Идентификация внутриклеточных сигнальных путей и функций белков, модулирующих процессы метастазирования и опухолевой прогрессии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат наук Чевкина, Елена Максимовна

• Чевкина, Елена Максимовна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Чевкина, Елена Максимовна

Введение...................................................................................................................7

Глава 1. Материалы и Методы.............................................................................17

1.1 Клеточные линии и условия культивирования......................................17

1.2 Образцы тканей.........................................................................................17

1.3 Выделение нуклеиновых кислот.............................................................18

1.3.1 Выделение плазмидной ДНК........................................................18

1.3.2 Выделение РНК из клеточных культур и образцов тканей.......19

1.3.3 Выделение фрагментов ДНК для клонирования

из агарозных гелей............................................................................19

1.4 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях.........................20

1.5 Молекулярное клонирование...................................................................20

1.5.1 Получение компетентных клеток Е. coli......................................20

1.5.2 Трансформация компетентных клеток E.coli..............................21

1.5.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами................21

1.5.4 Реакция лигирования......................................................................21

1.5.5 Клонирование кодирующей последовательности гена

с кДНК и получение экспрессирующих векторов.........................22

1.5.6 Клонирование предшественников малых шпилечных РНК......22

1.6 Обратная транскрипция РНК...................................................................23

1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)....................................................23

1.7.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)..........................................23

1.7.2 ПЦР в реальном времени...............................................................24

1.8 Трансфекция и получение псевдовирусных частиц..............................26

1.9 Инфекция псевдовирусными частицами................................................27

1.10 Анализ белков..........................................................................................27

1.10.1 Приготовление клеточных лизатов............................................27

1.10.2 Приготовление лизатов из образцов тканей легкого................28

1.10.3 Электрофорез белков и Вестерн-блот гибридизация...............28

1.10.4 Анализ активности фосфолипазы PLD......................................30

1.10.5 Анализ активности малой ГТФазы Ral......................................31

1.10.6 Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ внеклеточного матрикса............................31

1.10.7 Анализ желатиназной активности..............................................31

1.10.8 Анализ активности иРА...............................................................32

1.11 Исследование клеточных характеристик в культурах in vitro............32

1.11.1 Анализ динамики пролиферации................................................32

1.11.2 Анализ динамики пролиферации с использованием МТТ.......32

1.11.3 Анализ подвижности методом «зарастания раны» in vitro (wound healing assay).........................................................................33

1.11.4 Анализ клоногенности (тест на образование колоний

в условиях разреженной популяции...............................................33

1.11.5 Анализ способности к неприкрепленному росту (тест на образование колоний в полужидкой среде)...................................33

1.11.6 Анализ направленного движения

по градиенту концентрации факторов роста..................................34

1.11.7 Анализ инвазивной активности (тест на инвазию in vitro)......34

1.12 Исследование клеточных характеристик in vivo..................................34

1.12.1 Определение туморогенности и динамики роста опухолей ....34

1.12.2 Определение экспериментальной (ЭМА)

и спонтанной (СМА) метастатической активности.......................35

1.13 Иммуногистохимический анализ (ИГХ)...............................................35

1.14 Статистическая обработка результатов................................................36

1.15 Растворы, реагенты и среды...................................................................36

Глава 2. Анализ влияния онкогена H-Ras на метастатическую активность

трансформированных фибробластов и идентификация H-Ras-зависимых сигнальных путей, обеспечивающих усиление метастатического потенциала...............................................................................39

2.1. Состояние проблемы................................................................................39

2.2.Собственные результаты..........................................................................60

2.2.1 Экспрессия активированного онкогена H-Ras увеличивает спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов посредством активации H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути..............................................60

2.2.2 Роль малой ГТФазы Ral А в H-Ras-зависимой стимуляции метастатической активности клеток...............................................66

2.2.3. Значение активации RalA в усилении метастатической активности фибробластов, трансформированных вирусом

саркомы Рауса, спонтанно трансформированных фибробластов

и трансформированных фибробластов, прошедших

селекцию ш vivo................................................................................67

2.3.Обсуждение результатов..........................................................................74

Глава 3. Сравнение роли гомологичных белков RalA и RalB в приобретении трансформированными фибробластами

высоко-агрессивного фенотипа и метастатической активности......................79

3.1 Состояние проблемы.................................................................................79

3.2 Собственные результаты........................................................................100

3.2.1 RalB в большей степени, чем RalA, стимулирует спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов...................................................................................100

3.2.2 Совместная экспрессия белков RalA и RalB не приводит к дополнительному усилению метастатической активности........103

3.2.3 Сравнение влияния белков RalA и RalB на характеристики роста, подвижности и инвазивной активности исследуемых клеток........................................................................105

3.2.4 Анализ изменения экспрессии белков: Cyclin Dl, CD-24, Cav-1, а также активности белков Erkl/2, Jnk, р38 и Stat3 под влиянием экспрессии экзогенных

белков RalA и RalB.........................................................................114

3.2.5 Определение эффекторных мишеней белков RalA и RalB, взаимодействие с которыми необходимо для реализации их прометастатической функции........................................................118

3.3 Обсуждение результатов........................................................................122

Глава 4. Роль малой ГТФазы Arfó в пролиферации, инвазии и активации ключевых в аспекте канцерогенеза внутриклеточных сигнальных путей ....131

4.1 Состояние проблемы.....................................................................................131

4.2 Собственные результаты........................................................................171

4.2.1 Сравнение влияния экспрессии экзогенного Arfó, а также его совместной экспрессии с белками RalA/RalB

на метастатическую активность трансформированных фибробластов...................................................................................179

4.2.2 Arfó-зависимая стимуляция пролиферации и активация фосфолипазы D.....................................1..........................................179

4.2.3 Идентификация Arf6/PLD/mTORCl/S6Kl/S6 и Arfó/PLD/mTORC 1/4Е-ВР1 сигнальных путей, приводящих к Arfó-зависимой активации комплекса инициации трансляции...................................................................187

4.2.4 Влияние Arfó на активацию MAP киназ Erkl/2, Jnk и р38......194

4.2.5 Молекулярные механизмы Arfó-зависимой стимуляции пролиферации включают активацию mTORCI

комплекса и MAP киназы р38........................................................196

4.2.6 Анализ экспрессии Arf6 и RalA в клинических образцах

опухолей немелкоклеточноно рака легкого.................................201

4.3 Обсуждение результатов........................................................................207

Глава 5. Белок, связывающий ретиноевую кислоту, CRABP1, в усилении высокоагрессивного фенотипа трансформированных клеток........................217

5.1 Состояние проблемы...............................................................................217

5.2 Собственные результаты........................................................................228

5.2.1 Корреляция экспрессии CRABP1 с уровнем спонтанной метастатической активности трансформированных фибробластов..................................................................................228

5.2.2.Модуляция туморогенности и метастатической активности клеток при активации и подавлении экспрессии CRABP1........230

5.2.3.Анализ экспрессии мРНК и продукции белка CRABP1 в клинических образцах опухолей мезенхимального происхождения - мягкотканых сарком различного генеза........239

5.2.3.1 Изучение экспрессии мРНК CRABP1 и CRABP2

в образцах опухолей мягких тканей человека......................239

5.2.3.2 Анализ экспрессии белка CRABP1 в образцах синовиальных сарком..............................................................242

5.3 Обсуждение результатов........................................................................244

Заключение...........................................................................................................248

Выводы..................................................................................................................252

Список сокращений и условных обозначений.................................................254

Список литературы..............................................................................................261

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация внутриклеточных сигнальных путей и функций белков, модулирующих процессы метастазирования и опухолевой прогрессии»

Введение Актуальность темы исследования

Несмотря на появление новых методов диагностики, онкологические заболевания часто обнаруживают уже в ходе процесса метастазирования. Очевидно, что это клинически значимое явление невозможно предотвратить без понимания фундаментальных механизмов, определяющих процесс метастазирования на молекулярном и клеточном уровнях. Опухолевая прогрессия — это многоэтапный и многофакторный процесс, включающий в себя развитие первичной опухоли и распространение по организму опухолевых клеток, что приводит к образованию очагов вторичного роста опухоли в отдаленных органах. Именно этот процесс, называемый метастазированием, чаще всего является причиной летальных исходов онкологических заболеваний. В основе опухолевой прогрессии лежит сложная последовательность большого количества взаимозависимых на молекулярном уровне событий, происходящих в процессе формирования и роста опухоли, приводящая к отбору все более злокачественных клеток. В процессе такой селекции опухолевые клетки (или клоны клеток), за счет генетической нестабильности и межклеточной коммуникации наряду с базовыми характеристиками трансформированных клеток (неограниченная пролиферация, уход от программируемой клеточной гибели и др.) приобретают дополнительные качества, позволяющие им успешно распространяться по организму. Эти качества обеспечивают опухолевым клеткам выживание в условиях гипоксии, экстравазию и попадание в кровоток, (включая запуск процессов неоангиогенеза), избежание анойкиса (разновидности клеточной смерти при потере прикрепления к субстрату) в кровяном русле, противодействие атакам со стороны иммунной системы, проникновение в органы-мишени (интравазию) и, в конечном счете, пролиферацию в новом микроокружении и образование очагов вторичного роста, то есть метастазов. Перечисленные выше характеристики клеток, приобретаемые в процессе отбора, являются результатом многочисленных изменений в активности как отдельных генов и их продуктов, так и целых каскадов, передающих внутриклеточные и дистанционные сигналы. Взаимозависимые изменения (активация или подавление) отдельных сигнальных путей и их сочетаний приводят к формированию все более агрессивного фенотипа малигнизированных клеток - клетки избегают апоптоза, снижают потребность в ростовых факторах, увеличивают пролиферативную активность, подвижность, способность к неприкрепленному росту и ремоделированию внеклеточного матрикса, а также приобретают ряд других преимуществ, направленных на успешное выживание и распространение в организме.

Таким образом, в основе приобретения клетками метастатической активности лежат многочисленные нарушения функционирования путей передачи как внутриклеточных

сигналов, так и сигналов, определяющих межклеточные взаимодействия (включая взаимодействие опухоли с микроокружением). Несмотря на достижения последних лет, касающиеся роли отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, имеющиеся данные в значительной степени противоречивы и фрагментарны, и далеко не в полной мере объясняют картину событий, происходящих в процессе приобретения трансформированными клетками высоко агрессивного фенотипа.

В исследовательской практике изучение опухолевой прогрессии и метастазирования проводится с помощью различных методических подходов, которые можно условно разделить на скрининговые исследования (различного рода анализы клинических образцов, при которых определяются корреляции между функциональной активностью определенных генов или групп генов и клинико-морфологическими характеристиками опухоли и/или течением заболевания и прогнозом), так и с помощью исследований на экспериментальных моделях, позволяющих определять молекулярные механизмы, лежащие в основе данных процессов. В большинстве случаев такие модели позволяют успешно исследовать те или иные аспекты опухолевой прогрессии. Вместе с тем, особенно актуальным представляется использование биологических моделей, позволяющих изучать метастазирование как комплексный физиологический феномен in vivo. Эти модели должны обладать свойством, позволяющим при экспериментальном модулировании активности отдельных генов или белков (обработка различными химическими агентами или экспрессии определенных генетических конструкций) оценить суммарное влияние на метастатический фенотип клеток in vivo.

Одной из таких экспериментальных моделей является система линий трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка. Эта модель уникальна тем, что включает в себя клеточные линии одинакового происхождения, но отличающиеся по метастатической активности in vivo. Она была получена в лаборатории противоопухолевого иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н Блохина РАМН. Данная экспериментальная модель состоит из двух панелей линий эмбриональных фибробластов сирийского хомяка. Первая включает ряд линий независимо трансформированных вирусом саркомы Рауса (RSV, штамм Шмидт-Руппин Д), вторая - линии тех же первичных фибробластов, спонтанно трансформированных в культуре in vitro. Клетки этих линий обладают типично трансформированным фенотипом, обладают выраженной туморогенностью при подкожном введении сингенным животным и при этом принципиально различаются по уровню спонтанной метастатической активности (СМА). СМА определяется как способность клеток формировать метастазы после подкожного введения клеток экспериментальным животным. Соответственно, тест на СМА моделирует все этапы прогрессии - возникновение первичной подкожной опухоли, интравазию и распространение опухолевых клеток по кровотоку, выживание в кровотоке, экстравазию в органы-мишени и

пролиферацию в очаге вторичного роста в условиях противоопухолевого иммунитета. К основным достоинствам этой модели следует отнести: единое происхождение клеток с разным уровнем метастатической активности, возможность исследования процессов метастазирования in vivo с использованием иммунокомпетентных животных (сингенные животные); возможность изучения метастазирования с использованием теста на спонтанную метастатическую активность. Кроме того, клетки данной системы характеризуются направленным (органоспецифичным) легочным метастазированием, что упрощает количественную оценку активности метастатического процесса. Очевидно, что описанная выше модель является чрезвычайно перспективной для изучения механизмов опухолевой прогрессии и обнаружения потенциальных маркеров метастазирования, поскольку позволяет наиболее адекватно моделировать процессы опухолевой прогрессии и метастазирования, имеющие место в естественных условиях. Данная работа посвящена выявлению сигнальных путей и белков, участвующих в регуляции важнейших в аспекте канцерогенеза внутриклеточных сигнальных путей, таких как Ha-Ras-, PLD-mTORCl-, и Erkl/2 -ассоциированные каскады, и исследованию функциональной роли в опухолевой прогрессии и метастазировании малых ГТФаз суперсемейства Ras: Ral A, RalB, Arfó, а также белка, связывающего ретиноевую кислоту, CRABP1. Таким образом, идентификация и функциональный анализ ключевых белков и сигнальных каскадов, задействованных в регуляции опухолевой прогрессии и процесса метастазирования, является важнейшей фундаментальной задачей молекулярной биологии и экспериментальной онкологии, а имеющаяся экспериментальная модель представляется крайне перспективной для решения поставленной задачи.

Цели и задачи

Целью данной работы является поиск и исследование функциональной роли новых внутриклеточных сигнальных путей и белков, участвующих в регуляции процессов опухолевой прогрессии и метастазирования.

В соответствии с указанной целью были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:

1. На экспериментальной модельной системе клеток трансформированных фибробластов сирийского хомяка с различным исходным уровнем метастатической активности исследовать влияние экспрессии онкогена H-Ras на метастатический потенциал клеток.

2. Идентифицировать основные эффекторные белки и сигнальные пути, реализующие прометастатическую активность онкогена H-Ras.

3. Определить функциональное значение активации и подавления активности мишени H-Ras, малой ГТФазы Ral, для модуляции спонтанной метастатической активности клеток данной экспериментальной системы.

4. Провести сравнительный анализ влияния изоформ RalA и RalB на характеристики клеток in vivo и in vitro, ассоциированные с опухолевой прогрессией.

5. Определить важнейшие молекулы-эффекторы белков RalA и RalB, задействованные в Ral-зависимом усилении метастатической активности. Изучить влияние белков RalA/RalB на продукцию и активность ряда белков, вовлеченных в различные аспекты опухолевой прогрессии, таких как протеиназы внеклеточного матрикса, MAP киназы, белки CD24, Cav-1, Cyclin DI и др.

6. Определить влияние экспрессии малой ГТФазы Arfó (а также совместной экспрессии белков Arfó, RalA и RalB) на уровень спонтанной метастатической активности исследуемых клеток. Определить значение экспрессии Arfó для пролиферативной и инвазивной активности клеток.

7. Идентифицировать сигнальные пути и молекулярные механизмы, реализующие промитогенную активность Arfó. Исследовать роль данной ГТФазы в отношении активности фосфолипазы PLD, комплекса mTORCl и его мишеней: рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связывающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4Е-ВР1, а также MAP киназ Erkl/2, р38 и Jnk.

8. Провести анализ экспрессии генов Ral и Arfó в клинических образцах немелкоклеточного рака легкого. Сопоставить полученные данные с клинико-морфологическими характеристиками исследуемых образцов.

9. Определить функциональную роль экспрессии белка CRABP1 в формировании высокоагрессивного фенотипа клеток на модели трансформированных фибробластов сирийского хомяка. Изучить влияние данного белка на туморогенность и метастатический потенциал клеток in vivo.

10. Исследовать экспрессию мРНК CRABP1 в образцах сарком мягких тканей. Исследовать продукцию белка CRABP1 в монофазных синовиальных саркомах.

Научная новизна темы исследования

Данная работа посвящена выявлению белков, участвующих в регуляции важнейших в аспекте канцерогенеза сигнальных путей, таких как Ha-Ras- и PLD-mTORCl- ассоциированные каскады, и исследованию функциональной роли в опухолевой прогрессии и метастазировании

малых ГТФаз суперсемейства Ras: RalA, RalB, Arfó, а также белка, связывающего ретиноевую кислоту, CRABP1.

В ходе работы получены результаты, свидетельствующие о значительном влиянии онкогена H-Ras на усиление метастатического потенциала трансформированных клеток, и определены основные мишени и сигнальные пути, реализующие про-метастатическую функцию H-Ras. Результаты, опубликованные в процессе данной работе, являются одними из первых доказательств первостепенной значимости H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути в Н-Ras-зависимой стимуляции метастазирования, а также роли собственно малых G-белков RalA и RalB в данном процессе. В работе с использованием экспериментальной модельной системы трансформированных фибробластов с исходно разным уровнем метастатической активности впервые показано, что среди двух гомологичных белков, RalA и RalB, активация RalB в большей степени усиливает спонтанную метастатическую активность клеток in vivo. Ранее аналогичных работ, исследующих влияние гомологов RalA и RalB на спонтанную метастатическую активность клеток, не проводилось. При этом обнаружено, что про-метастатическая активность белка RalB осуществляется за счет взаимодействия с фосфолипазой D (PLD). Также впервые обнаружено, что малая ГТФаза Arfó, также относящаяся к суперсемейству малых G-белков Ras, активируя PLD, потенцирует один из ключевых в аспекте канцерогенеза белков, киназу mTOR, стимулируя PLD/mTORCl/-S6Kl-S6 и PLD/mTORCl/-4E-ВР1 сигнальные пути, приводящие к активации комплекса инициации трансляции. Кроме того, экспрессия Arfó стимулирует важнейшие митоген-активируемые киназы (MAP киназы) Erkl/2 и р38, причем активация последней также приводит к активации компонентов комплекса инициации трансляции. Ранее данных об Arfó-зависимой активации киназы р38 опубликовано не было. Полученные данные также впервые свидетельствуют о про-митогенной функции Arfó, реализуемой за счет активации Arfó/PLD/mTOR- и Arfó/p38-3aBHCHMbix сигнальных путей.

Еще одним исследуемым в работе белком является связывающий ретиноевую кислоту белок CRABP1, значение которого в процессах опухолевой прогрессии и метастазирования ранее не исследовалось. Впервые показано, что в рамках данной экспериментальной модели экспрессия CRABP1 прямо коррелирует с уровнем спонтанной метастатической активности клеток. Более того, впервые обнаружено, что экспрессия CRABP1 усиливает туморогенность опухолевых клеток, а подавление экспрессии CRABP1 - снижает как туморогенность, так и метастатическую активность клеток. На основании полученных на экспериментальной модели результатов в рамках данной работы впервые проведено исследование экспрессии гена CRABP1 в образцах опухолей человека мезенхимального происхождения - саркомах мягких тканей. Анализ мРНК CRABP1 выявил дифференциальный характер его экспрессии в зависимости от гистологического типа опухолей. Иммуногистохимический анализ образцов

синовиальных сарком выявил убиквитарный характер и преимущественно высокий уровень экспрессии бежа С11АВР1 в опухолевых клетках при отсутствии его экспрессии в окружающих тканях.

Таким образом, в работе идентифицированы новые внутриклеточные сигнальные пути и получен ряд приоритетных научных результатов о роли отдельных белков и внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в регуляции процессов опухолевой прогрессии и метастазирования.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Проведенные исследования привели к обнаружению новых внутриклеточных сигнальных путей, приводящих к приобретению высоко агрессивного фенотипа трансформированных клеток. Получен ряд приоритетных данных, свидетельствующих о ранее не известных функциях в опухолевой прогрессии отдельных белков (таких, как белок, связывающий ретиноевую кислоту, СЯАВР1) и внутриклеточных путей передачи сигналов. Так, представление в работе результаты легли в основу одной из первых опубликованных работ, показавших важнейшую роль Н-11а8/11аЮВ8/11а1 сигнального пути в приобретении высоко-метастазного фенотипа трансформированными клетками. Также, большое значение имеет обнаружение про-митогенной активности малой ГТФазы АгГб и ее участия в регуляции таких ключевых в канцерогенезе белков, как киназы тТСЖ и Егк1/2. Идентификация новых сигнальных путей, АгГ6->Р1ЛЭ-+тТ(ЖС1-»86К1->86, АгГ6-»РЬО->тТ(ЖС 1 ^4Е-ВР1 и р38—»Бб, приводящих к активации компонентов комплекса инициации трансляции, также является крайне значимым как для понимания молекулярных механизмов регуляции тТСЖ и процесса инициации трансляции, так и для направленного изменения активности комплекса тТ(ЖС1 при разработке новых таргетных препаратов.

Основные результаты работы опубликованы как в отечественных, так и в высокорейтинговых международных научных журналах и имеет большое теоретическое значение, существенно расширяя уровень знаний о фундаментальных аспектах молекулярных нарушений и функциональных изменений трансформированных клеток, лежащих в основе опухолевой прогрессии и метастазирования.

Полученные данные будут служить основой для дальнейших фундаментальных исследований в области молекулярных механизмов канцерогенеза. Ряд данных (в частности, новые механизмы регуляции тТОЯ и Егк1/2, а также обнаружение про-туморогенной активности С11АВР1 и его убиквитарной экспрессии в синовиальных саркомах) может иметь также и практическое значение в клинической практике для дифференциальной диагностики, а

4. Парафиновые блоки образцов монофазных синовиальных сарком, предоставленные архивом Отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.).

Методы исследования 1. Работа с культурами эукариотических клеток, фенотипирование in vitro: анализ пролиферации, подвижности, инвазивности, клоногенности, способности к неприкрепленному росту и др.),

2. Трансфекция бактериальных и эукариотических клеток.

3. Ретровирусная инфекция эукариотических клеток

4. Лентивирусная инфекция эукариотических клеток.

5. Выделение нуклеиновых кислот из культур клеток и клинических образцов с последующим их анализом с помощью различных модификаций ПЦР (прямой ПЦР, ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени)

6. Получение кДНК и молекулярное клонирование.

7. Получение малых шпилечных РНК

8. Выделение белков их культур клеток и клинических образцов с последующим анализом методом иммуноблоттинга.

9.Анализ активности белков: субстрат-специфическая зимография, анализ фосфорилированных форм белков, анализ ГТФ-связанных форм G-белков (Pull-down assay), флуоресцентный анализ ферментативной активности фосфолипазы Д.

10. Иммуногистохимический анализ.

11. Фенотипирование клеток in vivo: анализ туморогенности (трансплантационный тест), спонтанной (СМА) и экспериментальной (ЭМА) метастатической активности.

12. Статистическая обработка результатов. Для определения значимых различий в случае сравнения двух выборок применялся двухсторонний критерий Манна-Уитни. Для определения значимых различий при сравнении трех и более групп применяли анализ Крускала-Уоллиса. Расчеты производились с помощью программы GraphPad Prizm версия. 5.02 (GraphPad Software Inc) и IBM SPSS Statistics ver. 21 (IBM). Для определения статистической значимости взаимосвязи между клиническими характеристиками опухолей и экспрессией исследуемых белков использовался двухсторонний точный критерий Фишера. Уровень достоверности определялся как р<0.05.

Положения, выносимые на защиту

l.H-Ras является стимулятором метастатической активности трансформированных фибробластов in vivo и реализует про-метастатическое действие посредством активации внутриклеточного сигнального пути: H-Ras—RalGDS—Ral.

также для оценки агрессивности, прогнозировании течения и разработки мишеней для направленной трансляционной терапии злокачественных опухолей человека.

Методология и методы исследования

Материалы исследования:

1. Панель клеточных линий мезенхимального происхождения — фибробластов сирийского хомяка, трансформированных штаммом Шмидт-Руппин Д вируса саркомы Рауса (система линий HET-SR), либо спонтанно трансформированных в культуре in vitro (линии STHE), принципиально отличающихся между собой по уровню органоспецифического метастазирования в легкие при введении экспериментальным животным. Панель включает: исходно низко-метастазные варианты — линии HET-SR, STHE; исходно высоко-метастазные линии: HET-SR-1, HET-SR-8; линии, приобретшие высоко-метастазный фенотип в ходе селекции in vivo: HET-SR-LNM, STHE 83/20, STHE LNM8. Данная модель позволяет исследовать причины и молекулярные механизмы, определяющие различия в метастатической активности клеток единого происхождения, другими достоинствами данной модели являются возможность проведения теста на спонтанную метастатическую активность (СМА), органоспецифический характер метастазирования и использование иммунокомпетентных экспериментальных животных.

2. Для исследования влияния экспрессии, активации, подавления или модификации отдельных белков на исследуемые клеточные линии были использованы следующие кодирующие генетические последовательности дикого типа или несущие точечные замены: На-RasV12, Ha-RasV12G37, Ha-RasV12C40, Ha-RasV12S35, RalAG23V, RalBG23V, RalAS28N, RalAG23VD49N, RalAG23VD49E, RalAG23VANll, RalBG23VD49N, RalBG23VD49E, RalBG23VANl 1, Arfó Q67L, ArfóWT, Arf6T27N, Arf6N48I, CRABP1WT. Для введения данных последовательностей в клетки использовались ретровирусные векторы pLXSN, pBabe-puro, лентивирусные векторы pLV-CMV и pLKO.l puro. Для получения псевдоретровирусных частиц использовали клетки GP293. Для получения псевдо-лентивирусных частиц использовали клеточную линию 293FT

3.Клинические образцы опухолей, включая немелкоклеточный рак легкого (аденокарциномы и плоскоклеточные раки), образцы опухолей мягких тканей (синовиальные саркомы (СС), шванномы, злокачественные фиброзные гистиоцитомы (ЗФГ) и липосаркомы, а также образцы условно нормальных тканей того же гистогенеза от каждого пациента, полученные от больных, проходивших лечение в НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

2.0сновными мишенями H-Ras, увеличивающими метастатический потенциал клеток данной экспериментальной модели, являются малые ГТФазы RalA и RalB, причем RalB обладает большей про-метастатической активностью.

3. Как RalA- так и RalB-зависимое увеличение метастатического потенциала исследуемых клеток in vivo сопровождается сходным повышением показателей уровня малигнизации клеток in vitro, однако про-метастатическое действие RalA и RalB опосредуется различными сигнальными путями.

4. Малая ГТФаза Arfó активирует PLD и усиливает активность киназы mTOR и ее мишеней (рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связывающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4Е-ВР1), а также активирует MAP киназы Erkl/2 и р38. Идентифицированы активируемые белком Arfó сигнальные пути: PLD—»mTORCl—>S6K1—>Só, PLD—>mTORC 1 —>4E-BP 1, p38—»S6, приводящие к активации комплекса инициации трансляции.

5. Arfó усиливает пролиферативную активность трансформированных фибробластов и их способность к автономному росту, однако не оказывает значимого влияния на метастатическую активность исследуемых клеток. Молекулярные механизмы, реализующие про-митогенную активность Arfó, включают активацию сигнального пути PLD—mTORCl и усиление активности р38.

6.Белок, связывающий ретиноевую кислоту, CRABP1, обладает про-туморогенной и про-метастатической активностью в отношении трансформированных фибробластов.

7.мРНК CRABP1 дифференциально экспрессируется в злокачественных опухолях мягких тканей в зависимости от гистологического типа опухоли. Белок CRABP1 убиквитарно и

на высоком уровне экспрессирован в монофазных синовиальных саркомах.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов обеспечивается использованием современных методов исследования, наличием адекватных положительных и отрицательных контролей, проведением всех экспериментов в трех и более независимых повторах, применением современных способов статистической обработки данных. Все научные результаты, содержащиеся в диссертации, получены автором лично или под непосредственным руководством автора и представляют собой законченное самостоятельное научное исследование

Все изложенные в работе результаты опубликованы в ведущих отечественных и международных журналах. Информация о публикации каждой конкретной серии экспериментов приводится в конце каждого раздела. Всего по результатам работы

опубликованы 15 научных статей. По теме диссертации представлено 17 докладов (устные или постерные презентации) на российских и международных научных конференциях и симпозиумах, в том числе: «European Small GTPase meeting», Швеция (2007); "Cancer Degradome Symposium", Лондон, Великобритания (2008); «Microenvironment, motility and metastasis», Шотландия (2009); «Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer», Греция (2009); «Eurasian Forum on Cancer diagnostics», Украина, Киев (2011); «5th EMBO Meeting», Амстердам, Нидерланды (2013); «VIII Всероссийский съезд онкологов», Москва, (2013); «И Eurasian Oncology Conference», Москва (2013). Материалы других докладов опубликованы в приложениях к журналам: European Journal of Cancer, том.1, прил.5, стр. 180, (2003); European Journal of Cancer, том. 4, выпуск 6, стр.31-32, (2006); Anticancer Research, том. 28, (5C), стр3513, (2008), Цитология 50, 87, (2008); Tumor Biol. Том 33 (Прил. 1) стр.113, (2012).

Диссертация апробирована 28 октября 2013 г. на совместной научной конференции отдела трансформирующих генов опухолей, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов, лаборатории механизмов канцерогенеза, лаборатории механизмов химического канцерогенеза, лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза ФГБУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Глава 1. Материалы и методы исследования 1.1 Клеточные линии и условия культивирования

В качестве экспериментальной модели для данного исследования использовали эмбриональные фибробласты сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Waterh), спонтанно трансформированные в культуре in vitro (STHE, STHE 83/20, STHE LNM8) или трансформированные вирусом саркомы Рауса штамм Шмидт-Руппин D (лини HET-SR, НЕТ-SR-LNM, HET-SR1, HET-SR8). Данная панель клеточных линий была получена ранее в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и любезно предоставлена руководителем лаборатории д.м.н. Г.И. Дейчман.

Для получения ретро- и лентивирусных частиц использовались линии эпителиальных клеток GP293 (Clonetech) и 293FT (Invitrogen) (производные линии НЕК-293 - линии эмбриональных клеток почки человека). Все клеточные линии культивировали в СО2-инкубаторе при +37 °С, 5% СОг. В качестве среды для культивирования использовали среду DMEM с 0,294 мг/мл L-глутамина с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (РАА Laboratories или "Gibco BRL"), 0,1 мг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина или 10 мкг/мл гентамицина. Подсчёт клеток производили с помощью камеры Горяева.

Для подавления активности PLD, mTOR, Erkl/2, и р38 киназ клетки культивировали в течение 24 часов в среде с бутанолом-1 (Sigma, 1%), рапамицином (Biomol, ЮОнМ), ингибитором CI-1040 (Seileck Chemicals, 2мМ) или SB203580 (Upstate Biotechnology, 25 мМ) соответственно.

1.2 Образцы тканей

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чевкина, Елена Максимовна, 2014 год

Список литературы

1. Де лекторская, В.В. Экспрессия белка, связывающего ретиноевую кислоту, и пролиферативная активность клеток в нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы / В.В. Делекторская, Г.Ю. Чемерис, Я.А. Каинов et al. // Молекулярная медицина. 2013. № 1. —С. 38-44.

2. Каинов, Я.А. Белок, связывающий ретиноевую кислоту (CRABPI) в патогенезе острого промиелоцитарного лейкоза и других неопластических процессов / Я.А. Каинов, И.Б. Зборовская. // Технологии живых систем. 2011. Т. 8. № 3. — С. 48-55.

3. Книжник, А.В. Участие малой ГТФазы Arf6 в канцерогенезе. : Дис. канд. биол. наук: 14.01.12 —Москва, 2010, —150.

4. Книжник, А.В. Белки ARF6, RALA и BIRC5 при немелкоклеточном раке легкого / А.В. Книжник, О.В. Ковалева, К.К. Лактионов et al. // Молекулярная биология. 2011. Т. 45. № 2. —С. 307-315.

5. Рыбко, В.А. Исследование молекулярных механизмов Ral-опосредованной стимуляции метастазирования : Дис. канд. биол. наук: 14.01.12 — Москва, 2009. — 109 с.

6. Фаворская, И.А. Роль белка CRABP1 в формировании высокометастазного фенотипа RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка / И.А. Фаворская, Е.Е. Антошина, Т.Г. Горькова et al. // Российский биотерапевтический журнал. 2001. Т. 10. № 2. — С. 37-44.

7. Чевкина, Е.М. Экспрессия CRABP1 и CRABP2 в саркомах мягких тканей / Е.М. Чевкина, И.А. Фаворская, Я.А. Каинов et al. // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. 2013. № 1. —С. 47-53.

8. Afroze, S.H. Internalization of exogenous ADP-ribosylation factor 6 (Arf6) proteins into cells / S.H. Afroze, M.N. Uddin, X. Cao et al. // Mol Cell Biochem. 2011. T. 354. № 1-2. — C. 291299.

9. Agapova, L.S. Activation of Ras-Ral pathway attenuates p53-independent DNA damage G2 checkpoint / L.S. Agapova, J.L. Volodina, P.M. Chumakov, B.P. Kopnin. // J.Biol.Chem. 2004. T. 279. № 35. — C. 36382-36389.

10. Aguirre-Ghiso, J.A. RalA requirement for v-Src- and v-Ras-induced tumorigenicity and overproduction of urokinase-type plasminogen activator: involvement of metalloproteases / J.A. Aguirre-Ghiso, P. Frankel, E.F. Farias et al. // Oncogene. 1999. T. 18. № 33. _ c. 4718-4725.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22,

23,

24,

25,

26,

27,

28,

29,

30,

Ahlquist, T. Gene methylation profiles of normal mucosa, and benign and malignant colorectal tumors identify early onset markers / T. Ahlquist, G.E. Lind, V.L. Costa et al. // Mol Cancer. 2008. T. 7. — C. 94.

Ahn, B.H. Transmodulation between phospholipase D and c-Src enhances cell proliferation / B.H. Ahn, S.Y. Kim, E.H. Kim et al. // Mol.Cell Biol. 2003. T. 23. № 9. — C. 3103-3115. Aigner, S. CD24 mediates rolling of breast carcinoma cells on P-selectin / S. Aigner, C.L. Ramos, A. Hafezi-Moghadam et al. // FASEB J. 1998. T. 12. № 12. — C. 1241-1251. Albanese, C. Transforming p21ras mutants and c-Ets-2 activate the cyclin D1 promoter through distinguishable regions / C. Albanese, J. Johnson, G. Watanabe et al. // J Biol Chem. 1995. T. 270. № 40. — C. 23589-23597.

Alessi, D.R. 3-Phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1) phosphorylates and activates the p70 S6 kinase in vivo and in vitro / D.R. Alessi, M.T. Kozlowski, Q.P. Weng et al. // Curr Biol. 1998. T. 8. № 2. — C. 69-81.

Allen, M. Restricted tissue expression pattern of a novel human rasGAP-related gene and its murine ortholog / M. Allen, S. Chu, S. Brill et al. // Gene. 1998. T. 218. № 1-2. — C. 17-25. Almoguera, C. Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-K-ras genes / C. Almoguera, D. Shibata, K. Forrester et al. // Cell. 1988. T. 53. № 4. — C. 549-554. Anjum, R. The RSK family of kinases: emerging roles in cellular signalling / R. Anjum, J. Blenis. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2008. T. 9. № 10. — C. 747-758.

Antonny, B. N-terminal hydrophobic residues of the G-protein ADP-ribosylation factor-1 insert into membrane phospholipids upon GDP to GTP exchange / B. Antonny, S. Beraud-Dufour, P. Chardin, M. Chabre. // Biochemistry. 1997. T. 36. № 15. _ c. 4675-4684. Arthur, W.T. Rapl promotes cell spreading by localizing Rac guanine nucleotide exchange factors / W.T. Arthur, L.A. Quilliam, J.A. Cooper. // J Cell Biol. 2004. T. 167. № 1. — C. 111122.

Averous, J. When translation meets transformation: the mTOR story / J. Averous, C.G. Proud. // Oncogene. 2006. T. 25. № 48. — C. 6423-6435.

Avruch, J. The p70 S6 kinase integrates nutrient and growth signals to control translational capacity / J. Avruch, C. Belham, Q. Weng et al. // Prog Mol Subcell Biol. 2001. T. 26. — C. 115-154.

Awasthi, S. Novel function of human RLIP76: ATP-dependent transport of glutathione conjugates and doxorubicin / S. Awasthi, J. Cheng, S.S. Singhal et al. // Biochemistry. 2000. T. 39. № 31. — C. 9327-9334.

Awasthi, Y.C. The non-ABC drug transporter RLIP76 (RALBP-1) plays a major role in the mechanisms of drug resistance / Y.C. Awasthi, R. Sharma, S. Yadav et al. // Curr.Drug Metab. 2007. T. 8. № 4. — C. 315-323.

Backer, J.M. The regulation and function of Class III PI3Ks: novel roles for Vps34 / J.M. Backer. // Biochem J. 2008. T. 410. № 1. — C. 1-17.

Badway, J.A. Reps2: a cellular signaling and molecular trafficking nexus / J.A. Badway, J.D. Baleja. // Int J Biochem Cell Biol. 2011. T. 43. № 12. — C. 1660-1663. Baker, T.L. Distinct rates of palmitate turnover on membrane-bound cellular and oncogenic H-ras / T.L. Baker, H. Zheng, J. Walker et al. // J Biol Chem. 2003. T. 278. № 21. — C. 19292192300.

Bakiri, L. Cell cycle-dependent variations in c-Jun and JunB phosphorylation: a role in the control of cyclin D1 expression / L. Bakiri, D. Lallemand, E. Bossy-Wetzel, M. Yaniv. // EMBO J. 2000. T. 19. № 9. _ c. 2056-2068.

Balakireva, M. The Ral/exocyst effector complex counters c-Jun N-terminal kinase-dependent apoptosis in Drosophila melanogaster / M. Balakireva, C. Rosse, J. Langevin et al. // Mol.Cell Biol. 2006. T. 26. № 23. — C. 8953-8963.

Balasubramanian, N. RalA-Exocyst Complex Regulates Integrin-Dependent Membrane Raft Exocytosis and Growth Signaling / N. Balasubramanian, J.A. Meier, D.W. Scott et al. // Curr.Biol. 2009.

31. Balasubramanian, N. Arf6 and microtubules in adhesion-dependent trafficking of lipid rafts / N. Balasubramanian, D.W. Scott, J.D. Castle et al. //Nat Cell Biol. 2007. T. 9. № 12. — C. 13811391.

32. Balda, M.S. The ZO-1-associated Y-box factor ZONAB regulates epithelial cell proliferation and cell density / M.S. Balda, M.D. Garrett, K. Matter. // J.Cell Biol. 2003. T. 160. № 3. — C. 423-432.

33. Ballif, B.A. Quantitative phosphorylation profiling of the ERK/p90 ribosomal S6 kinase-signaling cassette and its targets, the tuberous sclerosis tumor suppressors / B.A. Ballif, P.P. Roux, S.A. Gerber et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. T. 102. № 3. — C. 667-672.

34. Bamford, S. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website / S. Bamford, E. Dawson, S. Forbes et al. // Br.J.Cancer. 2004. T. 91. № 2. — C. 355-358.

35. Banz, C. The molecular signature of endometriosis-associated endometrioid ovarian cancer differs significantly from endometriosis-independent endometrioid ovarian cancer / C. Banz, U. Ungethuem, R.J. Kuban et al. // Fertil Steril. 2010. T. 94. № 4. — C. 1212-1217.

36. Barbacid, M. ras genes / M. Barbacid. // Annu Rev Biochem. 1987. T. 56. — C. 779-827.

37. Barbie, D.A. Systematic RNA interference reveals that oncogenic KRAS-driven cancers require TBK1 / D.A. Barbie, P. Tamayo, J.S. Boehm et al. // Nature. 2009. T. 462. № 7269. — C. 108-112.

38. Bard, J.B. A bioinformatics approach for identifying candidate transcriptional regulators of mesenchyme-to-epithelium transitions in mouse embryos / J.B. Bard, M.S. Lam, S. Aitken. // Dev.Dyn. 2008. T. 237. № 10. — C. 2748-2754.

39. Bastian, B.C. Understanding the progression of melanocytic neoplasia using genomic analysis: from fields to cancer / B.C. Bastian. // Oncogene. 2003. T. 22. № 20. — C. 3081-3086.

40. Bauer, B. Effector recognition by the small GTP-binding proteins Ras and Ral / B. Bauer, G. Mirey, I.R. Vetter et al. // J Biol Chem. 1999. T. 274. № 25. — C. 17763-17770.

41. Begle, A. ARF6 regulates the synthesis of fusogenic lipids for calcium-regulated exocytosis in neuroendocrine cells / A. Begle, P. Tryoen-Toth, B.J. de et al. // J.Biol.Chem. 2009. T. 284. № 8. — C. 4836-4845.

42. Behrends, C. Network organization of the human autophagy system / C. Behrends, M.E. Sowa, S.P. Gygi, J.W. Harper. //Nature. 2010. T. 466. № 7302. — C. 68-76.

43. Bernards, A. GAP control: regulating the regulators of small GTPases / A. Bernards, J. Settleman. // Trends Cell Biol. 2004. T. 14. № 7. — C. 377-385.

44. Berstein, G. Phospholipase C-beta 1 is a GTPase-activating protein for Gq/11, its physiologic regulator / G. Berstein, J.L. Blank, D.Y. Jhon et al. // Cell. 1992. T. 70. № 3. — C. 411-418.

45. Bhanot, H. Induction of nonapoptotic cell death by activated Ras requires inverse regulation of Racl and Arf6 / H. Bhanot, A.M. Young, J.H. Overmeyer, W.A. Maltese. // Mol Cancer Res. 2010. T. 8. № 10. — C. 1358-1374.

46. Bhattacharya, M. Beta-arrestins regulate a Ral-GDS Ral effector pathway that mediates cytoskeletal reorganization / M. Bhattacharya, P.H. Anborgh, A.V. Babwah et al. // Nat.Cell Biol. 2002. T. 4. № 8. — C. 547-555.

47. Bhattacharya, M. Ral and phospholipase D2-dependent pathway for constitutive metabotropic glutamate receptor endocytosis / M. Bhattacharya, A.V. Babwah, C. Godin et al. // J.Neurosci. 2004. T. 24. № 40. — C. 8752-8761.

48. Bivona, T.G. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis / T.G. Bivona, S.E. Quatela, B.O. Bodemann et al. // Mol.Cell. 2006. T. 21. № 4. — C. 481-493.

49. Blaese, M. A. CRABP I expression and the mediation of the sensitivity of human tumour cells to retinoic acid and irradiation / M.A. Blaese, L. Santo-Hoeltje, H.P. Rodemann. // Int J Radiat Biol. 2003. T. 79. № 12. — C. 981-991.

50. Blenis, J. Distinct mechanisms for the activation of the RSK kinases/MAP2 kinase/pp90rsk and pp70-S6 kinase signaling systems are indicated by inhibition of protein synthesis / J. Blenis, J. Chung, E. Erikson et al. // Cell Growth Differ. 1991. T. 2. № 6. — C. 279-285.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

57.

58.

59.

60.

61.

62,

63

64,

65,

66.

67,

68

69

70,

Bodemann, B.O. RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly / B.O. Bodemann, A. Orvedahl, T. Cheng et al. // Cell. 2011. T. 144. № 2. — C. 253-267.

Bodemann, B.O. Ral GTPases and cancer: linchpin support of the tumorigenic platform / B.O. Bodemann, M.A. White. // Nat.Rev.Cancer. 2008. T. 8. № 2. — C. 133-140. Boettner, B. The junctional multidomain protein AF-6 is a binding partner of the RaplA GTPase and associates with the actin cytoskeletal regulator profilin / B. Boettner, E.E. Govek, J. Cross, L. Van Aelst. // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. T. 97. № 16. — C. 9064-9069. Boguski, M.S. Proteins regulating Ras and its relatives / M.S. Boguski, F. McCormick. // Nature. 1993. T. 366. № 6456. — C. 643-654.

Boissel, L. Recruitment of Cdc42 through the GAP domain of RLIP participates in remodeling of the actin cytoskeleton and is involved in Xenopus gastrulation / L. Boissel, N. Houssin, A. Chikh et al. // Dev.Biol. 2007. T. 312. № 1. — C. 331-343.

Bonner, T.I. Structure and biological activity of human homologs of the raf7mil oncogene / T.I. Bonner, S.B. Kerby, P. Sutrave et al. // Mol Cell Biol. 1985. T. 5. № 6. — C. 1400-1407. Bos, J.L. Ras-like GTPases / J.L. Bos. // Biochim.Biophys.Acta. 1997. T. 1333. № 2. — C. 1931.

Bos, J.L. All in the family? New insights and questions regarding interconnectivity of Ras, Rapl and Ral / J.L. Bos. // EMBO J. 1998. T. 17. № 23. — C. 6776-6782. Bos, J.L. ras oncogenes in human cancer: a review / J.L. Bos. // Cancer Res. 1989. T. 49. № 17. — C. 4682-4689.

Boshans, R.L. ADP-ribosylation factor 6 regulates actin cytoskeleton remodeling in coordination with Racl and RhoA / R.L. Boshans, S. Szanto, L. van Aelst, C. D'Souza-Schorey. // Mol Cell Biol. 2000. T. 20. № 10. — C. 3685-3694.

Boyd, C. Vesicles carry most exocyst subunits to exocytic sites marked by the remaining two subunits, Sec3p and Exo70p / C. Boyd, T. Hughes, M. Pypaert, P. Novick. // J.Cell Biol. 2004. T. 167. № 5. —C. 889-901.

Boylan, J.F. The level of CRABP-I expression influences the amounts and types of all-trans-retinoic acid metabolites in F9 teratocarcinoma stem cells / J.F. Boylan, L.J. Gudas. // J Biol Chem. 1992. T. 267. № 30. — C. 21486-21491.

Boylan, J.F. Overexpression of the cellular retinoic acid binding protein-I (CRABP-I) results in a reduction in differentiation-specific gene expression in F9 teratocarcinoma cells / J.F. Boylan, L.J. Gudas. // J Cell Biol. 1991. T. 112. № 5. — C. 965-979.

Brandes, M. Retinoic acid binding protein in human and experimental pancreatic carcinomas in hamsters / M. Brandes, M.S. Gesell, H. Ueda et al. // Ann Clin Lab Sci. 1983. T. 13. № 5. — C. 400-406.

Brashishkite, D.A. [Differences in the distribution of proviruses in low- and highly- metastatic variants of hamster cells, transformed by Rous sarcoma virus] / D.A. Brashishkite, A.G. Tatosian, F.L. Kiselev et al. // Mol Biol (Mosk). 1989. T. 23. № 3. — C. 758-764. Browne, G.J. A Novel mTOR-Regulated Phosphorylation Site in Elongation Factor 2 Kinase Modulates the Activity of the Kinase and Its Binding to Calmodulin / G.J. Browne, C.G. Proud. // Molecular and Cellular Biology. 2004. T. 24. № 7. — C. 2986-2997.

Browne, G.J. Regulation of peptide-chain elongation in mammalian cells / G.J. Browne, C.G. Proud. // Eur J Biochem. 2002. T. 269. № 22. — C. 5360-5368.

Brymora, A. The brain exocyst complex interacts with RalA in a GTP-dependent manner: identification of a novel mammalian Sec3 gene and a second Sec 15 gene / A. Brymora, V.A. Valova, M.R. Larsen et al. // J.Biol.Chem. 2001. T. 276. № 32. — C. 29792-29797. Buchsbaum, R.J. Regulation of p70 S6 kinase by complex formation between the Rac guanine nucleotide exchange factor (Rac-GEF) Tiaml and the scaffold spinophilin / R.J. Buchsbaum, B.A. Connolly, L.A. Feig. // J Biol Chem. 2003. T. 278. № 21. — C. 18833-18841. Budhu, A. Localization of the RAR interaction domain of cellular retinoic acid binding protein-II / A. Budhu, R. Gillilan, N. Noy. // J Mol Biol. 2001. T. 305. № 4. — C. 939-949.

71.

72.

73.

74.

75.

76.

77.

78.

79.

80

81.

82.

83,

84

85,

86

87,

88

89

90

Budhu, A.S. Direct channeling of retinoic acid between cellular retinoic acid-binding protein II and retinoic acid receptor sensitizes mammary carcinoma cells to retinoic acid-induced growth arrest / A.S. Budhu, N. Noy. // Mol.Cell Biol. 2002. T. 22. № 8. — C. 2632-2641. Bushue, N. Retinoid pathway and cancer therapeutics / N. Bushue, Y.J. Wan. // Adv Drug Deliv Rev. 2010. T. 62. № 13. — C. 1285-1298.

Byfield, M.P. hVps34 is a nutrient-regulated lipid kinase required for activation of p70 S6 kinase / M.P. Byfield, J.T. Murray, J.M. Backer. // J Biol Chem. 2005. T. 280. № 38. — C. 33076-33082.

Calmon, M.F. Epigenetic silencing of CRABP2 and MX1 in head and neck tumors / M.F. Calmon, R.Y. Rodrigues, C.M. Kaneto et al. // Neoplasia. 2009. Т. 11. № 12. — C. 1329-1339. Camonis, J.H. Ral GTPases: corrupting the exocyst in cancer cells / J.H. Camonis, M.A. White. // Trends Cell Biol. 2005. T. 15. № 6. — C. 327-332.

Cantor, S.B. Identification and characterization of Ral-binding protein 1, a potential downstream target of Ral GTPases / S.B. Cantor, T. Urano, L.A. Feig. // Mol.Cell Biol. 1995. T. 15. № 8. — C. 4578-4584.

Carbone, A. Human Harvey-ras is biochemically different from Kirsten- or N-ras / A. Carbone, G.L. Gusella, D, Radzioch, L. Varesio. // Oncogene. 1991. T. 6. № 5. — C. 731-737. Carlberg, U. Functional properties of phosphorylated elongation factor 2 / U. Carlberg, A. Nilsson, O. Nygard. // Eur J Biochem. 1990. T. 191. № 3. — C. 639-645. Carriere, A. Oncogenic МАРК signaling stimulates mTORCl activity by promoting RSK-mediated raptor phosphorylation / A. Carriere, M. Cargnello, L.A. Julien et al. // Curr Biol. 2008. T. 18. № 17. — C. 1269-1277.

Casanova, J.E. Regulation of Arf activation: the Sec7 family of guanine nucleotide exchange factors / J.E. Casanova. // Traffic. 2007. T. 8. № 11. — C. 1476-1485.

Casas-Terradellas, E. ERK and p38 pathways regulate amino acid signalling / E. Casas-Terradellas, I. Tato, R. Bartrons et al. // Biochim Biophys Acta. 2008.'T. 1783. № 12. — C. 2241-2254.

Cascone, I. Distinct roles of RalA and RalB in the progression of cytokinesis are supported by distinct RalGEFs /1. Cascone, R. Selimoglu, C. Ozdemir et al. // EMBO J. 2008. T. 27. № 18. — C. 2375-2387.

Chardin, P. The ral gene: a new ras related gene isolated by the use of a synthetic probe / P. Chardin, A. Tavitian. // EMBO J. 1986. T. 5. № 9. _ c. 2203-2208.

Chardin, P. Coding sequences of human ral A and ralB cDNAs / P. Chardin, A. Tavitian. // Nucleic Acids Res. 1989. T. 17. № 11. — C. 4380.

Chaudhuri, B.N. Structures of cellular retinoic acid binding proteins I and II in complex with synthetic retinoids / B.N. Chaudhuri, G.J. Kleywegt, I. Broutin-L'Hermite et al. // Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 1999. T. 55. №Pt 11. — C. 1850-1857.

Chavrier, P. Toward a structural understanding of arf family:effector specificity / P. Chavrier, J. Menetrey. // Structure. 2010. T. 18. № 12. — C. 1552-1558.

Chen, A.C. Homozygous deletion of the CRABPI gene in AB1 embryonic stem cells results in increased CRABPII gene expression and decreased intracellular retinoic acid concentration / A.C. Chen, K. Yu, M.A. Lane, L.J. Gudas. // Arch Biochem Biophys. 2003. T. 411. № 2. — C. 159-173.

Chen, X.W. RalA-exocyst-dependent recycling endosome trafficking is required for the completion of cytokinesis / X.W. Chen, M. Inoue, S.C. Hsu, A.R. Saltiel. // J.Biol.Chem. 2006. T. 281. № 50. — C. 38609-38616.

Chen, X.W. A Ral GAP complex links PI 3-kinase/Akt signaling to RalA activation in insulin action / X.W. Chen, D. Leto, T. Xiong et al. // Mol Biol Cell. 2011. T. 22. № 1. — C. 141-152. Chen, Y. Alternative phospholipase D/mTOR survival signal in human breast cancer cells / Y. Chen, V. Rodrik, D.A. Foster. // Oncogene. 2005. T. 24. № 4. — C. 672-679.

>

91. Chien, Y. RalB GTPase-mediated activation of the IkappaB family kinase TBK1 couples v innate immune signaling to tumor cell survival / Y. Chien, S. Kim, R. Bumeister et al. // Cell. 2006. T. 127. № 1. — C. 157-170.

92. Chien, Y. RAL GTPases are linchpin modulators of human tumour-cell proliferation and f survival / Y. Chien, M.A. White. // EMBO Rep. 2003. T. 4. № 8. — C. 800-806.

93. Christie, V.B. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. / V.B. Christie, D.J. Maltman, A.P. Henderson et al. // Journal of neuroscience methods. 2010. T. 193. — C. 239-245.

94. Chun, J. Characterization of class I and II ADP-ribosylation factors (Arfs) in live cells: GDP-bound class II Arfs associate with the ER-Golgi intermediate compartment independently of GBF1 / J. Chun, Z. Shapovalova, S.Y. Dejgaard et al. // Mol Biol Cell. 2008. T. 19. № 8. — C. 3488-3500.

95. Chung, J. Rapamycin-FKBP specifically blocks growth-dependent activation of and signaling by the 70 kd S6 protein kinases / J. Chung, C.J. Kuo, G.R. Crabtree, J. Blenis. // Cell. 1992. T. 69. № 7. — C. 1227-1236.

96. Cichowski, K. Dynamic regulation of the Ras pathway via proteolysis of the NF1 tumor suppressor / K. Cichowski, S. Santiago, M. Jardim et al. // Genes Dev. 2003. T. 17. № 4. — C. 449-454.

97. Claing, A. beta-Arrestin-mediated ADP-ribosylation factor 6 activation and beta 2-adrenergic receptor endocytosis / A. Claing, W. Chen, W.E. Miller et al. // J.Biol.Chem. 2001. T. 276. № 45, —C. 42509-42513.

98. Claperon, A. KSR and CNK: two scaffolds regulating RAS-mediated RAF activation / A. Claperon, M. Therrien. // Oncogene. 2007. T. 26. № 22. — C. 3143-3158.

99. Clough, R.R. Calmodulin binds RalA and RalB and is required for the thrombin-induced activation of Ral in human platelets / R.R. Clough, R.S. Sidhu, R.P. Bhullar. // J.Biol.Chem.

2002. T. 277. № 32. — C. 28972-28980.

100. Cockcroft, S. Phospholipase D: a downstream effector of ARF in granulocytes / S. Cockcroft, G.M. Thomas, A. Fensome et al. // Science. 1994. T. 263. № 5146. — C. 523-526.

101. Collins, C.A. Dynamic regulation of retinoic acid-binding proteins in developing, adult and neoplastic skin reveals roles for beta-catenin and Notch signalling / C.A. Collins, F.M. Watt. // DevBiol. 2008. T. 324. Jfel.-C. 55-67.

102. Collins, S.J. The role of retinoids and retinoic acid receptors in normal hematopoiesis / S.J. Collins. // Leukemia. 2002. T. 16. № 10. — C. 1896-1905.

103. Cotton, M. Endogenous ARF6 interacts with Racl upon angiotensin II stimulation to regulate membrane ruffling and cell migration / M. Cotton, P.L. Boulay, T. Houndolo et al. // Mol Biol Cell. 2007. T. 18. №2. — C. 501-511.

104. Cowley, S. Activation of MAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC 12 differentiation and for transformation of NIH 3T3 cells / S. Cowley, H. Paterson, P. Kemp, C.J. Marshall. // Cell. 1994. T. 77. № 6. — C. 841-852.

105. Cox, A.D. The dark side of Ras: regulation of apoptosis / A.D. Cox, C.J. Der. // Oncogene.

2003. T. 22. № 56. — C. 8999-9006.

106. Cozier, G.E. GAP1IP4BP contains a novel group I pleckstrin homology domain that directs constitutive plasma membrane association / G.E. Cozier, P.J. Lockyer, J.S. Reynolds et al. // J Biol Chem. 2000. T. 275. № 36. — C. 28261-28268.

107. D'Souza-Schorey, C. ARF proteins: roles in membrane traffic and beyond / C. D'Souza-Schorey, P. Chavrier. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2006. T. 7. № 5. — C. 347-358.

108. D'Souza-Schorey, C. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis / C. D'Souza-Schorey, G. Li, M.I. Colombo, P.D. Stahl. // Science. 1995. T. 267. № 5201. — C. 1175-1178.

109. D'Souza-Schorey, C. ARF6 targets recycling vesicles to the plasma membrane: insights from an ultrastructural investigation / C. D'Souza-Schorey, E. van Donselaar, V.W. Hsu et al. // J Cell Biol. 1998. T. 140. № 3. — C. 603-616.

110

111.

112

113,

114,

115,

116

117,

118

119,

120,

121

122,

123

124,

125,

126,

127,

Daher, Z. Endothelin-1 promotes migration of endothelial cells through the activation of ARF6 and the regulation of FAK activity / Z. Daher, J. Noel, A. Claing. // Cell Signal. 2008. T. 20. № 12. — C. 2256-2265.

Dai, Z. Oncogenic Abl and Src tyrosine kinases elicit the ubiquitin-dependent degradation of target proteins through a Ras-independent pathway / Z. Dai, R.C. Quackenbush, K.D. Courtney et al. // Genes Dev. 1998. T. 12. № 10. — C. 1415-1424.

Dalziel, M. Ras oncogene induces beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase (ST6Gal I) via a RalGEF-mediated signal to its housekeeping promoter / M. Dalziel, F. Dall'Olio, A. Mungul et al. // Eur.J.Biochem. 2004. T. 271. № 18. — C. 3623-3634.

Daniel, J.M. The tyrosine kinase substrate pl20cas binds directly to E-cadherin but not to the adenomatous polyposis coli protein or alpha-catenin / J.M. Daniel, A.B. Reynolds. // Mol Cell Biol. 1995. T. 15. № 9. — C. 4819-4824.

Dasgupta, B. Neurofibromatosis 1: closing the GAP between mice and men / B. Dasgupta, D.H. Gutmann. // Curr Opin Genet Dev. 2003. T. 13. № 1. — C. 20-27.

Dass, K. Evolving role of uPA/uPAR system in human cancers / K. Dass, A. Ahmad, A.S. Azmi et al. // Cancer TreatRev. 2008. T. 34. № 2. — C. 122-136.

Davies, H. Mutations of the BRAF gene in human cancer / H. Davies, G.R. Bignell, C. Cox et al. // Nature. 2002. T. 417. № 6892. — C. 949-954.

Davis, R.J. The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway / R.J. Davis. // J Biol Chem. 1993. T. 268. № 20. — C. 14553-14556.

de Gorter, D.J. The B cell antigen receptor controls AP-1 and NFAT activity through Rasmediated activation of Ral / D.J. de Gorter, J.C. Vos, S.T. Pals, M. Spaargaren. // J.Immunol. 2007. T. 178. № 3. — C. 1405-1414.

de Kier Joffe, E.B. [Signaling pathways regulating the expression of proteases during tumor progression] / E.B. de Kier Joffe, E. Mazzoni, J.A. guirre Ghiso. // Medicina (B Aires). 2000. T. 60 Suppl 2. — C. 34-40.

de Ruiter, N.D. Regulation of the Forkhead transcription factor AFX by Ral-dependent phosphorylation of threonines 447 and 451 / N.D. de Ruiter, B.M. Burgering, J.L. Bos. // Mol.Cell Biol. 2001. T. 21. № 23. — C. 8225-8235.

de Ruiter, N.D. Ras-dependent regulation of c-Jun phosphorylation is mediated by the Ral guanine nucleotide exchange factor-Ral pathway / N.D. de Ruiter, R.M. Wolthuis, D.H. van et al. // Mol.Cell Biol. 2000. T. 20. № 22. — C. 8480-8488.

de The, H. Identification of a retinoic acid responsive element in the retinoic acid receptor beta gene / H. de The, M.M. Vivanco-Ruiz, P. Tiollais et al. // Nature. 1990. T. 343. № 6254. — C. 177-180.

Deichman, G.I. Mechanisms of unusually high antioxidant activity of RSV-SR-transformed cells and of its suppression by activated p21(ras) / G.I. Deichman, L.M. Kashkina, O.A. Mizenina et al. // International Journal of Cancer. 1996. T. 66. № 6. — C. 747-752. Deichman, G.I. Clustering of discrete cell properties essential for tumorigenicity and metastasis.

II. Studies of Syrian hamster embryo fibroblasts transformed by Rous sarcoma virus / G.I. Deichman, H.A. Kashleva, T.E. Kluchareva, V.A. Matveeva. // Int J Cancer. 1989. T. 44. № 5. — C. 908-910.

Deichman, G.I. Clustering of discrete cell properties essential for tumorigenicity and metastasis. I. Studies of Syrian hamster embryo fibroblasts spontaneously transformed in vitro / G.I. Deichman, T.E. Kluchareva, V.A. Matveeva et al. // Int J Cancer. 1989. T. 44. № 5. — C. 904907.

Deichman, G.I. Clustering of discrete cell properties essential for tumorigenicity and metastasis.

III. Dissociation of the properties in N-ras-transfected RSV-SR-transformed cells / G.I. Deichman, L.Z. Topol, T.E. Kluchareva et al. // Int J Cancer. 1992. T. 51. № 6. — C. 903-908. del Pozo, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK / M.A. del Pozo, L.S. Price, N.B. Alderson et al. // EMBO J. 2000. T. 19. № 9. — C. 2008-2014.

128.

129.

130.

131.

132.

133.

134.

135.

136.

137.

138.

139.

140,

141,

142,

143,

144,

145,

146,

147,

148

Dennis, J.W. Glycoprotein glycosylation and cancer progression / J.W. Dennis, M. Granovsky, C.E. Warren. //Biochim.Biophys.Acta. 1999. T. 1473. № 1. — C. 21-34. Dennis, P.B. Mammalian TOR: a homeostatic ATP sensor / P.B. Dennis, A. Jaeschke, M. Saitoh et al. // Science. 2001. T. 294. № 5544. — C. 1102-1105.

Dodge, R. Developmental pathways during in vitro progression of human islet neogenesis / R. Dodge, C. Loomans, A. Sharma, S. Bonner-Weir. // Differentiation. 2009. T. 77. № 2. — C. 135-147.

Doherty, G.J. Mechanisms of endocytosis / G.J. Doherty, H.T. McMahon. // Annu.Rev.Biochem. 2009. T. 78. — C. 857-902.

Donaldson, J.G. Multiple roles for Arf6: sorting, structuring, and signaling at the plasma membrane / J.G. Donaldson. // J Biol Chem. 2003. T. 278. № 43. — C. 41573-41576. Donaldson, J.G. ARF family G proteins and their regulators: roles in membrane transport, development and disease / J.G. Donaldson, C.L. Jackson. //Nat Rev Mol Cell Biol. 2011. T. 12. №6. —C. 362-375.

Donaldson, J.G. Clathrin-independent endocytosis: a unique platform for cell signaling and PM remodeling / J.G. Donaldson, N. Porat-Shliom, L.A. Cohen. // Cell Signal. 2009. T. 21. № 1. — C. 1-6.

Dong, D. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid / D. Dong, S.E. Ruuska, D.J. Levinthal, N. Noy. // J Biol Chem. 1999. T. 274. № 34. — C. 23695-23698.

Dowling, R.J. mTORCl-mediated cell proliferation, but not cell growth, controlled by the 4E-BPs / R.J. Dowling, I. Topisirovic, T. Alain et al. // Science. 2010. T. 328. № 5982. — C. 1172-1176.

Downward, J. Ras signalling and apoptosis / J. Downward. // Curr Opin Genet Dev. 1998. T. 8. № 1. —C. 49-54.

Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy / J. Downward. // Nat Rev Cancer. 2003. T. 3. № 1. — C. 11-22.

Drake, K.J. RALBP1/RLIP76 mediates multidrug resistance / K.J. Drake, J. Singhal, S. Yadav et al. // Int J Oncol. 2007. T. 30. № 1. — C. 139-144.

Dressier, D. Expression of retinoid-related genes in serum-free cultures of normal, immortalized and malignant human oral keratinocytes / D. Dressier, Z. Sarang, Z. Szondy et al. // Int J Oncol. 2002. T. 20. № 5. — C. 897-903.

Drin, G. Stimulation of phospholipase Cbeta by membrane interactions, interdomain movement, and G protein binding—how many ways can you activate an enzyme? / G. Drin, S. Scarlata. // Cell Signal. 2007. T. 19. № 7. — C. 1383-1392.

Duij sings, D. Differential membrane association properties and regulation of class I and class II Arfs / D. Duij sings, K.H. Lanke, S.H. van Dooren et al. // Traffic. 2009. T. 10. № 3. — C. 316323.

Duong, V. The molecular physiology of nuclear retinoic acid receptors. From health to disease / V. Duong, C. Rochette-Egly. // Biochim Biophys Acta. 2011. T. 1812. № 8. — C. 1023-1031. Dupe, V. A newborn lethal defect due to inactivation of retinaldehyde dehydrogenase type 3 is prevented by maternal retinoic acid treatment / V. Dupe, N. Matt, J.M. Gamier et al. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2003. T. 100. № 24. — C. 14036-14041.

EauClaire, S. Conservation and specialization. The role of the exocyst in neuronal exocytosis / S. EauClaire, W. Guo. //Neuron. 2003. T. 37. № 3. — C. 369-370.

Ebnet, K. Junctional adhesion molecule interacts with the PDZ domain-containing proteins AF-6 and ZO-1 / K. Ebnet, C.U. Schulz, M.K. Meyer Zu Brickwedde et al. // J Biol Chem. 2000. T. 275. № 36. — C. 27979-27988.

Echard, A. Membrane traffic and polarization of lipid domains during cytokinesis / A. Echard. // Biochem Soc Trans. 2008. T. 36. № Pt 3. — C. 395-399.

Egeblad, M. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression / M. Egeblad, Z. Werb. //NatRev.Cancer. 2002. T. 2. № 3. — C. 161-174.

149. Ehrhardt, A. Ras and relatives-job sharing and networking keep an old family together / A. Ehrhardt, G.R. Ehrhardt, X. Guo, J.W. Schräder. // Exp.Hematol. 2002. T. 30. № 10. — C. 1089-1106.

150. Eichele, G. Retinoic acid induces a pattern of digits in anterior half wing buds that lack the zone of polarizing activity / G. Eichele. // Development. 1989. T. 107. № 4. — C. 863-867.

151. Eichele, G. Retinoids and vertebrate limb pattern formation / G. Eichele. // Trends Genet. 1989. T. 5. № 8. — C. 246-251.

152. Ellerbrock, S.M. SGEF, a RhoG guanine nucleotide exchange factor that stimulates macropinocytosis / S.M. Ellerbroek, K. Wennerberg, W.T. Arthur et al. // Mol Biol Cell. 2004. T. 15. № 7. — C. 3309-3319.

153. Emkey, R. Characterization of a GTPase-activating protein for the Ras-related Rai protein / R. Emkey, S. Freedman, L.A. Feig. // J.Biol.Chem. 1991. T. 266. № 15. — C. 9703-9706.

154. Essers, M.A. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Rai and JNK / M.A. Essers, S. Weijzen, A.M. de Vries-Smits et al. // EMBO J. 2004. T. 23. № 24. — C. 4802-4812.

155. Etienne-Manneville, S. Rho GTPases in cell biology / S. Etienne-Manneville, A. Hall. // Nature.

2002. T. 420. № 6916. — C. 629-635.

156. Evan, G. A matter of life and cell death / G. Evan, T. Littlewood. // Science. 1998. T. 281. № 5381. —C. 1317-1322.

157. Exton, J.H. Regulation of phospholipase D / J.H. Exton. // FEBS Lett. 2002. T. 531. № 1. — C. 58-61.

158. Exton, J.H. Phospholipase D-structure, regulation and function / J.H. Exton. // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2002. T. 144. — C. 1-94.

159. Eyster, C.A. Discovery of new cargo proteins that enter cells through clathrin-independent endocytosis / C.A. Eyster, J.D. Higginson, R. Huebner et al. // Traffic. 2009. T. 10. № 5. — C. 590-599.

160. Falace, A. TBC1D24, an ARF6-interacting protein, is mutated in familial infantile myoclonic epilepsy / A. Falace, F. Filipello, V. La Padula et al. // Am J Hum Genet. 2010. T. 87. № 3. _

C. 365-370.

161. Falsetti, S.C. Geranylgeranyltransferase I inhibitors target RalB to inhibit anchorage-dependent growth and induce apoptosis and RalA to inhibit anchorage-independent growth / S.C. Falsetti,

D.A. Wang, H. Peng et al. // Mol.Cell Biol. 2007. T. 27. № 22. — C. 8003-8014.

162. Fan, S. Ras effector pathways modulate scatter factor-stimulated NF-kappaB signaling and protection against DNA damage / S. Fan, Q. Meng, J.J. Laterra, E.M. Rosen. // Oncogene. 2007. T. 26. № 33. — C. 4774-4796.

163. Fang, X. CD24: from A to Z / X. Fang, P. Zheng, J. Tang, Y. Liu. // Cell Mol Immunol. 2010. T. 7. № 2. — C. 100-103.

164. Fang, Y. Phosphatidic acid-mediated mitogenic activation of mTOR signaling / Y. Fang, M. Vilella-Bach, R. Bachmann et al. // Science. 2001. T. 294. № 5548. — C. 1942-1945.

165. Farooqui, R. Glycogen synthase kinase-3 acts upstream of ADP-ribosylation factor 6 and Racl to regulate epithelial cell migration / R. Farooqui, S. Zhu, G. Fenteany. // Exp Cell Res. 2006. T. 312. № 9. — C. 1514-1525.

166. Fei, J. miR-181a post-transcriptionally downregulates oncogenic RalA and contributes to growth inhibition and apoptosis in chronic myelogenous leukemia (CML) / J. Fei, Y. Li, X. Zhu, X. Luo. // PLoS One. 2012. T. 7. № 3. — C. e32834.

167. Feig, L.A. Ral-GTPases: approaching their 15 minutes of fame / L.A. Feig. // Trends Cell Biol.

2003. T. 13. № 8. — C. 419-425.

168. Feig, L.A. Evidence for a Ras/Ral signaling cascade / L.A. Feig, T. Urano, S. Cantor. // Trends Biochem.Sci. 1996. T. 21. № 11. —C. 438-441.

169. Field, S.J. PtdIns(4,5)P2 functions at the cleavage furrow during cytokinesis / S.J. Field, N. Madson, M.L. Kerr et al. // Curr Biol. 2005. T. 15. № 15. — C. 1407-1412.

170.

171.

172.

173.

174.

175.

176.

177.

178.

179.

180,

181,

182,

183,

184

185

186

187,

188

189,

190

Fielding, A.B. Rabll-FIP3 and FIP4 interact with Arf6 and the exocyst to control membrane traffic in cytokinesis / A.B. Fielding, E. Schonteich, J. Matheson et al. // EMBO J. 2005. T. 24. № 19, —C. 3389-3399.

Findlay, G.M. A MAP4 kinase related to Ste20 is a nutrient-sensitive regulator of mTOR signalling / G.M. Findlay, L. Yan, J. Procter et al. // Biochem J. 2007. T. 403. № 1. — C. 13-20. Foster, D.A. Regulation of mTOR by phosphatidic acid? / D.A. Foster. // Cancer Res. 2007. T. 67. № 1. —C. 1-4.

Foster, D.A. Phospholipase D in cell proliferation and cancer / D.A. Foster, L. Xu. // Mol.Cancer Res. 2003. T. 1. № 11. — C. 789-800.

Franco, M. EFA6, a sec7 domain-containing exchange factor for ARF6, coordinates membrane recycling and actin cytoskeleton organization / M. Franco, P J. Peters, J. Boretto et al. // EMBO J. 1999. T. 18. № 6. — C. 1480-1491.

Frankel, P. RalA interacts with ZONAB in a cell density-dependent manner and regulates its transcriptional activity / P. Frankel, A. Aronheim, E. Kavanagh et al. // EMBO J. 2005. T. 24. № 1. —C. 54-62.

Frasa, M.A. Armus is a Racl effector that inactivates Rab7 and regulates E-cadherin degradation / M.A. Frasa, F.C. Maximiano, K. Smolarczyk et al. // Curr Biol. 2010. T. 20. № 3. — C. 198-208.

Frische, E.W. RAP-1 and the RAL-1/exocyst pathway coordinate hypodermal cell organization in Caenorhabditis elegans / E.W. Frische, B.W. Pellis-van, H.G. van et al. // EMBO J. 2007. T. 26. № 24. — C. 5083-5092.

Frohman, M.A. Phospholipase D structure and regulation / M.A. Frohman, A.J. Morris. // Chem Phys Lipids. 1999. T. 98. № 1-2. — C. 127-140.

Fukai, S. Structural basis of the interaction between RalA and Sec5, a subunit of the sec6/8 complex / S. Fukai, H.T. Matern, J.R. Jagath et al. // EMBO J. 2003. T. 22. № 13. — C. 32673278.

Fukami, K. Phosphatidic acid that accumulates in platelet-derived growth factor-stimulated Balb/c 3T3 cells is a potential mitogenic signal / K. Fukami, T. Takenawa. // J Biol Chem.

1992. T. 267. № 16. — C. 10988-10993.

Galandrini, R. Arf6: a new player in FcgammaRIIIA lymphocyte-mediated cytotoxicity / R.

Galandrini, F. Micucci, I. Tassi et al. // Blood. 2005. T. 106. № 2. — C. 577-583.

Gao, X. Tsc tumour suppressor proteins antagonize amino-acid-TOR signalling / X. Gao, Y.

Zhang, P. Arrazola et al. // Nat Cell Biol. 2002. T. 4. № 9. — C. 699-704.

Gesell, M.S. Retinoic acid binding protein in normal and neopolastic rat prostate / M.S. Gesell,

MJ. Brandes, E.A. Arnold et al. // Prostate. 1982. T. 3. № 2. — C. 131-138.

Giavazzi, R. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under

physiological flow conditions / R. Giavazzi, M. Foppolo, R. Dossi, A. Remuzzi. // J.Clin.Invest.

1993. T. 92. № 6. — C. 3038-3044.

Gibbs, J.B. The ras oncogene~an important regulatory element in lower eucaryotic organisms / J.B. Gibbs, M.S. Marshall. // Microbiol Rev. 1989. T. 53. № 2. — C. 171-185. Gildea, J.J. The role of Rai A in epidermal growth factor receptor-regulated cell motility / J.J. Gildea, M.A. Harding, M.J. Seraj et al. // Cancer Res. 2002. T. 62. № 4. — C. 982-985. Gillingham, A.K. The small G proteins of the Arf family and their regulators / A.K. Gillingham, S. Munro. // Annu Rev Cell Dev Biol. 2007. T. 23. — C. 579-611.

Gingras, A.C. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1 / A.C. Gingras, B. Raught, S.P. Gygi et al. // Genes Dev. 2001. T. 15. № 21. — C. 2852-2864. Gingras, A.C. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation / A.C. Gingras, B. Raught, N. Sonenberg. // Annu Rev Biochem. 1999. T. 68. — C. 913-963.

Gingras, A.C. Regulation of translation initiation by FRAP/mTOR / A.C. Gingras, B. Raught, N. Sonenberg. // Genes Dev. 2001. T. 15. № 7. _ c. 807-826.

191

192.

193,

194

195,

196

197,

198

199

200

201,

202,

203

204,

205,

206,

207,

208,

209,

Goetz, J.G. Caveolin-1 in tumor progression: the good, the bad and the ugly / J.G. Goetz, P. Lajoie, S.M. Wiseman, I.R. Nabi. // Cancer Metastasis Rev. 2008. T. 27. № 4. — C. 715-735. Goi, T. An EGF receptor/Ral-GTPase signaling cascade regulates c-Src activity and substrate specificity / T. Goi, M. Shipitsin, Z. Lu et al. // EMBO J. 2000. T. 19. № 4. — C. 623-630. Goldfinger, L.E. RLIP76 (RalBPl) is an R-Ras effector that mediates adhesion-dependent Rae activation and cell migration / L.E. Goldfinger, C. Ptak, E.D. Jeffery et al. // J.Cell Biol. 2006. T. 174. № 6. —C. 877-888.

Gonzalez-Garcia, A. RalGDS is required for tumor formation in a model of skin carcinogenesis / A. Gonzalez-Garcia, C.A. Pritchard, H.F. Paterson et al. // Cancer Cell. 2005. T. 7. № 3. — C. 219-226.

Goodwin, J.S. Depalmitoylated Ras traffics to and from the Golgi complex via a nonvesicular pathway / J.S. Goodwin, K.R. Drake, C. Rogers et al. // J Cell Biol. 2005. T. 170. № 2. — C. 261-272.

Gorry, P. The cellular retinoic acid binding protein I is dispensable / P. Gorry, T. Lufkin, A. Dierich et al. // Proc Natl Acad Sei USA. 1994. T. 91. № 19. _ c. 9032-9036. Grindstaff, K.K. Sec6/8 complex is recruited to cell-cell contacts and specifies transport vesicle delivery to the basal-lateral membrane in epithelial cells / K.K. Grindstaff, C. Yeaman, N. Anandasabapathy et al. // Cell. 1998. T. 93. № 5. — C. 731-740.

Grodnitzky, J.A. Somatostatin receptors signal through EFA6A-ARF6 to activate phospholipase D in clonal beta-cells / J.A. Grodnitzky, N. Syed, M.J. Kimber et al. // J.Biol.Chem. 2007. T. 282. № 18. — C. 13410-13418.

Guertin, D.A. Ablation in mice of the mTORC components raptor, rictor, or mLST8 reveals that mTORC2 is required for signaling to Akt-FOXO and PKCalpha, but not S6K1 / D.A. Guertin, D.M. Stevens, C.C. Thoreen et al. // Dev Cell. 2006. T. 11. № 6. — C. 859-871. Guil, S. Alternative splicing of the human proto-oncogene c-H-ras renders a new Ras family protein that trafficks to cytoplasm and nucleus / S. Guil, N. de La Iglesia, J. Fernandez-Larrea et al. // Cancer Res. 2003. T. 63. № 17. — C. 5178-5187.

Gulati, P. Amino acids activate mTOR complex 1 via Ca2+/CaM signaling to hVps34 / P. Gulati, L.D. Gaspers, S.G. Dann et al. // Cell Metab. 2008. T. 7. № 5. — C. 456-465. Guo, W. The exocyst is an effector for Sec4p, targeting secretory vesicles to sites of exocytosis / W. Guo, D. Roth, C. Walch-Solimena, P. Novick. // EMBO J. 1999. T. 18. № 4. — C. 10711080.

Guttridge, D.C. NF-kappaB controls cell growth and differentiation through transcriptional regulation of cyclin D1 / D.C. Guttridge, C. Albanese, JY. Reuther et al. // Mol Cell Biol. 1999. T. 19. № 8. — C. 5785-5799.

Ha, S.H. PLD2 forms a functional complex with mTOR/raptor to transduce mitogenic signals / S.H. Ha, D.H. Kim, I.S. Kim et al. // Cell Signal. 2006. T. 18. № 12. — C. 2283-2291. Hamad, N.M. Distinct requirements for Ras oncogenesis in human versus mouse cells / N.M. Hamad, J.H. Elconin, A.E. Karnoub et al. // Genes Dev. 2002. T. 16. № 16. — C. 2045-2057. Hancock, J.F. Lipid rafts: contentious only from simplistic standpoints / J.F. Hancock. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2006. T. 7. № 6. — C. 456-462.

Hancock, J.F. A polybasic domain or palmitoylation is required in addition to the CAAX motif to localize p21ras to the plasma membrane / J.F. Hancock, H. Paterson, C.J. Marshall. // Cell. 1990. T. 63. № 1. — C. 133-139.

Hashimoto, S. Assays and properties of the ArfGAPs, AMAP1 and AMAP2, in Arf6 function / S. Hashimoto, A. Hashimoto, A. Yamada et al. // Methods Enzymol. 2005. T. 404. — C. 216231.

Hashimoto, S. Requirement for Arf6 in breast cancer invasive activities / S. Hashimoto, Y. Onodera, A. Hashimoto et al. // Proc Natl Acad Sei USA. 2004. T. 101. № 17. — C. 66476652.

210,

211,

212,

213,

214,

215.

216,

217,

218,

219,

220,

221,

222,

223.

224,

225.

226.

227.

228.

Hawthorn, L. TIMP1 and SERPIN-A overexpression and TFF3 and CRABP1 underexpression as biomarkers for papillary thyroid carcinoma / L. Hawthorn, L. Stein, R. Varma et al. // Head Neck. 2004. T. 26. № 12. — C. 1069-1083.

Hay, N. The Akt-mTOR tango and its relevance to cancer / N. Hay. // Cancer Cell. 2005. T. 8. №3. —C. 179-183.

Hay, N. Upstream and downstream of mTOR / N. Hay, N. Sonenberg. // Genes Dev. 2004. T. 18. № 16. — C. 1926-1945.

Hazelett, C.C. RalA and RalB differentially regulate development of epithelial tight junctions / C.C. Hazelett, D. Sheff, C. Yeaman. // Mol Biol Cell. 2011. T. 22. № 24. — C. 4787-800. Hecker, T.P. Overexpression of FAK promotes Ras activity through the formation of a FAK/pl20RasGAP complex in malignant astrocytoma cells / T.P. Hecker, Q. Ding, T.A. Rege et al. // Oncogene. 2004. T. 23. № 22. — C. 3962-3971.

Helms, J.A. Retinoic acid signaling is required during early chick limb development / J.A. Helms, C.H. Kim, G. Eichele, C. Thaller. // Development. 1996. T. 122. № 5. — C. 1385-1394. Henry, D.O. Ral GTPases contribute to regulation of cyclin D1 through activation of NF-kappaB / D.O. Henry, S.A. Moskalenko, K.J. Kaur et al. // Mol.Cell Biol. 2000. T. 20. № 21. — C. 8084-8092.

Herbert, T.P. The extracellular signal-regulated kinase pathway regulates the phosphorylation of 4E-BP1 at multiple sites / T.P. Herbert, A.R. Tee, C.G. Proud. // J Biol Chem. 2002. T. 277. № 13. —C. 11591-11596.

Hernandez-Munoz, I. The Rgr oncogene (homologous to RalGDS) induces transformation and gene expression by activating Ras, Ral and Rho mediated pathways /1. Hernandez-Munoz, M. Malumbres, P. Leonardi, A. Pellicer. // Oncogene. 2000. T. 19. № 23. — C. 2745-2757. Heyman, R.A. 9-cis retinoic acid is a high affinity ligand for the retinoid X receptor / R.A. Heyman, D.J. Mangelsdorf, J.A. Dyck et al. // Cell. 1992. T. 68. № 2. — C. 397-406. Hiatt, K.K. Neurofibromin GTPase-activating protein-related domains restore normal growth in Nfl-/- cells / K.K. Hiatt, D.A. Ingram, Y. Zhang et al. // J Biol Chem. 2001. T. 276. № 10. — C. 7240-77245.

Hill, C.S. Transcriptional regulation by extracellular signals: mechanisms and specificity / C.S. Hill, R. Treisman. // Cell. 1995. T. 80. № 2. — C. 199-211.

Hind, M. Retinoic acid induces alveolar regeneration in the adult mouse lung / M. Hind, M. Maden. // Eur.Respir.J. 2004. T. 23. № 1. — C. 20-27.

Hinz, M. NF-kappaB function in growth control: regulation of'cyclin D1 expression and G0/G1 -to-S-phase transition / M. Hinz, D. Krappmann, A. Eichten et al. // Mol Cell Biol. 1999. T. 19. № 4. — C. 2690-2698.

Hofer, F. Activated Ras interacts with the Ral guanine nucleotide dissociation stimulator / F. Hofer, S. Fields, C. Schneider, G.S. Martin. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1994. T. 91. № 23. — C. 11089-11093.

Holz, M.K. Identification of S6 kinase 1 as a novel mammalian target of rapamycin (mTOR)-phosphorylating kinase / M.K. Holz, J. Blenis. // J Biol Chem. 2005. T. 280. № 28. — C. 26089-26093.

Honda, A. Phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase alpha is a downstream effector of the small G protein ARF6 in membrane ruffle formation / A. Honda, M. Nogami, T. Yokozeki et al. // Cell. 1999. T. 99. № 5. — C. 521-532.

Hoover, H. Investigating the role of ADP-ribosylation factor 6 in tumor cell invasion and extracellular signal-regulated kinase activation / H. Hoover, V. Muralidharan-Chari, S. Tague, C. D'Souza-Schorey. // Methods Enzymol. 2005. T. 404. — C. 134-147. Hornberger, T.A. The role of phospholipase D and phosphatide acid in the mechanical activation of mTOR signaling in skeletal muscle / T.A. Hornberger, W.K. Chu, Y.W. Mak et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. T. 103. № 12. — C. 4741-4746.

229.

230.

231.

232.

233.

234.

235.

236.

237.

238.

239.

240,

241.

242,

243,

244,

245,

246,

247,

Hoshino, T. Regulation of E-cadherin endocytosis by nectin through afadin, Rapl, and pl20ctn / T. Hoshino, T. Sakisaka, T. Baba et al. // J Biol Chem. 2005. T. 280. № 25. — C. 2409524103.

Houndolo, T. G protein-coupled receptor endocytosis in ADP-ribosylation factor 6-depleted cells / T. Houndolo, P.L. Boulay, A. Claing. // J.Biol.Chem. 2005. T. 280. № 7. — C. 55985604.

Howe, L.R. Activation of the MAP kinase pathway by the protein kinase raf / L.R. Howe, S.J. Leevers, N. Gomez et al. // Cell. 1992. T. 71. № 2. — C. 335-342.

Hsu, S.C. The exocyst complex in polarized exocytosis / S.C. Hsu, D. TerBush, M. Abraham, W. Guo. // Int Rev Cytol. 2004. T. 233. — C. 243-265.

Hu, B. ADP-ribosylation factor 6 regulates glioma cell invasion through the IQ-domain GTPase-activating protein 1-Racl-mediated pathway / B. Hu, B. Shi, M.J. Jarzynka et al. // Cancer Res. 2009. T. 69. № 3. — C. 794-801.

Hu, Y. HSF-1 interacts with Ral-binding protein 1 in a stress-responsive, multiprotein complex with HSP90 in vivo / Y Hu, N.F. Mivechi. // J.Biol.Chem. 2003. T. 278. № 19. — C. 1729917306.

Hu, Z. GEP100/Arf6 is required for epidermal growth factor-induced ERK/Racl signaling and cell migration in human hepatoma HepG2 cells / Z. Hu, J. Du, L. Yang et al. // PLoS One. 2012. T. 7. № 6. — C. e38777.

Hui, L. Phospholipase D elevates the level of MDM2 and suppresses DNA damage-induced increases in p53 / L. Hui, T. Abbas, R.M. Pielak et al. // Mol.Cell Biol. 2004. T. 24. № 13. — C. 5677-5686.

Hyman, T. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton / T. Hyman, M. Shmuel, Y. Altschuler. // Mol Biol Cell. 2006. T. 17. № 1. — C. 427-37.

Ikeda, M. rapl p21 regulates the interaction of ras p21 with RGL, a new effector protein of ras p21 / M. Ikeda, S. Koyama, M. Okazaki et al. // FEBS Lett. 1995. T. 375. № 1-2. — C. 37-40. Inoki, K. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival / K. Inoki, T. Zhu, K.L. Guan. // Cell. 2003. T. 115. № 5. — C. 577-590.

Inoue, H. Arf GAPs and their interacting proteins / H. Inoue, P.A. Randazzo. // Traffic. 2007. T. 8.№ 11. — C. 1465-1475.

Inoue, M. Compartmentalization of the exocyst complex in lipid rafts controls Glut4 vesicle tethering / M. Inoue, S.H. Chiang, L. Chang et al. // Mol Biol Cell. 2006. T. 17. № 5. — C. 2303-2311.

Itoh, Y. Protein knockdown using methyl bestatin-ligand hybrid molecules: design and synthesis of inducers of ubiquitination-mediated degradation of cellular retinoic acid-binding proteins / Y. Itoh, M. Ishikawa, M. Naito, Y. Hashimoto. // J Am Chem Soc. 2010. T. 132. № 16. —C. 5820-5826.

Jacinto, E. Tor signalling in bugs, brain and brawn / E. Jacinto, M.N. Hall. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2003. T. 4. № 2. — C. 117-126.

Jacinto, E. Mammalian TOR complex 2 controls the actin cytoskeleton and is rapamycin insensitive / E. Jacinto, R. Loewith, A. Schmidt et al. // Nat Cell Biol. 2004. T. 6. № 11. — C. 1122-1128.

Jackson, J.H. Farnesol modification of Kirsten-ras exon 4B protein is essential for transformation / J.H. Jackson, C.G. Cochrane, J.R. Bourne et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. T. 87. № 8. — C. 3042-3046.

Jackson, T.R. ACAPs are arf6 GTPase-activating proteins that function in the cell periphery / T.R. Jackson, F.D. Brown, Z. Nie et al. // J.Cell Biol. 2000. T. 151. № 3. — C. 627-638. Janetopoulos, C. Phosphoinositide signaling plays a key role in cytokinesis / C. Janetopoulos, P. Devreotes. // J Cell Biol. 2006. T. 174. № 4. — C. 485-490.

248.