Изучение и создание удвоенных гаплоидов свеклы столовой (Beta vulgaris L.) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат наук Григолава Тамара Руслановна

• Григолава Тамара Руслановна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Григолава Тамара Руслановна

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Биологические особенности свеклы столовой

1.2 Значение гаплоидных технологий в селекции и генетике растений и возможности их применения

1.3 Предпосылки и история использования гаплоидных технологий на свекле столовой

1.4 Проблемы культуры изолированных семязачатков свеклы и пути их решения

1.4.1 Генотип-специфичность и маркерные признаки отзывчивых генотипов к культуре изолированных семязачатков. Стадия развития зародышевого мешка

1.4.2 Подготовка донорных растений

1.4.3 Изоляция семязачатков

1.4.4 Стимуляция перехода семязачатков с гаметофитного пути развития на спорофитный

1.4.5 Формирование эмбриоидов и пути развития изолированных семязачатков

1.4.6 Подбор питательных сред для культивирования изолированных семязачатков

1.4.6 Регенерация растений из изолированных семязачатков

1.4.7 Проблема полиплоидизации и определение уровня плоидности растений-регенерантов

1.5 Проблемы технологии культуры изолированных микроспор и пути их решения

1.5.1 Стадия развития микроспор и маркерные признаки отзывчивых микроспор

1.5.2 Стимуляция перехода изолированных микроспор с гаметофитного пути развития на спорофитный

1.5.3 Состав питательных сред для индукции эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор и пыльников

2. Материалы и методы

2.1. Создание удвоенных гаплоидов свеклы столовой

2.1.1 Растительный материал

2.1.2 Подготовка растений-доноров

2.1.3 Стадия развития женского гаметофита

2.1.4 Выделение и культивирование семязачатков, получение эмбриоидов и каллуса

2.1.5 Изучение влияния факторов на эмбриогенез в культуре изолированных семязачатков

2.1.6 Определение стадии развития и жизнеспособности микроспор

2.1.7 Выделение и культивирование микроспор

2.1.8 Изучение факторов культуры изолированных микроспор

2.2 Анализ плоидности растений-регенерантов

2.3 Приготовление препаратов каллусной ткани, полученной в культуре изолированных микроспор

2.4 Статистическая обработка

3. Результаты и обсуждение

3.1 Изучение влияния различных факторов на частоту эмбриогенеза в культуре изолированных семязачатков

3.1.1 Влияние генотипа растения-донора на формирование и выход эмбриоидов и каллуса свеклы столовой (Beta vulgaris L.) в культуре изолированных семязачатков

3.1.2 Влияние питательной среды на формирование и выход эмбриоидов и каллуса свеклы столовой (Beta vulgaris L.) в культуре изолированных семязачатков

3.1.3 Влияние гелеобразователей питательных сред на формирование и выход эмбриоидов и каллуса свеклы столовой (Beta vulgaris L.) в культуре изолированных семязачатков

3.1.4 Влияние углеводного состава питательных сред на формирование и выход эмбриоидов и каллуса свеклы столовой (Beta vulgaris L.) в культуре изолированных семязачатков

3.1.5 Влияние регуляторов роста в составе питательных сред на формирование и выход эмбриоидов и каллуса свеклы столовой (Beta vulgaris L.) в культуре изолированных семязачатков

3.1.6 Влияние температуры и наличия/отсутствия освещенности при культивировании семязачатков на формирование и выход эмбриоидов и каллуса свеклы столовой (Beta vulgaris L.) в культуре изолированных семязачатков

3.2 Изучение влияния различных факторов на каллусогенез в культуре изолированных микроспор

3.2.1 Связь размера бутона, стадии развития микроспор и каллусогенеза изолированных микроспор

3.2.2 Влияние температурной обработки на каллусогенез в культуре изолированных микроспор

3.2.3. Влияние сахаров и регуляторов роста в составе питательной среды на частоту каллусогенеза изолированных микроспор

3.2.4. Влияние уровня pH питательной среды NLN-13 на частоту каллусогенеза изолированных микроспор

3.2.5. Влияние экспозиции температурной обработки при + 32,5 °С на каллусогенез изолированных микроспор

3.2.6. Влияние альфа-амилазы на каллусогенез в культуре изолированных микроспор

3.3 Изучение эмбриоидов, каллуса и растений-регенерантов

3.3.1 Исследования эмбриоидов и каллуса, полученных в культуре изолированных семязачатков

3.3.2 Изучение растений-регенерантов, полученных в культуре изолированных семязачатков

3.3.3 Цитологические исследования изолированных микроспор

3.3.4 Цитологические исследования каллуса, полученного в культуре изолированных микроспор

Заключение

Список сокращений

Библиографический список:

Приложения

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение и создание удвоенных гаплоидов свеклы столовой (Beta vulgaris L.)»

Актуальность темы исследования

Растения, принадлежащие к виду Beta vulgaris L., являются ценными овощными (свекла столовая), кормовыми (свекла кормовая) и техническими (свекла сахарная) культурами. В настоящее время востребованным направлением в селекции большинства сельскохозяйственных культур является создание гетерозисных F1-гибридов, которые создают путем подбора и гибридизации инбредных родительских линий. Методы традиционной селекции, позволяющие создавать чистые линии у двулетней культуры свеклы, это инбридинг и отбор на протяжении минимум 4-6 поколений, что занимает 8-12 лет (De La Fuente et al., 2013). Длительное время создания инбредных линий - одна из основных проблем селекции F1-гибридов. Технологии производства удвоенных гаплоидов позволяют сократить процесс создания чистых линий свеклы до 3 лет (Zhuzhzhalova et al., 2020).

Главное преимущество гаплоидных технологий - возможность добиться полной гомозиготности в одном поколении. Гаплоидные технологии позволяют наблюдать проявление рецессивных аллелей у гаплоидных растений, подавляемых в гетерозиготном состоянии у диплоидных форм, что облегчает выявление, оценку и отбор генотипов с полезными признаками (Doctrinal et al., 1989; Klimek-Chodacka, Baranski, 2013). Удвоенные гаплоиды используются для создания картирующих популяций, в генетической трансформации, в технологиях направленного мутагенеза, для упрощения секвенирования генома за счет устранения явления гетерозиготности (Dirks et al., 2009; Ferrie, 2011a).

Наиболее распространенной технологией производства удвоенных гаплоидов у представителей вида Beta vulgaris L. является технология культивирования неоплодотворенных семязачатков (гиногенез). Гиногенез -достаточно простая в исполнении, но трудоемкая технология, требующая ручной изоляции каждого семязачатка. Существенным недостатком гиногенеза является зависимость регенерационной способности семязачатков от генотипа и

относительно низкий процент морфогенных семязачатков (формирующих эмбриоиды или каллус) - 0-17 % у сахарной свеклы (Yang and Zhou, 1982; Van Geyt et al., 1987; Galatowitsch and Smith, 1989; Wang et al., 1989) и 0-12,67 % у столовой свеклы (Baranski, 1996; Zayachkovskaya et al., 2021). Кроме того, не исключено появление клонов донорного растения из соматических клеток, окружающих зародышевый мешок, что делает необходимым разработку эффективных методов дифференциации гомо- и гетерозигот с отбором первых среди полученных растений в культуре изолированных семязачатков.

Технология создания удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор позволила бы избежать необходимости генетического анализа, т.к. растения-регенеранты, полученные в культуре изолированных микроспор, развиваются только из гаплоидных микроспор, однако, на настоящий момент подобные протоколы производства удвоенных гаплоидов свеклы не разработаны.

Степень разработанности темы

Почти все протоколы производства удвоенных гаплоидов в культуре

изолированных семязачатков для Beta vulgaris L. разработаны для сахарной свеклы (Beta vulgaris L. convar. saccharifera Alef.) (Yang and Zhou, 1982; Hosemans, Bossoutrot 1983; D'Halluin, Keimer, 1986; Herrmann, Lux, 1988b; Doctrinal et al., 1989; Lux et al., 1990; Galatowitsch and Smith, 1989; Wang et al., 1989; Ferrant, Bouharmont, 1994; Gurel et al., 2000; Подвигина, 2003; Wremerth, Levall, 2003; Васильченко и др., 2017; Pazuki et al., 2018b), тогда как получению удвоенных гаплоидов у столовой свеклы (Beta vulgaris L. convar. esculenta Salisb.) посвящены единичные исследования (Baranski, 1996; Zayachkovskaya et al., 2021; Kiszczak et al., 2021).

Технология создания удвоенных гаплоидов путем андрогенеза свеклы долгое время считалась неэффективной, и исследователям удавалось получить лишь каллус или проэмбриоидные структуры без дальнейшей регенерации либо соматические клоны (Banba, Tanabe, 1972; Goska, Rogozinska, 1981; Van Geyt et al., 1985; Herrmann, Lux, 1988a). Однако, в 2017 г. исследователям удалось получить эмбриоиды свеклы столовой в культуре изолированных микроспор и

пыльников и неукорененные розетки листьев из них (Gorecka et al., 2017), а в 2018 г. исследователи смогли получить эмбриоиды в культуре изолированных пыльников у сахарной свеклы (Гонтаренко, Герасименко, 2018), что показывает возможность создания удвоенных гаплоидов Beta vulgaris L. путем андрогенеза.

Поиск способов увеличения количества морфогенных семязачатков у столовой свеклы, повышения частоты регенерации полученных эмбриоидов и каллуса в растения, разработка методик получения удвоенных гаплоидов путем андрогенеза - представляют собой ряд нерешенных задач в получении удвоенных гаплоидов столовой свеклы.

Цели и задачи исследования

Цель исследования - изучение влияния различных факторов на частоту эмбрио- и каллусогенеза в культуре изолированных семязачатков и в культуре изолированных микроспор свеклы столовой (Beta vulgaris L.).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение генотипспецифичной отзывчивости к эмбрио- и каллусогенезу образцов свеклы столовой в культуре изолированных семязачатков;

2. Изучение влияния питательной среды на эмбрио- и каллусогенез, и на соотношение формирующихся эмбриоидов и каллуса в культуре изолированных семязачатков;

3. Изучение влияния сахаров, гелеобразователей, условий культивирования семязачатков на частоту эмбриогенеза в культуре изолированных семязачатков;

4. Изучение отзывчивости и влияния факторов (генотип, размер бутона и стадии развития микроспор, питательной среды и условий культивирования) на отзывчивость к каллусогенезу свеклы столовой в экспериментальных условиях культуры изолированных микроспор.

5. Анализ уровня плоидности растений-регенерантов и определение доли спонтанного образования удвоенных гаплоидов свеклы столовой в культуре in vitro.

Научная новизна

Впервые показано, что культивирование изолированных семязачатков свеклы столовой на питательных средах, гелированных фитагелем, значимо повышает отзывчивость к эмбрио- и каллусогенезу (до 2,5 %) по сравнению со средами, гелированными агаром, агарозой или агаргелем.

Впервые для свеклы столовой установлено, что использование сахарозы в концентрации 60 г/л в составе питательной среды MS обеспечивает наибольшую отзывчивость к эмбрио- и каллусогенезу (0,81 шт./ч. Петри морфогенных семязачатков образца Ф2) в культуре изолированных семязачатков.

Установлено, что инкубирование смеси тетрад микроспор и микроспор одноядерной стадии развития, изолируемых из цветковых бутонов длиной 1,2-1,5 мм, вызывает наибольшую частоту формирования каллуса.

Показано, что частота формирования микроспорогенного каллуса в культуре изолированных микроспор свеклы столовой выше на питательной среде NLN с добавлением 130 г/л сахарозы, 0,1 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л НУК, по сравнению с альтернативными вариантами питательных сред.

Теоретическая и практическая значимость

Анализ генотипспецифичности индукции эмбрио- и каллусогенеза 19 генотипов свеклы столовой показал, что в среднем 57,9 % генотипов отзывчивы в культуре изолированных семязачатков.

Отмечен наибольший выход эмбриоидов и каллуса при культивировании семязачатков на питательной среде N6, содержащей 0,5 мг/л ИУК, 0,2 мг/л БАП и 60 г/л сахарозы.

Анализ генотипспецифичности индукции эмбрио- и каллусогенеза 17 образцов свеклы столовой в культуре изолированных микроспор показал, что 52,9 % изученных генотипов отзывчивы к каллусогенезу. На основании

проведенных исследований выявлено, что гелеобразователь питательных сред для культуры изолированных семязачатков, обеспечивающий значимое повышение отзывчивости к эмбрио- и каллусогенезу - фитагель (2 г/л).

При исследовании влияния сахаров показано, что использование сахарозы в концентрации 60 г/л в составе питательных сред MS обеспечивает наибольший выход эмбриоидов и каллуса.

При исследовании отзывчивости изолированных микроспор свеклы столовой на введение в культуру in vitro показано, что наиболее отзывчивы микроспоры на стадии тетрад и одноядерной, выделенные из бутонов длиной 1,21,5 мм.

Питательная среда NLN-13 с добавлением 130 г/л сахарозы, 0,1 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л НУК обеспечивает наибольший выход каллуса из изолированных микроспор свеклы столовой.

Методология и методы исследования

Теоретические исследования основаны на аналитическом обобщении опубликованных научных результатов. Экспериментальные исследования проведены с использованием стандартных и частных методик и последующей компьютерной обработкой результатов с применением дисперсионного анализа в программе Microsoft Excel. Полностью методология описана в главе «Материалы и методы».

Положения, выносимые на защиту:

1. При производстве удвоенных гаплоидов свеклы столовой в культуре

изолированных семязачатков гелеобразователь питательных сред, обеспечивающий максимальный уровень индукции эмбрио- и каллусогенеза из изолированных семязачатков - фитагель в концентрации 2 г/л.

2. При производстве удвоенных гаплоидов свеклы столовой в культуре изолированных семязачатков сахароза (60 г/л) в составе питательной среды MS, обеспечивает максимальный выход эмбриоидов и каллуса.

3. Наибольшая частота формирования микроспорогенного каллуса в культуре изолированных микроспор свеклы столовой характерна для цветковых бутонов длиной 1,2-1,5 мм, содержащих тетрады и одноядерные микроспоры.

4. Для культуры изолированных микроспор свеклы столовой использование питательной среды NLN с добавлением 0,1 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л НУК, 130 г/л сахарозы обеспечивает наибольшую отзывчивость изолированных микроспор на культивирование in vitro.

Степень достоверности

Достоверность исследований подтверждается обширными

экспериментальными исследованиями, выбором необходимого количества повторностей и объема выборки при закладке опытов, а также статистической обработкой полученных экспериментальных данных. Для статистической обработки экспериментальных данных применяли дисперсионный анализ.

Апробация результатов

Основные положения диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на Международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвящённая 150-летию А.В. Леонтовича (Москва, 2019); Международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвящённая 160-летию В.А. Михельсона (Москва, 2020); Всероссийской с международным участием научной конференции молодых учёных и специалистов, посвящённая 155-летию со дня рождения Н.Н. Худякова (Москва, 2021).

Публикации

По теме исследования опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад

Результаты экспериментальных и теоретических исследований получены автором лично. Соискателю принадлежат разработка программы исследования, и проведение экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 133 страницах, состоит из введения, основной части, содержащей 43 рисунка, 15 таблиц, заключения, списка принятых сокращений, библиографического списка, включающего 136 источников, в том числе 97 на иностранном языке, и 5 приложений.

1. Обзор литературы

1.1 Биологические особенности свеклы столовой

Свекла - аллогамное двулетнее растение (Буренин и др., 2019). На первый год формирует корнеплод, на второй год генеративные органы - соцветия и семена (Красочкин, 1960).

Для свеклы в основном характерно перекрестное (зиготическое) оплодотворение, т.к. самооплодотворение в обоеполых цветках предотвращается системой самонесовместимости. Однако, мутации аллелей самонесовместимости приводят к появлению в популяции самосовместимых растений, формирующих семена преимущественно за счет самооплодотворения (Харечко-Савицкая, 1940; Малецкий и др., 1970).

У свеклы может проявляться частичная самосовместимость, особенно во время длительной дождливой погоды в период цветения. Установлено, что самофертильность сильно повышается при выращивании маточных растений при пониженных температурах (+10...+12°С), эта особенность используется для получения самоопыленных линий и назвается псевдосамосовместимостью (Боос и др., 1990).

В популяциях свеклы встречаются генотипы, способные формировать семена без участия пыльцы (агамоспермия). Чаще всего это явление наблюдается у инбредных линий (Yudanova, 2003; Юданова, Малецкая, 2007).

Свекла - анемофильное растение, пыльца которого может переноситься на расстояние 2-5 км. В связи с этим в хозяйствах, где выращивают семенники различных сортов, необходима пространственная изоляция не менее 2-3 км, а при выращивании семенников кормовой, столовой и сахарной свеклы в одном хозяйстве пространственная изоляция должна быть не менее 10 км (Красочкин, 1971).

Цветение начинается через 50-60 дней после высадки маточных растений в грунт и в зависимости от погодных условий продолжается от 30 до 50 дней. Из-за растянутости периода цветения семена созревают неодновременно, что

затрудняет определение оптимальных сроков уборки урожая. Распускание бутонов начинается с соцветия первого порядка, начиная с нижнего яруса, позже происходит зацветание соцветий второго и последующих порядков (Красочкин, 1971).

Раздельноплодные (раздельноцветковые) растения характеризуются более поздним цветением (на 15-20, иногда на 30-40 суток), чем растения, формирующие кластеры из плодов (Бордонос, 1938, 1939). Пыльники в цветках созревают на 2-3 дня раньше пестиков. Пыльца распространяется ветром и насекомыми, которых привлекает сильный запах триметиламина. Жизнеспособность пыльцы сохраняется 4-7 суток, а яйцеклетка сохраняет способность к оплодотворению 12-17 суток после распускания цветка. В этот период требуется среднеповышенная температура и умеренная сухость воздуха. Развитие бутона, цветка и завязи проходит в течение недели (Буренин, 2007; Леунов, 2011).

Цветки мелкие, обоеполые, пятичленные, чаще собранные по 2-3 штуки, иногда до 8 штук в клубочках, изредка одиночные. Соцветия крупные, густые, обычно ветвистые, колосовидные. Цветки обоеполые, состоящие из зелёного или беловатого чашевидного пятичленного околоцветника, из пяти тычинок, прикреплённых к мясистому кольцу, окружающему завязь, и из пестика с полунижней одногнёздной завязью и двумя рыльцами. Плоды жесткие (сжатая односемянка), с почти деревянистой оболочкой из твердеющего околоцветника. Завязи срастаются, образуя соплодие клубочек (кластер), в соплодии содержится от 2 до 8 семян, обычно 3-4, при неблагоприятных условиях меньше. Ряд диких видов и односемянные сорта являются одноплодными (Красочкин, 1971).

Двулетний цикл развития свеклы часто нарушается: в первый год жизни может появиться цветуха, а во второй - упрямство. Цикл развития зависит не только от сорта, но и от сочетания температурного режима со степенью освещенности. Длительное воздействие пониженной температуры (0...+10 °С) стимулирует переход к генеративной фазе. Так, при холодном дождливом лете у раннеспелых сортов свеклы до 20-30 % растений может образовать цветуху в

первый год. Растения, у которых в первый год жизни появляются цветоносные побеги без образования корнеплодов, называют короткостадийными. Чем больше в составе сорта таких короткостадийных растений, тем сильнее появляется цветушность (Карпенко, 1964).

Упрямцы появляются под действием высоких температур, особенно в период хранения маточных корнеплодов или после их высадки в грунт. Для снижения процента упрямцев необходима температура хранения +5...+8 °С в течение 120-130 дней. Оптимальная температура хранения семенных корнеплодов свеклы в зимний период +1...+3 °С. В этих условиях яровизация проходит замедленно, но ко времени высадки семенников в грунт она завершается, а корнеплоды хорошо сохраняются (Стрижова, 2008).

1.2 Значение гаплоидных технологий в селекции и генетике растений и возможности их применения

Гаплоидные технологии - технологии производства гаплоидных растений из изолированных пыльников, неоплодотворенных завязей, изолированных семязачатков или микроспор. Гаплоидные технологии имеют крайне высокое значение в селекции из-за сокращения времени получения чистых линий и быстрой оценки ценности гибридных комбинаций. Технологии производства удвоенных гаплоидов позволяют сократить процесс создания чистых линий свеклы до 3-5 лет (Zhuzhzhalova et al., 2020). Удвоенные гаплоиды происходят либо из отцовского, либо из материнского геномов репродуктивных клеток, и являются полностью гомозиготными. У представителей рода Beta наиболее изученным способом производства чистых линий является гиногенез, который позволяет выявить формы с рецессивными и доминантными признаками и ускоренно производить чистые линии с ценными признаками (Ницше, Венцель, 1980; Bossoutrot, Hosemans, 1985; Павлова, 1987).

Преимущество гаплоидных технологий и созданных с их помощью растений также состоит в расширении формообразовательного процесса за счет гаметоклональной изменчивости (Шмыкова, 2015).

Еще одно преимущество гаплоидных технологий - возможность наблюдать проявление рецессивных аллелей у гаплоидных растений, замаскированных в гетерозиготном состоянии у диплоидных растений, что облегчает выявление, оценку и отбор растений с полезными признаками (Doctrinal et al., 1989; Klimek -Chodacka, Baranski, 2013).

Гомозиготные линии, полученные при удвоении хромосомного набора гаплоидного растения, используют в некоторых областях фундаментальных исследований, таких как классическая генетика растений и цитогенетика, молекулярная генетика, в том числе для изучения взаимодействия генов, генетической изменчивости, определения групп сцепления, локализации полигенов, картирование генома и др. (Dwivedi et al., 2015).

1.3 Предпосылки и история использования гаплоидных технологий на свекле столовой

Первые гаплоиды сахарной свеклы были обнаружены в 1945 г. Levan (1945), через некоторое время подобные открытия последовали от Zimmermann (1953), Fischer (1956), Butterfass (1959), Kruse (1961) и Hammond (1966). Гаплоидные растения были получены разными путями. Это были потомки растений, обработанных полиплоидизирующими агентами; потомки, полученные из семян ди- или анизоплоидных сортов; растения, полученные вегетативным размножением диплоидных, цитоплазматически мужскистерильных растений; потомки анизоплоидной сахарной свеклы.

Впервые заниматься экспериментальным получением гаплоидов сахарной свеклы стал Bosemark (1971). Bosemark (1971) опылял стерильные диплоидные растения сахарной свеклы пыльцой тетраплоидных растений, что привело к формированию в потомстве около 0,2 % гаплоидов. Производством гаплоидов с помощью отдаленной гибридизации занимался в 1983 г. в Чехословакии Seman, он скрещивал мужскистерильные растения свеклы сахарной со свеклой салатной, что привело к выходу гаплоидов в количестве 0,013 % (Seman, 1983). BuchterLarsen (1986) комбинировал опыление растений облученной пыльцой и последующее спасение зародышей, однако практически все полученные растения

оказывались гетерозиготными по одному или нескольким генам. Спасение зародышей, полученных при опылении пыльцой других видов Beta, привело к относительно большому выходу негаплоидных растений (Buchter-Larsen, 1986). Так как метод создания удвоенных гаплоидов in vivo путем отдаленной гибридизации с последующим спасением зародышей обеспечивал низкий выход гаплоидов и был крайне трудоемким, исследователи оставили попытки производства удвоенных гаплоидов in vivo.

Андрогенез - популярный в силу своей простоты и эффективности метод производства гаплоидов in vitro у многих культур. У представителей рода Beta неоднократно предпринимались попытки создания гаплоидов с применением культуры изолированных пыльников и микроспор. Первые попытки производства гаплоидов сахарной свеклы in vitro были предприняты Banba и Tanabe (1972), которые культивировали изолированные пыльники и получили одно растение, происхождение (соматический клон или гаплоид) которого не указано. Goska и Rogozinska (1981) при культивировании изолированных пыльников сахарной свеклы получили растения, которые не были андрогенными.

Hosemans и Bossoutrot (1983) занимались разработкой питательных сред для культивирования изолированных семязачатков и проводили цитологические исследования развивающихся на питательных средах семязачатков. Hosemans и Bossoutrot (1983) показали, что наиболее склонны к развитию in vitro семязачатки, содержащие зрелый 7-ядерный зародышевый мешок и, что зародыши развивались из гаплоидных клеток зародышевого мешка - синергид и антипод. Им удалось получить 17 гаплоидных растений из 7237 изолированных семязачатков сахарной свеклы из мужскистерильных донорных растений. Вскоре после первого сообщения об успешном получении гаплоидов in vitro методом гиногенеза у сахарной свеклы (Hosemans and Bossoutrot, 1983) последовал ряд аналогичных сообщений от других авторов (Goska, 1985; Magnusson et al. 1985; D'Halluin and Keimer, 1986; Barocka et al., 1986; Van Geyt et al., 1987; Doctrinal et al., 1989, 1990; Lux et al., 1990; Dubois et al., 1990; Galatowitsch and Smith, 1990).

Ученые многократно возвращались к исследованиям по созданию гаплоидов свеклы в культуре изолированных пыльников и микроспор, однако получить полноценные растения-регенеранты либо не удавалось (Van Geyt et al., 1985; Gorecka et al., 2017; Гонтаренко, Герасименко, 2018), либо они не были гаплоидами (Herrmann, Lux, 1988a). Поэтому главным методом производства гаплоидов сахарной и столовой свеклы стал гиногенез. Основной объем исследований по изучению гиногенеза у вида Beta vulgaris выполнен на сахарной свекле. Исследователи изучали влияние на выход эмбриоидов и регенерантов различных факторов: концентрации фитогормонов (D'Halluin, Keimer, 1986; Herrmann, Lux, 1988b; Ferrant, Bouharmont, 1994; Подвигина, 2003; Wremerth, Levall, 2003; Pazuki et al., 2018b), холодовой предобработки бутонов и семязачатков (Herrmann, Lux, 1988b; Svirshchevskaya, Dolezel, 2000; Подвигина, 2003; Pazuki et al., 2018b), шоковой стимуляции повышенными температурами изолированных семязачатков (Wremerth, Levall, 2003), времени введения семязачатков в культуру in vitro (Lux et al., 1990), расположения бутонов на соцветии (D'Halluin, Keimer, 1986; Doctrinal et al., 1989; Подвигина, 2003) и др. Гиногенез столовой свеклы менее исследован, изучением этой темы занимались Baranski (1996), Zayachkovskaya et al. (2021), Kiszczak et al. (2021). Baranski (1996) изучил влияние гормонального состава питательных сред и температуры культивирования изолированных семязачатков на выход эмбриоидов и каллуса, а также влияние времени года и места выращивания донорных растений (теплица/поле) на выход регенерантов. Zayachkovskaya et al. (2021) изучали влияние состава эмбриоиндукционных питательных сред и условий инкубирования на морфогенез изолированных семязачатков, а также состав питательных сред для регенерации растений из эмбриоидов и каллуса. Kiszczak et al. (2021) разработывали состав питательных эмбриоиндукционных питательных сред, сред для регенерации растений из эмбриоидов и каллуса и сред для укоренения.

1.4 Проблемы культуры изолированных семязачатков свеклы и пути их решения

Процесс производства гаплоидов определяется на генетическом уровне, но реализуется в зависимости от физических условий и инициирующих факторов, что прямо сказывается на проценте выхода регенерантов (Baranski, 1996; Подвигина, 2003; Кильчевский, 2012). Основными факторами являются генотипические особенности растений-доноров, стадии развития женского гаметофита, расположение бутона на соцветии. Высокую значимость имеют экзогенные факторы, оказывающие влияние на регенерационную способность культивируемых семязачатков. К таким факторам относят сезон и продолжительность выращивания (возраст) растений-доноров, холодовую и рентгеновскую обработку бутонов, температуру и условия культивирования изолированных семязачатков, процентное соотношение регуляторов роста в питательных средах (Van Geyt et al., 1987; Lux et al., 1990; Gurel et al., 2000).

1.4.1 Генотип-специфичность и маркерные признаки отзывчивых генотипов к культуре изолированных семязачатков. Стадия развития зародышевого мешка

Среди факторов, влияющих на успех эмбриогенеза, генотип считается наиболее значимым. Исследователи отмечают, что наиболее отзывчив при введении в культуру изолированных семязачатков материал гибридного и линейного происхождения - инцухт-линии, гибриды и сибсы, а самую низкую регенерационную способность имеют линии на основе ЦМС и сорта-популяции (Gurel et al., 2000; Подвигина, 2003).

Многие исследователи предполагают, что способность растения формировать эмбриоиды контролируется генетически, однако нет единого мнения о количестве генов, участвующих в контроле данного признака (Rudolf et al., 1999; Palmer et al., 1996; Zhang, 2001; Ferrie, 2004; Weber et al., 2005). У видов Beta vulgaris L. исследований количества генов, определяющих отзывчивость генотипов к формированию эмбриоидов in vitro, не проводили, что, вероятно, связано с низкой отзывчивостью генотипов и трудоемкостью используемых

методов производства гаплоидов. Выявить отзывчивые генотипы можно только экспериментальным путем.

Маркерным признаком отзывчивого генотипа сахарной свеклы может являться наличие аномальных пыльцевых зерен и микроспор в бутонах донорных растений, вызванных нарушением функции веретена деления, нерегулярным образованием клеточной перегородки или отсутствием цитокинеза при мейозе (Подвигина, 2003).

Определенное значение при индуцировании гаплоидов сахарной свеклы имеют месторасположение отбираемых бутонов на соцветии и стадии развития зародышевых мешков. Наибольшей склонностью к морфогенезу при введении в культуру in vitro обладают семязачатки, выделенные из бутонов с 1-го по 25-й снизу-вверх, кроме того, максимальный выход гаплоидов отмечается с центрального побега и побегов первого порядка по сравнению с ветвями второго порядка (D'Halluin, Keimer, 1986; Doctrinal et al., 1989; Подвигина, 2003).

Между размером бутонов и отзывчивостью семязачатков нет корреляции (D'Halluin and Keimer, 1986). Также не удалось найти корреляцию между размером семязачатка и его отзывчивостью (D'Halluin and Keimer, 1986). В отличие от технологий андрогенеза, где важна стадия развития микроспор, в технологии гиногенеза можно вызвать гиногенный ответ у семязачатков в широком диапазоне стадий развития (Pedersen, Keimer, 1996). Путем цитологического анализа Dubois et al. (1990) подтвердили, что полное созревание семязачатка не является необходимым для индукции гиногенеза. Культивирование пестиков, имеющих семязачатки длиной 0,3 мм, также приводило к индукции формирования эмбриоидов (D'Halluin and Keimer, 1986).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Григолава Тамара Руслановна, 2022 год

Библиографический список

1. Атанасов, А. И. Биотехнология в растениеводстве: учебное пособие / А. И.

Атаносов. - Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993. - 242 с.

2. Бордонос, М.Г. К изучению наследственности односемянности у свеклы: Основные выводы научно-исследовательских работ ВНИИС за 1937 г. - М; Л.: Пищепромиздат. - 1939. - 357-359 с.

3. Бордонос, М.Г. Характер расщепления и некоторые особенности свекловичных высадок с одноцветковыми семенами / М.Г. Бордонос // Селекция и семеноводство. - 1938. - № 6. - С. 24-27.

4. Бормотов, В. E. Турбин Н. В. Экспериментальная полиплоидия и гетерозис у сахарной свеклы / В. Е. Бормотов, Н. В. Турбин // Минск: Наука и техника. - 1972. - С. 230.

5. Буренин, В.И. Генофонд для селекции свеклы столовой (современные аспекты изучения и использования) / В.И. Буренин, Д.В. Соколова, Т.М. Пискунова // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 2019. -180 (3). - С. 19-25.

6. Бреславец, Л. П. Полиплоидия в природе и опыте / Л. П. Бреславец. - М.: АН СССР, 1963. -364 с.

7. Буренин, В.И. Генетические ресурсы рода Beta L. (Свекла) / В.И. Буренин. -СПб. - 2007. - 274 с.

8. Васильченко, Е. Н. Особенности формирования гаплоидных регенерантов сахарной свеклы в культуре in vitro / Е. Н. Васильченко, Т. П. Жужжалова, Т. Г. Ващенко, О. А. Землянухина, Н.А. Карпеченко, О. А. Подвигина // Вестник Воронежского государственного аграрного университета. - 2017. -№ 3(54) - С. 57-66.

9. Боос, Г. В. Гетерозис овощных культур: монография / Г.В. Боос, Г.В. Бадина, В.И. Буренин. - Л.: Агропромиздат, - 1990.- 218 с.

10. Голованова, И. В. Экспериментальная гаплоидия у мягкой пшеницы Triticum aestivum L. / И. В. Голованова // Проблемы ботаники Южной

Сибири и Монголии : сб. науч. ст. по материалам Тринадцатой междунар. науч.-практ. конф. АлтГУ, Ботан. ин-т им. В. Л. Комарова РАН, Центр. Сиб. ботан. сад СО РАН, Алтайское отд-ние Рус. ботан. о-ва; - Барнаул:, 2014. -60-63 с.

11. Гонтаренко, С. М. Прямий шдуцирований андрогенез у культур1 in vitro буряюв цукрових (Beta vulgaris L.) / С. М. Гонтаренко, Г. М. Герасименко // Plant Varieties Studying and Protection. - 2018. № 14(4). - С.375-381.

12. Григолава, Т.Р. Влияние гелеобразователи питательной среды на эмбрио- и каллусогенез в культуре изолированных семязачатков свеклы столовой (Beta vulgaris L.) / А.В. Вишнякова, О.Н. Зубко, Г.Ф. Монахос, С.Г. Монахос // Известия ТСХА. - 2021. - №6. - С. 32-38.

13. Зайковокая, Н.Е. Методика быстрого подсчета хромосом / Н. Е. Зайковская, М. П. Петрушина // Агробиология. - 1961. № 8(4) - С.631-633.

14. Знаменская, В.В. Принципы и методы создания и поддержания исходного материала на современном этапе селекции сахарной свеклы : дис. ... д-ра с/х наук : 06.01.05 / Знаменская Валентина Васильевна. - Рамонь, 1999 - 318 с.

15. Иванова, С.В. Морфометрическая и цитогенетическая характеристика гаплоидов томата / С.В. Иванова // Генетика. - 2000. - № 1. - С. 52-61.

16. Карпенко, П. В. Свекловодство: учебное пособие / П.В. Карпенко. - 3-е изд., перераб. - М.: Колос, 1964. - 308 с.

17. Кильчевский, А.В. Генетические основы селекции растений. В 4т. т.3. Биотехнология в селекции растений. Клеточная инженерия: учебное пособие / А. В. Кильчевский, Л. В. Хотылева; науч. ред. А. В. Кильчевский, Л. В. Хотылева. - Минск : Беларус. навука, 2012. - 489 с.

18. Красочкин, В. Т. Свёкла / В. Т. Красочкин. - Москва; Ленинград : Сельхозгиз, 1960. - 439 с.

19. Красочкин, В. Т. Культурная флора СССР: Том 19. Корнеплодные растения / В.Т. Красочкин, Б.И. Сечкарев, Л.В. Сазонова, Л.И. Левандовская. -Ленинград: Колос, 1971. - 436 с.

20. Лаптев, Ю.П. Гетероплоидия в селекции растений : монография. - М.: Колос, 1984.-248 с.

21. Леунов, В.И. Столовые корнеплоды в России : монография / В.И. Леунов. -М.: КМК, 2011.-272 с.

22. Малецкий, С.И. Гармонические пропорции числа хлоропластов в популяциях замыкающих клеток устьиц сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / С. И. Малецкий, С. С. Юданова, Е. И. Малецкая // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2013. -Т. 17. - № 1 - С.72-80.

23. Малецкий, С.И. Получение самоопыленных линий у самонесовместимых растений сахарной свеклы / С.И. Малецкий, Э.В. Денисова, А.Н. Лутков // Генетика. - 1970. - Т. 6. - №6. - С. 180-183.

24. Монахос, С.Г. Создание чистых линий - удвоенных гаплоидов капусты в культуре изолированных микроспор и селекция F1-гибридов на основе современных методов биотехнологии: метод. Рекомендации / С.Г. Монахос. - Москва : Изд-во РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева, 2014. - 44 с.

25. Ницше, В. Гаплоиды в селекции растений: научное издание / В. Ницше, Г. Венцель. М. : Колос, 1980. - 128 c.

26. Павлова, М.К. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек: возможности и перспективы / М.К. Павлова // Сельскохозяйственная биология. - 1987. - № 1. - С. 27-31.

27. Подвигина, О.А. Теоретическое обоснование и приемы использования методов биотехнологии в селекции сахарной свеклы: автореф. дис. ... д-ра с/х наук / О.А. Подвигина. - Воронеж, 2003. - 44 с.

28. Пухальский, В.А. Практикум по цитологии и цитогенетике растений: учебное пособие / В.А. Пухальский, А.А, Соловьев, Е.Д. Бадаева, В.Н. Юрцев. - М. : КолосС, 2007. - 198 с.

29. Рыбин, В.А. Цитологический метод в селекции плодовых / В.А. Рыбин. -М. : Колос, 1967. - 3-216 с.

30. Рыжков, В.Л. Полиплоидия и количественно-качественные отношения в генетике / В.Л. Рыжков // Полиплоидия у растений. - М.: АН СССР, 1962. -33-38 с.

31. Стрижова, Ф.М. Растениеводство: учебное пособие / Ф.М. Стрижова, Л.Е. Царева, Ю.Н. Титов. - Барнаул: Изд-во АГАУ, 2008. - 219 с.

32. Тимофеева, О.А. Культара клеток и тканей растений: учебное пособие / О.А. Тимофеева, Н.И. Румянцева. - Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2012. - 91 с.

33. Титова В.И. Использование метода проточной цитометрии для определения плоидности межвидовых гибридов Allium L. / В.И. Титова, Г. Шуман, У. Рушка, Э. Клоке // С.-х. биол. Сер. Биол. раст. 1998. - № 3. - С.76-81.

34. Харечко-Савицкая, Е.И. Вид Beta vulgaris L. как аутостерильное растение / Е.И. Харечко-Савицкая // Свекловодство. - Киев: Госсельхозиздат. - 1940. -С.501-510.

35. Шмыкова, Н.А. Получение удвоенных гаплоидов у видов рода Brassica L. / Н.А. Шмыкова, Д.В. Шумилина, Т.П. Супрунова // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2015. - № 19(1). - С. 111-120.

36. Щербаков, В.К. Полиплоидия и редукция наборов хромосом у растений под влиянием различных факторов и роль ядра и цитоплазмы в этих процессах / В.К. Щербаков // Успехи современной биологии. - 1962. - № 54 (2). - С.146-182.

37. Юданова, С.С. Миксоплоидия клеточных популяций сахарной свеклы и ее связь с репродуктивными признаками: автореф. дис. ... к-та с/х наук. / С.С. Юданова. - Новосибирск, 2004. - 24 с.

38. Юданова, С.С. Связь эпигеномной изменчивости семенной продуктивности при апозиготическом способе размножения сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / С.С. Юданова, Е.И. Малецкая // Досягнения и проблеми генетики, селекции та биотехнологии: збiрник наукових праць. - Юев, Логос. - 2007. -Т. 2. - С.221-225.

39. Юсубов A.M., Мосина Н.Р. Создание полиплоидных форм сахарной свеклы // Полиплоидия в селекции сахарной свеклы. М.: Наука, 1970. - С.120-133.

40. Artschwager, E., Development of flowers and seed in the sugar beet. / E. Artschwager // J. Agr. Res. - 1927. - № 34. P. 1-25.

41. Artschwager, E. The time factor in fertilization and embryo development in the sugar beet / E. Artschwager, R.C. Starrett // J. Agr. Res. - 1933. - № 47. P. 823843.

42. Banba, H., A study of anther culture in sugar beet / H.Banba, H.Tanabe // Bull. Sugar Beet Res. - 1972. - № 14. - P. 9-16.

43. Baranski, R. In vitro gynogenesis in red beet (Beta vulgaris L.): effects of ovule culture conditions. // R. Baranski // Acta Soc. Bot. Pol. Tow. Bot. - 1996. - № 65(1-2) - P. 57-60.

44. Barinova, I. Antirrhinum majus microspore maturation and transient transformation in vitro. / I. Barinova, M. Zhexembekova, E. Barsova, S. Lukyanov, E. Heberle-Bors, A. Touraev // J. Exp. Bot. 53. - 2002. - №11. - P. 19-29.

45. Barinova, J. Regulation of developmental pathways in cultured microspores of tobacco and snapdragon by medium pH. / J. Barinova, C. Clement, L. Marting, F. Baillieul, H. Soukupova, E. Heberle-Bors, A. Touraev // Planta. - 2004. - № 219.

- p. 141-146.

46. Barocka, K.H. Morphogenesis in ovule-derived sugar beet tissues / K.H. Barocka, F. Sievert, R. Nehls // VIth Int. Congress Plant Tissue and Cell Culture / D.A. Somers, B.G. Gengenbach, D.D. Biesboer, W.P. Hackett, C.E. Green (Eds.).

- Univ. Minnesota. - 1986. - P. 403.

47. Bishnoi, U. Anther culture of Recalcitrant indica x Basmati rice hybrids./ U. Bishnoi, R.K. Jain, J.S. Rohilla, V.K. Chowdhury, K. Gupta, R. and J.B. Chowdhury // Euphytica. - 2000. - № 114. - P. 93-101.

48. Bosemark, N. Haploids and homozygous diploids, triploids and tetraploids in sugar beet / N. Bosemark // Hereditas. - 1971. - № 69. P. 193-204.

49. Bossoutrot, D. Gynogenesis in Beta vulgaris L.: From in vitro culture of unpollinated ovules to the production of doubled haploid plants in soil / D. Bossoutrot, D. Hosemans // Plant Cell Rep. - 1985. - № 4. P. 300-303.

50. Bruun, L., The mature embryo sac of the sugar beet, Beta vulgaris: A structural investigation / L. Bruun // Nord. J. Bot. - 1987. - № 7/5. - P. 543-551.

51. Bruun, L. Histological and semiquantitative approaches to in vitro cellular responses of ovules, embryo and endosperm in sugar beet, Beta vulgaris L. / L. Bruun // Sex. Plant Reprod. - 1991. - № 4. - P. 64-72.

52. Buchter-Larsen, A. In situ Induction af Haploide Embryoner pa Sukkerroer efterfulgt af In vitro Embryokultur / A. Buchter-Larsen // Thesis, Acad. Technical Sciences. - Copenhagen, 1986.

53. Butterfass, T. Ploidie und Chloroplastenzahlen / T. Butterfass // Ber. Dtsch. bot. ges. - 1959. - № 72. - P. 440-451.

54. Chu, C.C. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources / C.C. Chu, C.C. Wang, C.S. Sun, K.C. Hsu, K.C. Yin, C.Y. Chu, F.Y. Bi // Scient. Sin. - 1975. - № 18. -P. 659-668.

55. Cristea, O. Effect of carbohydrate type over the microspore embryogenesis at Brassica Oleracea L. / O. Cristea, B. Creola, P. Maria, B. Marian // Romanian Biotechnological Letters. - 2013a. - Vol. 18. - №5 - P. 8677-8684.

56. Cristea, T.O. The influence of pH on microspore embryogenesis of white cabbage (Brassica oleracea L.) / T.O. Cristea // Not Sci. Biol. - 20136. - Vol. 5 -№ 4. - P. 485-489.

57. Custers, J.B.M. Microspore culture in rapeseed (Brassica napus L.). In doubled haploid production in crop plants. / J.B.M. Custers. In M. Maluszynski, 131 K.J. Kasha, B.P. Forster and I.Szarejko // Kluver. - Academic Publisher, 2003. - P. 185-194.

58. D'Halluin, K., Production of haploid sugar beets (Beta vulgaris L.) by ovule culture / K. D'Halluin, B. Keimer // In: Genetic Manipulation in Plant Breeding. Berlin. - 1986.

59. De La Fuente, G.N. Accelerating plant breeding / G.N. De La Fuente, U.K. Frei, T. Lübberstedt // Trends Plant Sci. - 2013. - № 18. - P. 667-672.

60. Dirks, R. Reverse breeding: a novel breeding approach based on engineered meiosis. / R. Dirks [et al.] // Plant Biotechnology Journal. - 2009. - Vol. 7. - № 9. - P. 837-845.

61. Doctrinal, M., In vitro gynogenesis in Beta vulgaris L.: Effects of plant growth regulators, temperature, genotypes and season / M. Doctrinal, R.S. Sangwan, B.S. Sangwan-Norreel // Plant Cell Tissue Organ Cult. - 1989. - №. 17. - P. 1-12.

62. Dubois, F. Do developmental stages of ovules influence in vitro induction of gynogenetic embryos in sugar beet / F. Dubois, P. Lenee, R.S. Sangwan and B.S. Sangwan-Norreel // In: Seeds: Genesis of natural and artificial forms, Le Biopole Vegetal, Amiens. - 1990. - P. 249.

63. Dunwell, J.M. Haploids in flowering plants: origins and exploitation / J.M. Dunwell // Plant Biotechnol. J. - 2010. - Vol. 8. - № 4. - P. 377-424.

64. Dunwell, J.M. Influence of genotype, plant growth temperature and anther incubation temperature on microspore embryo production in Brassica napus ssp. oleifera/ J.M. Dunwell, L.M. Cornish, A.G.F. DeCourcel // J. Expt. Bot. - 1985. -Vol. 36. - P. 679-689.

65. Dwivedi, S.L. Haploids: Constraints and opportunities in plant breeding / S.L. Dwivedi [et al.] // Biotechnol Adv. - 2015 - № 33: -812- 829.

66. Supena, E.D.J. Evaluation of crucial factors for implementing shed-microspore culture of Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L.) cultivars / E.D.J. Supena, W. Muswita., S. Suharsono, J.B.M. Custers // Scientia Horticulturae. -2006. - Vol. 107. - № 3. - P. 226-232

67. Ferrant, V. Origin of gynogenetic embryos of Beta vulgaris L. / V. Ferrant, J. Bouharmont // Sex. Plant Reprod. - 1994. - № 7. - P. 12-16.

68. Ferrie, A. Haploids and doubled haploids in Brassica spp. for genetic and genomic research. / A. Ferrie, C. Möllers // Plant Cell, Tissue Organ Cult. -2011a. - № 104. - P.375-386.

69. Ferrie, A.M.R. Brassica improvement through microspore culture. in: pua e.c., douglas c.j. (eds.) / A.M.R. Ferrie, W.A. Keller // Biotechnology in Agriculture and Forestry, Brassica. - Springer Verlag, Berlin. - 2004. - Vol. 54. - P. 149168.

70. Fischer, H.E. Untersuchungen an Zwillingen von Beta vulgaris L. / H.E. Fischer // Der Züchter. - 1956. - № 26. - P. 136-152.

71. Rank, G.H. A method for positive selection of 4N sugar beet plants in the vegetative Co generation / G.H. Rank, L.E. Evans // J American Society Sugar Beet Technol. 1966. - Vol. 13. - № 8. - P. 687-697

72. Galatowitsch, M.W. Regeneration from unfertilized ovule callus of sugar beet / M.W. Galatowitsch, G.A. Smith // Can. J. Plant Sci. - 1990. - № 70. - P. 83-89.

73. Gamborg, O.L. Nutrient requirement of suspension cultures of soybean root cells / O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima // Exp Cell Res. - 1968. - Vol. 50. - P. 151-158.

74. Gorecka, K. Development of embryoids by microspore and anther cultures of red beet (Beta vulgaris L. subsp. vulgaris) / Gorecka K. [et al.] // J. Cent. Eur. Agric. - 2017. - Vol.18. - 1. - P. 185-195.

75. Goska, M. Haploidy i Podwojone Haploidy Buraka Cukrowego (Beta vulgaris L.) oraz Mozliwosci Ich Wykorzystania w Hodowli : Monografie i Rozprawy Naukowe / M. Goska // Radzikow: Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roslin. -1997.

76. Goska, M., Recent results on obtaining beet haploids through in vitro culture of anthers / M. Goska, J.H. Rogozinska // Biuletyn Inst. Hodowli I Aklimatyzacji Roslin. - 1981. - Vol. 145. - P. 141-143.

77. Goska, M., Suger beet haploids obtained in the in vitro culture / M. Goska // Bull. Polish Acad. Sci. Biol. Sci. - 1985. - Vol. 33. - P. 1-6

78. Goska, M., Histological observations of sugar beet ovules in in vitro cultures / M. Goska, B. Jassem // Bull. Polish Acad. Sci. Biol. Sci. - 1988. - Vol. 36. - P. 171-175.

79. Grigolava, T.R. The effects of sugars and growth regulators on embryo- and callusogenesis in isolated ovules culture of beetroot, Beta vulgaris L. / T.R. Grigolava, A.V. Vishnyakova, A.V. Voronina, O.N. Zubko, S.G. Monakhos // Caspian Journal of Environmental Sciences. 2021. - Vol. 19 - № 5. - P. 10111015.

80. Gurel, S. Doubled haploid plant production from unpollinated ovules of sugar beet (Beta vulgaris L.) / S. Gurel, E. Gurel, Z. Kaya // Plant Cell Rep. - 2000. -Vol. 19. - P. 1155-1159.

81. Hammond, B.L. Homozygous diploid sugar beets / B.L. Hammond // J. Am. Soc. Sugar Beet Technol. - 1966. - № 14. - P. 75-78.

82. Hansen, A.L. Efficient chromosome doubling in Beta vulgaris L. ovule culture / A.L. Hansen [et al.] // Plant Breed. - 1994. - Vol. 112. - P. 89-95.

83. Herrmann, L. Antherenkultur bei Zuckerruben, Beta vulgaris L. var altissima / L. Herrmann, H. Lux // Arch. Zuchtungsforsch. Berlin. - 1988a. - Vol. 18. - 6. - P. 375-383.

84. Herrmann, L., Haploiden-technik bei der zuckerrube / L. Herrmann, C. Wetzel, H. Lux // Potsdam Forsch. B. - 1988b. - Vol. 57. - P. 95-99.

85. Hosemans, D. Induction of haploid plant from in vitro culture of unpollinated beet ovules (Beta vulgaris L.) / D. Hosemans, D. Bossoutrot // Z. Pflanzenzucht. 1983. - Vol. 91. - № 1. - P. 74-77.

86. Indrianto, A. Assessment of various stresses and carbohydrates for their effect on the induction of embryogenesis in isolated wheat microspores / A. Indrianto, E. Heberle-Bors, A. Touraev // Plant Sci. - 1999. - Vol. 143. - P. 71-79.

87. Islam, S.M.S. Enhancement of androgenesis by abiotic stress and other pretreatments in major crop species / S.M.S. Islam, N. Tuteja // Plant Sci. - 2012. - Vol. 182. - P. 134- 144.

88. Jensen, C.J., Chromosome doubling techniques in haploids / C.J. Jensen (Ed.), In: Haploids in Higher Plants: Advances and Potential. - University of Guelph Press, Guelph. - 1974. - P. 153-190.

89. Keimer, B. Induction of haploid sugar beet embryos from ovule culture. Effect of donor plant growth conditions / B. Keimer, H.C. Pedersen // In: 2nd Nordic Symposium on Cell and Tissue Culture, Elsinore, Denmark. - 1988. - P. 27.

90. Keimer, B. Production of haploid sugar beets (Beta vulgaris L.) by ovule culture: preliminary results / B. Keimer, K. D'Halluin // Hereditas. - 1985. Vol. 3 - P. 145-146.

91. Keller, W.A. In vitro production of plants from pollen in Brassica campestris / W.A. Keller, T. Rajhathy, J. Lacapra // Can J Genet Cytol. - 1975. - Vol. 17: - P. 655-665.

92. Kirov, I. An easy "Steam Drop" method for high quality plant chromosome preparation. / I. Kirov [et al.] // Molecular Cytogenetics. - 2014. - Vol. 7. - P. 21.

93. Kiszczak, W. Production of Homozygous Red Beet (Beta vulgaris L. subsp. vulgaris) / W. Kiszczak [et al.] // Plants by Ovule Culture. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) In book: Doubled Haploid Technology. - 2021. - P. 301312.

94. Klimek-Chodacka, M., Comparison of haploid and doubled haploid sugar beet clones in their ability to micropropagate and regenerate / M. Klimek-Chodacka, R. Baranski // Electron. J. Biotechnol. - 2013. - Vol. 16. - № 2 - P. 1-1.

95. Kruse, A. Haploids in polyembryos of beet, Beta vulgaris L. / A. Kruse // Roy. Vet. Agric. Coll. Copenhagen: Yearb. - 1961. - P. 87-98.

96. Levan, A. A haploid sugar beet after colchicine treatment / A. Levan // Hereditas. - 1945. - Vol. 31. - P. 399-410.

97. Lukaszewska, E. Most organs of sugar-beet (Beta vulgaris L.) plants at the vegetative and reproductive stages of development are polysomatic / E. Lukaszewska, E. Sliwinska // Sex. Plant Reprod. - 2007. - № 20. - P. 99-107.

98. Lux, H. Production on haploid sugar beet (Beta vulgaris L.) by culturing unpollinated ovules / H. Lux, L. Herrmann, C. Wetzel // Plant Breed. - 1990. - № 104. - P. 177-183.

99. Magnusson, I. Haploidization of Beta vulgaris through ovule culture / Magnusson I., E. Wremerth-Weich, C.R. Bornman // Hereditas. - 1985. - Vol. 3. - p. 147-148.

100. Maheswari, P., An Introduction to the Embryology of Angiosperms / P. Maheswari. - McGraw-Hill Book Co., New York. - 1950. - P. 468.

101. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures/ T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. - P. 473-497.

102. Navarro-Alvarez, W. Effect of sugars in wheat anther culture media / W. Navarro-Alvarez [et al.] // Plant Breeding. - 1994. - Vol. 112: - P. 53-62.

103. Olesen, P. Structure and variability of embryos, endosperm and perisperm during in vitro culture of sugar beet Beta vulgaris ovules / P. Olesen, E. Buck, B. Keimer // In: Sexual Reproduction in Higher Plants / M. Cristi [et al.]. - Berlin: Springer-Verlag. - 1988. - P. 107-112.

104. Osolnik, B. Stimulation of androgenesis in white cabbage (Brassica oleracea var. capitata) anthers by low temperature and anther dissection / B. Osolnik, B. Bohanes, S. Jelaska // Plant Cell. Tiss. Org. Cult. - 1993. - Vol. 32. - P. 241-246.

105. Palmer, C.E. Utilization of Brassica haploids / C.E. Palmer, W.A. Keller, P.G. Arnison, Eds. S.M. Jain, S.K. Sopory, R.E. Veilleux. // In vitro haploid production in higher plants. Important selected plants. - Dordrecht, Kluwer, 1996. - P. 143-171.

106. Pazuki, A. Gynogenesis Induction in Sugar Beet (Beta vulgaris) Improved by 6-Benzylaminopurine (BAP) and Synergized with Cold Pretreatment / A. Pazuki [et al.] // Sugar Tech. - 2018b. - Vol. 20. - P. 69-77.

107. Pazuki, A. The effects of proline on in vitro proliferation and propagation of doubled haploid sugar beet (Beta vulgaris) / A. Pazuki [et al.] // Turkish J. Bot. 2018a. - Vol. 42. - P. 280-288.

108. Prem, D. A new microspore embryogenesis system under low temperature which mimics zygotic embryogenesis initials, expresses auxin and efficiently

regenerates doubled-haploid plants in Brassica napus / D. Prem [et al.] // BMC Plant Biol. - 2012. - Vol. 12. - P. 127

109. Rommel, M. Some cytogenetic properties of autotetraploid varieties of sugar beet / M. Rommel // Nature. - 1963. - Vol. 198. - P. 13271328.

110. Rudolf, K. Microspore culture of white cabbage, Brassica oleracea var. capitata L.: Genetic improvement of nonresponsive cultivars and effect of genome doubling agents / K. Rudolf, B. Bohanec, M. Hansen // Plant Breeding. -1999. - Vol. 118. - P. 237-241.

111. Sangwan, R.S. Ultrastructural cytology of plastids in pollen grains of certain androgenic and nonandrogenic plants / R.S. Sangwan, B.S. Sangwan-Norreel // Protoplasma. - 1987. - Vol. 138. - P. 11-22.

112. Sathish, P., Rice anther culture. Callus initiation and androclonal variation in progenies of regenerated plants / P. Sathish, O.L. Gamborg, M.W. Nabors // Plant Cell Repts. - 1995. - Vol. 14. - № 7. - P. 432-436.

113. Seman, I. Possibilities of detection and induction of haploids in Beta vulgaris L. / I. Seman // II Biologia (Bratislava). - 1983. - Vol. 38. - P. 1113-1122.

114. Sendra, A.R. Calcium and cell wall dynamics during microspore embryogenesis and doubled haploid production in rapeseed and eggplant: Thesis ... Doctor in Biotechnology / A.R. Sendra. - Valencia, 2017. - P. 235.

115. Shariatpanahi, M.E. Stresses applied for the re- programming of plant microspores towards in vitro embryogenesis. / M.E. Shariatpanahi, U. Bal, E. Heberle- Bors, A. Touraev // Physiol Plant. - 2006. - Vol. 127. - P. 519- 534.

116. Speckmann, G.J. Methods for chromosome doubling in fodder crops / G.J. Speckmann // In Ploidy in Fodder Crops. Report of the Meeting of the Eucarpia Fodder Crop Section / B. Nuesch [et al]. - Ziirich-Reckenholz. - 1975. - P. 9095.

117. Speckmann, G.J. The induction of haploids of sugarbeet (Beta vulgaris L.) using anther and free pollen culture or ovule and ovary culture / G.J. Speckmann, J.P.C. Van Geyt, M. Jacobs // In: Genetic Manipulation in Plant Breeding / W.

Horn, C.J. Jensen, W. Odenbach, O. Schieder. De Gruyter, Berlin. - 1986. - P. 351-353.

118. Svirshchevskaya, A., Production and Performance of Gynogenetic Sugarbeet Lines / A. Svirshchevskaya, J. Dolezel // J. Sugar Beet Res. USA. - 2000. - Vol. 4. - № 37. - P. 117-133.

119. Telmer, C.A. Microspore development in Brassica napus and the effect of high temperature on division in vivo and in vitro / C.A. Telmer, W. Newcom, D.H. Simmonds // Protoplasma. - 1993. - Vol. 172. - P. 154-165.

120. Tomaszewska-Sowa, M. Cytometric analyses of sugar beet (Beta vulgaris L.) plants regenerated from unfertilized ovules cultured in vitro / M. Tomaszewska-Sowa // Plant Breed. - 2010. - Vol. 2. - P. 231-235.

121. Tomaszewska-Sowa, M., Plant Regeneration from Unpollinated Ovules of Sugar Beet (Beta vulgaris L.) on Growing Media with Different Carbohydrates / M. Tomaszewska-Sowa, A.J. Keutgen // Sugar Tech. - 2021.

122. Touraev, A. Efficient microspore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum L.) induced by starvation at high temperatures / A. Touraev [et al.] // Sex Plant Reprod. - 1996. - Vol. 9. - P. 209-215.

123. Van Geyt, J. Induction of nuclear and cell divisions in microspores of sugar beet (Beta vulgaris L.) / J. Van Geyt, K. D'Halluin, M. Jacobs // Z. Pflanzenzuecht - 1985. - Vol. 95. - P. 325-335.

124. Van Geyt, J. In vitro induction of haploid plants from unpollinated ovules and ovaries of the sugarbeet (Beta vulgaris L.) / J. Van Geyt, G.J. Speckmann, K. D'Halluin, M. Jacobs // Theor. Appl. Genet. - 1987. - Vol. 73. - P. 920-925.

125. Wang, Y.G. Studies on the in vitro culture of unpollinated sugar beet (Beta vulgaris L.) ovules and plant regeneration / Y.G. Wang [et al.]. In Rev. Adv. Plant Biotechnology 1985-88: 2nd International Symposium on Genetic Manipulation in Crops. A. Mujeeb-Kazi, L.A. Sitch. - Mexico and Manila. 1989. - P. 69-75.

126. Weber, S. Improved doubled haploid production protocol for Brassica napus using microspore colchicines treatment in vitro and ploidy determination by

123

flowcytometry / S. Weber, W. Ünker, W. Friedt // Plant Breeding. - 2005. - Vol. 124. - P. 511-513.

127. Wedzony, M. Progress in doubled haploid technology in higher plants. / M. Wedzony [et al.], In: A. Touraev, B.P. Forster, S.M. Jain (eds.) // Advances in haploid production in higher plants. Springer. - Dordrecht, Netherlands. - 2009.

- P. 1- 33.

128. Wremerth, W.E. Doubled haploid production of sugar beet (Beta vulgaris L.) / W.E. Wremerth, M.W. Levall // Published protocols for other crop plant species. Doubled Haploid Production in Crop Plants: A Manual. Kluwer Academic Publishers. - 2003.

129. Yang, H.Y. In vitro induction of haploids plants from unpollinated ovaries and ovules / H.Y. Yang, C. Zhou // Theor. Appl. Genet. - 1982. - Vol. 63. - P. 97104.

130. Yuan, S.X. Effects of pH, MES, arabinogalactan-proteins on microspore cultures in white cabbage / S.X. Yuan [et al.] //Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 2012.

- Vol. 110. - P. 69-76.

131. Yudanova, S.S. Epiplastome Variation of the Number of Chloroplasts in Stomata Guard Cells of Sugar Beet (Beta vulgaris L.) / S.S. Yudanova, E.I. Maletskaya, S.I. Maletskii // J. Genet. - 2004. - Vol. 40. - № 7. - P. 930-939.

132. Yudanova, S.S. Mixoploidy and apozygoty in sugar beet (Beta vulgaris L.) / S.S. Yudanova // Sugar Tech. - 2003. - Vol. 5. - № 3. - P. 173-178.

133. Zayachkovskaya, T. Production of Gynogenic Plants of Red Beet (Beta vulgaris L.) in Unpollinated Ovule Culture In Vitro / T. Zayachkovskaya [et al.] // Plants.

- 2021. - Vol. 10. - P. 2703.

134. Zhang, F.L. Inheritance of microspore embryogenic ability in Brassica crops / F.L. Zhang, Y. Takahata // Theor Appl Genet. - 2001. - Vol. 103. - P. 254-258.

135. Zhuzhzhalova, T.P. Biotechnological methods as a tool for efficient sugar beet breeding / T.P. Zhuzhzhalova, E.O. Kolesnikova, E.N. Vasilchenko, N.N. Cherkasova // Vavilov Journal of Genetics and Breeding. - 2020. - Vol. 24. - P. 40-47.

136. Zimmermann, K. Vermendung haploider Pflanzen in der Zuchtung / K. Zimmermann // Ber. Deut. Bot. Ges. - 1953. - Vol. 66. - P. 28-30.

Приложения

Приложение А

Состав питательных сред для производства удвоенных гаплоидов столовой свеклы по Вагашк (1996)

Среда М8 N6

Компоненты среды Концентрация, мг/л

Макроэлементы

N^N03 1650,0 -

КШэ 1900,0 2830,0

СаСЬ- 2Н2О 440,0 166,0

Мв804-7Н20 370,0 185,0

КН2Р04 170,0 400,0

Микроэлементы

^ЭДГА 37,3 37,3

Ее804-7Н20 27,95 27,95

Н3В03 6,2 1,6

Мп804-4Н20 22,3 4,4

7п804-7Н20 8,6 1,5

К1 0,83 0,83

Na2 Мо04- 2Н20 0,25 -

Си804-5Н20 0,025 -

СоС12-6Н20 0,025 -

Органические компоненты

Глицин 2,0 2,0

Мио-инозитол 100 -

Никотиновая кислота 0,5 0,5

Пиридоксин-Н1 0,5 0,5

Тиамин-Н1 1 1

Состав питательных сред бу1, Бу2, буэ, Бу4 для производства удвоенных гаплоидов сахарной свеклы по Wremerth, Ьеуа11 (2003)

Компонент бу1 Бу2 буэ Бу4

ы среды Эмбриоиндукцион ная среда Побегоиндукцион ная среда и среда для размножения Предукореняю щая среда Укореняющ ая среда

А) MS Полная Полная Полная

(основа)

Агароза 5,8 г/л 9 г/л

Агар - 9 г/л 9,5 г/л

В) 80 г/л 20 г/л - -

Сахароза - - 30 г/л 30 г/л

Сахар

С) 6-БАП 1,33 цМ - - -

2,4-0 0,23 цМ - - -

Кинетин - 0,93 цМ 2,32 цМ -

НУК - 0,54 цМ - -

ИУК - - 2,46 цМ 24,6цМ

рН 5,8 5,8 5,8 5,8

Состав питательных сред для культивирования изолированных микроспор

Компоненты среды В5 (Gamborg O.L. et al, 1968) NLN-13 (Lichter R., 1982)

Макроэлементы

KN03 2500 125

CaCl2- 2H2O 150 -

Ca(NO3> 4H2O - 500

KH2PO4 - 125

MgSO4- 7H2O 250 125

KCl 300 -

NaH2PO4- H2O 150 -

(NH4) 2SO4 134 -

Микроэлементы

MnSO4- 4H2O 10,0 25

ZnSO4- 7H2O 2,0 10

H3BO3 3,0 10

KI 2,5 -

Na2MoO4- 2H2O 0,3 0,25

CoCl2- 6H2O 0,025 0,025

CuSO4- 5H2O 0,025 0,025

Источник железа

FeSO4- 7H2O 30,0 -

Na2EDTA- 2H2O 36,0 -

NaFe(III)EDTA - 40,0

Органические вещества

Thiamin- HCl 10,0 0,5

Glycine - 2,0

Nicotiniacad 1,0 5,0 Продолжение приложения В

Piridoxine- HCl 1,0 0,5

Folic asid - 0,5

Biotin - 0,05

Myo-Inositol 100 100

L-Serine - 100

L-Glutamine - 800

Glutatinon - 30

Условия подготовки растений свеклы столовой и их отзывчивость в культуре изолированных семязачатков

№ Образец Характеристика генотипа Условия подготовки Отзывчивость генотипа

1 ДТ 15 Семья ОГ Отзывчивый

2 ЦИТ1-215 Семья ОГ Отзывчивый

3 ДТ 8 Семья ОГ Отзывчивый

4 F1 ЗК2 х П2 Гибрид ОГ Отзывчивый

5 RC х Д2 Гибрид ЗГ Отзывчивый

6 ДТ 12/11 Семья ОГ Не отзывчивый

7 ДТ 18/1 Семья ОГ Не отзывчивый

8 ДТ 23/1 Семья ОГ Не отзывчивый

9 ДТ 23/1 + 23/2 Семья ОГ Не отзывчивый

10 ДТ 27/2 Семья ОГ Отзывчивый

11 ДТ 27/5 Семья ОГ Не отзывчивый

12 ДТ 12 Семья ОГ Не отзывчивый

13 ДТ 12/3 Семья ОГ Не отзывчивый

14 Ф1 Селекционный образец ЗГ Отзывчивый

15 Ф2 Селекционный образец ЗГ Отзывчивый

16 Ф3 Селекционный образец ЗГ Не отзывчивый

17 Экшен F1 Б1-гибрид ОГ Отзывчивый

18 Кестрел Б1-гибрид ОГ Отзывчивый

19 ДТ 123 Семья ОГ Отзывчивый

20 F2 БФ Линия ЗГ Не отзывчивый

Продолжение приложения Г

21 F2 БС Линия ЗГ Отзывчивый

22 ЗК2-1 Инбредная линия ОГ Отзывчивый

23 ДТ №11 Семья ОГ Отзывчивый

24 ДТ 127/3 Семья ОГ Не отзывчивый

25 ДТ 2/3 Селекционный образец ОГ Не отзывчивый

26 Б1 Селекционный образец ОГ Отзывчивый

27 П2 Семья ОГ Отзывчивый

Условия подготовки растений свеклы столовой и их отзывчивость в культуре изолированных микроспор

№ Генотип Группа генотипа Условия подготовки Отзывчивость генотипа

1 RC х Д2 Гибрид ЗГ Отзывчивый

2 ДТ 12/11-6 Семья ОГ Не отзывчивый

3 ДТ 12/11-5 Семья ОГ Отзывчивый

4 ДТ 12/11-10 Семья ОГ Отзывчивый

5 6/1 Семья ОГ Не отзывчивый

6 ДТ 23/1 Семья ОГ Отзывчивый

7 2/11-7 Семья ОГ Отзывчивый

8 ДТ 18/1-1 Семья ОГ Не отзывчивый

9 № 2 р 2/1 Селекционный образец ОГ Не отзывчивый

10 ДТ 12/3/22 Семья ОГ Отзывчивый

11 ДТ 18/1-6 Семья ОГ Отзывчивый

12 ДТ 2/3 Селекционый образец ОГ Не отзывчивый

13 ДТ 12/3-5 Семья ОГ Не отзывчивый

14 ДТ 18/1-7 Семья ОГ Не отзывчивый

15 Б1 Селекционный образец ОГ Отзывчивый

16 П2 Семья ОГ Отзывчивый

17 ДТ 2 Семья ОГ Не отзывчивый