Участие анионных фосфолипидов цитоплазматической мембраны в секреции щелочной фосфатазы Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Калинин, Андрей Евгеньевич

• Калинин, Андрей Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Калинин, Андрей Евгеньевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ

СЕКРЕТОРНОГО ПРОЦЕССА У БАКТЕРИЙ

1.1. Секреторный аппарат Е. coli

1.1.1. Цитоплазматические факторы секреции

1.1.2. Транслокационная АТФ-аза белок SecA

1.1.3. Мембранная часть транслокационного аппарата

1.1.4. Сигнальные пептидазы

1.1.5. Каталитический цикл транслоказы белков-предшественников

1.2. Особенности первичной структуры секретируемых белков

1.2.1. Сигнальные последовательности

1.2.2. Особенности структуры зрелой части

экспортируемых белков

ГЛАВА 2. УЧАСТИЕ ФОСФОЛИПИДОВ В СЕКРЕЦИИ БЕЖА

2.1. Взаимосвязь секреции белка с составом и метаболизмом фосфолипидов

2.2. Участие анионных фосфолипидов в формировании сайта связывания и транслокации белка

2.3. Взаимодействие фосфолипидов с сигнальными последовательностями

2.4. Абсолютная необходимость анионных фосфолипидов для эффективной транслокации белка in vivo и in vitro

2.5. Участие анионных фосфолипидов в функционировании белковых компонентов секреторного аппарата

2.6. Необходимость непосредственного взаимодействия сигнальных последовательностей с анионными фосфолипидами

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ЗЛ. Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды

3.2. Среды и условия культивирования

3.3. Ферменты и реактивы

3.4. Методы работы с ДНК

3.5. Олигонуклеотиднаправленный мутагенез

3.6. Субклеточное фракционирование

3.7. Определение скорости превращения предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму in vivo

3.8. Анализ состава и обмена фосфолипидов

3.9. Анализ интенсивности переноса глицерофосфата из фосфатидилглицерина на арбутин

3.10. Выделение предшественников природной и мутантных форм щелочной фосфатазы

3.11. Приготовление липосом

3.12. Взаимодействие предшественников природной и мутантных

форм щелочной фосфатазы с липосомами

3.13. Аналитические методы

3.14. Стереохимический анализ

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ ЩЕЛОЧНОЙ

ФОСФАТАЗЫ И ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ИХ СЕКРЕЦИИ

4.1. Введение направленных мутаций в ген щелочной фосфатазы

4.2. Изучение транслокации мутантных форм щелочной фосфатазы

через цитоплазматическую мембрану

4.2.1. Замены заряженных аминокислот в N-концевом домене

зрелой полипептидной цепи PhoA не влияют на эффективность ее транслокации через мембрану

4.2.2. Замены положительно заряженной аминокислоты

в N-концевом домене сигнального пептида prePhoA снижают эффективность секреции

4.2.3. Замены аминокислот вблизи места отщепления сигнального пептида приводят к полному ингибированию созревания prePhoA и его заякориванию в цитоплазматической мембране

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БЕЛОК-ЛИПИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ПРОЦЕССЕ ТРАНСЛОКАЦИИ prePhoA ЧЕРЕЗ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ МЕМБРАНЫ IN VIVO И IN VITRO

5.1. Секреция мутантных prePhoA с отщепляемым сигнальным пептидом не влияет на состав и обмен фосфолипидов

5.2. "Заякоривание" мутантных prePhoA в цитоплазматической мембране сопровождается накоплением анионных фосфолипидов

и усилением их обмена

5.3. Положительно заряженный аминокислотный остаток

в N-концевом домене сигнального пептида prePhoA участвует во взаимодействии с анионными фосфолипидами in vivo

5.4. Положительный заряд N-концевого домена сигнального пептида необходим для эффективного взаимодействия prePhoA

с модельными фосфолипидными мембранами in vitro

5.5. Наличие положительно заряженного аминокислотного остатка в N-концевом домене сигнального пептида повышает стабильность предполагаемого комплекса "СП - анионный фосфолипид"

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНОЕ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат АФЛ - анионные фосфолипиды КЛ - кардиолипин ФГ - фосфатидилглицерин ФК - фосфатидная кислота ФЭА - фосфатидилэтаноламин СП - сигнальный пептид ДДС-Na - додецилсульфат натрия ДТТ - дитиотреитол Х-Р - 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат Трис - трис-(оксиметил)-аминометан ТХУ - трихлоруксусная кислота ЭДТА - этилендиаминтетраацетат А (А1а) - аланин Е (Glu) - глутаминовая кислота K(Lys) -лизин Р (Pro) - пролин Q (Gin) - глутамин R (Arg) - аргинин

С1ССР - карбонил-цианид-ж-хлорфенилгидразон IPTG - изопропил-р-В-тиогалактопиранозид PhoA - зрелая форма щелочной фосфатазы Escherichia coli PrePhoA - предшественник щелочной фосфатазы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие анионных фосфолипидов цитоплазматической мембраны в секреции щелочной фосфатазы Escherichia coli»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Многие белки, синтезируемые в цитоплазме бактерий, для осуществления своих функций должны транслоцироваться через цитоплазматическую мембрану и занять определенное место в клеточной оболочке бактериальной клетки. В оболочке локализуются белки, участвующие в гидролизе, транспорте и катаболизме питательных веществ, в генерации энергии и анаболических процессах. Секреция или экспорт белков лежит в основе биогенеза надмолекулярных клеточных структур и осуществлении взаимодействия клетки с окружающей средой. Таким образом, без выяснения молекулярного механизма секреции белков невозможно решить многие проблемы клеточной биологии и биотехнологии.

Состояние проблемы. Интенсивные исследования секреции белков у бактерий в течение последних 10-15 лет позволили охарактеризовать основные этапы этого процесса. Белки, предназначенные для экспорта из цитоплазмы, синтезируются в виде предшественников, содержащих экспортные сигналы или сигнальные последовательности, отщепляемые после завершения транслокации. Именно в сигнальных последовательностях содержится информация о взаимодействии с мембраной и компонентами секреторного аппарата, осуществляющего перенос гидрофильной молекулы белка через гидрофобную мембрану. Секреторный аппарат Escherichia coli состоит из семи Sec белков (см. Wickner, Leonard, 1996). Этапы, осуществляемые секреторным аппаратом, включают в себя узнавание белков, предназначенных для экспорта, направление их к мембране и последующую транслокацию через нее.

В то же время, установить точный молекулярный механизм секреции белков нельзя без выяснения роли мембранных фосфолипидов, определяющих барьерные свойства биологических мембран. С другой стороны, структурная, метаболическая и механическая динамичность фосфолипидов может способствовать транслокации белка через мембрану.

На основе данных о корреляции секреции белка с изменениями состава и обмена фосфолипидов (Евдокимова, Несмеянова, 1977; Землянухина и др., 1981), в нашей лаборатории была впервые предложена модель вовлечения фосфолипидов в этот процесс (Nesmeyanova, 1982). Модель предусматривала прямое взаимодействие белков-предшественников с анионными фосфолипидами с участием положительно заряженных аминокислот N-конца сигнального пептида и зрелой полипептидной цепи. В настоящее время показано, что анионные фосфолипиды, составляющие всего 20% фосфолипидов мембран, абсолютно необходимы для встраивания сигнальных пептидов в модельные липидные мембраны (Demel et al., 1990), эффективной транслокации белка в мембранные везикулы in vitro (Küsters et al., 1991; Küsters et al., 1994) и функционирования отдельных компонентов секреторной машины (Lill et al., 1990). Однако, до сих пор не было получено доказательств непосредственного взаимодействия сехретируемого белка с анионными фосфолипидами in vivo.

Целью данной работы было изучение роли положительно заряженных аминокислотных остатков щелочной фосфатазы E.coli в транслокации этого белка через мембрану и во взаимодействии с анионными фосфолипидами. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1) получить мутантные формы щелочной фосфатазы с заменами положительно заряженных аминокислот, предположительно участвующих во взаимодействии с анионными фосфолипидами;

2) изучить влияние этих замен на эффективность транслокации белка in vivo;

3) изучить особенности взаимодействия мутантных белков с фосфолипидами in vivo и in vitro;

4) провести стереохимический анализ взаимодействия сигнального пептида природной щелочной фосфатазы и ее мутантных форм с анионными фосфолипидами.

Научная новизна работы: Впервые показано прямое взаимодействие секретируемого белка с анионными фосфолипидами в живой бактериальной клетке в процессе транслокации белка через цитоплазматическую мембрану. Более того, обнаружено, что изменения структуры белка или фосфолипидов, нарушающие это взаимодействие, приводят как к снижению эффективности транслокации белка через мембрану in vivo, так и к снижению эффективности встраивания сигнальной последовательности в модельные фосфолипидные мембраны in vitro. Совокупность полученных в работе данных позволяет с большой долей уверенности утверждать, что роль положительно заряженного аминокислотного остатка в N-концевом домене сигнального пептида заключается в обеспечении стабильности комплекса "сигнальный пептид - анионный фосфолипид", необходимой для эффективной инициации секреции белка.

Научно-практическое значение работы: Научно-практическое значение работы состоит в том, что в ней получены результаты, углубляющие понимание механизма секреции белков у бактерий. Выявленные в работе закономерности могут использоваться в качестве теоретических основ для разработки путей оптимизации секреции гомологичных и гетерологичных белков клетками микроорганизмов, широко применяемой для получения полипептидов, необходимых в медицине и народном хозяйстве.

Научно-методическое значение работы заключается в том, что в ней применен новый способ получения мутантных форм щелочной фосфатазы E.coli. Для этого разработан простой метод введения мутаций в ген phoA, позволяющий избежать этап гибридизации с меченным мутагенным олигонуклеотидом и вести прямой отбор мутантных клонов по окраске на чашке с субстратом щелочной фосфатазы. Кроме того, предложен новый удобный способ сравнительной оценки содержания фосфатидилглицерина в цитоплазматической мембране E.coli.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ СЕКРЕТОРНОГО ПРОЦЕССА У БАКТЕРИЙ

Одним из центральных процессов жизнедеятельности бактериальной клетки является секреция белков в различные клеточные компартменты. В грам-отрицательных бактериях белки должны экспортироваться в три основных компартмента клеточной оболочки: цитоплазматическую мембрану, периплазматическое пространство и внешнюю мембрану. Начальные стадии экспорта всех белков, а именно - встраивание в и перенос через цитоплазматическую мембрану, происходят по общему механизму. Этот процесс оказался консервативным среди бактериальных видов, причем грам-положительные бактерии и архебактерии применяют одинаковый клеточный аппарат для секреции белков. Более того, основным компонентам экспортной машины, локализованным в цитоплазматической мембране бактерий, соответствуют гомологи в эукариотических клетках. От дрожжей Saccharomyces cerevisae до микросом поджелудочной железы собаки, транслокационный аппарат в мембране эндоплазматического ретикулума включает гомологи, по крайней мере, двух компонентов секреторной машины прокариот (Hartmann et al, 1994). Секреторный аппарат Escherichia coli включает цитоплазматические шаперонины: белки SecB, GroEL/ES, DnaK и другие, мембранный комплекс SecY/E/G/D/F/YajC, транслокационную АТФ-азу белок SecA и анионные фосфолипиды (Wickner, Leonard, 1996).

Экспорт белков включает в себя следующие основные этапы. Белки, предназначенные для клеточной оболочки, синтезируются с экспортными сигналами или сигнальными последовательностями (СП). В случае периплазматических белков или белков внешней мембраны, эти сигнальные последовательности расположены на N-конце и отщепляются от белка во время транслокации через цитоплазматическую мембрану. В случае белков цитоплазматической мембраны, эти сигналы обычно не отщепляются. У этого класса белков сигнальные последовательности могут располагаться на N-конце

или внутри белка и могут служить одновременно и экспортными сигналами и мембранными доменами в "собранном" белке. Сигнальные последовательности узнаются внутри клетки экспортным аппаратом. Это узнавание происходит еще до завершения трансляции белка, хотя транслокация через мембрану не полностью сопряжена с трансляцией. По-видимому, экспорт белка начинается только после синтеза значительной части полипептидной цепи (Randall, 1983). Более того, в некоторых случаях транслокацию белка можно наблюдать после завершения его трансляции и освобождения из рибосомы (Lee, Beckwith, 1986). Этот посттрансляционный экспорт наблюдается при каких-либо нарушениях экспорта, например, при снижении эффективности сигнальной последовательности из-за мутации. В противоположность этому, секреция белка в эукариотических клетках тесно сопряжена с трансляцией.

1.1. Секреторный аппарат E.coli.

Этапы, осуществляемые секреторным аппаратом, включают в себя узнавание белков, предназначенных для экспорта, направление их к мембране и последующую транслокацию через нее. Экспортный аппарат E.coli (табл. 1) был охарактеризован, в основном, благодаря генетическим исследованиям, а его функционирование изучалось с помощью комбинации генетических и биохимических подходов, а также при реконструкции процесса секреции in vitro (Bieker et al, 1990; Schatz, Beckwith, 1990; Wickner et cd., 1991).

1.1.1. Цитоплазматические факторы секреции.

SecB. Белок SecB, функционирующий в виде тетрамера (Watanabe, Blobel, 1989b), необходим для поддержания транслокационно-компетентной "развернутой" конформации некоторых секретируемых белков (Kumamoto, Beckwith, 1985). Показано, что SecB взаимодействует с заряженными участками белка-предшественника, благодаря чему наружу экспонируются гидрофобные участки белка (Randall, 1992; Topping, Randall, 1994). Вторая

11

Таблица 1

Генетические локусы, вовлеченные в экспорт белков у Е.сой

Ген (расположение) Белок, размер, субклеточная локализация Существенность Количество молекул белка в клетке*

secA (2.5 мин) SecA, 102 кДа, периферический цитоплазматической мембраны, цитоплазма Да 2500-5000

secB (81 мин) SecB, 16.6 кДа, цитоплазма Нет -

secY-prlA (72 мин) SecY, 49 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Да 300-600

secE (89 мин) SecE, 13.6 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Да 200-400

secD (9.5 мин) SecD, 67 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Нет 7-30

secF (9.5 мин) SecF, 35 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Нет 7-30

secG (69 мин) SecG (р12, полоса 1), 11.4 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Нет

ïfs 4.5 S РНК, цитоплазма Нет -

ffh Fifa, 48 кДа, цитоплазма Нет -

ftsY FtsY, 48 кДа, цитоплазма Нет •

lepB (55.5 мин) Lep, 36 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Да -

IspA (0.5 мин) Lsp, 18 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Да -

*Г1о Driessen. 1994

предполагаемая функция БесВ заключается в направлении белков к мембране, где расположена так называемая АТФ-зависимая транслоказа (см. ниже) (НоЙзс1ш11е г1 а1., 1994). Определенно известно, что при отсутствии БесВ даже развернутый предшественник мальтозосвязывающего белка экспортируется значительно менее эффективно, чем в его присутствии (СоШег, ВаэзГогс!, 1989).

Секреция щелочной фосфатазы (РЬоА), которая обычно не зависит от БесВ, может, при определенных условиях, становиться БесВ-зависимой. Так, например, при низкой температуре (Кшика\уа а1., 1989) или при секреции

щелочной фосфатазы, лишенной сигнального пептида, в prlA мутантах (Derman et al., 1993), отсутствие SecB существенно лимитирует транслокацию этого фермента. В этих условиях, по-видимому, PhoA сворачивается в цитоплазме более интенсивно из-за низкой температуры или вследствие более продолжительного пребывания в цитоплазме. Таким образом, если в обычных условиях присутствие SecB не требуется, то в некоторых случаях активность SecB может быть необходимой.

Несмотря на то, что SecB является пока единственным шапероном, необходимым для экспорта нескольких белков, вполне возможно, что определенные SecB-независимые белки могут использовать другой шаперон. Например, мутации в генах комплекса шаперонов GroEL-GroES оказывают существенное влияние на экспорт ß-лактамазы в периплазму (Kusukawa et al., 1989).

Аналог SRP-частицы. В эукариотических клетках содержится комплекс белков и 7S РНК, известный как сигнал-узнающая частица (SRP) (см. Rapoport, 1991). Этот комплекс узнает сигнальные последовательности синтезируемых белков с помощью входящего в его состав белка SRP54 и поддерживает белки-предшественники в компетентной для экспорта конформации. В E.coli обнаружены гомологи SRP54 и 7S РНК, белок Ffh (Р48) и 4.5S РНК, соответственно, а также аналог эукариотического SRP-рецептора, белок FtsY, что позволило выдвинуть предположение о том, что они осуществляют функцию, подобную своим эукариотическим аналогам (Hartl, Wiedmann, 1993; Luirink et al., 1994; Ribes et al., 1990). В исследованиях in vitro было показано, что Ffh или 4.5S РНК из E.coli могут замещать SRP54 или 7S РНК, соответственно, в экспериментах по изучению каталитических свойств эукариотической SRP (Luirink ei al., 1992; Ribes et al., 1990; Powers, Walter, 1997). В физиологических исследованиях недостаток 4.5S РНК или белков Ffh и FtsY в E.coli приводят к накоплению предшественников ß-лактамазы, белка внешней мембраны OmpF и рибозосвязывающего белка, но не других белков-предшественников (Luirink et al., 1994; Phillips, Silhavy, 1992; Ribes et al., 1990).

Таким образом, SRP-частица и ее рецептор необходимы для эффективной транслокации некоторых белков E.coli.

1.1.2. Транслокационная АТФ-аза белок SecA.

Подобно белку SecB, SecA также очищен до гомогенного состояния (Cabelli et al., 1988; Cunningham et al., 1989) и поэтому очень интенсивно изучался с помощью биохимических методов. SecA является многофункциональным белком, существующим в виде гомодимера (Driessen, 1993) в двух субклеточных компартментах: цитоплазме и цитоплазматической мембране (Cabelli et al., 1991). Этот белок содержит домены, ответственные за связывание и гидролиз АТФ, взаимодействие с белками-предшественниками и за способность связываться с мембраной (см. Eichler, Wickner, 1997) (рис. 1). Центральная роль SecA в секреции белков подтверждается следующими фактами: 1) он способен взаимодействовать с предшественниками секретируемых белков; 2) он взаимодействует со многими белками секреторного аппарата; и 3) он необходим для транслокации как in vivo так и in vitro.

Домен SecA, отвечающий за связывание предшественника, был установлен с помощью химической сшивки и соответствует аминокислотным остаткам с 267-го по 340-ой (Kimura et al., 1991) (рис. 1).

Взаимодействие SecA с цитоплазматическим шапероном SecB было показано in vitro (Hartl et al., 1990). Однако, хотя сродство SecA к SecB и оказалось достаточно специфичным, оно было довольно низким. Их сродство

сайт связывания белка-предшественника

НСД1 I

сайт связывания липидов и SecB

НСД2

N-

65-кДа -N-концевой домен

_ 1

-Г.-

3 0-кДа

С

Рис. 1. Расположение доменов SecA белка. НСД1, НСД2 - нуклеотид-связывающие домены.

возрастает при добавлении предшественника, но не ясно, происходит ли это за счет способности SecB поддерживать предшественник в состоянии, более благоприятном для связывания с SecA, или за счет предложенного непосредственного взаимодействия SecB с SecA (Hartl et al., 1990). Оба варианта могут приводить к образованию тройного комплекса SecA-SecB-предшественник.

Анализ АТФазных активностей SecA с помощью направленного мутагенеза выявил, что SecA обладает двумя АТФ-связывающими сайтами: НСД1 и НСД2 (рис. 1), один из них характеризуется высоким, а другой -низким сродством к АТФ, соответственно (Matsuyama et al., 1990а; Mitchell, Oliver, 1993). АТФазная активность SecA оказалась необходимой для транслокации белков-предшественников через цитоплазматическую мембрану, и поэтому белок SecA был назван "транслокационной АТФазой" (Cunningham, Wickner, 1989; Uli et al., 1989).

1.1.3. Мембранная часть транслокационного аппарата.

Мембранный компонент транслокационного аппарата состоит из шести интегральных белков цитоплазматичесхой мембраны: пяти Sec белков - SecY, SecE, SecG, SecD и SecF, и белка YajC, входящего в состав secD оперона. Белки SecY и SecE являются основными компонентами транслоказы. Только их присутствие в протеолипосомах достаточно для связывания и встраивания SecA, его активации как АТФазы и, в определенной степени, для транслокации белка-предшественника внутрь протеолипосомы (Duong, Wickner, 1997а). Однако, транслокация в этом случае очень неэффективна и приводит к значительному гидролизу АТФ без пропорционального увеличения количества транслоцированного белка (Kawasaki et al1993). Для более эффективной транслокации белка требуется наличие SecG (Hanada et al., 1994) или белков secD оперона - SecD, SecF и YajC (Duong, Wickner, 1997a), хотя их роль в транслокации еще до конца не выяснена.

SecY. SecY - большой интегральный белок цитоплазматической мембраны, существенно важный для экспорта белков in vitro (Nishiyama et al., 1991). Поскольку SecY пересекает мембрану 10 раз (Akiyama, Ito, 1987), предположили, что этот белок может формировать, сам по себе или вместе с другими компонентами секреторного аппарата, пору, через которую проходит транслоцирующийся белок (Akiyama, Ito, 1987; Joly, Wickner, 1993). Биохимические, физиологические и генетические исследования свидетельствуют о том, что SecY взаимодействует с несколькими компонентами секреторного аппарата, формируя рецептор в цитоплазматической мембране, с которым SecA связывается с высокой афинностью. Было показано, что SecA защищает SecY от протеолиза in vitro (Haiti et al., 1990). Нарушения, вызванные температуро-чувствительной мутацией в SecY, можно супрессировать in vitro с помощью добавления избытка SecA (Fandl et al., 1988). С другой стороны, антитела, специфичные к цитоплазматическим эпитопам SecY, могут блокировать связывание SecA (Hartl et al, 1990) и предшественников (Watanabe, Blobel, 1989a) с мембранными везикулами.

Транслоцирующиеся белки-предшественники можно связать с SecY с помощью химической сшивки на поздних стадиях транслокации (Joly, Wickner, 1993). Однако, пока не ясно, взаимодействуют ли сигнальные последовательности белков-предшественников с SecY при инициации транслокации. Существование prlA мутаций в secY, восстанавливающих экспорт белков с нарушенными сигнальными последовательностями, свидетельствует о возможности такого взаимодействия (Emr et al., 1981). По-видимому, SecY может распознавать функциональные СП и позволяет белкам, присоединенным к ним, экспортироваться. prlA мутации изменяют или нарушают эту способность таким образом, что белки с измененными СП продуктивно экспортируются.

SecE. В дополнение к белку SecY, белок цитоплазматической мембраны SecE является частью кора транслокационного аппарата. Он пронизывает

цитоплазматическую мембрану три раза (Schatz et al., 1989). SecE не только необходим для транслокации in vitro (Tokuda et al., 1991), но и существенно важен in vivo для выживания клеток и секреции белков (Schatz et al., 1989). Мутации, изменяющие аминокислотные остатки 3-го мембранного домена, позволяют экспортироваться белкам с мутант] 1ыми СП (Stader et al., 1989), свидетельствуя о том, что SecE может влиять на "цензорскую" функцию SecY (Osborne, Silhavy, 1993).

Детальный мутационный анализ SecE позволил установить, что его небольшая часть, содержащая только 3-ий мембранный домен, С-концевой периплазматический домен и часть второй цитоплазматической петли, может комплементировать SecE in vivo (Schatz et al., 1991). Гомологи SecE в других бактериях и эукариотах, обнаруженные на сегодняшний день, содержат только домены, соответствующие этим трем участкам SecE (Hartmann et al., 1994). 3-ий мембранный домен можно заменить на гетерологичный мембранный сегмент без потери функции SecE, поэтому единственная существенная часть этого белка находится во второй цитоплазматической петле (Murphy, Beckwith, 1994). Аминокислотные остатки в этом домене SecE проявляют консервативность среди эубактерий, что свидетельствует об их важной роли в секреции белка (Hartmann et al, 1994; Murphy, Beckwith, 1994). Возможная роль SecE в секреции заключается в его участии в формировании "транслокационной поры", или в привлечении других факторов или белков, необходимых для секреции, к месту транслокации посредством взаимодействий в цитоплазме (Murphy, Beckwith, 1994).

Белок SecG, первоначально названный "полосой 1" или "р12", идентифицирован как белок, который выделялся из цитоплазматической мембраны вместе с комплексом SecY/SecE (Brundage et al., 1992; Nishiyama et al., 1993). Последовательность гена secG свидетельствует о том, что SecG является белком цитоплазматической мембраны, пронизывающим ее два или три раза (Nishiyama et al, 1993). В системе транслокации в мембранные везикулы in vitro, реконструированной с белками SecE и SecY, добавление

SecG стимулирует транслокацию в 20 раз (Nishiyama et al, 1993). Этот эффект удивителен в свете данных о несущественности SecG in vivo при 37°С (Nishiyama et al, 1994).

SecD, SecF и YajC - белки цитоплазматической мембраны, которые, в отличие от белков SecY, SecE и SecG, имеют большие гидрофильные домены, локализованные в периплазме (Gardel et al, 1990; Pogliano, Beckwith, 1994a). Совместная суперпродукция SecD и SecF приводит к супрессии дефектов в СП и даже к более эффективному экспорту белков в клетках природного типа (Pogliano, Beckwith, 1994b). Хромосомальная делеция генов, кодирующих SecD и SecF, или снижение количества этих белков в клетке, приводят к серьезным нарушениям в секреции, хотя подобные штаммы выживают при определенных условиях (Pogliano, Beckwith, 1994b), и нарушения секреции не такие серьезные, как при недостатке SecE. Подобные нарушения секреции проявляются, когда инактивирован либо SecD, либо SecF, либо они оба, что указывает на их возможное совместное функционирование в виде комплекса (Pogliano, Beckwith, 1994b). При выделении этого комплекса обнаружили, что в его состав также входит белок YajC (Duong, Wickner, 1997а). Является ли этот предполагаемый комплекс частью комплекса SecY/E/G, остается неясным. Количество SecD, SecF и YajC в клетке оценивается как в 10 раз меньшее, чем уровень SecE, SecY и SecG, и совместная очистка этих белков осуществима только в определенных условиях (Duong, Wickner, 1997а). Совокупность данных свидетельствует о каталитической роли SecD/F/YajC, но не исключает возможности того, что они образуют временный или нестехиометрический комплекс с SecE и SecY.

Несколько возможных механизмов функционирования SecD/F/YajC были предложены на основе исследований in vivo. Мицушима с соавторами показали, что высвобождение зрелых секретируемых белков ингибируется при обработке сферопластов, компетентных для транслокации, антителами к периплазматической части SecD (Matsuyama et al, 1993). Они обнаружили, что в этих условиях зрелый мальтозо-связывающий белок был чувствителен к

добавленной протеазе, в то время как в случае необработанных сферопластов, он сворачивался в растворимую, устойчивую к протеазе форму. Указанные результаты свидетельствуют, что SecD может принимать участие в сворачивании и/или высвобождении белка из цитоплазматической мембраны или секреторного аппарата. Альтернативное предположение заключается в том, что комплекс SecD/F/YajC обеспечивает энергизированное состояние мембраны. Арковитц и Викнер обнаружили нарушение, хотя и умеренное, способности поддерживать электрохимический градиент (Ар.н+) в клетках с пониженным уровнем SecD и SecF (Arkowitz, Wickner, 1994). И наконец, в лаборатории Викнера обнаружили, что SecD/F/YajC стабилизирует встраивание белка SecA в мембрану (Duong, Wickner, 1997а; Economou et al., 1995), а также замедляет движение белка-предшественника при пересечении мембраны как в прямом, так и в обратном направлении (Duong, Wickner, 1997b).

До сих пор нет убедительных доказательств необходимости SecD/F/YajC для транслокации белка in vitro, хотя их влияние можно наблюдать при отсутствии протондвижущей силы, в зависимости от исследуемого белка-предшественника (Arkowitz, Wickner, 1994). Расхождения ме'жду результатами, полученными при исследованиях in vivo и in vitro, можно объяснить как особенностями комплекса SecD/F/YajC, так и самой системы in vitro. В такой системе можно оценивать транслокацию белков-предшественников в везикулы только по отщеплению СП и приобретению ими устойчивости к добавленной протеазе. В подобных экспериментах нельзя изучить стадию или стадии, наблюдаемые после пересечения белком мембраны, например, сворачивание бежа или высвобождение его из мембранного сайта транслокации. Кроме того, SecD/F/YajC может отвечать за координацию между АТФ- и Лр.н+-движимой транслокацией и, таким образом, снижать количество гидролизуемого АТФ в рассчете на одну транслоцируемую молекулу белка.

1.1.4. Сигнальные пептидазы.

После пересечения цитоплазматической мембраны белком-предшественником, предназначенным для периплазмы или внешней мембраны, происходит так называемый процессинг - отщепление сигнальной последовательности белка с помощью специфических сигнальных пептидаз. В E.coli существует две протеазы подобного рода. Одна из них, LspA, процессирует только пролипопротеины (Yamagata et al., 1983). Другая, Lep, действует на предшественники всех остальных белков клеточной оболочки, содержащие отщепляемые СП (Dalbey, von Heijne, 1992). Последняя была объектом интенсивных топологических (San Millan et al., 1989; Wolfe et al., 1983) и структурно-функциональных (Bilgin et al., 1990) исследований и изучена более детально (Shen et al., 1991). Она заякорена в цитоплазматической мембране с помощью двух трансмембранных доменов (Wolfe et al., 1983). Ее активный центр находится в периплазме (Bilgin et al., 1990; Tschantz et al., 1993). Мутационный анализ свидетельствует, что Lep и ее гомологи составляют новый класс сериновых протеаз. Несмотря на то, что отщепляемые СП не содержат консервативной последовательности аминокислот, они обладают определенными особенностями, существенно важными для узнавания в качестве субстрата сигнальной пептидазы. Эффективно отщепляемые СП содержат небольшие аминокислотные остатки в положениях -1 и -3 и остаток, нарушающий а-спираль вблизи положения -6 (Shen et al., 1991). После отщепления от белка-предшественника, СП разрушаются до отдельных аминокислот различными протеазами. Полагают, что протеаза IV, расположенная в цитоплазматической мембране, и цитоплазматический фермент олигопептидаза А участвуют в этом процессе (Ichihara et al., 1984; Novak, Dev, 1988; Suzuki et al., 1987). Тем не менее, до сих пор не известно, существуют ли специфические протеазы для деградации СП, или несколько неспецифических протеаз осуществляют эту функцию в клетке.

1.1.5. Каталитический цикл транслоказы белков-предшественников.

Одна из современных рабочих моделей функционирования белков транслокационного аппарата E.coli представлена на рисунке 2. Появляющаяся из рибосомы полипептидная цепь синтезируемого белка-предшественника взаимодействует с шапероном(ами). Ассоциированные с рибосомой шапероны, SRP и триггерный фактор (Lili et al., 1988), конкурируют за связывание с синтезируемой цепью, причем SRP обладает большим сродством к гидрофобным СП белков-предшественников. Дальнейшее связывание с цитоплазматическими шаперонами, такими как SecB, предотвращает преждевременное сворачивание или агрегацию предшественников, а также способствует взаимодействию секретируемого белка с находящейся в мембране транслоказой, благодаря сродству SecB к периферической субъединице транслоказы - белку SecA.

SecA присутствует в клетке в стехиометрическом избытке по сравнению с интегральным доменом SecYEGDFyajC (Matsuyama et al., 1992). Он может

Рис. 2. Каталитический цикл транслоказы белков-предшественников.

(Wickner, Leonard, 1996), объяснения в тексте.

связываться с липидными низкоафинными сайтами (Lill et al., 1990), но функционально и с высокой афинностью связывается только с тем местом мембраны, где расположен комплекс SecYEGDFyajC и анионные фосфолипиды (Douville et al., 1995) (стадия 1 на рис. 2). Это связывание активирует SecA как рецептор для узнавания комплекса SecB-предшественник и как фермент для связывания и гидролиза АТФ. Взаимодействие SecA с комплексом SecB-предшественник (стадия 2 на рис. 2) вызывает конформационные изменения, способствующие обмену нуклеотидов в нуклеотид-связывающих доменах (НСД) SecA: АТФ заменяет АДФ в НСД1 (стадия 3 на рис. 2). Связывание АТФ с НСД1 приводит к глубокому встраиванию SecA в мембрану вблизи с SecYEG (стадия 4 на рис. 2). Поскольку SecA содержит сайт связывания зрелой части предшественника, вместе с ним встраивается в мембрану 20-30 аминокислотных остатков белка-предшественника. Уже на этой стадии может происходить отщепление СП с помощью сигнальной пептидазы (на рисунке 2 не показано). Встраивание SecA в мембрану сопровождается инверсией топологии SecG (Nishiyama et al., 1996) (на рис. 2 отражено в виде перевернутого "G"). Взаимодействие с белками SecD, SecF и YajC стабилизирует встраивание SecA в мембрану. Кроме этого, SecD/F/YajC, вероятно, предотвращает утечку ионов через открытую пору транслоказы, что необходимо для поддержания стабильного трансмембранного потенциала. Гидролиз АТФ в НСД1 инициирует диссоциацию транслоцировавшихся участков предшественника и SecA, а также высвобождение SecA из мембраны (стадия 5 на рис. 2). В момент высвобождения SecA из мембраны необходимо присутствие SecD/F/YajC, чтобы "удержать" предшественник в мембране, иначе он частично высвобождается вместе с SecA (Duong, Wickner, 1997b). Затем происходит быстрая потенциал-зависимая транслокация доменов белка-предшественника, не связанных с SecA. Гидролиз АТФ в НСД2 не является необходимым условием для встраивания или высвобождения SecA из мембраны (Economou et al., 1995), но требуется для процесса транслокации в целом (Mitchell, Oliver,

1993). Очередной домен транспонируемого белка может снова связаться с периферическим SecA-ДЦФ и цикл повторяется.

Этот необычный, подобный работе швейной машины, механизм действия транслоказы подтверждается тремя независимыми наблюдениями. Учида с соавторами (Uchida et al., 1995) показали, что транслокация предшественника белка внешней мембраны ОтрА происходит в виде "шагов" приблизительно в 25 аминокислотных остатков, а не один или несколько остатков за один раз. Такой "ступенчатый" характер транслокации определяется расположением коротких гидрофобных участков в зрелой части белка-предшественника, причем белок SecA контактирует с этими гидрофобными сегментами (Sato et al., 1997). Эта модель согласуется также с исследованиями Джоли с соавторами (Joly, Wickner, 1993), которые обнаружили, что транслоцирующийся белок-предшественник находится в тесном контакте с белками SecA и SecY. И наконец, было показано, что инверсия топологии SecG зависит от присутствия АТФ и белка-предшественника таким же образом, как и встраивание SecA, а для восстановления первоначальной ориентации SecG требовались факторы, инициировавшие высвобождение SecA из мембраны (NishiyaJna et al., 1996).

Одним из открытых до настоящего времени вопросов остается роль электрохимического градиента (Ацн+) в процессе экспорта белков. Хотя направляемая SecA и АТФ транслокация белка-предшественника может происходить и при отсутствии Ajuh+ (Tani et al., 1989), эффективность транслокации значительно повышается при возникновении Ар.н+ (Geller et al., 1986). Если транслокация может происходить при отсутствии Ацн+, тогда какую роль играет эта форма энергии в обеспечении секреции? Одно из предположений заключается в том, что мембранный потенциал, один из компонентов Дцн+, вносит прямой вклад в механическое движение путем воздействия на заряженные части белка-предшественника электрофоретическим образом. Однако, Като с соавторами показали, что модельный белок, лишенный заряженных остатков, эффективно

транслоцировался в мембранные везикулы Дцн+-зависимым образом (Как> et а1., 1992). Второе возможное объяснение состоит в том, что Дцн+ влияет на направление транслокации белка (БсЫеЬе! а1., 1991). В подтверждение этого предположения, было показано, что изменение направления Дин+ в везикулах приводило к изменению направления транслокации белков-предшественников, встроенных в секреторный аппарат (Впеззеп, 1992). Таким образом, гидролиз АТФ, осуществляемый 8есА, высвобождает транслоцирующийся белок, и на этой стадии Дцн+ воздействует либо на белок, либо на транслокационный аппарат таким образом, что происходит продвижение порции белка-предшественника через цитоплазматическую мембрану по направлению к периплазме.

1.2. Особенности первичной структуры секретируемых белков.

1.2.1. Сигнальные последовательности.

Основной особенностью всех экспортируемых белков является наличие сигнальной последовательности. Отщепляемую СП на 1М-конце белка-предшественника принято называть сигнальным пептидом. При отсутствии общей гомологии, СП обладают несколькими характерными особенностями (уоп Нецпе, 1990) (рис. 3). У Е.соИ их длина варьирует от 18 до 30 аминокислот. Они имеют один или больше положительно заряженных аминокислотных остатков около 1Ч-конца, центральную гидрофобную область из семи или более остатков и гидрофильный С-конец, содержащий

Сигнальный пептид

Сайт процессинга

Зрелый белок

гидрофобная область

Рис. 3. Структура канонического сигнального пептида.

последовательность, узнаваемую сигнальной пептидазой. Подробный мутационный анализ СП позволил установить необходимость сохранения характерных особенностей его структуры для эффективного функционирования. Мутации в гидрофобной области, снижающие ее гидрофобность, приводят к серьезным нарушениям экспорта. Например, замена гидрофобной аминокислоты на заряженную, такую как аргинин, может снизить экспорт в 100 раз (Michaelis et al., 1983b). Во-вторых, полное удаление положительно заряженных аминокислот N-концевого домена СП, хотя и оказывает гораздо меньшее влияние на экспорт, может значительно снизить его эффективность (Bosch et al., 1989; Tanji et al., 1991; Vlasuk et al., 1983). И наконец, замены аминокислот, составляющих сайт узнавания сигнальной пептидазой, могут нарушать отщепление СП, но они не влияют на процесс транслокации зрелой части белка-предшественника через мембрану (Вагкосу-Gallagher, Bassford, 1992; Fikes, Bassford, 1987). Кроме этого, как генетические, так и проведенные in vitro эксперименты указывают на то, что в дополнение к гидрофобной природе, способность приобретать а-спиральную конформацию является необходимой особенностью гидрофобной области СП (Briggs et al., 1986; Emr, Silhavy, 1983).

Сигнальные последовательности, по-видимому, выполняют несколько функций. Прежде всего, СП может замедлять сворачивание белков-предшественников, поддерживая их в транслокационно-компетентной конформации более длительное время. Исследования in vitro показали, что такое замедление действительно происходит (Liu et al., 1989). Гидрофобная природа СП привела к предположению, что он осуществляет свою роль путем встраивания в липидный бислой (Blobel, Dobberstein, 1975), а положительный заряд N-концевого домена необходим для взаимодействия с отрицательно заряженными головками анионных фосфолипидов (Nesmeyanova, 1982) (см. главу 2). Встраивание изолированных СП в модельные липидные мембраны действительно происходит (см. раздел 2.3). Кроме вышесказанного, наличие функционального СП может быть необходимым условием узнавания белков-

предшественников цитоплазматическими или мембранными компонентами транслокационного аппарата (Akita et al., 1990; Lill et al., 1990; Osborne, Silhavy, 1993). И наконец, предполагается, что СП может "открывать" белковую пору в мембране, через которую затем транслоцируется зрелая часть белка-предшественника (Simon, Blobel, 1992).

1.2.2. Особенности структуры зрелой части экспортируемых белков.

Как уже упоминалось выше, существует прямая корреляция между скоростью сворачивания белка-предшественника и его способностью экспортироваться. Например, мутации, нарушающие сворачивание мальтозо- и рибозосвязывающего белков, придают этим белкам повышенную способность экспортироваться (Collier et al., 1989; Teschke et al., 1991). Мутации в СП этих белков могут супрессироваться мутациями по сворачиванию.

Таким образом, вероятно, белкам клеточной оболочки свойственно более медленное сворачивание, чем цитоплазматическим белкам. Это свойство может быть обусловлено: 1) упомянутым выше влиянием СП на сворачивание, 2) особенностями сворачивания самих экспортируемых белков, 3) "шаперонами", такими как SecB, ингибирующими сворачивание.

Если наличие СП достаточно для замедления сворачивания белка настолько, чтобы позволить его экспорт, означает ли это, что присоединение СП к любому белку (например, к обычному цитоплазматическому белку) приведет к его выводу из цитоплазмы? К сожалению, пока нет достаточных систематических исследований этого вопроса, чтобы дать однозначный ответ. Сообщения об экспорте цитоплазматических белков недостаточно многочисленны, чтобы делать строгие выводы (Maclntyre et al., 1987; Takahara et al., 1988). Эксперименты Беквита с соавторами на примере (3-галактозидазы и субъединицы триптофансинтазы, свидетельствуют о том, что цитоплазматические белки не обязательно хорошо экспортируются (Lee et al., 1989). Эффективность, с которой экспортируются цитоплазматические белки, может зависеть от длины полипептидной цепи (Blondel, Bedouelle, 1994; Lee et

al., 1989). Кажется вероятным, что сворачивание белков в их обычном окружении, цитоплазме, конкурирует с процессом экспорта. Если это так, то возможно, что кроме наличия СП существуют другие специфические особенности структуры экспортируемых белков-предшественников. Такой особенностью может быть скорость сворачивания внутренних участков белка. Однако попытки обнаружить какие-либо особенности (например, гидрофобность) аминокислотной последовательности экспортируемых белков по сравнению с цитоплазматическими белками, оказались неудачными.

В отличие от первичной структуры внутренних участков зрелых экспортируемых белков, структура их N-концевого домена, непосредственно примыкающего к СП, обладает одной характерной особенностью. Присутствие слишком большого числа положительно заряженных аминокислот в этом участке приводит к остановке транслокации белка (Boyd, Beckwith, 1990; Li et al., 1988; Yamane, Mizushima, 1988). Важным свойством оказалось также распределение зарядов вокруг СП: чем больше положительных зарядов на N-конце СП, тем меньшее влияние на экспорт оказывает наличие положительно заряженных аминокислот в начале зрелой последовательности (Puziss et al., 1992). В экспериментах фон Хейне показано, что влияние вставки шести остатков аргинина в зрелую часть белка уменьшается при увеличении расстояния от вставки до СП (в этом случае изучали мембранный белок) (Andersson, von Heijne, 1991). Было выдвинуто предположение, что соответствующее распределение зарядов вокруг СП необходимо для ее правильной ориентации в мембране (von Heijne, 1986а). Направление трансмембранного электрохимического градиента, также как и модель «петли СП», предполагающая положительно заряженный N-конец СП экспонированным в цитоплазму, а С-конец - в периплазму, находятся в соответствии с этим предположением. Действительно, снятие электрохимического градиента может ослаблять влияние неправильного распределения зарядов (Andersson, von Heijne, 1994). Подобное распределение зарядов было обнаружено и вокруг пронизывающих мембрану доменов

мембранных белков (Boyd, Beckwith, 1990; von Heijne, 1986b). Эксперименты с изменяемым составом фосфолипидов мембраны позволяют предположить, что влияние заряда зависит от природы липидов (анионных или нейтральных) (Küsters et al., 1991). Однако Андерсон и фон Хейне полагают, что именно взаимодействие с мембранным электрохимическим потенциалом ответственно за влияние заряженных аминокислот (Andersson, von Heijne, 1994).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Калинин, Андрей Евгеньевич

выводы

1. Показано, что замены аминокислот в N-концевом домене зрелой полипептидной цепи, изменяющие заряд этого домена, не влияют на эффективность секреции PhoA и обмен фосфолипидов в клетках, секретирующих мутантные формы PhoA.

2. Замены положительно заряженного лизина в N-конце сигнального пептида на незаряженный аланин или отрицательно заряженную глутаминовую кислоту снижают скорость транслокации prePhoA in vivo и ухудшают его взаимодействие с модельными липидными мембранами in vitro.

3. Эффективность взаимодействия prePhoA с модельными мембранами прямо пропорционально зависит от содержания анионных фосфолипидов в мембране.

4. Обнаружено прямое неопосредованное взаимодействие положительно заряженного Lys(-20) prePhoA с анионными фосфолипидами in vivo. Накопление анионных фосфолипидов в клетках Е. coli, вызванное "заякориванием" непроцессируемого мутантного prePhoA в цитоплазматической мембране, наблюдается только при наличии положительного заряда в N-концевом домене белка-предшественника.

5. В результате стереохимического анализа взаимодействия сигнального пептида prePhoA с молекулой анионного фосфолипида установлено, что остаток положительно заряженной аминокислоты в положении -20 prePhoA может участвовать в стабилизации комплекса "N-конец сигнального пептида -анионный фосфолипид", предположительно формируемого при инициации секреции.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что электростатическое взаимодействие сегрегируемого белка-предшественника с анионными фосфолипидами является одним из условий эффективной транслокации белка через цитоплазматическую мембрану E.coli.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Калинин, Андрей Евгеньевич, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Богданов М.В., Кулаев И.С., Несмеянова М.А. Изучение липид-белковых взаимодействий в процессе переноса белков через мембрану бактерий. I. Координированное подавление протонофором синтеза и секреции экзобелка и обмена фосфолипидов. - Биол. мембраны, 1984, т.1, с.495-502.

2. Богданов М.В., Несмеянова М.А. Энергизация мембраны в процессе секреции белков у грамотрицательных бактерий. - Докл. Акад. наук СССР, "Биохимия", 1986, т.288, с.1247-1250.

3. Богданов М.В., Сузина Н.Е., Несмеянова М.А. Особенности обмена фосфолипидов и ультраструктурной организации цитоплазматической мембраны E.coli в процессе секреции щелочной фосфатазы. - Биол. мембраны, 1985а, т.2, с.367-375.

4. Богданов М.В., Цфасман И.М., Несмеянова М.А. Изучение липид-белковых взаимодействий в процессе переноса белков через мембрану бактерий. II. Фосфолипиды в участке транслокации щелочной фосфатазы через мембрану E.coli. - Биол. мембраны, 19856, т.2, с.623-629.

5. Евдокимова O.A., Несмеянова М.А. Фосфолипидный состав клеток и мембран E.coli в условиях репрессии и дерепрессии биосинтеза щелочной фосфатазы. Биохимия. 1977, т.42, с. 1791-1799.

6. Зайцев E.H., Зайцева Е.М., Бахланова И.В., Горелов В.И., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Ланцов В.А. Клонирование и характеристика гена гесА из Pseudomonas aeruginosa. - Генетика, 1986, N11, с.2721-2727.

7. Землянухина O.A., Колычева В.В., Несмеянова М.А. Влияние липотропных агентов спиртов на биосинтез и репрессию секретируемой щелочной фосфатазы у E.coli. - Биохимия, 1981, т.46, е.92-99.

8. Карамышев А.Л., Шляпников М.Г., Хмельницкий М.И., Несмеянова М.А., Ксензенко В.Н. Изучение биогенеза и секреции щелочной фосфатазы и ее мутантных форм у E.coli. I. Введение направленных мутаций в ген щелочной фосфатазы. -Молекуляр. биология, 1994, т.28, с. 150-157.

9. Карамышева З.Н., Карамышев A.JL, Ксензенко В.Н., Несмеянова М.А. Анализ влияния замен Lys(-20) в сигнальном пептиде щелочной фосфатазы на секрецию этого фермента. - Биохимия, 1996, т.61, с.745-754.

10.Карамышева З.Н., Карамышев A.JI., Ксензенко В.Н., Шляпников М.Г., Каява A.B., Несмеянова М.А. Изучение биогенеза и секреции щелочной фосфатазы и ее мутантных форм у E.coli. IV. Замены аминокислот в С-концевом домене сигнального пептида щелочной фосфатазы влияют на эффективность процессинга этого белка. -Молекуляр. биология, 1997, т.31, с.917-923.

П.Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. - М.: Мир, 1976, 436 с.

12.Несмеянова М.А., Богданов М.В., Колот М.Н., Землянухина O.A., Кулаев И.С. Взаимодействие щелочной фосфатазы с кислыми фосфолипидами клеток E.coli и икусственных мембран. - Биохимия, 1982, т.47, с.671-677.

13.Несмеянова М.А., Евдокимова O.A. Фосфолипиды E.coli и активность щелочной фосфатазы. - Биохимия, 1979, т.44, с. 1512-1520.

М.Несмеянова М.А., Карамышев A.JL, Цфасман И.М., Федотикова Е.Т. Трансформация различных штаммов E.coli мультикопийными плазмидами с геном phoA приводит к секреции периплазматической щелочной фосфатазы в среду и накоплению ее предшественника. - Молекулярная биология, 1991, т.25, с.770-778.

15.Несмеянова М.А., Крупянко В.И., Калинин А.Е., Кадырова Л.Ю. Выделение и некоторые свойства мутантных щелочных фосфатаз E.coli. - Биохимия, 1996, т.61, с.89-99.

16.Цфасман И.М., Несмеянова М.А., Горбулев В., Рубцов П.М., Скрябин К.Г. Биосинтез и секреция гормона роста быка у Е. coli под контролем секреторного вектора, содержащего промотор и сигнальную последовательность гена щелочной фосфатазы. - Молекулярная биология, 1989, т.23, с.422-431.

17.Akita M., Sasaki S., Matsuyama S., Mizushima S. SecA interacts with secretory proteins by recognizing the positive charge at the amino terminus of the signal peptide in E. coli. - j. Biol. Chem., 1990, v.265, p.8164-8169.

18.Akiyama Y., Ito K. Topology analysis of the SecY protein, an integral membrane protein involved in protein export in E.coli. - EMBO J., 1987, v.6, p.3465-3470.

19.Ames G.F., Spudish E., Nicaido H. Lipids membrane of Salmonella typhimurium and Escherichia colt structure and metabolism. - J. Bacterid., 1968, v.95, p.833-843.

20.Andersson H., von Heijne G. A 30-residue-long "export initiation domain" adjacent to the signal sequence is critical for protein translocation across the inner membrane oiE.coli. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v.88, p.9751-9754.

21.Andersson H., von Heijne G. Membrane protein topology: effects of deltap.H+ on the translocation of charged residues explain the 'positive inside' rule. - EMBO J., 1994, v.13, p.2267-2272.

22.Arkowitz R.A., Wickner W. SecD and SecF are required for the proton electrochemical gradient stimulation of preprotein translocation. - EMBO J., 1994, v.13, p.954-963.

23.Bachmann B.J. Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E.coli K12. - In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and molecular biology (F.C. Neidhardt, ed.), American Society for Microbiology, Washington, 1987, p.1190-1219.

24.Barkocy-Gallagher G.A., Bassford P.J., Jr. Synthesis of precursor maltose-binding protein with proline in the +1 position of the cleavage site interferes with the activity of E.coli signal peptidase I in vivo. - J. Biol. Chem., 1992, v.267, p.1231-1238.

25.Batenburg A.M., Demel R.A., Verkleij A.J., de Kruijff B. Penetration of the signal sequence of E.coli PhoE protein into phospholipid model membranes leads to lipid-specific changes in signal peptide structure and alterations of lipid organization. -Biochemistry, 1988, v.27, p.5678-5685.

26.Beacham I.R., Taylor N.S., Youell M. Enzyme secretion in E.coli: synthesis of alkaline phosphatase and acid hexose phosphatase in the absence of phospholipid synthesis. - J. Bacterid., 1976, v. 128, p.522-527.

27.Bieker K.L., Phillips G.J., Silhavy T.J. The sec and prl genes of E.coli. - J. Bioenerg. Biomembr., 1990, v.22, p.291-310.

28.Bilgin N., Lee J.N., Zhu H.-Y, Dalbey R., von Heijne G. Mapping of catalitically important domains in E.coli leader peptidase. - EMBO J., 1990, v.9, p.2712-2722.

29.Blobel G., Dobberstein B. Transfer of proteins across membranes. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. - J. Cell. Biol., 1975, v.67, p.835-851.

30.Blondel A., Bedouelle H. Export and purification of a cytoplasmic dimeric protein of fusion to the maltose-binding protein of E.coli. - Eur. J. Biochem., 1994, v.193, p.325-330.

31.Bosch D., Boer P., Bitter W., Tommasen J. The role of the positively charged N-terminus of the signal sequence of E.coli outer membrane protein PhoE in export. -Biochim. Biophys. Acta, 1989, v.979, p.69-76.

32.Boyd D., Beckwith J. The role of charged amino acids in the localization of secreted and membrane proteins. - Cell, 1990, v.62, p. 1031-1033.

33.Boyd D., Guan C.-D., Willard S., Wright W., Strauch K., Beckwith J. Enzymatic activity of alkaline phosphatase precursor depends on its cellular location. - In: Phosphate metabolism and cellular regulation in microorganisms (Torriani-Gorini A., Rothman F.G., Silver S., Wright A., Yagil E., eds.), American society for microbiology, Washington, D.C., 1987, p.89-93.

34.Breukink E., Demel R.A., De Korte-Kool G., de Kruijff B. SecA insertion into phospholipids is stimulated by negatively charged lipids and inhibited by ATP: a monolayer study. - Biochemistry, 1992, v.31, p. 1119-1124.

35.Briggs M.S., Cornell R.G., Dluhy R.A., Gierasch L.M. Conformations of signal peptides induced by lipids suggest initial steps in protein export. - Science, 1986, v.233, p.206-208.

36.Brundage L., Fimmel C.J., Mizushima S., Wickner W. SecY, SecE, and Band 1 form the membrane-embedded domain of E.coli preprotein translocase. - J. Biol. Chem., 1992, v.267, p.4166-4170.

37.Brunger, A.T. X-PLOR, Version 3.1,1992, Yale University Press, New Haven.

38.Brunner J. - New photolabeling and crosslinking methods. In: Photochemical labeling, 1993, p.483-514.

39.Cabelli R.J., Chen L., Tai P.C., Oliver D.B. SecA protein is required for secretory protein translocation into E.coli membrane vesicles. - Cell, 1988, v.55, p.683-692.

40.Cabelli R.J., Dolan K.M., Qian L., Oliver D.B. Characterization of membrane-associated and soluble states of SecA protein from wild-type and SecA51(TS) mutant strains of E.coli. - J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.24420-24427.

41.Cashman J.S., Webster R.E. Effect of cessation of phospholipid synthesis on the synthesis of a specific membrane-associated bacteriophage protein in E.coli. - J. Bacterid, 1977, v. 129, p. 1245-1249.

42.Chamberlain B.K., Webster R.E. Lipid-protein interactions in E.coli. Membrane-associated fl bacteriophage coat protein and phospholipid metabolism. - J. Biol. Chem., 1976, v.251, p.7739-7745.

43.Chang C.N., Inouye H., Model P., Beckwith J. Processing of alkaline phosphatase precursor to the mature enzyme by on E.coli inner membrane preparation. - J. Bacterid., 1980, v. 142, p.726-728.

44.Collier D.N., Bassford P.J., Jr. Mutations that improve export of maltose-binding protein in SecB" cells of E.coli. - J. Bacteriol., 1989, v.171, p.4640-4647.

45.Cornell D.G., Dluhy R.A., Briggs M.S., McKnight C.J., Gierasch L.M. Conformations and orientations of a signal peptide interacting with phospholipid monolayers. - Biochemistry, 1989, v.28, p.2789-2797.

46.Cunningham K., Lill R., Crooke E., Rice M., Moore K., Wickner W., Oliver D. SecA protein, a peripheral membrane protein of the E.coli plasma membrane, is essential for the functional binding and translocation of proOmpA. - EMBO J., 1989, v.8, p.955-959.

47.Cunningham K., Wickner W. Specific recognition of the leader region of precursor proteins is required for the activation of the translocation ATPase of E.coli. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v.86, p.8630-8634.

48.Dalbey R.E. In vivo protein translocation into or across the bacterial plasma membrane. - In: Methods Cell Biol., 1991, v.34, p.39-60.

49.Dalbey R.E., von Heijne G. Signal peptidases in prokaryotes and eukaiyotes - a new protease family. - Trends Biochem. Sci., 1992, v. 17, p.474-478.

50.De Chavigny A., Heacock P.N., Dowhan W. Sequence and inactivation of the pss gene of E.colL- J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.5323-5332.

51.de Kruijff B. Lipids beyond the bilayer. - Nature (London), 1997, v.386, p.129-130.

52.de Kruijff B., Cullis P.R., Verkleij A.J., Hope M.J., van Echteld C.J.A., Tarashi T.F. Lipid polymorphism and membrane function. - In: The Enzymes of Biological Membranes (Martonosi A., ed.) Plenum Press, New York, 1985, 131-204.

53.Demel R.A., Goormaghtigh E., de Kruijff B. Lipid and peptide specificities in signal peptide - lipid interactions in model membranes. - Biochim. Biophys. Acta, 1990, v.1027, p.155-162.

54.Derman A.I., Puziss J.W., Bassford P.J., Jr., Beckwith J. A signal sequence is not required for protein export inprlA mutants of E.coli. - EMBO J., 1993, v. 12, p.879-888.

55.de Vrije G.J., Batenburg A.M., Killian J.A., de Kruijff B. Lipid involvement in protein translocation in E.coli. - Mol. Microbiol., 1990, v.4, p.143-150.

56.de Vrije T., de Swart R.L., Dowhan W., Tommassen J., de Kruijff B. Phosphatidilglycerol is involved in protein translocation across E.coli inner membranes. - Nature (London), 1988, v.334, p. 173-175.

57.Douville K., Price A., Eichler J., Economou A., Wickner W. SecYEG and SecA are the stoichiometric components of preprotein translocase. - J. Biol. Chem., 1995, v.270, p.20106-20111.

58.Driessen A.J.M. Precursor protein translocation by the E.coli translocase is directed by the protonmotive force. - EMBO J., 1992, v.l 1, p.847-853.

59.Driessen A.J.M. SecA, the peripheral subunit of the E.coli precursor protein translocase, is functional as a dimer. - Biochemistry, 1993, v.32, p. 13190-13197.

60.Driessen A.J.M. How proteins cross the bacterial cytoplasmic membrane. - J. Membrane Biol., 1994, v.142, p.145-159.

61.Duong F., Wickner W. Distinct catalytic roles of the Sec YE, SecG and SecDFyajC subunits of preprotein translocase holoenzyme. - EMBO J., 1997a, v. 16, p.2756-2768.

62.Duong F., Wickner W. The SecDFyajC domain of preprotein translocase controls preprotein movement by regulating SecA membrane cycling. - EMBO J., 1997b, v.16, p.4871-4879.

63.Economou A., Pogliano J.A., Beckwith J., Oliver D.B., Wickner W. SecA membrane cycling at SecYEG is driven by distinct ATP binding and hydrolysis events and is regulated by SecD and SecF. - Cell, 1995, v.83, p. 1171-1181.

64.Eichler J., Wickner W. Both an N-terminal 65-kDa domain and a C-terminal 30-kDa domain of SecA cycle into the membrane at SecYEG during translocation. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v.94, p.5574-5581.

65.Emr S.D., Hanley-Way S., Silhavy T.J. Suppressor mutations that restore export of a protein with a defective signal sequence. - Cell, 1981, v.23, p.79-88.

66.Emr S.D., Silhavy T.J. Importance of secondary structure in the signal sequence for protein export. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v.80, p.4599-4603.

67.Fandl J.P., Cabelli R., Oliver D., Tai P.C. SecA supresses the temperature-sensitive SecY24 defect in protein translocation in E.coli membrane vesicles. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, p.8953-8957.

68.Fikes J.D., Bassford P.J., Jr. Export of unprocessed maltose-binding protein to the periplasm of E.coli cells. - J. Bacterid., 1987, v.169, p.2352-2359.

69.Fine J.B., Sprecker H. Unidimensional thin-layer chromatography of phospholipids on boric acid-impregnated plates. - J. Lipid Res., 1982, v.23, p.660-663.

70.Fujiki Y., Hubbard A.L., Fowler S., Lazarow P.B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment. - J. Cell Biol., 1982, v.93, p.97-102.

71.Gardel C., Johnson K., Jacq A., Beckwith J. The secD locus of E.coli codes for two membrane proteins required for protein export. - EMBO J., 1990, v.9, p.3209-3216.

72.Geller B.L., Mowa N.R., Wickner W. Both ATP and the electrochemical potential are required for optimal assembly of pro-OmpA into E.coli inner membrane vesicles. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, v.83, p.4219-4222.

73.Hall M.N., Gabay J., Schwartz M. Evidence for a coupling of synthesis and export of an outer membrane protein in E.coli. - EMBO J., 1983, v.2, p.15-19.

74.Hanada M., Nishiyama K., Mizushima S., Tokuda H. Reconstitution of an efficient protein translocation machinery comprising SecA and the three membrane proteins, SecY, SecE and SecG (pl2). - J. Biol. Chem., 1994, v.269, p.23625-23631.

75.Hartl F.-U., Lecker S., Schiebel E., Hendrick J.P., Wickner W. The binding cascade of SecB to SecA to SecY/E mediates preprotein targeting to the E.coli plasma membrane. - Cell, 1990, v.63, p.269-279.

76.Hartl F.-U., Wiedmann M. Procariotic secretion: a signal recognition particle in E.coli. - Curr. Biol., 1993, v.3, p.86-89.

77.Hartman E., Sommer T., Prehn S., Gorlich D., Jentsch S., Rapoport T. Evolutionary conservation of components of the protein translocation apparatus. - Nature (London), 1994, v.367, p.654-657.

78.Heacock P.N., Dowhan W. Construction of a lethal mutation in the synthesis of the major acidic phospholipids of E.coli. - J. Biol. Chem., 1987, v.262, p. 13044-13049.

79.Hendrick J.P., Wickner W. SecA protein needs both acidic phospholipids and SecY/E protein for functional, high-affinity binding to the E.coli plasma membrane. -J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.24596-24600.

80.Hoffschulte H.K., Drees B., Muller M. Identification of a soluble SecA/SecB complex by means of a subfractionated cell-free export system. - J. Biol. Chem., 1994, v.269, p.12833-12839.

81.Hoyt D.W., Gierasch L.M. Hydrophobic content and lipid interactions of wild-type and mutant OmpA signal peptides correlate with their in vivo function. -Biochemistiy, 1991, v.30, p.10155-10163.

82.1chihara S., Beppu N., Mizushima S. Protease IV, a cytoplasmic membrane protein of E.coli, has signal peptide activity. - J. Biol. Chem., 1984, v.259, p.9853-9857.

83.Inouye H., Beckwith J. Synthesis and processing of alkaline phosphatase precursor in vitro.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, p. 1440-1444.

84.Inouye H., Michaelis S., Wright A., Beckwith J. Cloning and restriction mapping of alkaline phosphatase structural gene (phoA) of E.coli and generation of deletion mutant in vitro. - J. Bacterid., 1981, v.146, p.668-675.

85.Inouye S., Soberon X., Franceschini T., Nakamura K., Itakura K., Inouye M. Role of positive charge on the ammo-terminal region of the signal peptide in protein secretion across the membrane. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, v.79, p.3438-3441.

86.1zui K. A lipid requirement for induction of alkaline phosphatase, one of periplasmic enzymes, in E.coli. -Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, v.45, p.1506-1512.

87.Jackson B.J., Kennedy E.P. The biosynthesis of membrane-derived oligosacharides. A membrane-bound phosphoglycerol transferase. - J. Biol. Chem., 1983, v.258, p.2394-2398.

88.Joly J.C., Wickner W. The SecA and SecY subunits of translocase are the nearest neighbors of a translocating preprotein, shielding it from phospholipids. - EMBO J., 1993, v.12, p.255-263.

89.Kajava A.V., Bogdanov M.V., Nesmeyanova M.A. Stereochemical analysis of interaction of signal peptide with phospholipids at the initiation of protein translocation across the membrane. - J. Biomol. Struct. & Dynamics, 1991, v.9, p.143-157.

90.Kamitani S., Akiyama Y., Ito K. Identification and characterization of an E.coli gene required for the formation of correctly folded alkaline phosphatase, a periplasmic enzyme.-EMBO J., 1992, v. 11, p.57-62.

91.Kato M., Tokuda H., Mizushima S. In vitro translocation of secretory proteins possessing no charges at the mature domain takes place efficiently in a protonmotive force-dependent manner. - J. Biol. Chem., 1992, v.267, p.413-418.

92.Kawasaki S., Mizushima S., Tokuda H. Membrane vesicles containing overproduced SecY and SecE exhibit high translocation ATPase activity and counterrnovement of protons in a SecA- and presecretory protein-dependent manner. - J. Biol. Chem., 1993, v.268, p.8193-8198.

93.Keller R.C.A., ten Berge D., Nouwen N., Snel M.M.E., Tommassen J., Marsh D., de Kruijff B. Mode of insertion of the signal sequence of a bacterial precursor protein into phospholipid bilayers as revealed by cysteine-based site-directed spectroscopy. - Biochemistry, 1996, v.35, p.3063-3071.

94.Killian J.A., Keller R.C.A., Struyve M., de Kroon A., Tommassen J., de Kruijff B. Tryptophan fluorescence study on the interaction of the signal peptide of the E.coli outer membrane protein PhoE with model membranes. - Biochemistry, 1990, v.29, p.8131-8137.

95.Kimura E., Akita M., Matsuyama S., Mizushima S. Determination of a region in SecA that interacts with presecretory proteins in E.coli. - J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.6600-6606.

96.Kleina L.G., Masson J.-M., Normanly J., Abelson J., Miller J.H. Construction of E.coli amber suppressor tRNA genes. II. Synthesis of additional tRNA genes and improvement of suppressor efficiency. - J. Mol. Biol., 1990, v.213, p.705-717.

97.Kontinen V.P., Tokuda H. Overexpression of phosphatidylglycerophosphate syntase restores protein translocation in a secG deletion mutant of E.coli at low temperature. - FEBS Lett., 1995, v.364, p.157-160.

98.Kumamoto C.A., Beckwith J. Evidence for specificity at an early step in protein export in E.coli. - J. Bacteriol., 1985, v.163, p.267-274.

99.Kusters R., Breukink E., Gallusser A., Kuhn A., de Kruijff B. A dual role for phosphatidylglycerol in protein translocation across E.coli inner membrane. - J. Biol. Chem., 1994, v.269, p.1560-1563.

100. Kusters R., Dowhan W., de Kruijff B. Negatively charged phospholipids restore prePhoE translocation across phosphatidylglycerol-depleted E.coli inner membrane vesicles. - J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.8569-8662.

101. Kusulcawa N., Yura T., Ueguchi C., Akiyama Y., Ito K. Effects of mutations in heat-shock genes groES and groEL on protein export in E.coli. - EMBO J., 1989, v.8, p.3517-3521.

102. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. - Nature, 1970, v.227, p.680-685.

103. Lee C., Beckwith J. Cotranslational and posttranslational protein translocation in procaryotic systems. - Annu. Rev. Cell Biol., 1986, v.2, p.315-336.

104. Lee C., Li P., Inouye H., Beckwith J. Genetic studies on the inability of J3-galactosidase to be translocated across the E.coli cytoplasmic membrane. - J. Bacterid., 1989, v.171, p.4609-4616.

105. Li P., Beckwith J., Inouye H. Alteration of the amino terminus of the mature sequence of a periplasmic protein can severely affect protein export in E.coli. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, v.85, p.7685-7689.

106. Lill R., Crooke E., Guthrie B., Wickner W. The "trigger factor cycle" includes ribosomes, presecretory proteins and the plasma membrane. - Cell, 1988, v.54, p.1013-1018.

107. Lill R., Cunningham K., Brundage L., Ito K., Oliver D., Wickner W. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of E.coli. - EMBO J., 1989, v.8, p.961-966.

108. Lill R., Dowhan W., Wickner W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. - Cell, 1990, v.60, p.271-280.

109. Liu G., Topping T.B., Randall L.L. Physiological role during export for the retardation of folding by the leader peptide of maltose-binding protein. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v.86, p.9213-9217.

110. Looman A.C., Bodlaender J., Comstock L.J., Eaton D., Jhurani P., de Boer H.A., van Knippenberg P.H. Influence of the codon following the AUG initiation codon on the expression of a modified lacZ gene in E.coli. - EMBO J., 1987, v.6, p.2489-2492.

111. Lowrv O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R,J. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. - J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p.265-275.

112. Luirink J., High S., Wood H., Giner A., Tollervey D., Dobberstein B. Signal-sequence recognition by an E.coli ribonucleoprotein complex. - Nature, 1992, v.359, p.741-743.

113. Luirink J., ten Hagen-Jongman C.M., van der Weijden C.C., Oudega B., High S., Wood H., Dobberstein B., Kusters R. An alternative protein targeting pathway in E.coli: studies on the role of FtsY. - EMBO J., 1994, v. 13, p.2289-2296.

114. Maclntyre S., Freudl R., Degen M., Hindennach I., Henning U. The signal sequence of an E.coli outer membrane protein can mediate translocation of a not normally secreted protein across the plasma membrane. - J. Biol. Chem., 1987, v.262, p.8416-8422.

115. Martoglio B., Hofmann M.W., Brunner J., Dobberstein B. The protein-conducting channel in the membrane of the endoplasmic reticulum is open laterllay toward the lipid bilayer. - Cell, 1995, v.81, p.207-214.

116. Matsuyama S., Fujita Y., Mizushima S. SecD is involved in the release of translocated secretory proteins from the cytoplasmic membrane of E.coli. - EMBO J., 1993, v.12, p.265-270.

117. Matsuyama S., Fujita Y., Sagara K., Mizushima S. - Biochim. Biophys. Acta, 1992, v. 1122, p.77-84.

118. Matsuyama S., Kimura E., Mizushima S. Complementation of two overlapping fragments of SecA, a protein translocation ATPase of E.coli, allows ATP binding to its amino-terminal region. - J. Biol. Chem., 1990a, v.265, p.8760.-8765.

119. Michaelis S., Hunt J.F., Beckwith J. Effects of signal sequence mutations on the kinetics of alkaline phosphatase export to the periplasm in E.coli. - J. Bacterid, 1986, v. 167, p. 160-167.

120. Michaelis S., Inouye H., Oliver D., Beckwith J. Mutations that alter the signal sequence of alkaline phosphatase in. E.coli. -J. Bacteriol., 1983, v.154, p.366-374.

121. Mitchell C., Oliver D. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by E.coli SecA ATPase. - Mol. Microbiol., 1993, v. 10, p.483-497.

122. Mi lira T., Mizushima S. Separation by density gradient centrifugation of two types of membrane from spheroplast membrane of E.coli K12. - Biochim. Biophys. Acta, 1968, v.150, p.159-161.

123. Mothes W., Heinrich S.U., Graf R., Nilsson I.-M., von Heijne G., Brunner J., Rapoport T. Molecular mechanism of membrane protein integration into the endoplasmic reticulum. - Cell, 1997, v.89, p.523-533.

124. Murphy C.K., Beckwith J. Residues essential for the function of SecE, a membrane component of the E.coli secretion apparatus, are located in a conserved cytoplasmic region. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v.91, p.2557-2561.

125. Nesmeyanova M.A. On the possible participitation of acid phospholipids in the translocation of secreted proteins through the bacterial cytoplasmic membrane. -FEBS Lett., 1982, v.142, p.189-193.

126. Nesmeyanova M.A., Bogdanov M.V. Participation of acid phospholipids in protein translocation across the bacterial cytoplasmic membrane. - FEBS Lett., 1989, v.257, p.203-207.

127. Nishiyama K., Hanada M., Tokuda J. Disruption of the gene encoding pl2 (SecG) reveals the direct involvement and important function of SecG in the protein translocation of E.coli at low temperature. - EMBO J., 1994, v.13, p.3272-3277.

128. Nishiyama K., Kabuyama Y., Akimaru J., Matsuyama S., Tokuda H., Mizushima S. SecY is an indispensable component of the protein secretory machinery of E.coli. - Biochim. Biophys. Acta, 1991, v.1065, p.89-98.

129. Nishiyama K., Mizushima S., Tokuda H. A novel membrane protein involved in protein translocation across the cytoplasmic membrane of E.coli. - EMBO J., 1993, v.12, p.3409-3415.

130. Nishiyama K.-i., Suzuki T., Tokuda H. Inversion of the membrane topology of SecG coupled with SecA-dependent preprotein translocation. - Cell, 1996, v.85, p.71-81.

131. Nouwen N., Tommassen J., de Kruijff B. Requirement for conformational flexibility in the signal sequence of precursor protein. - J Biol Chem., 1994, v.269, p.16029-16033.

132. Novak P., Dev I.K. Degradation of a signal peptide by protease VI and oligopeptidase A. - J. Bacteriol., 1988, v. 170, p.5067-5075.

133. Osborn M.J., Gander J.E., Parisi E., Carson J. Mechanism of assembly of outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. - J. Biol. Chem., 1972, v.247, p.3962-3972.

134. Osborne R.S., Silhavy T.J. PrlA suppressor mutations cluster in regions corresponding to three distinct topological domains. - EMBO J., 1993, v. 12, p.3391-3398.

135. Phillips G.J., Silhavy T.J. The E.coli ffli gene is necessary for viability and efficient protein export. - Nature (London), 1992, v.359, p.744-746.

136. Phoenix D.A., de Wolf F.A., Staffhorst R.W.H., Hikita C., Mizushima S., de Kruijff B. Phosphatidylglycerol dependent protein translocation across the E.coli inner membrane is inhibited by the anti-cancer drug doxorubicin. Evidence for an electrostatic interaction between the signal sequence and phosphatidylglycerol. -FEES Lett., 1993b, v.324, p.113-116.

137. Phoenix D.A., Kusters R., Hikita C., Mizushima S. and de Kruijff B. OmpF-Lpp signal sequence mutants with varying charge hydrophobicity rations provide evidence for a phosphatidylglycerol-signal sequence interaction during protein translocation across the E.coli inner membrane. - J. Biol. Chem., 1993a, v.268, p.17069-17073.

138. Pogliano J.A., Beckwith J. SecD and SecF facilitate protein export in E.coli. -EMBO J., 1994b, v.13, p.554-561.

139. Pogliano K.J., Beckwith J. Genetic and molecular characterization of the E.coli secD operon and its products. - J. Bacterid., 1994a, v. 176, p.804-814.

140. Powers T., Walter P. Co-translational protein targeting catalyzed by the E.coli signal recognition particle and its receptor. - EMBO J., 1997, v. 16, p.4880-4886.

141. Puziss J.W., Stroebel S.M., Bassford P.J. Export of maltose-binding protein species with altered charge distribution surrounding the signal peptide hydrophobic core in E.coli cells harboring prl supressor mutations. - J. Bacteriol., 1992, v. 174, p.92-101.

142. Randall L.L. Translocation of domains of nascent periplasmic proteins across the cytoplasmic membrane is independent of elongation. - Cell, 1983, v.33, p.231-240.

143. Randall L.L. Peptide binding by chaperone SecB: implications for recognition of normative structure. - Science, 1992, v.257, p.241-245.

144. Rapoport T.A. - Science, 1992, v.258, p.931-936.

145. Ribes V., Romisch K., Giner A., Dobberstein B., Tollervey D. E.coli 4.5S RNA is part of a ribonucleoprotein particle that has properties related to signal recognition particle. - Cell, 1990, v.63, p.591-600.

146. Roussel A., Inisan A.G. TURBO-FRODO, Version 4.3, 1993, Bio-Graphics, Marseille, France.

147. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. -Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989, v. 1-3, 1626 p.

148. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-teimination inhibitors. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, p.5463-5467.

149. San Millan J.L., Boyd D., Dalbey R., Wickner W., Beckwith J. Use of phoA fusions to study the topology of the E.coli inner membrane protein leader peptidase. -J. Bacterid., 1989, v. 171, p.5536-5541.

150. Sato K., Mori H., Yoshida M., Tagaya M., Mizushima S. Short hydrophobic segments in the mature domain of proOmpA determine its stepwise movement during translocation across the cytoplasmic membrane of E.coli. - J. -Biol. Chem., 1997, v.272, p.5880-5886.

151. Schatz P.J., Beckwith J. Genetic analysis of protein export in E.coli. - Annu. Rev. Genet., 1990, v.24, p.215-248.

152. Schatz P. J., Bieker K.L., Ottemann K.M., Silhavy T.J., Beckwith J. One of three transmembrane stretches is sufficient for the functioning of the SecE protein, a membrane component of the E.coli secretion machinery. - EMBO J., 1991, v.10, p.1749-1757.

153. Schatz P.J., Riggs P.D., Jacq A., Fath M.J., Beckwith J. The secE gene encodes an integral membrane protein required for protein export in E.coli. - Genes Dev., 1989, v.3, p.1035-1044.

154. Schiebel E., Driessen A.J.M., Hartl F.U., Wickner W. DeltaUH+ and ATP function at different steps of the catalytic cycle of preprotein translocase. - Cell, 1991, v.64, p.927-939.

155. Schnaitman C.A. Solubilization of the cytoplasmic membrane of E.coli by tritón X-100. - J. Bacteriol., 1971, v.108, p.545-552.

156. Shen L.M., Lee J.-L, Cheng S., Jutte H., Kuhn A., Dalbey R.E. Use of site-directed mutagenesis to define the limits of sequence variation tolerated for processing of the M13 procoat protein by the E.coli leader peptidase. -Biochemistry, 1991, v.30, p. 11775-11781.

157. Shibuya I. Metabolic regulations and biological functions of phospholipids in E.coli. - Prog. Lipid Res., 1992, v.31, p.245-299.

158. Shinkai A., Hong Mei L., Tokuda H., Mizushima S. The conformation of SecA, as revealed by its protease sensitivity, is altered upon interaction with ATP, presecretory proteins, everted membrane vesicles, and phospholipids. — J. Biol. Chem., 1991, V.26Ó, p.5827-5833.

159. Simon S.M., Blobel G. Signal peptides open protein-conducting chanels in E.coli. -Cell, 1992, v.69, p.677-684.

160. Stader J., Gansheroff L.J., Silhavy T.J. New suppressors* of signal-sequence mutations, prlG, are linked tightly to the secE gene of. - Genes Dev., 1989, v.3, p.1045-1052.

161. Suzuki T., Itoh A., Ichihara S., Mizushima S. Characterization of the sppA gene coding for protease IV, a signal peptide peptidase of E.coli. - J. Bacteriol., 1987, v.169, p.2523-2528.

162. Tai P.C., Tian G., Xu H., Lian J.P., Yu J.N. In vitro protein translocation into E.coli inverted membrane vesicles. - In: Methods Cell Biol., 1991, v.34, p. 167-187.

163. Takahara M., Sagai H., Inouye S., Inouye M. Secretion of human superoxide dismutase in E.coli. - Bio Technology, 1988, v.6, p. 195-198.

164. Tani K., Shiozuka K., Tokuda H., Mizushima S. In vitro analysis of the process of translocation of proOmpA across the E.coli cytoplasmic membrane. - J. Biol. Chem., 1989, v.264, p.18582-18588.

165. Tanji Y., Geimity J., Pollitt S., Inouye M. Effect of OmpA signal peptide mutations on OmpA secretion, synthesis, and assembly. - J. Bacterid., 1991, v. 173, p. 1997-2005.

166. Teschke C.M., Kim J., Song T., Park S., Park C., Randall L.L. Mutations that affect the folding of ribose-binding protein selected as suppressors of a defect in export in E.coli. - J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.l 1789-11796.

167. Tokuda H., Akimaru J., Matsuyama S., Nishiyama K., Mizushima S. Purification of SecE and reconstitution of SecE-dependent protein translocation activity. - FEBS Lett., 1991, v.279, p.233-236.

168. Topping T.B., Randall L.L. Determination of the binding frame within a physiological ligand for the chaperone SecB. - Protein Sci., 1994, v.3, p.730-736.

169. Torriani A. Influence of inorganic phosphate in the formation of phosphatase by E.coli. - Biochim. Biophys. Acta, 1960, v.38, p.460-466.

170. Torriani A. Alkaline phosphatase from E.coli. - In: Procedures in nucleic acid research (Cantoni, G.L. and Davis, R., Eds.), Harper and Row, Publishers, New York, 1966, p.224-234.

171. Tschantz W.R., Sung M., Delgado-Partin V.M., Dalbey R.E. A serine and a lysine residue implicated in the catalytic mechanism of the E.coli leader peptidase. -J. Biol. Chem., 1993, v.268, p.27349-27354.

172. Uchida K„ Mori H., Mizushima S. - J. Biol. Chem., 1995, v.270, p.30862-30868.

173. Ulbrandt N.D., London E., Oliver D.B. Deep penetration of a portion of E.coli SecA protein into model membranes is promoted by anionic phospholipids and by partial unfolding. - J. Biol. Chem., 1992, v.267, p. 15184-15192.

174. Vlasuk G.P., Inouye S., Ito H., Itakura K., Inouye M. Effects of the complete removal of basic amino acid residues from the signal peptide on secretion of lipoprotein in E.coli. - J. Biol. Chem., 1983, v.258, p.7141-7148.

175. von Heijne G. Net N-C charge imbalance may be important for signal sequence function in bacteria. - J. Mol. Biol., 1986a, v. 192, p.287-290.

176. von Heijne G. The distribution of positively charged residues in bacterial inner membrane proteins correlates with the trans-membrane topology. - EMBO J., 1986b, v.5, p.3021-3027.

177. von Heijne G. The signal peptide. - J. Memb. Biol., 1990, v.l 15, p.195-201.

178. Watanabe M., Blobel G. Site specific antibodies against the PrlA (SecY) protein of E.coli inhibit protein export by interfering with plasma membrane binding of preproteins. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989a, v.86, p.1895-1899.

179. Watanabe M., Blobel G. Cytosolic factor purified from E.coli is necessary and sufficient for the export of a protein and is a homotetramer of SecB. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989b, v.86, p.2728-2732.

180. Wickner W., Driessen A.J.M., Hartl F.-U. The enzymology of protein translocation across the E.coli plasma membrane. - Annu. Rev. Biochem., 1991, v.60, p.101-124.

181. Wickner W., Leonard M. R. E.coli preprotein translocase. - J. Biol. Chem., 1996, v.271, p.29514-29516.

182. Wolfe P.B., Wickner W., Goodman J.M. Sequence of the leader peptidase gene of E.coli and the orientation of leader peptidase in the bacterial envelope. - J. Biol. Chem., 1983, v.258, p.12073-12080.

183. Yamagata H., Daishima K., Mizushima S. Cloning and expression of a gene coding for the prolipoprotein signal peptidase of E.coli. - FEBS Lett., 1983, v. 158, p.301-304.

184. Yamane K., Mizushima S. Introduction of basic amino acid residues after the signal peptide inhibits protein translocation across the cytoplasmic membrane of E.coli. - J. Biol. Chem., 1988, v.263, p.19690-19696.

Прежде всего, я признателен своим родителям - Марии Григорьевне и Евгению Петровичу Калининым, а также выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю - профессору Марине Артемьевне Несмеяновой, которая помимо научного руководства оказала неоценимую человеческую поддержку. Я искренне благодарен всем сотрудникам лаборатории секреции белков у бактерий, лично - к.б.н. Наталье Ивановне Михалевой за совместное проведение ряда исследований, к.б.н. Андрею Львовичу Карамышеву за идею модификации метода введения направленных мутаций в ген щелочной фосфатазы и помощь в освоении методов молекулярной биологии и Евдокии Тимофеевне Федотиковой за техническую поддержку.

Благодарю заведующего лабораторией структурно-функционального анализа генетических систем микроорганизмов к.б.н. Владимира Николаевича Ксензенко за плодотворное сотрудничество, к.х.н. Михаила Григорьевича Шляпникова за синтез олигонуклеотидов, Наталью Панькову за секвенирование мутантных ркоА генов, к.м.н. Игоря Александровича Сидорова за помощь в статистической обработке данных и профессора Вильяма Довхана (США) за предоставление мутантных штаммов Е.соИ с контролируемым составом фосфолипидов.

Особую благодарность выражаю Игорю Эдуардовичу Грановскому.