Участие малой ГТфазы ARF6 в канцерогенезе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Книжник, Анна Вадимовна

• Книжник, Анна Вадимовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Книжник, Анна Вадимовна

Введение.

1. Обзор литературы. Малая ГТФаза Arf6.

1.1 Структура белков Arf.

1.2 Регуляция активности Arf6.

1.3 Функции Arf6 в клетках.

1.3.1 Arf6 и подвижность. Racl.

1.3.2 Arf6 и цитокинез.

1.3.3 Arf6 в метаболизме фосфолипидов. PLD.

1.3.4 Arf6 и эндоцитоз.

1.3.5 Arf6 и канцерогенез.

2. Материалы и Методы.

2.1 Клеточные линии.

2.2 Образцы тканей.

2.3 Выделение нуклеиновых кислот.

2.3.1 Выделение плазмидной ДНК.

2.3.2 Выделение РНК из образцов тканей легкого.

2.3.3 Выделение фрагментов ДНК для клонирования из агарозных гелей.

2.4 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях.

2.5 Молекулярное клонирование.

2.5.1 Получение компетентных клеток Е. coli.

2.5.2 Трансформация компетентных клеток E.coli.

2.5.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами.

2.5.4 Реакция лигирования.

2.6 Обратная транскрипция РНК.

2.7 Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.8 Трансфекция и получение ретровирусных частиц.

2.9 Инфицирование клеток.

2.10 Анализ белков.

2.10.1 Приготовление клеточных лизатов.

2.10.2 Приготовление лизатов из образцов тканей легкого.

2.10.3 Вестерн-блот гибридизация.

2.10.4 Анализ активности PLD.

2.10.5 Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеаз.

2.10.6 Анализ желатиназной активности.

2.10.7 Анализ активности иРА.

2.11 Исследование клеточных характеристик в культурах in vitro.

2.11.1 Анализ динамики роста клеток.

2.11.2 Анализ клеточной подвижности методом «зарастания раны» in vitro (wound healing assay).

2.11.3 Тест на образование колоний в условиях разреженной популяции.

2.11.4 Тест на образование колоний в полужидкой среде.

2.11.5 Тест на движение по градиенту концентраций факторов роста.

2.11.6 Тест на инвазию in vitro.

2.12 Определение спонтанной метастатической активности.

2.13 Статистическая обработка результатов.

2.14 Растворы, реагенты и среды.

3. Результаты.

3.1 Получение ретровирусных векторов и клеточных линий, экспрессирующих различные варианты белка Arf6.

3.2 Исследование характеристик полученных клеточных линий в культуре in vitro.

3.2.1 Исследование динамики роста полученных культур.

3.2.2 Анализ способности к колониеобразованию в условиях разреженной популяции (клоногенность).

3.2.3 Анализ способности к неприкрепленному росту.

3.2.4 Исследование миграционной способности полученных клеточных линий ("wound healing assay").

3.2.5 Анализ движения по градиенту концентрации ростовых факторов.

3.2.6 Анализ инвазивных свойств полученных клеточных линий.

3.3 Анализ активности секретируемых протеаз, ремоделирующих ВКМ.

3.3.1 Анализ уровня секреции матриксных металлопротеаз (ММР).

3.3.2 Анализ уровня секреции урокиназа-подобного активатора плазминогена (иРА)

3.4 Идентификация сигнального пути Arf6-PLD-mTOR-S6Kl.

3.4.1 Экспрессия активного Arf6 приводит к стимуляции активности PLD.

3.4.2 АгГб-зависимая стимуляция PLD активирует mTOR-S6K сигнальный путь.

3.5 Исследование влияния Arf6 на фосфорилирование основных митоген-активируемых киназ.

3.6 Исследование спонтанной метастатической активности (СМА) полученных клеточных линий.

3.7 Получение АгАб-производных клеточных линий HET-SR RalAV23 и HET-SR RalBV23.

3.8 Исследование спонтанной метастатической активности (СМА) полученных клеточных линий.

3.9 Анализ экспрессии Arf6 и RalA в образцах HMPJI.

Обсуждение.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие малой ГТфазы ARF6 в канцерогенезе»

Белок Arf6 относится к семейству малых G-белков Arf, входящему в состав суперсемейства малых ГТФаз Ras. В то время как в отношении большинства малых ГТФаз накоплен огромный экспериментальный материал, доказывающий их участие в злокачественной трансформации клеток, Arf6 долго оставался «в тени» более известных G-белков. Однако за последние годы появилось множество данных, указывающих на важнейшую роль Arf6 в ключевых аспектах жизнедеятельности клетки, таких как везикулярный транспорт, реорганизация цитоскелета, цитокинез, изменение липидного состава мембран и др. Все больше внимания стало уделяться белкам Arf, в частности Arf6, и в аспекте канцерогенеза. Тем не менее, до сих пор опубликованы лишь единичные работы, исследующие участие Arf6 в опухолевой прогрессии и метастазировании и механизмы, это участие опосредующие. Так, роль непосредственно Arf6 в процессе метастазирования исследовалась лишь в одной работе на линии меланомы человека LOX, где показано, что сигнальный каскад Arf6—>PLD—^ERKl/2—>Racl регулирует процесс инвазии клеток меланомы in vivo (Muralidharan-Chari et al, 2009b). Среди возможных механизмов, определяющих участие Arf6 в канцерогенезе, чаще всего рассматривается АгГб-зависимое изменение цитоскелета и подвижности, а также изменения в эндоцитозе ряда белков, например pi-интегринов, р-катенинов и ряда GPCR. Менее понятной остается роль Arf6 в метаболизме липидов и участие этой ГТФазы во внутриклеточных сигнальных путях. Одним из основных кандидатов на роль эффектора Arf6, влияющего на изменение внутриклеточной передачи сигнала, является PLD (фосфолипаза D). Участие Arf6 в активации PLD показано в нескольких работах последнего времени (Grodnitzky et al, 2007; Begle et al, 2009). PLD продуцирует важнейшие вторичные мессенджеры, РА (фосфатидную кислоту) и холин, которые участвуют в регуляции многих процессов, таких как эндоцитоз, реорганизация мембраны, миграция и др. Таким образом, активация PLD представляется одним из важнейших механизмов, опосредующих участие Arf6 в самых различных аспектах канцерогенеза и опухолевой прогрессии.

Данная работа посвящена исследованию роли Arf6 в изменении основных биологических характеристик трансформированных клеток, а также участия этой малой1 ГТФазы в модуляции внутриклеточных сигнальных путей, ассоциированных с опухолевой прогрессией. В последние годы появилось несколько работ, обнаруживающих Аг£6-зависимую активацию ERK1/2, ключевой MAP киназы Ras-Raf-MAPK сигнального пути, где показано, что Arf6 активирует ERK1/2 PLD-зависимо (Li et al., 2006; Muralidharan-Chari et al., 2009a, b). В то же время, до сих пор не исследовалось влияние Arf6 на активацию других MAP киназ, а также на другие сигнальные пути, связанные с активностью PLD.

В данной работе впервые исследовано влияние Arf6 на MAP киназу р38, а также на киназу S6K1. Для изучения влияния Arf6 на различные функциональные характеристики трансформированных клеток in vivo, а также на молекулярно-биологические характеристики клеток in vitro, была выбрана клеточная линия эмбриональных фибробластов сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Waterh) HET-SR. Ранее на данной клеточной линии в лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов ГУ РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН показано, что основным, путем, опосредующим модулирующие метастазирование свойства H-Ras, является Ras-RalGDS-Ral зависимый путь (Tchevkina et al., 2005). PLD является одним из эффекторов Ral (Jiang et al., 1995), и, как ранее показано в нашей лаборатории, взаимодействие PLD с Ral является необходимым для Ral-опосредованной стимуляции метатазирования (диссертация н.с. В.А. Рыбко, 2009). Согласно некоторым литературным данным, активация PLD требует совместного участия белков Arf6 и RalA.

В отличие от RalA, экспрессия которого исследовалась при некоторых онкопаталогиях, данные об экспрессии Arf6 в опухолях человека практически отсутствуют. Для исследования возможной роли Arf6 в патогенезе опухолей человека нами проведен анализ его экспрессии в образцах HMPJI (немелкоклеточный рак легкого).

Таким образом, поскольку Arf6 влияет на многие важнейшие внутриклеточные процессы, претерпевающие перестройки в ходе злокачественной трансформации, изучение роли Arf6 в регуляции внутриклеточной передачи сигнала и патогенезе опухолей человека, в частности при таком распространенном заболевании как HMPJI, представляет большой интерес и научно-практическую значимость.

Целью данной работы являлось: Исследование влияния малой ГТФазы Arf6 на ключевые биологические свойства трансформированных клеток в культуре in vitro и метастатическую активность in vivo, а также на активацию отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, ассоциированных с опухолевой прогрессией.

В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. На основе клеточной линии HET-SR (RSV трансформированные фибробласты хомяка) получить производные линии, стабильно экспрессирующие различные формы белка Arf6: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную, не способную взаимодействовать с PLD.

2. Изучить основные биологические свойства клеток HET-SR, экспрессирующих различные формы Arf6, в культуре in vitro: скорость пролиферации, подвижность, инвазивность, клоногенность и способность к неприкрепленному росту.

3. Исследовать влияние различных форм Arf6 на протеолитическую активность внеклеточных протеаз ММР1,2,9 и иРА, активность PLD, а также на статус фосфорилирования основных MAP киназ (ERK1/2, р38 и JNK1) и киназ Akt и S6K1.

4. Получить клеточные линии, экспрессирующие одновременно активные формы белков Ral (RalA и RalB) и белок Arf6 как в активной, так и в доминантно-негативной форме.

5. Сравнить уровень спонтанной метастатической активности всех полученных клеточных линий in vivo.

6. Провести анализ экспрессии белков Arf6 и RalA в образцах HMPJI человека.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Книжник, Анна Вадимовна

Выводы

1. На основе линии HET-SR получена панель новых клеточных линий, экспрессирующих различные формы белка Arf6: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную и не способную взаимодействовать с PLD. Кроме того, получены линии с одновременной экспрессией белков Ral (RalA и RalB) с Arf6 (конститутивно-активной и доминантно-негативной формой).

2. Обнаружено, что экспрессия всех исследованных форм Arf6 приводит к усилению клоногенности клеток; активная форма Arf6, также как и Arf6 дикого типа, увеличивает скорость пролиферации.

3. Отсутствие взаимодействия между Arf6 и PLD снижает подвижность клеток, но стимулирует их инвазивность в экспериментах in vitro, что коррелирует с увеличением протеолитической активности иРА.

4. Впервые показана АгАб-зависимая активация киназы S6K1 и идентифицирован Arf6—»PLD—»mTOR—>S6K1 сигнальный путь.

5. Впервые обнаружено АгАб-зависимое фосфорилирование киназы р38; показано, что Arf6 приводит к PLD-зависимой активации ERK1/2. I

6. Показано, что экспрессия различных форм Arf6 не изменяет уровень СМА полученных клеточных линий in vivo и не влияет на Ral-зависимое повышение СМА при одновременной экспрессии с белками RalA и RalB.

7. Впервые исследована экспрессия мРНК Arf6 при HMPJI и показано, что в 90% образцов (как АК, так и ПКРЛ) наблюдается падение уровня мРНК в опухоли по сравнению с «условной нормой».

8. Обнаружена статистически значимая корреляция снижения экспрессии белка RalA с отсутствием регионарных метастатических узлов при ПКРЛ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Книжник, Анна Вадимовна, 2010 год

1. Зборовская, И.Б. и Татосян, А.Г. (2004) Молекулярные маркеры различных стадий развития немелкоклеточного рака легкого. Мол. Биология 38: 1-12.

2. Зуева, Е.С., Чевкина Е.М., Кимхи, А. и Татосян, А.Г. (2002) Подавление метастатического потенциала клеток трансформированных онкогеном v-src как результат активности экзогенной DAP киназы. Мол. Биология 36: 472-479.

3. Вalasubramanian,N., Meier,J.A., Scott,D.W., Norambuena,A., White,M.A., and Schwartz,M.A. (2009) RalA-Exocyst Complex Regulates Integrin-Dependent Membrane Raft Exocytosis and Growth Signaling. Curr Biol 20: 75-79.

4. Balasubramanian,N., Scott,D.W., Castle,J.D., Casanova,J.E., and Schwartz,M.A. (2007) Arf6 and microtubules in adhesion-dependent trafficking of lipid rafts. Nat Cell Biol 9: 1381-1391.

5. Begle,A., Tryoen-Toth,P., de,B.J., Bader,M.F., and Vitale,N. (2009) ARF6 regulates the synthesis of fusogenic lipids for calcium-regulated exocytosis in neuroendocrine cells. J Biol Chem 284: 4836-4845.

6. Berven,L.A., and Crouch,M.F. (2000) Cellular function of p70S6K: a role in regulating cell motility. Immunol Cell Biol 78: 447-451.

7. Bodempudi,V., Yamoutpoor,F., Pan,W., Dudek,A.Z., Esfandyari,T., Piedra,M. et al. (2009) Ral overactivation in malignant peripheral nerve sheath tumors. Mol Cell Biol 29: 3964-3974.

8. Boshans,R.L., Szanto,S., van,A.L., and Souza-Schorey,C. (2000) ADP-ribosylation factor 6 regulates actin cytoskeleton remodeling in coordination with Racl and RhoA. Mol Cell Biol 20: 3685-3694.

9. Brown,H.A., Gutowski,S., Moomaw,C.R., Slaughter,C., and Sternweis,P.C. (1993) ADP-ribosylation factor, a small GTP-dependent regulatory protein, stimulates phospholipase D activity. Cell 75: 1137-1144.

10. Burnett,Р.Е., Barrow,R.K., Cohen,N.A., Snyder,S.H., and Sabatini,D.M. (1998) RAFT1 phosphorylation of the translational regulators p70 S6 kinase and 4E-BP1. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 1432-1437.

11. Carracedo,A., Ma,L., Teruya-Feldstein,J., Rojo,F., Salmena,L., Alimonti,A. et al. (2008) Inhibition of mTORCl leads to МАРК pathway activation through a PI3K-dependent feedback loop in human cancer. J Clin Invest 118: 30653074.

12. Casanova,J.E. (2007) Regulation of Arf activation: the Sec7 family of guanine nucleotide exchange factors. Traffic 8: 1476-1485.

13. Chen,Y., Rodrik,V., and Foster,D.A. (2005) Alternative phospholipase D/mTOR survival signal in human breast cancer cells. Oncogene 24: 672-679.

14. Claing,A., Chen,W., Miller,W.E., Vitale,N., Moss,J., Premont,R.T., and Lefkowitz,R.J. (2001) beta-Arrestin-mediated ADP-ribosylation factor 6 activation and beta 2-adrenergic receptor endocytosis. J Biol Chem 276: 42509-42513.

15. Cotton,M., Boulay,P.L., Houndolo,T., Vitale,N., Pitcher,J.A., and Claing,A. (2007) Endogenous ARF6 interacts with Racl upon angiotensin II stimulation to regulate membrane ruffling and cell migration. Mol Biol Cell 18: 501-511.

16. Daher,Z., Noel,J., and Claing,A. (2008) Endothelin-1 promotes migration of endothelial cells through the activation of ARF6 and the regulation of FAK activity. Cell Signal 20: 2256-2265.

17. Dass,K., Ahmad,A., Azmi,A.S„ Sarkar,S.H., and Sarkar,F.H. (2008) Evolving role of uPA/uPAR system in human cancers. Cancer Treat Rev 34: 122-136.

18. Doherty,G.J., and McMahon,H.T. (2009) Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem 78: 857-902.

19. Donaldson,J.G. (2003) Multiple roles for Arf6: sorting, structuring, and signaling at the plasma membrane. J Biol Chem 278: 41573-41576.

20. Donaldson,J.G., Porat-Shliom,N., and Cohen,L.A. (2009) Clathrin-independent endocytosis: a unique platform for cell signaling and PM remodeling. Cell Signal 21: 1-6.

21. Exton, J.H. (2002) Regulation of phospholipase D. FEBS Lett 531: 58-61.

22. Eyster,C.A., Higginson,J.D., Huebner,R., Porat-Shliom,N., Weigert,R., Wu,W.W. et al. (2009) Discovery of New Cargo Proteins that Enter Cells through Clathrin-Independent Endocytosis. Traffic.

23. Farooqui,R., Zhu,S., and Fenteany,G. (2006) Glycogen synthase kinase-3 acts upstream of ADP-ribosylation factor 6 and Racl to regulate epithelial cell migration. Exp Cell Res 312: 1514-1525.

24. Fielding,A.B., Schonteich,E., Matheson,J., Wilson,G., Yu,X., Hickson,G.R. et al. (2005) Rabl 1-FIP3 and FIP4 interact with Arf6 and the exocyst to control membrane traffic in cytokinesis. EMBO J 24: 3389-3399.

25. Foster,D.A. (2007) Regulation of mTOR by phosphatidic acid? Cancer Res 67: 1-4.

26. Foster,D.A., and Xu,L. (2003) Phospholipase D in cell proliferation and cancer. Mol Cancer Res 1: 789-800.

27. Galandrini,R., Micucci,F., Tassi,I., Cifone,M.G., Cinque,В., Piccoli,M. et al. (2005) Arf6: a new player in FcgammaRIIIA lymphocyte-mediated cytotoxicity. Blood 106: 577-583.

28. Gillingham,A.K., and Munro,S. (2007) The small G proteins of the Arf family and their regulators. Annu Rev Cell Dev Biol 23: 579-611.

29. Goldfinger,L.E., Ptak,C., Jeffery,E.D., Shabanowitz,J., Hunt,D.F., and Ginsberg,M.H. (2006) RLIP76 (RalBPl) is an R-Ras effector that mediates adhesion-dependent Rac activation and cell migration. J Cell Biol 174: 877888.

30. Grodnitzky,J.A., Syed,N., Kimber,M.J., Day,T.A., Donaldson,J.G., and Hsu,W.H. (2007) Somatostatin receptors signal through EFA6A-ARF6 to activate phospholipase D in clonal beta-cells. J Biol Chem 282: 13410-13418.

31. Hashimoto,S., Hashimoto,A., Yamada,A., Onodera,Y., and Sabe,H. (2005) Assays and properties of the ArfGAPs, AMAP1 and AMAP2, in Arf6 function. Methods Enzymol 404: 216-231.

32. Hashimoto,S., Onodera,Y., Hashimoto,A., Tanaka,M., Hamaguchi,M., Yamada,A., and Sabe,H. (2004) Requirement for Arf6 in breast cancer invasive activities. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 6647-6652.

33. Honda,A., Nogami,M., Yokozeki,T., Yamazaki,M., Nakamura,H., Watanabe,H. et al. (1999) Phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase alpha is a downstream effector of the small G protein ARF6 in membrane ruffle formation. Cell 99: 521-532.

34. Hong,J.H., Oh,S.O., Lee,M., Kim,Y.R., Kim,D.U., Hur,G.M. et al. (2001) Enhancement of lysophosphatidic acid-induced ERK phosphorylation by phospholipase D1 via the formation of phosphatidic acid. Biochem Biophys Res Commun281: 1337-1342.

35. Hoover,H., Muralidharan-Chari,V., Tague,S., and Souza-Schorey,C. (2005) Investigating the role of ADP-ribosylation factor 6 in tumor cell invasion and extracellular signal-regulated kinase activation. Methods Enzymol 404: 134147.

36. Hornberger,T.A., Chu,W.K., Mak,Y.W., Hsiung,J.W., Huang,S.A., and Chien,S. (2006) The role of phospholipase D and phosphatidic acid in the mechanical activation of mTOR signaling in skeletal muscle. Proc Natl Acad SciUS A 103:4741-4746.

37. Houndolo,T., Boulay,P.L., and Claing,A. (2005) G protein-coupled receptor endocytosis in ADP-ribosylation factor 6-depleted cells. J Biol Chem 280: 5598-5604.

38. Hu,B., Shi,В., Jarzynka,M.J., Yiin,J.J., Souza-Schorey,C., and Cheng,S.Y. (2009) ADP-ribosylation factor 6 regulates glioma cell invasion through the IQ-domain GTPase-activating protein 1-Racl-mediated pathway. Cancer Res 69:794-801.

39. Ikeda,S., Ushio-Fukai,M., Zuo,L., Tojo,T., Dikalov,S., Patrushev,N.A., and Alexander,R.W. (2005) Novel role of ARF6 in vascular endothelial growth factor-induced signaling and angiogenesis. Circ Res 96: 467-475.

40. Inoue,H., and Randazzo,P.A. (2007) Arf GAPs and their interacting proteins. Traffic 8: 1465-1475.

41. Jackson,T.R., Brown,F.D., Nie,Z., Miura,K., Foroni,L., Sun,J. et al. (2000) ACAPs are arf6 GTPase-activating proteins that function in the cell periphery. J Cell Biol 151: 627-638.

42. Jenkins,G.M., and Frohman,M.A. (2005) Phospholipase D: a lipid centric review. Cell Mol Life Sci 62: 2305-2316.

43. Jiang,H., Luo,J.Q., Urano,T., Frankel,P., Lu,Z., Foster,D.A., and Feig,L.A. (1995) Involvement of Ral GTPase in v-Src-induced phospholipase D activation. Nature 378: 409-412.

44. Jing,J., Tarbutton,E., Wilson,G., and Prekeris,R. (2009) Rabll-FIP3 is a Rabl 1-binding protein that regulates breast cancer cell motility by modulating the actin cytoskeleton. Eur J Cell Biol 88: 325-341.

45. Kahn,R.A., Cherfils,J., Elias,M., Lovering,R.C., Munro,S., and Schurmann,A. (2006) Nomenclature for the human Arf family of GTP-binding proteins: ARF, ARL, and SAR proteins. J Cell Biol 172: 645-650.

46. Kahn,R.A., and Gilman,A.G. (1986) The protein cofactor necessary for ADP-ribosylation of Gs by cholera toxin is itself a GTP binding protein. J Biol Chem 261:7906-7911.

47. Kam,Y., and Exton,J.H. (2001) Phospholipase D activity is required for actin stress fiber formation in fibroblasts. Mol Cell Biol 21: 4055-4066.

48. Kang,Y.S., Zhao,X., Lovaas,J., Eisenberg,E., and Greene,L.E. (2009) Clathrin-independent internalization of normal cellular prion protein in neuroblastoma cells is associated with the Arf6 pathway. J Cell Sci 122: 4062-4069.

49. Killeen,S., Hennessey,A., E1,H.Y., and Waldron,B. (2008) The urokinase plasminogen activator system in cancer: a putative therapeutic target? Drug News Perspect 21: 107-116.

50. Kim,S.W., Hayashi,M., Lo,J.F., Yang,Y., Yoo,J.S., and Lee,J.D. (2003) ADP-ribosylation factor 4 small GTPase mediates epidermal growth factor receptor-dependent phospholipase D2 activation. J Biol Chem 278: 26612668.

51. Kon,S., Tanabe,K., Watanabe,T., Sabe,H., and Satake,M. (2008) Clathrin dependent endocytosis of E-cadherin is regulated by the Arf6GAP isoform SMAP1. Exp Cell Res 314: 1415-1428.

52. Krauss,M., Kinuta,M., Wenk,M.R., De,C.P., Takei,K., and Haucke,V. (2003) ARF6 stimulates clathrin/AP-2 recruitment to synaptic membranes by activating phosphatidylinositol phosphate kinase type Igamma. J Cell Biol 162: 113-124.

53. Krishna,M., and Narang,H. (2008) The complexity of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) made simple. Cell Mol Life Sci 65: 3525-3544.

54. Laakkonen,J.P., Makela,A.R., Kakkonen,E., Turkki,P., Kukkonen,S., Peranen,J. et al. (2009) Clathrin-independent entry of baculovirus triggers uptake of E. coli in non-phagocytic human cells. PLoS One 4: e5093.

55. Lau,A.W., and Chou,M.M. (2008) The adaptor complex AP-2 regulates post-endocytic trafficking through the non-clathrin Arf6-dependent endocytic pathway. J Cell Sci 121: 4008-4017.

56. Lebeda,R.A., Johnson,S.K., Stewart,M.I., and Haun,R.S. (2003) Sequence, genomic organization, and expression of the human ADP-ribosylation factor 6 (ARF6) gene: a class III ARF. DNA Cell Biol 22: 737-741.

57. Li,C.C., Chiang,T.C., Wu,T.S., Pacheco-Rodriguez,G., Moss,J., and Lee,FJ. (2007) ARL4D recruits cytohesin-2/ARNO to modulate actin remodeling. Mol Biol Cell 18: 4420-4437.

58. Li,H.S., Shome,K., Rojas,R., Rizzo,M.A., Vasudevan,C., Fluharty,E. et al.2003) The guanine nucleotide exchange factor ARNO mediates the activation of ARF and phospholipase D by insulin. BMC Cell Biol 4: 13.

59. Li,M., Ng,S.S., Wang,J., Lai,L., Leung,S.Y., Franco,M. et al. (2006) EFA6A enhances glioma cell invasion through ADP ribosylation factor 6/extracellular signal-regulated kinase signaling. Cancer Res 66: 1583-1590.

60. Li,M., Wang,J., Ng,S.S., Chan,C.Y., He,M.L., Yu,F. et al. (2009) Adenosine diphosphate-ribosylation factor 6 is required for epidermal growth factor-induced glioblastoma cell proliferation. Cancer 115: 4959-4972.

61. Lim,K.H., 0'Hayer,K., Adam,SJ., Kendall,S.D., Campbell,P.M., Der,CJ., and Counter,C.M. (2006) Divergent roles for RalA and RalB in malignant growth of human pancreatic carcinoma cells. Curr Biol 16: 2385-2394.t

62. Liu,L., Liao,H., Castle,A., Zhang,J., Casanova,J., Szabo,G., and Castle,D. (2005) SCAMP2 interacts with Arf6 and phospholipase D1 and links their function to exocytotic fusion pore formation in PC 12 cells. Mol Biol Cell 16: 4463-4472.

63. Liu,Y., and Fanburg,B.L. (2008) Phospholipase D signaling in serotonin-induced mitogenesis of pulmonary artery smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 295: L471-L478.

64. Lundmark,R., Doherty,G.J., Vallis,Y., Peter,B.J., and McMahon,H.T. (2008) Arf family GTP loading is activated by, and generates, positive membrane curvature. Biochem J 414: 189-194.

65. Luttrell,L.M., and Lefkowitz,RJ. (2002) The role of beta-arrestins in the termination and transduction of G-protein-coupled receptor signals. J Cell Sci 115:455-465.

66. Macia,E., Luton,F., Partisani,M., Cherfils,J., Chardin,P., and Franco,M.2004) The GDP-bound form of Arf6 is located at the plasma membrane. J Cell Sci 117: 2389-2398.

67. Marchant,D., Sail,A., Si,X., Abraham,Т., Wu,W., Luo,Z. et al. (2009) ERK MAP kinase-activated Arf6 trafficking directs coxsackievirus type B3 into an unproductive compartment during virus host-cell entry. J Gen Virol 90: 854862.

68. Menetrey,J., Macia,E., Pasqualato,S., Franco,M., and Cherfils,J. (2000) Structure of Arf6-GDP suggests a basis for guanine nucleotide exchange factors specificity. Nat Struct Biol 7: 466-469.

69. Mi,R., Ma,J., Zhang,D., Li,L., and Zhang,H. (2009) Efficacy of combined inhibition of mTOR and ERK/MAPK pathways in treating a tuberous sclerosis complex cell model. J Genet Genomics 36: 355-361.

70. Montagnac,G., Sibarita,J.B., Loubery,S., Daviet,L., Romao,M., Raposo,G., and Chavrier,P. (2009) ARF6 Interacts with JIP4 to control a motor switch mechanism regulating endosome traffic in cytokinesis. Curr Biol 19: 184-195.

71. Morishige,M., Hashimoto,S., Ogawa,E., Toda,Y., Kotani,H., Hirose,M. et al. (2008) GEP 100 links epidermal growth factor receptor signalling to Arf6 activation to induce breast cancer invasion. Nat Cell Biol 10: 85-92.

72. Moss,J., and Vaughan,M. (1998) Molecules in the ARF orbit. J Biol Chem 273: 21431-21434.

73. Muralidharan-Chari,V., Clancy,J., Plou,C., Romao,M., Chavrier,P., Raposo,G., and Souza-Schorey,C. (2009a) ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Curr Biol 19: 1875-1885.

74. Muralidharan-Chari,V., Hoover,H., Clancy,J., Schweitzer,J., Suckow,M.A., Schroeder,V. et al. (2009b) ADP-ribosylation factor 6 regulates tumorigenic and invasive properties in vivo. Cancer Res 69: 2201-2209.

75. Naslavsky,N., Weigert,R., and Donaldson,J.G. (2003) Convergence of non-clathrin- and clathrin-derived endosomes involves Arf6 inactivation and changes in phosphoinositides. Mol Biol Cell 14: 417-431.

76. Niedergang,F., Colucci-Guyon,E., Dubois,Т., Raposo,G., and Chavrier,P. (2003) ADP ribosylation factor 6 is activated and controls membrane delivery during phagocytosis in macrophages. J Cell Biol 161:1143-1150.

77. Noh,D.Y., Ahn,S.J., Lee,R.A., РагкД.А., Kim,J.H., Suh,P.G. et al. (2000) Overexpression of phospholipase D1 in human breast cancer tissues. Cancer Lett 161: 207-214.

78. O'Neal,C.J., Jobling,M.G., Holmes,R.K., and Hol,W.G. (2005) Structural basis for the activation of cholera toxin by human ARF6-GTP. Science 309: 1093-1096.

79. Onodera,Y., Hashimoto,S., Hashimoto,A., Morishige,M., Mazaki,Y., Yamada,A. et al. (2005) Expression of AMAP1, an ArfGAP, provides novel targets to inhibit breast cancer invasive activities. EMBO J 24: 963-973.

80. Oude Weernink,P.A., Lopez de,J.M., and Schmidt,M. (2007) Phospholipase D signaling: orchestration by PIP2 and small GTPases. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 374: 399-411.

81. Palacios,F., Price,L., Schweitzer,J., Collard,J.G., and Souza-Schorey,C. (2001) An essential role for ARF6-regulated membrane traffic in adherens junction turnover and epithelial cell migration. EMBO J 20: 4973-4986.

82. Palacios,F., Schweitzer,J.K., Boshans,R.L., and Souza-Schorey,C. (2002) ARF6-GTP recruits Nm23-Hl to facilitate dynamin-mediated endocytosis during adherens junctions disassembly. Nat Cell Biol 4: 929-936.

83. Palacios,F., and Souza-Schorey,C. (2003) Modulation of Racl and ARF6 activation during epithelial cell scattering. J Biol Chem 278: 17395-17400.

84. Paleotti,0., Macia,E., Luton,F., Klein,S., Partisani,M., Chardin,P. et al. (2005) The small G-protein Arf6GTP recruits the AP-2 adaptor complex to membranes. J Biol Chem 280: 21661-21666.

85. Paris,S., Beraud-Dufour,S., Robineau,S., Bigay,J., Antonny,B., Chabre,M., and Chardin,P. (1997) Role of protein-phospholipid interactions in the activation of ARF1 by the guanine nucleotide exchange factor Arno. J Biol Chem 272: 22221-22226.

86. Pasqualato,S., Menetrey,J., Franco,M., and Cherfils,J. (2001) The structural GDP/GTP cycle of human Arf6. EMBO Rep 2: 234-238.

87. Peters,P.J., Hsu,V.W., Ooi,C.E., Finazzi,D., Teal,S.В., Oorschot,V. et al. (1995) Overexpression of wild-type and mutant ARF1 and ARF6: distinct perturbations of nonoverlapping membrane compartments. J Cell Biol 128: 1003-1017.

88. Petroulakis,E., Mamane,Y., Le,B.O., Shahbazian,D., and Sonenberg,N. (2006) mTOR signaling: implications for cancer and anticancer therapy. Br J Cancer 94: 195-199.

89. Porat-Shliom,N., Kloog,Y., and Donaldson,J.G. (2008) A unique platform for H-Ras signaling involving clathrin-independent endocytosis. Mol Biol Cell 19: 765-775.

90. Poupart,М.Е., Fessart,D., Cotton,M., Laporte,S.A., and Claing,A. (2007) ARF6 regulates angiotensin II type 1 receptor endocytosis by controlling the recruitment of AP-2 and clathrin. Cell Signal 19: 2370-2378.

91. Radhakrishna,H., Klausner,R.D., and Donaldson,J.G. (1996) Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol 134: 935-947.

92. Raftopoulou,M., and Hall,A. (2004) Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol 265: 23-32.

93. Rankovic,M., Jacob,L., Rankovic,V., Brandenburg,L.O., Schroder,H., Hollt,V., and Koch,T. (2009) ADP-ribosylation factor 6 regulates mu-opioid receptor trafficking and signaling via activation of phospholipase D2. Cell Signal 21: 1784-1793.

94. Robin,P., Chouayekh,S., Bole-Feysot,C., Leiber,D., and Tanfin,Z. (2005) Contribution of phospholipase D in endothelin-1-mediated extracellular signal-regulated kinase activation and proliferation in rat uterine leiomyoma cells. Biol Reprod 72: 69-77.

95. Sabe,H., Hashimoto,S., Morishige,M., Hashimoto,A., and Ogawa,E. (2008) The EGFR-GEP100-Arf6 pathway in breast cancer: Full invasiveness is not from the inside. Cell Adh Migr 2: 71-73.

96. Sabe,H., Hashimoto,S., Morishige,M., Ogawa,E., Hashimoto,A., Nam,J.M. et al. (2009) The EGFR-GEP100-Arf6-AMAP 1 signaling pathway specific to breast cancer invasion and metastasis. Traffic 10: 982-993.

97. Santy,L.C., and Casanova,J.E. (2001) Activation of ARF6 by ARNO stimulates epithelial cell migration through downstream activation of both Racl and phospholipase D. J Cell Biol 154: 599-610.

98. Santy,L.C., Ravichandran,K.S., and Casanova,J.E. (2005) The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Racl. CurrBiol 15: 1749-1754.

99. Schonteich,E., Pilli,M., Simon,G.C., Matern,H.T., Junutula,J.R, Sentz,D. et al. (2007) Molecular characterization of Rabll-FIP3 binding to ARF GTPases. Eur J Cell Biol 86: 417-431.

100. Schweitzer,J.K., and Souza-Schorey,C. (2002) Localization and activation of the ARF6 GTPase during cleavage furrow ingression and cytokinesis. J Biol Chem 277: 27210-27216.

101. Skippen,A., Jones,D.H., Morgan,C.P., Li,M., and Cockcroft,S. (2002) Mechanism of ADP ribosylation factor-stimulated phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate synthesis in HL60 cells. J Biol Chem 277: 5823-5831.

102. Smith,S.C., Oxford,G., Baras,A.S., Owens,C., Havaleshko,D., Brautigan,D.L. et al. (2007) Expression of ral GTPases, their effectors, and activators in human bladder cancer. Clin Cancer Res 13: 3803-3813.

103. Souza-Schorey,C., and Chavrier,P. (2006) ARF proteins: roles in membrane traffic and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 347-358.

104. Souza-Schorey,C., and Stahl,P.D. (1995) Myristoylation is required for the intracellular localization and endocytic function of ARF6. Exp Cell Res 221: 153-159.

105. Sunaga,N., Miyajima,K., Suzuki,M., Sato,M., White,M.A., Ramirez,R.D. et al. (2004) Different roles for caveolin-1 in the development of non-small cell lung cancer versus small cell lung cancer. Cancer Res 64: 4277-4285.

106. Suzuki,Т., Kanai,Y., Hara,T., Sasaki,J., Sasaki,Т., Kohara,M. et al. (2006) Crucial role of the small GTPase ARF6 in hepatic cord formation during liver development. Mol Cell Biol 26: 6149-6156.

107. Svensson,H.G., West,M.A., Mollahan,P., Prescott,A.R., Zaru,R., and Watts,C. (2008) A role for ARF6 in dendritic cell podosome formation and migration. Eur J Immunol 38: 818-828.

108. Tague,S.E., Muralidharan,V., and Souza-Schorey,C. (2004) ADP-ribosylation factor 6 regulates tumor cell invasion through the activation of the MEK/ERK signaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 9671-9676.

109. Tanabe,K., Torii,T., Natsume,W., Braesch-Andersen,S., Watanabe,T., and Satake,M. (2005) A novel GTPase-activating protein for ARF6 directly interacts with clathrin and regulates clathrin-dependent endocytosis. Mol Biol Cell 16: 1617-1628.

110. Tchevkina,E., Agapova,L., Dyakova,N., Martinjuk,A., Komelkov,A., and Tatosyan,A. (2005) The small G-protein RalA stimulates metastasis of transformed cells. Oncogene 24: 329-335.

111. Tsuchiya,M., Price,S.R., Tsai,S.C., Moss,J., and Vaughan,M. (1991) Molecular identification of ADP-ribosylation factor mRNAs and their expression in mammalian cells. J Biol Chem 266: 2772-2777.

112. Wan,Т., Liu,Т., Zhang,H., Tang,S., and Min,W. (2009) AIP1 functions as Arf6-GAP to negatively regulate TLR4 signaling. J Biol Chem 285: 3750

113. Williger,B.T., Ho,W.T., and Exton,J.H. (1999) Phospholipase D mediates matrix metalloproteinase-9 secretion in phorbol ester-stimulated human fibrosarcoma cells. J Biol Chem 274: 735-738.

114. Xu,L., Frankel,P., Jackson,D., Rotunda,Т., Boshans,R.L., Souza-Schorey,C., and Foster,D.A. (2003) Elevated phospholipase D activity in H-Ras- but not K-Ras-transformed cells by the synergistic action of RalA and ARF6. Mol Cell Biol 23: 645-654.

115. Yano,H., Kobayashi,I., Onodera,Y., Luton,F., Franco,M., Mazaki,Y. et al. (2008) Fbx8 makes Arf6 refractory to function via ubiquitination. Mol Biol Cell 19: 822-832.

116. Yin,J., Pollock,C., Tracy,K., Chock,M., Martin,P., Oberst,M., and Kelly,K. (2007) Activation of the RalGEF/Ral pathway promotes prostate cancer metastasis to bone. Mol Cell Biol 27: 7538-7550.

117. Zhao,Y., Ehara,H., Akao,Y., Shamoto,M., Nakagawa,Y., Banno,Y. et al. (2000) Increased activity and intranuclear expression of phospholipase D2 in human renal cancer. Biochem Biophys Res Commun 278: 140-143.3757.