Экспрессия и активность белков множественной лекарственной устойчивости опухолей при воздействии ингибитора протеасом бортезомиба тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Лалетина, Лидия Александровна

• Лалетина, Лидия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лалетина, Лидия Александровна

Список сокращений.

I. Введение.

II. Литературный обзор.

II.1. Устойчивость опухолей к терапии.

II. 1.1. Механизмы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолей. Многофакторная ЛУ.

II. 1.2. Основные транспортёры семейства ABC.

II. 1.3. Экспрессия ABC-транспортеров в опухолях.

II. 1.4. Стволовые клетки и ABC-транспортеры.

II.1.5. Регуляция ABC-транспортеров.

II. 1.5.1. Регуляция транскрипции генов ABC-транспортеров. Факторы транскрипции, регулирующие ABC транспортеры.

II. 1.5.1.а. Влияние белка р53 на регуляцию транскрипции АВСтранспортеров.

И. 1.5.1.6. Влияние белка YB-1 на регуляцию транскрипции ABC транспортеров.

И. 1.5.1.в. Роль факторов транскрипции семейства АР-1 в регуляции гена

MDR1.

II. 1.5.2. Регуляция ABC-транспортеров на пост-транскрипционном уровне.

II. 1.5.3. Пути сигнальной трансдукции, вовлеченные в регуляцию АВСтранспортеров.

II.1. 6. Многофакторная МЛУ. Сигнальный путь PI3K/Akt/ PTEN.

II. 1. 7. Участие систем деградации белков в лекарственной устойчивости опухолей.

II. 1. 7.1. Протеасома. Её строение и роль в клетке.

II. 1. 7.2. Противоопухолевые агенты, действие которых направленно на ингибирование активности протеасом.

II.l. 7.3. Бортезомиб и транспортные белки семейства ABC.

III. Материалы и методы.

III. 1. Линии клеток, использованные в работе.

111.2. Реагенты, использованные в работе.

111.3. Оценка цитотоксичности препаратов - колориметрический метод (МТТ).

111.4. Метод антительного сдвига (UIC2-shift assay или UIC2-OAC).

111.5. Оценка функциональной активности Р-гликопротеина с помощью родамина (Rh 123).

111.6. Иммуноцитохимический анализ белков.

111.7. Выделение РЖ и ОТ-ПЦР.

111.8. Иммуноблотинг.

111.9. Иммунноцитохимическое определение внутриклеточной локализации белка YB-1.

IV. Результаты.

IV-1. Исследование цитотоксического действия бортезомиба на различные линии чувствительных и резистентных к лекарственным препаратам опухолевых клеток.

IV-2. Влияние бортезомиба на функциональную активность и экспрессию

Р-гликопротеина (Pgp).

IV-2 Л. Оценка влияния бортезомиба на функциональную активность и экспрессию Р-гликопротеина (Pgp) в клетках K562/Í-S9 с помощью метода антительного сдвига (UIC2-shift assay или UIC2-OAC).

IV-2.2. Влияние бортезомиба на выброс родамина 123 клетками K562/Í-S9.47 IV-3. Влияние бортезомиба на степень чувствительности родительских и резистентных опухолевых клеток к препаратам круга МЛУ.

IV-4. Влияние бортезомиба на экспрессию гена MDR1 и других генов круга

МЛУ в опухолевых клетках разного гистогенеза.

IV-4. 1. Базальный уровень экспрессии мРНК генов МЛУ в исследованных клетках.

IV-4. 2. Влияние бортезомиба на содержание мРНК генов МЛУ в исследованных линиях.

IV-5. Влияние бортезомиба на количество белков множественной лекарственной устойчивости в опухолевых клетках.

IV-6. Изменения активности киназ Akt и ERK1/2 под влиянием бортезомиба в лекарственно-устойчивых и родительских клетках.

IV-7. Анализ уровня экспрессии генов MDR1 и MRP1 в опухолевых клетках при воздействии на них бортезомиба и Ly 294002 (специфического ингибитора фосфорилированной формы Akt-киназы).

IV-8. Влияние бортезомиба на фенотип МЛУ при длительном воздействии препарата на популяции опухолевых клеток.

IV-8.1. Сравнение чувствительности к бортезомибу клеток до и после длительного культивирования в присутствии этого препарата.

IV-8.2. Сравнение конститутивной экспрессии фосфорилированной формы киназы Akt в клетках до и после длительного культивирования в присутствии бортезомиба.

IV-8.3. Исследование экспрессии белка Pgp и маркеров стволовых кроветворных клеток CD34 и CD38 в клетках до и после длительного культивирования в присутствии бортезомиба.

IV-9. Роль белка YB-1 в характере ответа опухолевых клеток на бортезомиб.

IV-9.1. Определение влияния бортезомиба на экспрессию мРНК гена YB-1 в опухолевых клетках.

IV-9.2. Исследование влияние бортезомиба на локализацию белка YB-1 в опухолевых клетках.

V. Обсуждение результатов.

VI. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия и активность белков множественной лекарственной устойчивости опухолей при воздействии ингибитора протеасом бортезомиба»

Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ) 9 является серьезным препятствием на пути химиотерапии злокачественных новообразований. МЛУ - это система защиты популяции опухолевых клеток одновременно от многих лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку [108, 33]. МЛУ - важный фактор, определяющий эволюцию популяций малигнизированных клеток. Среди известных молекулярных причин лекарственной устойчивости опухолей человека хорошо охарактеризованным на сегодняшний день механизмом является повышенная активность белка семейства ABC Р-гликопротеина (АВСВ1 или Pgp), кодируемого геном MDR1 (АВСВ1). В семейство ABC (ATP binding cassette) входит несколько других мембранных белков, имеющих отношение к МЛУ, таких как белки семейства MRP (семейство АВСС), белок BCRP (ABCG2) и др. Белок Pgp, используя энергию АТФ, транспортирует группу различающихся по структуре веществ из цитозоля и/или из плазматической мембраны во внеклеточное пространство [39]. Однако, активность транспортных белков семейства ABC может не только определять защиту популяций опухолевых клеток от лекарственных препаратов, но и способствовать дальнейшей прогрессии опухоли другим путем. Ранее в нашей лаборатории были получены данные, свидетельствующие в пользу того, что противоопухолевый препарат, ингибитор тирозинкиназ иматиниб (Gleevec), может отбирать клетки, гиперэкспрессирующие Pgp и другие ABC транспортеры. Такие клетки, возможно, являются стволовыми опухолевыми клетками [109]. Таким образом, селекция противоопухолевыми препаратами нового поколения (таргетными препаратами) клеток, гиперэкпсрессирующих ABC транспортеры, может оказаться фактором, способствующим размножению клеток, поддерживающих существование новообразования.

В настоящее время активно изучается новый класс таргетных противоопухолевых агентов, действие которых направленно на ингибирование активности протеасом, так как деградация белка в клетке является одним из важнейших процессов, связанных с её нормальным функционированием. Показано, что ингибирование активности протеасом приводит к апоптозу. Одним из наиболее известных и уже применяемых в клинике протеасомных ингибиторов для лечения множественных миелом, лимфом и некоторых других опухолей, является бортезомиб (PS-341, Velcade). Механизмы и закономерности эволюции популяций малигнизированных клеток при воздействии бортезомиба не ясны, в частности, не ясно участие ABC транспортеров в этом процессе.

Основные цели и задачи исследования

Цели данной работы: Исследование роли транспортных белков семейства ABC в эволюции злокачественных новообразований под влиянием бортезомиба и изучение молекулярных механизмов регуляции ABC транспортеров ингибиторами протеасом. В соответствии с основными целями исследования были поставлены следующие задачи:

1. Получить ответ на вопрос, транспортируют ли ABC белки бортезомиб?

Для этого сравнить чувствительность родительских клеток и клеток, гиперэкспрессирующих Pgp , к бортезомибу, оценить скорость выброса этими клетками флуоресцирующего вещества родамина 123 , а также применить метод 1ЛС2-сдвига (UIC2 shift assay), который позволяет судить как об экспрессии, так и об активности Pgp, в присутствии бортезомиба.

2. Получить ответ на вопрос, изменяется ли экспрессия и активность ABC транспортеров (Pgp, MRP 1, BCRP) при краткосрочном и длительном воздействии бортезомиба.

3. Получить ответ на вопрос, изменяется ли экспрессия маркеров опухолевых стволовых клеток при длительном воздействии бортезомиба.

4. Получить ответ на вопрос, участвуют ли сигнальный путь, контролируемый фосфоинозитол -3-киназой (PI3K), и многофункциональный белок YB-1 в характере ответа популяций опухолевых клеток на бортезомиб.

Научная новизна

Впервые было проведено систематическое исследование, которое дало ответ на вопрос, является ли бортезомиб субстратом ABC транспортера - Pgp. Впервые была исследована эволюция экспрессии и активности ABC транспортеров при длительном воздействии бортезомиба на культуры малигнизированных клеток. Впервые было показано, что при продолжительном воздействии бортезомиба в популяции клеток, гиперэкспрессирующих АБС транспортер, накапливаются варианты с повышенной активностью киназы Akt, в то время как в популяции родительских клеток это не наблюдается. Впервые было проведено исследование корреляций изменений экспрессии ABC транспортеров под влиянием бортезомиба и маркеров стволовых клеток опухолей. Впервые была исследованы изменения многофункционального белка YB-1 при ответе опухолевых клеток на бортезомиб.

II. Обзор литературы.

II. 1 Устойчивость опухолей к лекарственной терапии

Одной из важнейших причин, препятствующих успешному лечению злокачественных новообразований, является развитие устойчивости опухолей к лекарственной терапии (ЛУ). По этой причине уже несколько десятилетий исследование механизмов лекарственной устойчивости является одним из приоритетных направлений онкологии. Понимание механизмов этого явления важно ещё и потому, что те же механизмы, которые включаются в подвергаемой химическому воздействию раковой клетке, в норме играют важнейшую роль, обеспечивая защиту всего живого от вредных воздействий. По аналогии с изучением устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, исследование лекарственной устойчивости в онкологии фокусируется на двух важных моментах: во-первых, на ЛУ, возникающей благодаря генетическим изменениям, происходящим в клетке во время опухолевой трансформации, во-вторых, на генетических изменениях, которые происходят в результате токсического воздействия химиопрепаратов на опухоль. Исследователи этого вопроса не оставили без внимания тот факт, что возникновение резистентности к одному из препаратов, часто оказывается резистентностью к препаратам различного строения и спектра действия, т.е. множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).

II. 1.1. Механизмы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолей. Многофакторная МЛУ

В последние годы набор механизмов, которые могут определять МЛУ, значительно расширился, и картина организации защиты клетки от повреждения усложнилась. Один из главных методов выяснения механизмов МЛУ - отбор клеток, выживших в присутствии цитотоксического препарата, и обнаружение генов и белков, измененных в таких клетках по сравнению с исходными. Некоторые исследователи выделяют три основных механизма возникновения ЛУ в клетке: первый -сниженный вход веществ в клетку; второй - изменения внутриклеточных мишеней лекарств и сигнальных путей, например, нарушения в клеточном цикле, нарушения механизмов апоптоза, изменения метаболизма самого препарата и пр.; третий - усиление выброса препаратов из клетки [36, 22].

Различные механизмы могут быть задействованы одновременно в возникновении резистентности в подвергшейся действию токсина клетке. Таким образом, речь идет не просто о МЛУ, а об многофакторной МЛУ, т.е. об МЛУ, определяемой несколькими факторами [108]. Остается неясным, связаны ли и как связаны разные защитные механизмы клетки, действующие сочетанно. Этот вопрос выступает в настоящее время на первый план.

Впервые устойчивость к лекарствам была описана в 1950 году, для клеток лейкоза мыши, резистентных к 4амино-Ш0-метил-птероглютаминовой кислоте [13]. В 70-ые годы прошлого столетия К. Dano описал активное выведение дауномицина клетками, обладающими резистентностью и к другим антрациклинам, а также к винка-алкалоидам [22]. Продолжая работу Dano, другая группа учёных показала, что фенотип МЛУ определяется повышенной экспрессией на клеточной мембране белка с молекулярной массой 170 kDa, названного Р-гликопротеином [43]. Затем был клонирован ген MDR1, кодирующий Pgp [91]. За последние 30 лет стало понятно, что некоторые представители семейства белков АТФ-зависимых транспортеров (ATP-binding cassette (ABC) transporters), такие как Р-гликопротеин (по новой терминологии - АВСВ1), являются важнейшими факторами, определяющими МЛУ. Поэтому, исследуя механизмы МЛУ в том или ином конкретном случае, имеет смысл начинать с изучения именно ABC транспортеров, которые широко экспрессированы в нормальных тканях и в опухолях и их способность формировать лекарственную устойчивость не вызывает сомнения [54].

II. 1.2. Основные транспортеры семейства ABC

Наиболее широко охарактеризованными АВС-транспортерами являются такие белки как: Р-гликопротеин (также известный как MDR1 или АВСВ1), MRP1 (по новой терминологии АВСС1) и BCRP (также известный как MXR, по новой терминологии ABCG2). Открытия Pgp и белка MRP 1 стали крупным прорывом в понимании механизмов МЛУ, что побудило к исследованию многочисленных белков с соответствующей структурой и аналогичными транспортными функциями. В целом, семейство ABC у человека включает 49 генов и состоит из 7-ми подсемейств [44, 26]. Отнесение белка к тому или другому подсемейству зависит от его доменной организации - числа и сочетания трансмембранных (TMD) и АТФ-связывающих доменов (ABC домены). ABC домены всех белков данного семейства сходны (они имеют 30-40% гомологии, независимо от субстратной специфичности транспортеров, которая весьма различается) [44, 26].

Семейство АБС - эволюционно консервативно и представлено практически у всех живых организмов - от прокариот до млекопитающих [39]. Многие АБС транспортеры имеют сходный набор TMD и ABC доменов и состоят как из двух частей, каждая из которых может включать шесть трансмембранных спиралей и два нуклеотид - связывающих домена (Pgp, MRP1), так и состоять из одной части (BCRP) [44].

MDR1 MXR

Рисунок 1. Схема строения белков множественной лекарственной устойчивости Р-гликопротеина (Pgp; MDR1; АВСВ1) и BCRP (ABCG2; MXR). 1 - домены содержащие трансмембранные участки (обозначены прямоугольниками); 2 - АТФ-связывающие домены (обведены овалом); 3 - фрагмент мембраны. (Ставровская, 2000 [108])

Основные транспортеры, ответственные за МЛУ - Pgp (АВСВ1 ), MRP 1 (АВСС1) и BCRP (ABCG2) [26] - связывают самые разнообразные субстраты, включающие органические анионы и неанионные компоненты, химиотерапевтические препараты, иные лекарственные препараты (например, некоторые лекарства используемые в кардиологии и неврологии), многие флуоресцентные красители, а также другие вещества (например бромистый этидий) [3]. Сходство структурной организации транспортеров отражается в том, что субстратная специфичность основных транспортных белков ABC часто совпадает, хотя разные транспортеры могут выбрасывать и специфические вещества, а также могут работать, используя различающиеся молекулярные механизмы. Pgp участвует в транспорте многих клинически значимых субстратов, например противораковых препаратов, ингибиторов протеазы ВИЧ, антибиотиков, антидепрессантов, анальгетиков. В основном, это - незаряженные или положительно заряженные вещества. В то же время, предпочтительными субстратами для MRP1 (АВСС1) являются органические анионы, включая вещества, коньюгированные с глютатионом или сульфатом

55]. В отличие от Pgp, АВС-транспортеры подсемейства АВСС, в которое входит MRP1, почти не транспортируют таксаны [21]. Также MRP1 осуществляет ко-транспорт неконьюгированных анионов, вместе со свободным глютатионом. Основная физиологическая функция MRP1 -транспорт лейкотриена С4 [9]. BCRP1 (ABCG2) также имеет свой набор субстратов, он транспортирует большие молекулы, как положительно, так и отрицательно заряженные, сульфатные метаболиты гормонов, антибиотики, флавоноиды, цитотоксические препараты, такие как митоксантрон [80]. В связи с выше изложенным, в нашей работе мы исследовали, в первую очередь, Pgp (АВСВ1), а также MRP1 (АВСС1) и BCRP (ABCG2).

II. 1.3. Экспрессия АВС-транспортеров в опухолях

Уровни базальной экспрессии АВС-транспортёров в опухолях значительно различаются в зависимости от типа клеток. Так опухоли кишечника, мочеточников, гепатоцеллюлярный рак характеризуются высокой конститутивной экспрессией Pgp и (или) гена MDR1 [108]. В клинике такие опухоли относятся к первично-резистентным [30]. Однако из клинической практики стало понятно, что базальный уровень экспрессии гена MDR1 не всегда может являться диагностическим признаком резистентности опухоли. При остром миелоцитарном лейкозе, мелкоклеточном раке лёгкого, в опухолях молочной железы и яичников исходно уровень экспрессии MDR1, как правило, невысокий. Тем не менее, после химиотерапии показано увеличение экспрессии Pgp и наблюдается появление резистентности. Так, экспрессия Pgp была обнаружена у 14% пациентов с опухолями молочной железы при первичном обследовании, после химиотерапии она возрастала до 43% [18]. Экспрессия Pgp, найденная при первом обследовании у 27% больных острым миелолейкозом, после лечения обнаруживалась у 64% [85]. Повышенная экспрессия MRP1 отмечается при раке молочной железы, раках лёгкого (от 80 до 100%) [96]. Таким образом, многие опухоли исходно отличаются повышенной экспрессией транспортёров, тогда как экспрессия в других новообразованиях заметно возрастает после химиотерапии. Изучение этих явлений и их взаимосвязи с важнейшими клеточными процессами, безусловно, актуальна. В частности, практически не изучена связь изменений уровня экспрессии АВС-транспортеров с изменениями функционирования систем деградации белков. В нашей работе мы попытались получить данные, имеющие отношение к этой проблеме.

II. 1.4. Стволовые клетки и АВС-транспортёры

Одним из важных фактов (в отношении АВС-транспортеров) является гиперэкспрессия нескольких белков этого семейства стволовыми клетками [27]. Исследования лейкозных стволовых клеток показали, что эти клетки характеризуются способностью к ускоренному выбросу из клетки флуоресцентных красителей Hoechst 33342 и Родамина 123 (Rhl23), которые транспортируются белками семейства ABC [27]. Более 20-ти лет назад было впервые показано, что клетки с фенотипом CD34+ (один из маркёров стволовых кроветворных клеток) гиперэкспрессируют Pgp [16]. Показано, что В CRP также экспрессируется стволовыми кроветворными клетками [100]. Было найдено, что стволовые кроветворные клетки экспрессируют значительное количество разных белков семейства ABC [25]. Стволовые клетки обнаруживаются не только в популяции лейкозных клеток, солидные опухоли также имеют стволовые клетки [7]. Пока неясно, какие функции выполняют белки ABC в стволовых клетках. Чаще всего им приписывают защитную функцию: полагают, что белки семейства ABC защищают стволовые клетки от повреждающих их веществ [27]. Предполагают также, что АВС-транспортеры могут участвовать в регуляции ключевых признаков стволовых клеток - их способности к самообновлению и дифференцировке [35].

Стволовые клетки опухолей могут накапливаться при воздействии некоторых лекарственных препаратов. Факты, свидетельствующие в пользу этого были получены в нашей лаборатории при изучении частоты обнаружения клеток, экспрессирующих Pgp, в периферической крови больных хроническим миелолейкозом (XMJI) на фоне лечения препаратом нового поколения Гливек [109]. Возникает вопрос, могут ли другие препараты (особенно перспективные препараты нового поколения) также способствовать накоплению в популяции малигнизированных клеток, гиперэкспрессирующих ABC-транспортеры и маркеры стволовых клеток? В нашей работе мы пытались выяснить, способен ли бортезомиб отбирать стволовые клетки опухолей при длительном воздействии этого препарата на различные линии опухолевых клеток, в том числе и на опухолевые клетки с фенотипом МЛУ.

II. 1.5. Регуляция АВС-транспортеров

II. 1.5.1 Регуляция транскрипции генов АВС-транспортеров. Факторы транскрипции, регулирующие ABC транспортеры.

Транскрипция гена MDR1 активируется под влиянием самых разных воздействий. В культивируемых клетках человека промотор гена MDR1 активировался химиотерапевтическими препаратами. Они могли быть как субстратами Pgp (например, винкристин и доксорубицин, так и не являться субстратами Pgp (например, 5-флюроурацил и этопозид) [48]. На активность промотора гена MDR1 также оказывали влияние голодание, ультрофиолетовое облучение, тепловой шок, гипоксия и другие факторы [67, 17]. Показано, что обработка клеток ретиноевой кислотой и другими агентами, индуцирующими диференцировку, приводила к повышению экспрессии белка Pgp [6]. Таким образом, самые разнообразные стимулы участвуют в регуляции ABC транспортеров, т.е. эта система легко активируется в разных, и не только в стрессорных ситуациях.

Разные факторы транскрипции регулируют активность транспортных белков семейства ABC [83]. Из Таблицы 1, взятой их достаточно старого, но очень тщательно составленного обзора К. Scotto, можно сделать принципиальные выводы. Видно, что большое количество разнообразных транскрипционных факторов участвуют в регуляции ABC транспортеров. Видно также, что некоторые факторы участвуют в регуляции генов нескольких транспортных белков (например, Sp-1), Другие регулируют какой-то один из генов. С тех пор как появилась эта обзорная статья, были опубликованы новые результаты. Мы не ставим задачу подробно осветить все эти новые исследования, отметим лишь те, которые важны для нашей работы.

Таблица 1. Факторы транскрипции, вовлеченные в регуляцию активности транспортных белков семейства ABC. (Scotto, 2003 [83])

MDR1 MRP1 MRP2 MRP3 BCRP BSEP ABCA2

Spl GR Spl Spl? Spl Spl? RXR Spl

Sp3 TCF/LEF p53 YB-1 FTF FXR Sp3

Egr-1 IMED AP-1? RA Ra LXR? Sp4

WT-1 MEF-1 FXR CAR? Egrl

NF-Y SXR PXR

PCAF RXR CAR

P300 MeCP2 RXR

Ets-1 HSF1 AP-1?

HDAC CEBPP HAT?

HIF-1 HDAC? СЕВР?

II. 1.5.1 .а. Влияние белка р53 на регуляцию транскрипции АВС-транспортеров.

Промотор гена МОЯ1 был одним из первых, для которого было показано влияние р53 [19]. В промоторной области гена МИЯ! человека, кодирующего Р§р, был обнаружен сайт связывания для р53. Интересно отметить, что обнаруженный сайт не представляет собой канонический сайт связывания р53, используемый этим белком при активации генов. Это -новый, ранее неизвестный сайт, связываясь с которым р53 подавляет активность промотора гена МИЯ! [42]. Связь утраты или мутации антионкогена р53 с повышенной экспрессией гена МОЯ1 обнаруживается на клиническом материале и касается некоторых видов опухолей, но не всех. Более информативны экспериментальные данные. Они свидетельствуют о том, что потеря одного из аллелей р53, равно как и мутации, могут приводить к повышению экспрессии гена МЛЯ1. Причем, скорее всего, р53 дикого типа ингибирует экспрессию эндогенного АЮЯ1 в тканях с исходно высокой экспрессией МОЯ1 (печень, эпителий кишечника) [79]. Потеря аллеля р53 вызывает повышение экспрессии МОЯ1, это показано в опытах с использованием транс-доминантно-негативного р53 ив опытах с введением в клетки гена тс1т2, белковый продукт которого связывает и инактивирует р53 [97]. Не противоречит этой точке зрения представление о репрессирующем свойстве нормального р53. В экспериментах было выявлено, что р53 дикого типа вызывает репрессию транскрипции гена МИШ [19], хотя было предложено несколько механизмов этой репрессии. В лаборатории К. 8сойо было показано, что репрессия регулируется вследствие прямого взаимодействия р53 с проксимальной частью промотора гена МО/? 7 (-72 к -40) [83], что делает его промотором класса репрессируемых р53 промоторов. Связывание р53 с промотором гена МОЯ1, а именно с сайтом НТ (ЬеасИо^П - "голова к хвосту") очевидно, индуцирует новую тетрамерную конформацию р53 (возможно через дифференциальный рекрутинг кофакторов), в которой он работает как репрессор. Репрессия mdrl диким типом р53 была найдена у мышей и хомячков, тогда как есть и работы, позволяющие думать об активирующем влиянии р53 на промотор гена mdrl у мышей в ответ на повреждение ДНК и стресс [42]. Дикий тип р53 также репрессирует транскрипцию гена MDR1 у человека. Несколько мутантов р53 способны активировать промотор гена MDR1, по крайней мере, один из них активирует MDR1, через мутант-специфическое взаимодействие с фактором транскрипции Ets-1 в проксимальном регионе промотора (-69 к -63) [79]. Этот тип прямого эффекта, не наблюдается в случае гена MRP1. Роль р53 в регуляции генов МЛУ довольно противоречива, в нескольких случаях наблюдались противоположные эффекты в разных условиях и в разных типах клеток. Важно учитывать архитектуру индивидуальных промоторов, присутствие или отсутствие других генов семейства р53 [83]. Показано, что р53 дикого типа способен подавлять транскрипцию гена MRP1 [5], а потеря экспрессии белка р53 в клетках рака прямой кишки приводит к увеличению экспрессии MRP1 [32]. Ясно, таким образом, что транскрипция генов, кодирующих Pgp и MRP1, может зависеть от статуса р53 в клетках опухоли.

II. 1.5.1.6. Влияние белка YB-1 на регуляцию транскрипции ABC транспортеров.

Появились данные о том, что многофункциональный белок YB-1 в качестве транскрипционного фактора участвует в регуляции генов транспортеров. Он является членом семейства ДНК- и РНК-связывающих белков с эволюционно консервативным доменом холодового шока. YB-1 принимает участие во многих ДНК- и мРНК-зависимых процессах [106, 47]. Этот белок обнаруживается как в ядре, так и в цитоплазме клеток млекопитающих. Функционируя в качестве фактора транскрипции в ядре, YB-1 регулирует в клетке экспрессию генов, содержащих Y-боксы в промоторах, в том числе, генов МЛУ MDR1 и LRP [106, 47]. В цитоплазме YB-1 является одним из основных белков, связывающихся с мРНК и формирующих мРНП (рибонуклеопротеиновые частицы) с уникальными физико-химическими характеристиками. От его количества в мРНП зависит скорость синтеза различных белков. Таким образом, с локализацией YB-1 в клетках связаны разные молекулярные механизмы, определяющие его влияние на фенотип опухолевых клеток. Известно, что гиперэкспрессия YB-1 наблюдается в опухолях разного гистогенеза [60]. Было показано также, что противоопухолевые препараты могут индуцировать перемещение YB-1 из цитоплазмы в ядра клеток [101]. Согласно данным, полученным в нашей лаборатории, в опухолях больных раком молочной железы неоадьювантная химиотерапия может способствовать переходу YB-1 в ядра опухолевых клеток [103].Таким образом, химиотерапевтические препараты могут способствовать усилению функции YB-1 в качестве фактора транскрипции. Возникает вопрос, могут ли препараты нового поколения, такие как бортезомиб влиять на функции белка YB-1. Такие данные в литературе отсутствуют. В нашей работе мы исследовали влияние бортезомиба на локализацию белка YB-1 в опухолевых клетках.

II. 1.5. I.e. Роль факторов транскрипции семейства АР-1 в регуляции гена MDR1.

Имеются непрямые данные о том, что комплекс АР-1 может быть вовлечен в транскрипцию нескольких транспортеров семейства ABC. АР-1 - это общий термин для комплекса факторов транскрипции, который состоит из членов семейства онкогенов Fos и Jun. АР-1 конститутивно экспрессирован во многих типах клеток. Связывание этого комплекса с ДНК индуцируется сывороткой, форболовыми эфирами и различными факторами роста, а также различными стресс-стимулами. Высокие уровни c-Fos были найдены в нескольких клеточных линиях устойчивых к лекарствам, по сравнению с их лекарственно-чувствительными клонами [83]. В линии клеток человека КВ-3 (которые использованы в наших исследованиях), адриамицин, винбластин, этопозид (VP16) активировали jun-киназу (JNK), было показано, что это связано с повышенной экспрессией гена MDR1 на уровне мРНК [73]. В двух сублиниях КВ-3, характеризующихся МЛУ (КВА-1 и KBV-1), были обнаружены более высокие базальные уровни активности JNK по сравнению с родительской линией КВ-3. Предполагаемые неконсенсусные сайты связывания АР-1 были найдены в промоторе гена, кодирующего Pgp у человека и хомячка. АР-1 связывающие сайты генов хомячков (- 55 к - 49) и человека (-121 к — 115) вовлечены в активацию транскрипции, более того, клетки трансфецированные c-Jun показывают более высокий уровень экспрессии MDR1 мРНК и белка Pgp. АР-1 сайт в мышином гомологе регулирует репрессию этого гена.

Промотор гена MRP-1 также содержит предполагаемый АР-1 сайт (- 498 к - 492), который взаимодействует с комплексом содержащим c-jun и junD [51]. Уровни этого комплекса были повышены в высокоустойчивых за счет экспрессии MRP-1 клетках H69AR по сравнению с их родительским вариантом [83].

Ранее исследования регуляции генов и белков МЛУ проводились чаще всего на уровне транскрипции, в настоящее время становится ясно, что они могут регулироваться также и на уровне трансляции.

II. 1.5.2. Регуляции АВС-транспортеров на пост-транскрипционном уровне.

Некоторые механизмы регуляции генов и белков ABC на посттранскрипционном уровне были выявлены достаточно давно. Так в клетках миелолейкоза К562, обрабатываемых химиопрепаратом, регуляция гена

MDR1 осуществлась на уровнях стабилизации мРНК и инициации трансляции [93]. При исследовании регуляции другого АВС-транспортера -MRP4 (АВСС4) было показано, что регуляция экспрессии гена осуществляется на уровне сплайсинга мРНК [53]. В настоящее время большая часть работ посвящена изучению стабильности, активности, а также модификациям мРНК гена MDR1 в резистентных к лекарствам опухолях. Так было показано, что в устойчивых вариантах нескольких линий карциномы толстой кишки и в клетках хронического миелолейкоза человека (К562) происходят изменения в 5 'концевой области мРНК гена MDR1. А именно, найдено, что в резистентных клетках, транскрибируется более длинный участок гена MDR1, при этом трансляция белка Pgp с такой мРНК происходит более эффективно [34]. В другой работе, в клетках К562, устойчивых к доксорубицину и колхицину, было обнаружено увеличение периода полураспада мРНК гена MDR1. Повышение стационарных уровней мРНК гена MDR1 возможно связано с увеличением стабильности мРНК, за чем может следовать блок дальнейшей трансляции белка. Было показано, что последующее воздействие химиопрепаратами приводило к инициации трансляции [52].

Обширные исследования последних лет показали, что существует и иной важный механизм не мутационной регуляции функции генов - влияние коротких некодирующих РНК (микроРНК). Показано, что микроРНК являются регуляторами ключевых генов, участвующих в механизмах лекарственной устойчивости. Аберрантные уровни микроРНК (miRNA) были обнаружены в различных опухолях человека. Так было показано, что в клетках гепатоцеллюлярной карциномы печени активация ABC транспортеров вследствие химиотерапевтического лечения, связана с регуляцией транскрипции генов этих белков с помощью микроРНК [8]. Существуют данные литературы о том, что микроРНК, такие как микроРНК-27а и микроРНК-451 принимают непосредственное участие в активации экспрессии Р-гликопротеина. Найдено, что экспрессия микроРНК-27а и микроРНК-451 выше в опухолевых клетках линий с фенотипом МЛУ (A2780DX5 и KB-V1) по сравнению с их родительскими линиями А2780 и КВ-3-1 [98]. В другой работе было показано, что эпигенетические нарушения в резистентном варианте клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7/DOX, в частности, потеря метилирования по цитозину, может быть связана с повышением экспрессии микроРНК [49]. Полагают, что дальнейшее изучение микроРНК может лечь в основу генной терапии и стать новым перспективным способом влияния на профиль ABC транспортёров в преодолении устойчивости к химиотерапии.

Одним из механизмов пост-транскрипционной регуляции ABC транспортеров является их регуляция на уровне деградации белков. На этом механизме мы остановимся ниже (см. раздел II. 1. 7.).

II. 1.5.3. Пути сигнальной трансдукции, вовлеченные в регуляцию АВС-транспортеров.

Регуляция активности генов и белков ABC-транспортеров обеспечивается различными элементами клеточных сигнальных каскадов. Например, показано, что активность Pgp может регулироваться при участии сигнального пути Ras/Raf [66]. В промоторе гена MDR1 имеется GC - богатый район, в котором располагаются перекрывающиеся участки для связывания эффекторов Ras - транскрипционных факторов Spl/Sp3, Erg-1 и опухолевого супрессора WT-1 [64, 90, 40]. Эти находки позволяют думать, что регуляция экспрессии транспортеров через Ras/Raf и WT-1 - сложный процесс, требующий участия нескольких транскрипционных факторов. Подобные GC-богатые участки были найдены и в промоторах некоторых генов семейства АВСС (MRP).

В регуляцию транспортеров семейства ABC в некоторых клетках вовлечен ERK1 / 2 МАР киназный путь. Активация этого сигнального каскада служит как потенциальный путь выживания различных типов опухолей, и недавние исследования показывают, что ERK1 / 2 МАР киназный путь может быть активирован в ответ на воздействие химиотерапевтическими препаратами или ингибиторами mTOR [37]. Так было установлено, что в клетках линий саркоматозной эндотелиомы доксорубицин вызывает активацию ERK1 / 2 киназ, что способствует преодолению клетками гибели, индуцированной доксорубицином [84]. В одной из работ было показано, что в клеточных линиях рака яичника со стабильной экспрессией кДНК MDR1 развитие лекарственной устойчивости к таксолу связано с активацией ERK1 / 2 МАР киназного пути [29]. Ингибирование этого сигнального пути с использованием специфических ингибиторов таких как U0126 или PD098059 приводило к сенсибилизации этих клеток к Таксолу. Существуют данные, что ERK1/2 МАР сигнальный каскад играет первостепенную роль в регуляции экспрессии гена АВСС6 (MRP6) в гепатоцитах человека [24].

Известно, что Р-гликопротеин человека содержит сайты со структурными особенностями имитирующими сайты фосфорилирования для протеинкиназы киназы С (РКС) или протеинкиназы А (РКА). Было показано, что существуют конкретные участки в линкерной области Р-гликопротеина, которые фосфорилируются РКС [15], и что это влияет на стимуляцию активности АТФ-азы белка Pgp [10]. В одной из работ было обнаружено, что PKC-alpha фосфорилирует и активирует Pgp, и что ингибирование РКС приводит к снижению фосфорилирования Pgp в клетках карциномы мягких тканей. Это приводит к сенсибилизации этих клеток к химиотерапевтическим агентам [99].

Множественность регуляторных систем ABC транспортеров, свидетельствует о том, что эта защитная система клетки жизненно важна для клетки и по этой причине её регуляция неоднократно продублирована.

Среди других путей сигнальной трансдукции, с активацией или подавлением которых может быть связана МЛУ, опосредованная и не опосредованная активностью АВС-транспортеров, важное место принадлежит сигнальному каскаду PI3K/Akt/ PTEN. Сигнальный путь PI3K/Akt и его компонент mTOR вносят вклад в развитие многофакторной МЛУ опухолевых клеток при воздействии цитостатиков как за счет прямого влияния на выживаемость клеток, так и за счет влияния на активность транспортных белков семейства ABC. Остановимся подробнее на сигнальном пути PI3 K/Akt/ PTEN, поскольку активность этого пути (киназы Akt) исследовалась в нашей работе.

II.1. 6. Многофакторная МЛУ. Сигнальный путь PI3K/Akt/ PTEN.

Достаточно долгое время при исследовании лекарственной устойчивости, обращали внимание в основном на экспрессию генов/белков множественной лекарственной устойчивости MDRlfPgp и MRP 1. Затем стало понятно, что причины лекарственной устойчивости множественны и определяются не только функционированием белков-транспортеров, но также и другими причинами, в том числе активацией различных сигнальных путей в клетке, изменённых при опухолевой трансформации. Зачастую лекарственная устойчивость является результатом совокупности событий, в конечном итоге приводящих к невозможности клетке вступить в апоптоз под влиянием цитотоксических веществ. Таким образом, речь идет о многофакторной МЛУ.

Сигнальный каскад PI3K/Akt/PTEN/mTOR - играет одну из важнейших ролей в клетке. Он часто бывает нарушен при опухолевой трансформации. Фосфорилирование различных рецепторных тирозин-киназ приводит к активации этого пути. Известно, что фосфорилированная по тирозину рецепторная тирозин-киназа взаимодействует напрямую с р85 регуляторной субъединицей PI3K, это взаимодействие ведёт к активации PI3K и перемещению киназы к её непосредственному субстрату фосфо-инозитол-дифосфату на плазматической мембране. Здесь, используя энергию АТФ, дифосфат превращается в трифосфат. Сигнальный путь PI3K/Akt регулирует процессы клеточного роста, пролиферации, ангиогенеза и внутриклеточного метаболизма. Активация сигнального пути PI3K/Akt в опухолевых клетках после стресса может регулировать устойчивость опухолевых клеток к действию химиотерапевтических препаратов, а также степень чувствительности злокачественных опухолей к радиотерапии [62]. Одним из основных звеньев сигнального пути PI3K/Akt является серин /треониновая киназа Akt (также известная как РКВ). С момента своего открытия в качестве протоонкогена, киназа Akt привлекает внимание многих исследователей в связи со своей важной регуляторной ролью в различных процессах, в том числе в прогрессии опухолей и в метаболизме инсулина. Существуют доказательства того, что Aktl-киназа фосфорилирует про-апоптотический белок BAD, прокаспазу-9 и транскрипционный фактор FKHRL1, вызывая тем самым уменьшение способности связываться с BAD и Bel-XL, ингибирование каспазы-9, протеазной активности и транскрипции FAS [81]. Также Akt контролирует синтез анти-апоптотических белков, например Вс1-2 [23].

Сигнальный путь PI3K/Akt/PTEN/mTOR - важнейший путь, ответственный за выживание клеток. Показано, что его активность влияет на чувствительность опухолевых клеток к ряду химиотерапевтических препаратов. Так, при изучении механизмов резистентности клеток HL-60AR (клеточный клон промиелоцитарной лейкемии, резистентный к целому ряду лекарств), стало очевидным, что ни Pgp ни MRP1 не ответственны за резистентность этого клона [70]. Neri и др. показали, что эти клетки имеют высокий уровень активности PI3K и Aktl-киназы, и уровень фосфорилирования PI(3,4,5)P3 значительно повышен в них по сравнению с родительскими клетками. Так же в этих клетках значительно повышена активность c-IAPl и c-IAP2 - главных регуляторов активности каспазы-3, одного из основных компонентов сигнального пути, приводящего к апоптозу. Эксперименты показали, что путь PI3K/Akt играет решающую роль в приобретении резистентности этими клетками. Были предприняты попытки объяснить механизм повышенной активности PI3K. Повышенную активность PI3K/Akt Neri с соавторами объясняют усилением фосфорилирования тирозина регуляторной субъединицы р85 PI3K, что в свою очередь является результатом аутокринной выработки IGF-1 (инсулино-подобный фактор роста-1). Другие авторы на клетках нейробластомы, показали, что некоторые нейробластомы, экспрессирующие в большом количестве рецептор TrkB и его лиганд BDNF (brain-derived neurotrophic factor), характеризуются повышенной выживаемостью, резистентностью к химиотерапии и увеличением активности Akt [41]. В этой работе как и в работе Neri, авторы говорят об участии аутокринного механизма в активации Р13К-зависимого сигнального пути. В другой работе авторы показали, что ингибирование PI3K вортманином или LY294002 (специфический ингибитор PI3K) приводило к усилению апоптоза, индуцированного цитостатиками, в клетках HL-60, [74]. Такой же эффект был обнаружен в опытах с использованием клеток аденокарциномы поджелудочной железы (РК1 и РК8), которые резистентны почти ко всем известным цитотоксическим веществам, за исключением гемцитабина [71]. Ингибирование PI3K в этих клетках приводило к заметному увеличению их чувствительности к гемцитабину. На различных линиях клеток рака молочной железы было показано, что резистентность к цитотоксическим препаратам напрямую связана с повышенной активностью Akt [20]. Эти результаты подтверждают факт участия PI3K/Akt сигнального пути в формировании лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

Наряду с этими исследованиями, следует еще раз отметить, что влияние сигнального пути PI3K/Akt на лекарственную устойчивость опухолевых клеток может быть связано и с тем, что он участвует в регуляции белков семейства ABC (см. раздел II. 1.5). Сигнальный путь PI3K/Akt и его компонент mTOR вносят вклад в развитие многофакторной МЛУ опухолевых клеток при воздействии цитостатиков как за счет прямого влияния на выживаемость клеток, так и за счет влияния на активность транспортных белков семейства ABC. Так было показано, что изменение активности этого сигнального каскада в клетках карцином предстательной железы, способствует уменьшению экспрессии гена MRP1 и увеличению чувствительности клеток к цитостатикам [110, 111]. Имеются литературные данные, что ингибирование сигнального пути PI3K/Akt приводит к повышению чувствительности клеток рака молочной железы к тамоксифену [20], рака мочевого пузыря - к доксорубицину [89], аденокарциномы поджелудочной железы - к гемцитабину [71].

Множественность причин лекарственной устойчивости заключается не только в том, что она может быть обусловлена различными молекулярными механизмами, но также и тем, что это - сложный феномен, в который вовлекаются одновременно несколько белков (это может быть несколько транспортных белков, активация этих белков может сочетаться с изменениями активности других защитных систем клетки). Картина механизмов МЛУ в последние годы стала значительно сложнее, становится ясным, что различные системы защиты клеток, тканей и целого организма тесно взаимосвязаны, однако не совсем ясно как они соотносятся между собой. К этой проблеме мы попытались подойти в нашей работе.

II. 1. 7. Участие систем деградации белков в лекарственной устойчивости опухолей

Система деградации белков в клетке, играет ключевую роль в регуляции метаболизма белков, поддерживая внутриклеточный гомеостаз. Многие расщепляемые белки имеют критическое значение для контроля внутриклеточных процессов, включая правильное прохождение клеточного цикла, деление и выживание клеток. Подавление системы деградации, предотвращает направленный протеолиз и тем самым влияет на многие внутриклеточные каскады реакций передачи сигнала. Существует два пути деградации белков в клетке, а именно убиквитин-зависимая деградация (Рисунок 2) и убиквитин-независимая деградация белка. Хорошо изученная классическая убиквитин-зависимая протеасомная деградация белков требует полиубиквитинирования белкового субстрата. Она осуществляется с затратой энергии АТР, а ее продуктами являются короткие пептиды. Подавляющее большинство примеров неклассической протеасомной деградации связано с убиквитин-независимой деградацией субстратов протеасомы. При деградации протеасомой 26S единственным отличием от классического механизма является то, что роль убиквитина (Ub) выполняет другой белок или сигнал для деградации содержится в последовательности самого белка-субстрата [107]. о х b ОН дур ATP op

E,-SH E-S üb О А b

26S Proleasome complex

Degraded ATpN proteins

Protein substrate

Ub

Рисунок 2. Схема убиквитин-зависимой деградации белка при участии 26S протеасомы. (Adams, 1999 [1])

II. 1.7.1. Протеасома. Её строение и роль в клетке.

Протеасома - АТФ-зависимая, мультисубъединичная протеаза, которая является центральной протеолитической машиной в клетке. Протеасома, осуществляющая убиквитин-зависимую деградацию белков, состоит из двух основных субкомплексов: "коровой" 20S протеасомы (20S CP, -700 кДа) и 19S регуляторной частицы (19S RP, -900 кДа). 20S протеасома содержит протеазные субъединицы, а 19S частицы включают субъединицы, способные связывать полиШ цепи и субстрат, а также изопептидазы, отщепляющие Ub, и АТРазы, которые обеспечивают разворачивание субстрата и транслокацию его в канал коровой части протеасомы (Рисунок 4). 19S частицы могут присоединяться к 20S протеасоме с одного или обоих концов, в результате образуются 26S и 30S протеасомы соответственно. Однако, термин «30S протеасома» практически не используется, а название «26S протеасома» принято для обозначения обеих изоформ. Помимо регуляторных частиц 19S, в состав 26 S протеасомы могут входить альтернативные регуляторные частицы: PA28a/ß (или IIS REG), РА28у (или REGy), РА200, PI31 и др [107]. 20S протеасома представлена 4 сложенными кольцами, каждое из которых содержит 7 субъединиц. Существует две категории субъединиц - а и ß. Это разделение основывается сходством последовательностей. Два внутренних кольца потеасомы содержат ß -субъединицы (ß 1- ß 7), 3 из которых ß 1, ß 2 и ß5 — содержат активные сайты [68]. 20S протеасома прокариот и эукариот состоит из 28 субъединиц. У прокариот протеасома содержит 14 копий идентичных а-субъединиц и 14 копий идентичных ß-субъединиц.

26S Proteasome Complex

3 a

19S Regulatory Complex A

Рисунок 3. Строение 26S протеасомы. 20S - коровая часть. 19S - регуляторные частицы (Richardson et al, 2003 [77]).

У эукариот три из семи (3-субъединиц имеют треонин-протеазные каталитические центры разной субстратной специфичности, то есть каждая протеасома имеет 6 протеазных центров. Известно, что субъединица (31 обладает каспазоподобной активностью (гидролизует пептидную связь после отрицательно заряженных аминокислотных остатков), субъединица (32 -трипсиноподобной активностью, тогда как [35 - химотрипсиноподобной активностью [38]. Все протеиназные центры обращены во внутреннюю протеолитическую полость, образованную (3-субъединицами, доступ субстрата к ним возможен через пору, сформированную а-субъединицами [46]. Протеасомы в эукариотических клетках локализуются как в цитоплазме, так и в ядре. К примеру, в гепатоцитах 17% от общего количества протеасом находится в ядре, 14% связано с ЭПР (эндоплазматический ретикулум), а оставшаяся доля обнаруживается в цитоплазматическом матриксе; содержание протеасом в ядрах клеток легочного эпителия составляет 51%. Было также показано, что уровень синтеза протеасом в лейкозных клетках значительно выше чем в нормальных клетках крови [50]. Повышенное содержание протеасом в сыворотке крови отмечено и у больных с различными аутоиммунными заболеваниями и этот показатель используется в настоящее время как один из клинических маркеров протекания заболеваний. Молекулярные механизмы секреции протеасом остаются малоизученными.

Исходя из вышесказанного, нет сомнений, что протеасома играет критическую роль в процессе жизнедеятельности клетки.

II.1. 7.2. Противоопухолевые агенты, действие которых направленно на ингибирование активности протеасом.

В настоящее время, активно изучается новый класс противоопухолевых агентов, действие которых направленно на ингибирование активности протеасом. Нарушение работы тех или иных компонентов убиквитин-протеасомной системы может быть причиной различных заболеваний. Поэтому поиск специфичных ингибиторов этой системы является важным направлением. Однако необходимо учитывать тот факт, что убиквитин-протеасомная система непрерывно участвует в ключевых для жизни клетки событиях и что в результате ее ингибирования нарушается нормальное течение большого количества процессов. Большинство используемых ингибиторов 20S протеасомы направлено на подавление ее химотрипсинподобной активности. Это связано, во-первых, с тем, что блокирование именно этой активности приводит к наибольшему снижению уровня расщепления белков, а во-вторых, ингибиторы этой активности обычно представляют собой гидрофобные молекулы и поэтому легко проникают в клетку, в отличие от ингибиторов других каталитических центров протеасомы, которые содержат заряженные участки. При достаточно длительном воздействии ингибиторы 20S протеасомы оказываются токсичными для клеток и приводят к их гибели в результате апоптоза, причем пролиферирующие клетки обычно более чувствительны к этим веществам [4, 31]. В целом, применение веществ, модулирующих активность убиквитин-протеасомной системы в терапевтических целях рассматривается как весьма перспективное. Сегодня их пытаются использовать в первую очередь для лечения злокачественных новообразований.

Одним из наиболее известных и уже применяемых в клинике протеасомных ингибиторов является пиразинилкарбонил-РЬе-Ьеи-боронат -бортезомиб (bortezomib, PS-341, Velcade). После того, как была описана противоопухолевая активность бортезомиба in vitro и in vivo, начались его испытания в клинике [1]. Доклинические исследования выявили противоопухолевую активность бортезомиба при множественной миеломе (ММ), лимфомах и некоторых солидных опухолях. Исследования, проведенные на линиях миеломных клеток и на плазматических клетках, полученных от больных ММ, резистентных к стандартной химиотерапии, показали, что бортезомиб индуцирует апоптоз опухолевых клеток. Также выяснилось, что бортезомиб в основном не эффективен как монопрепарат в лечении солидных опухолей, но дает очень хорошие результаты в случаях ММ и некоторых других гемобластозов [57, 58, 77]. Бортезамиб применяется в клинике и рассматривается как одно из многообещающих лекарственных средств для лечения множественных миелом и лимфом, а также рака молочной железы [77].

Бортезомиб представляет из себя водорастворимое соединение, являющееся мощным селективным, обратимым ингибитором протеасомного комплекса (Рисунок 4). Само соединение представляет из себя дипептид борониковой кислоты. Бортезомиб ковалентно связываясь с активным сайтом каталитической субьединици |35 - 20S коровой части протеасомы, способен её ингибировать. в

Рисунок.4. Химическое строение бортезомиба. (Richardson et al, 2003 [77])

Важным свойством этого протеасомного ингибитора является то, что он влияет на некоторые опухолевые клетки в тех концентрациях, которые не оказывает воздействия на нормальные клетки. В сочетании с химиотерапевтическими агентами он даёт аддитивный или синергический эффект. В предклинических исследованиях показано, что вызываемое бортезомибом угнетение активности протеасомы предотвращает расщепление внутриклеточных белков, что влияет на многие пути передачи сигнала в клетке. Поскольку пролиферация, метастазирование и выживание опухолевых клеток зависят от белков, расщепляемых в протеасоме, то нарушение этих каскадов реакций может приводить к гибели клеток и торможению опухолевого роста.

Существуют данные литературы относительно того, что бортезомиб способен оказывать воздействие не только на протеасомы, но и влиять на другие внутриклеточные механизмы. Известно, что бортезомиб ингибирует активацию NF-kB, способен участвовать в стабилизации р53, р21 и р27 [77]. Было показано, что при ингибировании NF-kB с помощью бортезомиба, in vitro, происходит заметное подавление роста клеток MM in vivo и клеток культивируемых линий ММ [94].

II.1. 7.3. Бортезомиб и транспортные белки семейства ABC.

Механизмы и закономерности эволюции популяций малигнизированных клеток при воздействии бортезомиба не ясны, в частности, не ясно участие ABC-транспортеров в этом процессе. Данные, относительно роли Pgp в связывании бортезомиба, имеющиеся в литературе, противоречивы. В одной из работ, посвященной этой теме, на линиях клеток лимфобластов и линии клеток глиобластомы было показано, что бортезомиб не является субстратом Pgp [88]. Однако, в других работах, выполненных на других линиях клеток, исследователи получили данные, свидетельствующие в пользу того, что бортезомиб - субстрат белка Pgp [65, 69, 78]. Относительно взаимодействия бортезомиба и других ABC транспортеров конкретных данных к началу нашей работы не было. Исследование связи МЛУ, опосредованной АВС-белками, и закономерностей воздействия бортезомиба на клетки требовали дальнейших исследований и это стало одной из задач нашей работы. Изучение влияния бортезомиба на активность ABC-транспортеров может дать новые сведения относительно регуляции активности этих белков на посттранляционном уровне.

III. Материалы и методы

111.1. Линии клеток, использованные в работе. Линию клеток хронического миелолейкоза человека К562 [56] и ее сублинию, гиперэкспрессирующую Pgp (K562/i-S9) [63] поддерживали на среде RPMI 1640 с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Также использована линия клеток острого миелобластного лейкоза KG1 человека [45], пассируемая на среде Iscove's MDM с 10% fcs. Клетки эпидермоидной карциномы полости рта человека KB 3-1 и клетки сублинии KB 8-5, гиперэкспрессирующие Pgp, отобранные на резистентность к колхицину [2], клетки MCF-7 - линия клеток аденокарциномы молочной железы человека [86]. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% сыворотки. Все клеточные линии культивировали при температуре 37°С в атмосфере 5% со2.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Лалетина, Лидия Александровна

Выводы

1. Бортезомиб является субстратом с Р-гликопротеина (Pgp или АВСВ1). Его свойства в качестве субстрата Pgp отличаются от свойств классического субстрата Pgp винбластина: в отличие от винбластина, бортезомиб является менее специфичным субстратом для этого транспортёра, кроме того бортезомиб не конкурирует с родамином (Rh 123) за связывание с

PgP

2. Клетки с повышенной экспрессией Р-глигопротеина (Pgp), могут быть как резистентнее (клетки линии КВ 8-5) так и чувствительнее (клетки линии K562/Í-S9) к бортезомибу, чем соответствующие родительские клетки. Таким образом, гиперэкспрессия Pgp не обязательно определяет резистентность опухолевых клеток к бортезомибу.

3. В клетках линии КВ 8-5 (клетки с повышенной экспрессий Pgp) бортезомиб повышает чувствительность к доксорубицину - субстрату Pgp. Таким образом, в некоторых клетках бортезомиб может выступать как ингибитор активности Pgp.

4. Обработка бортезомибом приводит к снижению количества мРНК гена MDR1 (.АВСВ1) и MRP i (.ABCCl) в клетках линий КВ 8-5 и гена MRP1 в клетках линии MCF-7. Таким образом, бортезомиб может снижать количество мРНК генов некоторых транспортных белков семейства ABC.

5. Воздействие бортезомиба на клетки способствует повышению количества белков (Pgp и MRP1) в некоторых, но не во всех клеточных линиях. Это, по-видимому, связано с подавлением активности протеасом.

6. В клетках KB 8-5 (резистентных за счет повышенной экспрессии Р-глигопротеина) бортезомиб увеличивает количество фосфорилированной формы киназы Akt и снижает количество фосфорилированной ERK1/2 киназы. Снижение количества мРНК гена MRP1 под влиянием бортезомиба связано с активацией киназы Akt. При сравнении резистентных (КВ 8-5) и чувствительных (КВ 3-1) клеток этот эффект обнаружен только в резистентном варианте. Это свидетельствует о том, что под влиянием бортезомиба изменения сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию пролиферации, может происходить в первую очередь в лекарственно-устойчивых клетках с гипрэкспрессией ABC транспортера.

7. При продолжительном воздействии бортезомиба на популяцию клеток линии K562/Í-S9 (клетки с повышенной экспрессий Pgp), в популяции накапливаются варианты с активированной киназой Akt. Так же в этих вариантах наблюдается повышенная экспрессия Р-гликопротеина и маркера стволовых кроветворных клеток CD34, т.е. накапливаются варианты с фенотипом стволовых кроветворных клеток. Это не наблюдалось в популяции не резистентных клеток К562. Таким образом, бортезомиб может способствовать накоплению в малигнизированной лекарственно-устойчивой популяции вариантов, за счет которых опухоль может прогрессировать.

8. Обработка бортезомибом клеток MCF-7 приводит к перемещению белка YB-1, регулирующего лекарственную устойчивость, из цитоплазмы в ядра клеток, что может способствовать повышению активности белка YB-1 в качестве фактора транскрипции. Бортезомиб не оказывает влияния на количество мРНК гена YB-1 в клетках.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лалетина, Лидия Александровна, 2012 год

1. Akiyama S. MM. Isolation and genetic characterization of human KB cell lines resistant to multiple drugs / S. Akiyama, A. Fojo, J.A. Hanover, I. Pastan, M.M. Gottesman // Somat. Cell Mol. Genet. 1985. - V. 11. - P. 117-126.

2. Ambudkar S.V. Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter / S.V. Ambudkar, S. Dey, C.A. Hrycyna, M. Ramachandra, I. Pastan, M.M. Gottesman // Annu Rev Pharmacol Toxicol.1999.-V. 39.-P. 361-398.

3. Bahr O. Modulation of MDR/MRP by wild-type and mutant p53 / O. Bahr, W. Wick, M. Weller // J Clin Invest. 2001. - V. 107. - P. 643-646.

4. Blanpain C. Epithelial stem cells: turning over new leaves / C. Blanpain, V. Horsley, E. Fuchs // Cell. 2007. - V. 128. - P. 445-458.

5. Borst P. A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins / P. Borst, R. Evers, M. Kool, J. Wijnholds // J Natl Cancer Inst.2000.-V. 92.-P. 1295-1302.

6. Breier A. P-glycoprotein~implications of metabolism of neoplastic cells and cancer therapy / A. Breier, M. Barancik, Z. Sulova, B. Uhrik // Curr Cancer Drug Targets. 2005. - V. 5. - P. 457-468.

7. Burchenal J.H. Prevention of chemotherapeutic effects of 4-amino-Nl 0-methyl-pteroylglutamic acid on mouse leukemia by citrovorum factor / J.H. Burchenal, G.M. Babcock, H.P. Broquist, T.H. Jukes // Proc Soc Exp Biol Med. 1950. - V. 74. - P. 735-737.

8. Egudina S.V. Early steps of the P-glycoprotein expression in cell cultures studied with vital fluorochrome / S.V. Egudina, T.P. Stromskaya, E.A. Frolova, A.A. Stavrovskaya // FEBS Lett. 1993. - V. 329. - P. 63-66.

9. Chaudhary P.M. Expression and activity of P-glycoprotein, a multidrug efflux pump, in human hematopoietic stem cells / P.M. Chaudhary, I.B. Roninson // Cell. 1991. - V. 66. - P. 85-94.

10. Chaudhary P.M. Induction of multidrug resistance in human cells by transient exposure to different chemotherapeutic drugs / P.M. Chaudhary, I.B. Roninson // J Natl Cancer Inst. 1993. - V. 85. - P. 632-639.

11. Chevillard S. A study of the expression of MDR1 gene in solid tumors. Initial results of a multicenter evaluation / S. Chevillard, P. Vielh, P.

12. Vallidire, J. Robert, J.P. Marie // Bull Cancer. 1996. - V. 83. - P. 626633.

13. Chin K.V. Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53 / K.V. Chin, K. Ueda, I. Pastan, M.M. Gottesman // Science. 1992. - V. 255. - P. 459-462.

14. Clark A.S. Constitutive and inducible Akt activity promotes resistance to chemotherapy, trastuzumab, or tamoxifen in breast cancer cells /A.S. Clark, K. West, S. Streicher, P.A. Dennis // Mol Cancer Ther. 2002. - V. l.-P. 707-717.

15. Cole S.P. Pharmacological characterization of multidrug resistant MRP-transfected human tumor cells / S.P. Cole, K.E. Sparks, K. Fraser, D.W. Loe, C.E. Grant, G.M. Wilson, R.G. Deeley // Cancer Res. 1994. - V. 54. -P. 5902-5910.

16. Dano K. Active outward transport of daunomycin in resistant Ehrlich ascites tumor cells / K. Dano // Biochim Biophys Acta. 1973. - V. 323. -P. 466-483.

17. Dean M. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily / M. Dean, Y. Hamon, G. Chimini // Journal of Lipid Research. 2001. - V. 42.-P. 1007-1017

18. Dean M. Cancer stem cells: Implications for cancer causation and therapy resistance / M. Dean // Discov Med. 2005. - V. 5. - P. 278-282.

19. Ding S. Cross-talk between signalling pathways and the multidrug resistant protein MDR-1 / S. Ding, M. Chamberlain, A. McLaren, L. Goh, I. Duncan, C.R. Wolf// Br J Cancer. 2001. - V. 85. - P. 1175-1184.

20. Fojo A.T. Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tissues / A.T. Fojo, K. Ueda, D.J. Slamon, D.G. Poplack, M.M. Gottesman, I. Pastan // Proc Natl Acad Sci USA.- 1987. V. 84. - P. 265-269.

21. Fribley A. Proteasome Inhibitor Induces Apoptosis through Induction of Endoplasmic Reticulum Stress / A. Fribley, C.Y. Wang // Cancer Biol. Ther. 2006. - V. 5. - P. 745-748.

22. Glavinas H. The Role of ABC Transporters in Drug Resistance, Metabolism and Toxicity / H. Glavinas, P. Krajcsi, J. Cserepes, B. Sarkadi // Current Drug Delivery. 2004. - V. 1. - P. 27-42.

23. Good J.R. Evidence that a cell-type-specific efflux pump regulates cell differentiation in Dictyostelium / J.R. Good, A. Kuspa // Dev Biol. 2000. -V. 220.-P. 53-61.

24. Gottesman M.M. The molecular basis of multidrug resistance in cancer: the early years of P-glycoprotein research / M.M. Gottesman, V. Ling // FEBS Lett. 2006. - V. 580. - P. 998-1009.

25. Grant S. Cotargeting survival signaling pathways in cancer / S. Grant // J Clin Invest. -2008. V. 118. - P. 3003-3006.

26. Heinemeyer W. The Active sites of the eukaryotic 20 S proteasome and their involvement in subunit precursor processing / W. Heinemeyer, M. Fischer, T. Krimmer, U. Stachon, D.H. Wolf// J.Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 25200-25209.

27. Higgins C.F. Multiple molecular mechanisms for multidrug resistance transporters / C.F. Higgins // Nature 2007. - V. 446. - P. 749-757.

28. Hirose M. The role of Wilms' tumor genes / M. J. Hirose // Med Invest. -1999.-V. 46.-P. 130-140.

29. Ho R, Eggert A. Resistance to chemotherapy mediated by TrkB in neuroblastomas / R. Ho, A. Eggert, T. Hishiki, J.E. Minturn, N. Ikegaki, P. Foster, A.M. Camoratto, A.E. Evans, G.M. Brodeur // Cancer Res. 2002. -V. 62.-P. 6462-6466.

30. Johnson R.A. Transcriptional repression by p53 through direct binding to a novel DNA element / R.A. Johnson, T.A. Ince, K.W. Scotto // J Biol Chem. -2001. -V. 276.-P. 27716-27720.

31. Juliano R.L. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants / R.L. Juliano, V.Ling // Biochim Biophys Acta. 1976. - V. 455. - P. 152-162.

32. Klein I. An inventory of the human ABC proteins /1. Klein, B. Sarkadi, Va.radi A.Biochimica et Biophysica Acta. 1999. - V. 1461. - P. 237-262.

33. Koeffler H.P. Acute myelogenous leukemia: a human cell line responsive to colony stimulating activity / H.P. Koeffler, D.W. Golde // Science. -1978.-V. 200.-P. 1153-1154.

34. Kohler A. The substrate translocation channel of the proteasome / A. Kohler, M. Bajorek, M. Groll, L. Moroder, D.M. Rubin, R. Huber, M.H. Glickman, D. Finley // Biochimie. 2001. - V. 83. -P. 325-332.

35. Kohno K. The pleiotropic functions of the Y-box-binding protein, YB-1 / K. Kohno, H. Izumi, T. Uchiumi, M. Ashizuka, M. Kuwano // Bioessays. -2003.-V. 25.-P. 691-698.

36. Kohno K. The direct activation of human multidrug resistance gene (MDR1) by anticancer agents / K. Kohno, S. Sato, H. Takano, K. Matsuo, M. Kuwano // Biochem Biophys Res Commun. 1989. - V. 165. -P. 1415-1421.

37. Kumatori A. Abnormally high expression of proteasomes in human leukemic cells / A. Kumatori, K. Tanak, N. Inamura, S. Sone, T. Ogura, T. Matsumoto, T. Tachikawa, S. Shin, A. Ichihara // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 7071-7075.

38. Kuo M.T. Redox regulation of multidrug resistance in cancer chemotherapy: molecular mechanisms and therapeutic opportunities / M.T. Kuo // Antioxid Redox Signal. 2009. - V. 11. - P. 99-133.

39. Leonard G.D. The role of ABC transporters in clinical practice / G.D. Leonard, T. Fojo, S.E. Bates // Oncologist. 2003. - V. 8. - P. 411-424.

40. Lozzio B.B. Properties and usefulness of the original K-562 human myelogenous leukemia cell line / B.B. Lozzio, C.B. Lozzio // Leuk Res. -1979.-V. 3.-P. 363-370.

41. Ludwig H. Proteasome inhibition and its clinical prospects in the treatment of hematologic and solid malignancies / H. Ludwig, D. Khayat, G. Giaccone, T. Facon // Cancer. 2005. - V. 104. - P. 1794-1807.

42. Matsumoto K. Significance of the Y-box proteins in human cancers / K. Matsumoto, B.H. Bay // J Mol Genet Med. 2005. - V. 1. - P. 11-17.

43. Matsui W. Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance / W. Matsui, Q. Wang, J.P. Barber // Cancer Res. -2008.-V. 68.-P. 190-197.

44. Mechetner E.B. Efficient inhibition of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance with a monoclonal antibody / E.B. Mechetner, I.B. Roninson // Proc Natl Acad Sci USA.- 1992. V. 89. - P. 5824-5828.

45. Mitin N. Signaling interplay in Ras superfamily function / N. Mitin, K.L. Rossman, C.J. Der // Curr Biol. 2005. - V. 15. - P. 563-574.

46. Miyazaki M. Activation of human multidrug resistance-1 gene promoter in response to heat shock stress / M. Miyazaki, K. Kohno, T. Uchiumi, H. Tanimura, K. Matsuo, M. Nasu, M. Kuwano // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 187. - P. 677-684.

47. Moran E. The role of proteasome in malignant diseases / E. Moran, A. Nencioni // J Buon. 2007. - V. 12. - P. 95-99.

48. Ng S.S.W. Inhibition of phosphatidylinositide 3-kinase enhances gemcitabine-induced apoptosis in human pancreatic cancer cells / S.S.W. Ng, M.S. Tsao, S. Chow, D.W. Hedley // Cancer Res. 2000. - V. 60. - P. 5451-5455.

49. Osborn M.T. Role of the stress-activated/c-Jun NH2-terminal protein kinase pathway in the cellular response to adriamycin and other chemotherapeutic drugs / M.T. Osborn, T.C. Chambers // J Biol Chem. -1996.-V. 271.-P. 30950-30955.

50. O'Gorman D.M. Sensitisation of HL60 human leukaemic cells to cytotoxic drug-induced apoptosis by inhibition of PI3-kinase survival signals / D.M. O'Gorman, S.L. McKenna, A.J. McGahon, K.A. Knox, T.G. Cotter // Leukemia. 2000. - V. 4. - P. 602-611.

51. Park S.W. Analysis of P-glycoprotein mediated membrane transport in human peripheral blood lymphocytes using the UIC2 shift assay / S.W. Park, N. Lomri, L.A. Simeoni, J.P. Fruehauf, E. Mechetner // Cytometry A. -2003. V. 53.-P. 67-78.

52. Rumpold H. Knockdown of PgP resensitizes leukemic cells to proteasome inhibitors / H. Rumpold, C. Salvador, A.M. Wolf, H. Tilg, G. Gastl, D. Wolf// Biochem Biophys Res Commun. 2007. - V. 361. - P. 549-554.

53. Sampath J. Mutant p53 cooperates with ETS and selectively up-regulates human MDR1 not MRP 1 / J. Sampath, D. Sun, V.J. Kidd, J. Grenet, A. Gandhi, L.H. Shapiro, Q. Wang, G.P. Zambetti, J.D. Schuetz // J Biol Chem. 2001. - V. 276. - P. 39359-39367.

54. Sarkadi B. Human multidrug resistance ABCB and ABCG transporters: participation in a chemoimmunity defense system /B. Sarkadi, L. Homolya, G. Szakács, A. Váradi // Physiol Rev. 2006. - V. 86. - P. 1179-1236.

55. Scheid M.P. Phosphatidylinositol 3' kinase signaling in mammary tumorigenesis / M.P. Scheid, J.R. Woodgett // J. Mammary Gland Biol Neoplasia. 2001. - V. 1. - P. 83-99.

56. Scheffer G.L. Lung resistance-related protein/major vault protein and vaults in multidrug-resistant cancer / G.L. Scheffer, A.B. Schroeijers, M.A. Izquierdo, E.A. Wiemer, R.J. Scheper // Curr Opin Oncol. 2000. - V. 6. -P. 550-556.

57. Scotto K.W, Transcriptional regulation of ABC drug transporters / K.W. Scotto // Oncogene. 2003. - V. 22. - P. 7496-7511

58. Sonneveld P. Multidrug resistance in haematological malignancies / P. Sonneveld // J Intern Med. 2000. - V. 247. - P. 521-534.

59. Soule H.D. A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma / H.D. Soule, J. Vazguez, A. Long, S. Albert, M. Brennan // J. Natl Cancer Inst. 1973.-V. 51.-P. 1409-1416.

60. Stromskaya T.P. Influence of RARalpha gene on MDR1 expression and Pglycoprotein function in human leukemic cells / T.P. Stromskaya, E.Y. Rybalkina, T.N. Zabotina, A.A. Shishkin, A.A. Stavrovskaya // Cancer Cell Internat. 2005. - V. 5.-P. 5-15.

61. Styczynski J. Activity of bortezomib in glioblastoma / J. Styczynski, D. Olszewska-Slonina, B. Kolodziej, M. Napieraj, M. Wysocki // Anticancer Res. 2006. - V. 26. - P. 4499-4503.

62. Tanaka M. MMAC1/PTEN inhibits cell growth and induces chemosensitivity to doxorubicin in human bladder cancer cells / M. Tanaka, D. Koul, M.A. Davies, M. Liebert, P.A. Steck, H.B. Grossman // Oncogene. 2000. - V. 19. - P. 5406-5412.

63. Thiel G. Regulation of life and death by the zinc finger transcription factor Egr-1 / G. Thiel, G. Cibelli // J. Cell Physiol. 2002. - V. 193. - P. 287292.

64. Ueda K. Isolation and sequence of the promoter region of the human multidrug-resistance (P-glycoprotein) gene / K. Ueda, I. Pastan, M.M. Gottesman // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 17432-17436.

65. Wiberg K. In vitro activity of bortezomib in cultures of patient tumour cells—potential utility in haematological malignancies / K. Wiberg, K. Carlson, A. Aleskog, R. Larsson, P. Nygren, E. Lindhagen // Med Oncol. -2009.-V. 26.-P. 193-201.

66. Yang H.H. Overcoming drug resistance in multiple myeloma: the emergence of therapeutic approaches to induce apoptosis / H.H. Yang, M.H. Ma, R.A. Vescio, J.R. Berenson // Journal of Clinical Oncology. -2003.-V. 21.-P. 4239-4247.

67. Yerlikaya A. Differential sensitivity of breast cancer and melanoma cells to proteasome inhibitor Velcade / A. Yerlikaya, N. Erin // Int. J. Mol. Med. -2008.-V. 22.-P. 817-823.

68. Zastawny R.L. The core promoter region of the P-glycoprotein gene is sufficient to confer differential responsiveness to wild-type and mutant p53 / R.L. Zastawny, R. Salvino, J. Chen, S. Benchimol, V. Ling // Oncogene. -1993.-V. 6.-P. 1529-1535.

69. Zhu H. Role of MicroRNA miR-27a and miR-451 in the regulation of MDR1/P-glycoprotein expression in human cancer cells / H. Zhu, H. Wu, X. Liu, B.R. Evans, D.J. Medina, C.G. Liu, J.M.Yang // Biochem Pharmacol. 2008. - V. 76. - P. 582-588.

70. Вайман A.B. Исследование роли белка YB -1 в лекарственнойустойчивости опухолей молочной железы / A.B. Вайман, Г.П. Гене,

71. Т.П. Стромская, Е.Ю. Рыбалкина, A.B. Сорокин, С.Г. Гурьянов, Л.П. Овчинников, A.A. Ставровская // Молекулярная медицина. 2007. -T. 1.-С. 31-37.

72. Мечетнер Е.Б. Новые подходы к оценке экспрессии и функциональной активности Р-гликопротеина / Е.Б. Мечетнер // Биологические мембраны. 2003. - Т. 20. - С. 213-224.

73. Скабкин М.А. Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов / М.А. Скабкин, О.В. Скабкина, Л.П. Овчинников // Успехи биол. химии. 2004. - Т. 44. - С. 3-52.

74. Сорокин A.B. Протеасомная система деградации и процессинга белков / A.B. Сорокин, Е.Р. Ким, Л. П. Овчинников // Успехи биологической химии. 2009. - Т. 49. - С. 1-74.

75. Ставровская A.A. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток / A.A. Ставровская // Биохимия. 2000. - Т. 65. - С. 112-126.

76. Стромская Т.П. Участие Р-гликопротеина в эволюции популяций клеток хронического миелолейкоза при воздействии иматиниба / Т.П. Стромская, Е.Ю. Рыбалкина, С.С. Круглов, Т.Н. Заботина, Е.Б.73.-С. 36-46.

77. Щербакова Е.А. Роль белка PTEN в формировании множественной лекарственной устойчивости клеток рака предстательной железы / Е.А. Щербакова, Т.П. Стромская, Е.Ю. Рыбалкина // Молекулярная биология. 2008. - Т. 42. - С. 1-7.

78. Щербакова Е.А. Участие белка mTOR в регуляции множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток / Е.А. Щербакова, Е.Ю. Рыбалкина, Т.П. Стромская, A.A. Ставровская // Биол. мембраны. 2009. - Т. 26. - С. 119-125.

79. Чертков И.Л., Дризе Н.И. Дифференцировочный потенциал стволовых клеток (проблема пластичности) / И.Л. Чертков, Н.И. Дризе // Вестн. РАМН. 2005. - Т. 10. - С. 5-10.