Экспрессия и характеристика новых изоформ лиганда Wnt11 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Посвятенко, Александра Викторовна

• Посвятенко, Александра Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Посвятенко, Александра Викторовна

2.1 Белки Wnt

2.2 Сигнальный путь Wnt

Канонический ß-катенин-зависимый сигнальный путь

Неканонический, кальций-зависимый сигнальный путь Wnt

Неканонический сигнальный путь Wnt. Путь планарной клеточной полярности

2.3 Многообразие сигнальных путей Wnt и факторы, определяющие тип активируемого сигнального каскада

Классификация лигандов Wnt и рецепторов Fzd

Роль корецептора LRP5/6 в определении типа активируемого сигнального пути

Контроль активации сигнальных путей Wnt с участием регуляторных молекул

Активация сигнальных путей Wnt может происходить с участием

альтернативных рецепторов

Альтернативные рецепторы или корецепторы?

Механизмы активации сигнального пути Wnt с участием белков, не принадлежащих к семейству Wnt

2.4 Роль сигнальных путей Wnt в канцерогенезе

Канонический сигнальный путь и его роль в канцерогенезе

Роль неканонических сигнальных путей Wnt в формировании и прогрессии опухолей

3. Материалы и методы исследований

Ферменты и реактивы

Выделение РНК, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

Гель-электрофорез ДНК

Секвенирование

Молекулярное клонирование

Создание экспрессионных конструкций, кодирующих микроРНК

Трансформация клеток Е. coli

Культивирование клеточных линий, трансфекция

Получение антител к белку hWntl 1

Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот анализ

Двойной люциферазный тест

Аффинная хроматография

Аффинная хроматография с сефарозой, несущей антитела к DED-эпитопу

Статистическая обработка результатов

Программное обеспечение

4. Результаты и обсуждение

4.1 Исследование экспрессии лиганда hWntll в различных опухолевых и нормальных клетках

Экспрессия лиганда hWntll наблюдается в различных клеточных линиях меланомы

человека

Экспрессия лиганда hWntll в клетках линий колоректалъно рака

Экспрессия лиганда hWntll в клетках нормальных тканей человека

4.2 Экспрессия лиганда hWntl 1 сопровождается альтернативным сплайсингом

4.3 Исследование свойств белковых продуктов сплайс-вариантов hWntl lspl и hWntl lsp3

Создание экспрессионных конструкций и получение специфических антител против

hWntll

Белковый продукт альтернативного сплайсинга hWntl lsp3 связывается с

гепарин-сефарозой, но не секретируется

В клетках линии НТ29 антителами против hWntll выявлен набор

иммунореактивных полос различной молекулярной массы

Белковый продукт альтернативного сплайсинга hWntl lspl связывается с

гепарин-сефарозой и сохраняет способность секретироваться

Белковый продукт сплайс-варианта hWntl lspl связывается с регуляторным белком WIF

4.4 Исследование функциональной активности изоформ лиганда hWntl 1

Экспрессия лиганда hWntll ингибирует активацию канонического сигнального

пути Wnt

Экспрессия эндогенного hWntll может влиять на активацию канонического

сигнального пути Wnt

Исследование функциональной активности сплайс-вариантов лиганда h Wnt 11

5. Заключение

6. Выводы

Список литературы

Благодарности

Список использованных сокращений

АРС Adenomatous Polyposis Coli (аденоматозный полипоз толстой кишки)

ЬТгСР beta-Transducin repeat Containing Protein (белок, содержащий ß-

трансдуциновый повтор) САМКИ Ca2+/Calmodulin-dependent protein Kinase II (Са2+/кальмодулин-зависимая киназа II)

CKI Casein Kinase 1 (казеин киназа 1)

CRD Cysteine-Rich Domain (домен богатый цистеиновыми аминокислотными

остатками)

Cthrcl Collagen triple helix repeat containing 1 (белок, содержащий коллаген

подобный повтор)

Daaml Dishevelled associated activator of morphogenesis 1 (активатор морфогенеза,

ассоциированный с Dishevelled) Dkk Dickkopf

Dsh Dishevelled

EGF Epidermal Growth Factor (эпидермальный фактор роста)

Fmi Flamingo

Fzd Frizzled

GAPDH Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase

(глицеральдегидЗ-фосфатдегидрогеназа) GSK-3ß Glycogen Synthase Kinase-3 (киназа-3 гликогенсинтазы)

JNK c-Jun N-terminal Kinase (c-Jun N-терминальная киназа)

LRP Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein (белок родственный

рецепторам липопротеинов низкой плотности) ММР Matrix Metalloproteinase (матриксная металлопротеиназа)

РСР Planar Cell Polarity (планарная клеточная полярность)

Pk Prikle

РКС Protein Kinase С (протеинкиназа С)

PVDF Polyvinylidene diFluoride (поливинилиденфторид)

ROCK Rho-associated protein Kinase (Rho-ассоциированная протеинкиназа)

Ror Receptor tyrosine-kinase like Orphan Receptor (рецептор семейства

тирозинкиназ, подобный рецепторам - сиротам) Ryk Related to Receptor tyrosine (Y) kinase (родственный тирозинкиназным

рецепторам)

SFRP Secreted frizzled-related protein (секретируемые белки родственные Frizzled)

Stbm Strabismus

TAE Tris-Acetate-EDTA (трис-ацетатный буфер с ЭДТА)

TBS Tris-Buffered Saline (трис-HCl солевой буфер)

TCF/LEF T-Cell Factor/Lymphoid Enhancer Factor (Т-клеточный/лимфоидный

транскрипционный фактор)

Vangl Van-Gogh like protein

wg Wingless

WIF-1 Wnt Inhibitory Factor (Wnt ингибирующий фактор)

XGAP Xenopus GTPase-Activating Protein (белок активирующий ГТФазу у Xenopus)

ХР АРС Xenopus Paraxial Protocadherin (параксиальный протокадгерин у Xenopus)

zw3 zeste-white3 kinase

а.о. аминокислотные остатки

ГТФаза гуанозинтрифосфатаза

Да (кДа) дальтон (килодальтон)

ДСН-ПААГ полиакриламидный гель, содержащий додецилсульфат натрия

ИПТГ изопропил-Р-Э-тиогалактозид

мРНК матричная РНК

ОТ-ПЦР Обратная Транскрипция с последующей Полимеразной Цепной Реакцией

п.н. пар нуклеотидов

1. Общая характеристика работы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия и характеристика новых изоформ лиганда Wnt11»

1.1 Введение

Среди характерных свойств злокачественных новообразований особого внимания заслуживают инвазивный рост и метастазирование. Именно благодаря этим качествам опухоль поражает не только исходный орган или ткань, но проникает в соседние ткани и распространяется в организме пациента. В основе инвазивного роста лежат взаимосвязанные изменения в организации цитоскелета, нарушается взаимодействие клеток между собой и с межклеточным матриксом. Метастазирование - образование вторичных очагов опухолевого роста - наиболее опасное проявление опухолевой прогрессии, являющееся основной причиной смерти онкологических больных. Чтобы дать метастаз клетка должна приобрести ряд свойств: умение проникать в глубину окружающих нормальных тканей, в том числе в кровеносные или лимфатические сосуды; способность выживать после попадания в сосуды, а затем выходить из них и размножаться в несвойственном для данного типа клеток микроокружении, давая новый очаг опухолевого роста [1].

Инвазивный рост и метастазирование объединяет способность клеток к движению. Это свойство также как и некоторые другие черты опухолевой клетки (высокий пролиферативный потенциал, отсутствие клеточной дифференцировки) характерно для клеток эмбриональных тканей. Сигнальные пути, регулирующие эмбриональное развитие, часто активированы в опухолевых клетках, например, Notch, BMP и Wnt [113]. Роль лигандов Wnt в формировании меланоцитов в образовании, а затем в прогрессии меланомы активно исследуется и может иллюстрировать общность процессов эмбрионального развития и злокачественного перерождения. Сочетание лигандов Wnt контролирует образование нервной трубки и нервного гребня [210]. Также активацией различных компонентов сигнального каскада Wnt сопровождается процесс созревания, позиционирования и дифференцировки клеток нервного гребня, будущих меланоцитов [57]. В то же время установлено, что нарушения в регуляции сигнальных каскадов, запускаемых лигандами семейства Wnt, играют ключевую роль в злокачественном перерождении меланоцитов - образовании меланомы [106, 158].

Меланобласты пролиферируют и мигрируют, тогда как меланомные клетки

пролиферируют и метастазируют. Растет число свидетельств того, что эти процессы,

контролируются одними и теми же сигнальными путями [194]. В эмбриональном

развитии движение клеток нервного гребня, предшественников меланоцитов,

регулируется лигандом Wnt 11 [50, 120]. Однако роль этого лиганда в процессе

метастазирования меланом остается не изученной. Усиление экспрессии Wntll

6

детектировано в клетках различных опухолей, в том числе колоректального рака [98, 137]. В норме этот лиганд задействован в регуляции пролиферации, трансформации и миграции клеток эпителия кишечника [143]. Естественно предположить, что \Vntll играет непосредственную роль в процессах формирования и, особенно, прогрессии колоректального рака. Для различных сигнальных каскадов описаны механизмы, регулирующие активность лигандов за счет альтернативного сплайсинга [4, 146]. Однако, в случае сигнального пути \Viit, информация о существовании изоформ лигандов \Уп1 ограничивается несколькими фактами [61, 169]. Экспериментальные данные о существовании изоформ лиганда Ь\¥пШ отсутствуют, хотя они потенциально могут иметь другое функциональное значение и играть роль, в том числе, и при развитии опухолевых заболеваний.

В связи с вышеизложенным, цель настоящей работы состояла в изучении экспрессии лиганда ЬЛУпЙ 1 в клеточных линиях опухолей различного происхождения и его роль в регуляции сигнальных путей \¥п1:. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. исследовать экспрессию лиганда 1г\\/п1;11 в опухолевых клеточных линиях;

2. провести поиск изоформ лиганда ИАУп! 11;

3. исследовать функциональные свойства изоформ лиганда 1Л^п1;11;

2. Обзор литературы.

Современные представления о механизмах регуляции сигнальных путей Wnt и их роль в канцерогенезе.

2.1 Белки Wnt

В восьмидесятых годах прошлого века было положено начало исследованиям, которые ведутся по сей день и становятся все более и более актуальными. Речь идет об изучении сигнального пути Wnt. В 1982 году в журнале Cell была опубликована статья, в которой сообщалось о гене int-1, активируемом в результате интеграции вируса (инсерционной мутации), происходящей при заражении вирусом опухоли молочной железы мышей (Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV) [140]. В 1987 году было показано, что белок int-1 является гомологом белка wingless плодовой мушки Drosophila melanogaster, относящегося к классу белков, регулирующих полярность каждого сегмента тела насекомого [155, 192]. Объединение названий этих белков образовало имя Wnt. Сейчас семейство белков Wnt активно изучается, с точки зрения строения генов, кодирующих белки, структуры и свойств самих белков и, главное, эффектов, вызываемых ими [126].

Уже первые исследования белка int-1 дали основания полагать, что этот белок является секретируемым. Данное предположение было сделано на основании анализа аминокислотной последовательности (наличие лидерного пептида) и посттрансляционных модификаций (гликозилирование). В дальнейшем было подтверждено, что int-1 секретируется, но остается связанным с поверхностью клетки, не являясь при этом трансмембранным белком. Было высказано предположение, что его функции сродни ростовым факторам, причем с паракринным или аутокринным типом сигнала [144, 145]. Сейчас известно о существовании белков семейства Wnt у различных многоклеточных животных. Число типов белков семейства разнится от пяти (С. elegans) до девятнадцати (Я. sapiens). Для всех членов семейства характерна определенная консервативность в структуре генов (обычно четыре экзона), аминокислотной последовательности (около 370 аминокислот, лидерный пептид, консервативно расположенные цистеины) в строении и свойствах белка (гликозилирование, гидрофобность, презентация на поверхности клетки) [126].

Рассмотрение белков wg и int-1 как членов одного семейства предполагает, что информация об одном из них хотя бы отчасти справедлива и для другого. Исходно int-1 был обнаружен в опухолевых клетках, позднее было показано, что экспрессия int-1 (Wntl) характерна для эмбриональных тканей, в частности, для формирующейся нервной

системы [138, 204]. Свою естественную функцию белок int-1 выполняет в развивающихся тканях, а во взрослом организме только инсерционная мутация переводит int-1 из молчащего гена в состояние низкоэкспрессируемого [62]. С другой стороны, ген wg был открыт при нарушениях нормального развития крыльев у мух, вызванных рецессивной мутацией [163]. Исследования wg дали основания полагать, что действие белка Wingless обеспечивает взаимодействие клеток между собой, и показали, что он является внеклеточным фактором дифференциации, в частности, регулирующим полярность сегментов тела (т.е. относящимся к классу генов segment-polarity) [54, 131].

2.2 Сигнальный путь Wnt

В 1984 году было показано, что мутации в гене arm нарушали нормальное развитие сегментов мух и приводили к фенотипу аналогичному тому, который вызван мутацией wg [203]. Эти наблюдения навели исследователей на мысль, что белки, кодируемые этими генами (Armadillo и Wingless соответственно), принадлежат к одному сигнальному пути. Генетические и биохимические подтверждения этой гипотезы были опубликованы в 1994 году [99, 166]. В частности, было показано, что уровень Armadillo в клетке изменяется в ответ на воздействие Wingless и что регуляция уровня внутриклеточного Armadillo осуществляется с участием киназы zw3 [149]. Так в середине 90-х годов был впервые описан сигнальный путь, который сейчас называется каноническим сигнальным путем Wnt.

На данный момент известно три основных сигнальных пути, активируемых белками семейства Wnt. Это так называемый канонический/р-катенин-зависимый путь и два неканонических сигнальных пути - кальций-зависимый и путь планарной клеточной полярности.

Канонический (3-катенин-зависимый сигнальный путь

Р-катенин-зависимый сигнальный путь был впервые описан в 1994 году. В отсутствие активации белками Wnt Р-катенин (гомологичный белку Armadillo у D. melanogaster) накапливается в межклеточных контактах (adherens junctions), а уровень внутриклеточного Р-катенина остается низким. Свободный Р-катенин в таких клетках связывается с деградационным комплексом, в состав которого входят опухолевые супрессоры АРС и Axin [45]. Связь с последними позволяет киназам GSK3P (гомолог киназы zw3 у D. melanogaster) и CKI последовательно фосфорилировать соответствующие сайты на N-конце Р-катенина (Рисунок 1). Убиквитин-лигаза, содержащая F-box белок Slimb/bTrCP, распознает правильно фосфорилированный р-катенин и определяет его дальнейшую судьбу - полиубиквитинилирование и протеасомальную деградацию.

Белки Wnt на поверхности клетки-мишени связываются с рецептором Frizzled (Fzd) и корецептором LRP5/6. Связывание этих белков с лигандом Wnt вызывает фосфорилирование цитоплазматического участка LRP5/6, что создает сайт связывания для Axin. Связывание Axin с LRP5/6 инактивирует деградационный комплекс. В этой инактивации принимает также участие белок Dishevelled (Dsh). Освободившийся Р-катенин входит в ядро, где связывается с Groucho. Белок Groucho является корепрессором транскрипции и, в ядре клеток, не подверженных активации сигнального пути Wnt, он взаимодействует с транскрипционными факторами семейства TCF/LEF. Освободившиеся от Groucho факторы транскрипции образуют комплекс, в состав которого входят также белки Pygopus и Legless/Bcl9. Таким образом, сформированный благодаря [З-катенипу комплекс активирует траенкриццшо генов-мишеней сигнального пути Wnt [32, 127]. Сейчас известно более 70 генов-мишеней канонического сигнального пути Wnt, активно исследуется его роль, как в эмбриональном развитии организмов, так и заболевания, вызванные нарушением правильной регуляции и/или развития этого сигналыюго каскада [32, 139].

Fzd

меморана

цитоплазма

CKla

p-catenin

ядро '

□ ¿Нп

протсасомалы тя деградация

(3-catenin

ТС F

активация транскрипции

Рисунок 1. Схема канонического сигнального пути Wn(.

В отсутствие Wnt лиганда формируется деградационный комплекс, в который входят белки APC, GSK3P, Axin н CKla. Этот комплекс белков делает возможной протеасомальную деградацию Р-катенииа. При взаимодействии Wnt с рецептором Fzd и корецептором LRP5/6 активируется сигнальный путь, в результате развития которого разрушается деградационный комплекс, (1-катеиии накапливается, входи т в ядро и действует как транскрипционный фактор.

Неканонический, кальций-зависимый сигнальный путь Writ

\м&морц1ш

Неканонический сигнальный путь, называемый кальций-зависимым, активируется в результате взаимодействия лигапда Wnt5a (Wntl I) с рецептором Fzd2, а не в результате воздействия кальция на клетку, как можно подумать (Рисунок 2). Наоборот, этот

сигнальный путь приводит к высвобождению кальция из внутриклеточных депо и активации кальций-зависимых ферментов и сигнальных молекул, таких как кальмодулин-зависимая киназа белков \\ (САМКИ), протеинкиназа С (РКС) и кальцинеурин [104]. Современная модель развития этого сигнального каскада предполагает, что Frizzled действует как рецептор, ассоциированный с G-белками (G prolein coupled receptor): взаимодействие его с лигапдом приводит к активации Dsh, который, в свою очередь, активирует фосфодиэстеразу (PDE) и фосфолипазу (PLC). что приводит к освобождению внутриклеточного кальция. Показано, что САМКИ в результате развития этого сигнального каскада активирует киназу активируемую TGF[3 (TAKI) и Nemo-like киназу (NLK), которые ингибируют р-катсниновый сигнальный путь. Протеинкиназа С активирует малую Г'ГФазу CDC42, которая регулирует перестройку питоекелета и движение клеток. Кроме того, РКС фосфорилирует р-катеиин,

ядро

NFAT

перестройка цитоскелета

S -» 4

fp-cat~j TCP] акт||вания транскрипции

Рисунок 2 - Схема Са2-зависимого сигнального пути Wnt.

(Пояснения в тексте)

обеспечивая его деградацию. Фактор транскрипции ОТ-АТ перемещается в ядро и активирует кальцинеурин-зависимую транскрипцию генов, что определяет перераспределение клеток в ходе гаструляции.

Роль этого сигнального каскада в процессе эмбриогенеза различна и включает как ингибирование образования второй дорсальной оси, так и перераспределение клеток в вентральную область, регуляцию разделения тканей и согласованные движения клеток в ходе гаструляции. г)то направление \¥п1-сигналинга очень активно изучается. Особенно большое внимание уделяется роли этого каскада при онкологических заболеваниях, например, при меланоме [85, 101].

Неканонический сигнальный путь Writ. Путь пленарной клеточной полярности

Планариая клеточная полярность - это организация белковых комплексов, обнаруживаемых в индивидуальных клетках, в плоскости одного слоя ткани, которая направлена перпендикулярно апикально-базальной оси.

Показано, что этот сигнальный путь активирован в эпителиальных тканях многоклеточных организмов от D. mehuwgcister до человека [60]. Эпителиальные ткани обладают среди прочих характерным свойством - апикально-базальной полярностью. Кроме того, клетки этих (и других) тканей также поляризованы в плоскости эпителиального слоя. Строгая организация характеризует ориентацию волосяных фолликулов, сенсорных щетинок и даже шестигранное устройство омматидиев в глазах D. mekmogaster. У позвоночных подобной строгой организации подчинены структура и ориентация стереоцилий в сенсорном эпи телии вну треннего уха, организация волосяных фолликулов, а также морфологические и миграционные свойства клеток мезодермы в ходе гаструляции [200]. В ходе гаструляции клетки мезодермы и эктодермы осуществляют согласованное движение, обеспечивающее так называемое конвергентное расширение (convergent extension). Ныло показано, что регуляция и поляризации клеток, и движения дорсальной мезодрсмы, и более позднего закрытия нервной трубки осуществляется, благодаря активации пути плапарной клеточной полярности, который вызывает ассиметричную перестройку цитоскелста и координированную поляризацию клеток в плоскости ткани [101]. Белки Wnt4. Wnt5a и Wntl 1 способны активировать этот путь.

Представление о сигнальном пути клеточной полярности возникло при исследовании механизмов, контролирующих полярность сегментов тела D. melaiwgaster [68]. В настоящий момент условно выделяют три группы белков: регулирующие активность (Wnt, Fat. Dachsous. XGAP), коровыс (Frizzled, Dishevelled. Vangl (Strabismus), Celsr (Flamingo), Prickle, Dishevelled. Diego) и эффекторные (RhoA, Rae. JNK, DaamI, Fuzzy, Naked) белки пути плапарной клеточной полярности.

Внутриклеточный каскад сигнального пути нланарной клеточной полярности

Взаимодействие Writ ли ганда с рецептором Fzd вызывает активацию Dsh. В белке Dsh выделяют три домена, два из которых - PDZ и DEP задействованы в запуске двух параллельных путей - активации малых ГТФаз RhoA и Rac [16]. Ветвь сигнального каскада «RhoA» индуцируется созданием комплекса Dsh-Daaml, в результате чего

активным становится белок Daaml, который активирует ГТФазу RhoA. Для этого требуется, как минимум один фактор обмена гуанина, идентифицированный как WGEF (Weak-similarity Guanine nucleotide Exchange Factor). Активация ГТФазы RhoA приводит к активации RhoA-ассоциированных киназ (ROCK) и миозина, что вызывает модификацию актина и перестройку цитоскедета. Вторая ветвь сигнального каскада -активация ГТФазы Rac, которая происходит независимо от Daaml, и, в свою очередь, стимулирует c-Jun N-терминальную кииазу (JNK) [71]. Факторы, регулируемые этой кииазой, еще не определены окончательно, но одна из функций JNK - регулирование динамики микротрубочек путём фосфорслирования белков ассоциированных с микротрубочками (Microtubiile-associated Proteins, MAPs) [39]. Следует отметить, что у D. melanogaster c-Jun N-терминальная киназа активируется не Rac, a RhoA ГТФазой 142]. И хотя, RhoA и Rac ГТФазы вовлечены в регуляцию транскрипции, остается неясным, есть ли гены, чья транскрипция зависит непосредственно от них в неканоническом сигнальном пути Wnt. Превалирует мнение, что их основная роль заключается во влиянии на цитоскелст (Рисунок 3).

Регуляция пути нланарной клеточной полярности внеклеточными, трансмембранньши и цитоплазматическими белками

Активация пути пленарной клеточной полярности приводит к реорганизации

цитоскелета, но перестройка и перемещение компонентов цитоскелета важны не сами по

себе, а в масштабе слоя клеток, формирующих ткань или на уровне согласованного

движения группы клеток в ходе процессов развития. Для того чтобы в клетках

происходили одинаковые и одновременные изменения, вызываемые активацией

13

Рисунок 3 - Схема неканонического сигнального пути Wnt (планарной клеточНОЙ поляр!юсти) Пояснения в тексте

сигнального пути, требуется регуляция па более высоком уровне, чем взаимодействие лиганда с рецептором в мембране одной клетки.

Современные исследования демонстрируют, что путь пленарной клеточной полярности это консервативная программа, определяющая полярность клеток в различных тканях у организмов разных видов. Регуляция этого направления сигнального пути \Viit позволяет достигать единообразного эффекта во многих клетках, обеспечивая план арную полярность клеток в ткани или их согласованное движение [228].

Влияние сигнального пути клеточной полярности па изменения цитоскелста можно видеть на крыльях и других частях тела О. те1апо%аШег. Каждая эпителиальная клетка О. \nelanogaater формирует волосок, и все они обращены в одном направлении [14]. Напротив, поляризация омматидиев в глазах йгозоркИа зависит от ядерного сигнала, но он также определяется путем клеточной полярности [128]. У млекопитающих путь планарной клеточкой поляркости опосредует поляризацию стерсоцшшй во внутреннем ухе и ориентацию волосков на коже мышей [70, 130]. Для всех этих тканей показано, что при нарушении этого неканонического сигнального пути \¥п1, возникают, соответственно, дефекты полярности. Участие пути планарной клеточной полярности в контроле ориентации митотического веретена показано у I). те\ат^а$1ег, С. е1е%ап* и геЬгайзИ [23, 65, 66].

Развитие внутриклеточного каскада инициирует и поддерживает полярность в клетках. тогда как различные сочетания белков-эффекторов определяют тканеспецифические клеточные ответы, необходимые для реализации приведенных выше примеров. Для того чтобы иметь полное представление о пути планарной клеточной полярности, необходимо представлять, как происходит регуляция активации этого направления неканонического сигнального пути \Viit на более высоком уровне, чем клеточный.

Поляризация волосков иа крыльях О. те/апо^аМег результат активации пути планарной клеточной поляриост и

Самым простым примером, иллюстрирующим роль регуляторов пути планарной

клеточной полярности, является организация волосков на крыльях Огоьор1п1а. Каждая

клетка крыла формирует единичный вырост, называемый трихома или волосок. Все

волоски направлены в одном направлении вдоль проксиматьно-дистальной оси, а именно,

к краю крыла. 11уть клеточной полярности регулирует, как ориентацию и субклеточную

локализацию волоска, так и число волосков, образуемых каждой клеткой. В качестве

регуляторов активации пути планарной клеточной полярности выступают белки,

кодируемые РСР-генами. Модель, описывающая взаимодействие РСР-белков в клетках

эпителия крыла, предполагает следующее развитие событий (Рисунок 4). Молекулы

14

атипичного кадгерииа Flamingo (Fmi) располагаются на дистальной стороне мембраны клеток и на проксимальной стороне, где они взаимодействуют с молекулами Fmi, локализованными на дистальной стороне соседней клетки. Дистальные Fmi индуцируют локальную аккумуляцию рецепторов Fzd, которые в свою очередь привлекают к мембране белки Dsh. Цитоплазматический белок Prikle (Pk) накапливается в проксимальной области клетки, он мешает Fmi привлекать Fzd и Dsh и усиливает, таким образом, ассиметрию распределения последних. В результате, участники сигнального каскада аккумулированы на дистальной части клетки и активация сигнального пути происходит локально, приводя к образованию волоска богатого актином на дистальной стороне клетки [186]. В то время как в проксимальной области, благодаря активности Pk, не накапливаются рецепторы Fzd. не активируется путь илапарной клеточной полярности и не происходит перестройка цитоскелета.

Рисунок 4 - Схема распределения и взаимодействия белков в клетках крыльев Drosophila, обеспечивающих пленарную клеточную полярность.

Proximal проксимальная сторона клетки; Distal-дистальная сторона клетки В дистальной области клетки накапливаются белки Fmi, привлекающие Fzd н Dsh, благодаря чему активация сигнального пути Writ происходит локально и приводит к образованию трихомы на дистальной стороне клетки. В проксимальной области клетки атипичные кадгерины Fmi взаимодействуют с Fmi, находящимися на дистальной стороне соседней клетки. Также в проксимальной области накапливаются белки Pk, которые не позволяют Fmi привлекать Fzd и Dsh, и путь планарной клеточной полярности в проксимальной области клетки не активируется. Рецепторы Ivel па дистальной стороне одной клетки стимулируют накопление Pk в проксимальной области соседней. (Tree et al.. 2002)

Регуляция пути планариой клеточной полярности а процессе согласованного движения клеток па примере конвергентного расширения при гаструляции у X. laevis

В процессе гаструляции позвоночных, высокоорганизованные клеточные перемещения приводят к формированию трех зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и эндодермы. Образование гаструлы базируется на относительно простом наборе основных движений клеток. Один из процессов, обеспечиваемый сочетанием различных типов клеточных движений, необходимый для процесса гаструляции - это конвергентное расширение. Для X. laevis это процесс описан давно и подробно [92. 93 ]. Сейчас показано, что путь планарной клеточной полярности задействован и в конвергентном расширении и в закрытии нервной трубки [196 - 198].

Модель, демонстрирующая роль комплекса белков PCP в поляризации клеток, сопровождающей конвергентное расширение, предполагает двухэтаппый процесс (Рисунок 5А). На первом этапе взаимодействие эпителиальных тканей (нервной и эндодермальной) с мезодермой может индуцировать радиальную поляризацию мезодермальиых клеток. Радиально поляризованные клетки мезодермы секретируют фибронектин на своей поверхности, в результате чего, на внешних концах клеток собирается фибронектиновый матрикс, который является посредником между мезенхималыюй мезодермой и соседними эпителиальными клетками. После образования фибронектинового матрикса полярность клеток изменяется с радиальной на медиолатеральную. Такая полярность позволяет клеткам реализовать характерное интеркалирующее поведение и, таким образом, осуществлять конвергентное расширение [67].

Считается, что коровью белки пути планарной клеточной полярности Stbm и Рк локализованы на переднем крае клеток, тогда как комплекс XGAP располагается в медиолатсральных концах клеток. Располагаясь таким образом, белки ориентируют клетки по обеим осям, относительно которых осуществляется реорганизация цитоскелета и движение (Рисунок 5В) [86]. Нарушение функций Рк или Stbm и Fzd приводит к утрате радиальной поляризации и, образованию дезорганизованного, неполяризованного матрикса. Впоследствии медиолатеральная поляризация тоже нарушается, и ткань утолщается, так как механизм конвергентного расширения нарушен (Рисунок 5В) [67].

а А

I

I

i

р

Рисунок 5. Модель, демонстрирующая роль белков пути пленарном клеточной полярности в поляризации клеток, необходимой для конвергентного расширения. Л. Схема двухэтаппой поляризации клеток мезодермы.

Первый шаг; радиальная поляризация клеток мезодермы и, соответственно, поляризованная секреция фибронектина па внешней поверхности мезодермальных клеток, отделяющая их от нервной н эндодермальной эпителиальных тканей (синяя стрелка).

Второй шаг: клетки поляризуются медиалатерапьно, что дает возможность реализовать характерное интеркалирующее поведение и, таким образом осуществлять конвергентное расширение (фиолетовая стрелка). Б. Схема нарушенной поляризации клеток мезодермы.

В отсутствие экспрессии коровых генов пути плапарпой клеточной полярности происходит нарушение секреции поляризованного фибропектинового матрикса (голубая стрелка), что е свою очередь вызывает нарушение медиолатеральной поляризации (сиреневая стрелка). В. Схематическое изображение конвергентного расширения.

На переднем крае клеток локализованы коровые белки пути плапарпой клеточной полярности (Stbm, Pk), на медиолатеральных концах клеток располагаются комплексы XGAP. Происходит перегруппировка клеток, приводящая к конвергенции (медиолатерально) и расширению (в передне-заднем направлении), а- (anterior) передний край р- (posterior) задний край md- (mediolateral) медиолатерапьпая ось

(А) и (Б). Goto T. et al.. 2005 с изменениями, (В) Jones and Chen, 2007 с изменениями

2.3 Многообразие сигнальных путей Wnt и факторы, определяющие тип активируемого сигнального каскада

Описанные сигнальные пути, активируемые лигандами Wnt, различаются кардинально и, более того, их активация - часто взаимоисключающее явление. Неизбежно возникают вопросы:

■ Какие факторы определяют тип сигнального пути?

■ Как различные участники сигнального каскада влияют на конечный результат?

■ Какие из них являются только звеном в цепочке, а какие регуляторными молекулами или объектом регуляции?

Ответы на эти вопросы необходимы для понимания механизмов топкой регуляции активации сигнальных каскадов Wnt.

Классификация лигандов Wnt и рецепторов Fzd

Известно, что геном D. melanogaster, С. elegans, X. laevis и высших позвоночных

содержит множество генов Wnt. Примечательно, что разнообразный репертуар

представлен уже у кишечнополостных (Cnidaria) - древнейшего типа многоклеточных,

включающего в себя, как пресноводные полипы, так и морские анемоны [69]. Это

показывает, что разнообразие генов возникло в эволюции рано, и что оно остается

существенным для правильного развития многоклеточных организмов, Исследователи

пытались разгруппировать индивидуальные белки Wnt в классы, определенные по

специфической активности. Это привело к разделению белков Wnt на канонические и

неканонические, на основании способности индуцировать удвоение оси в эмбрионе

Xenopus и вызывать морфологическую трансформацию в клетках опухоли молочной

железы мышей (C57MG) [122, 206]. Обе активности коррелируют с накоплением

Р-катенина в цитоплазме и активностью [З-катенин/TCF сигнального пути [165].

Исследования Drosophilci показали, что белки Fzd и Dsh необходимы для установления

клеточной полярности независимо от р-катепинового сигнального пути 11 "70, 183. 195].

Когда было показано, что некоторые белки Wnt контролируют движения конвергентного

расширения в ходе развития позвоночных, разделение между двумя группами лигандов

обрело четкие границы. «Канонические» белки Wnt связываются с Fzd и активируют

р-катенин-зависимый сигнальный путь и TCF-зависимую экспрессию, тогда как

«неканонические» Wnt связываются с Fzd и активируют малые ГТФазы Rho, c-Jun

N-концевую киназу и другие р-катенин-независимые сигнальные пути [76, 175, 196].

Однако, оказалось, что не свойства лигандов, точнее не только собственные

свойства белков Wnt - фактор, определяющий тип активируемого сигнального пути. По

18

крайней мере, в ряде случаев клеточный ответ, возникающий в результате взаимодействия Wnt и рецептора, определяется сигнальной специфичностью рецептора. Fzd был первым обнаруженным рецептором, передающим сигнал Wnt. Для рецепторов этого семейства характерно наличие семи трансмембранных участков, С-конец, обращенный внутрь цитоплазмы, и внеклеточный домен, содержащий 10 цистеиновых остатков, называемый CRD.

Также как и среди Wnt на уровне рецепторов обнаружено разнообразие: 4 рецептора Fzd было обнаружено у D. melanogaster и С. elegans и 10 Fzd найдено у мышей и человека [24, 94]. Цистеиновыс домены различных Fzd демонстрируют высокую аффинность при связывании Wilt, но показано, что для способности активировать ß-катенин-зависимый сигнальный путь важна аминокислотная последовательность С-конца Fzd [209]. Так у Drosophila рецептор Fzd вовлечен скорее в формирование планарной клеточной полярности. Л ß-катенин-зависимый сигнальный путь активируется с участием рецептора Fzd2, имеющего большую афиппость к wg чем Fzd [24, 185]. Работа, в которой были созданы и использованы химерные белки, состоящие из различных участков рецепторов Fzd и Fzd2, показала, что именно обмен цитоплазматичсскими - С-концевыми доменами приводит к перемене типа сигнального пути, активируемого в результате взаимодействия ivg с рецептором [29]. Но, в то же время, Fzd7 у Xenopus обеспечивает активацию как «канонического» так и «неканонического» направлений [123, 171]. Таким образом, нельзя сказать, что только лиганды или только рецепторы могут определять тип активируемого пути.

Роль коре цеп тора LR Р5/6 в определении типа активируемого сигнального пути

Исследование роли рецепторов в активации канонического сигнального пути при воздействии лигандов Wnt3a и Wnt5a на клетки линии Drosophila S2, показало, что Wnt3a стабилизирует уровень Armadillo (гомолога ß-катенина у Drosophila) в комбинации со специфическими рецепторами Fzd, тогда как Wnt5a ни с одним из проверяемых рецепторов не активировал канонический сигнальный путь [177]. Однако, данные результаты отражают не только свойства лигандов или даже рецепторов, но, как оказалось, показывают неспособность Wnt5a привлекать гомолог LRP у D. melanogaster -Arrow. В действительности, Wnt5a способен индуцировать ß-кате н и 11 /ТС F-зависи м ы й сигнальный путь в клетках НЕК293 (эмбриональная почка человека), которые экспрессируют Fzd4 и LRP5 [125]. Таким образом, при рецепции лиганда. специфической для активации определенного направления сигнального пути, необходим корецептор.

Трапсмембранные белки семейства LRP (Arrow у Drosophila) формируют корецепторный комплекс для передачи канонического сигнала. Белки LRP5/6 обладают

относительно малым внутриклеточным доменом и значительным внеклеточным, содержащим несколько областей, способных взаимодействовать с различными белками. Корецепторы, лишенные внеклеточной части, но сохранившие трансмембранный и внутриклеточный домены, вызывают постоянную активацию сигнального пути Wnt. Напротив, белки LRP. лишенные внутриклеточного домена, функционируют как-доминантно негативные [75]. Фосфорилировапие LRP/Arrow, также как и образование ими больших агрегатов или «сигналосом», требует функционирования Fzd и обязательны для накопления ß-катенина при стимуляции лигандами Wnt [25]. Считается, что участие корецептора LRP - необходимое условие для индукции ß-катеиип-зависимого сигнального пути [179, 202]. Однако показано, что LRP6 также вовлечен в регуляцию конвергентного расширения и установление полярности тканей позвоночных - процессов, регулируемых неканоническим сигнальным путем Wnt [31, 176]. Однако, корсцептор LRP/Arrow не только неотъемлемое звено в передаче канонического сигнала, но и молекула, благодаря которой происходит регуляция.

Контроль активации сигнальных нутеи Wnt с участием регуляторных молекул

Примерами регуляторных молекул, воздействующих на внеклеточном уровне, но способных определить направление активируемого пути являются белки Kremcn (1 и 2) и Dkk. Kiemen - белок однократно пронизывающий мембрану, он может связывать растворимый белок Dkk, который взаимодействует с LRP5/6 и препятствует развитию сигнального каскада Wnt. Помогая обеспечить Dkk-опосредоваипую интернализацию LRP. Krcmcn негативно регулирует Wnt/ß-катениновый сигнальный путь [118]. В то же время, в отсутствие Dkk, этот белок способствует локализации LRP5/6 на клеточной поверхности [74]. Исследователи Csclenyi и Lee в своей работе показали способность Krcmcn к двойственному воздействию: в областях с низким уровнем Dkk фактор Kremen способен усиливать Wnt/ß-катсниновый сигнальный путь, он же может активно этот путь угнетать, как только концентрация Dkk достигает критического уровня [48]. Показано, что регуляция секретируемым белком Dkk актуальна как для канонического, так и для неканонического сигнальных путей Wnt [36, 38, 162]. Независимый секретируемый ингибитор сигнального пути Wnt Wise также действует, связывая внеклеточный домен LRP6, и его влияние также зависит от контекста: он может активировать и ингибировать сигнальный каскад [84].

Растворимые белки родственные Fzd (sFRP) составляют семейство регуляторных факторов, все члены которого имеют на амино-конце домен богатый цистеипами, гомологичный лиганд-связываюшему домену CRD рецепторов Fzd [77]. Другой регулятор - W1F это секретируемая молекула, которая содержит домен структурно отличный от

CRD, но обладающий большой аффинностью к лигандам Wnt, вероятно, благодаря взаимодействию с остатками пальмитиновой кислоты [80]. Ii отличие от Dkk и Wise белки SFRP и WIF взаимодействуют непосредственно с лигандом Wnt. SFRP и WIF также считались внеклеточными ингибиторами сигнального пути Wnt, но и они, в зависимости от контекста, могут активировать сигнальный путь, стабилизируя Wnt или облегчая его секрецию или транспорт (Рисунок 6) [45. 161].

Рисунок 6 Многообразие вариантов регуляции взаимодействия лиганда \Viit с рецептором F7.il и корсцентором !.КР5/6 (пояснения в тексте); пунктир обозначает активацию сигнального пути \УпЦ происходящую в результате взаимодействия рецепторов ¥гс\ с белками, ис принадлежащими к семейс тву \Vtit.

Подводя промежуточный итог, можно сказать, что разделение на канонические и неканонические лиганды неправомерно, как и подобная классификация рецепторов. В определении специфичности взаимодействия лигандов и рецепторов задействованы корецепторы, с которыми в свою очередь взаимодействуют регуляторпые факторы, но и этим не ограничивается разнообразие факторов, регулирующих тип сигнального пути.

Активация сигнальных путей Wut может происходить с участием альтернативных рецепторов

Долгое время считалось, что лиганд Wntll активирует исключительно неканонический сигнальный путь (пленарной клеточной полярности). Однако в работе Тао и коллег показано, что присутствие мРГТК, кодирующей Wntll - необходимое и достаточное условие для того, чтобы активировался канонический сигнальный путь Writ, ответственный за формирование оси тела в процессе эмбрионального развития. Способность Wntl 1 активировать второй, казалось бы совершенно непохожий сигнальный путь, обусловлена присутствием на поверхности клеток белка FRLl/Cripto, принадлежащего семейству EGF-CFC (Epidermal Growth Factor-crypto/FRLl/cryptic). Таким образом, присутствие на поверхности клетки альтернативного рецептора может привести к активации сигнального пути «альтернативного» для данного л и ганда [ 182].

Могут ли другие белки, например, содержащие домен, связывающий Writ, также служить рецепторами для представителей этого семейства? Богатый цистеинами домен был обнаружен в двух других типах рецепторов: Smoothened (Snio) и Ror2. А WlF-домсн обнаружен во внеклеточной части рецептора Ryk. Несмотря на то, что Smo-рецептор отчасти гомологичен рецепторам Fzd. его CRD домен не связывает белки Wnt и не создает эффективный сигнал в ответ па стимуляцию лигапдами Wnt [150]. Тогда как, белки Ror2 и Ryk напротив способны связывать Wnt и активировать соответствующий сигнальный путь. Вот только какой?

Члены подсемейства Ryk имеют необычную для тирозинкиназньтх рецепторов, но очень консервативную структуру. Замена аминокислот во внутриклеточном домене приводит к потере киназпой активности. Кроме того белки Ryk содержат WIF-домен, который позволяет им функционировать в качестве рецептора Wnt [103]. Показано, что у Drosophila рецептор Derailed (DRL, ортолог Ryk) связывает Wnt5a, содействуя комиссуральному направлению роста аксонов и правильной миграции слюнных желез [223]. Возможно, что благодаря взаимодействию Wnt и DRL активируются члены семейства киназ Src [73, 207]. Так как на данный момент не обнаружены другие компоненты сигнального пути Wnt (кроме самого лиганда Wnt), вовлеченые в ответ на взаимодействие Ryk и Wnt, возможно, это отдельный независимый сигнальный каскад [193].

Другой альтернативный рецептор - Ror2 также представляет собой атипичную

тирозинокиназу [215]. Ror2 содержит CRD-домеп, но хотя и отличается структурно от Fzd

рецепторов и пронизывает мембрану только один раз, вовлечен в реализацию сигнального

пути Wnt. Показано, что Wnt5a связывается с Ror2, благодаря чему активируется

неканонический сигнальный путь Wnt, включающий в себя активацию с-Jim

22

N-терминальной кииазы. И мыши нокаутные по гену Ror2 и мыши нокаутные по Wnt5a демонстрировали карликовость, укорочение конечностей и хвоста, нарушение формирования (дисплазию) легких и половых органов [142]. В эмбрионах Xenopus и клетках культуры мышиной ткани Ror2 влияет на движения конвергентного расширения и ингибирует канонический сигнальный путь. Также показано, что недостаток Ror2 приводит к нарушениям в пленарной полярности клеток во внутреннем ухе мышей [124. 216].

Альтернативные рецепторы или корецепторы?

Ряд исследований показан, что альтернативные рецепторы Ryk и Ror2 действуют не самостоятельно, а участвуют во взаимодействии Wnt-Fzd. Так, например, регуляция направления роста аксонов у Drosophila происходит независимо от Fzd и Dsh. У С. elegans LIN-18 (гомолог Ryk) взаимодействует с МОМ-2 (гомологом Wnt) и действует сообща с LIN-17 и LIN-44 (гомологами Fzd и Wnt соответственно), определяя специфическую клеточную судьбу в процессе развития вульвы [83]. Считается, что Ryk не действует как корецептор в данном контексте. Действительно, двойные мутанты по L1N-18 и LIN-17 показывают более сильный фенотип, чем мутанты но отдельным этим генам. Это позволяет предположить, что они действуют независимо, а не в одном и том же сигнальном пути [15]. Но в то же время показано, что у млекопитающих Ryk непосредственно связывается с Wntl и Wnt3a через WIF-домен и необходим для TCF-зависимой активации, происходящей в результате связывания с Wntl. Внеклеточный домен Ryk формирует комплекс с Wntl и Fzd, тогда как внутриклеточный домен Ryk взаимодействует с Dsh [114]. Также показано, что в регуляции движений конвергентного расширения у X. laevis Ryk выступает в роли корецептора Wntl 1, взаимодействуя с Fzd7 195].

Ряд исследований свидетельствует, что Ror2 не только опосредует активацию неканонического сигнального пути Wnt, но может усиливать [3-катенин-зависимый сигнальный каскад, индуцированный Wntl и Wnt3a. В этом случае, по-видимому, не требуется тирозинкипазная активность Ror2, который выступает в качестве корецептора [110. 205].

Таким образом, нельзя однозначно утверждать, что альтернативные рецепторы оказались всего лишь дополнением к обычному взаимодействию Wnt-Fzd. В зависимости от организма, ткани, стадии развития и присутствия других регуляторных факторов, они могут быть, как рецензорами Wnt, активирующими самостоятельный неканонический сигнальный путь, так и корсцеп торами, усиливающими канонический или неканонический сигнальный каскад.

Механизмы активации сигнального пути \Viit с участием белков, не принадлежащих к семейству И ///

Кроме альтернативных рецепторов описаны альтернативные лиганды, взаимодействующие с рецепторами \:гс\. По крайней мере, два типа белков, которые не имеют отношения к факторам \Viit, активируют сигнальный путь \Vrit (Рис.6 пунктир). Белок 1Чотп обладает высокой аффинностью к рецептору Г"¿<14 и активирует канонический сигнальный путь \Viit в случае присутствия на клеточной поверхности ЬЯР5. Кроме способности связываться с С1Ш-до.меном \:ух\4 Ыогпп объединяют с белками Wnt следующие свойства: это секретируемый белок, часто ассоциированный с мембраной и участвующий в передаче сигнала на небольшое расстояние. По-видимому, 1Могпп способствует ангиогенезу [44, 136, 214].

Другими факторами, активирующими канонический сигнальный путь являются белки семейства К-спондипов, содержащие домен тромбоспопдина. У Хепори.у, К-спондин-2 является агонистом \Viit, который совместно с \Viit активирует р-катснии-зависимый сигнальный путь [90]. Обнаружено, что человеческий К-сиондин-1 сильно способствует пролиферации клеток в криптах кишечника, процессу, который также включает стабилизацию (3-кагенина [96]. Действительно, исследование культур клеток показало, что Я-спондины могут физически взаимодействовать с внеклеточными доменами ЬЯРб и Г;гс18 и активируют экспрессию ТСР-зависимых генов [133].

Развитие методов исследования и растущий интерес к изучению сигнальных путей \Viit привели к тому, что на сегодняшний день объем знаний об этих сигнальных путях настолько велик, что систематизация полученных данных представляется проблематичной. Классификация лигаидов, рецепторов и даже регудяторных молекул по способности активировать тот или иной сигнальный путь \Viit невозможна. Активация определенного направления сигнального пути происходит не только контекст-зависимо (т.е. то какой путь активируется, зависит от того какие молекулы представлены, на поверхности клетки-мишени, вокруг и внутри пес), но и регулируется динамически, т.е. важны и концентрации и сочетания белков, участвующих в регуляции.

Разнообразие лигаидов \Yiit, существование специфических взаимодействий разных представителей семейства \Viit с рецепторами Г;2с1 и многообразные факторы, регулирующие активацию сигнальных путей, обеспечивают тонкую настройку процессов, происходящих в результате активации сигнальных путей \Ytit, в пространстве, во времени, ткане- и органо- специфически. Благодаря такой тонкой регуляции активации сигнальных путей они имеют столь большое значение в процессах развития и поддержания гомеостаза.

Рисунок 7 - Участие альтернативных рецепторов в активации сигнальных путей \Viit. Белки Ког2, Кук и РШЛ выступают в качестве рецепторов (сплошные стрелки) или в качестве корецепторов (пунктирные стрелки)

2.4 Роль сигнальных путей Wnt в канцерогенезе

Опухолевая клетка отличается от нормальной рядом свойств, таких как генетическая нестабильность, нечувствительность к сигналам, ингибирующим пролиферацию и индуцирующим дифференцировку или апоптоз, отсутствие потребности в сигналах, активирующих пролиферацию, и других [72]. Причины возникновения злокачественных опухолей различны и обычно представляют собой сочетание нескольких факторов. Несмотря на это, в клетках опухолей разного происхождения детектируются общие особенности: нарушения в одних и тех же процессах, аномальная активация одинаковых сигнальных путей и т.д. Аберрантная активация сигнальных путей Wnt часто наблюдается в опухолевых клетках, что дает основания полагать важность этого сигнального пути для формирования свойств опухолевой клетки. Исследование сигнальных путей Wnt не только позволяет понять их значение и механизмы взаимодействия в канцерогенезе, но и способствует поиску новых мишеней при разработке лекарств и вакцин для терапии и профилактики злокачественных новообразований.

Канонический сигнальный путь и его роль е канцерогенезе

Канонический сигнальный путь является на данный момент наиболее изученным из «семейства» сигнальных каскадов Wnt. Для него разработаны достоверные модельные системы как для in vitro, так и для in vivo экспериментов. Его аберрантная активация и мутации участников сигнального пути активно исследуются, так как сопровождают или вызывают различные патологические состояния: будь то нарушения развития организма или заболевания, в том числе и онкологические.

Канонический сигнальный путь имеет особое значение для колоректального рака, занимающего среди онкологических заболеваний второе место по смертности в западных странах и становящегося все более распространенным в развивающихся странах. Мутации АРС, приводящие к нарушению фосфорилирования ß-катенина и, соответственно, его деградации, ответственны за семейный аденоматозный полипоз (Familial Adenomous Polyposis, FAP) и за 80% случаев спорадического колоректального рака [97]. Мутации АРС и гена, кодирующего ß-катенин (CTNNB), благодаря которым белок избегает фосфорилирования, ведущего к деградации, детектированы во многих опухолях кишечника [149]. Так как ß-катенин-зависимый сигнальный путь в тканях кишечника участвует в поддержании гомеостаза и регуляции самообновления стволовых клеток, его нерегулируемая активация или усиление приводят к избыточной пролиферации клеток-предшественниц, предрасполагая к образованию опухоли [45, 112].

Мутации, активирующие канонический сигнальный путь встречаются не только в колоректальном раке. Описано большое количество спорадических опухолей, в которых

показаны мутации генов A PC, CTNNB и иногда AXIN или других компонентов сигнального каскада [64].

Меланома - один из типов опухолей человека, который был в первую очередь исследован на предмет мутаций А PC или CTNNB. Первоначальные результаты показали заметную роль сигнального пути Wnt в этиологии злокачественной меланомы (необычный сплайсинг и миссенс-мутация CTNNB в 6 из 26 исследуемых клеточных линий и изменение гена АРС еще в 2 линиях) [158]. Но скрининг последующих 195 клеточных линий и образцов первичной опухоли меланомы увеличил список мутаций всего на пять вариантов. Эти данные дают основание полагать, что мутации CTNNB и АРС составляют приблизительно 5% во всех меланомах. Для 28% меланом показано, что (3-катенин локализован в ядре, что может быть следствием активации канонического сигнального пути [156].

Однако исследования активации канонического сигнального пути в клетках меланомы продемонстрировали, что повышенный уровень (3-катенина в ядре коррелирует с хорошим прогнозом для пациентов. Основываясь на том, что активация Р-катенин-зависимого сигнального пути Wnt существенна в процессе формирования меланоцитов из клеток нервного гребня, а для прогрессии меланомы характерно остутствие р-катенина в ядре, авторы полагают, что активация этого сигнального каскада существенна для поддержания гомеостаза нормальных меланоцитов [194]. Отсутствие Р-катенина в ядре клеток прогрессирующей меланомы коррелирует с худшей выживаемостью пациентов по сравнению с показателями пациентов, у которых в меланоме активирован канонический сигнальный путь [18, 41].

Канонический сигнальный путь Wnt имеет отношение к инициации, развитию, прогрессии и метастазированию рака простаты, что подтверждено как у пациентов, так и на мышиных моделях [40, 52]. Функция р-катенина в клетках рака простаты не ограничивается только активацией TCF-зависимой транскрицпии. р-катенин способен взаимодействовать с андрогеновыми рецепторами клеток простаты, активируя андроген-зависимую транскрипцию [221].

Немелкоклеточный рак легких одна из наиболее распространенных карцином человека, имеющих плохой прогноз для пациентов. Последние исследования показали, что гиперэкспрессия Wntl, приводящая к аномальному накоплению Р-катенина ассоциирована с экспрессией мишеней сигнального пути Wnt (с-Мус, Cyclin Dl, ММР7), пролиферацией опухоли, ангиогенезом и является плохим прогностическим фактором в этом заболевании [81].

Кроме того, изменения канонического сигнального пути, вызванные мутациями Р-катенина, детектированы в широком спектре других злокачественных заболеваний,

включая гепатоцеллюлярную карциному, опухоль Вильямса, опухоли эпителия яичников [51, 115, 211, 212]. В некоторых случаях установлен факт мутации гена Axin, кодирующего белок деградационного комплекса, в других выявлена потеря экспрессии секретируемых антагонистов сигнального пути Wnt, таких как SFRP1 или WIF [22, 33, 191].

Показано, что канонический сигнальный путь Wnt играет важную роль в кроветворении, контролируя пролиферацию, выживание и дифференцировку гематопоэтических клеток [153]. Его аберрантная активация сопровождает патологические состояния кроветворной системы. Так, конститутивная активность ß-катенина в кроветворных стволовых клетках блокирует дифференцировку, включая ранние стадии дифференцировки Б-лимфоцитов [154]. Нарушение сигнального пути Wnt детектировано в таких заболеваниях кроветворной системы как острая и хроническая миелоидная лейкемии, хронический лимфолейкоз, множественная миелома [17, 167].

In vitro и in vivo показана экспрессия различных лигандов сигнального пути Wnt в клетках эндотелия и гладкой мускулатуры сосудов, в зародышевых сосудах плаценты [129, 208]. В эмбриогенезе человека ядерный и/или цитоплазматический ß-катенин был обнаружен в капиллярах ворсинок плаценты, зародышевых капиллярах, артериях и венах. Более того, канонический сигнальный путь может способствовать пролиферации и выживанию клеток эндотелия, благодаря индукции известных регуляторов ангиогенеза, таких как интерлейкин-8, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF-A) [119, 230].

Значение канонического сигнального пути Wnt для опухолевого ангиогенеза

Ангиогенез - необходимая составляющая прогрессии опухоли, обеспечивающая возможность роста и метастазирования. Накопление ß-катенина в цитоплазме и ядре характерно для клеток эндотелия новообразованных сосудов индуцированной глиомы у крыс, медуллобластомы и других опухолей ЦНС и редко наблюдается в клетках сосудов здорового мозга [59, 219, 220]. Таким образом, канонический сигнальный путь, возможно, способствует прогрессии опухолей, регулируя формирование сосудов.

Ангиогенез - это процесс, практически отсутствующий в норме у взрослого человека. Интенсивный рост сосудов наблюдается в процессе эмбриогенеза (васкулогенез), у взрослого человека ангиогенез наблюдается только во время физиологических процессов (например, при заживлении ран, при росте эндометрия). Во всех остальных случаях ангиогенез является патологическим процессом и происходит, в том числе, при воспалении или при росте и развитии большинства типов опухолей.

Основная роль в ходе ангиогенеза принадлежит факторам роста эндотелия сосудов VEGF. У человека к семейству VEGF принадлежит 5 представителей, но наиболее всего

показано участие в ангиогенезе белка УЕОР-А. Этот цитокин оказывает множество биологических эффектов, в том числе, характерных для процессов канцерогенеза и метастазирования.

Одним из основных механизмов запуска экспрессии УЕОБ-А является состояние гипоксии, однако существует целый ряд других механизмов регуляции его экспрессии. В частности, показано, что в регуляции физиологической или патологической транскрипции гена УЕОР-А участвует \¥п1/ (З-катениновый сигнальный путь - в промоторе гена УЕОБ-А имеется семь участков связывания Р-катенин/ТчТ[58, 229, 230].

Для лигандов канонического пути показано воздействие на метаболизм

костной ткани. Несмотря на то, что \Vnt3a сам по себе оказывает мало влияния на синтез УЕвР, он существенно усиливает стимулированный трансформирующим фактором роста-|3 (ТСР- Р) выход УЕвР из остеобластоподобных клеток [135].

Аберрантная активация канонического пути \Vrit наблюдается при многих видах рака [151]. В частности, показано, что усиление регуляции УЕвР-А выявлялось в тех образцах рака толстой кишки, в которых процесс канцерогенеза сопровождался снижением регуляции Р-катенина [58, 230].

Белки семейства УЕОБ могут связываться с двумя основными рецепторами, задействованными в процессе ангиогенеза - это УЕОР-Ш (также называемый ЕШ) и УЕОР-112. Различные варианты связывания представителей семейства со своими рецепторами определяет все многообразие биологических эффектов, вызываемых этим семейством цитокинов.

Показано, что ингибирование ангиогенеза в сетчатке глаза мыши происходит за счет того, что миелоидные клетки, расположенные в глубоких слоях сетчатки, усиливают продукцию рецептора Р1Ы, который связывает свободный УЕОР и, тем самым, ингибирует рост сосудов. Обнаружено, что продукция БЫ зависит от вырабатываемых миелоидными клетками \Vnt-лигандов неканонического пути - \Vnt5a и \Vntl 1 [168].

С тех пор как было установлено, что аберрантная активация канонического сигнального пути вовлечена в патогенез различных опухолевых заболеваний, в том числе карцином, естественно, ведутся не только исследования, расширяющие область знаний, о том в каких процессах и как задействованы компоненты сигнального пути. Активно изучается возможность противоопухолевой терапии, направленной на компенсацию аберрантной активации сигнального пути Так, например, сейчас известно, что

нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) могут подавлять активность Р-катенина. НПВС могут ингибировать \¥п1:/р-катениновый сигнальный путь на различных уровнях, включая индукцию деградации непосредственно р-катенина или

разрушение комплекса TCF/ß-катенин [28, 134]. Производные витаминов А и Д, образующиеся в организме человека или получаемые искусственно, продемонстрировали способность ингибировать сигнальный путь Wnt, подавляя образование комплекса TCF/ß-катенин. Благодаря накопленным знаниям о сигнальном пути и свойствах его компонентов разрабатываются различные высокоспецифичные средства. Такие как малые молекулы - ингибиторы, препятствующие образованию комплекса TCF/ß-катенин или Fzd/Dsh. Иммунотерапия, в которой используются антитела к различным компонентам сигнального пути. Терапия, основанная на применении онколитических вирусов или избирательной экспрессии генов вирусного происхождения, кодирующих токсины или их предшественники, направленные против опухолевых клеток [19].

Роль неканонических сигнальных путей Wnt в формировании и прогрессии опухолей

Эволюционно консервативный и важный для развития канонический сигнальный путь Wnt традиционно рассматривается как существенный фактор канцерогенеза. Тем не менее, накапливаются сведения о роли сигнального пути планарной клеточной полярности в процессах прогрессии опухоли, инвазии, метастазирования и ангиогенеза. Как было сказано выше, утверждать, что активирован тот или иной сигнальный путь, основываясь на том, какие присутствуют в клетках лиганды или рецепторы невозможно. Для того чтобы судить, об активации сигнального пути Wnt и представлять, к чему она приводит в описываемом случае, необходимо апеллировать к специфическим компонентам этого сигнального каскада. К коровым белкам сигнального пути планарной клеточной полярности относятся Frizzled, Dishevelled, Vangl (Strabismus), Celsr (Flamingo), Prickle. Их распределение задает координаты для поляризации клетки. Тканеспецифичные эффекторы этого неканонического сигнального пути преобразуют полученный сигнал в особую морфогенетическую программу, создавая определенный фенотип соответствующий планарной полярности (Daaml, Rae, Rho (RhoA), ROCK, Jnk, Profilin) [160]. Роль пути планарной полярности существенна для многих процессов эмбрионального развития, включая формирование большинства тканей и органов эмбриона. Примечательно, что эмбриональное развитие имеет много общих черт с процессом канцерогенеза. Еще в 19 веке Конгейм высказал предположение, что канцерогенез представляет собой сумму черт эмбрионального развития [152]. Действительно, регуляция консервативных сигнальных путей, участвующих в эмбриогенезе, включая Wnt, Notch, Hedgehog, нарушена в опухолевых клетках, подтверждая теорию, что опухоль представляет собой развитие (эмбриональное) пошедшее неправильно.

Для меланомы и гепатоцеллюлярной карциномы показано, что на начальных стадиях развития опухоли активирован канонический сигнальный путь, тогда как для прогрессии свойственна активация неканонического сигнального пути, активируемого лигандом Wnt5a. Так гепатоцеллюлярные карциномы условно разделяют на высокодифференцированные и низкодифференцированные. К первым относятся опухоли, в которых активирован канонический сигнальный путь Wnt, что коррелирует с хорошим прогнозом для пациентов. Низкодифференцированные характеризуются экспрессией «неканонических» лигандов и маркеров ЭМП (twist, slug, snail) [41, 141, 227].

Экспрессия классического «неканонического» лиганда Wnt5 показана в клетках различных линий и образцах колоректального рака [78]. Исследование экспрессии маркеров неканонических сигнальных путей при формировании колоректального рака показало, что на стадии аденомы активированы кальций-зависимый сигнальный путь Wnt и путь планарной клеточной полярности, а на стадии инвазивной опухоли -преимущественно второй из них [34]. Роль лиганда Wntll в регуляции нормального развития эпителия кишечника была изучена на линии клеток эпителия кишечника крыс. Показано, что присутствие в культуральной среде лиганда Wntll уменьшает скорость пролиферации, стимулирует дифференцировку клеток, ингибирует активацию канонического сигнального пути, стимулирует подвижность клеток. В качестве компонентов сигнального каскада, активируемого исследуемым лигандом, протестированы РКС и CarnKII и показана их активация. Последний факт говорит об активации кальций-зависимого сигнального пути, но не пути планарной клеточной полярности. Однако, фактов свидетельствующих, что путь планарной клеточной полярности не активирован, не представлено [143].

Для клеточных линий мезотелиомы показано, что наряду с активацией канонического сигнального пути присутствует экспрессия компонентов неканонического сигнального пути Wnt. Например, в клетках мезотелиомы детектирована повышенная экспрессия JNK и показано, что функциональная активность этой киназы способствует апоптозу опухолевых клеток [224].

Экспрессия Wnt5a коррелирует с прогрессией немелкоклеточного рака легких, поджелудочной железы, желудка [82, 107, 157].

Значение пути планарной клеточной полярности для метастазирования

Метастазы являются причиной смерти от рака приблизительно в 90% случаев. По мере развития опухоли, трансформированные клетки развивают способность проникать в окружающие ткани и через базальную мембрану, чтобы формировать вторичные опухоли в областях отдаленных от первичного очага. Образование опухолевого метастаза

представляет собой набор отдельных процессов. Выделяют стадии метастазирования, каждая из которых характеризуется определенным набором свойств и регулируется специфическими сигналами (отделение от опухоли клеток, выход в кровеносную или лимфатическую систему, циркуляция в организме, выход из крови/лимфы в ткани, формирование вторичной опухоли в новом месте) [213]. И хотя, молекулярные механизмы, вовлеченные в эти процессы, остаются не до конца понятными, факторы, ассоциированные с клеточной адгезией и миграцией клеток, считаются наиболее существенными для прогрессии опухоли и метастазирования.

Установлена центральная роль сигнального пути клеточной планарной полярности в модуляции клеточной адгезии, подвижности и движении клеток в эмбриогенезе [200]. Исследование компонентов и регуляторов этого сигнального пути показало их участие в процессах канцерогенеза и метастазирования.

Белок Van Gogh-Like2 (гомолог Van Gogh/Strabismus), регулирующий сигнальный путь планарной клеточной полярности, контролирует поведение мигрирующих клеток мезодермы в ходе гаструляции zebrafish. Полагают, что Vangl2 координирует внутренние и внешние процессы, лежащие в основе движения популяции клеток. Это мнение подтверждается генетическими взаимодействиями между Vangl2 и генами, кодирующими белки важные для регуляции клеточной адгезии, например ММР14/МТ1-ММР [47]. Экспрессия подобных матриксных металлопротеиназ характерна для процесса метастазирования, в частности, экспрессия МТ1-ММР высока в скелетных метастазах при прогрессии рака простаты [27]. Исследование роли Vangl2 в канцерогенезе показало, что этот белок регулирует коллективную миграцию клеток фибросаркомы, ограничивая инвазию опухоли. Также Vangl2 контролирует количество металлопротеиназ, представленных на поверхности плазматической мембраны, подавляя метастазирование. В некоторых типах опухолей детектирована повышенная экспрессия различных компонентов пути планарной клеточной полярности, включая Vangl2, в других наоборот. Так, аденокарцинома (кишечника, легких, поджелудочной железы), рабдомиосаркома и меланома ассоциированы с пониженным уровнем Vangl2 [37]. Что говорит о разнообразии механизмов, задействованных в канцерогенезе, в том числе и о разной роли сигнальных путей Wnt в разных опухолях.

Секретируемый белок Cthrcl, содержащий коллаген-подобные повторы, временно экспрессируется в клетках, образующих стенку кровеносных сосудов в ответ на повреждение. Показано, что на клеточном уровне Cthrcl действует координировано с Wnt5a и Dsh2, активируя эффекторные молекулы пути планарной полярности такие как RhoA и Rac. Биохимические исследования выявили, что Cthrcl способствует кластеризации Wnt/Fzd/Ror2, обеспечивая таким образом специфическую активацию пути

планарной клеточной полярности [216]. В то же время показано, что экспрессия Cthrcl усилена в опухолевых клетках и, по-видимому, ассоциирована с процессами инвазии и метастазирования [181].

Путь планарной клеточной полярности в ангиогенезе

Формирование кровеносных сосудов важный процесс не только для растущей опухоли, но и для метастазирования. Ангиогенез делает возможным снабжение опухолевой ткани кислородом и питательными веществами, а также проникновение опухолевых клеток в кровеносную систему организма. Процесс формирования новых сосудов многостадийный и сложный. Исследование вероятного естественного антагониста ангиогенеза фумагиллина выявило, что он выступает в роли специфического ингибитора неканонического сигнального пути Wnt, давая основания предполагать связь между этим сигнальным путем и ангиогенезом [231]. Искусственно синтезированный аналог фумагиллина TNP-40 нарушает рост, поляризацию и миграцию эндотелиальных клеток. Компонент сигнального пути планарной полярности Daaml может компенсировать дефекты, вызванные воздействием TNP-40 [43].

Двойственная роль пути планарной клеточной полярности в опухолевой прогрессии

Молекула клеточной адгезии параксиальный протокадгерин (РАРС) у лягушки участвует в регуляции конвергентного расширения в процессе эмбрионального развития. Показано, что ХРАРС может активировать сигнальный путь планарной клеточной полярности, действуя через RhoÀ и Jnk, чтобы координировать и синхронизировать клеточное движение [190]. Гомолог РАРС у человека - белок PCDH8 функционирует в качестве опухолевого супрессора и инактивирован в трети случаев карциномы молочной железы [225].

Взаимодействие лигандов (ephrinA и ephrinB) с рецепторными тирозинкиназами Eph играет существенную роль в эмбриогенезе и поддержании гомеостаза взрослого организма, регулируя разнообразные процессы, такие как адгезия, подвижность и миграция клеток, межклеточное взаимодействие [147]. Гены EphB экспрессируются в результате активации канонического сигнального пути Wnt. В эпителии тонкого кишечника рецепторы EphB контролируют компартментализацию клеток [21].

В клетках колоректального рака, несмотря на сохраняющуюся активность канонического сигнального пути, теряется экспрессия EphB/EphrinB [20]. Возможно, что EphrinB в раке кишечника выполняет функции супрессора опухолевой прогрессии, как PCDH8, и его присутствие способствует активации неканонического сигнального пути Wnt, который блокирует канонический сигнальный путь [46].

В опухолевых клетках часто детектируется повышенный уровень экспрессии членов семейства ephrinB, что также ассоциировано с ангиогенезом и метастазированием [35, 180]. Последние данные свидетельствуют, что внутриклеточный домен ephrinB 1 взаимодействует с Dsh и модулирует активность пути клеточной планарной полярности, контролируя адгезию и движения клеток [109].

Путь планарной клеточной полярности изучен гораздо меньше, чем канонический, но и для него уже накоплено достаточно противоречивых данных. Однако, знаний пока не достаточно, чтобы сформулировать модель, описывающую роль пути планарной клеточной полярности в канцерогенезе, его участие в опухолевой прогрессии или наоборот ингибирование оной. Существует мнение, что роль этого сигнального пути в канцерогенезе двойственна: на ранних стадиях он выступает в качестве супрессора, но в случае развития опухоли способствует прогрессии [199].

По сравнению с каноническим сигнальным путем, который играет существенную физиологическую роль, поддерживая гомеостаз в тканях взрослого организма, а не только регулируя процессы эмбриогенеза, путь планарной клеточной полярности по данным исследований считается более важным в первую очередь для эмбрионального развития. В соответствии с таким взглядом, компоненты этого неканонического сигнального пути являются более привлекательными мишенями для противоопухолевой терапии [199].

3. Материалы и методы исследований Ферменты и реактивы

В работе использовались ферменты, производимые фирмой «Fermentas» (Литва), и реактивы производства фирм «Sigma-Aldrich» (США), «Мегск» (Германия), «ICN» (США), «Bio-Rad» (США), «GE Healthcare» (США), «Applichem» (Германия), «Helicon» (Россия), «MP Biomedicals» (США), BD (США). Олигонуклеотиды для проведения ОТ-ПЦР, ПЦР и создания конструкций, кодирующих премикроРНК были заказаны в фирме «Литех» (Россия).

Выделение РНК, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

РНК выделяли из клеток линий меланомы человека и колоректального рака, а также из тканей человека по стандартному протоколу с модификациями [159]. Стволовые эмбриональные клетки были любезно предоставлены Ревазовой Е.С. (International Stem Cell Corporation, США), образцы других тканей были получены при хирургических вмешательствах, обусловленных медицинскими показаниями. Клетки или образцы тканей лизировали в буфере (4М гуанидин изотиоционат; 25мМ цитрат натрия, рН=7.0; 0.5% лауросаркозил натрия; 0.1 М (3-меркаптоэтанол), далее добавляли 0.1 объема 2М ацетата натрия, рН=4.0. Далее проводили экстракцию с помощью кислого фенола, с последующей экстракцией супернатанта хлороформом с изоамиловым спиртом (24:1). Затем осаждали РНК из супернатанта одним объёмом пропанола при -20° в течение часа. После осаждения РНК центрифугированием в течение 20 минут 3000 об/мин при +4°С. Осадок растворяли в лизирующем буфере (без добавления меркаптоэтанола, объем 1/3 от первоначального объема лизата) и повторяли осаждение, добавляя равный объем изопропанола. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в чистой воде. Концентрацию и чистоту РНК оценивали спектрофотометрическим методом.

Полученная тотальная РНК далее использовалась для получения первой цепи

кДНК в реакции обратной транскрипции под действием ревертазы RevertAid Reverse

Transcriptase ("Fermentas", Литва). Реакция обратной транскрипции проводилась в

условиях, рекомендованных производителем ревертазы. Для каждой реакции

использовалось по 1 мкг тотальной РНК. Первая цепь кДНК далее была использована в

качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для осуществления ПЦР

использовались пластиковые пробирки 0.65 мл («Corning Incorporated», США) и

ПЦР-прибор Omnigene («HYBAID», Великобритания). ПЦР-смесь включала в себя воду

«HyPure™ Molecular Grade Water Nuclease-Free, Deionized, Distilled, 0.1 um Sterile Filtered»

(«HyClone», США) и реагенты производства «Fermentas» (Литва): набор dNTP, Taq

35

ДНК-полимераза, буфер и раствор MgCh в концентрации, рекомендованной производителем фермента. Для предотвращения конденсации ПЦР-смеси на крышке пробирки использовалось минеральное масло. Результаты ПЦР регистрировали в 5% акриламидном геле. Для первого этапа гнездовой (nested) ПЦР были использованы праймеры NF1 [5'-GCC GCG CGA CGA TGA GGG-3'] и NR1 [5'-CAG AGT ССТ CGC ТСС TGC GT-3'], для второго этапа - NF2 [5'-ATG AGG GCG CGG CCG CAG GT-3'] и NR2 [5'-GAG GGC AGG GCC TCA CTT-3']. Для ОТ-ПЦР анализа экспрессии лиганда hWntl 1 в различных тканях и клетках использовали праймеры AF [5'-GTG AAG G АС TGG GAA СТТ GT-3'], BF [5'-GGG AGT CGG ССТ TCG TGT AT-3'], CR [5'-TCA CTT GCA GAC ATA GCG CT-3'], DF [5'-CCG CAG GTC TGC GAG G-3'], DR [5'-AGG AGC TGC AGG ATG TGG CT-3']. Для амплификации фрагмента, использованного при получении антител к белку hWntl 1 - hvFl [5'- AAG GAT CCC AGG ATG TGG CTG CTG AC-3'] и hvRl [5'-AAG TCG ACT TAG GGG TTG TAG CCA CGC C-3']; для контроля количества исследуемого материала использовали праймеры к гену глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы hGAPDHF [5'-АСС АСА GTC CAT GCC АТС АС-3'] и hGAPDHR [5'-ТСС АСС АСС CTG TTG CTG ТА-3'].

Гель-электрофорез ДНК

Для детекции фрагментов плазмидной ДНК и результатов ОТ-ПЦР проводили гель-электрофорез ДНК в 1 % агарозном геле, содержащем буфер ТАЕ с бромистым этидием [159]. Также для разделения ПЦР-фрагментов использовался электрофорез ДНК в 5% ПААГ, содержащем буфер TBE. После электрофореза гель инкубировали в растворе бромистого этидия в течение 15 мин. ДНК детектировалась в ультрафиолете (302 нм). Продукты ПЦР или фрагменты плазмидной ДНК вырезали из агарозного геля и очищали с помощью набора JETSORB Gel Extraction Kit («GENOMED GmbH», Германия).

Секвенирование

Секвенирование фрагментов ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 («Applied Biosystems», США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 («Applied Biosystems»).

Молекулярное клонирование

Для получения антител к белку hWntl 1 были созданы экспрессионные конструкции на базе плазмид pGEX-4T-l («GE Healthcare», США), pQE-30 («Qiagen», Германия) и очищенного из геля ПЦР-фрагмента, кодирующего область белка,

36

выбранную для иммунизации. Для исследования свойств белковых продуктов выявленных в работе сплайс-вариантов hWntl 1 использовались экспрессионные конструкции на базе плазмид pcDNA5/FRT/TO («Invitrogen», США) и pDED (любезно предоставленная к.б.н. Коробко И.В., ИБГ РАН, Москва). Кодирующие последовательности клонировали в указанные плазмиды с помощью стандартной методики лигирования липких концов в соответствии с протоколом производителя ферментов. Выделение плазмидной ДНК осуществляли при помощи набора HiSpeed® Plasmid Midi Kit («Qiagen GmbH», Германия). Выделение фрагментов плазмидной ДНК из геля проводили с использованием набора JETSORB Gel Extraction Kit («GENOMED», Германия).

Создание экспрессионных конструкций, кодирующих микроРНК

Для специфического ингибирования экспрессии hWntl 1 применяли набор «BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression Vector» производства «Invitrogen» (США). Проектирование последовательности, кодирующей пре-микроРНК, производили с помощью программного обеспечения, доступного на сайте производителя набора [26]. Были составлены олигонуклеотиды, кодирующие пре-микроРНК к трем разным участкам последовательности hWntl 1 : «939» [5'- TGC TGT ТСС GTT GGA TGT СТТ GTT GCG ТТТ TGG ССА CTG ACT GAC GCA АСА AGA ТСС AAC GGA А -3'], «958» [5'- TGC TGA TAA GGT CGC AGC TGT CGC TTG TTT TGG CCA CTG ACT GAC AAG CGA CAT GCG ACC TTA T -3'] и «102» [5'- TGC TGA CTT GAT GCC ATA GCA CAC GCG TTT TGG CCA CTG ACT GAC GCG TGT GCT GGC АТС AAG T -3']. В соответствии с протоколом производителя кодирующие и комплементарные им последовательности отжигали для создания двухцепочечной ДНК, которая использовалась для клонирования в экспрессионный вектор pcDNA™6.2-GW («Invitrogen», США). Специфичность последовательности, клонированной в вектор, проверяли путем секвенирования. Конструкция, использованная в качестве отрицательного контроля «NEG», входит в состав набора. Конструкция для отрицательного контроля «176» была создана в соответствии с рекомендациями производителей набора.

Трансформация клеток Е. coli.

Для амплификации рекомбинантных плазмидных ДНК использовался штамм Е. coli XL 10 Gold. Трансформацию бактериальных клеток осуществляли с использованием КСМ-буфера [91]. Компетентные клетки получали по стандартному протоколу [159]. Для трансформации к 100 мкл компетентных клеток добавляли 100 мкл смеси, состоящей из буфера КСМ и 10 мкл ДНК. Смесь клеток с ДНК 10 мин инкубировали на льду, после

37

чего 20 минут инкубировали при комнатной температуре. Трансформированные клетки высевали на чашки с твердым агаром и соответствующим антибиотиком и растили при 37°С в течение ночи. Полученные колонии использовали для наращивания культур и выделения плазмидной ДНК.

Культивирование клеточных линий, трансфекция

В работе были использованы клеточные линии меланомы человека (Mel 226, Mel 82, Mel G, Mel Ibr, Mel II, Mel Kor, Mel Kis, Mel Ksen, Mel Me, Mel P, Mel R, Mel Si). Первичные культуры всех клеточных линий меланомы человека, используемых в работе, были установлены из метастатических узлов пациентов [6-12]. Также в работе были использованы клеточные линии колоректального рака НТ29 и Т84 и линия клеток яичника китайского хомячка СНО (American Type Culture Collection, США).

Использованные в работе клеточные линии культивировали в пластиковой посуде «Corning Inc.» (США), в инкубаторе Heracell 150 («Thermo electron corp.», США) при температуре 37°С, 95% влажности и содержании С02 7%. Для культивирования клеточных линий НТ29, Т84 и СНО использовали среду DME/F12; для клеточных линий меланомы человека - среду RPMI-1640. Указанные среды применяли с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2мМ L-глутамина («HyClone», США), 100ед/мл пенициллина («ОАО Синтез», Россия) и 100мкг/мл стрептомицина («ОАО Биохимик», Россия). При пересеве удаляли питательную среду, избавлялись от следов среды и её компонентов путем добавления к клеткам фосфатно-солевого буфера («HyClone», США), удаляли буфер и инкубировали клетки в 0,05%» растворе трипсина («HyClone», США) в течение 3-5 минут. Затем фермент инактивировали путём добавления среды и засевали клетки в необходимой для дальнейшей экспериментальной работы плотности.

Трансфекцию клеток проводили с использованием реагента Unifectin 56, любезно предоставленного д.х.н. А.Ю. Суровым (Институт биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова РАН, Москва), который применяли в соответствии с рекомендациями производителя.

Получение антител к белку hWnt11

В качестве антигена для наработки антител против белка hWntll был выбран участок Gln231-Pro320. Для экспрессии фрагмента белка, выбранного для иммунизации, бактерии E.coli штамма XLIOGOLD были трансформированы конструкцией на основе вектора pGEX-4T-l. Трансформированные бактерии растили на среде LB и индуцировали экспрессию белка по стандартному протоколу [159]. Рекомбинантный белок, представляющий собой фрагмент Gln231-Pro320 лиганда hWntll, слитый с ферментом

глутатион-Б-трансферазой, выделяли из лизатов бактерий и очищали с использованием глутатион-сефарозы Glutatione Sepharose 4 Fast Flow («GE Healthcare», Великобритания) в соответствии с рекомендациями производителя. Двести мкг полученного рекомбинантного белка в 1 мл фосфатно-солевого буфера смешивали с равным объёмом адъюванта Фрейнда («Gibco», США) эмульгировали и инъецировали кролика подкожно. Дальнейшая реиммунизация, контрольное и окончательное взятие сыворотки проводилось по стандартной методике [5].

Для аффинной очистки антител из поликлональной сыворотки получали химерный белок, представляющий собой фрагмент лиганда hWntll Gln231-Pro320 с последовательностью из шести гистидиновых остатков на N-конце (His6 - "гистидиновый тэг"). Бактерии Е. coli штамма XLIOGOLD, трансформированные конструкцией на базе плазмиды pQE30, лизировали в соответствии с протоколом для денатурирующих условий. Наработанный белок очищали методом металл-хелатной хроматографии, используя субстрат Ni-NTA ("QIAGEN" Еермания) в соответствии с протоколом производителя. Очищенный белок подвергали диализу против буфера (10 мМ NaH2P04, 8 M мочевина, рН=8) и иммобилизовали на агарозе, активированной триазином. Полученный сорбент последовательно инкубировали с лизатом нетрансформированных бактерий, диализованным против того же буфера, а затем с сывороткой. Антитела, специфически связавшиеся с фрагментом лиганда hWntll, элюировали с сорбента (0.1 M цитрата, 0.05% Tween, рН=2) и доводили значение рН до 7. После добавления этиленгликоля (до 40% об./об.) антитела хранили при температуре -20°С.

Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот анализ

Процедуры электрофоретического разделения белков и переноса на мембрану осуществляли при комнатной температуре. Для подготовки проб (лизирование нативных или трансфицированных клеток или элюция с хроматографического носителя) применяли буфер для нанесения (125мМ Трис-HCl, рН=6.8, 4% SDS, 20% глицерола, 10% Р-меркаптоэтанола и 0.01% (вес/объем) бромфенолового синего). Пробы кипятили в течение 5 минут, а затем центрифугировали в течение 30 секунд при 14000 об/мин (настольная мини-центрифуга, «Eppendorf», Германия). Полученные образцы подвергали электрофорезу в 12.5% ДСН-ПААГ (толщина 0.75 мм) по Лэммли в камере для вертикального электрофореза MiniProtean 3 Cell Gel System («Bio-Rad», США) по стандартному протоколу. В качестве стандартов молекулярных весов использовались Prestained Dual Color Protein Standards («Bio-Rad», США).

Перенос белков на PVDF мембрану HYBOND-P («GE Healthcare», США) осуществляли при 90мА в течение 1 часа. Для предотвращения неспецифического связывания, инкубировали мембрану с блокирующим буфером (TBS, 0.05% Tween 20, 3% обезжиренное молоко) при температуре +4° С в течение часа. Для выявления белков использовали антитела кролика против Wntl 1 полученные как описано выше (разведение 1:1000 в 5% БСА, инкубация при 4°С в течение ночи) и против белка WIF («R&D systems», США). Также были использованы мышиные антитела к GFP («Русбиолинк», Россия), а-тубулину («Sigma», США) и DED-эпитопу («Русбиолинк», Россия). В качестве вторичных использовали антитела к иммуноглобулинам кролика или мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена («GE Healthcare», США). В случае необходимости использовалась биотинилированная форма антител к DED-эпитопу. В этом случае в качестве вторичных антител применяли стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена («Calbiochem», Канада). Люминесценцию детектировали с помощью набора реагентов Immobilon Western («Millipore», США) и документировали на приборе Universal Hood II Gel Imager («Bio-Rad», США).

Двойной люциферазный тест

Активацию канонического сигнального пути Wnt детектировали с использованием набора реагентов «Dual-Luciferase® Reporter Assay System» производства «Promega» (США). Для проведения двойного люциферазного теста клетки линий меланомы человека высевали в 24-луночный планшет, в количестве 1,5x105 клеток на лунку. Через 18-20 часов клетки трансфицировали, используя 100 нг плазмидной ДНК TOPFLASH («Millipore», США), 2 нг плазмидной ДНК pRL-CMV («Promega», США) и 100 нг pcDNA™5/FRT/TO («Invitrogen», США) или 100 нг плазмидной ДНК, содержащей вставку, кодирующую исследуемый белок. Вектор pCMV-hWnt3a, кодирующий белок Wnt3a человека (№NM_033131 в NCBI GenBank), любезно предоставленный д.б.н. Коробко И.В. (Институт биологии гена РАН) использовали в количестве 1 нг на реакцию трансфекции. Через 26 часа после трансфекции клетки лизировали и детектировали интенсивность биолюминесценции в клетках, используя люменометр Glomax 20\20 Luminometer («Promega», США) в соответствии с рекомендациями производителя. Каждый эксперимент проводили 3 раза, после чего вычисляли арифметическое среднее значение и стандартное отклонение.

Аффинная хроматография

Хроматография на гепарин-сефарозе осуществлялась в малых объемах - инкубация без элюции. Гепарин-сефарозу CL-6B («GE Healthcare», США), уравновешивали

г-1 ■ ' ■■■> > .'..iii. 5

фосфатно-солевым буфером с низким содержанием соли (до 20мМ Nad} К (етки CHOj или НТ29 высевали в 6-луночный планшет в количестве 2x105 клеток на лунку. Для исследования нативных клеток линии НТ29 собирали кондиционную среду и лизировали клетки через 24 часа после достижения монослоя. Клетки линии СНО трансфицировали экспрессионными конструкциями, используя 500 нг плазмидной ДНК на лунку. Через 72 часа после трансфекции клеток линии СНО экспрессионными конструкциями, собирали кондиционную среду или лизировали клетки, используя фосфатный буфер с добавлением детергентов (1% Triton Х-100 («Sigma», США), 0.1% Nonidet-40 («Flucka», Швейцария)). Один мл среды или лизата центрифугировали 1 мин при 14000 об\мин (настольная мини-центрифуга, «Eppendorf», Германия), супернатант инкубировали с 20 мкл 50% гепарин-сефарозы при 4°С на ротаторе в течение ночи, а затем центрифугировали 1 мин при 3500 об\мин (настольная мини-центрифуга, «Eppendorf», Германия). Для удаления несвязавшихся компонентов лизата или среды гепарин-сефарозу инкубировали с фосфатным буфером и центрифугировали 1 мин при 3500 об\мин (три раза). Вместо элюции субстрат кипятили с равным объемом буфера Лэммли для последующей детекции белков, связавшихся с субстратом [108].

Аффинная хроматография с сефарозой, несущей антитела к DED-эпитопу.

Клетки культуры СНО высевали в 6-луночный планшет из расчета 2x105 клеток на лунку. Через сутки клетки трансфицировали экспрессионными конструкциями, кодирующими белки слитые с DED-эпитопом, используя 500нг плазмидной ДНК на лунку. Через 24 часа после трансфекции клетки промывали фосфатным буфером («HyClone», США), затем лизировали в буфере (NaH2P04 20мМ, 1% Triton Х-100, 0.1% Nonidet-40; рН=7,4), лизаты клеток центрифугировали при 14000 об/мин (настольная мини-центрифуга, «Eppendorf», Еермания). Полученный супернатант (1 мл) инкубировали в присутствии сефарозы, конъюгированной с антителами к DED-эпитопу (20 мкл 50%-сефарозы на пробу), в течение ночи при температуре 4°С на ротаторе. Затем неспецифическое связывание инактивировалось трехкратной кратковременной инкубацией с фосфатным буфером. Вместо элюции субстрат кипятили с равным объемом буфера Лэммли для последующей детекции белков, связавшихся с субстратом.

Для выявления взаимодействия изоформ белка hWntl 1 с регуляторной молекулой WIF применяли последовательную инкубацию с сефарозой, несущей антитела к DED-эпитопу. На первом этапе 1 мл лизата трансфицированных или нативных клеток инкубировали с 40 мкл 50%-сефарозы, как описано выше. После троекратной инкубации с фосфатным буфером к '/г части образца добавляли буфер для нанесения и кипятили. Вторую половину образца инкубировали с фосфатным буфером, содержащим ЗООнг

ингибитора WIF («R&D systems», США) в течение ночи при темепературе 4°С на ротаторе. Избыток белка WIF удаляли путем троекратной инкубации с фосфатным буфером, после чего добавляли равный объем буфера для нанесения, чтобы детектировать связавшиеся белки методом Вестерн-блот анализа.

Статистическая обработка результатов.

При постановке всех экспериментов параллельно с опытными включали контрольные группы. Это позволило учитывать только те изменения, которые возникали под влиянием специфических воздействий, а не являлись результатом естественных колебаний характеристик экспериментальных моделей.

При обработке результатов двойного люциферазного теста пользовались стандартными статистическими методами. Каждый эксперимент проводили 3 раза, после чего вычисляли арифметическое среднее значение и стандартное отклонение. Оценку достоверности различий между исследуемыми группами проводили с использованием U-теста Манна-Уитни. Различия средних показателей считали достоверными при уровне значимости менее 0.05.

Программное обеспечение

При проведении in silico анализа полученных в работе данных использовались следующие программы. Анализ хроматограмм осуществляли с помощью программы Sequence Scanner Software vl.O («Applied biosystems», США). Нуклеотидные последовательности выравнивали относительно последовательности мРНК Wntl 1 (ас. No. ВС113386) из NCBI GenBank, используя программу Vector NTI v.10 («Invitrogen», США). Для выбора иммуногенного фрагмента проводили анализ физических свойств различных областей белка hWntl 1, используя программное обеспечение, предлагаемое базой ExPASy (http://cn.expasy.org/tools/).

4. Результаты и обсуждение

Формирование нормальных меланоцитов и возникновение и прогрессия меланомы - хороший пример общности процессов эмбрионального и опухолевого развития, регулируемых сигнальными путями \Vrit. Это обусловило выбор меланомы в качестве объекта исследования. Клеточные линии меланомы представляют собой отдельные популяции опухолевых клеток, являясь потомками индивидуальных клеток меланомы. Поэтому они могут нести различные генетические нарушения, и в клетках разных линий могут различаться биохимические процессы и регулирующие их сигнальные пути, как и их нарушения. Таким образом, использование в качестве объекта исследований клеточных линий меланомы позволяет получать репрезентативные результаты.

Активация канонического сигнального пути в клетках меланомы имеет особое значение. В обзоре литературы уже упоминалось, что отсутствие р-катенина в ядре клеток прогрессирующей меланомы коррелирует с худшей выживаемостью пациентов по сравнению с показателями пациентов, у которых в меланоме активирован канонический сигнальный путь [18]. Активность канонического сигнального пути \tynt, таким образом, представляет собой один из ключевых признаков, характеризующих опухолевую клетку. Для клеток меланомы активация канонического сигнального пути может быть свидетельством умеренной злокачественной трансформации. Ранее в нашей лаборатории была исследована способность клеток линий меланомы активировать канонический сигнальный путь в присутствии лиганда 11\Уп13а [3]. Исследование, было проведено с использованием двойного люциферазного теста. Клетки линий меланомы трансфицировали плазмидой, кодирующей фермент люциферазу светлячка (Ркойпт ругаШ) «ф» под ТСР-зависимым промотором, и плазмидой, кодирующей люциферазу морских кишечнополостных (ЯепШа гет/оптя) «р». Активация канонического сигнального пути приводит к экспрессии генов, находящихся под контролем

ТСР-зависимого промотора. Ген люциферазы «ф» находится под контролем ТСР-зависимого промотора, поэтому экспрессия люциферазы «ф» происходит в ответ на активацию канонического сигнального пути \¥п!:. Экспрессия люциферазы «р» происходит независимо от активации сигнальных путей и используется для контроля уровня трансфекции и базальной экспрессии. Активация канонического сигнального пути \¥п1 происходит в результате трансфекции клеток модельной системы конструкцией, кодирующей лиганд Ь'МЫЗа, и детектируется, благодаря увеличению уровня относительной биолюминесценции (Рис. 8).

х

Ц

Ж ri

«3 '_>

5; ^

чЛт

Й f-

3 0

с.

о

Л о

п

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Посвятенко, Александра Викторовна

6. Выводы

• Экспрессия лигаида ИАУпН 1 детектируется в 75% исследованных клеточных линий меланомы человека.

• Впервые показано, что в опухолевых клетках и нормальных тканях существует механизм альтернативного сплайсинга лиганда 1.

• Изоформа Ь\УпЦ 1 зрЗ лиганда й^УпИ 1, в отличие от полноразмерного белка, не является секретируемым белком.

• Изоформа 1 ер 1 лиганда 1т\Уп1:11 сохраняет способность секретироваться, а также взаимодействовать с секретируемым ингибитором сигнального пути белком ХУД7.

• Обнаруженные изоформы лиганда ИУ/пЦ1 в отличие от полноразмерного белка теряют способность ингибировать активацию канонического сигнального пути.

5. Заключение

Меланома принадлежит к числу быстро прогрессирующих и агрессивных опухолей. Клетки меланомы имеют общие свойства с предшественниками меланоцитов. Среди общих характерных черт - подвижность клеток и их пролиферативный потенциал. Установлено, что сигнальные пути Wnt принимают участие в контроле этих свойств, как в клетках меланомы так и в меланобластах. Активация канонического сигнального пути считается хорошим прогностическим признаком для пациентов с диагнозом меланома [41]. По мнению исследователей это может быть обусловлено существенной ролью канонического сигнального пути Wnt в процессе созревания меланоцитов. Активация неканонических сигнальных путей \Vflt может влиять на перестройку цитоскелета и подвижность клеток. Это существенно как для процессов инвазии и метастазирования, так и для эмбрионального развития. Например, лиганд \Vntl 1 участвует в регуляции миграции клеток нервного гребня, которые являются предшественниками нескольких типов клеток, включая нейроны и меланоциты [50, 120]. Лиганд \Vntl 1 считается «неканоническим», потому что преобладают данные о том, что он активирует неканонический сигнальный путь планарной клеточной полярности.

Активация пути планарной клеточной полярности контролирует организацию цитоскелета, подвижность клеток, их взаимодействие между собой. Вероятно, что активация сигнального пути планарной клеточной полярности может способствовать приобретению клетками фенотипа, характерного для злокачественной опухоли. Негативный эффект от активации неканонических сигнальных путей \\fnt усугубляется тем, что одним из следствий их активации является ингибирование канонического сигнального пути Несмотря на то, что \УпП 1 считается классическим активатором пути планарной клеточной полярности, отсутствуют данные о его роли в регуляции инвазии и метастазировании меланомы. Детальное исследование особенностей экспрессии лиганда в клетках меланомы является первым шагом к пониманию его роли в формировании агрессивного фенотипа клеток.

В данной работе были исследованы особенности экспрессии лиганда ИМ^пШ в различных опухолевых и нормальных клетках. Для исследования экспрессии 1г\УпШ в клетках меланомы были выбраны клеточные линии меланомы человека. Клеточные линии меланомы представляют собой отдельные популяции опухолевых клеток, каждая из которых является потомком конкретного клона меланомы, полученного из опухоли пациента. Поэтому они характеризуются различными генетическими и биохимическими особенностями, свойственными различным стадиям развития меланомы.

Исследование экспрессии ЬЛУпШ методом ОТ-ПЦР показало, что в 9 из 12 клеточных линий меланомы наблюдаются специфические ПЦР-продукты. Анализ экспрессии Ь\¥пЦ1 в клеточных линиях меланомы человека дает основания утверждать, что в 75% исследованных клеточных линий меланомы происходит экспрессия этого лиганда. Исследование экспрессии Ь\УпИ1 с применением праймеров, фланкирующих более протяженную область последовательности кДНК (ВР+СЫ по сравнению с АБ+СЯ, см приложение А панель А) выявило присутствие ампликонов различного размера. Соответствие нуклеотидной последовательности наблюдаемых ПЦР-фрагментов последовательности кДНК ИЛУпИ 1, подтверждено секвенированием.

В патогенезе колоректального рака также задействованы сигнальные пути \Уп1;. Однако, их участие отличается от такового в клетках меланомы. Для колоректального рака активация канонического сигнального пути является не только плохим признаком, но в 90% случаев - причиной возникновения опухоли. Тогда как активация неканонических сигнальных путей, во всяком случае, активируемых лигандом Wnt5a, ассоциирована с хорошим прогнозом для пациентов. Исследование экспрессии лиганда 11\Уп1;11 в клетках колоректального рака может прояснить роль данного лиганда в формировании злокачественного фенотипа клеток. Учитывая результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии 11\УпИ 1 в клетках линий меланомы и роль неканонических сигнальных путей в прогрессии колоректального рака, исследование экспрессии «неканонического» лиганда 1г\УпШ в клетках колоректального рака представляет особый интерес.

Результаты анализа экспрессии ЬХУпИ 1 в клеточных линиях колоректального рака человека методом ОТ-ПЦР позволяет заключить, что присутствие нескольких ампликонов разного размера, не является явлением специфичным только для клеток линий меланомы человека. Аналогичным образом, методом ОТ-ПЦР в клетках нормальных тканей человека с применением нескольких пар праймеров, установлено, что это явление не является опухоль-специфичным. Результат ОТ-ПЦР анализа экспрессии лиганда ИЛУпи 1 в клетках нормальных тканей также представляет собой набор ампликонов разного размера.

Обнаруженные ампликоны разных размеров были секвенированы, что подтвердило их соответствие нуклеотидной последовательности кДНК 11\УпШ. В результате т &Шсо анализа последовательностей, полученных в результате секвенирования, было установлено, что ампликоны, не соответствующие расчетной величине, свидетельствуют о присутствии в клетках нескольких изоформ мРНК 11\УпИ 1.

В данной работе впервые экспериментально показано, что экспрессия лиганда 1з\УпШ может сопровождаться альтернативным сплайсингом. Обнаруженные сплайс-варианты кодируют белки, отличающиеся от полноразмерного лиганда, что опровергает предсказанные в работе других авторов возможные результаты альтернативного сплайсинга [87]. Использованные в ОТ-ПЦР анализе праймеры, позволили детектировать четыре сплайс-варианта отличные от мРНК полноразмерного лиганда. Два сплайс-варианта имеют практически одинаковую кодирующую последовательность (Ъ\Уп1;118р1 и Ь\¥пШ8р4). Формирование изоформы 11\УпШ8р2 сопровождается сдвигом рамки считывания, аминокислотная последовательность этого сплайс-варианта еще не установлена. В качестве объектов исследования были выбраны изоформы Ь\¥пи 1эр1 и И\Уп1:118рЗ.

Для исследования свойств изоформ лиганда ЬХУпО 1 получены антитела к лиганду, позволяющие детектировать рекомбинантный и эндогенный белки Ь\Уп1:11.

Изучение свойств белковых продуктов ИХУпШвр! и 11\¥п1:118рЗ дало следующие результаты. Оба сплайс-варианта сохраняют способность связываться с веществом внеклеточного матрикса гепарином, что является одним из характерных свойств секретируемых молекул, в том числе семейства У/гй. Изоформа 11\УпШ8р1 является секретируемым белком. В результате трансляции сплайс-варианта ЬМ/пШврЗ образуется несекретируемая форма, тогда как полноразмерный лиганд ЬАУпШ относится к секретируемым белкам.

Изоформа Ь\УпШ, кодируемая сплайс-вариантом Ь\Уп1;118р1, также как и полноразмерный лиганд способна взаимодействовать с секретируемым регуляторным белком "ШТ.

Для исследования функциональной активности изоформ в качестве критерия была выбрана способность ингибировать канонический сигнальный путь \Уп1;. Это свойство лиганда 11\¥пШ было подтверждено исследованием эффектов, которые оказывает на активацию канонического сигнального пути подавление экспрессии эндогенного лиганда 11\¥пи 1 или экспрессия рекомбинатного ИХУпи 1.

В результате изучения функциональной активности обнаруженных изоформ Ь\УпШ установлено, что ни 1г\Уп1;118р1 ни 11\УпШ8рЗ не ингибируют активацию канонического сигнального пути Wnt. Таким образом, обе исследуемые новые изформы лишены функциональной активности, характерной для полноразмерного белка 11\Уп1;11.

Различные свойства исследованных изоформ ЬЛУпШ дают основание предположить, что они выполняют разные функции. Тот факт, что 1г\УпШ8р1 и И^УпШзрЗ лишены функциональной активности, характерной для полноразмерного белка ЬЛУпП1, не означает, что они лишены любой функциональной активности.

Результаты данной работы подчеркивают необходимость при исследовании сигнальных путей учитывать возможное существование сплайс-вариантов компонентов. Так как альтернативный сплайсинг может привести к образованию белков имеющих абсолютно другие функции, чем полноразмерная изоформа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Посвятенко, Александра Викторовна, 2012 год

Список литературы

1. Копнин Б.П. 2002. Неопластическая клетка: основные свойства и механизмы их возникновения. Практическая онкология. 3(4), 229-235.

2. Коробко И.В., Коробко Е.В., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Гнучев Н.В. Пептид DED и его применение для идентификации и/или очистки рекомбинантных белков, вектор pDED. Патент RU 2380373, Приоритет изобретения 21.11.2007.

3. Куликова К.В., Посвятенко A.B., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Кибардин A.B., Ларин С.С. 2011. Внутриядерная локализация ß-катенина не может считаться достаточным условием для активности канонического сигнального пути Wnt в клеточных линиях меланомы человека. Молекулярная биология. 45(5), 884—891.

4. Лукьянов Е.В., Виедлоха А., Куявская Д.В., Олснес С., Козлов Ю.В. 2002. Короткая форма гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста с измененным EGF-доменом. Молекуляр. биология. 36, 76-83.

5. Михайлов А.Т., Смирский В.Н. 1991. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. М.:Наука.

6. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Барышников К.А. Клеточная линия меланомы человека mel Me, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент RU 2402603 Приоритет изобретения 12.02.2009.

7. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Барышников К.А., Клеточная линия меланомы человека mel Ksen, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент RU 2392316 Приоритет изобретения 26.12.2008.

8. Михайлова H.H., Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Киселев С.Л., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Клеточная линия меланомы человека mel Si, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент RU 2363734, Приоритет изобретения 24.04.2008.

9. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бережной А.Е., Козлов A.M., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В. Клеточная линия меланомы человека mel Ibr, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент RU 2387576, Приоритет изобретения 22.04.2005.

10. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л.В., Лукашина М.И., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В., Клеточная линия меланомы человека mel IL, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент RU 2387577, Приоритет изобретения 22.04.2005.

11. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л.В., Палкина Т.Н., Козлов A.M., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В., Клеточная линия меланомы человека mel Р, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент RU 2387575, Приоритет изобретения 22.04.2005.

12. Михайлова И.Н., Барышников А.Ю., Морозова Л.Ф., Бурова О.С., Демидов Л.В., Козлов A.M., Ларин С.С., Георгиев Г.П., Ворожцов Г.Н., Гнучев Н.В., Клеточная линия меланомы человека mel Ког, используемая для получения противоопухолевых вакцин. Патент RU 2387578, Приоритет изобретения 22.04.2005.

13. Патрушев Л.И. 2000. Экспрессия генов. М.: Наука.

14. Adler P.N. 2002. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev. Cell. 2, 525-535.

15. Angers S. and Moon R.T. 2009. Proximal events in Wnt signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 468-477.

16. Axelrod J.D., Miller J.R., Shulman J.M., Moon R.T. and Perrimon N. 1998. Differential recruitment of Dishevelled provides signaling specificity in the planar cell polarity and Wingless signaling pathways. Genes Dev. 12, 2610-2622.

17. Baba Y., Yokota Т., Spits H., Garrett K.P., Hayashi S., Kincade P.W. 2006. Constitutively active beta-catenin promotes expansion of multipotent hematopoietic progenitors in culture. J. Immunol. 177, 2294-2303.

18. Bachmann I.M., Straume O., Puntervoll H.E., Kalvenes M.B. and Akslen L.A. 2005. Importance of P-Cadherin, B-Catenin, and Wnt5a/Frizzled for Progression of Melanocytic Tumors and Prognosis in Cutaneous Melanoma. Clin. Cancer Res. 11(24), 8606-8614.

19. Barker N., Clevers H. 2006. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 997-1014.

20. Batlle E., Bacani J., Begthel H., Jonkeer S., Gregorieff A., van de Born M., Malats N., Sancho E., Boon E., Pawson Т., Gallinger S., Pals S. and Clevers H. 2005. EphB receptor activity suppresses colorectal cancer progression. Nature. 435, 1126-1130.

21. Batlle E., Henderson J.T., Beghtel H., van den Born M.M.W., Sancho E., Huls G., Meeldijk J., Robertson J., van de Wetering M., Pawson T. and Clevers H. 2002. |3-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/EphrinB. Cell. Ill, 251-263.

22. Behrens J., Jerchow B.A., Wurtele M., Grimm J., Asbrand C., Wirtz R., Kiihl M., Wedlich D., Birchmeier W. 1998. Functional interaction of an axin homolog, conductin, with beta-catenin, APC, and GSK3beta. Science. 280, 596-599.

23. Bellaiche Y., Beaudoin-Massiani O., Stuttem I. and SchweisguthF. 2004. The planar cell polarity protein Strabismus promotes Pins anterior localization during asymmetric division of sensory organ precursor cells in Drosophila. Development. 131, 469-478.

24. Bhanot P., Brink ML, Samos C.H., Hsieh J.C., Wang Y., Маске J.P., Andrew D., Nathans J. and Nusse R. 1996. A new member of the frizzled family from Drosophila functions as a Wingless receptor. Nature. 382, 225-230.

25. Bilic J., Huang Y. L., Davidson G., Zimmermann Т., Cruciat C.M., Bienz M. and Niehrs C. 2007. Wnt induces LRP6 signalosomes and promotes dishevelled-dependent LRP6 phosphorylation. Science. 316, 1619-1622.

26. BLOCK-iT™ RNAi Designer, [электронный ресурс] URL: http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/ дата посещения 20.01.2012.

27. Bonfil R.D., Dong Z., Carlos J., Filho Т., Sabbota A., Osenkowski P., Nabha S., Yamamoto H., Chinni S.R, Zhao H., Mobashery S., Vessella R.L., Fridman R. and Cher M.L. 2007. Prostate Cancer-Associated Membrane Type 1-Matrix Metalloproteinase. A Pivotal Role in Bone Response and Intraosseous Tumor Growth. Am. J. Pathol. 170(6), 2100-2111.

28. Bos C.L., Kodach L.L., van den Brink G.R., Diks S.H., van Santen M.M., Richel D.J., Peppelenbosch M.P., Hardwick J.C. 2006. Effect of aspirin on the Wnt/betacatenin pathway is mediated via protein phosphatase 2A. Oncogene. 25, 6447-6456.

29. Boutros M., Mihaly J., Bouwmeester T. and Mlodzik M. 2000. Signaling specificity by Frizzled receptors in Drosophila. Science 288, 1825-1828.

30. Bradley R.S., Brown A.M. 1990. The proto-oncogene int-1 encodes a secreted protein associated with the extracellular matrix. EMBOJ., 9(5), 1569-1575.

31. Bryja V., Andersson E.R., Schambony A., Esner M., Bryjova L., Biris K.K., Hall A.C., Kraft В., Cajanek L., Yamaguchi T.P., Buckingham M.]f and Arenas E. 2009. The extracellular domain of Lrp5/6 inhibits noncanonical Wnt signaling in vivo. Mol. Biol. Cell. 20, 924-936.

32. Cadigan K.M. and Peifer M. 2009. Wnt Signaling from Development to Disease: Insights from Model Systems. Cold Spring Harb Perspect Biol. 1, a002881, 1-23.

33. Caldwell G. M., Jones С. E., Taniere P., Warrack R., Soon Y., Matthews G. M., Morton D. G. 2006. Wnt antagonist sFRPl is downregulated in premalignant large bowel adenomas. Br J Cancer. 94, 922-927.

34. Caldwell G.M., Jones C.M., Soon Y., Warraek R., Morton D.G., and Matthews G.M. 2008. Reorganisation of Wnt-response pathways in colorectal tumorigenesis. Br. J. of Cancer. 98, 1437-1442.

35. Campbell T.N., Robbins S.M. 2008. The Eph Receptor/Ephrin system: an emerging player in the invasion game. Curr. Issues Mol. Biol. 10, 61-66.

36. Caneparo L., Huang Y.L., Staudt N., Tada M., Ahrendt R., Kazanskaya O., Niehrs C. and Houart C. 2007. Dickkopf-1 regulates gastrulation movements by coordinated modulation of Wnt/beta catenin and Wnt/PCP ctivities, through interaction with the Dally-like homolog Knypek. Genes Dev. 21, 465-480.

37. Cantrell A., Jessen J.R. 2010. The planar cell polarity protein Van Gogh-Like 2 regulates tumor cell migration and matrix metalloproteinase-dependent invasion. Cancer Lett. 287(1), 54-61.

38. Cha S.W., Tadjuidje E., Tao Q., Wylie C. and Heasman J. 2008. Wnt5a and Wntl 1 interact in a maternal Dkkl-regulated fashion to activate both canonical and non-canonical signaling in Xenopus axis formation. Development. 135, 3719-3729.

39. Chang L., Jones Y., Ellisman M.H., Goldstein L.S., and Karin M. 2003. JNK1 is required for maintenance of neuronal microtubules and controls phosphorylation of microtubule-associated proteins. Dev. Cell. 4, 521-553.

40. Chesire D.R., Ewing C.M., Sauvageot J., Bova G.S., Isaacs W.B. 2000. Detection and analysis of beta-catenin mutations in prostate cancer. Prostate. 45, 323-334.

41. Chien A.J., Moore E.C., Lonsdorf A.S., Kulikauskas R.M., Rothberg B.G., Berger A.J., Major M.B., Hwang S.T., Rimm D.L., and Moon R.T. 2009b. Activated Wnt/b-catenin signaling in melanoma is associated with decreased proliferation in patient tumors and a murine melanoma model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106(4), 1193-1198.

42. Choi S.-C. and Han J.-K. 2002. Xenopus Cdc42 regulates convergent extension movements during gastrulation through Wnt/Ca2+ signaling pathway. Dev. Biol. 244, 342-357.

43. Cirone P., Lin S., Griesbach H.L., Zhang Y., Slusarski D.C., Crews C.M. 2008. A role for planar cell polarity signaling in angiogenesis. Angiogenesis. 11, 347-360.

44. Clevers H. 2004. Wnt signaling: Ig-norrin the dogma. Curr. Biol. 14, R436-R437.

45. Clevers H. 2006. Wnt/p-Catenin Signaling in Development and Disease. Cell. 127, 469-480.

46. Clevers H. and Batlle E. 2006. EphB/EphrinB Receptors, Wnt, and Colorectal Cancer. Cancer Res. 66(1), 2-5.

47. Coyle R.C., Latimer A., Jessen J.R. 2008. Membrane-type 1 matrix metalloproteinase regulates cell migration during zebrafish gastrulation: Evidence for an interaction with non-canonical Wnt signaling. Exp. Cell Res. 314, 2150-2162.

48. Cselenyi C.S. and Lee E. 2008. Context-dependent activation or inhibition of Wnt-beta-catenin signaling by Kremen. Sci. Signal. 1, pelO.

49. Da Forno P.D., Pringle J.H., Hutchinson P., Osborn J., Huang Q., Potter L., Hancox R.A., Fletcher A., Saldanha G.S. 2008. WNT5A expression increases during melanoma progression and correlates with outcome. Clin. Cancer Res. 14, 5825-5832.

50. De Calisto J., Araya C., Marchant L., Riaz C. F. and Mayor R. 2005 Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development. 132, 2587-2597.

51. de La Coste A., Romagnolo B., Billuart P., Renard C.A., Buendia M.A., Soubrane O., Fabre M„ Chelly J., Beldjord C., Kahn A., Perret C. 1998. Somatic mutations of the beta-catenin gene are frequent in mouse and human hepatocellular carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 8847-8851.

52. de la Taille A., Rubin M.A., Chen M.W., Vacherot F., de Medina S.G., Burchardt M., Buttyan R., Chopin D. 2003. Beta-catenin-related anomalies in apoptosis-resistant and hormone-refractory prostate cancer cells. Clin. Cancer Res. 9, 1801-1807.

53. Dejmek J., Dejmek A., Sáfholm A., Sjolander A., Andersson T. 2005. Wnt-5a protein expression in primary dukes B colon cancers identifies a subgroup of patients with good prognosis. Cancer Res. 65, 9142-9146.

54. DiNardo S., Sher E., Heemskerk-Jongens J., Kassis J.A. and O'Farrell P.H. 1988. The present view on the function of wg/Dint-1 is that it functions as an extracellular differentiation factor that contributes to the developing fate of neighboring cells by affecting their gene expression. Nature. 332, 604-609.

55. Dissanayake S.K. and Weeraratna A.T. 2008. Detecting PKC Phosphorylation as Part of the Wnt/Calcium Pathway in Cutaneous Melanoma. In: Wnt Signaling, Volume I: Pathway Methods and Mammalian Models, vol. 468. Ed. Elizabeth Vincan. Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, Totowa, NJ, pp. 157-172.

56. Doubravska L., Krausova M., Gradl D., Vojtechova M., Tumova L., Lukas J., Valenta T., Pospichalova V., Fafilek B., Plachy J., Sebesta O., Korinek V. 2011. Fatty acid modification of Wntl and Wnt3a at serine is prerequisite for lipidation at cysteine and is essential for Wnt signaling. Cell Signal. 23(5), 837-848.

57. Dunn K.J., Williams B.O., Li Y., Pavan W.J. 2000. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wntl role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 97, 10050-10055.

58.

59.

60.

61.

62.

63.

64.

65.

66.

67.

68.

69,

70

71

Easwaran V.E., Lee S.H., Inge L., Guo L., Goldbeck C., Garrett E., Wiesmann M., Garcia P.D., Fuller J.H., Chan V., Randazzo F., Gundel R., Warren R.S., Escobedo J., Aukerman S.L., Taylor R.N. and Fantl W.J. 2003. beta-Catenin regulates vascular endothelial growth factor expression in colon cancer. Cancer Res. 63(12), 3145-3153. Eberhart C.G., Tihan T., Burger P.C. 2000. Nuclear localization and mutation of beta-catenin in medulloblastomas. JNeuropathol Exp. Neurol. 59, 333-337. Fanto M. and McNeill H. 2004. Planar polarity from flies to vertebrates. Journal of Cell Science. 117, 527-533.

Fear M.W., Kelsell D.P., Spurr N.K. and Barnes M.R. 2000. Wnt-16a, a novel Wnt-16 isoform, which shows differential expression in adult human tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun. 278, 814-820.

Fung Y.K.T., Shackleford G.M., Brown A.M.C., Sanders G.S. and Varmus H.E. 1985. Nucleotide sequence and expression in vitro of cDNA derived from mRNA of int-1, a provirally activated mouse mammary oncogene. Mol. Cell. Biol. 5, 3337-3344. Gardina P.J., Clark T.A., Shimada B., Staples M.K., Yang Q., Veitch J., Schweitzer A., Awad T., Sugnet C., Dee S., Davies C., Williams A. and Turpaz Y. 2006 Alternative splicing and differential gene expression in colon cancer detected by a whole genome exon array. BMC Genomics. 7, 325.

Giles R.H., van Es J.H., Clevers H. 2003. Caught up in a Wnt storm: Wnt signaling in cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 1653, 1 - 24.

Goldstein B., Takeshita H., Mizumoto K. and Sawa H. 2006. Wnt signals can function

as positional cues in establishing cell polarity. Dev. Cell. 10, 391-396.

Gong Y., Mo C. and Fraser S.E. 2004. Planar cell polarity signalling controls cell

division orientation during zebrafish gastrulation. Nature. 430, 689-693.

Goto T., Davidson L., Asashima M., Keller R. 2005. Planar Cell Polarity Genes

Regulate Polarized Extracellular Matrix Deposition during Frog Gastrulation. Curr.

Biol. 15, 787-793.

Gubb D., Garcia-Bellido A. 1982. A genetic analysis of the determination of cuticular polarity during development in Drosophila melanogaster. JEmbryol Exp Morphol. 68, 37-57.

Guder C., Philipp I., Lengfeld T., Watanabe H., Hobmayer B. and Holstein T. W. 2006. The Wnt code: cnidarians signal the way. Oncogene. 25(57), 7450-7460. Guo N., Hawkins C. and Nathans J. 2004. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 9277-9281.

Habas R., Dawid I. B., He X. 2003. Coactivation of Rac and Rho by Wnt/Frizzled signaling is required for vertebrate gastrulation. Genes Dev. 17, 295-309.

72. Hanahan D., and Weinberg R.A. 2000. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70.

73. Harris K.E. and Beckendorf S.K. 2007. Different Wnt signals act through the Frizzled and RYK receptors during Drosophila salivary gland migration. Development. 134, 2017-2025.

74. Hassler C., Cruciat C.M., Huang Y.L., Kuriyama S., Mayor R. and Niehrs C. 2007. Kremen is required for neural crest induction in Xenopus and promotes LRP6-mediated Wnt signaling. Development. 134, 4255-4263.

75. He X., Semenov M., Tamai K., Zeng X. 2004. LDL receptor-related proteins 5 and 6 in Wnt/beta-catenin signaling: arrows point the way. Development. 131, 1663-1677.

76. Heisenberg C.P., Tada M., Rauch G.J., Saude L., Concha M. L., Geisler R., Stemple D.L., Smith J.C. and Wilson S.W. 2000. Silberblick/Wntl 1 mediates convergent extension movements during zebrafish gastrulation. Nature. 405, 76-81.

77. Hoang B., Moos M. Jr., Vukicevic S. and Luyten F.P. 1996. Primary structure and tissue distribution of FRZB, a novel protein related to Drosophila frizzled, suggest a role in skeletal morphogenesis. J. Biol. Chem. 271, 26131-26137.

78. Holcombe R.F., Marsh J.L., Waterman M.L., Lin F., Milovanovic T., Truong T. 2002. Expression of Wnt ligands and Frizzled receptors in colonic mucosa and in colon carcinoma. J. Clin. Pathol.: Mol. Pathol. 55, 220-226.

79. Hoppler S., Brown J.D., and Moon R.T. 1996. Expression of a dominant-negative Wnt bloks induction of MyoD in Xenopus embryos. Genes Dev. 10, 2805-2817.

80. Hsieh J.C., Kodjabachian L., Rebbert M.L., Rattner A., Smallwood P.M., Samos C.H., Nusse R., Dawid I.B., and Nathans J. 1999. A new secreted protein that binds to Wnt proteins and inhibits their activities. Nature. 398, 431 —436.

81. Huang C.L., Liu D., Ishikawa S., Nakashima T., Nakashima N., Yokomise H., Kadota K., Ueno M. 2008. Wntl overexpression promotes tumor progression in non-small cell lung cancer. European Journal of Cancer. 44, 2680-2688.

82. Huang C.L., Liu D., Nakano J., Ishikawa S., Kontani K., Yokomise H., Ueno M. 2005. Wnt5a expression is associated with the tumor proliferation and the stromal vascular endothelial growth factor - an expression in non-small-cell lung cancer. J Clin. Oncol. 23, 8765-8773.

83. Inoue T., Oz H.S., Wiland D., Gharib S., Deshpande R., Hill R.J., Katz W.S. and Sternberg P.W. 2004. C. elegans LIN-18 is a Ryk ortholog and functions in parallel to LIN-17/Frizzled in Wnt signaling. Cell. 118, 795-806.

84. Itasaki N., Jones C.M., Mercurio S., Rowe A., Domingos P.M., Smith J.C., and Krumlauf R. 2003. Wise, a context-dependent activator and inhibitor of Wnt signaling. Development. 130, 4295^305.

85.

86.

87.

88.

89.

90.

91.

92.

93,

94.

95.

96

97

98

James R.J., Conrad W.H. and Moon T. 2008. P-Catenin-Independent Wnt Pathways: Signals, Core Proteins, and Effectors. In: Methods in molecular biology. Wnt Signaling. Volume I. Pathway Methods and Mammalian Models. Vol. 468. Ed Vincan E. Humana Press, pp. 131-144.

Jones and Chen 2007 Planar cell polarity signaling in vertebrates. BioEssays. 29, 120-132.

Katoh M. and Katoh M. 2009. Integrative genomic analyses of WNT 11 : Transcriptional mechanisms based on canonical WNT signals and GATA transcription factors. Int. J. Mol. Med. 24, 247-251.

Katoh M., Hirai M., Sugimura T., Terada M. 1996. Cloning, expression and chromosomal localization of Wnt-13, a novel member of the Wnt gene family. Oncogene. 13(4), 873-876.

Katoh M., Kirikoshi H., Saitoh T., Sagara N. and Koike J. 2000. Alternative splicing of the WNT-2B/WNT-13 gene. Biochem. Biophys. Res. Commun. 275, 209-216. Kazanskaya O., Glinka A., del Barco Barrantes I., Stannek P., Niehrs C., Wu W. 2004. R-Spondin2 is a secreted activator of Wnt/beta-catenin signaling and is required for Xenopus myogenesis. Dev. Cell. 7, 525-534.

KCM buffer (5X). 2008. Cold Spring Harbor Protocols. doi:10.1101/pdb.recl 1454 Keller R., Davidson L., Edlund A., Elul T., Ezin M., Shook D., Skoglund P. 2000. Mechanisms of convergence and extension by cell intercalation. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol Sci. 355, 897-922.

Keller R.E., Danilchik M., Gimlich R. and Shih J. 1985. The function and mechanism of convergent extension during gastrulation of Xenopus laevis. Embryol. exp. Morph. 89, Supplement, 185-209.

Kikuchi A., Yamamoto H. and Sato A. 2009. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends Cell Biol. 19, 119-129.

Kim G.-H., Her J.-H. and Han J.-K. 2008. Ryk cooperates with Frizzled 7 to promote Wnt 11-mediated endocytosis and is essential for Xenopus laevis convergent extension movements./. Cell Biol. 182(6), 1073-1082.

Kim K.A., Kakitani M., Zhao J., Oshima T., Tang T., Binnerts M., Liu Y., Boyle B.,

Park E., Emtage P., Funk W.D., Tomizuka K. 2005. Mitogenic influence of human

R-spondinl on the intestinal epithelium. Science. 309, 1256-1259.

Kinzler K.W., Vogelstein B. 1996. Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell. 87,

159-170.

Kirikoshi H., Sekihara H. and Katoh M. 2001. Molecular cloning and characterization of human WNT11. Int. J. Mol. Med. 8, 651-656.

99.

100,

101

102,

103

104,

105

106

107

108

109

110

111

Klingensmith J. and Nüsse R. 1994. Signaling by wingless in Drosophila. Dev. Biol. 166, 396^114.

Komekado H., Yamamoto H., Chiba T., Kikuchi A. 2007.Glycosylation and palmitoylation of Wnt-3a are coupled to produce an active form of Wnt-3a. Genes Cells. 12(4), 521-534.

Komiya Y. and Habas R. 2008. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4(2), 68-75.

Korinek V., Barker N., Morin P.J., van Wichen D., de Weger R., Kinzler K.W., Vogelstein B., Clevers H. 1997. Constitutive transcriptional activation by a beta-Catenin-Tcf complex in APC_/ colon carcinoma. Science. 275, 1784-1787. Kroiher M., Miller M.A., Steele R.E. 2001. Deceiving appearances: Signaling by "dead" and "fractured" receptor protein-tyrosine kinases. Bioessays. 23, 69-76. Kühl M., Sheldahl L.C., Malbon C.C. and Moon, R.T. 2000a. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is stimulated by Wnt and Frizzled homologs and promotes ventral cell fates in Xenopus. J. Biol. Chem. 275, 12701-12711. Kühl M., Sheldahl L.C., Park M., Miller J.R., Moon R.T. 2000. The Wnt/Ca2+ pathway: a new vertebrate Wnt signaling pathway takes shape. Trends Genet. 16, 279283.

Kulikova K., Kibardin A., Gnuchev N., Georgiev G. and Sergey Larin. 2011. Dual Function of Wnts in Human Cutaneous Melanoma. In: Research on Melanoma - A Glimpse into Current Directions and Future Trends Eds Murph M. InTech, pp 243268.

Kurayoshi M., Oue N., Yamamoto H., Kishida M., Inoue A., Asahara T., Yasui W., Kikuchi A. 2006. Expression of Wnt-5a is correlated with aggressiveness of gastric cancer by stimulating cell migration and invasion. Cancer Res. 66, 10439-10448. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 221, 680-685.

Lee H.S., Mood K., Battu G., Ji Y.J., Singh A., Daar I.O. 2009. Fibroblast growth factor receptor-induced phosphorylation of EphrinBl modulates its interaction with Dishevelled. Mol. Biol. Cell. 20, 124-133.

Li C., Chen H., Hu L., Xing Y., Sasaki T., Villosis M.F., Li J., Nishita M., Minami Y. and Minoo P. 2008. Ror2 modulates the canonical Wnt signaling in lung epithelial cells through cooperation with Fzd2. BMC Mol. Biol 9, 11.

Liepinsh E., Bänyai L., Patthy L., Otting G. 2006. NMR structure of the WIF domain of the human Wnt-inhibitory factor-1. J. Mol. Biol. 357, 942-950.

112.

113.

114.

115.

116.

117.

118.

119.

120.

121.

122.

123.

124

125

126

Liu C. and He X. 2010. Destruction of a Destructor: A New Avenue for Cancer Therapeutics Targeting the Wnt Pathway. JMol. Cell Biol. 2(2), 70-73. Logan C.Y., Nuss R. 2004. The Wnt signaling in development and disease. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 781-810.

Lu W., Yamamoto V., Ortega B., and Baltimore D. 2004. Mammalian Ryk Is a Wnt Coreceptor Required for Stimulation of Neurite Outgrowth. Cell. 119, 97-108. Maiti S., Alam R., Amos C.I., Huff V. 2000. Frequent association of beta-catenin and WT1 mutations in Wilms tumors. Cancer Res. 60, 6288-6292. Malinauskas T. 2008. Docking of fatty acids into the WIF domain of the human Wnt inhibitory factor-1. Lipids. 43(3), 227-230.

Malinauskas T., Aricescu A.R., Lu W., Siebold C., Jones E.Y. 2011 Modular mechanism of Wnt signaling inhibition by Wnt inhibitory factor 1. Nat. Struct. Mol. Biol. 18(8), 886-893.

Mao B., Wu W., Li Y., Hoppe D., Stannek P., Glinka A. and Niehrs C. 2001. LDL-receptor-related protein 6 is a receptor for Dickkopf proteins. Nature. 411, 321325.

Masckauchan T.N., Shawber C.J., Funahashi Y., Li C.M., Kitajewski J. 2005. Wnt/beta-catenin signaling induces proliferation, survival and Interleukin-8 in human endothelial cells. Angiogenesis. 8, 43-51.

Matthews H.K., Broders-Bondon F., Thiery J.P. and Mayor R. 2008. Wntl lr Is Required for Cranial Neural Crest Migration. Developmental dynamics. 237, 3404-3409.

Maye P., Zheng J., Li L. and Wu D. 2004. Multiple Mechanisms for Wntl 1-mediated Repression of the Canonical Wnt Signaling Pathway. . J. Biol. Chem. 279(23), 24659-24665.

McMahon A.P. and Moon R.T. 1989. Ectopic expression of the protooncogene int-1 in Xenopus embryos leads to duplication of the embryonic axis. Cell. 58, 1075-1084. Medina A., Reintsch W. and Steinbeisser H. 2000. Xenopus frizzled 7 can act in canonical and non-canonical Wnt signaling pathways: implications on early patterning and morphogenesis. Mech. Dev. 92, 227-237.

Mikels A., Minami Y. and Nusse R. 2009. Ror2 Receptor Requires Tyrosine Kinase Activity to Mediate Wnt5A Signaling. J. Biol. Chem. 284(44), 30167-30176. Mikels A.J. and Nusse R. 2006. Purified Wnt5a protein activates or inhibits beta-catenin-TCF signaling depending on receptor context. PLoSBiol. 4, el 15. Miller J.R. 2001. The Wnts. Genome Biology, 3(1), 3001.1-3001.15.

127.

128.

129.

130.

131.

132.

133,

134,

135

136

137

138

139

Miller J.R. and Moon R.T. 1996. Signal transduction through b-catenin and

specification of cell fate during embryogenesis. Genes & Dev. 10, 2527-2539.

Mlodzik M. 1999. Planar polarity in the Drosophila eye: a multifaceted view of

signaling specificity and cross-talk. Embo J. 18, 6873-6879.

Monkley S.J., Delaney S.J., Pennisi D.J., Christiansen J.H., Wainwright B.J. 1996.

Targeted disruption of the Wnt2 gene results in placentation defects. Development. 122,

3343-3353.

Montcouquiol M., Sans N., Huss D., Kach J., Dickman J. D., Forge A., Rachel R. A., Copeland N.G., Jenkins N.A., Bogani D., Murdoch J., Warchol M.E., Wenthold R.J. and Kelley M.W. 2006. Asymmetric localization of Vangl2 and Fz3 indicate novel mechanisms for planar cell polarity in mammals. JNeurosci. 26, 5265-5275. Morata G. and Lawrence P. A. 1977. The development of wingless, ahomeotic mutation of Drosophila. Dev. Biol. 56, 227-240.

Morin P.J., Sparks A.B., Korinek V., Barker N., Clevers H., Vogelstein В., Kinzler K.W. 1997. Activation of (3-Catenin-Tcf Signaling in Colon Cancer by Mutations in ¡3-Catenin or APC. Science. 275, 1787-1790.

Nam J.S.,Turcotte T.J., Smith P.F., Choi S., and Yoon J.K. 2006. Mouse Cristin/R-spondin Family Proteins Are Novel Ligands for the Frizzled 8 and LRP6 Receptors and Activate P-Catenin-dependent Gene Expression. J. Biol. Chem. 281, 13247-13257.

Nath N., Kashfi K., Chen J., Rigas B. 2003. Nitric oxide-donating aspirin inhibits beta-

catenin/T cell factor (TCF) signaling in SW480 colon cancer cells by disrupting the

nuclear beta-catenin-TCF association. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 12584-12589.

Natsume H., Tokuda H., Matsushima-Nishiwaki R., Kato K., Yamakawa K., Otsuka Т.,

Kozawa O. 2011. Wnt3a upregulates transforming growth factor-beta-stimulated VEGF

synthesis in osteoblasts. Cell Biochem. Fund. 29(5), 371-377.

Niehrs C. 2004. Norrin and frizzled: a new vein for the eye. Dev. Cell. 6, 453-454.

Nishioka M., Ueno K., Hazama S., Okada Т., Sakai K., Suehiro Y., Okayama N.,

Hirata H., Oka M., Imai K., Dahiya R. and Hinoda Y. 2011. Possible Involvement of

Wntll in Colorectal Cancer Progression. Mol. Carcinogenesis, doi: 10.1002/mc.21845

Noordermeer J., Mellink F., Verrijzer P., Rijsewijk F. and Destree O. 1989. Isolation of

the Xenopus homolog of int-1/wingless and expression during neurula stages of early

development. Nucleic Acids Res. 17, 11-18.

Nuss R. The Wnt homepage, [электронный ресурс] URL:

http ://www. stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/

140. Nusse R., Varmus H.E., 1982 .Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31, 99109.

141. O'Connell M.P. and Weeraratna A.T. 2009. Hear the Wnt Ror: how melanoma cells adjust to changes in Wnt. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 724-739.

142. Oishi I., Suzuki H., Onishi N., Takada R., Kani S., Ohkawara B., Koshida I., Suzuki K., Yamada G., Schwabe G.C., Mundlos S., Shibuya H., Takada S., Minami Y. 2003. The receptor tyrosine kinase Ror2 is involved in non-canonical Wnt5a/JNK signalling pathway. Genes Cells. 8, 645-654.

143. Ouko L., Ziegler T.R, Gu L.H., Eisenberg L.M., and Yang V.W. 2004. Wntl 1 Signaling Promotes Proliferation, Transformation, and Migration of IEC6 Intestinal Epithelial Cells. J. Biol. Chem. 279(25), 26707-26715.

144. Papkoff J. and Schryver B. 1990. Secreted int-1 Protein Is Associated with the Cell Surface. Mol. Cell.Biol. 10(6), 2723-2730.

145. Papkoff J., Brown A.M.C. and Varmus H.E.I 987. The int-I Proto-Oncogene Products Are Glycoproteins That Appear To Enter the Secretory Pathway. Mol. Cell.Biol. 7(11), 3978-3984.

146. Park J.E., Keller G.A., Ferrara N. 1993. The vascular endothelial growth factor (VEGF) isoforms: differential deposition into the subepithelial extracellular matrix and bioactivity of extracellular matrix-bound VEGF. M9/. Biol. Cell. 4, 1317-1326.

147. Pasquale E.B. 2008. Eph-Ephrin Bidirectional Signaling in Physiology and Disease. Cell. 133, 38-52.

148. Peifer M., Sweeton D., Casey M. and Wieschaus E. 1994. Wingless signal and zeste-white 3 kinase trigger opposing changes in the intracellular distribution of armadillo. Development. 120, 369-380.

149. Polakis P. 2000. Wnt signaling and cancer. Genes Dev. 14, 1837-1851.

150. Povelones M., Nusse R. 2005. The role of the cysteine-rich domain of Frizzled in Wingless-Armadillo signaling. EMBOJ. 24, 3493-3503.

151. Ramachandran I., Thavathiru E., Ramalingam S., Natarajan G., Mills W.K., Benbrook D.M., Zuna R., Lightfoot S., Reis A., Anant S., Queimado L. 2011. Wnt inhibitory factor 1 induces apoptosis and inhibits cervical cancer growth, invasion and angiogenesis in vivo. Oncogene. doi:10.1038/onc.2011.455

152. Rather L.J. 1978. The genesis of cancer: A study in the history of ideas. Baltimore (MD): Johns Hopkins University Press.

153. Reya T., Duncan A.W., Ailles L., Domen J., Scherer D.C., Willert K., Hintz L., Nusse R., Weissman I.L. 2003. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423, 409-414.

154. Reya T., O'Riordan M., Okamura R., Devaney E., Willert K., Nusse R., Grosschedl R. 2000. Wnt signaling regulates B lymphocyte proliferation through a LEF-1 dependent mechanism. Immunity. 13, 15-24.

155. Rijsewijk F., Schuermann M., Wagenaar E., Parren P., Weigel D., and Nusse R. 1987. The Drosophila homologue of the touse mammary oncogene int-1 is identical to the segment polarity gene Wingless. Cell. 50, 649-657.

156. Rimm D.L., Caca K., Hu G., Harrison F.B., Fearon E.R. 1999. Frequent Nuclear/Cytoplasmic Localization of b-Catenin without Exon 3 Mutations in Malignant Melanoma. Am. J. Pathol. 154, 325-329.

157. Ripka S., König A., Buchholz M., Wagner M., Sipos B., Klöppel G., Downward J., Gress T., Michl P. 2007. WNT5A - target of CUTL1 and potent modulator of tumor cell migration and invasion in pancreatic cancer. Carcinogenesis. 28, 1178-1187.

158. Rubinfeld B., Robbins P., el-Gamil M., Albert I., Porfiri E., Polakis P. 1997. Stabilization of ß-catenin by genetic defects in melanoma cell lines. Science. 275, 1790-1792.

159. Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T., Molecular cloning. 2nd ed. 1989, Ann Arbor, MI: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

160. Schlessinger K, Hall A., Tolwinski N. 2009. Wnt signaling pathways meet Rho GTPases. Genes Dev. 23, 265-277.

161. Semenov M. and He X. 2003. Secreted antagonists/modulators of Wnt signaling. In: Wnt Signaling in Development, ed. Kühl M. Geogetown, TX: Landers Bioscience, pp. 16-25.

162. Semenov M.V., Tamai K., Brott B.K., Kühl M., Sokol S. and He X. 2001. Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6. Current Biology. 11, 951961.

163. Sharma R.P. 1973. Wingless - a new mutant in D. melanogaster. Dros. Inf. Service. 50, 134.

164. Sheldahl L.C., Slusarski D.C., Pandur P., Miller J.R., Kühl M. and Moon R.T. 2003. Dishevelled activates Ca2+ flux, PKC, and CamKII in vertebrate embryos. J. Cell Biol. 161,769-777.

165. Shimizu H., Julius M.A., Giarre M., Zheng Z., Brown A.M. and Kitajewski J. 1997. Transformation by Wnt family proteins correlates with regulation of beta-catenin. Cell Growth Differ. 8, 1349-1358.

166. Siegfried E., Wilder E.L. and Perrimon N. 1994. Components of wingless signaling in Drosophila. Nature. 367, 76-80.

167. Staal F.J.T. and Clevers H.C. 2005. Wnt signalling and haematopoiesis: a Wnt-Wnt situation. Nature. 5, 21-30.

168. Stefater J.A. 3rd, Lewkowich I., Rao S., Mariggi G., Carpenter A.C., Burr A.R., Fan J., Ajima R., Molkentin J.D., Williams B.O., Wills-Karp M., Pollard J.W., Yamaguchi T., Ferrara N., Gerhardt H., Lang R.A. 2011. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Fltl pathway in myeloid cells. Nature. 474(7352), 511-515.

169. Struewing I.T., Toborek A. and Mao C.D. 2006. Mitochondrial and Nuclear Forms of Wntl3 Are Generated via Alternative Promoters, Alternative RNA Splicing, and Alternative Translation Start Sites. J. Biol. Chem. 281(11), 7282-7293.

170. Strutt D.I., Weber U. and Mlodzik M. 1997. The role of RhoA in tissue polarity and Frizzled signalling. Nature. 387, 292-295.

171. Sumanas S., Strege P., Heasman J. and Ekker S.C. 2000. The putative wnt receptor Xenopus frizzled-7 functions upstream of beta-catenin in vertebrate dorsoventral mesoderm patterning. Development. 127, 1981-1990.

172. Surmann-Schmitt C., Widmann N., Dietz U., Saeger B., Eitzinger N., Nakamura Y., Rattel M., Latham R., Hartmann C., von der Mark H., Schett G., von der Mark K., Stock M. 2009 Wif-1 is expressed at cartilage-mesenchyme interfaces and impedes Wnt3a-mediated inhibition of chondrogenesis. J. Cell Sci. 122(Pt 20), 3627-3637.

173. Suzuki H., Gabrielson E., Chen W., Anbazhagan R., van Engeland M., Weijenberg M.P., Herman J.G. and Baylin S.B. 2002. A genomic screen for genes upregulated by demethylation and histone deacetylase inhibition in human colorectal cancer. Nat. Genet. 31, 141-149.

174. Suzuki H., Watkins D.N., Jair K.-W., Schuebel K.E., Markowitz S.D., Chen W.D., Pretlow T.P., Yang B., Akiyama Y., van Engeland M., Toyota M., Tokino T., Hinoda Y., Imai K., James G. Herman J.G., Baylin S.B. 2004. Epigenetic inactivation of SFRP genes allows constitutive WNT signaling in colorectal cancer. Nat. Genet. 36, 417-422.

175. Tada M. and Smith J.C. 2000. Xwntl 1 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127, 2227-2238.

176. Tahinci E., Thorne C.A., Franklin J.L., Salic A., Christian K.M., Lee L.A., Coffey R.J. and Lee E. 2007. Lrp6 is required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Development. 134, 4095-4106.

177. Takada R., Hijikata H., Kondoh H. and Takada S. 2005. Analysis of combinatorial effects of Wnts and Frizzleds on beta-catenin/armadillo stabilization and Dishevelled phosphorylation. Genes Cells. 10, 919-928.

178. Takada R., Satomi Y., Kurata T., Ueno N., Norioka S., Kondoh H., Takao T., Takada S. 2006. Monounsaturated Fatty Acid Modification of Wnt Protein: Its Role in Wnt Secretion. Dev Cell. 11(6), 791-801.

179. Tamai K., Semenov M., Kato Y., Spokony R., Liu C., Katsuyama Y., Hess F., Saint-Jeannet J.P. and He X. 2000. LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction. Nature. 407, 530-535.

180. Tanaka M., Kamata R., Takigahira M., Yanagihara K., Sakai R. 2007. Phosphorylation of Ephrin-Bl regulates dissemination of gastric scirrhous carcinoma. Am. J. Pathol. 171,68-78.

181. Tang L., Dai D.L., Su M., Martinka M., Li G., Zhou Y. 2006. Aberrant expression of collagen triple helix repeat containing 1 in human solid cancers. Clin. Cancer Res. 12, 3716-3722.

182. Tao Q., Yokota C., Puck H., Kofron M., Birsoy B., Yan D., Asashima M., Wylie C.C., Lin X. and Heasman J. 2005. Maternal Wntl 1 activates the canonical Wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120, 857-871.

183. Theisen H., Purcell J., Bennett M., Kansagara D., Syed A. and Marsh J.L. 1994. dishevelled is required during wingless signaling to establish both cell polarity and cell identity. Development. 120, 347-360.

184. Thorsen K., Sorensen K.D., Brems-Eskildsen A.S., Modin C., Gaustadnes M., Hein A.-M.K., Kruhoffer M., Laurberg S., Borre M., Wang K., Brunak S., Adrian R. Krainer A.R., Torring N., Dyrskjot L., Andersen C.L., and 0rntoft T.F. 2008. Alternative Splicing in Colon, Bladder, and Prostate Cancer Identified by Exon Array Analysis. Molecular and Cellular Proteomics. 7, 1214-1224.

185. Tomlinson A., Strapps W.R. and Heemskerk J. 1997. Linking Frizzled and Wnt signaling in Drosophila development. Development. 124, 4515-4521.

186. Tree D.R.P., Shulman J.M., Rousset R.I., Scott M.P., Gubb D. and Axelrod J.D. 2002. Prickle Mediates Feedback Amplification to Generate Asymmetric Planar Cell Polarity Signaling. Cell. 109, 371-381.

187. UniProt, UniProtKB/SwissProt, 096014 (WNT11 HUMAN), http://www.uniprot.org/uniprot/Q96014

188. UniProt, UniProtKB/SwissProt, P41221 (WNT5A__HUMAN), http://www.uniprot.org/uniprot/P41221

189. UniProt, UniProtKB/SwissProt, Q9H1J5 (WNT8A_HUMAN), http://www.uniprot.org/uniprot/Q9HlJ5

190. Unterseher F., Hefele J.A., Giehl K., De Robertis E.M., Wedlich D., Schambony A. 2004. Paraxial protocadherin coordinates cell polarity during convergent extension via Rho A and JNK. EMBO J. 23, 3259-3269.

191. Urakami S., Shiina H., Enokida H., Kawakami T., Tokizane T., Ogishima T., Tanaka Y., Li L.C., Ribeiro-Filho L.A., Terashima M., Kikuno N., Adachi H., Yoneda T., Kishi H., Shigeno K., Konety B.R., Igawa M., Dahiya R. 2006. Epigenetic inactivation of Wnt inhibitory factor-1 plays an important role in bladder cancer through aberrant canonical Wnt/beta-catenin signaling pathway. Clin. Cancer Res. 12, 383-391.

192. Uzvolgyi E., Kiss I., Pitt A., Arsenian S., Ingvarsson S., Udvardy A., Hamada M., Klein G., and Sumegi J. 1988. Drosophila homolog of the murine Int-1 protooncogene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3034-3038.

193. van Amerongen R., Mikels A., Nusse R. 2008. Alternative Wnt signaling is initiated by distinct receptors. Sci. Signal. 1, re9.

194. Vance K.W., Goding C.R. 2004. The Transcription Network Regulating Melanocyte Development and Melanoma. Pigment cell. 17, 318-325.

195. Vinson C.R. and Adler P.N. 1987. Directional non-cell autonomy and the transmission of polarity information by the frizzled gene of Drosophila. Nature. 329, 549-551.

196. Wallingford J. B., and Harland R. M. (2001). Xenopus dishevelled signaling regulates both neural and mesodermal convergent extension: parallel forces elongating the body axis. Development. 128, 2581-2592.

197. Wallingford J.B., Harland R.M. 2002. Neural tube closure requires Dishevelled-dependent convergent extension of the midline. Development. 129, 5815-5825.

198. Wang J., HambletN.S., Mark S., Dickinson M.E., Brinkman B.C., Segil N., Fraser S.E., Chen P., Wallingford J.B., Wynshaw-Boris A. 2006. Dishevelled genes mediate a conserved mammalian PCP pathway to regulate convergent extension during neurulation. Development. 133, 1767-1778.

199. Wang Y. 2009. Wnt/Planar cell polarity signaling: a new paradigm for cancer therapy. Mol. Cancer Ther. 8(8), 2103-2109.

200. Wang Y. and Nathans J. 2007. Tissue/planar cell polarity in vertebrates: new insights and new questions. Development. 134, 647-658.

201. Weeraratna T.A., Jiang Y., Hostetter G., Rosenblatt K., Duray P., Bittner M., and Trent M.J. 2002. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1(3), 279-288.

202. Wehrli M., Dougan S.T., Caldwell K., O'Keefe L., Schwartz S., Vaizel-Ohayon D., Schejter E., Tomlinson A. and DiNardo S. 2000. arrow encodes an LDL-receptor-related protein essential for Wingless signalling. Nature. 407, 527-530.

203. Wieschaus E., Niisslein-Volhard C. and Juirgens G. 1984. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III. Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome.Roux's Arch. Dev. Biol., (193): 269-307.

204. Wilkinson D.G., Bailes J.A., and McMahon A.P. 1987. Expression of the proto-oncogene int-i is restricted to specific neural cells in the developing mouse embryo. Cell. 50, 79-88.

205. Winkel A., Strieker S., Tylzanowski P., Seiffart V., Mundlos S., Gross G. and Hoffmann A. 2008. Wnt-ligand-dependent interaction of TAK1 (TGFbeta-activated kinase-1) with the receptor tyrosine kinase Ror2 modulates canonical Wnt-signalling. Cell Signal. 20,2134-2144.

206. Wong G.T., Gavin B J. and McMahon A.P. 1994. Differential transformation of mammary epithelial cells by Wnt genes. Mol. Cell. Biol. 14, 6278-6286.

207. Wouda R.R., Bansraj M.R.K.S., de Jong A.W.M., Noordermeer J.N. and Fradkin L.G. 2008. Src family kinases are required for WNT5 signaling through the Derailed/RYK receptor in the Drosophila embryonic central nervous system. Development. 135, 2277-2287.

208. Wright M., Aikawa M., Szeto W., Papkoff J. 1999. Identification of a Wnt responsive signal transduction pathway in primary endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 263, 384-388.

209. Wu C.-H., Nusse R. 2002. Ligand receptor interactions in the Wnt signaling pathway in Drosophila. J. Biol. Chem. 277, 41762-41769.

210. Wu J., Saint-Jeannet J.P., Klein P.S. 2003. Wnt-frizzled signaling in neural crest formation. Trends Neurosci. 26, 40-45.

211. WuR, Hendrix-Lucas N., Kuick R., Zhai Y., Schwartz D.R., Akyol A., Hanash S., Misek D.E., Katabuchi H., Williams B.O., Fearon E.R. and Cho K.R. 2007. Mouse Model of Human Ovarian Endometrioid Adenocarcinoma Based on Somatic Defects in the Wnt/b-Catenin and PI3K/Pten Signaling Pathways. Cancer Cell. 11, 321-333.

212. Wu R., Zhai Y., Fearon E.R., Cho K.R. 2001. Diverse mechanisms ofbeta-catenin deregulation in ovarian endometrioid adenocarcinomas. Cancer Res. 61, 8247-8255.

213. Wu W.-S. and Wu J.-R. 2010. Overview of Signal Transduction in Tumor Metastasis. In: Cancer Metastasis - Biology and Treatment. Signal Transduction in Cancer Metastasis. Vol.15. Eds Wu W.-S. and Hu C.-T. Dordrecht: Springer Science+Business Media B.V. pp. 1-8.

214. Xu Q., Wang Y., Dabdoub A., Smallwood P.M., Williams J., Woods C., Kelley M.W., Jiang L., Tasman W., Zhang K., Nathans J. 2004. Vascular development in the retina and inner ear: a high-affinity ligandreceptor pair. Cell. 116, 883-895.

215. Xu Y.K., Nusse R. 1998. The Frizzled CRD domain is conserved in diverse proteins including several receptor tyrosine kinases. Curr. Biol. 8, R405-R406.

216. Yamamoto S., Nishimura O., Misaki K., Nishita M., Minami Y., Yonemura S., Tarui H., Sasaki H. 2008. Cthrcl selectively activates the planar cell polarity pathway of Wnt signaling by stabilizing the Wnt-receptor complex. Dev. Cell. 15, 23-36.

217. Yamanaka H., Moriguchi T., Masuyama N., Kusakabe M., Hanafusa H., Takada R., Takada S., Nishida E. 2002. JNK functions in the non-canonical Wnt pathway to regulate convergent extension movements in vertebrates. EMBO Rep. 3, 69-75.

218. Yan D., Wiesmann M., Rohan M., Chan V., Jefferson A.B., Guo L., Sakamoto D., Caothien R.H., Fuller J.H., Reinhard C., Garcia P.D., Randazzo F.M., Escobedo J., Fantl W.J. and Williams L.T. 2001. Elevated expression of axin2 and hnkd mRNA provides evidence that Wnt/p-catenin signaling is activated in human colon tumors. PNAS. 98(26), 14973-14978.

219. Yano H., Hara A., Shinoda J., Takenaka K., Yoshimi N., Mori H., Sakai N. 2000. Immunohistochemical analysis of beta-catenin in N-ethyl-N-nitrosoureainduced rat gliomas: Implications in regulation ofangiogenesis. Neurol Res. 22, 527-532.

220. Yano H., Hara A., Takenaka K., Shinoda J., Shimokawa K., Yoshimi N., Mori H., Sakai N. 2000. Differential expression of beta-catenin in human glioblastoma multiforme and normal brain tissue. Neurol. Res. 22, 650-656.

221. Yardy G.W. and Brewster S.F. 2005. Wnt signalling and prostate cancer. Prostate Cancer and Prostatic Diseases. 8(2), 119-126.

222. Ybot-Gonzalez P., Savery D., Gerrelli D., Signore M., Mitchell C.E., Faux C.H., Greene N.D.E. and Copp A.J. 2007. Convergent extension, planar cell polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134(4), 789-799.

223. Yoshikawa S., McKinnon R.D., Kokel M. and Thomas J.B. 2003. Wnt mediated axon guidance via the Drosophila Derailed receptor. Nature. 422, 583-588.

224. You L., He B., Uematsu K., Xu Z., Mazieres J., Lee A., McCormick F. and Jablons D.M. 2004. Inhibition of Wnt-1 Signaling Induces Apoptosis in P-Catenin-Deficient Mesothelioma Cells. Cancer Res. 64, 3474-3478.

225. Yu J.S., Koujak S., Nagase S., Li C.-M., Su T., Wang X., Keniry M., Memeo L., Rojtman A., Mansukhani M., Hibshoosh H., Tycko B. and Parsons R. 2008. PCDH8, the human homolog of PAPC, is a candidate tumor suppressor of breast cancer. Oncogene. 27, 4657-4665.

226. Yu L., Tao Q., Cheng Y.Y., Lee K.Y., Ng S.S.M., Cheung K.F., Tian L., Rha S.Y., Neumann U., Rocken C., Ebert M.P.A., Chan F.K.L. and Sung J.J.Y. 2009. Promoter Methylation of the Wnt/b-Catenin Signaling Antagonist Dkk-3 Is Associated With Poor Survival in Gastric Cancer. Cancer. 115 (1), 49-60.

227. Yuzugullu H., Benhaj K., Ozturk N., Senturk S., Celik E., Toylu A., Tasdemir N., Yilmaz M., Erdal E., Akcali K.C., Atabey N. and Ozturk M. 2009. Canonical Wnt signaling is antagonized by noncanonical Wnt5a in hepatocellular carcinoma cells. Molecular Cancer. 8, 90

228. Zallen J.A. 2007. Planar Polarity and Tissue Morphogenesis. Cell. 129(6), 1051-1063.

229. Zerlin M., Julius M.A. and Kitajewski J. 2008. Wnt/Frizzled signaling in angiogenesis. Angiogenesis. 11(1), 63-69.

230. Zhang X., Gaspard J.P. and Chung D.C. 2001. Regulation of vascular endothelial growth factor by the Wnt and K-ras pathways in colonic neoplasia. Cancer Res. 61, 6050-6054.

231. Zhang Y., Yeh J.R., Mara A., Ju R., Hines J.F., Cirone P., Griesbach H.L., Igor Schneider I., Slusarski D.C., Holley S.A. and Crews C.M. 2006. A chemical and genetic approach to the mode of action of fumagillin. Chem Biol. 13, 1001-1009.

Благодарности

Я выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Сергею Сергеевичу Ларину за оказанное доверие, за терпение и чуткое руководство, а также критическое чтение диссертации.

Отдельное большое спасибо Кибардину Алексею Владимировичу за обучение методам, помощь в планировании экспериментов и неоценимый вклад в интерпретацию результатов.

Благодарю Коробко Игоря Викторовича за предоставленные реактивы и ценные советы.

Спасибо Куликовой Ксении Валерьевне за участие на этапах проведения экспериментов и возможность критически взглянуть на полученные результаты.

Благодарю всех сотрудников лаборатории генной терапии и лаборатории молекулярной онкогенетики, с которыми мне посчастливилось работать, за помощь в освоении методик, за советы и консультации, за терпение, хорошее настроение и дружескую атмосферу в коллективе.

Выражаю признательность моей семье и моим друзьям за оказание моральной и интеллектуальной поддержки!