publication, 0489, University of Guelph. - 1988.

74. Cristea, O. Effect of carbohydrate type over the microspore embryogenesis at Brassica Oleracea L. / O. Cristea, B. Creola, P. Maria, B. Marian // Romanian Biotechnological Letters. - 2013a. - Vol. 18. - №5 - P. 8677-8684.

75. Cristea, T.O. The influence of pH on microspore embryogenesis of white cabbage (Brassica oleracea L.) / T.O. Cristea // Not Sci. Biol. - 20136. -Vol. 5 - № 4. - P. 485-489.

76. Custers, J.B.M. Microspore culture in rapeseed (Brassica napus L.). In doubled haploid production in crop plants. / J.B.M. Custers. In M. Maluszynski,

K.J. Kasha, B.P. Forster and I.Szarejko // Kluver. - Academic Publisher, 2003.

- P. 185-194.

77. Custers, J.B.M. Temperature controls both gametophytic and sporophytic development in microspore cultures of Brassica napus. / J.B.M. Custers, J.H.G. Gordewener, Y. Nollen, J.J.M. Dons, M.M. Van Lookeren-Campagne // Plant Cell Rep. - 1994. - Vol.13 - P.267-271.

78. d'Amato, F. Role of polyploidy in reproductive organs and tissues / F. d'Amato. In: B.M. Johri (eds.) Embryology of angiosperms. - Springer-Verlag, New York, 1984. - P. 519-566.

79. Dawis, R.L. Report of the Plant Breeder / R.L. Dawis // Rept. Puerto-Rico Agr. Axper. Sta. - 1927. - P. 14-15.

80. Dias, S.J.C. Effect of incubation temperature regimes and culture medium on broccoli microspore culture embryogenesis / S.J.C. Dias // Euphytica. - 2001.

- Vol. 119. - P. 389-394

81. Dias, S.J.C. Protocol for broccoli microspore culture / S.J.C. Dias // Doubled haploid production in crop plants: a manual / Eds. M. Maluszynski, K.J. Kasha, B.P. Forster, I. Szarejko. - Dordrecht: Kluwer, 2003. - P. 195-204.

82. Dirks, R. Reverse breeding: a novel breeding approach based on engineered meiosis. / R. Dirks [et al.] // Plant Biotechnology Journal. - 2009. - Vol. 7. -№ 9. - P. 837-845. - ISSN 1467-7652.

83. Duijs, J.C. Microspore culture is successful in most crop types of Brassica oleracea L./ J.C. Duijs, R.E. Voorrips, D.L. Visser, J.B.M.Custers // Euphytica

- 1992. - №60. - P. 45-55.

84. Dunwell, J.M. Haploids in flowering plants: origins and exploitation / J.M. Dunwell // Plant Biotechnol. J. - 2010. - Vol. 8. - № 4. - P. 377-424.

85. Dunwell, J.M. Influence of genotype, plant growth temperature and anther incubation temperature on microspore embryo production in Brassica napus ssp. oleifera/ J.M. Dunwell, L.M. Cornish, A.G.F. DeCourcel // J. Expt. Bot. -1985. - Vol. 36. - P. 679-689.

86. Dwivedi, S.L. Haploids: Constraints and opportunities in plant breeding / S.L. Dwivedi [et al.] // Biotechnol Adv. - 2015 -№ 33: -812-829.

87. Fan, Z. Development of microspores in vivo and in vitro in Brassica napus L. / Z. Fan, K. C.Armstrong, W.A.Keller // Protoplasma. - 1988. - № 147. -P. 191-199.

88. Ferrie, A. Haploids and doubled haploids in Brassica spp. for genetic and genomic research. / A. Ferrie, C. Möllers // Plant Cell, Tissue Organ Cult. -2011a. - № 104. - P.375-386. - doi: 10.1007/s11240-010-9831-4

89. Ferrie, A.M.R. Brassica improvement through microspore culture. in: pua e.c., douglas c.j. (eds.) / A.M.R. Ferrie, W.A. Keller // Biotechnology in Agriculture and Forestry, Brassica. - Springer Verlag, Berlin. - 2004. - Vol. 54. - P. 149168.

90. Ferrie, A.M.R. Haploid embryogenesis. in thorpe t.a. (ed.): in vitro embryogenesis in plants / A.M.R. Ferrie, C.E. Palmer, W.A Keller. - Kluwer, Dordrecht, 1995. - P. 309-344.

91. Ferrie, A.M.R. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production / A.M.R. Ferrie, K.L.Caswell // Plant Cell Tiss. Organ Cult. - 2011b. - №104 - P. 301-309.

92. Ferrie, A.M.R. Microspore culture of Brassica species / A.M.R. Ferrie // Doubled haploid production in crop plants / Eds. M. Maluszynski, K.J. Kasha, B.P. Forster, I. Szarejko. - Kluver Academic Publisher, 2003. - P. 205-215.

93. Forster, B.P. The resurgence of haploids in higher plants / B.P. Forster, E. Heberle-Bors, K.J. Kasha, A. Touraev // Trends Plant Sci. - 2007. - № 12. -P. 368-375. - 10.1016/j.tplants.2007.06.007

94. Gamborg, O.L. Nutrient requirement of suspension cultures of soybean root cells / O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima // Exp Cell Res. - 1968. -Vol. 50. - P. 151-158.

95. Good, G. Hydrogen ion buffers for bifological research / G. Good [et al.] // Biochemistry. - 1966. - Vol. 5 - №2. - P. 467-477.

96. Griffing, B. Concept of general and specific combining ability in relation to diallel crossing system / B. Griffing // Aust. J Biol. Sci. - 1956. - №9. -P. 463-493.

97. Gu, H.H. High frequency spontaneous production of doubled haploid plants from microspore culture in Brassica rapa ssp. chinensis / H.H. Gu, W.J. Zhou, Hagberg // Euphytica. - 2003. - № 134. - P. 239-245.

98. Guha, S. Cell division and differentiation of embryos in the pollen grains of Datura in vitro / S. Guha, S.C. Maheshwari // Nature- 1966. - №212. - P. 9798.

99. Guha, S. In vitro production of embryos from anthers of Datura / S. Guha, S.C. Maheshwari // Nature - 1964. - №204 - P. 497.

100. Haddadi, P. Effects of gibberellin, abscisic acid and embryo desiccation on normal plantlet regeneration, secondary embryogenesis and callogenesis in microspore culture of Brassica napus L. cv. PF704 / P. Haddadi [et al.] //Int J Plant Prod. - 2008. - №2. - P. 153-162.

101. Hansen, M. Gametic embryogenesis in Brassica: optimization of production and germination of embryos. / M. Hansen. In: B. Javornik, B. Bohanec, I. Kreft (eds.) // Proceedings of the international colloquium on impact of plant biotechnology on agriculture. Rogla, Slovenia, Centre for Plant Biotechnology and Breeding. - University of Ljubjana, Slovenia, 1994. - P. 15-18.

102. Hansen, M. Modern plant Breeding - Production of homogeneous varieties in Brassica / M. Hansen // NJF Congress Agriculture and Society, Aas (Norway). - 1999. - V.81. - № 3. - P. 148-153.

103. Haruta, T. Studies on the genetics of self- and cross-incompatibility in cruciferous vegetables/ T. Haruta // Res. Bull. Takii. Plant Breed. Sta. 1962. -№ 2. - 1958. - P. 63-85.

104. Hayman, B.I. The theory and analysis of diallel crosses / B.I. Hayman // Genetics. - 1954. - Vol.39. - P. 789-809.

105. Henry, Y. Origin of microspore-derived dihaploid and polyhaploid in vitro plants / Y. Henry // Plant Tissue Culture and Biotechnology. - 1998. - №4. -P. 127-135.

106. Hoseini, M. Effects of ascorbic acid, alpha-tocopherol, and glutathione on microspore embryogenesis in Brassica napus L. / M. Hoseini [et al.] // In Vitro Cellular & Developmental Biology: Plant. - 2013. - Vol. 50 - P. 26-35.

107. Huang, B. Microspore culture technology / B. Huang, and W.A. Keller // J. Tiss. Cult. Meth. - 1989. - Vol. 12. - P. 171.

108. Huang, B. Plant regeneration from microspore-derived embryos of Brassica napus: Effect of embryo age, culture temperature, osmotic pressure, and abscisic acid. / B. Huang [et al.] // In vitro Cell Dev Biol. - 1991. - Vol. 27. -P. 28-31.

109. Indrianto, A. Assessment of various stresses and carbohydrates for their effect on the induction of embryogenesis in isolated wheat microspores / A. Indrianto, E. Heberle-Bors, A. Touraev // Plant Sci. - 1999. - Vol. 143. -P. 71-79.

110. Islam, S.M.S. Enhancement of androgenesis by abiotic stress and other pretreatments in major crop species / S.M.S. Islam, N. Tuteja // Plant Sci. -2012. - Vol. 182: - P. 134-144.

111. Jinks, J.L. The analysis of diallel crosses / J.L. Jinks, B.I. Hayman // Maize Genet Cooperation News Lett. - 1953. - Vol. 27. - P. 48-54.

112. Kaminski, P. Gametoclonal and somaclonal variation among head cabbage androgenic lines of R1 and R2 generations obtained from Jaguar F1 hybrid / P. Kaminski // Journal of Agricultural Science. - 2010. - Vol. 2. - №2: -P. 119-128.

113. Keller, W.A. Haploids from gametophytic cells - recent developments and future prospects / W.A. Keller, P.G. Arnison, B.J. Cardy // Plant Tissue and Cell culture/ eds. C.E. Green, D.A. Somers, W.P. Hackett, D.D. Biesboer. -New York, 1987. - P. 223-241.

114. Keller, W.A. In vitro production of plants from pollen in Brassica campestris / W.A. Keller, T. Rajhathy, J. Lacapra // Can J Genet Cytol. - 1975. - Vol. 17: -P. 655-665.

115. Kirov, I. An easy "SteamDrop" method for high quality plant chromosome preparation. / I. Kirov [et al.] // Molecular Cytogenetics. - 2014. - Vol. 7. -P. 21.

116. Klutschewski, S. Methodical improvements in microspore culture of Brassica napus L. : dis. zur Erlangung des Doktorgrades / S. Klutschewski. - Göttingen, Germany, 2012. - P. 91.

117. Kott, L.S. Enhanced plant regeneration from microspore-derived embryos of Brassica napus by chilling, partial desiccation and age selection / L.S. Kott, W.D. Beversdorf // Plant Cell Tissue Organ Cult - 1990. - Vol. 23. - P. 187192.

118. Lichter, R. Efficient yield of embryoids by culture of isolated microspores of different Brassicacea species / R. Lichter // Plant Breeding. - 1989. - Vol. 103. - P. 119-123.

119. Lichter, R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus / R. Lichter // E. Pflanzenphysiol. - 1982. - Vol. 105. - P. 427-434.

120. Majewska-Sawka, A. The multiple role of arabinogalactan-proteins in plant development / A. Majewska-Sawka, E.A. Nothnagel // Plant Physiol. - 2000. -Vol. 122. - P. 3-9.

121. Malik, M.R. Transcript profiling and identification of molecular markers for early microspore embryogenesis in Brassica napus / M.R. Malik [et al.] // Plant Physiology. - 2007. - Vol. 144. - P. 134-154.

122. Maluszynska, J. Cytogenetic tests for ploidy level analyses — chromosome counting / M. Maluszynski, K. J. Kasha, B. P. Forster, I. Szarejko // Doubled Haploid Production in Crop Plants: A Manual. Springer -Netherlands, Dordrecht, 2003- P. 391-395.

123. Maraschin, S.F. Androgenic switch: an example of plant embryogenesis from the male gametophyte perspective / S.F. Maraschin [et al.] // J. Exp. Bot. -2005. - Vol. 56. - P. 1711-1726.

124. McCabe, P.F. Soluble signals from cells identified at the cell wall, establish a developmental pathway in carrot. / P.F. McCabe [et al.] // Plant Cell - 1997. -Vol. 9. - P. 2225-2241.

125. Möllers, C. Doubled haploids in breeding winter oilseed rape. / C. Möllers, M.C.M. Iqbal // In: A. Touraev, B.P. Forster, S.M. Jain (eds.). Advances in Haploid Production in Higher Plants. - Springer Science, 2009. - P. 161-170.

126. Na, H. Microspore derived embryo formation and doubled haploid plant production in broccoli (Brassica oleracea L. var italica) according to nutritional and environmental conditions / H. Na [et al.] // African Journal of Biotechnology. - 2011. - Vol. 10. - №59. - pp. 12535-12541.

127. Navarro-Alvarez, W. Effect of sugars in wheat anther culture media / W. Navarro-Alvarez [et al.] // Plant Breeding. - 1994. - Vol. 112: - P. 53-62.

128. Ochatt, S.J. Flow cytometry in plant breeding. / S.J. Ochatt // Cytometry. -2008. - Part A. - Vol. 73A. - P. 581-598.

129. Ockendon, D.J. Genetic and nongenetic factors affecting anther culture of Brussels sprout (Brassica oleracea var. gemmifera). / D.J. Ockendon, R.A. Sutherland // Theor. Appl. Genet. - 1987. - Vol. 74. - P. 566-570.

130. Osolnik, B. Stimulation of androgenesis in white cabbage (Brassica oleracea var. capitata) anthers by low temperature and anther dissection / B. Osolnik, B. Bohanes, S. Jelaska // Plant Cell. Tiss. Org. Cult. - 1993. - Vol. 32. - P. 241-246.

131. Palmer, C.E. Utilization of Brassica haploids / C.E. Palmer, W.A. Keller, P.G. Arnison, Eds. S.M. Jain, S.K. Sopory, R.E. Veilleux. // In vitro haploid production in higher plants. Important selected plants. - Dordrecht, Kluwer, 1996. - P. 143-171.

132. Pechan, P.M. Androgenesis: affecting the fate of the male gametophyte / P.M. Pechan, P. Smykal // Physiol Plantarum. - 2001. -Vol. 111. - P. 1-8.

133. Pechan, P.M. Identification of potentially embryogenic microspores in Brassica napus / P.M. Pechan, W.A. Keller // Plant Physiol. - 1988. - Vol. 74. - P. 377-384.

134. Pratap, A. Microsporogenesis and haploidy breeding / A. Pratap, S.K. Gupta, Y. Takahata // Biology and breeding of Crucifers / Ed. Gupta S.K. New York, 2009. - P. 293-307.

135. Prem, D. A new microspore embryogenesis system under low temperature which mimics zygotic embryogenesis initials, expresses auxin and efficiently regenerates doubled-haploid plants in Brassica napus / D. Prem [et al.] // BMC Plant Biol. - 2012. - Vol. 12. - P. 127.

136. Prem, D. Activated charcoal induced high frequency microspore embryogenesis and efficient doubled haploid production in Brassica juncea / D. Prem [et al.] // Plant Cell Tissue Organ Cult. - 2008. - Vol. 93. - P. 269282. - doi : 10.1007/s11240-008-9373-1

137. Roulund, N. Effect of genotype, environment and carbohydrate on anther culture response in head cabbage (Brassica oleracea L. convar. capitata Alef.) / N. Roulund, L. Hansted, S.B. Anderson, B. Forestveit // Euphytica. - 1990. -Vol. 49. - P. 237-242.

138. Rudolf, K. Microspore culture of white cabbage, Brassica oleracea var. capitata L.: Genetic improvement of nonresponsive cultivars and effect of genome doubling agents / K. Rudolf, B. Bohanec, M. Hansen // Plant Breeding. - 1999. - Vol. 118. - P. 237-241.

139. Sangwan, R.S. Ultrastructural cytology of plastids in pollen grains of certain androgenic and nonandrogenic plants / R.S. Sangwan, B.S. Sangwan-Norreel // Protoplasma - 1987. - Vol. 138. - P. 11-22.

140. Sato, S. Effect of low temperature pretreatment of buds or inflorescence on isolated microspore culture in Brassica rapa (syn. B. campestris) / S. Sato [et al.] // Breed. Sci. - 2002. - Vol. 52. - P. 23-26.

141. Sato, T. Plant regeneration from isolated microspore cultures of Chinese cabbage (Brassica campestris spp. pekinensis) / T. Sato, T. Nishio, M. Hirai // Plant Cell Reports. - 1989. - Vol. 8. - P. 486-488.

142. Seguí-Simarro, J.M. Androgenesis revisited / J.M. Seguí-Simarro // Bot Rev. -2010. - Vol. 76. - P. 377-404

143. Seguí-Simarro, J.M. Pathways to doubled haploidy: chromosome doubling during androgenesis / J.M. Seguí-Simarro, F. Nuez // Cytogenet Genome Res.

- 2008. - Vol. 120. - P. 358-369.

144. Sendra A.R. Calcium and cell wall dynamics during microspore embryogenesis and doubled haploid production in rapeseed and eggplant : Thesis ... Doctor in Biotechnology / A.R. Sendra. - Valencia, 2017. - P. 235.

145. Serpe, M.D. Effects of Yariv phenylglycosides on Rosa cell suspensions: evidence for the improvement of arabinogalactan-proteins in cell proliferation. / M.D. Serpe, E.A. Nothnagel // Planta. - 1994. - Vol. 193. - P. 542-550.

146. Shariatpanahi, M.E. Stresses applied for the re-programming of plant microspores towards in vitro embryogenesis. / M.E. Shariatpanahi, U. Bal, E. Heberle-Bors, A. Touraev // Physiol Plant. - 2006. - Vol. 127. - P. 519-534.

147. Shim, Y.S. The relationship between induction of embryogenesis and chromosome doubling in microspore cultures / Y.S. Shim [et al.] // Protoplasma. - 2006. - Vol. 228. - P. 79-86.

148. Showalter, A.M. Arabinogalactan-proteins: structure, expression, and function / A.M. Showalter // Cell Mol Life Sci. - 2001. - Vol. 58. - P. 1399-1417.

149. Siebel, J. A comparison of anther and microspore culture as a breeding tool in Brassica napus / J. Siebel, K.P. Pauls // Theor. Appl. Genet. - 1989. - Vol. 78.

- P. 473-479.

150. Smykalova, I. Efficiency of microspore culture for doubled haploid production in the breeding project "czech winter rape" / I. Smykalova [et al.] / Genet. Plant Breed. - 2006. - P. 58-71.

151. Stipic, M. An improved protocol for androgenesis in cauliflowers (Brassica oleracea var. botrytis) / M. Stipic, B. Campion // Plant Breeding. - 1997. -Vol. 116. - P. 153-157.

152. Stringam, G.R. Effectiveness of selection for early flowering in f-2 populations of Brassica napus l. - a comparison of doubled haploid & single seed descent methods / G.R. Stringam, M.R. Thiagarajah // 8th IRC Saskatoon CN. - 1991. - Vol. 1 - P. 70-75.

153. Swanson, E.B. Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos from Brassica napus / E. B. Swanson [et al.] // Plant Cell Reports. - 1987. - Vol. 6. - P. 94-97.

154. Takahata, A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L / A. Takahata, W.A. Keller // Plant Science. - 1991. - Vol. 74. - P. 235-242.

155. Takahata, Y. Utilization of microspore-derived embryos / Y. Takahata, K. Fukuoka, K. Wakui. In : C.F.Palmer, W.A. Keller and K.J. Kasha (Eds.) // Biotechnology in Agriculture and Forestry Haploid in Crop Improvement 11. Springer-Verlag, Berlin I leidelberk. - 2005. - Vol. 56. - P. 153-169.

156. Tang, X.C. The role of arabinogalactan proteins binding to Yariv reagents in the initiation, cell developmental fate, and maintenance of microspore embryogenesis in Brassica napus L. cv. Topas./ X.C. Tang [et al.]// J. Exp. Bot. - 2006. - Vol. 57. - №11. - P. 2639-2650.

157. Telmer, C.A. Microspore development in Brassica napus and the effect of high temperature on division in vivo and in vitro / C.A. Telmer, W. Newcom, D.H. Simmonds // Protoplasma. - 1993. - Vol. 172. - P. 154-165.

158. Telmer, C.A., Cellular changes during heat shock induction and embryo and embryo development of cultured microspores of Brassica napus cv. Topas /

C.A. Telmer, W. Newcomb, D.H. Simmonds // Protoplasma. - 1995. -Vol. 185. - P. 106-112.

159. Thomas, E. Embryogenesis from microspores of Brassica napus. / E. Thomas, G. Wenzel. - Z. Pflanzenzuecht, 1975. - P. 77-81.

160. Thomas, W.T.B. Doubled haploids in breeding. / W.T.B.Thomas, B. Gertson,

B.P. Forster, In: M. Maluszynski, K.J. Kasha, B.P. Forster, I. Szarejko (Eds.) // Doubled Haploid Production in Crop Plants: A Manual. Kluwer Academic Publ. - Dordrecht, the Netherlands, 2003. - P. 337-350.

161. Thompson, K.F. Oil-seed rape. In reports of the Plant Breeding Institute, Cambridge / K.F Thompson // Cambridge University Press, 1972. - P. 94-96.

162. Thurling, N. The influence of donor plant genotype and environment on production of multicellular microspores in cultured anthers of Brassica napus ssp. Oleifera / N. Thurling, P.M. Chay // Ann. Bot. - 1984. - Vol. 54. - P. 681695.

163. Tian, H. High frequency conversion of microspore-derived embryos of Brassica napus cv. Topas by supplemental calcium and vitamins / H. Tian,

C.H.Yaoy, M.X.Sun // Plant Cell Tissue and Organ Culture. - 2004. - Vol. 76. - P. 159-165.

164. Touraev, A. Efficient microspore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum L.) induced by starvation at high temperatures / A. Touraev [et al.] // Sex Plant Reprod. - 1996. - Vol. 9. - P. 209-215.

165. Tuncera, B. Effect of heat shock treatment on microspore embryogenesis in Brassica oleracea species / B. Tuncera, A. Qigb, R.Yanmazc, F.Ya§ara // Tanm Bilimleri Dergisi - Journal of Agricultural Sciences. - 2016. - № 22. -P. 548-554.

166. Varnier, A.L. Programmed cell death and microspore embryogenesis / A.L. Varnier, C. Jacquard, C. Clement, In: A. Touraev, B.P. Forster, S.M. Jain (Eds.) // Advances in Haploid Production in Higher Plants. Springer. -Dordrecht, the Netherlands, 2009. - P. 147-154.

167. Wallace, D.H. Interaction of S-alleles in sporophytically controlled selfincompatibility of Brassica / D.H. Wallace // Theoret. Appl. Genet. - 1979. - Vol. 54. - № 5. - P. 193-201.

168. Wang, H.Z. Studies on microspore culture of hybrid parents in Brassica napus. / H.Z. Wang [et al.] // Proc. 4th Int. Crop Sci. Congr. - Brisbane, Australia, 2004. - P. 1-6.

169. Wang, T.T. Initiation and development of microspore embryogenesis in recalcitrant purple flowering stalk (Brassica campestris ssp. Chinensis var. purpurea Hort) genotypes. / T.T. Wang, H.X. Li, J. Zhang, B. Ouyang, Y. Lu, Z. Ye // Sci Hort. - 2009. - Vol. 121. - №4. - P. 419-424.

170. Weber, S. Improved doubled haploid production protocol for Brassica napus using microspore colchicines treatment in vitro and ploidy determination by flowcytometry / S. Weber, W. Ünker, W. Friedt // Plant Breeding. - 2005. -Vol. 124. - P. 511-513.

171. Wedzony, M. Progress in doubled haploid technology in higher plants. / M. Wedzony [et al.], In: A. Touraev, B.P. Forster, S.M. Jain (eds.) // Advances in haploid production in higher plants. Springer. - Dordrecht, Netherlands, 2009. - P. 1-33.

172. Winarto, B. Microspore culture protocol for Indonesian Brassica oleracea // B. Winarto, J.A. Teixeira da Silva // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 2011. -Vol. 107. - P. 305-315. - D01:10.1007/s11240-011-9981-z

173. Xu, L. Haploid and doubled haploid technology / L. Xu [et al.], In: S.K. Gupta (eds.) //Advances in botanical research : rapeseed breeding. - Elsevier, California, 2007. - P. 181-216.

174. Yuan, S. Chromosome doubling of microspore-derived plants from cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) and broccoli (Brassica oleracea var. italica L.) / S. Yuan [et al.] // Front. Plant Sci. - 2015. - Vol. 6. - P. 1118. -Doi : 10.3389/fpls.2015.01118.

175. Yuan, S. Plant regeneration from microspore-derived embryos in cabbage (Brassica oleracea var. capitata) and broccoli (Brassica oleracea var. italica) / S. Yuan [et al.] // Chin. Bull. Bot. - 2010. - Vol. 45. - P. 226-232.

176. Yuan, S.X. Effects of pH, MES, arabinogalactan-proteins on microspore cultures in white cabbage / S.X. Yuan [et al.] //Plant Cell Tiss. Org. Cult. -2012. - Vol. 110. - P. 69-76. - D01:10.1007/s 11240-012-0131-z

177. Zeng, A.S. Effect of ascorbic acid and embryogenic microspore selection on embryogenesis in white cabbage (Brassica oleracea L. Var. capitata). / A.S. Zeng [et al.] // Jorunal of Horticultural Science & Biotechnology. -2015a. - Vol. 90. - P. 607-612.

178. Zeng, A.S. Microspore embryogenesis and plant regeneration in Brussels sprouts (Brassica oleracea L. var. gemmifera) / A.S. Zeng [et al.] // Scientia Horticulturae. - 2015b. - Vol. 191. - P. 31-37.

179. Zeng, L. Reduced ascorbate and reduced glutathione improve embryogenesis in broccoli microspore culture / L. Zeng, Y. Song, J. Cui // Yan South African Journal of Botany. - 2017. - Vol. 109. - P. 275-280.

180. Zhang, F.L. Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops / F.L. Zhang, Y. Takahata // Theor Appl Genet. - 2001. - Vol. 103. - P. 254-258

181. Zhang, G.Q. Plant development from microspore derived embryos in oilseed rape as affected by chilling, desiccation and cotyledon excision / G.Q. Zhang [et al.] // Biol Plant. - 2006. - Vol. 50. - P. 180-186.

182. Zhang, W. The culture of isolated microspores of ornamental kale (Brassica oleracea var. acephala) and the importance of genotype to embryo regeneration / W. Zhang [et al.] // Sci. Hortic. - 2008. - Vol. 117. - P. 69-72. -D0I:10.1016/j.scienta.2008.03.023

183. Zur, I. Stress-related variation in antioxidative enzymes activity and cell metabolism efficiency associated with embryogenesis induction in isolated microspore culture of Triticale (*Triticosecale Wittm.) / I. Zur [et al.] // Plant Cell Reports. - 2009. - Vol. 28. - P. 1279-1287.

Приложения Приложение А

Состав базовых питательных сред

Компоненты среды В5 (ОашЬог§ 0.Ь. е! а1, 1968) ЖК (ЫсМег К, 1982)

Макроэлементы

КК03 2500 125

СаС12*2Н20 150 -

Са(К0з)2*4Н20 - 500

КН2Р04 - 125

МвБ04 *7Н20 250 125

КС1 300 -

КаН2Р04 *Н20 150 -

№4)2804 134 -

Микроэлементы

МпБ04*4Н20 10,0 25

7пБ04* 7Н20 2,0 10

Н3ВО3 3,0 10

К1 2,5 -

Ка2Мо04*2Н2О 0,3 0,25

СоС12 *6Н20 0,025 0,025

СиБ04 *5Н20 0,025 0,025

Источник железа

Бе804 *7Н20 30,0 -

Ка2ЕВТЛ *2Н20 36,0 -

КаРе(Ш)БВТЛ - 40

Органические вещества

ТЫашт*НС1 10,0 0,5

01усте - 2,0

Мсойтсашё 1,0 5,0

Рупёохте*НС1 1,0 0,5

БоНс аБ1ё - 0,5

Бю1т - 0,05

Муо-1пов11:о1 100 100

Ь-Беппе - 100

Ь-ОЫаште - 800

ОШайоп - 30

Приложение Б

Результаты дисперсионного анализа влияния генотипа на частоту эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор, 2014-2018 гг.

Таблица Б.1 - Результаты дисперсионного анализа распределения по группам отзывчивости генотипов капусты белокочанной при введении в культуру изолированных микроспор в период 2014-2018 гг.

Источник вариации SS df MS F P-Значение F критическое

год 538,3 4 134,58 5,50 0,009 3,26

Группа генотипа 802,8 3 267,60 10,938 0,00095 3,49

Погрешность 293,7 12 24,48

Итого 1634,8 19

Таблица Б.2 - Результаты дисперсионного анализа распределения по группам отзывчивости и степени гетерозиготности генотипов капусты белокочанной при введении в культуру изолированных микроспор

Источник вариации SS df MS F P- Значение F критическое

Группа отзывчивости к эмбриогенезу 991,5 3 330,5 1,82 0,213 3,86

Группа генотипа по степени 4053 3 1351 7,44 0,008 3,86

гетерозиготности

Погрешность 1633,5 9 181,5

Итого 6678 15

Таблица Б.3 - Результаты дисперсионного анализа влияния года и генотипа линии УГ на частоту эмбриогенеза в культуре микроспор_

Источник вариации SS MS F P- Значение F критическое

генотип 218058 2 109029 1,53 0,32 6,94

год 1472000 2 736000,2 10,34 0,03 6,94

Погрешность 284709,1 4 71177,28

Итого 1974767 8

Приложение В

Результаты эксперимента по влиянию рН среды на частоту эмбриогенеза в

культуре изолированных микроспор

Таблица В.1 - Данные эксперимента по влиянию рН среды на частоту эмбриогенеза в культуре микроспор в 2014/2017 гг.

год генотип Число эмбриоидов шт. /ч. Петри

рН 5,8 рН 6,1 рН 6,4

2017 На1Ки1 58 53 20 72 62 72 - 90 90 80

2017 F1 Магнус 1 1 6 9 14 1 - 19 10 0

2017 F1Пандиан 0 0 2 2 3 4 - 1 0 0

2017 Мег2ф3 0 0 0 0 0 0 - 0 0 0

2017 Вб4ф2 0 0 0 0 0 0 - 0 0 0

2017 F1 Чамп 4 4 0 8 0 0 - 3 4 0

2014 F1 Green Hourmant 1 4 0 11 44 28 - 21 20

2014 F1 Агрессор 1 0 0 3 5 2 2 3 4 5

2014 F1 Тиара 1 0 0 6 0 0 0 12 3 0

2014 Ак3хБю1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2

Таблица В.2 - Результаты анализа ТТЕСТ на уровне значимости Р=0.05 к эксперименту по подбору уровня рН среды для различных генотипов

год Генотип рН 5,8-рН 6,1 рН5,8-рН6,4 рН6,1-рН6,4

2016 На1Ки1 0,11 0,03 0,02

2016 F1 Магнус 0,27 0,29 0,81

2016 F1 Пандиан 0,06 0,68 0,02

2016 Мег2ф3 - - -

2016 Вб4ф2 - - -

2016 F1 Чамп 1 0,86 0,91

2014 F1 Green Hourmant 0,05 0,001 0,53

2014 F1 Агрессор 0,03 0,029 0,35

2014 F1 Тиара 0,54 0,54 0,36

2014 Ак3хБю1 - - 0,005

Приложение Г

Значения рН среды во время культивирования микроспор генотипов Мег2ф2, Магнус

Генотип Б1 Магнус Б1 Мег2ф3

Исходный уровень рН Дни культивирования Дни культивирования

2 7 14 21 27 35 2 7 14 21 27

рН 5,8 5,75 5,65 5,42 5,63 5,83 5,99 5,69 5,86 5,50 5,78 5,91

рН 6,1 5,95 5,89 5,71 5,95 5,44 5,61 6,06 5,64 5,61 5,67 5,90

рН 6,4 6,27 6,22 6,01 6,15 5,85 5,99 6,27 6,25 6,10 6,26 6,35

Приложение Д

Влияние добавок MES и гуммиарабик на частоту эмбриогенеза белокочанной капусты

Таблица Д.1 Число сформировавшихся эмбриоидов в повторностях при оценке влияния MES и гуммиарабик на частоту эмбриогенеза капусты белокочанной в среде NLN-13 рН 6,0, шт./ч.Петри

генотип варианты эксперимента

Без добавок 3 цМ MES 10 мг/л гуммиарабик 3 mM MES + 10 мг/л гуммиарабик

Ewэ хЭт4/хЭт4г1 9 4 14 49 11 2 20 110 58 81 4 59

Мег2хЦр2/1хЦр2/2 1 1 0 0 0 0 2 1 0 0 1 1

ЦР1 gг1х/EwэхМЛ7/61 9 8 1 6 10 5 14 23 10 5 14 9

Сю2г 49 50 53 0 26 19 42 42 0 0 0 7

Фрг28 3 0 23 6 0 5 30 24 37 40 21 18

Этг4 5 0 0 2 5 8 16 26 13 13 7 4

Эт3хФРГ28 10 14 8 14 5 11 13 24 26 7 12 12

Таблица Д.2 - Результаты анализа ТТЕСТ на уровне значимости P=0.05 к эксперименту по влиянию добавок MES и гуммиарабик на частоту эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор капусты белокочанной

Генотип Контроль - MES Контроль -гуммиарабик Контроль - MES +гуммиарабик MES -гуммиарабик MES - MES + гуммиарабик Гуммиарабик -MES + гуммиарабик

Ewa хЭт4/хЭт4г1 0,47 0,11 0,17 0,23 0,37 0,69

Мег2хЦр2/1хЦр2/2 0,12 0,64 1,00 0,16 0,12 0,64

ЦР^г1х^эхМЛ7/61 0,75 0,10 0,41 0,10 0,48 0,24

Сю2г 0,01 0,18 0,0001 0,46 0,19 0,14

Фрг28 0,54 0,0562 0,15 0,0031 0,03 0,64

Этг4 0,24 0,02 0,11 0,04 0,40 0,09

Эт3хФРГ28 0,84 0,08 0,90 0,09 0,92 0,07

Приложение Е

Влияние концентрации нутриентов в питательной среде на частоту эмбриогенеза в культуре

изолированных микроспор

Таблица Е.1 - Число сформировавшихся эмбриоидов в повторностях при оценке влияния разбавления питательной среды КЪК-13 на эмбриогенез в культуре микроспор, шт./ч. Петри

Генотип Варианты эксперимента

/ NLN Уз NLN У NLN

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

На1гки5 51 37 23 29 50 51 26 18 23 21 10 9

F1 Чамп 4 7 12 5 2 0 3 2 3 5 2 0

Цр1хСа1хШ5 3 5 7 7 7 8 8 13 13 5 3 5

Цр1хПа1хШ15 1 1 0 4 2 2 7 5 5 0 3 3

МЛЭwexфу4)БФIxМЩ)2 0 0 1 4 3 5 5 5 5 3 4 2

Мл7 хфу4/ хМЦ1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

N3БЮF/xЦрI/2/16 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

МФу4/1х/БФ1хМц1 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0

Цр1хАмс2/1м 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0

Цр1хАн1ф2-1 /м1 0 0 0 0 0 0 3 0 0 3 5 4

Таблица Е.2 - Результаты анализа ТТЕСТ на уровне значимости Р=0.05 к эксперименту по изучению влияния концентрации нутриентов в питательной среде на эмбриогенез в культуре микроспор

генотип Варианты эксперимента

МЬК-1/2КЬК КЬК-1/3МЬК КЬК-1/4МЬК 1/2КЬК-1/3МЬК 1/2КЬК-1/4МЬК 1/3КЬК-1/4МЬК

На1гки5 0,59 0,16 0,06 0,05 0,021 0,12

F1 Чамп 0,13 0,10 0,12 0,83 1,00 0,83

Цр1хСа1хШ5 0,13 0,04 0,64 0,08 0,02 0,02

Цр1хПа1хШ15 0,06 0,003 0,27 0,03 0,61 0,04

МЛЭwexфу4)БФIxМЩ)2 0,005 0,0002 0,02 0,16 0,29 0,03

Мл7хфу4/хМЦ1 - - - - - -

N3БЮF/xЦрI/2/16 0,37 0,37 0,3 - - -

МФу4/1 х/БФ1х Мц1 0,37 - - 0,37 0,37 -

Цр1хАмс2/1м - 0,37 - 0,37 - 0,37

Цр1хАн1ф2-1 /м1 - 0,37 0,002 0,37 0,002 0,06

Приложение Ж

Число сформировавшихся эмбриоидов в повторностях при оценке влияния концентрации макроэлементов в питательной среде КЪК-13 на эмбриогенез в культуре изолированных микроспор, шт./ч. Петри

Варианты питательных сред генотип

НанхНц21 За 4

1 2 3 4 1 2 3 4

КЪК-13 с полной концентрацией макросолей 16 27 20 32 0 0 0 0

КЪК-13 с половинной концентрацией макросолей 55 53 40 20 0 0 0 0

Результаты анализа ТТЕСТ на уровне значимости Р=0.05 при сравнении полной и половинной концентрации макросолей во время культивирования микроспор генотипа НанхНц21 = 0,08

Приложение И

Влияние различных видов инициирующего стресса на частоту эмбриогенеза

Таблица И.1 - Число сформировавшихся эмбриоидов в повторностях при оценке уровня рН и теплового шока на частоту эмбриогенеза, шт./мл

Генотип Варианты эксперимента

Контроль рН 5,8, г=32,5±0,1 °С рН 8,0, г=32,5±0,1 °С рН 8,0, г=28±1 °С

Плг0Ки1-13 6,0 13,0 8,6 - - 14,0 21 27,3 - - 9,2 12,2 14,6 - - -

Сю2х(Дт46хс 110)1 0,0 0,0 0,0 0 - 0,5 1,5 0,0 - - 0,0 0,0 0,0 - - -

Плг0Ки1-15 4,0 3,0 3,0 - - 5,0 4,5 4,0 - - 0,8 0,2 0,2 - - -

Плг0Ки1-18 1,1 1,4 0,3 1,1 - 1,2 6,0 3,4 6,2 - 0,5 2,3 2,0 - - -

Фрг47 3,0 0,0 0,0 - - 15,5 15,0 0,0 - - 0,0 0,0 0,0 - - -

Плг0Ки1-15 0,3 0,0 0,0 0,0 - 0,5 0,5 2,8 1,0 - 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 -

См8Ки1хсм8/2 2, 7 1,7 1,3 - - 1,0 2,3 0,0 - - 0,2 0,0 0,0 0,0 - -

Плг0 1,3 0,5 1,3 1,3 0,5 4,0 6,3 8,3 0,0 - 0,5 0,8 0,5 1,3 0,3 0,5

Плг0Ки2-4 0,3 1,7 0, 7 0,3 - 3,5 2,5 3,5 - - 0,3 0,0 0,0 0,0 - -

Гэс2рх15цка1-1)1 0,3 0,3 1,0 0,0 - 2,3 1,0 0,0 0,0 - 0,0 0,0 0,0 0,0 - -

Гэс2рх15-5)3 0,7 2,0 0,3 0,0 - 1,8 4,8 15,8 16,5 - 0,4 0,4 0,4 0,4 - -

Атп1х(С110КихСю2)13 14,9 23,1 25,1 - - 12,3 23,5 35,0 30,5 - 7,0 10,0 9,0 0,0 - -

(ЦСа1-1хса1)1 0,3 0,0 0,0 - - 1,0 0,3 10,5 - - 0,0 0,0 0,0 - - -

Гэс2рх15-5)2 2,3 1,7 1,0 1,0 - 3,5 3,0 2,3 10,5 - 0,3 0,3 0,0 - - -

Атп1х(С110КихСю2)14 1,0 0,0 0,0 0,0 - 3,3 5,3 5,7 5,0 - 0,3 0,0 0,0 0,0 - -

Мф43х15)22 0,0 0,0 0,0 0,0 - 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Таблица И.2 - Результаты анализа ТТЕСТ на уровне значимости Р=0.05 к эксперименту по изучению влияния высокого рН среды и температуры на индукцию эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор капусты белокочанной

Генотип 1-2 1-3 2-3

Плг0Ки1-13 0,03 0,17 0,05

Сю2х(Дт46хс110)1 0,06 - 0,10

Плг0Ки1-15 0,03 0,00 0,00

Плг0Ки1-18 0,02 0,17 0,07

Фрг47 0,08 0,19 0,06

См8Ки1хсм8/2 0,19 0,00 0,06

Плг0 0,03 0,09 0,01

Плг0Ки2-4 0,00 0,04 0,00

Гэс2рх15цка1-1)1 0,25 0,05 0,09

Гэс2рх15-5)3 0,03 0,23 0,02

Атп1х(С110КихСю2)13 0,27 0,01 0,01

(ЦСа1-1хса1)1 0,15 0,19 0,15

Гэс2рх15-5)2 0,07 0,01 0,05

Атп1х(С110КихСю2)14 0,00 0,28 0,00

Мф43х15)22 - 0,22 0,19

Примечание: 1. культивирование рН среды N№N-13 5,8, тепловой шок 32,5±0,1 °С в течение 48 ч. (контроль); 2. культивирование на среде №N-13 с рН 8,0 и инкубирование в термошкафу при 32,5±0,1 °С в течение 48 ч.; 3. культивирование на среде №N-13 с рН 8,0 при 28±1 °С в течение 48 ч.

Приложение К

Данные учета степени самонесовместимости (семян/стручок) в 2014 у растений-регенерантов (Я0), в 2016, 2017 гг. у линий УГ (Я2, Я3)

Название линии 2014 2016 2017 Степень самонесовместимости

Наг0 0,0 с 0,0 СС

Наг2 0,0 с 0,0 СС

Наг4 0,0 ф 1,7 СС-Ср

Наг1 0,3 с 0,0 СС

Плг0 0,0 с 0,2 СС

Плг3 1,0 с 0,3 СС

Плг1 0,0 с 0,0 СС

Плг8 0,0 с 0,0 СС

Плг9 0,1 с 0,0 СС

Сюг0 0,0 с 0,1 СС

Сюг1 0,0 с 0,0 СС

Сюг13 0,0 с 0,6 СС