Совершенствование технологии получения удвоенных гаплоидов in vitro для использования в селекции риса подвида japonica тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат наук Савенко, Елена Георгиевна

• Савенко, Елена Георгиевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Савенко, Елена Георгиевна

СОДЕРЖАНИЕ

СТР.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ

(Литературный обзор)

1.1 Метод экспериментального андрогенеза

1.2 Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников

1.3 Развитие пыльника злаковых культур

1.4 Андрогенез in vitro

1.5 Условия успешного культивирования пыльников для

получения дигаплоидных линий

1.6 Предварительная подготовка пыльников

1.7 Среды для культивирования пыльников растений

1.8 Выбор и концентрация фитогормонов

1.9 Выбор сахаров для приготовления питательных сред

1.10 Культура микроспор

1.11 Влияние на регенерацию периодичности пассирования

каллусов и размера экспланта

1.12 Объем культуральных сред и используемых для

культивирования сосудов в культуре тканей риса

1.13 Взаимосвязь между морфологическими характеристиками каллусных тканей злаковых и их способностью регенерировать растения

1.14 Разнокачественность индуцируемых каллусов риса

1.15 Классификация каллуса риса по морфогенетическому потенциалу

1.16 Гистохимический анализ каллуса

1.17 Определение полисахаридных комплексов каллуса

1.18 Цито-гистологический анализ морфогенеза в культуре пыльников

1.19 Генетические факторы, влияющие на эффективность культивирования пыльников

1.19.1 Генотип донорных растений

1.19.2 Различия внутри подвидов

1.20 Создание сортов с использованием гаплоидной селекции

ГЛАВА 2. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Методика культуры пыльников in vitro

2.2 Методика определения плоидности растений

2.3 Методика приготовления гистологических срезов

ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO РИСА ПОДВИДА JAPONIKA L.

(Результаты исследования)

3.1 Состав искусственных питательных сред и эффективность индукции каллусогенеза и регенерации в культуре 42 пыльников риса in vitro

3.1.1 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при ^ различных концентрациях 6-бензиламинопурина (6-БАП)...

3.1.2 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при ^ различных концентрациях сульфата железа (FeSO47H2O)

3.1.3 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при ^ различных концентрациях а-нафтилуксусной кислоты (а-НУК)

3.1.4 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях нитрата серебра

3.1.5 Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях абсцизовой кислоты (АБК)

3.2 Влияние условий культивирования на индукцию каллусогенеза и регенерацию риса

ГЛАВА 4. ПРЯМАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ РИСА

4.1 Состав оптимизированных сред и эффективность их использования в различных гибридных комбинациях

4.2 Корреляция результатов каллусогенеза и регенерации

4.3 Выделение гибридных комбинаций с максимальным каллусогенезом

4.4 Кластеризация гибридных комбинаций по эффективности каллусообразования и регенерации

ГЛАВА 5. ЦИТО - ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПЫЛЬНИКА

И КАЛЛУСА РИСА

5.1 Развитие пыльников риса in vivo

5.2 Изменения тканей стенки пыльника и развитие микроспороцитов in vivo

5.3 Развитие микроспор риса в культуре пыльников in vitro

5.4 Цито-гистологическое изучение андроклинного каллуса

риса

ГЛАВА 6. СОЗДАНИЕ СОРТОВ НА ОСНОВЕ УДВОЕННЫХ

ГАПЛОИДОВ РИСА И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ И

ПРОИЗВОДСТВА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование технологии получения удвоенных гаплоидов in vitro для использования в селекции риса подвида japonica»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Для решения задачи обеспечения населения нашей страны высококачественной крупой риса и сокращения её импорта необходимо повысить урожайность культуры. Наиболее эффективный способ - селекция. Однако, создание новых сортов - длительный процесс, занимающий во времени 10 и более лет. В связи с этим усилия ученых направлены на разработку методов, ускоряющих этот процесс. Одним из них является метод культуры пыльников in vitro, позволяющий в массовом количестве получать гаплоидные растения риса. Эффективность метода зависит от ряда взаимосвязанных условий (генетических, физиологических, внешней среды, минерального и гормонального состава питательной среды, приемов культивирования), каждый из которых оказывает влияние на морфогенетические процессы при культивировании изолированных пыльников и микроспор in vitro. Однако это влияние еще не в полной мере изучено [13]. Разработанные приемы до сих пор не гарантируют получение достаточного для исследований количества линий генплазмы различного происхождения. Тем не менее, культура пыльников in vitro стала важнейшим источником для селекционеров, позволяющим сократить время создания сортов риса, фиксировать рекомбинации.

Актуальность совершенствования метода культуры пыльников in vitro состоит в том, что он позволяет повышать эффективность селекционного процесса: сокращать время на создание сорта, проводить работы круглый год, экономить площади для выращивания исходного материала, повышать коэффициент размножения растений, снижать стерильность гибридов. Применяется он также как один из приемов в методиках для создания гетерозисных гибридов интенсивного типа [7, 11]. Исследования в области культуры пыльников проводятся на многих сельскохозяйственных культурах. Этим методом получены гаплоидные растения более чем у 200 видов, в том числе у пшеницы, ячменя, ржи, риса, картофеля и других культур [13].

Цель научных исследований - совершенствование метода получения в культуре пыльников in vitro удвоенных гаплоидов гибридов риса Oryza sativa L. подвида japonica для использования в селекции.

Задачи исследований:

1. Оптимизировать состав питательных сред для культивирования пыльников: определить концентрации 6-бензиламинопурина (6-БАП), а-нафтилуксусной кислоты (а-НУК), абсцизовой кислоты (AE^, ионов Fe , нитрата серебра (AgNO3), стимулирующие индукцию массового каллусогенеза и регенерацию гибридов риса;

2. Изучить влияние условий культивирования на каллусогенез и регенерацию растений риса;

3. Оценить корреляционные связи между результатами каллусогенеза и регенерацией;

4. Выделить гибридные комбинации риса с максимальным каллусогенезом;

5. Провести цито-гистологические исследования пыльников риса: изучить развитие пыльников риса in vivo (развитие микроспороцитов и изменения в тканях стенки пыльника), развитие микроспор риса в культуре пыльников in vitro. Провести цито-гистологические исследования андроклинного каллуса риса;

6. Создать исходный материал и сорта риса Oryza sativa L. подвида japonica с применением технологии культуры пыльников in vitro.

Научная новизна исследований. Оптимизирован состав индуцирующих питательных сред для культивирования пыльников, стимулирующих регенерацию растений отечественных гибридов риса Oryza sativa L. подвида japonica непосредственно на каллусогенной среде, что позволило усовершенствовать технологию получения удвоенных гаплоидов через культуру пыльников in vitro. Изучены цито-эмбриологические особенности формирования морфогенных структур в культуре пыльников

риса. Установлено, что у гибридов отечественного генофонда процессы морфогенеза идут по пути гемморизогенеза и формирования вторичных эмбриоидов из клеток каллуса. Впервые показано, что в культуре пыльников отечественных гибридов риса инициальными клетками андрогенеза являются только микроспоры. Клетки стенки пыльника в условиях in vitro не способны к каллусо- и эмбриогенезу. С использованием метода культуры пыльников in vitro созданы исходный материал и сорта риса. Научная новизна работы подтверждена тремя патентами и тремя авторскими свидетельствами на сорта риса и заявкой на новый сорт (Водопад).

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработан состав питательных сред для отечественных гибридов риса Oryza sativa L. подвида japónica, позволяющий индуцировать морфогенез непосредственно на каллусогенной среде, что дает возможность сократить технологический цикл регенерации гомозиготных растений на 2-3 месяца, по сравнению с классической схемой культуры пыльников in vitro. Выделены гибридные комбинации, обеспечивающие максимальную эффективность процесса. Цитологически подтверждено, что при культивировании пыльников риса не происходит соматический эмбриогенез из клеток стенок, что позволяет использовать их культуру как надежный метод для регенерации удвоенных гаплоидов. С использованием разработанных методов создано 3 сорта риса: Соната, Ивушка и Привольный 4. Находится на государственном сортоиспытании сорт Водопад.

Основные положения, выносимые на защиту:

- оптимизированный состав питательной среды для индукции процессов регенерации удвоенных гаплоидов в культуре пыльников in vitro гибридов риса подвида japonica;

- влияние условий культивирования на индукцию каллусогенеза и регенерацию;

- корреляционная связь между результатами каллусогенеза и регенерацией;

- гибридные комбинации с максимальным каллусогенезом;

- результаты цито-гистологического исследования формирования пыльника и

андроклинного каллуса риса;

- созданные на основе удвоенных гаплоидов сорта риса подвида japonica.

Степень достоверности и апробация работы. Научные положения, результаты экспериментальных исследований, выводы диссертации оригинальны, обоснованы и получены в лабораторных, вегетационных и полевых опытах, подтверждаются обработкой экспериментальных данных статистическими методами с использованием программ Microsoft Excel, Statistica 6.0.

Основные результаты диссертационной работы рассматривались на заседаниях методической комиссии ФГБНУ «ВНИИ риса» (2003-2015 гг.), также были представлены на научно-практических конференциях: XIX Международном Научном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Селекция и генетика. Эниология. Экология и здоровье», Алушта, 2010 г.; Х Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования, Москва, 2013 г.; XXIII Международном симпозиуме «Охрана био-ноосферы. Эниология. Нетрадиционное растениеводство. Экология и медицина», Симферополь, 2014 г.; XI Международной научно-методической конференции «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия культурных растений», Махачкала, 2014; Международной научно-практической конференции молодых ученых, преподавателей, аспирантов, студентов «Инновационные разработки молодых ученых для агропромышленного комплекса России и стран СНГ», Краснодар, 2014 г.; XI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Москва: Российский университет дружбы народов, 2015 г.; XXIV Международном симпозиуме «Охрана био-ноосферы. Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье», Алушта, 2015 г.; Научно

практической конференции Кубанского отделения ВОГиС «Вклад Вавиловского общества генетиков и селекционеров и инновационное развитие Российской Федерации», Краснодар, КубГАУ, 2015 г.; Всероссийской конференции «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы», Москва, 2016 г.; Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы биотехнологии в растениеводстве», Сочи, 2016 г.; Международной конференции Нижегородской ГСХА, 2016 г.; Международном саммите молодых ученых «Современные решения в развитии с/х науки и производства», Краснодар, 2016 г.

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 50 научных работах, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 146 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 6 глав, заключения, предложений для селекционной практики и производства, содержит 26 таблиц, 47 рисунков и 13 приложений.

ГЛАВА 1. КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙ

(Обзор литературы)

1.1 Метод экспериментального андрогенеза

Метод экспериментального андрогенеза быстро развивается. В настоящее время гаплоидные растения в культуре пыльников in vitro получены более чем у 200 видов культурных растений и практически используются в аналитической селекции рапса, табака, тритикале, риса, ячменя и пшеницы [13, 54, 145]. Вместе с тем у многих видов растений попытки получения андрогенных гаплоидов оказались безуспешны. Для его разработки следует исследовать закономерности индукции андрогенного развития и влияния на этот процесс различных факторов, действие которых очень видоспецифично - предобработки, стадии эксплантации, времени года и условий выращивания донорных растений, питательной среды, условий культивирования пыльников и некоторых других. Важно установить критический период в развитии микроспоры, характеризующийся определенными физиолого-биохимическими событиями, когда возможно осуществить переключение ее развития на путь андрогенеза [1, 31].

Разработка метода получения андрогенных гаплоидов диктуется необходимостью создания гомозиготных линий для классической, гетерозисной и сомаклональной селекции, а также ускорения процесса селектирования сортов, отвечающих современным требованиям производства [80, 81, 82, 83, 87, 91].

Для получения гаплоидных растений из исходно нормальных микроспор и пыльцевых зерен у некоторых видов растений необходима разработка специфических методик для выделения спорогенных комплексов, микроспор из пыльника и их посадка без стенки пыльника в культуру in vitro. Особенно ценна разработка такого метода для культивирования зрелой пыльцы. Это даст возможность регенерации только гаплоидных растений, поскольку в их

образовании не будут участвовать ткани материнского организма — стенки пыльника, что обычно создает дополнительные трудности, так как могут получаться и не гаплоидные регенеранты. Получение гаплоидов вышеуказанными путями представляет собой сложный многоступенчатый процесс, поскольку он связан с изменением детерминации клеток, что в свою очередь связано с дедифференциацией и дифференциацией тканей [62, 87].

Важным направлением в современной селекции является создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к заболеваниям, биотическим и абиотическим стрессовым факторам среды, при сохранении и повышении их продуктивности и качества [100, 101]. Рациональное сочетание методов классической селекции с биотехнологическими методами позволяет решать поставленные задачи за более короткий срок [48, 49, 50, 64, 74].

Культура пыльников in vitro используется для получения из микроспор гаплоидных растений с одинарным набором хромосом. После удвоения числа хромосом за 1 -2 поколения получаются гомозиготные по всем генам фертильные растения, в то время как при традиционных способах селекции на это затрачивается до 10 лет и более [109].

Этот метод изучен на 427 видах растений, которые принадлежат к 88 родам и 33 семействам. Среди них пшеница, рис, кукуруза, ячмень, люцерна, лен, табак, перец, апельсин, яблоня, виноград и другие культуры [13].

1.2 Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников

Одной из важнейших задач селекционной работы является получение генетически стабильных линий как исходного материала для создания гибридов F1. Процесс производства константных линий основан на гибридизации с последующим многократным отбором, использованием инфекционно-провокационных фонов, позволяющим оценить материал на

устойчивость к стрессовым факторам среды. Этот метод достаточно трудоемок и продолжителен. Кроме того, использование ручного труда, незначительное количество получаемых семян и их высокая стоимость являются большим недостатком [12, 14, 83].

Использование культуры in vitro пыльников один из альтернативных путей индуцирования гаплоидных клеток, тканей и константных растений. Использование гаметной технологии дает ряд преимуществ, в частности, позволяет сократить время в создании исходного константного гомозиготного материала и, тем самым, облегчает и ускоряет селекционный процесс [41, 96].

Получение гаплоидных растений из изолированных пыльников может идти по двум направлениям: прямая регенерация зародышей и косвенная -через каллусогенез. В первом случае внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен формируются проэмбриональные структуры, которые при определенных условиях культивирования развиваются в эмбриоиды, дающие начало гаплоидным растениям. Эмбриоиды - зародышеподобные структуры [104]. Во втором - микроспора делится, возникшие в результате этого клетки быстро увеличиваются в размерах и образуют каллус. В результате дальнейшего морфогенеза из этих каллусных клеток регенерируют растения. При этом растения могут иметь разную плоидность - ди-, поли-, гаплоидные. Последние стерильны, но после обработки растений колхицином происходит удвоение числа хромосом, в результате чего можно получить фертильные гомозиготы [31, 124].

Пыльцевой эмбриогенез обусловлен функциональной и структурной детерминацией (процессом определения пути развития клеток на основе блокирования отдельных генов) пыльцевого ядра и клеток гаметофита, поэтому в развитии могут принимать участие: вегетативные, генеративные или оба типа клеток, при их слиянии образуется диплоидный эмбриоид. Для пасленовых культур характерен только эмбриогенез, для злаковых -

образование, как каллусов, так и эмбриоидов. Среди гаплоидов много альбиносов (особенно у злаков). Наибольший выход регенерантов-альбиносов в культуре пыльников, что вызвано, по-видимому, нарушениями развития пыльцы. Причина не установлена, возможно, это результат мутаций в микроспорах при культивировании [53].

Для культуры пыльников используют целые пыльники, стерильно выделенные в определенной фазе развития. Их помещают на твердую питательную среду, либо на поверхность жидкой. В редких случаях культивируют бутоны или соцветия [108, 109].

1.3 Развитие пыльников злаковых культур

Развитие пыльника злаковых культур чётко разграничивается на 3 периода: премейотический, мейотический и постмейотический [4, 86].

В премейотический период формируется стенка пыльника и спорогенная ткань. Завершается он переходом спорогенных клеток в микроспороциты. На этом этапе пыльник состоит из однородных меристематических клеток, окружённых эпидермисом. В результате периклинального деления (периклинальное деление - сопровождается образованием клеточных стенок, ориентированных параллельно поверхности) археспориальной клетки образуются первичная париетальная и спорогенная клетки. Из париетальных в премейотический период формируется стенка пыльника, а спорогенные образуют материнские клетки микроспор (микроспороциты) [35].

В этот же период происходит формирование спорогенной ткани и превращение её клеток в микроспороциты. Спорогенные клетки образуются после периклинального деления археспориальных. Прекращение митоза сопровождается увеличением спорогенных клеток и их ядер в размере. Они превращаются в микроспороциты и вступают в стадию мейоза. В результате двух мейотических делений образуются тетрады гаплоидных микроспор, затем они распадаются на отдельные микроспоры. Дифференциация слоев

стенки пыльника происходит в мейотический и постмейотический периоды развития пыльника. Эндотеций является производным первичного париетального слоя. Средний слой располагается между эндотецием и тапетумом. Количество средних слоев может варьировать за счёт дополнительных периклинальных делений. Средние слои с началом мейоза постепенно дегенерируют. Признаки дегенерации отмечаются во время деления ядер микроспор.

В процессе развития микроспорангиев микроспороциты располагаются в один слой, прилегающий к тапетуму. Тапетум обеспечивает поступление веществ к развивающимся микроспороцитам, микроспорам и пыльцевым зёрнам. Эпидермис пыльника на ранних стадиях имеет клетки правильной формы, деление в них происходят только в антиклинальном направлении (антиклинальное деление - образование клеточной перегородки под прямым углом к поверхности растущего органа). На более поздних стадиях наружная стенка эпидермиса покрывается кутикулой или неравномерно утолщается, клетки увеличиваются, сплющиваются или становятся зубчатыми [86].

В постмейотический период развивается и созревает пыльца. После разобщения из тетрад микроспоры невелики, с ядром в центре клетки и густой цитоплазмой. В дальнейшем пыльцевое зерно и ядро увеличиваются в размере, появляется вакуоль (вакуоль - отдельный компонент сложной высокодифференцированной системы полостей растительных клеток с многообразными функциями, включая запасающие, лизосомные, саморегуляцию и т.д.), ядро перемещается в подстенный слой цитоплазмы, где митотически делится. Образуется небольшая линзовидная генеративная клетка и вегетативная клетка, занимающая остальной объём пыльцевого зерна. Генеративная клетка затем перемещается внутрь вегетативной и в зрелом пыльцевом зерне располагается рядом с её ядром. Вакуоль исчезает, цитоплазма заполняется запасными веществами (белки, крахмал и жиры). Зрелые пыльцевые зёрна двухклеточны или трехклеточны [35].

1.4 Андрогенез in vitro

Андрогенез in vitro является одним из интересных феноменов, заключающемся в формировании растений из микроспоры.

Процессы формирования и культивирования пыльника in vitro приводят к блокированию развития части микроспор по нормальному гаметофитному пути и переходу их к аномальному развитию, в результате которого из каллуса или эмбриоидов образуются растения. В условиях in vitro в ядре включается новая программа, в соответствии с которой и происходит дальнейшее развитие организма. На ядро воздействуют индукторы, дифференцирующие активность генов, репрессию и депрессию различных участков последовательности ДНК [20, 39].

1.5 Условия успешного культивирования пыльников для индуцирования дигаплоидных линий

Наиболее важными условиями успешного культивирования пыльников для индуцирования удвоенных гаплоидов является подбор реагирующего генотипа, условий выращивания донорных растений, стадии развития пыльцевого зерна, предобработки материала, состав питательной среды и способ диплоидизации. Индукция андрогенеза зависит от состояния пыльцы в момент введения ее в культуру. Для получения гаплоидной ткани пыльники рекомендуется эксплантировать в момент первого митоза ядра микроспоры или сразу после его прохождения [106, 107].

На успех культивирования пыльников влияет физиологическое состояние донорного растения, метелки и пыльника. Различия погодных условий в период выращивания донорских растений приводят к тому, что реакция генотипов в культуре пыльников изменяется в разные годы иногда настолько, что в чувствительном генотипе новообразования вообще не появляются. Индукция андрогенеза in vitro при культивировании изолированных пыльников также зависит от ингредиентов в составе

питательной среды (ауксинов, цитокининов, гиббереллинов, абсцизинов, этилена) в определенной концентрации [20, 28, 37, 142].

Основные структуры, которые развиваются в культуре пыльников -эмбриоиды. Это биполярные структуры, по морфологии сходны с зиготичными зародышами, имеют точку роста стебля и корней. Для нормального развития эмбриоидов необходимо наличие в среде ионов железа, лучше в форме с хелатами (Fe ЭДТА). В отсутствие ионов железа проэмбрион развивается только до глобулярной стадии. [111].

На образование гаплоидов влияет генотип, общее состояние растения-донора, стадия развития пыльцы, состав питательной среды с более высокой концентрацией (до 9-12 %) сахарозы в сравнении с MS (Мурасиге и Скуга) и присутствием ионов Fe2+, а также физические условия культивирования микроспор (объем воздуха, спектральный состав света, температура, жидкая среда) [139, 161].

Повышение эффективности метода культуры пыльников in vitro заключается в выявлении сортов, гибридов, линий, обладающих повышенной адроклинной способностью, определении длины метелки или бутона на момент изоляции пыльника, при которой микроспоры являются морфогенными, подборе режима их стерилизации и состава питательной среды для их культивирования [130].

Таким образом, по литературным данным на результативность реализации гаплопродукционной способности оказывает существенное влияние совокупность взаимосвязанных факторов (генетических, физиологических, условий внешней среды, минерального и гормонального состава питательной среды, условий культивирования), каждый из которых оказывает свое определенное влияние на морфогенетические процессы при культивировании изолированных пыльников и микроспор in vitro [10, 25, 33].

Традиционная селекция многих сельскохозяйственных культур сейчас испытывает своего рода кризис, так как потенциал продуктивности растений

в последние годы не растет или темпы ее возрастания значительно снизились. Урожайность, если и увеличивается, то за счет повышения устойчивости вновь создаваемых образцов к стрессовым факторам [27]. Так, потенциал продуктивности растений вновь создаваемых сортов риса методами традиционной селекции в различных регионах мира остается на уровне 10-12 тонн с гектара [24]. Причина в том, что возможность собрать комплекс «лучших» генов, повышающих продуктивность, в одном образце при отборе в поздних поколениях явление более, чем затруднительное. Преодолеть этот барьер можно, используя успехи селекции в сочетании с методами культуры тканей [22].

Культивирование пыльников высокопродуктивных гибридов риса позволяет создать на их основе сорта с такой же продуктивностью, как исходные гибриды, и даже выше. При этом очень значительно сокращается время, необходимое для их создания [23]. Об эффективности использования метода можно судить на примере достижений в биотехнологии Китая, где через культуру пыльников первые сорта риса с использованием гибридов F1 поколения получены ещё в 1975 году. Уже в 1983 году было районировано 28 новых сортов, полученных при помощи данного метода. Среди них Xin-xiu и Wan - keng, выращиваемые на площади 300 и 530 тыс. га соответственно. В настоящее время многие селекционные лаборатории используют методы получения дигаплоидных линий при создании сортов различных сельскохозяйственных культур [99].

Популяции удвоенных гаплоидов нашли широкое применение в молекулярно-генетических исследованиях при маркировании и локализации локусов генов хозяйственно ценных признаков, создании устойчивых к стрессам линий, увеличении генетического разнообразия, повышении озерненности гибридов, закреплении гетерозисного эффекта [8, 22, 26, 92, 133].

Однако до сих пор получение дигаплоидных линий остается процессом трудоемким и малоэффективным. Регенеранты получают в три этапа и при

этом используют 3 типа сред: для индукции каллусообразования и дедифференциации, регенерации растений, образования и развития корней. Для большинства генотипов выход регенерантов не превышает 0,5 % от количества высаживаемых пыльников.

1.6 Предварительная подготовка пыльников

Температурный (±) шок самая важная стадия при культивировании пыльников. Именно она способствует началу деления микроспор и формированию каллуса; холодовая обработка также увеличивает вероятность регенерации из микроспор. Предварительное содержание пыльников при низкой температуре значительно увеличивает как индукцию каллусов, так и выход зеленых растений. Продолжительность воздействия зависит от температуры. Для сортов подвида japónica более эффективно воздействие температуры 50С в течение 7 дней, чем 100С в течение - 10 дней или 130С -10 - 14 дней; для сортов подвида indica: 3-50С в течение 10 дней эффективнее, чем при 6-80С - 10 - 15 дней или при 9-100С - 15- 20 дней. Чем выше температура, тем продолжительнее воздействие, но период её действия также варьирует в зависимости от используемого генотипа. Слишком длительное воздействие низких температур приводит к снижению регенерации зеленых растений и повышению числа альбиносов. Причины положительного воздействия низких температур еще недостаточно выяснены. Предполагается, что оно стимулирует переход большинства микроспор на одноядерную стадию, и обеспечивает благоприятные условия для дальнейшего роста пыльцевых зерен, увеличивая их продолжительность жизни за счет образования белков теплового шока [162]. Стресс необходим для смены фазы в жизненном цикле растения [138]. Оптимальная температура и продолжительность холодовой обработки зависит от генотипа. В различных работах это от 4 до 130С продолжительностью от 7 до 28 дней [135]. В некоторых работах рекомендуется комбинация теплового (350С в

течение от 5 минут до 5 дней) и холодового шока (100С в течение семи дней) [126]. В более поздних работах рекомендуется низкая температура 40С продолжительностью воздействия от 8 до 14 дней [158].

Есть сообщения о возможности использования центрифугирования в качестве стресса. При этом варьируется как продолжительность центрифугирования, так и его режимы. Полученные результаты показали большую эффективность этого приема по сравнению с ранее предложенными. Показано, что каллусогенез в этом случае несколько ниже, но количество получаемых зеленых регенерантов при использовании центрифугирования выше [150, 153].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Савенко, Елена Георгиевна, 2017 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алешин, Е.П. Исследования по биотехнологии и молекулярной биологии риса / Е.П. Алешин, П.Н. Харченко, Л.А. Кучеренко, Э.Р. Авакян, Н.Е. Алешин / Тез. докл. Междунар. совещания по с.-х. биологии. - Краснодар: Краснодарский с.-х. биотехнологический центр, 1988. - С. 3-4.

2. Анапияев, Б.Б. Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы: дисс. докт. с.-х. наук. - Алматы, 2001.

3. Атабекова, А.И. Цитология растений / А.И. Атабекова, Е.И. Устинова / М.: Колос, 1980. - С. 105-176.

4. Батыгина, Т.Б. Хлебное зерно. Атлас / Т.Б. Батыгина / Л.: Наука, 1987. -102 с.

5. Батыгина, Т.Б. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции / Т.Б. Батыгина / Генеративные органы цветка, 1994. -Т.1. -С.120-121.

6. Беккужина, С.С. Гаплоидные технологии в ускоренном создании исходных форм и линий яровой мягкой пшеницы, устойчивость к засухе и Septoria nodorum berk: автореф. докт. с.-х. наук. - М., 2011. - 42 с.

7. Бельская, Г.Б. Получение гаплоидов белокочанной капусты с помощью культуры пыльников для создания гетерозисных гибридов интенсивного типа / Г.Б. Бельская, Т.В. Семашко / Проблемы селекции овощных культур. - Минск, 1997. - С. 17-20.

8. Белянская, С.Л. Морфогенез в клонах риса, резистентных к стрессовым факторам / С.Л. Белянская, З.Б. Шамина, Л.А. Кучеренко / Физиология растений, 1994. - Т. 41. - № 4. - С. 573-577.

9. Блажний, Е. С. Почвы дельты реки Кубани и прилегающих пространств / Е.С. Блажний / Краснодар: Кн. изд-во, 1971. - 276 с.

10. Бондарева, Л.Л. Научное обоснование и разработка системы методов селекции и семеноводства капустных культур: автореф. докт. с.-х. наук, 2009. - 36 с.

11. Бунин, М.С. Использование биотехнологических методов для получения исходного селекционного материала капусты / М.С. Бунин, Н.А. Шмыкова / М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2004. - 44 с.

12. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко // М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. -160 с.

13. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных клеток и тканей в селекции растений / Р.Г. Бутенко, Г.И. Тихонович [и др.] / Основы сельскохозяйственной биотехнологии, 1990. - С.162-165.

14. Бутенко, Р.Г. Технология массового получения регенерантов из соматических тканей in vitro / Р.Г. Бутенко / М., 1970. - С. 154-228.

15. Власов, В.Г. Морфогенез в культуре изолированных пыльников риса: цитолого-гистологический анализ / В.Г. Власов, Е.Г. Савенко // Рисоводство, 2010. - №16. - С.26-29.

16. Власов, В.Г. К вопросу об андрогеном гаплоидном эмбриогенезе риса / В.Г. Власов, Е.Г. Савенко / Сб. тезисов. - Алушта, 2008. - №5 - С.574-575.

17. Власов, В.Г. Цитологическое и гистологическое изучение пыльника риса / В.Г. Власов, Е.Г. Савенко / Рисоводство, 2009. - №14. - С.20.

18. Власов, В.Г. Цитолого-гистологический анализ андроклинного каллуса риса в онтогенезе / В.Г. Власов, Е.Г. Савенко // Сб. научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов». - Киев, 2010. -Т.9. - С.138-142.

19. Габедава, Л.Ш. Цитология грузинских тетраплоидных пшениц и их гибридов: автореф. дисс. к.б.н. - Тбилиси, 1976. - 32 с.

20. Гамбург, К.З. Ауксины в культурах тканей и клеток растений / К.З. Гамбург, Н.И. Рекославская, С.Г. Швецов / Новосибирск: Наука, 1990. -С.243.

21. Голованова, И.В. Индукция гаплоидов тритикале в культуре пыльников / И.В. Голованова, А.Ю. Прибытков // АПК Сибири, Монголии и Республики Казахстан в XXI веке - Новосибирск, 2001. - С. 126-127.

22. Гончарова, Ю.К. Метод закрепления гетерозисного эффекта -реализация на растениях (К столетию со дня рождения В.А. Струнникова) / Ю.К. Гончарова / Научный журнал: Онтогенез. М.: Наука, 2014. - Т.45. - №6. - С.442-446.

23. Гончарова, Ю.К. Наследование признака "отзывчивость на культуру пыльников" у риса / Ю.К. Гончарова / Вестник Российской академии с.-х.н. - М., 2008. - № 2. - С. 40-42.

24. Гончарова, Ю.К. Природа гетерозисисного эффекта / Ю.К. Гончарова, Е.М. Харитонов, Е.В. Литвинова / Доклады РАСХН. - М., 2010. - №4. -С. 10-12.

25. Гончарова, Ю.К. Причины низкого выхода регенерантов в культуре пыльников / Ю.К. Гончарова, Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина / Материалы междунар. научно-практич. конф. «Актуальные проблемы, научное обеспечение и перспективы развития рисоводства в 21 веке. -Краснодар, 2003. - С. 34-37.

26. Гончарова, Ю.К. Способность к каллусообразованию и регенерации зеленых растений у гибридов с различной величиной гетерозисного эффекта / Ю.К. Гончарова, Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина / Материалы междунар. симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Т.2 - Пущино, 2005. - С.236-239.

27. Гончарова, Ю.К., Харитонов Е.М. Генетические основы повышения продуктивности риса / Ю.К. Гончарова, Е.М. Харитонов // ООО «Просвещение ЮГ», Краснодар, 2015. - 314 с.

28. Давоян, Э.И. Оптимизация условий культивирования изолированных пыльников риса / Э.И. Давоян, Е.Г. Кучменко (Е.Г. Савенко), Г.А. Сингильдин // С/х биология. - М., 1988. - №4. - С.69-71.

29. Данилова, Т.В. Оптимизация методики получения гаплоидов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) в культуре пыльников in vitro и возможности их использования в селекции: автореф. дисс. к.б.н. - М.: Изд-во МСХА, 2000. - 16 с.

30. Данилова, Т.В. Свойства линий дигаплоидов яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) полученных в культуре пыльников in vitro / Т.В. Данилова, Н.Н. Скорняков // С/х биотехнология, под ред. акад. РАСХН Шевелухи

B.C. - М.: Воскресенье, 2001. - Т. II. - С. 151-162.

31. Дитченко, Т.И. Культура клеток, тканей и органов растений / Т.И. Дитченко / Курс лекций. - Минск, БГУ, 2007. - 102 с.

32. Долгих, Ю.И. Стимуляция морфогенеза в культуре тканей растений под действием антиоксиданта / Ю.И. Долгих, А.Ю. Степанова, С.В. Трусова, Н.В. Чичкова, А.Б. Вартапетян / Физиология растений. - С-П., 2001. -

C.219.

33. Домблидес, Е.А. Разработка методов индукции андрогенеза у различных видов капусты: автореф. канд. с.-х. наук, 2001. - 153 с.

34. Епифанович, Н.В. Методическая схема контроля гаметного происхождения регенерантов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) / Н.В. Епифанович, С.В. Гаркуша, Ж.М. Мухина, Е.Г. Савенко и др. / Материалы докл., сообщений ФГБНУ «ВНИИФ», Большие Вязёмы, 2016. - Т.1. - С. 449-45.

35. Ивановская, Е.В. Цитоэмбриологическое исследование дифференцировки клеток растений / Е.В. Ивановская / М., 1983. - 152 с.

36. Исмагул, А. Анализ методов гомозиготизации материала в селекции и разработка протоколов культуры изолированных микроспор казахстанских сортов пшеницы / А. Исмагул, С. Елибай, Б.М.

Башабаева, А.И. Абугалиева / Вестник КазНУ, серия биологическая, 2012. - №2(54). - С. 17-23.

37. Калинин, Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук / Киев: Наукова думка, 1980. - С.145-243.

38. Костылев, П.И. Северный рис (генетика, селекция, технология) / П.И. Костылев, А.А Парфенюк, В.И. Степовой / Ростов-на-Дону. ЗАО «Книга»; 2004. - 450 с.

39. Красникова, О.В. Генетические аспекты решения проблемы повышения выхода хлорофильных пыльцевых регенерантов риса / О.В. Красникова, Э.Р. Авакян, Н.Е. Алешин, П.Н. Харченко, Е.П. Алешин / Докл. ВАСХНИЛ. - М., 1991. - С. 13-14.

40. Круглова, Н.Н. Морфогенетический потенциал спорогенных клеток пыльника злаков / Н.Н. Круглова, Т.Б. Батыгина, О.А. Сельдимирова / М.: РУДН, 2008. - С.21.

41. Кучеренко, Л.А. Каллусогенез, выход и характеристика регенерирующих растений риса в культуре тканей в зависимости от гормонального состава индукционной среды / Л.А. Кучеренко / Доклад РАСХН. - М., 1993. - №4. - С.3-6.

42. Кучеренко, Л.А. Морфологическая разнокачественность каллусных тканей риса и ее связь с регенерационной способностью / Л.А. Кучеренко // Физиология растений, 1993. - Т. 40. - С. 797-801.

43. Кучеренко, Л.А. Морфологическая разнокачественность каллусных тканей риса и ее связь с регенерационной способностью / Л.А. Кучеренко, Н.А. Долотова, В.Г. Власов // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. Междунар. конф. - Новосибирск, 2 -6 авг. 1988. - С. 115.

44. Кучеренко, Л.А. Подходы к разработке технологии массовой регенерации растений in vitro / Л.А. Кучеренко // Биотехнология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С. 232-242.

45. Кучеренко, Л.А О возможности применения методов культуры изолированных органов и тканей в селекции риса / Л.А. Кучеренко, П.Н. Харченко, Э.И. Давоян // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. - М.: Колос, 1979. -С. 31-38.

46. Кучеренко JI.A. Условия получения растений-регенерантов в культуре тканей риса / JI.A. Кучеренко // Сельскохозяйственная биология. 1984.-№4.-с. 70-72.

47. Либберт, Э. Физиология растений / Э. Либберт // М.: Мир, 1976. - С.353-370.

48. Май Дык Чунг. Совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса (brassica napus l.) и белокочанной капусты (brassica oleracea l.) in vitro: автореф. дис. к.б.н. - М., 2010.

49. Малышева, Н.Н. Комплексная оценка дигаплоидных линий риса / Н.Н. Малышева, Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / Материалы Международного АгроБизнес Форума «Развитие сельскохозяйственного производства в условиях Таможенного союза» 15-17 октября 2010 года. -Кызылорда, 2010. - С.67-71.

50. Малышева, Н.Н. Получение, оценка и отбор дигаплоидных линий риса с хозяйственно-ценными признаками / Н.Н. Малышева, Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / Рисоводство, 2012. - Т.21. - С. 14-18.

51. Методические указания «Анатомия риса» // ВНИИ риса, 1982. - 110 с.

52. Морозова, С.Е. Продолжительность сохранения регенерационной способности у каллусов пшеницы / С.Е. Морозова / М.: Наука, 1991. - С. 256-258.

53. Муромцев, Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев / М.: Агропромиздат, 1990.

54. Ницше, В. Гаплоиды в селекции растений / В. Ницше, Г. Венцель / перевод с анг. В.В. Попова. - М.: Колос, 1980. - С. 127.

55. Остапенко, Н.В. Использование метода культуры пыльников для создания сортов / Н.В. Остапенко, Е.Г. Савенко, Л.А. Шундрина, В.А. Глазырина / Рисоводство, 2006. - №8. - С.15-17.

56. Остапенко, Н.В. Использование явления андроклинии для создания сортов риса / Н.В. Остапенко, Е.Г. Савенко, Л.А. Шундрина, В.А. Глазырина, В.А. Дзюба / Сб. тезисов. - Алушта, 2006. - №15. - С.320-321.

57. Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева // М.: Колос, 1974. - 284 с.

58. Размахнин, Е.П. Влияние различных сред на выход каллюсов, эмбриоидов, альбиносных и зеленых растений в культуре пыльников пырея сизого Agropyron glaucum и удлиненного Agropyron е1о^аШт / Е.П. Размахнин, Д.М. Туллер, С.Н. Велиев и др. / Онтогенетика высших растений: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. (17-18 октября 1989). -Кишинев: Штиинца, 1989. - С. 342.

59. Размахнин, Е.П. Применение гаплоидной биотехнологии и оригинальных биостимуляторов в отдаленной гибридизации пшеницы и пырея / Е.П. Размахнин, В.М. Чекуров // Тр. междунар. конф. «Отдаленная гибридизация. Состояние и перспективы развития», посвященной 105-летию со дня рождения акад. Н.В. Цицина. - Москва, 16-17 декабря 2003. - М.: Изд. МСХА, 2003б. - С. 208-212.

60. Размахнин, Е.П. Эффективность получения гомозиготных линий пырея сизого методом инбридинга и андрогенеза т vitro / Е.П. Размахнин, В.М. Чекуров / Тр. междунар. науч.-практ. конф. «Инновационные

технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур». - Москва, 7-9 августа. 2006а.

61. Ралдугина, Г.Н. Генотипические различия при действии абсцизовой кислоты на каллусные культуры Brassica napus L. / Г.Н. Ралдугина, Г.И. Соболькова // Физиология растений, 1994. - Т.41. - С. 702-706.

62. Рахинбаев, И.Р. Биотехнология зерновых культур / И.Р. Рахинбаев, Ж. Тивари, Н.К. Бишимбаева, С.В. Кушнаренко, Е.Д. Азимов // Алма-ата: Гылым, 1992. - С.40.

63. Савенко Е.Г. Система прямой регенерации растений риса в культуре пыльников in vitro / Е.Г. Савенко / IX международный симпозиум "Нетрадиционное растениеводство. Экология и здоровье". - Алушта, Крым, 3-10 сентября 2000, С.125

64. Савенко, Е.Г. Использование метода культуры пыльников in vitro для создания генетического разнообразия у риса / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина, Ж.М. Мухина / сборник научно практической конференции Кубанского отделения ВОГиС «Вклад Вавиловского общества генетиков и селекционеров и инновационное развитие Российской Федерации». - Краснодар, КУБГАУ, 22 марта -2015. - С.57-60

65. Савенко, Е.Г. Прямая регенерация интактных растений риса методом андрогенеза in vitro / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, В.Г. Власов / - Отчет РФФИ, 2004, - 21 С.

66. Савенко, Е.Г. Разработка модельной системы прямой регенерации растений риса в культуре пыльников / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Ж.М. Мухина, Л.А. Шундрина / Сб. тезисов Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология". -Саратов, 9-13 сентября, 2003. - С.107

67. Савенко, Е.Г. Разработка системы прямой регенерации растений / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Ж.М. Мухина / Рисоводство. - Краснодар, 2002. - №1. - С.19.

68. Савенко, Е.Г. Прямая регенерация у гибридов риса методом андрогенеза in vitro / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина / Материалы XIII Международного симпозиума «Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье». - Алушта, 2004. Книга I. - С. 412.

69. Савенко Е.Г. Влияние фитогормонов на процессы прямой регенерации растений из пыльников риса/ Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина. // Рисоводство, Краснодар, 2003. - N3. - С.34-38.

70. Савенко, Е.Г. Каллусогенез и регенерация гибридов риса при различных концентрациях абсцизовой кислоты (АБК) / Е.Г. Савенко, Э.Н. Кострюкова, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / Рисоводство. -Краснодар, 2017. - № 2(35), - С.46-50

71. Савенко, Е.Г. Прямая регенерация интактных растений / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина / Материалы научно-практической конференции «Развитие инновационных процессов в рисоводстве». - Краснодар, 2005, - 285с.

72. Савенко, Е.Г. Способность к каллусообразованию и регенерации зеленых регенерантов у гибридов риса / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина / Сб. конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». - Пущино, 2005, Т.2 - С.236-239.

73. Савенко, Е.Г. Влияние генотипа в культуре пыльников риса in vitro / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / Рисоводство, 2011. - Т.19. -С. 31-33.

74. Савенко, Е.Г. Использование методов in vitro для получения исходного селекционного материала / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / Рисоводство, 2012. - Т.20. - С. 13-16.

75. Савенко, Е.Г. Оптимизация питательных сред, стимулирующих массовый морфогенез у различных генотипов риса / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / Краснодар: КубГАУ, 2009. - Материалы научно-практической конференции Кубанского отделения ВОГис «Роль ВОГис в современном научном мире» 18-19 марта 2009. - С.105-106.

76. Савенко, Е.Г. Создание холодостойких сортов риса с использованием метода культуры пыльников т vitro / Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / Вклад ВОГиС в решение проблем инновационного развития России. - Краснодар, 2012. - С. 136-141

77. Савенко, Е.Г. Разработка прямой регенерации растений риса т vitro / Е.Г. Савенко, Ж.М. Мухина. / II Международная научная конференция "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". -М., 18-19 октября 2000. - С.239.

78. Савенко, Е.Г. Влияние концентрации 6-бензиламинопурина на каллусогенез и регенерацию у гибридов риса / Е.Г. Савенко, Э.Н. Кострюкова, В.А. Глазырина, Ю.К. Гончарова / ВНИИ с.-х. биотехнологии. - XVII Всероссийская молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». -М., 6-7 апреля 2017. - С.122 - 124.

79. Савенко, Е.Г. Цито-гистологический анализ морфогенеза в культуре изолированных пыльников риса / Е.Г. Савенко, В.Г. Власов // Рисоводство, 2011. - Т.18. - С.19-22.

80. Скаженник, М.А. Создание холодостойкого исходного материала риса для селекции сортов в рамках консорциума стран с умеренным климатом / М.А. Скаженник, Н.В. Воробьев, В.А. Дзюба, И.Н. Чухирь, Е.Г. Савенко, Т.С. Пшеницына / Зерновое хозяйство России, 2014. - №5 (35). - С.11-17.

81. Скаженник, М.А. Оценка и создание исходного материала риса, различающегося по холодостойкости / М.А. Скаженник, Н.В. Воробьев,

B.А. Дзюба, И.Н. Чухирь, Т.С. Пшеницына, Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / Материалы Х международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. -М.: Изд-во Российского университета дружбы народов. - Пущино, 17-21 июня 2013. - Т. II. - С. 120-123.

82. Скаженник, М.А. Использование ДНК-технологий для создания и улучшения исходного материала при селекции холодостойких сортов риса / М.А. Скаженник, В.А. Дзюба, В.С. Ковалев, Е.В. Дубина, Е.Г. Савенко, Т.С. Пшеницына / Зерновое хозяйство России, 2016. - №5(47).-

C.22-28.

83. Скаженник, М.А. Оценка и создание исходного материала риса, устойчивого к низким положительным температурам / М.А. Скаженник, Н.В. Воробьев, И.Н. Чухирь, Т.С. Пшеницына, Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / Материалы Х междунар. Научно-методической конференции, посвященной памяти академика РАСХН Немцева Николая Сергеевича «Интродукция нетрадиционных и редких растений». - Ульяновск: УлГТУ, 2012. - Т.2. - С.195-197.

84. Сорока, А.И. Разработка биотехнологических основ создания селекционно-ценного материала масличных культур»: дисс. доктора с.-х. наук. - Институт масличных культур НААН Украины. - 316 с.

85. Суханов, В.М. К использованию андроклинных растений в селекции пшеницы. / В.М. Суханов /Доклады ВАСХНИЛ, 1982. - Т. 11. - С. 7-8.

86. Тутаюк, В.Х. Анатомия и морфология растений / В.Х. Тутаюк // М.: Высшая школа, 1980. - 315 с.

87. Тюкавин, Г.Б. Биотехнологические основы селекционной технологии моркови фаисш carota L.): автореф. дис. д.б.н. - М., 2007. - 27 с.

88. Фурст, Г.Г. Методы анатомо-гистологического исследования растительных тканей / Г.Г. Фурст // М.: Наука, 1979. - С.42, 60-61, 63-64, 73, 93-97, 100, 104-105, 114-115.

89. Хайлакян, М.Х. Регуляция цветения высших растений / М.Х. Хайлакян // М.: Наука, 1988. - 510 с.

90. Хан, Н. Получение анеуплоидных и гетероплоидных растений в культуре пыльников / Н. Хан / Современные достижения молекулярной биологии хромосом и клеток. Алма-Ата, 1989. - С.71-81.

91. Харитонов, Е.М. Создание холодостойких сортов риса в рамках консорциума стран с мереным климатом / Е.М. Харитонов, М.А. Скаженник, Н.В. Воробьев, В.А. Дзюба, И.Н. Чухирь, Т.С. Пшеницына, Е.Г. Савенко, В.А. Глазырина, Л.А. Шундрина / IV съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированные генетические симпозиумы. - Ростов-на-Дону, 15-20 июня 2014 г. - С.7.

92. Харитонов, Е.М. Генетика признаков, определяющих адаптивность риса (ORYZA SATIVA L.) к абиотическим стрессам / Е.М. Харитонов, Ю.К. Гончарова, Е.А. Малюченко // Экологическая генетика, 2015. - Т 13. - № 4. - С. 37-54.

93. Харченко, П.Н. Диплоидизация гаплоидов риса / П.Н. Харченко, Е.Г. Савенко, П. Датта, Д. Кумар // Рис России, 1997. - Т. 5. - №5(13). - С. 3.

94. Харченко, П.Н. Питательная среда для культивирования пыльников / П.Н. Харченко, Н.Е. Алешин, Э.Р. Авакян, Е.П. Алешин, И.Г. Воронков / Патент Н 1676256 от 15.04.1993.

95. Харченко, П.Н. Питательная среда для культивирования пыльников риса / П.Н. Харченко, Н.Е. Алешин, Э.Р. Авакян, Е.П. Алешин, Н.Г. Воронков / Авторское свидетельство H1678256. Открытия, изобретения, 1991. Н35. - С.6(2).

96. Хохлов, С.С. Гаплоидия и селекция / С.С. Хохлов, B.C. Тырнов, Е.В. Гришина / М.: Наука, 1976. - 221 с.

97. Хохлов, С.С. Гаплоидия у покрытосемянных растений / С.С. Хохлов, Е.В. Гришина, М.И. Зайцева, B.C. Тырнов, Н.А. Малышева-Шишкинская // Саратов: Изд-во Саратовского университета, 1970. - Ч.1. - 140 с.

98. Чекуров, В.М. Эффект применения регуляторов роста в получении андрогенных линий пырея сизого Agropyron glaucum / В.М. Чекуров, Е.П. Размахнин, Т.М. Размахнина // Матер. I Междунар. конгр. «Биотехнология - состояние и перспективы развития». - Москва, 14-18 октября, 2002. - С. 130-131.

99. Чеченева, Т.Н. Изменчивость злаков в культуре in vitro в процессе регенерации растений / Т.Н. Чеченева // Физиология и биохимия культурных растений, 2006. - №38 (2). - С.163-171.

100. Чеченева, Т.Н. Культура in vitro селекции кукурузы с целью улучшения белкового состава зерновых / Т.Н. Чеченева // Биотехнология, 1997. -№6. - С.25-29.

101. Чеченева, Т.Н. Повышение регенерационной способности инбредных линий кукурузы in vitro / Т.Н. Чеченева // Цитология и генетика, 1997. -31(№2). - С.36-39.

102. Чистякова, В.Н. Гаплоиды неполных пшенично-пырейных амфидиплоидов, мягкой пшеницы и ячменя: получение и использование: автореф. дисс. д.б.н. - Нимчиновка 1, Московская область, 2000. - 58 с.

103. Шамина, З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор / З.Б. Шамина // Культура клеток растений. - М., 1981. - С. 124-136.

104. Шаяхметов, И.Ф. Культура клеток и тканей пшеницы in vitro и соматический эмбриогенез: автореф. д.б.н. - С.-П., 2001. - 219 с.

105. Шаяхметов, И.Ф. Формирование соматических эмбриоидов в суспензионной культуре клеток пшеницы в присутствии АБК / И.Ф. Шаяхметов, Ф.М. Шакирова // Физиология растений, 1996. - Т.43. - С. 101-103.

106. Шевелуха, В.С. Морфогенез в каллусных тканях / В.С. Шевелуха // Сельскохозяйственная биотехнология, 1996. - С.29-35.

107. Широков, А.И. Основы биотехнологии растений / А.И. Широков, Л.А. Крюков / Уч.-методич. пособие. - Нижний Новгород, 2012. - 49 с.

108. Шмыкова, Н.А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на ускорение селекционного процесса овощных культур: автореф. дис. д.с.-х.н. - М., 2006. - 44 с.

109. Шумилина, Д.В. Методы получения гаплоидных и дигаплоидных растений перца в культуре пыльников и микроспор / Д.В. Шумилина, Н.А. Шмыкова // Сельскохозяйственная биология, М., 2001. - №5. - С.56-61.

110. Эзау, К. Анатомия семенных растений / К. Эзау // М.: Мир, 1980. - Кн.1 и 2. - 248 с. и 258 с.

111. Электронное учебно-методическое пособие // Нижний Новгород, 2012. -49 с.

112. Эльконин, Н.А. Диплоидизация в культуре гаплоидных тканей сорго: роль экспланта и гормонального состава среды / Н.А. Эльконин, Т.Н. Гудова // Биол. основы селекции. - Саратов, 1991. - С.9-17.

113. Abe, Т. Varietal Difference of Plant Regeneration from Root Callus Tissues in Rice / Т. Abe, Y. Futsuhara // Japan. J. Breed., 1984. - V.34. - №2. - P.147.

114. Andersen, S.B. Carrot (Daucus carota L.): In vitro production of haploids and field trails / S.B. Andersen, I. Christiansen, B. Faresteit // Biotechnology in Agriculture and Foresty, 1990. - V. 12(6). - P. 393-402.

115. Baenziger, J.U. The Plasma Proteins / J.U. Baenziger // Academic Press, Oriando, Florida, 1984. - V.4. - P.271-315.

116. Bajaj, S. Efficient plant regeneration from long-term callus cultures of rice by spermidine / S. Bajaj, M. Rajam // Plant Cell Repts., 1995. - V.14. - №11. -P.717-720.

117. Benson, E.E. Do Free Radicals Have a Role in Plant Tissue Culture Recalcitrance / E.E. Benson // In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant., 2000. - V. 36. - P. 163-170.

118. Blaydes, D.F. Interaction of kinetin and various inhibitors in the growth of soybean tissue / D.F. Blaydes // Physiol Plant., 1966. - V.19. -Р. 748 - 753.

119. Chen, L.J. Medium evaluation for rice anther culture / L.J. Chen, P.C. Lai, C.H. Liao and H.S. Tsay // Plant Tissue Culture, Tokyo, 1982. - P. 551 - 552.

120. Chen, Y. Investigation on the induction and genetic expression of rice pollen plants / Y. Chen, L.C. Li, R.E. Wang, S.Y. Li, W.Z. Tian and S.W. Zeng // Scientia Sinica -1974.- V.17.- P. 209- 226.

121. Chen, C.C. In vitro development of plant from microspores of rice / C.C. Chen // In vitro, 1977.-V.13. - P.484 - 489.

122. Chekurov, V.M. Effect of inbreeding and growth regulators on the in vitro androgenesis of wheatgrass, Agropyron glaucum / V.M. Chekurov, E.P. Razmakhnin // Plant Breeding., 1999. - V. 118. - P. 571-573.

123. Chuang, Ch.-Ch. A set of potato media for wheat anther culture / Ch.-Ch. Chuang, T.-W. Ouyang // Proc. Symp. on Plant Tissue Culture. Peking: Sci. Press, 1978. - P. 51-56.

124. Christianson, M.L. Organogenesis in vitro as a developmental process / M.L. Christianson, D.A. Warnick // Horticultural Science, 1988. - V.23. - № 3. -P.515-119.

125. Dabba, K. Эмбриогенез и регенерация растений из микроспор индийского и японского риса / K. Dabba, and J. Petrykus // Plant Seine, 1990. - V.67. - P.88.

126. Gabriela, T. The effects of cold-pretreatment, auxins and carbon source on anther culture of rice / T. Gabriela, M. Uriel, S. Guadalupe, A. De Jes'us S'anchez, B. Mart'mez Bonfil, M. Rodr'iguez-Monroy & A. Jim'enez-Aparicio / Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2002. - V.71. - Р. 41-46.

127. Gorecka, K. Plant regeneration from carrot (Daucus carota L.) anther culture derived embryos / K. Gorecka, D. Krzyzanowska, W. Kiszczak, U. Kowalska //Acta Physiol Plant., 2009. - V. 31. - P.1139-1145.

128. Herrmann, R.G. The presence of DNA in ribosome-deficient plastids of heat-bleached rye leaves / R.G. Herrmann, J. Feierabend / Eur J. Biochem, 1980. -V.104. - Р.603-609.

129. Hess, W.R. Chlorophyl synthethase and chloroplast tRNAglu are present in heat-bleached, ribosome-deficient plastids / W.R. Hess, M. Blank-Huber, B. Fieder, T. B'orner, W. R'udiger / J. Plant Physiol., 1992. - V.139. - Р.427-430.

130. Heyser, J.M. Long-term plant regeneration, somatic embryogenesis and green spot formation in secondary oat (Avena sativa) callus / J.M. Heyser, N.W. Nabors // Z. Pflanzenphysiol., 1982. - V.107. - №.3. - P.153-160.

131. Hu, K.L. Haploid plant production in carrot (Daucus carota L.) / K.L. Hu, S. Matsubara, K. Murakami // J. Japan. Hort. Sci., 1993. - V. 62(3). - Р.561-565.

132. Hu, T.C. Improvement of isolated microspore culture / T.C. Hu, K.J. Kasha / Канада, Университет Гельф, 2001. - V. 52(359).

133. Hua, J.P. Genetic dissection of an elite rice hybrid revealed that heterozygotes are not always advantageous for performance / J.P. Hua, Y.Z. Xing, C.O. Xu, X.L. Sun, S.B. Yu, Q. Zhang // Genetics., 2002. - V. 162. - P. 1885-1895.

134. Kowalska, U. Cytological a ssessment of c arrot p lants o btained / U. Kowalska, D. Rybaczek, D. Krzyzanowska, W. Kiszczak, K. Gorecka // Polish Academy of Sciences, Cracow, 2008.

135. Kasha, K.J. Haploids in Cereal improvement: anther and microspore culture // K.J. Kasha, A. Ziauddin, U.H. Cho // In: Gustafson JP (ed) Gene manipulation in plant improvement. - Plenum Press, New York, 1990. - P. 213-235.

136. Khanna, H.K. Genotype x culture medium interaction effects on regeneration response of three indice rice cultivars / H.K. Khanna, S.K. Raina // Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1998. - V. 52. - Р. 145-153.

137. Lee, S.Y. Production of doubled haploids through anther culture of MI rice plants derived from mutagenized fertilized egg cells / S.Y. Lee, J.I. Cheong, T.S. Kim // Plant Cell Repts., 2003. - V.22. -№ 3. - P. 218-223.

138. Guohui, M. Achievements and development of hybrid rice in China / M. Guohui and Y. Longping /Abstracts 4th International Symposium on Hybrid rice, 2002. - P. 22.

139. Mascswaran, M. Influence of genotypes and culture media on callus induction and plant regeneration in Oryza species / M. Mascswaran, S.R. Rangasamy // J. Genet. Breedg., 1989. - V.43. - №3. - P.165-170.

140. Matsubara, S. Callus formation and regeneration of adventitious embryos from carrot, fennel and mitsuba microspores by anther and isolated microspore cultures / S. Matsubara, N. Dohya, K. Murakami // Acta Horticult., 1995. - V. 392. - P.129-137.

141. Mehran, E. Stresses applied for the re-programming of plant microspores towards in vitro embryogenesis / E. Mehran, Shariatpanahi, U. Bal, E. Heberle-Bors and A. Touraev // Physiologia Plantarum, 2006. - V.127. -P.519-534.

142. Murashige, I. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture / I. Murashige, F. Skoog // Plant Phyziol., 1962. - V.15. - P.473-479.

143. Nishi, T. Occurence of various ploidy plants from anther and ovary culture of rice plant / T. Nishi, S. Mitsuoka // Japan J. Genet., 1969. - V. 44. - №6. - P. 341-346.

144. Novak, F.J. Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration in Zea mays L. / F.J. Novak, M. Dolezelova, M. Nesticky, A. Piovarci // Maydica, 1983. - V. 28. - P. 381-390.

145. Pickering, R.A. Haploid production: approaches and use in plant breeding / R.A. Pickering, P. Devaux / In: Barley: genetics, biochemistry, molecular biology and biot echnology / P.R. Shewry (ed.) Oxford, 1992. - P.519-547.

146. Reddy, V.S. Influence of genotype regeneration from wheat anther and barley microspore culture using phenylacetic acid (PAA) / V.S. Reddy, S. Leelavathis & S.K. Sen // Plant Cell Rep., 1985. - V. 11. - P.489-498.

147. Rihova, L. Influence of 2,4-D and lactose on pollen embryogenesis in anther culture of potato / L. Rihova, J. Tupi // Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1996. -V.45. - P.259-264.

148. Sanchez, R. Age-dependent responsiveness to cell differentiation stimulus in maize callus culture / E. Sanchez, M. Vargas, R. Aguilar et al. // Plant Physiol. Biochem., 1988. - V.26. - №.6. - P.723-732.

149. Scott, P. Initiation of embryogenesis from cultured barley microspores: a further investigation into the toxic effects of sucrose and glucose / P. Scott, R.L. Lyne / Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1994. - V. 37. - P. 61-65.

150. Tanaka, M. The effect of centrifugal treatment on the emergence of plantlets from cultured anther of tobacco / M. Tanaka // Jpn. J. Breed., 1973. - V. 23. -P.171-174.

151. Touraev, A. Microspore embryogenesis and in vitro pollen maturation in tobacco / A. Touraev, E. Heberle-Bors // In: Hall RD (ed) Methods in molecular biology: Plant cell culture protocols. Humana Press Inc. Totowa, NJ, 2009. -V. 111. - P. 281-291.

152. Touraev, A. Efficient microspore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum L.) induced by starvation at high temperatures / A. Touraev, A. Indrianto, I. Wratschko, O. Vicente, E. Heberle-Bors // Sex Plant Reprod., 1996. - V. 9. -P.209-215.

153. Touraev, A. The microspore: a haploid multipurpose cell / A. Touraev, M. Pfosser, E. Heberle-Bors // Adv. Bot. Res., 2001. - V. 35. - P.53-109.

154. Touraev, A. Initiation of microspore embryogenesis by stress / A. Touraev, O. Vicente, E. Heberle-Bors // Trends Plant Sci., 1997. - V. 2. - P. 297-302.

155. Vasil, V. Somatic embryogenesis in longterm callus cultures of Zea mays L. (Gramineae) / V. Vasil, I. Vasil, L. Chin-vi // Amer. J. Bot., 1984. - V.71. -№1. - P. 158-161.

156. Wang, J.J. Effects of in vitro culture conditions on the occurrence of albino seedlings derived from rice pollens / J.J. Wang, J.S. Sun, Z.Q. Zhu // Asta Botan. Sinica., 1977. - V.18. - P.190-199.

157. Xie, J.H. Improved isolated microspore culture efficiency in medium with maltose and optimized growth regulator combination in japonica rice (Oryza sativa) / J.H. Xie, M. Gao, Q. Cai, X. Sheng, Y. Shen & Z. Liang / Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1995. - V. 42. - P. 245-250.

158. Xie, J.H. The effect of cool-pretreatment on the isolated microspore culture and the free amino acid change of anthers in Japonica Rice (Oryza sativa L.) / J.H. Xie, M.W. Gao, Z.Q. Liang, Q.Y. Shu, X.Y. Cheng & Q.Z. Xue // J. Plant Physiol., 1997. - V.151. - P.79-82.

159. Yoshida, R. Cool temperature-induced chlorosis in rice plants: II. Effects of cool temperature on the expression of plastid-encoded genes during shoot growth in darkness / R. Yoshida, A. Kanno, T. Kameya // Plant Phyiol., 1996b. - V. 112. - P. 585-590.

160. Zheng, M.Y. Production of doubled haploids in wheat (Triticum aestivum L.) through microspore embryogenesis triggered by inducer chemicals / M.Y. Zheng, W. Liu, Y. Weng, E. Polle, C.F. Konzak / In: Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (eds). - Doubled haploid production in crop plants, a manual. - Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 2003b. - P.83-94.

161. Zhuo, L.S. Phenylacetic acid stimulation of direct choot formation in anther and somatic tissue cultures of rice (Oryza sativa) / L.S. Zhuo, S.H. Cheng and Z.X. San // Plant Breeding., 1996. - V.115. - P.295-300.

162. Lantos, C. Isolated microspore culture of wheat (Triticum aestivum L.) with Hungarian cultivars / C. Lantos, S. Paricsi, A. Zofajova, J. Weyen, J. Pauk // Acta Biologica Szegediensis http://www.sci.u-szeged.hu/ABS, 2006. -V.50 (1-2). - P.31-35.