Усовершенствование элементов технологии получения растений - регенерантов моркови столовой (Daucus carota L.) в культуре пыльников и микроспор тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат наук Демидкина, Марина Александровна

• Демидкина, Марина Александровна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Демидкина, Марина Александровна

СОДЕРЖАНИЕ

стр

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гаплоидия

1.2. Факторы, влияющие на продуктивность андрогенеза

1.2.1. Генотип

1.2.2. Физиологические факторы

1.2.3. Химические факторы

1.3. Характеристика удвоенных гаплоидов

1.3.1. Способы удвоения гаплоидов

1.4. Ботанические и биологические особенности Истсш саго1а Ь

1.4.1. Эмбриологические и кариологические особенности

1.4.2. Строение пыльника моркови

1.4.3. Развитие пыльника моркови ш у/уо

1.4.4. Микроспорогенез и микрогаметогенез у моркови

1.4.5. Типы микроспор и их способность к андрогенезу

1.5. Условия культивирования

1.5.1. Методы изолирования микроспор

ГЛАВА 2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛ,

МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТЫ

2.1. Цель, задачи исследований

2.2. Схема исследований

2.3 Почвенные и агрохимические условия проведения исследований

2.3.1 Погодные условия в период проведения исследования

2.4. Материалы и методики проведения исследований

2.4.1. Исходный материал

2.4.2. Методика проведения исследований

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Эффективность способов получения культуры микроспор

моркови столовой

3.1.1. Доращивание зонтичков в лабораторных условиях

3.1.2. Растрескиваемость пыльников в жидкой питательной среде в зависимости от концентрации сахарозы

3.1.3. Механическое выделение микроспор из пыльников в жидкой питательной среде

3.2. Влияние концентрации микроспор на эмбриогенез моркови столовой

3.3. Влияние температурной предобработки бутонов на эмбриогенез моркови в культуре микроспор

3.4. Влияние наночастиц серебра на эффективность эмбриогенеза моркови столовой

3.4.1. Влияние наночастиц серебра на донорные растения моркови столо-

вой

3.4.2. Влияние наночастиц серебра на индукцию эмбриогенеза моркови

столовой в культуре микроспор

3.5. Подбор питательных сред для культивирования микроспор моркови столовой

3.6. Влияние сахарозы на рост и развитие микроспор в двухслойной питательной среде при введении в культуру in vitro

3.7. Усовершенствование элементов методики культуры пыльников моркови столовой

3.7.1. Подбор оптимальных условий предобработки донорных растений

3.7.1.1. Влияние нитрата серебра на эффективность эмбриогенеза моркови столовой в культуре пыльников

3.7.1.2. Влияние обработки донорных растений различными веществами на индукцию эмбриогенеза моркови в культуре пыльников

3.7.1.3. Влияние обработки донорных растений препаратами Энергия -Ми Циркон на начало каллусогенеза моркови в культуре пыльников

3.7.2. Влияние нитрата серебра на индукцию эмбриогенеза моркови столовой в культуре бутонов и пыльников

3.7.2.1. Влияние нитрата серебра на индукцию эмбриогенеза моркови в культуре бутонов

3.7.2.2. Влияние нитрата серебра на индукцию эмбриогенеза моркови в культуре пыльников

3.8 Получение растений-регенерантов моркови столовой

3.8.1. Регенерация растений - регенерантов моркови столовой из каллуса

3.8.2. Укоренение побегов моркови, полученных в культуре пыльников

3.8.3. Адаптация растений - регенерантов моркови

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ МОРКОВИ

СТОЛОВОЙ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ

4.1. Идентификация гаплоидов моркови

4.2. Характеристика растений - регенерантов Ro

4.2.1. Характеристика растений - регенерантов R]

ГЛАВА 5. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ - РЕГНЕРАНТОВ МОРКОВИ СТОЛОВОЙ В КУЛЬТУРЕ

ПЫЛЬНИКОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Сокращенное название

ГНУВНИИО Россельхозакадемии

МС

МСм

МСп 2,4-Д

нч кин

а-НУК ДМСО

Полное название

Государственное научное учреждение Всероссийский научно - исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии

питательная среда Мурасиге - Скуга (Мига1^е Т., 8коо§ Б., 1962)

питательная модифицированная среда (МаБиёа К., КлкигаУ., 1981)

питательная среда (РоНакоу А.У., 2001) 2,4 - дихлорфеноксиуксусная кислота наночастицы кинетин

а - нафтилуксусная кислота диметилсульфоксид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Усовершенствование элементов технологии получения растений - регенерантов моркови столовой (Daucus carota L.) в культуре пыльников и микроспор»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Впервые о моркови упоминалось в Вавилонии (нынешний Ирак) в X в. до н. э., а также в литературных источниках Древней Греции. Морковь стала известна человеку более 4 тыс. лёт назад, о чем свидетельствуют исследования археологов в различных странах. Так, в Швейцарии (г. Берн), в окаменелостях над свайными постройками древности найдены ее остатки. Раскопки Помпеи, Геркуланума и Стабии, погребенных под лавой извергнувшегося Везувия в 79 году н. э., показали, что на стенах древних домов изображены пучки моркови (Николайчук JI.B, Жигар М.П., 1993). При изучении ареалов её распространения в Афганистане было выявлено большое разнообразие моркови, которая по своим признакам отличалась от европейских сортов. В связи с этим был сделан вывод о двух центрах происхождения культурной моркови: Средиземноморском и Юго -западно - азиатском (Сазонова JI.B., Власова Э.А., 1990). ;

Современная культурная морковь Daucus carota L. возникла в результате скрещивания дикой формы ssp. carota с распространенной в средиземно-морско-переднеазиатских областях формой ssp. maxima. Возможно, это произошло в результате нескольких мутаций: от красно-фиолетовой формы к желтой, белой и, затем, к оранжевой. Красно-фиолетовая форма моркови распространилась из Азии в Средиземноморье, где развились мутанты с желтой окраской корнеплода. В XIV-XV вв. обе формы проникли в среднюю Европу, где прежде всего была распространена форма с желтой окраской корнеплода. Из нее в XVII в. мутировала форма с белой окраской корнеплода. Желтую и белую формы возделывали в Европе до начала XX в. и известны как конская морковь. Предположительно, в Нидерландах из формы с белым корнеплодом возникла форма с оранжевым корнеплодом, которая распространилась по всей Европе. Исходные формы многих культивируемых до настоящего времени сортов возделывались уже в XIX в., сорта с высоким содержанием каротина были выделены только в последние десятилетия XX в. (Круг Г., 2000).

Корнеплоды моркови обладают высокой питательной и диетической ценностью, особой из которой является содержание каротина (провитамина А). В оранжево-красных корнеплодах каротина не менее 15-17 мг%, а при благоприятных условиях роста и развития растений - до 20-27 мг°/о (в последнее время созданы высококаротиновые сорта, в которых содержание каротина достигает 37 мг%). Морковь богата сахарами, количество которых в лучших

1

сортах достигает 12%, содержит клетчатку (1,7%), крахмал (от 1,5 до 6,6% в сухом веществе), азотистые вещества представлены белками (до 6,7% сухого вещества), аминокислотами (5,5%), амидами. В корнеплодах обнаружены ала-нин, аспарагин, глютамин, глицин, лизин, серин, валин и другие ценные аминокислоты, много калия, имеются натрий, кальций, фосфор, железо, алюминий, бор, бром, йод, марганец, молибден, олово, цинк, все витамины группы В (тиамин (витамин В]), рибофлавин (витамин В2), пантотеновая1 кислота (витамин В5), теридоксин (витамин Вб), фолиевая кислота (В9)), инозит, витамин С, никотиновая кислота (витамин РР), биотин (витамин Н), флавоноиды (витамин Р), токоферолы (Е). Листья, семена и корнеплоды моркови содержат эфирное масло. Энергетическая ценность 100 г моркови 33 ккал, или 138 кДж (Пивоваров В.Ф., 2006).

Морковь нашла свое применение и в медицине. Ее используют для профилактики и лечения авитаминозов, малокровия, сердечнососудистой системы, гипертонии, печени, почек, для выделения из организма холестерина. Морковь - ценное косметическое средство (Литвинов С.С., Россошанский А.А., 1998).

На сегодняшний день селекция растений остается длительным и трудоемким процессом, основанным преимущественно на внутривидовой гибридизации с последующим многократным отбором, использовании. инфекционно-провокационных фонов для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды и зависимости от вида растения вегетативного или репродуктивного способов размножения. В настоящее время решение практических задач селекции во многом определяется эффективностью вовлечения современ-

ных биотехнологических методов, которые могут быть успешно использованы на всех этапах селекционного процесса, включая создание генетического разнообразия, получение генетически стабильных линий, идентификацию генотипов и их размножение (Поляков A.B., 2004). Морковь имеет довольно мелкие генеративные органы и на начало 80-х годов XX века ¡высказывалось скептическое мнение о возможности получения гаплоидов с использованием метода андрогенеза in vitro (Dudits D., 1981). На сегодняшний день существующие методы получения гаплоидов и удвоенных гаплоидбв моркови не получили достаточно широкого использования в селекционной практике и нуждаются в усовершенствовании. В связи с тем, что в последние годы в производстве особое внимание стали уделять технологиям, сортам и гибридам, приводящим к получению высокой выравненное™, товарности, урожайности, поэтому использование удвоенных гаплоидов в овощеводстве особенно актуально.

Роль гаплоидных растений в селекции велика. Применение их позволяет существенно повысить эффективность селекционного процесса в связи с тем, что гаплоиды ускоряют получение генетически стабильных линий и облегчают поиск редких признаков, контролируемых рецессивными генами (Поляков A.B., 2000).

В настоящее время разработаны методы получения гаплоидов и удвоенных гаплоидов моркови столовой в культуре изолированных пыльников (Тю-кавин Г.Б., 2000, 2007; Поляков A.B., Ильченко О.В., 2003); культуре семяпочек (Домблидес Е.А., 2000; Поляков A.B., Ильченко О.В., 2003; Тюкавин Г.Б., 2007); индуцированном апомиксисе (Тимин Н.И., 1994; Ильченко О.В., 2007). Эти методы остаются недостаточно эффективными для того, чтобы использовать в селекционном процессе и нуждаются в усовершенствовании.

Данная работа посвящена усовершенствованию технологии получения растений - регенерантов моркови столовой в культуре пыльников и микроспор для использования в селекционном процессе.

Объект исследований — технология получения растений-регенерантов

моркови столовой в культуре пыльников и микроспор.

Предмет исследований - зонтички, бутоны, пыльники и микроспоры, эм-бриоиды, растения-регенеранты моркови столовой (Daucus carota L.).

Научная новизна работы. Установлено, что предобработка донорных растений моркови столовой нитратом серебра в концентрации 60 мг/л позволяет ускорить начало каллусогенеза на 44-63 суток по сравнению с контролем, а также в зависимости от сорта получать 32-45% каллусогенных пыльников. Добавление нитрата серебра в концентрации 40 мг/л в агаризованную среду МСм в культуре пыльников позволяет получать в зависимости от сорта 7,4— 11,1% каллусогенных пыльников, по сравнению 0-5,9% в контроле.

Предобработка бутонов пониженными температурами (+4...+5 °С) при экспозиции 48 часов увеличивает образование эмбриоидов на 0,13-0,14% в культуре микроспор в зависимости от сорта.

В культуре микроспор моркови столовой использование сахарозы в комбинациях: агаризованная МСм среда, содержащая 30 г/л и жидкая среда - 30 г/л или агаризованная среда - 30 г/л и жидкая среда - 60 г/л на фоне 2,4-Д, используемом в концентрации 0,2 мг/л, позволяет получать 0,41-0,49% эмбриоидов в зависимости от сорта.

Практическая ценность исследований. Усовершенствованы элементы технологии, применение которых позволяют ускорить начало каллусогенеза на 44-63 суток, индуцировать ризогенез у 54,3-59,1% трудноукореняемых побегов моркови столовой, снизить себестоимость получнения 1 растения-регенеранта в культуре пыльников на 5,2%, затраты энергии - на 666,1 КДж.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическими планами НИР института и отдела биотехнологии ГНУ ВНИИО Россельхозакаде-мии в 2008-2013 гг. (задание 04.04.04.01), является законченной НИР, содержит решение актуальности вопроса (№ ГР 01201169874, инв. № 02201358777).

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследо-

ваниями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были представлены на 22-ой специализированной выставке - ярмарке «ФАЗЕНДА» (Москва, 2012; г.), Международной научно - практической конференции молодых учёных, посвящённой

125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова «Овощеводство будущего: новые знания и идеи» (Москва, 2012 г.), а также на заседаниях методической комиссии по селекции, семеноводству и биотехнологии ГНУ ВНИИО Россельхоза-кадемии (2009 - 2012 гг.).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• предобработка донорных растений моркови столовой нитратом серебра в концентрации 60 мг/л ускоряет начало каллусогенеза на 44-63 суток в культуре пыльников;

• добавление в питательную среду МС нитрата серебра в концентрации 40 мг/л индуцирует каллусогенез у 7,4-11,1% пыльников у моркови столовой;

• использование жидкой питательной среды МС с концентрацией питательных элементов 75% и НУК-0,1 мг/л индуцирует ризогенез у 54,3-59,1% побегов с зачатком корнеплода;

• предобработка бутонов моркови столовой пониженными температурами (+4...+5 °С) в течении 48 ч увеличивает образование эмбриоидов на 0,130,14% в культуре микроспор в зависимости от сорта;

• эффективность образования эмбриоидов при механическом выделение микроспор 0,15-0,24%;

• добавление в агаризованную среду МСм сахарозы в концентрации 30 г/л и жидкую среду -30 г/л или агаризованную среду- 30 г/л и жидкую среду- 60 г/л, позволяет получать 0,41-0,49% эмбриоидов в культуре микроспор;

• концентрация микроспор 50000 шт./1 мл питательной среды позволяет получать эмбриоиды моркови столовой с частотой 0,12-0,35%.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.

«

Структура и объем работы

]

Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, заключения, предложений для использования в селекционной практике, списка литературы, содержащего 189 наименований, в том числе 105 иностранных авторов, ресурсы интернет. Она изложена на 169 страницах компьютерного текста, содержит 31 таблицы, 17 приложений и иллюстрирована 18 рисунками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Гаплоидия

Гаплоидия - одно из важнейших прикладных направлений генетики и селекции. Путем удвоения числа хромосом у гаплоидов можно создать гомозиготные линии, на выделение которых при селекции на гетерозис у перекрёстноопыляющихся культур приходится затрачивать до 7-10 лет (однолетние растения) и/или 14-20 лет (двулетние растения) (Поляков A.B., 2000).

История гаплоидии высших растений насчитывает более 90 лет, когда впервые было выявлено и цитологически определено гаплоидное растение у Daruta stramonium (Chase S.S., 1949). Первые экспериментальные гаплоиды

были получены в результате отдалённой гибридизации у Nicotiana tabacum

1

(Clausen R.E., Mann M.C., 1924), Nicotiana langsdorffii (Kostoff D., 1929). К настоящему времени гаплоиды получены более чем у 200 видов (включая гибридные формы) и число их растёт, в основном, за счёт получаемых в культуре in vitro (Тырнов B.C., 1998). Гаплоиды могут различаться по своим генетическим и цитологическим особенностям. В настоящее время гаплоиды разделяют на следующие основные типы:

1. Матроклинные - развившиеся из клеток женской половой сферы (зародышевого мешка) и имеющие ядро и цитоплазму от одной особи.

2. Андрогенные - развивающиеся из клеток мужской половой сферы, у которых собственные хромосомы замещены хромосомами спермия, имеющие цитоплазму от одной особи, а ядро от другой.

3. Андроклинные - развивающиеся из пыльцевых зерен. Этот тип получают в культуре пыльников или изолированных микроспор, в настоящее время чаще всего определяют как «андрогенез in vitro» (Тырнов B.C., 1998).

Андрогенез описан у более 170 видов растений, принадлежащих почти к 60 родам и 26 семействам покрытосеменных (Ницше В., Венцель Г., 1980; Ни & Zend, 1984; Vasil I.K., 1990; Поляков A.B., 2000). Известно, что метод гап-лоидии позволяет преодолеть ряд селекционных трудностей.

Во - первых, поскольку гаплоиды имеют лишь один набор хромосом, то проявление и обнаружение рецессивных генов значительно упрощается. Гаплоидные растения стерильны, но при обработке их колхицином или другими веществами, вызывающими удвоение числа хромосом, образуются полноценные семена, способные дать начало диплоидным фертильным растениям с двумя наборами идентичных хромосом. На основе гаплоидов гомозиготные линии могут быть получены за 2-3 года (Дворядкина А.Г., 1972).

Во - вторых, получение стабильных гомозиготных линий из популяции облегчает поиск редких генотипов, что в 2-3 раза может ускорить селекционный процесс, а также помогает выяснить вопросы неаллельной комплементации (Lazar M.D., Baenzinger P.S., Schaeffer G.W., 1984).

В - третьих, использование удвоенных гаплоидных линий позволяет более эффективно проводить отбор желательных генотипов из сравнительно небольших популяций по сравнению с традиционной технологией выделения самоопыленных генотипов (Choo Т.М., 1981).

В - четвертых, их можно успешно использовать в мутационной селекции, так как у гаплоидов отсутствует явление доминантности; для передачи генов от полиплоидных видов диплоидным, при решении теоретических вопросов, связанных с происхождением видов, созданием серий моносомиков (Ницше В., Венцель Г., 1980).

Таким образом, гаплоидная технология является существенно ускоряющим эффективным средством селекции новых сортов за относительно короткое время, позволяющая, по данным ряда исследователей, сократить селекционный процесс на 4 поколения (Choo Т.М. et al., 1985).

Использование изолированных микроспор для производства удвоенных гаплоидных линий могло бы быть альтернативным способом создания гомозиготных линий, однако, результативность этих экспериментов .остается недостаточна высокой, чтобы использовать в селекционных программах. Гаплоиды в настоящее время используются для создания новых, устойчивых к различным болезням, сортов риса (Chen V.H., 1986), пшеницы (Chuang С.С., et al,

1978), ячменя (De Lafonteyne J., 1993), рапса (Mollers , 1991), картофеля (Pretova А., 1993), табака (Nakamura et al., 1974) и других культур.

Для того, чтобы применение этого приема стало реальным, необходимо наличие технологии, обеспечивающей возможность получения гаплоидов в достаточно большом количестве от любого генотипа, включенного в селекцию, и чтобы получение гаплоидов не сопровождалось мутацирнным процессом (Поляков, 2000).

Наиболее перспективный подход к разработке технологии получения гаплоидов, отвечающий современным требованиям - это культивирование пыльников или пыльцы in vitro (Хотылева B.C., Ермишин А.П., Воронкова Е.В., 1988). Продуктивность андрогенеза in vitro зависит от многих взаимосвязанных факторов: генотипа, условий выращивания донорных растений, стадии развития микроспор, предобработки эксплантов, состава питательной среды, условий культивирования, путей формирования андрогенных структур, способов удвоения гаплоидов и т.д. (Тюкавин Г.Б., 2006).

1.2. Факторы, влияющие на продуктивность андрогенеза у растений

1.2.1. Генотип

На ранних этапах исследований по андрогенезу in vitro было отмечено, что одним из наиболее важных факторов, влияющих на успешную индукцию гаплоидов, является генотип растения. Различия по отзывчивости пыльников в культуре in vitro наблюдали у различных видов и сортов растений. Так, при культивировании in vitro пыльников 21 сорта пшеницы гаплоидный каллус был получен у 10 сортов. Зависимость морфогенетического потенциала пыльников от генотипа установлена у многих культур (Bajaj Y.P.S., 1983).

1.2.2. Физиологические факторы

Список физиологических факторов, которые могут затрагивать эмбрио-генную пыльцу в культуре микроспор/пыльников, обширен, и включает такие особенности, как условия роста растений-доноров; стадию развития микроспор, предшествующую культивированию в условиях in vitro; предобработку

пыльников; температуру инкубации; плотность посеянных микроспор; фотопериод (Шмыкова Н.А., 2006).

Условия выращивания растений - доноров. На выход андрогенных структур (каллус, эмбриоиды, проростки) оказывают влияние агроклиматические

1

условия (интенсивность света, длина фотопериода, температура), при которых выращиваются донорные растения (Приходько Н.И., 1989; Duriwell J.M., Sunderland N, 1973; Dieu P., Beckert M., 1986; Ouyang J.W. et al., 1983, 1987; Thurl-ing N., Chay P.M., 1984; Dunwell J.M., 1976, 1985), возраст растения, содержание минеральных элементов в почве (Sunderland N., 1971, 1978)?

Выявлено, что дополнительная подкормка растений является эффективным фактором увеличения частоты новообразований у льна в культуре пыльников (Поляков А.В., 2000).

В целом условия выращивания донорных растений оказывают значительное влияние на выход продуктов аномального развития микроспор и воспроизводимые результаты могут быть получены лишь при выращивании растений в контролируемых условиях окружающей среды. Однако для ряда культур, например, риса лучшие результаты получаются при отборе пыльников с донорных растений, выращенных в полевых условиях (Харченко П.Н., 1986).

Однако, для каждого вида, сорта или гибрида следует подбирать свои оптимальные режимы выращивания донорных растений (Атанасов А.И., 1993).

Предобработка бутонов, пыльников, микроспор. Предобработка бутонов влияет на культивируемые микроспоры, индуцируя андрогенез. Многие эксперименты показали, что в большинстве случаев специальная предобработка является необходимой для переключения нормальных микроспор/пыльцы с гаметофитного пути развития на спорофитный. В литературе описаны различные типы предобработок в зависимости от генотипов и типа исходного материала (Шмыкова Н.А., 2006).

Температурная обработка. При выборе режима тепловой обработки бутонов и пыльников определяют температурный диапазон и экспозицию. Обычно температурный стресс может эффективно применяться на предшествующей

стадии, в течение или сразу же в период первого гаплоидного митоза (Шмы-

{

кова H.A., 2006).

Выдерживание цветочных бутонов в условиях высоких или низких температур изменяет метаболические процессы в пыльцевых зернах и направление андрогенеза. Продолжительность температурной обработки зависит от вида растения (Атанасов А.И., 1993).

- Обработка пониженными температурами. Высокие результаты были достигнуты при обработке холодом пыльников после помещения их на среду для культивирования (Dunwell J.M., 1985). Предобработка пыльников при температуре 4 °С в течение 3-4 суток оказала стимулирующее действие на частоту образования каллусов у винограда (Cersosimo, 1986), яблони (Zhang Y.X et al., 1987), дурмана индейского (Nitsch J.P., 1969; Nitsch P., 1972). При культивировании пыльников ячменя в течение 28 суток при 4 °С или в течение 14 суток при 7°С получают оптимальные результаты (Калашникова Е.А., Кочиева Е.З., Миронова О.Ю., 2006).

Было установлено, что положительный эффект низкотемпературной обработки пыльников связан с более длительным поддержанием жизнеспособности их стенок и нормальных взаимосвязей с микроспорами (Fang Guo-wei, Liang Haimen, 1985).

Эффективность предобработки, позиции и диапазона температур зависит от генотипических особенностей растения-донора, поэтому! для ряда культур температурная обработка не всегда эффективна. Стимулирующий эффект предобработки пониженной температурой не был установлен при культивировании пыльников хлопчатника, сахарной, кормовой и диких видов свеклы, а так же пыльников цветной капусты (Рахимбаев И.Р., 1992). ;

- Обработка повышенными температурами. Положительное влияние на образование эмбриогенных структур наблюдали при предобработке исходного материала повышенными температурами. У пшеницы, проса и гороха тепловая обработка пыльников оказалась эффективной в термостате при +32...+33

°С в течение 5 суток непосредственно после инокуляции (Бояджиев П., 1986;

!

Бобков C.B., 2005), для брюссельской и цветной капусты при тепловой обра-

ботке 35 °С в течение 16 часов (Ockendon D.J, 1984; Phippen С., Ockendon D.J, 1990; Miiller D., Keller J., 1990).

- Обработка комбинированными температурами. В ряде случаев для получения эффекта используется сочетание обработки пыльников высокими и пониженными температурами. Так у риса для индукции образования каллуса и регенерации зеленых растений применялся следующий режим обработки

I

пыльников: 35 °С в течение 5 минут с последующей обработкой 10 С в течение 7 суток (Reddy P.J et al., 1985). При применении холода или высокой температурной обработки для пыльников баклажана положительная индукция ан-дрогенеза была отмечена в обоих случаях. Однако, когда низкая температура сменялась высокой, индукция не наблюдалась (Alemazkoor S.K 'et al., 1986).

Исследования показали, что температурные предобработки не всегда бывают эффективными, так предобработка пыльников лилии (Machteid Y.Q.et al., 1988), кормовой и диких видов свеклы (Rogozinska J.H., Goska М., 1982) низкой или высокой температурой не дала четкого эффекта. s

Облучение гамма-лучами. Предварительное облучение цветочных почек рапса низкими дозами (10-15 Гр) увеличивало частоту эмбриогенеза в культуре пыльников (Macdonald et al., 1988).

Обработка лазером. Лазер использовался в исследованиях по андрогенезу in vitro у пшеницы. Обработке подвергали пыльники, содержащие одноклеточную пыльцу. При этом на выход андрогенной гаплоидии влияли плотность мощности и экспозиция облучения (Тародей И.В., Башарова Т.В., 1987).

Атмосферное давление. Выдерживание пыльников табака при пониженном атмосферном давлении в течение 10-90 мин увеличивало частоту эмбриогенеза, выход пыльников, продуцирующих растения, а также среднее число растений на пыльник. На частоту эмбриогенеза влияют величина атмосферного давления и время обработки (Harada J., Imamura Н., 1982).

Центрифугирование. В ранних работах по андрогенезу in vitro было установлено, что предварительное центрифугирование пыльников дурмана усиливает эффект обработки холодом (Sangwan-Norreel B.S., 1977). Положительное

t

влияние центрифугирования на частоту эмбриогенных пыльников было показано у табака и картофеля (Маруненко И.М., 1988, 1990). Предполагается, что при центрифугировании нарушаются структуры цитоскелета (нарушаются

микротрубочки и микрофиламенты), что ингибирует нормальный митоз в

j

микроспорах и индуцирует клетки к аномальному пути развития (Маруненко И.М., 1988). :

Обработка двуокисью углерода. У некоторых видов эмбриогенез в культуре пыльников значительно усиливался при предварительном инкубировании пыльников в течение различного периода времени в атмосфере с 2 % С02, а затем перенесенных для дальнейшего культивирования в условия с нормальной концентрацией (0,04 %) СОг. Однако, это влияние характерно не для всех культур (Johansson К.Е, 1982,).

Обработка биологически активными веществами. Применение биологически активных веществ для предобработки пыльников оказывает положительное влияние на их регенерационную способность. Эффект действия активного вещества зависит от его природы, концентрации и экспозиции. Так, пыльники риса на мейотической стадии обрабатывали ГК3 и этрелом (Zhao С. et al., 1988), пыльники табака перед посевом на питательную среду - низкими концентрациями этилметансульфоната при экспозиции 1-2 часа, что увеличивало число пыльников, регенерирующих побеги, и среднее число растений -регенерантов от одного пыльника (Medrano Н. et al., 1986). Эффективной оказалась и обработка пыльников табака АБК в концентрации

в течение 1 -

3 суток (Harada Н., Imamura J., 1982; Harada Н. et al., 1986).

Zao С. (1996) с соавторами отметили, что у Brassica napus обработка колхицином может самостоятельно способствовать переходу пыльцы к эмбриогенезу в культуре микроспор, а также влиять на цитоскелет и заставлять микроспоры переходить на спорофитный путь развития. !

Предобработка эксплантов белокочанной капусты раствором борной кислоты в концентрации 0,1-2,0 мг/л в течение 2 часов стимулировала процесс

геммогенеза после двух недель культивирования пыльников in vitro (Бунин М.С., Шмыкова H.A., 2004).

При обработке срезанных растений пшеницы гормонами ауксинового типа действия (2,4-D) выявлено, что повышение концентрации гормона увеличивает частоту выхода эмбриоидов у всех изучаемых генотипов от 3% до 8%

}

(Беккужина С.С., 2011).

Обработка соцветий раствором нитрата серебра в концентрации 40 мг/л

в течение 2 суток при температуре + 6 °С с последующим культивированием

t

изолированных пыльников in vitro при температуре +32°С в течение 1 суток,

способствовала увеличению частоты андрогенеза до 2,1% (Май Дык Чунг,

2010). Положительное действие нитрата серебра показано для пыльников ри-

t

са, капусты, пшеницы и других сельскохозяйственных культур (Поляков A.B., 2000).

Так, обработка рылец кукурузы до опыления гидразидом малеиновой кислоты (50 мг/л) увеличивала частоту гаплоидов с 1:400 до 1:143. Гидразид малеиновой кислоты (40 мг/л) в сочетании с диметилсульфоксидом (ДМСО) с концентрацией 2% оказался эффективным и для индуцирования гомозиготных диплоидов кукурузы. Большинство полученных растений оказались ди-плоидами, некоторые миксоплоидами и лишь немногие - гаплоидами. Диплоидные растения были морфологически однородны и сходны с родителями (Май Дык Чунг, 2010). <

Таким образом, исходя из литературных источников отмечен ряд факторов, оказывающих определённое влияние на эмбриогенную способность микроспор/пыльников: этанольный стресс (Keller W.A., 1983), воздействие колхицином (Zaki М.А.М, 1991), углеводное голодание (Zarsky V. et al., 1985), водный стресс (Шмыкова H.A., 2005), анаэробные условия (Imamura Н. and HaradaJ., 1980, 1981).

1.2.3. Влияние химических факторов на эмбриогенез

Список химических факторов, которые могут влиять на морфогенез в культуре пыльников /микроспор обширен и включает такие как состав питательной среды, источник углеводов, регуляторы роста, твердая или жидкая среда, присутствие соматических тканей в культуре и другие. ;

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Демидкина, Марина Александровна, 2013 год

Библиографический список

1. Бялт, В.В., Флора Восточной Европы / В.В. Бялт, В.М. Виноградова, Д.В. Гельтман, И.А. Грудзинская, С.С. Иконников, Л.И. Крупкина, М.Л. Кузьмина, Ю.Л. Минецкий, И.В. Соколова, В.Н. Тихомиров, H.H. Цвелев. Том XI. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. - 536 е.; ил.

2. Зонтиков, Д.Н. Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор: Автореф... канд. с.-х. наук: М.- 2009.22 с.

3. Леунов, В.И. Столовые корнеплоды в России/ В.И. Леунов. М.: Товарищество научных изданий КМК .-2011.-271 е.: ил. (

4. Лудилов, В. А. Все об овощах: Полный справочник/ В. А. Лудилов, М. И. Иванова. — М.: ЗАО «Фитон+», 2010. - 424 с. + 32 с. ил. (

5. Поляков, A.B. Биотехнология в селекции льна/ A.B. Поляков. - Тверь, 2000. - 180 с.

6. Пухальский, В.А. Цитология и цитогенетика растений /В.А. Пухальский, A.A. Соловьев, В.Н. Юрцев. М.: - Издат-во МСХА, 2004. - 118с.

7. Тюкавин, Г.Б. Основы биотехнологии моркови. / Г.Б. Тюкавин М, 2007. - 480 с.

8. Тюкавин, Г.Б. Методические рекомендации по получению дигаплоидов моркови методом андрогенеза/ Г.Б. Тюкавин, H.A. Шмыкова. - М.: ВНИИССОК, 2000. - 54 с.

9. Guo, J.D. Maintenance of male sterile germ-plasm in Brassica rapa by in vitro propagation. /J.D. Guo, T. Niemela, U. Talisalo, S. Pulli. //Agr, And Food Scince in Finland. - 2000. - V. 9. -P. 231238.

10. Masuda, K. Revision of the Medium for Somatic Embryogenesis in Carrot Suspension Culture/ K. Masuda, Y. Kikuta// J. Fac. Agr. Hokkaido Univ. - 1981. -V. 60. - P. 183-193.

11. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. P. 473-497.

12. Pechan, P.M. Identification of potentially embryogenic in Brassica napus /Р.М Pechan, W.A. Keller //Physiologia Plantarum. - 1988. - V.74. P.377-384