Подходы к изучению структуры и функции предшественников секреторных протеиназ микроорганизмов семейства Bacillaceae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Савилова, Анастасия Михайловна

• Савилова, Анастасия Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Савилова, Анастасия Михайловна

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

Секреция белков у Bacillus subtilis Свойства секреторных белков

2.1. Введение

2.2. Какие белки секретируются?

2.3. Структура сигнального пептида в целом

2.4. Классификация сигнальных пептидов

2.4.1. Определение предположительных сигнальных пептидов компьютерными методами

2.4.2. Сигнальные пептиды белков, транспортирующихся через главный секреторный путь (Sec-систему)

2.4.3. Сигнальные пептиды, несущие мотив с двумя аргининовыми остатками (RR-мотив)

2.4.4. Сигнальные пептиды липопротеинов

2.4.5. Сигнальные пептиды препилин-подобных белков

2.4.6. Сигнальные пептиды бактериоцинов и феромонов

2.5. Количество транспортируемых белков

2.6. See-зависимая секреторная система

2.6.1. Цитозольные шапероны

2.6.1.1. Шапероны, специфически участвующие в секреции

2.6.1.2. Шапероны широкого спектра действия

2.6.2. Транслоказа

2.6.3. Сигнальные пептидазы типа I

2.6.4. Процессинг липопротеинов СПазой типа II

2.6.5. Пептидазы сигнальных пептидов

2.6.6. Внецитоплазматические катализаторы фолдинга белков 44 2.6.6.1 .Петидил-пролил цис-транс изомеразы

2.6.6.2. Тиол-дисульфид оксидоредуктазы

2.6.6.3. Пропептиды

2.6.6.4. Другие катализаторы фолдинга (небелковой природы)

2.7. Контроль качества транспортируемых белков

2.8. Sec-независимый экспорт белков

2.8.1. Tat-система транспорта

2.8.2. Система экспорта препилин-подобных белков

2.8.3. ABC-система транспорта

2.9. Роль пропептида в секреции белков

2.10. Экспорт белков, локализованных в клеточной стенке

2.10.1. Сигналы для удержания белков в клеточной стенке

2.10.2. Ковалентное связывание с клеточной стенкой

2.11. Транспорт белков во время споруляции

2.11.1. Транспорт белков, специфичных для процесса споруляции

2.11.2. Факторы, участвующие в споруляционно-зависимом транспорте белков

3. Материалы и методы исследования

3.1. Материалы

3.2. Методы

4. Результаты и обсуждение

4.1. Экспрессия гена глутамилэндопептидазы gseBL из Bacillus licheniformis

4.1.1. Получение предшественника GseBL в клетках Е. coli

4.1.2. Экспрессия гена gseBL в клетках L-форм P. mirabilis

4.2. Экспрессия гена cpt из Thermoactinomyces vulgaris

4.2.1. Экспрессия модифицированного гена cpt в клетках L-форм P. mirabilis

4.2.2. Экспрессия гена cpt в клетках В. subtilis

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Подходы к изучению структуры и функции предшественников секреторных протеиназ микроорганизмов семейства Bacillaceae»

Бактериальные, и в частности, бациллярные протеиназы являются классическим объектом фундаментальных научных исследований в области энзимологии и структурной химии белка. Многие из них имеют также важное практическое значение, производятся и потребляются в значительных объемах. Все это позволило накопить достаточный объем знаний о структурно-функциональной организации протеиназ. Почти все известные к настоящему времени протеиназы из различных источников первоначально синтезируются в виде неактивных предшественников - проферментов, молекулы которых, кроме последовательности зрелого фермента, включают еще N-концевой секреторный лидер (препептид), обеспечивающий транспорт белка через плазматическую мембрану, и активационный пептид (пропептид). Известно, что активация предшественников, приводящая к появлению протеолитической активности, сопровождается отщеплением и деградацией пропептида. Тем не менее, слабо разработанной стороной в изучении протеиназ остается вопрос о функциональном предназначении их пропептидов и предшественников.

Предполагается, что пропептиды могут быть необходимы для формирования функциональной третичной структуры белка, направляя свертывание белковой глобулы («фолдирующая» функция) и для поддержания фермента в неактивном состоянии («ингибирующая» функция). В меньшей мере обсуждается роль пропептида в обеспечении взаимодействия предшественника с транспортным механизмом клетки и секреции («секреторная» функция).

Необходимо отметить, что, несмотря на наличие в мире нескольких лабораторий, специализирующихся в области изучения предшественников и пропептидов субтилизиноподобных и термолизиноподобных протеиназ, прогресс в этой области сдерживается биологическими особенностями пропептидов. Дело в том, что в ходе синтеза в клетках микроорганизмов предшественники протеиназ бацилл, в отличие от зимогенов панкреатических протеиназ животных, не подлежат длительному хранению и в процессе секреции подвергаются немедленному процессингу с образованием зрелого активного фермента. При этом даже наиболее современными высокочувствительными методами не удается зафиксировать во внутриклеточном пространстве грам-положительных микроорганизмов хотя бы следовых количеств незрелых форм секреторных протеиназ. Далее, предшественники многих протеиназ бацилл способны к самоактивации, что исключает их получение в нативной форме in vitro. В то же время мутационный и делеционный анализ на уровне гена доказывает основополагающую роль пропептидов в обеспечении естественной функциональности протеиназ. Более того, структура пропептида является фундаментальным фактором, определяющим продуктивность штаммов, синтезирующих многие протеиназы промышленного назначения, и, возможно, свойства получаемого фермента. Кроме того, раскрытие предполагаемой роли пропептида в секреции позволит в перспективе разработать новые подходы к созданию бациллярных продуцентов гетерологичных белков и ферментов, что в настоящее время остается нерешенной проблемой прикладной биотехнологии.

Таким образом, разработка подходов к изучению структуры и функции пропептидов и предшественников протеиназ бацилл является актуальной в фундаментальном и практическом плане задачей. 5

Целью настоящей работы являлась разработка методов получения предшественников глутамилэндопептидазы Bacillus licheniformis (GseBL) и карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris (СрТ) и изучение их взаимодействия с системами природного хозяина, контролирующими транспорт, активацию и деградацию белка в процессе секреции. Возможность получения данных протеиназ в виде предшественников изучалась с помощью нескольких различных подходов: экспрессии в клетках бацилл и L-формах, а также с помощью ренатурации белка из тел включения.

2. Обзор литературы

Секреция белков у Bacillus subtilis Свойства секреторных белков

2.1. Введение

Одной из общих черт прокариотических и эукариотических клеток является транспорт белков из места их синтеза, в основном цитоплазмы, в другие пункты назначения как внутри, так и снаружи клетки. Для достижения этого экспортируемые белки обычно синтезируются в виде предшественников с N-концевым сигнальным пептидом, который распознается клеточными сортирующими и транслоцирующими белки системами (vonHeijne, 1990; 1998). Сигнальные пептиды представляют собой короткие последовательности аминокислот, которые, после того как белок будет доставлен в нужный субклеточный компартмент, часто отщепляются специализированными сигнальными пептидазами. Однако некоторые белки могут заякориваться в мембране, что зависит от наличия дополнительных гидрофобных участков в полипептидной цепи. Прокариотический сигнальный пептид нередко может выполнять свои функции в эукариотах, и наоборот.

Транспорт белков через мембрану может происходить в течение их синтеза (котрансляционно), либо после его завершения (посттрансляционно). Первый путь встречается во всех организмах, однако его важность может варьировать; так, хотя у млекопитающих он, вероятно, преобладает, у прокариот и S. cerevisiae большинство белков, по-видимому, транспортируются посттрансляционно (Pohlschroder et. al., 1997).

В эукариотических клетках белки могут транспортироваться в различные части клетки, такие как ядро, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы, плазматическая мембрана, клеточная стенка, хлоропласты, митохондрии, пероксисомы и различные мембранные системы и компартменты в вышеперечисленных органеллах. Кроме того, белки могут секретироваться во внешнюю среду клетки. В отличие от этого, в эубактериях и археях сортирующие системы белков ограничены лишь несколькими компартментами: цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка (у грам-положительных бактерий и архей), периплазма и внешняя мембрана (у грам-отрицательных бактерий). И они также могут секретировать белки во внеклеточную среду. Для i достижения этого данные одноклеточные организмы используют различные пути, такие как главный путь секреции (Sec-система), путь транслокации с использованием сигнала из двух смежных аргининовых остатков в секреторном пептиде (Tat-pathway, twin-arginine pathway, Tat-система) и транспорт через АТР-связывающую кассету (ATP-binding cassette, ABC-транспортеры).

Представляется важным рассмотреть известные механизмы белкового транспорта через мембрану. В основном, обзор будет сфокусирован на рассмотрении Бес-системы транслокации белков на примере хорошо изученной грам-положительной бактерии В. subtilis, особенно привлекательной для промышленного использования в области получения гетерологичных белков благодаря своей высокой секреторной способности и непатогенности. Однако, системы экспорта белков грам-отрицательных бактерий, в частности Е. coli, и некоторых эукариот (S. cerevisiae) во многих случаях охарактеризованы более детально, поэтому они также будут рассмотрены, где это покажется необходимо. 7

Для различных видов бацилл существуют хорошо разработанные технологии ферментации (Braun et. al., 1999; Bron et. al., 1998; Simonen and Palva, 1993). Многие белки могут секретироваться В. subtilis с высоким выходом, например, альфа-амилаза AmyQ из В. amyloliquefaciens (1-3 г/л) (Palva, 1982), белок А из Staphylococcus aureus (>1 г/л) (Fahnestock, 1986) и человеческий интерлейкин-3 (Quax, 1997). К сожалению, секреция гетерологичных белков видами рода Bacillus часто серьезно затруднена из-за существования нескольких "узких мест" в секреторном пути, таких как плохая адресация белка к транслоказе, деградация секретируемых белков, медленный или неправильный их фолдинг. Таким образом, не только с научной точки зрения, но и для практических целей представляется важным установить состав так называемой секретомы В. subtilis, под которой подразумевают как компоненты секреторного пути, так и секретируемые белки. Благодаря доступности полного сиквенса генома В. subtilis (Kunst et. al., 1997) в последние годы исследователи достигли значительного прогресса в области определения и характеристики компонентов и клеточных функций, необходимых для секреции белков у этой бактерии.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Савилова, Анастасия Михайловна

6. Выводы

1. Показано, что при экспрессии гена предшественника GseBL в клетках L-форм P. mirabilis профермент накапливается в нативной форме во внеклеточной среде, не подвергаясь немедленной активации. Эти наблюдения позволяют предположить, что L-формы являются удобным инструментом для получения предшественников протеиназ в нативной непроцессированной форме.

2. Впервые обнаружена способность карбоксипептидазы Т к приобретению функционально активной третичной структуры в отсутствие полноразмерного собственного пропептида, что отличает ее от всех известных секреторных протеиназ бациллярного происхождения и делает перспективным объектом для изучения возможной роли пропептида во взаимодействии с клеткой-хозяином.

3. Показано, что, несмотря на близость естественного хозяина СрТ к роду Bacillus, экспрессия гена предшественника этого фермента в клетках бацилл не приводит к образованию функционально активного зрелого белка при использовании разработанных экспрессионных систем.

4. Показана эффективность разработанных векторных и репортерных систем в обеспечении необходимого уровня транскрипции структурных генов cpt и gseBL для проведения белково-инженерных экспериментов с соответствующими белками.

7. Благодарности

Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории Химии белка им. В.М. Степанова («ГосНИИгенетика», Москва) к.х.н. Серкиной А.В. за проведение экспериментов по активации предшественников бактериальных протеиназ in vitro и к.б.н. Трачук JI.A. за разработку методики и проведение экспериментов по ренатурации предшественников протеиназ из тел включения, полученных в рекомбинантных штаммах Е. coli. Автор признателен к.х.н. Воюшиной Т.Л., к.х.н. Юсуповой М.П. и к.х.н. Мильготиной Е.И. за синтезированные и предоставленные пептидные субстраты, использованные для определения протеолитической активности ферментов, к.х.н. Ивановой Н.М. за предоставленные препараты протеиназ для проведения экспериментов по активации предшественников GseBL и СрТ in vitro, а также Константиновой Г.Е за поддержание и трансформацию штаммов В. subtilis.

Автор благодарит к.б.н. Матца М.В. (фирма "КлонТех", США) за предоставленную экспрессионную конструкцию pSMUK7 с геном карбоксипептидазы Т, к.б.н. Лившица В.А. (АГРИ, Москва) и к.б.н. Алешина В.В. (Институт сельскохозяйственного животноводства, г. Боровск) за предоставление исходных конструкций для разработки векторов на основе репликона pLF, а также проф. Манькина А. (США) за полученную от него конструкцию pES7, несущую мини-ген Е-пептида.

Существенный вклад в настоящую работу внесла оригинальная клеточная система на базе L-форм P. mirabilis, разработанная в секторе Клеточной биологии прокариот Института молекулярной биотехнологии (Йена, Германия) под руководством проф. Гумперта Й. Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам этой лаборатории доктору Хойшену К., Эльске Г. и доктору Куяу М. за помощь в освоении методов культивирования L-форм и внимательное отношение, а также доктору Зибену Ш. за предоставленный вектор pSIS2. Выражаем благодарность также сотруднику лаборатории Анализа генома Института молекулярной биотехнологии (Йена, Германия) доктору Ниакатуре Дж. за проведенное им полное определение нуклеотидной последовательности модифицированных форм гена глутамилэндопептидазы и карбоксипептидазы.

В заключение хочется поблагодарить всех сотрудников лаборатории Химии белка им. В.М. Степанова за помощь в освоении лабораторных методов, плодотворные дискуссии в ходе осмысления полученных результатов и теплое отношение к автору.

5. Заключение

Планируя и выполняя настоящую работу, мы исходили из предположения о наличии общих черт в структурно-функциональной орагнизации всех предшественников секреторных протеиназ бацилл и родственных им микроорганизмов, акцентируя внимание, в первую очередь, на возможном участии пропептидов в обеспечении контроля активации и транспорта предшественников за пределы клетки. Поэтому при выборе объекта исследования мы принимали в расчет прежде всего те особенности предшественника, которые обеспечили бы его максимальную стабилизацию in vitro и за счет этого облегчили бы возможность его препаративного выделения и изучения. Предусматривалась также возможность функционального картирования в структуре предшественника элементов, ответственных как за внутримолекулярное взаимодействие между пропептидом и зрелой частью, так и за взаимодействие предшественника в целом с регуляторными механизмами бациллярной клетки, обеспечивающими транспорт и своевременную активацию внеклеточных белков. В дальнейшем планировалось приложить данные, полученные на модельных объектах, к исследованию других бактериальных протеаз, имеющих большее практическое значение, однако в силу индивидуальных особенностей структуры предшественника не позволяющих непосредственно изучить механизмы их синтеза, фолдинга, транспорта и активации. Таким образом, не исключено, что ценность настоящей работы не ограничивается изучением лишь карбоксипептидазы Т и глутамилэндопептидаз.

В результате проведенных экспериментов удалось доказать, что предшественник GseBL при соблюдении ряда условий может быть получен в нативном состоянии и сохранять свою структуру в течение длительного времени. Это наблюдение не является непосредственным доказательством неспособности npo-GseBL к самоактивации, однако оно обеспечивает необходимые условия как для изучения предшественника GseBL физико-химическими методами in vitro, включая рентгено-структурный анализ. Кроме того, оно представляет ценность с точки зрения планирования дальнейших экспериментов по картированию в структуре npo-GseBL детерминант, ответственных за связывание с другими молекулами в процессе транспорта и активации. Однако наличие у пропептида GseBL фолдирующей функции, предположенное на основании данных по экспрессии модифицированного гена gseBL, кодирующего непосредственно зрелый фермент без прочасти, значительно осложняет такую работу. При мутационном или делеционном анализе последовательности пропептида GseBL могут быть затронуты как участки, нарушающие транспорт и активацию предшественника, так и части, ответственные за фолдинг зрелой части молекулы. Это существенно затруднит интерпретацию причин наличия или отсутствия продукции того или иного мутантного белка в зрелой секреторной форме.

В отличие от GseBL, СрТ, по-видимому, представляет собой наиболее перспективный из ранее изучавшихся объект для функционального картирования пропептида. Полученные данные о возможности фолдинга и секреции. СрТ, лишенной препептида, доказывают, что, в отличие от всех других изучавшихся до настоящего времени бациллярных протеиназ, ингибирующая и фолдирующая функции в данном случае не являются необходимыми. Это открывает широкие перспективы для детального изучения других возможных функций пропептида в составе предшественника, непосредственно не связанных с участием зрелого фермента.

Ill

Обнаруженная в нашей работе неспособность СрТ секретироваться из клеток бацилл, несущих ген его предшественника, является неожиданным результатом, так как бациллы, как правило, способны транспортировать во внешнюю среду секреторные белки даже менее родственных грам-положительных микроорганизмов, чем Т. vulgaris, в частности, клостридий, кокков, лактобацилл и актиномицетов. Возможным объяснением неспособности СрТ к секреции в бациллах является наличие в ее структуре дисульфидных связей, нехарактерных для большинства собственных секреторных белков бацилл. Однако, расположение остатков Cys в молекуле СрТ позволяет легко удалить их путем делеции или замены, не вызывая нарушений фолдинга и дальнейшего функционирования фермента. Запланированное проведение этих экспериментов позволит впервые экспериментально изучить роль дисульфидных связей в секреции из клеток бацилл, и, возможно, позволит создать удобную модель для функционального картирования межмолекулярных взаимодействий профермента.

112

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Савилова, Анастасия Михайловна, 2001 год

1. Akita М., Sasaki S., Matsuyama S. and Mizushima S. 1990. SecA interacts with secretory proteins by recognizing the positive charge at the amino terminus of the signal peptide in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 265: 8162-8169.

2. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res. 15: 3389-3402.

3. Asai K., Kawamura F., Sadaie Y. and Takahashi H.J. 1997. Isolation and characterization of a sporulation initiation mutation in the Bacillus subtilis secA gene. J. Bacteriol. 179: 544-547.

4. BaardsnesJ., Sidhu S., MacLeod A., Elliott J., Morden D., Watson J. and Borgford T. 1998. Streptomyces griseus protease B: secretion correlates with the length of the propeptide. J. Bacteriol. 180: 3241-3244.

5. Baba T. and Schneewind O. 1998. Targeting of muralytic enzymes to the sell division site of gram-positive bacteria: repeat domains direct autolysin to the equatorial surface ring of Staphylococcus aureus. EMBO J. 17: 4639-4646.

6. Banerjee S. and Hansen J.N. 1988. Structure and expression of a gene encoding the precursor of subtilin, a small protein antibiotic. J. Biol. Chem. 263: 9508-9514.

7. Barkocy-Gallagher G.A. and Bassford P.J. 1992. Synthesis of precursor maltose-binding protein with proline in the +1 position of the cleavage site interferes with the activity of Escherichia coli signal peptidase I in vivo. J. Biol. Chem. 267:1231-1238.

8. Beaman T.C., Hitchins A.D., OchiK., VasanthaN., Endo T. and Freese E.I.1983. Specificity and control of uptake of purines and other compounds in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 156: 1107-1117.

9. Beck K., Wu L.F., Brunner J. and Muller M. 2000. Discrimination between SRP-and SecA/SecB-dependent substrates involves selective recognition of nascent chains by SRP and trigger factor. EMBO J. 19: 134-143.

10. Berks B.C., Sargent F. and Palmer T. 2000. The Tat protein export pathway. Mol. Microbiol. 5: 260-274.

11. Bolhius A., Broekhuizen C.P., Sorokin A., van Roosmalen M.L., Venema G., BronS., QuaxW.J. and vanDijlJ.M. 1998. SecDF of Bacillus subtilis, a molecular Siamese twin required for the efficient secretion of proteins. J. Biol. Chem. 273: 21217-21224.

12. Bolhuis A., Tjalsma H., Smith H.E., de Jong A., Meima R., Venema G., Bron S. and vanDijlJ.M. 1999a. Evaluation of bottlenecks in the late stages of protein secretion in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2934-2941.

13. Bolhuis A., Venema G., Quax J., Bron S., vanDijlJ.M. 1999c. Functional analysis of paralogous thiol-disulfide oxidoreductases in Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 274: 24531-24538.

14. Bolhuis A., Koetje E., Dubois J.-Y., Vehmaanpera J., Venema G., Bron S. and van DijI J.M. 2000. Did the mitochondrial processing peptidase evolve from a eubacterial regulator of gene expression? Mol. Microbiol. Evol. 17: 198-201.

15. Bowie J.U. 1997. Helix packing in membrane proteins. J. Mol. Biol. 272: 780-789.

16. Boyd D., Schierle C. and Beckwith J. 1998. How many membrane proteins are there? Protein Sci. 7: 201-205.

17. Braun P., Gerritse G., van Dijl J.M. and Quax W.J. 1999. Improving protein secretion by engineering components of the bacterial translocation machinery. Curr. Opin. Biotechnol. 10: 376-381.

18. Braun P., Tommassen J. and Filloux A. 1996. Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 19: 297-306.

19. Briggs M.S., Cornell D.J., Dluhy R.A. and Gierasch L.M. 1986. Conformations of signal peptides induced by lipids suggest initial steps in protein export. Science 233: 206-208.

20. Bron S., Bolhuis A., Tjalsma H., Holsappel S., Venema G. and van Dijl J.M.1998. Protein secretion and possible roles for multiple signal peptidases for precursor processing in bacilli. J. Biotechnol. 64: 3-13.

21. Chambert R. and Petit-Glatron M.F. 1999. Anionic polymers of Bacillus subtilis cell wall modulate the folding rate of secreted proteins. FEMS Microbiol. Lett. 179: 43-47.

22. Chen M. and Nagarajan V. 1994. Effect of alteration of charged residues at the N termini of signal peptides on protein export in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 176:5796-5801.

23. Chung Y.S. and Dubnau D. 1995. ComC is required for the processing and translocation of ComGC, a pilin-like competence protein of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 15: 543-551.

24. Chung Y.S. and Dubnau D. 1998. All seven comC open reading frames are required for DNA binding during transformation of competent Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180: 41-45.

25. Chung Y.S., Breidt F. and Dubnau D. 1998. Cell surface localization and processing of the ComG proteins, required for DNA binding during transformation of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 29: 905-913.

26. Cristobal S., de Gier J.W., Nielsen H. and von Heijne G. 1999. Competition between Sec- and Tat-dependent protein translocation in Escherichia coli. EMBO J. 18: 2982-2990.

27. Dalbey R.E. and Robinson C. 1999. Protein translocation into and across the bacterial plasma membrane and the plant thylacoid membrane. Trends Biochem. Sci. 24: 17-22.

28. Dalbey R.E., Lively M.O., Bron S. and vanDijlJ.M. 1997. The chemistry and enzymology of the type I signal peptidases. Protein Sci. 6: 1129-1138.

29. Deuerling E., Mogk A., Richter C., Purucker M. and Schumann W. 1997. The ftsH gene of Bacillus subtilis is involved in major cellular processes such as sporulation, stress adaptation and secretion. Mol. Microbiol. 23: 921-933.

30. Errington J. 1993. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis. Microbiol. Rev. 57: 1-33.

31. Fahnestock S.R. and Fisher K.E. 1986. Expression of staphylococcal protein A gene in Bacillus subtilis by gene fusions utilizing the promoter from Bacillus amyloliquefaciens a-amylase gene. J. Bacteriol. 165: 796-804.

32. Fekkes P. and Driessen A.J.M. 1999. Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 161-173.

33. Fekkes P., van der Does C. and Driessen A.J. 1997. The molecular chaperone SecB is released from the carboxyl terminus of SecA during initiation of precursor protein translocation. EMBO J. 16: 6105-6113.

34. Franke C.M., Tiemersma J., Venema G. and Kok J. 1999. Membrane topology of the lactococcal bacteriocin ATP-binding cassette transporter protein LcnC. Involvement of LcnC in lactococcin maturation. J. Biol. Chem. 274: 8484-8490.

35. Gumpert J. and Taubeneck U. 1983. Characteristic properties and biological significance of stable protoplast type L-forms. Experientia Suppl. 46: 227-241.

36. HartI F.U., Lecker S., Schiebel E., Hendrick J.P. and WicknerW. 1990. The binding cascade of SecB to SecA to SecY/E mediates pre-protein targeting to the E. coli plasma membrane. Cell 63: 269-279.

37. Havarstein L.S., Diep D.B. and Nes I.F. 1995. A family of bacteriocin ABC transporters carry out proteolytic processing of their substrates concominant with export. Mol. Microbiol. 16: 229-240.

38. Hell K., Herrmann J.M., Pratje E., Neupert W. and StuartR.A. 1998. Oxalp, an essential component of the N-tail protein export machinery in mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2250-2255.

39. Hirose I., Sano K., Shioda I., Kumano M., Nakamura K. and Yamane K. 2000. Proteome analysis of Bacillus subtilis extracellular proteins: a two-dimensional protein electrophoretic study. Microbiology 146: 65-75

40. Hofmeister A. 1998. Activation of the proprotein transcription factor pro-sigma E is associated with its progression through three patterns of subcellular localization during sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 180: 2426-2433.

41. Hynds P.J., Robinson D. and Robinson C. 1998. The sec-independent twin-arginine translocation system can transport both tightly folded and malfolded proteins across the thylakoid membrane. J. Biol. Chem. 273: 34868-34874.

42. Jensen C.L., Stephenson K., Jorgensen S.T. and Harwood C. 2000. Cell-associated degradation affects the yield of secreted engineered and heterologous proteins in the Bacillus subtilis expression system. Microbiology 146: 2583-2594.

43. Jiang M., Grau R. and Perego M. 2000. Differential processing of propeptide inhibitors of Rap phosphatases 'mBacillus subtilis. J. Bacteriol. 182: 303-310.

44. Jungnickel В., Rapoport T.A. and Hartmann E. 1994. Protein translocation: common themes from bacteria to man. FEBS Lett. 346: 73-77.

45. Keiler K.C., Waller P.R. and Sauer R.T. 1996. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science 271: 990-993.

46. Kessler E. 1995. Beta-lytic endopeptidases. Methods Enzymol. 248: 740-756.

47. Kessler E. and Safrin M. 1988. Partial purification and characterization of an inactive precursor of Pseudomonas aeruginosa elastase. J. Bacteriol. 170: 1215-1219.

48. Kessler E., Safrin M., Gustin J.K. and Ohman D.E. 1998. Elastase and the LasA protease of Pseudomonas aeruginosa are secreted with their propeptides. J. Biol. Chem. 273: 30225-30231.

49. Kihara A., Akiyama Y. and Ito K. 1999. Dislocation of membrane proteins in FtsH-mediated proteolysis. EMBO J. 18: 2970-2981.

50. Knoblauch N.T., Rudiger S., Schonfeld H.J., Driessen A.J.M., Schneider-MergenerJ. and Bukau B. 1999. Substrate specificity of the SecB chaperone. J. Biol. Chem. 274: 34219-34225.

51. Kontinen V.P. and Sarvas M. 1993. The PrsA lipoprotein is essential for protein secretion in Bacillus subtilis and sets a limit for high-level secretion. Mol. Microbiol. 8: 727-737.

52. Kopito R.R. 1997. ER quality control: the cytoplasmic connection. Cell 88: 427-430.

53. Kumamoto C.A. and Francetic O. 1993. Highly selective binding of nascent polypeptides by an Escherichia coli chaperone protein in vivo. J. Bacteriol. 175:2184-2188.

54. KunstF., OgasavaraN., Moszerl., Albertini A.M., Alloni G., Azevedo V., Bertero M.G., Bessieres P., Bolotin A., Borchert S. et al. 1997. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390: 249-256.

55. LaPointe C.F. and Taylor R.K. 2000. The tipe IV prepilin peptidases comprise a novel family of aspartic acid proteases. J. Biol. Chem. 275: 1502-1510.

56. Lee S.J., Kim D.M., Bae K.H., Byun S.M. and Chung J.H. 2000. Enhancement of secretion and extracellular stability of staphylokinase in Bacillus subtilis by wprA gene disruption. Appl. Environ. Microbiol. 66: 476-480.

57. Le Loir Y., Gruss A., Ehrlich S.D. and Langella P. 1998. A nine-residue synthetic propeptide enhances secretion efficiency of heterologous proteins in Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 180: 1895-1903.

58. Le Loir Y., Nouaille S., Commissaire J., Bretigny L., Gruss A. and Langella P. 2001. Signal peptide and propeptide optimization for heterologous protein secretion in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4119-4127.

59. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovich E.L., Balaban N.P., Mardanova A.M., Sharipova M.R., Viryasov M.B., Rudenskaya G.N. and Stepanov V.M. 1997. Glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius, strain 3-19. FEBS Lett. 404: 241-244.

60. Lill R., Crooke E., Guthrie B. and Wickner W. 1988. The "trigger factor cycle" includes ribisomes, presecretory proteins and the plasma membrane. Cell 54: 1013-1018.

61. Magnuson R., Solomon J. and Grossman A.D. 1994. Biochemical and genetic characterization of a competence pheromone from Bacillus subtilis. Cell 77: 207-216.

62. Mansfeld J., Vriend G., Dijkstra B.W., Veltman O.R., van den Burg O.R., Venema G., Ulbrich-Hofmann R. and EijsinkV.G. 1997. Extreme stabilization of a thermophlysin-like protease by an engeneered disulfide bond. J. Biol. Chem. 272:11152-11156.

63. Margot P., Wahlen M., Gholamhoseinian A., Piggot P. and Karamata D. 1998. The lytE gene of Bacillus subtilis 168 encodes a cell wall hydrolase. J. Bacteriol. 180: 749-752.

64. Matsumoto G., Mori H. and Ito K. 1998. Roles of SecG in ATP- and SecA-dependent protein translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13567-13572.

65. Matsuyama S., Tajima T. and Tokuda H. 1995. A novel periplasmic carrier protein involved in the sorting and transport of Escherichia coli lipoproteins destined for the outer membrane. EMBO J. 14: 3365-3372.

66. Matsuyama S., Yokota N. and Tokuda H. 1997. A novel outer membrane lipoprotein, LolB (HemM), involved in the LolA (p20)-dependent localization of lipoproteins to the outer membrane of Escherichia coli. EMBO J. 16: 6947-6955.

67. Mazmanian S.K., Liu G., Ton-That H. and Schneewind O. 1999. Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall. Science 285: 760-763.

68. Mclver K.S., Olson J.C. and Ohman D.E. 1993. Pseudomonas aeruginosa lasBl mutants produce an elastase, substituted at active-site His-223, that is defective in activity, processing, and secretion. J. Bacteriol. 175: 4008-4015.

69. Miller J.R., Kovacevic S. and Veal L.E. 1987. Secretion and processing of staphylococcal nuclease by Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 169: 3508-3514.

70. Miiller J., Ozegowski J., Vettermann S., Swaving J., van Wely K.H. and Driessen A.J.M. 2000. Interaction of Bacillus subtilis CsaA with SecA and precursor proteins. Biochem. J. 348: 367-373.

71. Nakamura K., Yahagi S., Yamazaki T. and Yamane K. 1999. Bacillus subtilis histone-like protein, HBsu, is an integral component of a SRP-like particle that can bind the Alu domain of small cytoplasmic RNA. J. Biol. Chem. 274: 13569-13576.

72. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. and von Heijne G. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng. 10: 1-6.

73. Novak P. and Dev I.K. 1988. Degradation of a signal peptide by protease IV and oligopeptidase A. J. Bacteriol. 170: 5067-5075.

74. Ogura A., Kakeshita H., Honda K., Takamatsu H., Nakamura K. and YamaneK. 1995. srb: a Bacillus subtilis gene encoding a homologue of the alpha-subunit of the mammalian signal recognition particle receptor. DNA Res. 2: 95-100.

75. Paetzel M., Dalbey R.E. and Strynadka N.C. 1998. Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a beta-lactam inhibitor. Nature 396: 186-190.

76. Palva I. 1982. Molecular cloning of a-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens and its expression in Bacillus subtilis. Gene 19: 81-87.

77. Perego M. 1997. A peptide export-import control circuit modulating bacterial development regulates protein phosphatases of the phosphorelay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8612-8617.

78. Pohlschroder M., PrinzW.A., HartmannE. and Beckwith J. 1997. Protein translocation in the three domains of life: variations on a theme. Cell 91: 563-566.

79. Pooley H.M., Merchante R. and Karamata D. 1996. Overall protein content and induced enzyme components of the periplasm of Bacillus subtilis. Microbiol. Drug Resist. 2:9-15.

80. Popham D.L., Helin J., Costello C.E. and SetlowP. 1996. Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J. Bacteriol. 178: 6451-6458.

81. Popham D.L., Meador-Parton J., Costello C.E. and SetlowP. 1999. Spore peptidoglycan structure in cwlD dacB double mutant of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 181: 6205-6209.

82. Powers T. and Walter P. 1997. Co-translational protein targeting catalyzed by the Escherichia coli signal recognition particle and its receptor. EMBO J. 16: 4880-4886.

83. Pugsley A.P. 1993. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50-108.

84. Pugsley A.P., Francetic O., Possot O.M., SauvonnetN. and HardieK.R. 1997. Recent progress and future directions in studies of the main terminal branch of the general secretory pathway in gram-negative bacteria. Gene 192: 13-19.

85. Quax W.J. 1997. Merits of secretion of heterologous proteins from industrial micro-organisms. Folia Microbiol. (Prague) 42: 99-103.

86. Rosenow C., Ryan P., Weiser J.N., Johnson S., Fontan P., Ortqvist A. and MasureH.R. 1997. Contribution of novel choline-binding proteins to adherence, colonization and immunogenecity of Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 25: 819-829.

87. Sadaie Y. and Kada T. 1985. Bacillus subtilis gene involved in cell division, sporulation, and exoenzyme secretion. J. Bacteriol. 163: 648-653.

88. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. 1989. Molecular cloning; 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol.3, New York, NY.

89. Sargent F., Stanley N.R., Berks B.C. and Palmer T. 1999. Sec-independent protein translocation in Escherichia coli: a distinct and pivotal role for the TatB protein. J. Biol. Chem. 274: 36073-36082.

90. Schatz G. and Dobberstein B. 1996. Common principles of protein translocation across membranes. Science 271: 1519-1526.

91. Schneewind O., Fawler A. and Faull K.F. 1995. Structure of the cell wall anchor of surface proteins in Staphylococcus aureus. Science 268: 103-106.

92. ScottiP.A., UrbanusM.L., BrunnerJ., deGierJ.W., von Heijne G., van der Does C., Driessen A.J.M., Oudega B. and LuirinkJ. 2000. YidC, the Escherichia coli homologue of mitochondrial Oxalp, is a component of the Sec translocase. EMBO J. 19: 542-549.

93. Серкина A.B., Бушуева A.M. (Савилова), Честухина Г.Г., ГумпертЙ., ХойшенК., КуяуМ., Шевелев А.Б. 2001. Получение предшественника глутамилэндопептидазы В. licheniformis и изучение его процессинга in vitro. Вопр. Мед. Хим. 47: 111-122.

94. Settles А.М., Yonetani A., Baron A., Bush D.R., Cline К. and Martienssen R. 1997. Sec-independent protein translocation by the maize Hcfl06 protein. Science 278: 1467-1470.

95. Seydel A., Gounon P. and Pugsley A.P. 1999. Testing the "+2rule" for lipoptotein sorting in the Escherichia coli cell envelope with a new genetic selection. Mol. Microbiol. 34: 810-821.

96. Siegel V. and Walter P. 1988. Each of the activities of signal recognition particle (SRP) is contained within a distinct domain: analysis of biochemical mutants of SRP. Cell 52: 39-49.

97. Simonen M. and Palva I. 1993. Protein secretion in Bacillus species. Microbiol. Rev. 57: 109-137.

98. Sipos L. and von Heijne G. 1993. Predicting the topology of eukaryotic membrane proteins. Eur. J. Biochem. 213: 1333-1340,

99. Solomon J.M., Magnuson R., Srivastava A. and Grossman A.D. 1995. Convergent sensing pathways mediate response to two extracellular competence factors in Bacillus subtilis. Genes Dev. 9: 547-558.

100. Stephenson K. and Harwood C.R. 1998. Influence of a cell wall-associated protease on production of alpha-amylase by Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2875-2881.

101. Stephenson K., Carter N.M., Harwood C.R., Petit-Glatron M.F. and ChambertR. 1998. The influence of protein folding on the late stages of the secretion of a-amylases from Bacillus subtilis. FEBS Lett. 430: 385-389.

102. Stover A.G. and Driks A. 1999. Secretion, localization, and antibacterial activity of TasA, a Bacillus subtilis spore-associated protein. J. Bacteriol. 181: 1664-1672.

103. Stragier P. and Losick R. 1996. Molecular genetics of sporulation in Bacillus subtilis. Annu. Rev. Genet. 30: 297-341.

104. Sturmfels A., Gotz F. and PeschelA. 2001. Secretion of human growth hormone by the food-grade bacterium Staphylococcus carnosus requires a propeptide irrespective of the signal peptide used. Arch. Microbiol. 175: 295-300.

105. Suciu D. and M. Inouye. 1996. The 19-residue pro-peptide of staphylococcal nuclease has a profound secretion-enhancing ability in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 21: 181-195.

106. Sutcliffe I.C. and Russell R.R.B. 1995. Lipoproteins of gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 177: 1123-1128.

107. Svendsen I. and Breddam K. Isolation and amino acid sequence of a glutamic acid specific endopeptidase from Bacillus licheniformis. 1992. Eur. J. Biochem. 204: 165-171.

108. Swaving J., van Wely K.H. and Driessen A.J.M. 1999. Pre-protein translocation by a hybrid translocase composed of Escherichia coli and Bacillus subtilis subunits. J. Bacteriol. 181: 7021-7027.

109. Taura Т., Akiyama Y. and Ito K. 1994. Genetic analysis of SecY: additional export-defective mutations and factors affecting their phenotypes. Mol. Gen. Genet. 243: 261-269.

110. Tjalsma H., Zanen G., Venema G., Bron S. and van DijI J.M. 1999c. The potential active site of the lipoprotein-specific (type II) signal peptidase of Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 274: 28191-28197.

111. Tjalsma H., Bolhius A., Jongbloed J.D.H., Bron S. and van Dijl J.M. 2000. Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome. Microbiol, and Mol. Biol. Rew. 64: 515-547.

112. Ulbrandt N.D., Newitt J.A. and Bernstein H.D. 1997. The Escherichia coli signal recognition particle is required for the insertion of a subset of inner membrane proteins. Cell 88: 187-196.

113. Wallin E. and von Heijne G. 1997. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7: 1029-1038.

114. Weiner J.H., Bilous P.T., Shaw G.M., Lubitz S.P., Frost L., Thomas G.H., Cole J.A. and Turner R.J. 1998. A novel and ubiquitous system for membrane targeting and secretion of cofactor-containing proteins. Cell 93: 93-101.

115. Wetmore D.R., Wong S.L. and Roche R.S. 1992. The role of the pro-sequence in the processing and secretion of the thermolysin-like neutral protease from Bacillus cereus. Mol. Microbiol. 6: 1593-1604.

116. Wild J., RossmeissI P., Walter A. and Gross C.A. 1996. Involvement of the DnaK-DnaJ-GrpE chaperone team in protein secretion in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178:3608-3613.123

117. Zheng G., Yan L.Z., Vederas J.C. and Zuber P.J. 1999. Genes of the sbo-alb locus of Bacillus subtilis are required for production of the antilisterial bacteriocin subtilosin. J. Bacteriol. 181: 7346-7355.

118. Zhu X.L., Ohta Y., Jordan F. and Inouye M. 1989. Pro-sequence of subtilisin can guide the refolding of denatured subtilisin in an intermolecular process. Nature 339: 483-484.