Сравнительное изучение мембраносвязанной и периплазматической щелочной фосфатазы ESCHERICHIA COLI тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Колот, Михаил Наумович

• Колот, Михаил Наумович
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Колот, Михаил Наумович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Секретируемые белки бактерий

ГЛАВА I. Секретируемые белки бактерий и особенности их биосинтеза

1. Секретируемые белки бактерий

2. Особенности биосинтеза секретируемых белков . . II

3. Природа предшественников секретируемых белков

ГЛАВА II. Щелочная фосйатаза E.coli - секретируемый фермент.

1. Структура и свойства щелочной фосфатазы

2. Особенности биосинтеза щелочной фосфатазы, как мембраносвязанного процесса

ЭКСПЕРШЛЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА III. Методы исследования.

1. Используемый штамм и его свойства.

2. Условия выращивания культуры.

3. Получение растворимой фракции и мембран

4. Солюбшшзация мембраносвязанной щелочной фосфатазы различными агентами.

5. Выделение и очистка периплазматической и мембраносвязанной щелочной фосфатазы.

6. Разделение множественных форм перишгазматической щелочной фосфатазы

7. Электрофоретические системы

8. Определение молекулярной массы щелочной фосфатазы с помощью гельгоильтрации на сефадексе С

9. Снятие ультрафиолетовых спектров.

10. Хроматография на октил-сефарозе.

11. Обратимая денатурация щелочной фосфатазы

12. Взаимодействие щелочной фосфатазы с искусственными фосфолишщными мембранами

13. Аналитические методы.

14. Реактивы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 1У. Выделение и очистка лериплазматической и мембраносвязанной щелочной фосфатазы E.coli.

1. Выбор оптимальных условии для солюбилизации мембраносвязанной щелочной фосфатазы.

2. Выделение и очистка лериплазматической и мембраносвязанной щелочной фосфатазы.

3. Разделение множественных молекулярных форм лериплазматической щелочной фосфатазы

ГЛАВА У. Сравнительное изучение некоторых физико-химических и кинетических свойств мембраносвязанной и лериплазматической щелочной фосфатазы Е. coli

1. Молекулярная масса.

2. Ультрафиолетовые спектры

3. Оптимум рН

4. Влияние температуры, ионной силы и катионов металлов.

5. Субстратная специфичность и ингибирование

6. Амфифильные свойства.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительное изучение мембраносвязанной и периплазматической щелочной фосфатазы ESCHERICHIA COLI»

Одной из актуальных проблем современной биологии является изучение механизма переноса белков через биологические мембраны. Она включает такие вопросы, как локализация биосинтеза секрети-руемых белков, механизм транслокации белков через мембрану, а также механизмы регуляции биосинтеза, секреции и посттрансляционной модификации белков.

Исследование этих вопросов является важным звеном в решении ряда таких фундаментальных проблем, как сборка и функционирование биологических мембран, а также в решении некоторых практических задач, так как секретируемые белки (гидролазы, токсины, детоксифицирующие ферменты) имеют большое экономическое значение.

В последние годы эта проблема интенсивно исследуется, и к моменту начала настоящей работы многие вопросы, касающиеся биосинтеза и секреции экзобелков, были выяснены. Показано, в частности, что большинство се1фетируемых белков у прокариот синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах в виде предшественников большего размера с дополнительной гидрофобной последовательностью на ы -конце полипептидной цепи и транслоцируется через мембрану по мере своего синтеза, как растущие полипептидные цепи. Процессинг предшественников осуществляется с помощью мембраносвязанных сигнальных пептидаз после "пересечения" белком мембраны. Доказана важная роль сигнального пептида в транслокации белка через мембрану (Inouye , Halegoua , 1980; Wickner , 1980).

Предложено несколько моделей секреции. Самая ранняя "сигнальная" гипотеза (Blobel , Dobbersten , 1975) предполагает транслокацию белка через белковый канал, образуемый специфическими рецепторными белками мембран при взаимодействии сигнального пептида секретируемых белков с мембранами. Согласно большинству других моделей (inouye , Halegoua , 1980; Wickner , 1980; von Heyne , Biomberg , 1979), транслокация осуществляется непосредственно через липидный бислой. Так "мемфрано-триггерная" модель предполагает самосборку изменяющейся белковой конформации при переходе белка из водного компартмента в мембранный. В настоящее время предложена модель транслокации белка, сопряженной с транслокацией фосфолишщов (Несмеянова, 1982).

Однако, несмотря на значительные успехи в понимании процесса секреции, многие вопросы остаются неясными. К ним относятся, в частности, вопросы, касающиеся природы и свойств мембраносвя-зэнных форм растворимых экзобелков, решение которых также необходимо для понимания процесса секреции. К моменту начала настоящей работы эти вопросы были в определенной степени изучены лишь для пенициллиназы B.iicheniformis , у которой количество мемб-раносвязанной формы составляет до 50$ от общего количества этого секретируемого белка, что несомненно облегчило задачу изучения мембраносвязанной формы. Сравнительное изучение структуры и физико-химических свойств этих форм фермента показало, что мембра-носвязанная форма является предшественником растворимой (Sargent et al. , 1968; Lampen , 1967).

Что касается секретируемых белков грам-отрицательных бактерий, то они не содержат значительное количество мембраносвязан-ных форм. Попытки препаративного выделения мембраносвязанных форм секретируемых белков грам-отрицательных бактерий ранее предприняты не были и такая задача была поставлена в настоящей работе на примере се1фетируемой щелочной фосфатазы E.coli . Ранее небольшое количество этого фермента (до 1%) было обнаружено в прочно связанном с мембранами состоянии (Несмеянова и др. ,1975; Северин и др., 1976).

Целью настоящей работы явилось препаративное выделение и сравнительное изучение мембраносвязанной и периплазматической щелочной фосфатазы - секретируемого белка E.coli .

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Отработать оптимальные условия для солюбилизадии мембраносвязанной щелочной фосфатазы.

2. Провести выделение в препаративных количествах и очистку до электрофоретически гомогенного состояния мембраносвязанной и периплазматической щелочной фосфатазы.

3. Провести сравнительное изучение ряда физико-химических и каталитических свойств этих форм щелочной фосфатазы.

В результате проведенных исследований подобраны оптимальные условия для солюбилизадии мембраносвязанной щелочной фосфатазы, ато позволило выделить эту форму в препаративных количествах. Выделены и очшцены до электрофоретически гомогенного состояния мембраносвязанная и множественные молекулярные формы периплазматической щелочной фосфатазы.

Показано, что мембранная форма имеет более выраженные ам-фифильные свойства по сравнению с растворимой формой. В то же время щелочная фосфатаза, подобно ряду других зрелых форм секре-тируемых белков, имеет определенные амфифильные свойства по сравнению с цитоплазматическими растворимыми белками. Сходство ряда физико-химических и кинетических свойств изученных форм фермента указывает на идентичность структуры и каталитически активных конформаций и свидетельствует о единстве их природы.

По субстратной специфичности наибольшее сходство обнаружено между мембраносвязанным ферментом и изоформой I периплазмати-ческого фермента, которая, как известно, синтезируется первой ( Schlesinger , Andersen , 1968) . Эти данные указывают на ТО, что мембранная форма является предшественником растворимого фермента.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СЕКРЕТИРУЕМЫЕ БЕЛКИ БАКТЕРИЙ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Колот, Михаил Наумович

выводы

1. Выделены и очищены до электрофоретически гомогенного состояния мембраносвязанная и три молекулярные формы периплазматической щелочной фосфатазы E.coli.

2. Проведено сравнительное изучение ряда каталитических и физико-химических свойств выделенных форм фермента. При этом установлено: а) сходство каталитических свойств, специфичности и механизмов действия мембраносвязанной и трех форм периплазматической щелочной' фосфатазы; б) показана более амфифильная природа мембранного фермента по сравнению с периплазматическим, а также большая амфифильность зрелых секретируемых белков по сравнению с цитоплазматичес-кими; в) выявлено наибольшее сходство по субстратной специфичности мембраносвязанной щелочной фосфатазы с первой формой пери-плазматического фермента, которая синтезируется первой.

3. Совокупность полученных данных свидетельствует о единстве природы мембраносвязанной и растворимых форд фермента и позволяет считать, что мембранная щелочная фосфатаза является предшественником периплазматической.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биогенез секретируемых белков у бактерий является сложным многостадийным процессом. Он включает в себя биосинтез предшественников секретируемых белков» содержащих дополнительный "сигнальный" пептид, их транслокацию через мембрану, а затем котрансляционный или посттрансляционный цроцессинг, включающий прежде всего протео-литическое отщепление "сигнального" пептида и освобождение зрелого белка из мембран.

Указанные этапы биогенеза были установлены и для секретируе-мой щелочной фосфатазы е. coli , являющейся предметом нашего исследования.

Несмотря на значительные успехи в расшифровке различных этапов биогенеза экзобелков, многие вопросы, касающиеся процесса транслокации белка через мембрану, остаются, однако, неясными.

Так процесс транслокации белка через мембрану предполагает образование его мембраносвязанной формы. Однако природа и функция этих форм не вполне ясна. Изучение структуры и свойств мембранных форм в сравнении со зрелыми растворимыми белками является важным этапом в установлении механизма секреции белка.

К моменту начала настоящей работы была выделена и изучена мембраносвязанная форма пенициллиназы B.iicheniformis • Данные о мембраносвязанных формах секретируемых белков грам-отрицательных бактерий в литературе отсутствовали.

Было известно, что небольшое количество секретируемой щелочной фосфатазы E.coli находится в прочное вязанном с мембранами состоянии (Несмеянова и др., 1975; Северин и др.,1976). Оставалось между тем неясным, является ли мембраносвязанная щелочная фосфатаза предшественником растворимого фермента и имеет с ним сходную структуру и свойства, либо она является автономным ферментом, выполняющим в мембране определенную функцию и отличается от растворимой щелочной фосфатазы по структуре и свойствам.

Цель настоящей работы - сравнительное изучение мембраносвязанной и периплазматической щелочной фосфатазы E.coii определила и конкретные задачи исследования.

Для препаративного вццеления и очистки мембраносвязанной формы фермента были отработаны условия ее солюбилизации^ При сравнении действия ряда агентов, используемых для вццеления различных мембра-носвязанных ферментов нами было показано, что лучшим агентом для солюбилизации мембраносвязанной щелочной фосфатазы является тритон Х-100 в конечной концентрации 0,2%, который и был использован для выделения мембранной формы фермента. Последний очищали параллельно с растворимой щелочной фосфатазой по аналогичной схеме.

Мембраносвязанная и растворимая щелочная фосфатаза были очищены до электрофоретически гомогенного состояния, а периплазмати-ческий фермент разделен на множественные формы, что позволило изучить их физико-химические и каталитические свойства. Проведенное исследование показало, что все формы фермента имеют сходные Кд гидролиза п-НФФ, KiPi , одинаковый оптимум рН и ионной силы, а также одинаковую зависимость начальной скорости гидролиза субстрата от рН, ионной силы, температуры, присутствия катионов металлов. Выявлено также практически полное совпадение энергии активации всех исследованных форм фермента.

Таким образом, в работе показано сходство ряда каталитических свойств изучаемых форм фермента, что свидетельствует о сходстве структуры активных центров и механизмов действия мембраносвязанной и трех форм периплазматической щелочной фосфатазы. Это указывает в свою очередь на единство природы этих форм.

Известно, что щелочная фосфатаза, как и другие секретируемые белки, синтезируется в виде предшественника с дополнительным "сигнальным" пептидом ( Inouye .Beckwith , 1977). Однако в процессе биосинтеза и секреции фермент подвергается модификации с помощью протеаз. Первый ее этап включает отщепление "сигнального" пептида мембраносвязанной "сигнальной" пептидазой ( Chang et al. , 1980), а второй - отщепление тт -концевого аргинина у периплазматического фермента ( Garen , Natori, 1970; Hakata et al. , 1979) с образованием множественных молекулярных форм. Обнаружение трех форм растворимого фермента указывает, что фермент в изучаемых нами условиях прошел все стадии протеолитической модификации.

При изучении субстратной специфичности нами было обнаружено сходство между мембраносвязанным:; ферментом и изоформой I периплазматического фермента, которая, как известно, синтезируется первой ( Schlisinger , Andersen , 1968).

Сходство каталитических свойств всех форм щелочной фосфатазы и особенно сходство по субстратной специфичности мембраносвязанно-го фермента и первой формы периплазматического фермента свидетельствует в пользу того, что мембранная форма щелочной фосфатазы является предшественником периплазматического фермента.

Синтез предшественников секретируемых белков в виде полипептидных цепей, содержащих дополнительный пептид, предопределяет особенности их физико-химических свойств, в частности, большую амфи-фильность этих белков по сравнению со зрелыми растворимыми белками. Поэтому изучение физико-химических свойств и, в первую очередь, ам$ифильных свойств мембраносвязанной щелочной фосфатазы могло помочь сделать заключение о структуре этой формы фермента.

При сравнительном изучении аь^ифильных свойств мембраносвязанного фермента в сравнении с растворимым нами было показано, что мембранная щелочная фосфатаза обладает большей гидрофобностью. Она изменяла подвижность при электрофорезе в присутствии смеси детергентов и связывалась с гидрофобным носителем-октилсефарозой.

- 114

Амфифильные свойства били ранее обнаружены у продукта прямой трансляции м-РНК щелочной фосфатазы в бесклеточной системе, который взаимодействовал с гидрофобным носителем-децилагарозой (inouye, Beckwith , 1977). Во время выполнения нашей работы появилось сообщение о выделении мембраносвязанной щелочной фосфатазы E.coli ( Lazdunski et al,, 1979). Из мембран была выделена как форда щелочной фосфатазы, взаимодействующая с октил-сефарозой, так и зрелый фермент, а также пептид, который, как считали авторы, является "сигнальным" пептидом, отщепляющимся от предшественника в процессе выделения. амфигаильных

Обнаружение свойств выделенного в нашей работе фермента позволяет предположить, что мембраносвязанная щелочная фосфатаза может быть выделена в наших условиях также в виде предшественника, содержащего "сигнальный" пептид. Однако отсутствие разницы в молекулярных массах изучаемых форм фермента не позволяет сделать этот вывод окончательным и требует дополнительных исследований структуры мембраносвязанной щелочной фосфатазы.

Интересно отметить, что при изучении амйифильных свойств с помощью метода обратимой денатурации ряда зрелых форд секретируе-мых белков: щелочной фосфатазы, лизоцима, л- и fi -амилазы и цито-плазматических белков: альдолазы и пируваткиназы наш было показано, что зрелые формы секретируемых бежов обладают более выраженными ам|ифильными свойствами по сравнению с растворимыми внутриклеточными белками.

Дополнительные доказательства в пользу амфифильной природы мембраносвязанной форды щелочной фосфатазы мы попытались получить в опытах по взаимодействию мембранной и растворимой форм фермента с искусственными липидными мембранами. Наши исследования показали, что растворимый фермент связывается с липосомами только при рН ниже изоэлектрической точки и это связывание зависит от ионной силы.

Это свидетельствует о том, что взаимодействие положительно заряженной молекулы фермента с отрицательно заряженными фосфолигшдами (фосфатидилглицерином и кардиолипином) определяется электростатическими силами. Это подтверждается и тем, что взаимодействие усиливается при обогащении липосом кислыми фосфолипидами и предотвращается полимиксином, взаимодействующим, как известно, с кислыми фосфолипидами.

При реконструкции электростатическое взаимодействие в ряде случаев сопровождается далее гидрофобным взаимодействием. В наших условиях гидрофобного взаимодействия наблюдать не удалось ни для периплазматической, ни для мембраносвязанной щелочной фосфатазы. То, что взаимодействие щелочной фосфатазы с липосомами сопровождается еще и инактивацией фермента, свидетельствует о том, что в этих условиях происходит диссоциация фермента на субъединицы и нарушение его четвертичной структуры. В такой ситуации наличие определенных амфифильных свойств у растворимой щелочной фосфатазы и дополнительных амфифильных свойств у мембранной формы фермента оказалось недостаточным чтобы выявить различия во взаимодействии этих белков с липосомами.

Таким образом, проведенное в нашей работе комплексное сравнительное изучение каталитических и физико-химических свойств трех форм периплазматической и мембраносвязанной щелочной фосфатазы Е. coli показало единство природы этих фора и позволило установить, что мембранная форма фермента является предшественником в образовании множественных форм периплазматической щелочной фосфатазы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Колот, Михаил Наумович, 1984 год

1. Евдокимова О.А., Несмеянова М.А. 1977. Фосфолипидный состав клеток и мембран Escherichia coli в условиях репрессии и дерепрес-сии биосинтеза щелочной фосфатазы.-Биохимия 42, I79I-I799.

2. Евдокимова О.А., Несмеянова М.А., Кулаев И.О. 1978. Индукция синтеза щелочной фосфатазы у Е. coli преинкубацией при пониженной температуре. -Биохимия 43, 1680-1687.

3. Землянухина О.А., Колычева В.В., Несмеянова М.А. 1981. Влияние ли-потропных агентов спиртов на биосинтез и репрессию секретируе-мой щелочной фосфатазы у E.coli . -Биохимия 46 , 92-99.

4. ЛенинджерА. . 1974. -Биохимия, М., Мир.

5. Мараева О.Б., Колот М.Н., Несмеянова М.А. 1978. Выделение и некоторые свойства множественных форм щелочной фосфатазы из Е. coli .Всесоюзн.симпоз."Методы получения высокоочищенных ферментов". Вильнюс, 27. Тезисы докл.

6. Мараева О.Б. 1980. Изучение множественных форм щелочной фосфатазы E.coli и взаимосвязь ее регуляции с другими фосфогидролаза-ми. Канд.диссерт., Пущино.

7. Несмеянова М.А., Витвицкий В.Н., Богданов А.А. 1966. Изучение механизма фосфорилирования ма1фоструктуры щелочной фосфатазы из Escherichia coli в процессе ее биосинтеза. Биохимия, 31, 902-909.

8. Несмеянова М.А., Мараева О.Б., Северин А.И., Кулаев И.С. 1975. Локализация полифосфатазы в клетках Е. coli с репрессированным и дерепрессированным биосинтезом этого фермента. Докл. АН СССР 223, 1266-1268.

9. Несмеянова М.А., Евдокимова О.А, 1979. Фосфолипиды Escherichia coli и активность щелочной фосфатазы. Биохимия, 44, 1512-1519.

10. Несмеянова М.А. 1982а. О возможном участии кислых фосфолипидов в транслокации секретируемых белков через цитоплазматическую мембрану бактерий. Мол.биол., 16, 821-828.

11. Несмеянова М.А. 19826. Роль мембран в биосинтезе секретируемых белков у E.coii . Доктор.диссерт. Пущино.

12. Несмеянова М.А., Богданов М.В., Колот М.Н., Землянухина О.А.,

13. Кулаев И.С. ,1982. Взаимодействие щелочной фосфатазы с кислыми фосфолипидами клеток E.coii и искусственных мембран. -Биохимия, 47, 671-677.

14. Северин А.И., Луста К.А., Несмеянова М.А., Кулаев И.С. 1976. По-лифосфатаза, связанная с мембранами Е. coliБиохимия, 41, 357-362.

15. Achtman М., Kennedy N., Skurray R. 1977. Cell-cell interaction in conjugating Ecoli, role of tra T protein in surface exolusion. Proc.Hat 1. Acad. Sci.USA, 74, 5104-5108.

16. Adelman M. R., Sabatini D.D., Blobel G. 1973. RiboBome-membraneinteraction, nondestructive disassembly of rat liver rough microsomes into rlbosomal membranous components. J. Cell. Biol., 56, 206-229.

17. Alphen V. van, Havekes L., bugtenberg B. 1977. Major outer membrane protein "d" of E.coii K-12: purification and in vitroactivity of bacteriophage КЗ and f-pilus mediated bacteriophage. FEBS Lett.75, 285-290.

18. Ames G.P. 1968. Lipids of Salmonella typhymurium and E.coli: structure and metabolism. J.Bacteriol. 95» 833-843.

19. Applebury M.L., Coleman J.E. 1969* E.coli alkaline phosphatase.

20. Metal binding, protein conformation and quaternary structure. J.Biol.Chem. 244, 308-318.

21. Arella M., Sylvester M. 1979. Production of an extracellularribonuclease by Pseudomonas maltophilia. Canad.J.Microbiol., 25, 321-339.

22. Argast M., Boos W. 1979. Purification and properties of the sn-glycerol, 3-phosphate-binding protein of E.coli. J.Biol. Chem. 254, 10931-10935.

23. Aronson A. 1965. Membrane bound messenger KNA and polysomes in sporulating bacteria. J. Mbl.Biol, 13, 92-104.

24. Austen B,M. 1979. Predicted secondary structures of aminotermi-nal extension sequences of secreted proteins. FEBS Lett. 103, 308-313.

25. Bale J.R., Chock P.В., Huang C.Y. 1980a. The nature of negative cooperativity in alkaline phosphatase. J.Biol.Chem. 255, 8424-8430.

26. Bale J.R., Huang C.Y., Chock P.B. 1980b. transient kinetic analysis of the catalytic cycle of alkaline phosphatase. J. Biol.Chem. 255, 8431-8436.

27. Baty D., Lazdunski C. 1979. An anti-(signal peptide) antibody: purification, properties and use as a conformational probes, Eur. J. Biochem. 102, 503-507.

28. Beacham I.K, 1979. Periplasmio enaymis in gram-negative bacteria. Intern. J. Biochem. 10, 877-883.

29. Berenblum J., Chain E, 1938. An imposed method for the colorimet-ric determination of phosphate. Biochem. J., 32, 295-299.

30. Blobel G., Sabatini D.D, 1971* Ribosome-membrane interaction ineukaryotic cells. -In» Biomembranes. Ed. Hanson., 2, 193-195.

31. Blobel G., Dobbersten B. 1975. Transfer of proteins across membrane. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chaine on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. J.Cell.Biol., 67, 835-851.

32. Bloch W., Schlesinger M. J. 1974. Kinetics of substrate hydrolysis by molecular variants of E.coli alkaline phosphatase. J.Biol.Chem. 249, 1760-1768.

33. Boeke I. P., Rubael M., Model P. 1980. Processing of filamentous phage pre-ooat protein. Effect of sequence variations near the signal peptidase cleavage site. J.Mol. Biol. 144» ЮЗ--116.

34. Booth B.K. 1980. Cell surface proteins of E.coli. Biochem.Bio-phys. Res. Commun., 94, 1029-Ю36.

35. Bosron W.P., Vailее В.Ъ. 1975. Effect of phosphate on multiple forms of Escherichia coli alkaline phosphatase. Biochem. Biophys.Res. Commun. 66, 809-813.

36. Bosron W.P., Kennedy F.S., ValleeB.L. 1975. Zinc and magnesium content of alkaline phosphatase from Escherichia coli. Biochemistry 14, 2275-2282.

37. Braun V, 1975. Covalent lipoprotein from the outer membrane of E.coli. Biochim.Biophys.Acta 415, 335-377.

38. Braun 7., Bosch V. 1972. Sequence of the murein lipoprotein and the attachment site of the lipid. Eur.J. Biochem., 28, 51-69.

39. Braun V., Rotering H., Ohms J.P., Hagenmaier H. 1976,Conformational studies on murein lipoprotein from the outermembrane E.coli. Eur. J. Biochem., 601-610.

40. Broad D.F., Smith V. 1981. E.coli 5'tfucleotidase: purification, properties and its release by osmotic shock. J. Gen, Microbiol. 123, 241-247.

41. Brockman R.W,, Heppel L.A. 1968. On the localisation of alkaline phosphatase and cyclic phosphodiesterase in E,coli. Biochemistry, 7, 2554-2562,

42. Cancedda R,,Schlesinger M.J. 1974. Localization of polyribosomes, containing alkaline phosphatase nascent polypeptides on membranes of E.coli. J. Bacterid. 117, 290-301.

43. Chang C.W., Blobel G., Model P. 1978. Detection of procaryoticsignal peptidase in an E.coli membrane fraction: endoproteo-lytic cleavage of nascent f-1 precoat protein, Proc.Hat. Acad, Sci USA, 75, 361-365.

44. Chang C.N., Inouye H., Model P., Beckwith J, 1980» Processing of alkaline phosphatase precursor to the nature enzyme by on E.coli inner membrane preparation, J.Bacteriol, 142,726728.

45. Cheng R., Henning V. 1980. Primary structure of major outer membrane protein II (omp.A) protein of E.coli K-12. Proc.Nat. Acad.Sci.USA, 77, 4592-4596.

46. Chua N.-H., Blobel G., Siekevitz P , Palade G,E. 1976. Periodic variations in the ration of free to thylakoid-bound chloro-plast ribosomes during the cell cycle of Chlamydomonas reinhardtii. J. Cell. Biol., 71, 497-514.

47. Clarke S. 1977. The interaction of triton X-100 with soluble proteins: possible implications for the transport of proteins across membranes. Biochem.Biophys.Res,Communs, 79,46-52.

48. Cocivera M., Ms Manaman J., Wilson I.B. 1980. Formation of active isozymes I and III Ъу reassociation of separated submits of isozyme II of alkaline phosphatase. Arch,Biochem,Biophys, 200, 396-400.

49. Costello M,J,, Gulik-Krzywicki T. 1976. Correlated X-ray difrac-tion and freeze-fracture studies on membrane model systems. Perturbations induced by freeze-fracture preparative procedures. Biochim.Biophys,Acta 455, 412-432.

50. Costerton J, W,, Ingram J. M,, Cheng K,J, 1974. Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria. Bacterid, Rev, , 38, 87-110.

51. Csopak H,, Jonson M,, Halberg B. 1972. Isoelectric fractionation of the E.coli alkaline phosphatase and resolution of the purified enzymes into isoenzyme. Acta Chem, Scand, 26, 2412-2416,

52. Crane L.J., Lampen J.O. 1974. B.licheniformis 749/c plasma membrane penicillinase, a hydrophobic polar protein. Arch.Bio-chem.Biophys, 160, 655-666.

53. Datta D.B., Arden B,, Henning U. 1977. lajor proteins of the

54. E.coli outer cell envelope membrane as bacteriophage receptors. J.Bacteriol. 131, 821-829.

55. Devillers-Thyery A., Kindt Т., Schecle G,, Blobel G. 1975. Homology in amino-terminal sequence of precursors to pancreatic secretoryproteins. Proc.Nati Acad.Sci USA, 72, 5016-5020.

56. Devis H.J. 1964. Disk electrophoresis. Method and application to human serum proteins, Ann. N.Y.Acad.Sci, 121, 404-427.

57. Di Rienzo J.M., Uakamura K., Inouye M. 1978. The outer membrane proteins of gram-negative bacterias biosyntesis, assembly and function. Annu.Res.Biochem,, 47, 481-512,

58. Di Rienzo J.M., Xriouye M. 1979. Lipid fluidity-dependent biosynthesis and assembly of the outer membrane proteins of E.coli. Cell 17, 155-161.

59. Dvorack H,P., Brockman B.W,, Heppel L„A. 1967- Purification and properties of two acid phosphatase fractions isolated from osmotic shock fluid of E.coli. Biochemistry 6, 1743-1751.

60. Eckstein P., Stembach H* 1967* Nucleoside 5f-0-phosphorothioates as inhibitors for phosphatase. Biochem.Biophys.Acta 146, 618-619.

61. Engstrom L. 1962. Incorporation of inorganic phosphate into alkaline phosphatase from E.coli. Biochem.Biophys.Acta 56, 606-609.

62. Poulds I., Chai T. 1978. A new outer membrane protein found in

63. E.coli: tol P mutant resistant to phage tul I b. J„Bacterid. 133, 1478-1483.

64. Preer J.H., Salton M.R. 1967. Ultrastructure of the cell wall of E.coli and chemical nature of its constituent. J.Ultra-struct.Res. 19, 45-83.

65. Garen A., Levinthal C. 1960. A fine-structure genetic and chemi^il study of the enzyme alkaline phosphatase of E.coli. Purification and characterisation of alkaline phosphatase. Biochem. Biophys.Acta 38, 470-483.

66. Gamier J., Gaye P., Mercier J.-C., Robson B. 1980. Structural properties of signal peptides and their membrane insertion. Biochimie 62, 231-239.

67. Gerlach E,, Deuticke B. 1963. Pine einfache methode zur microbes timmung von phosphate in der papierchromatographie. Biochem. Zeitschrift 337, 477-479.

68. Ghosh A,, Ghosh B,K. 1972. Changes in the membrane bound alkaline phosphatase of glucose and lactate grown vegetative cells cf B.subtilis SB15.Biochem.Biophys.Res.Communs. 49, 906-915»

69. Glenn A. R. 1976, Production of extracellular proteins by bacteria. Ann.Rev. Microbiol. 30, 41-62.

70. Godson G.N., Hunter G.D., Butler J.A.V. 1961. Cellular components of B.megaterium and their role in protein biosynthesis» Biochem.J. 81, 59-68.

71. Gottesman M., Simpson R.T., Vallee B.L, 1969. Kinetic properties of cobalt alkaline phosphatase. Biochemistry 8, 3776-3783.

72. Halegoua S., Hirashima H., Sekizawa I., Inouye M, 1976. Protein synthesis in toluene-treated E.coli:exclusive synthesis of membrane proteins. Eur.J, Biochem., 69, 163-167.

73. Halegoua S., Sekizawa I., Inouye M. 1977. A new form of structure lipoprotein of outer membrane of E.coli. J.Biol.Chem., 252, 2324-2330,

74. Halegoua S., Inouye M. 1979. Translocation and assembly of outer membrane proteins of E.coli: selective accumulation of precursors and novel assembly intermediates caused by phene-tyl alcohol. J.Mol.Biol. 130, 39-61.

75. Halford S.E., Bennett H.G., Trentham D.R., Gutfreund H. 1969.

76. A substrate-indiced conformation change in the reaction of alkaline phosphatase from Escherichia coli. Biochem. J. 114, 243-251.

77. Hallberg P.A., Hauge J.G, 1965. The involment of membranes inprotein synthesis in Bacterium anitratum. Biochira.Biophys. Acta 95, 80-85.

78. Hancock R.E.W., Decad G.M., Mkaiio M, 1975. Identification ofthe protein producing transmembrane diffusion pores in the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Biochim.Biophys. Acta 554, 323-331.

79. Hantke K., Braun V. 1973. Covalent binding of lipid to protein. Diglyceride and amide-linked fatty acid at the N-terminalof the murein-lipoprotein of E.coii outer membrane. Eur.J. Biochem. 34, 284-296.

80. Hardy S.J.S., Randall L,L. 1978. Position of the extra amino acid sequence in precursor arabinose-binding protein. J,Bacterid. 135, 291-293.

81. Harris M. I., Coleman J.E. 1968. The biosynthesis of apo- and me-talloalkaline phosphatases of E.coii. J,Biol.Chem, 243, 5063-5073.

82. Hedpeth J., Clemont J.M., Marchal C., Perrin D., Hofnung M. 1980. DMA sequence encoding the HHg-terminal peptide involved in transport of R-receptor an E.coii secretory protein. Proc, Hatl.Acad.Sci.USA 77, 2621-2625.

83. Heijne G. von, Blomberg C. 1979. Trans-membrane translocation of proteins. The direct transfer model. Eur.J.Biochem, 97, 175-181.

84. Helenius A., Simons K. 1975. Solubilization of membranes by detergents. B&hira. Biophys.Acta 415, 29-79.

85. Helenius A., Simons K. 1977. Charge shift electrophoresis: simple method for distinguishing between amphiphilic and hydrophi-lic proteins in detergerc t solution. Proc,Natl,Acad. Sci.USA 74, 529-532,

86. Henning V., Schmidmayer W., Hindennach I. 1977. Major proteins of the outer cell envelope membrane of E.coii K-12: multiple species of protein I. Mol.Gen.Genet. 154, 293-298.

87. Heppel L.A. 1971. The concept of periplasmic enzymes, in: "Structure and functional of biological membrane11. Ed.L.Rothfield, Acad.Press N.V. 224-240.

88. Kelley P.M., Neumann P. A., Shreifer K., Cancedda P., Schlesinger

89. M.J., Bradshow R.A. 1973. Amino acidv sequence of E.coli alkaline phosphatase. Amino acid carboxyl-terminal sequences and variations between two isoenzymes. Biochemistry 12, 3499-3503.

90. Kida S, 1974. The biological function of the R2a regulatory gene for alkaline phosphatase in E.coli, Arch.Biochem.Biophys. 163, 231-237.

91. Kikuchi Y., Yoda K,, Yamasaki M., Tamura G. 1981, Sequence of the signal peptide of E.coli alkaline phosphatase, Agric.Biol, Chem. 45, 2401-2404.

92. Kimura K., Irui K, 1976. Importance of membrane fluidity in the induction of alkaline phosphatase a periplasmic enzyme in E.coll. Biochem.Biophys.Res.Coramun. 70, 900-906,

93. Malamy M.H., Horecker B.L, 1961. Localisation of alkaline phosphatase of Escherichia coli K-12. Biochem, Biophys.Res.Commnn. 5, 104-Ю8.

94. Malamy M.H., Horecker R.L. 1964. Release of alkaline phosphatase from cells of Escherichia coli upon lysoeyme spheroplast formation. Biochemistry 3, 1889-1897.

95. Mantsala P., Zalkin H. 1979. Membrane-bound and soluble extracellular oC-amylase B.subtilis. J.Biol.Chem. 254, 8540-8547.

96. Markwell M.A.K., Haas S.M., Bieber L.L., Tolbert K.E. 1978. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. Anal.Biochem, 87, 206-210.

97. Marvin D,A., Hohn B. 1969. Filamentous bacterial viruses. Bacteriol.Rev. 33, 172-209.

98. MeManaman I., Wilson I.B. 1978. Phosphate content of E.coli alkaline phosphatase. The effect of phosphate and zinc on separation of isoenzymes. Biochemistry 17, 5372^5376.

99. Mellgren R.Ь., Slaugtter G.R., Thomas J. A. 1977. Dephosphorylation of phosphoproteins by Escherichia coli alkaline phosphatase. J.Biol.Chem. 252, 6082-6089.

100. Mizuno T. 1981a. Structure of the peptidoglycan-associated lipoprotein (PAL) of the Proteus mirabilis outer membrane.I.Isolation and characterization of fatty acid containing peptides. J.Biochem. 89, 1051-1058.

101. Mizuno T, 1981b. A novel peptidoglycan-associated lipoprotein (PAL) found in the outer membrane of Proteus mirabilis and other gram-negative bacteria. J.Biochem. 89, 1039-1049.

102. Mowa N.R., Nakamura R., Inouye M. 1980. Gene structure of the omp A protein, a major surface protein of E.coli required for cell-cell interaction. J.Biol.Chem. 255, 27-29.

103. Murayama K,, Kanno T. 1977. A sensitive and separative fluoromet-ric analysis of alkaline phosphatase isoenzymes. Physicochem. biol. 24, 1-4.

104. Kurgier M,, Pelissier C., Lazdunski A., Bernadac S., Lazdunski C, 1977. Aminopeptidase N from E.coli unusual interactions with the cell surface. Eur.J.Biochem. 74, 425-433.

105. Nagata У., Yamagushi K., Maruo B. 1974. Genetic and biochemical studies on cell-bound ol-amilaee in В subtilis marbury. J. Bacterid. 119, 425-430.

106. Nakae T. 1976, Identification of the outer membrane proteins of E.coli that produces transmembrane channels in reconstituted vesicle membranes. Biochem.Biophys.Res,Commun. 71,877-884.

107. Kelson N., Kanner В.I., Gutnick D.L. 1974. Purification and pro2 +2perties of Mg Ca adenosinetriphosphatase from E.coli. Proc.Natl.Acad,Sci.USA 71, 2720-2724, Nesmeyanova M.A., Maraeva O.B., Severin A,I., Kulaev I.S. 1976,

108. Nielsen J,, Caulfield M., Lampen J.O. 1981. Lipoprotein nature of B.licheniformis membrane penicillinase. Proc Natl.Acad,Sci, USA 78, 3511-3515.nomenclature of multiple forms of enzymes. Recomendations. 1976. Eur,J.Biochem. 82, 1-3.

109. Palade G.F. 1975» Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science 189, 347-358.

110. Piggott P.J., Sklar H. D., Gorini L, 1972. Ribosomal alterationscontrolling alkaline phosphatase isozymes in E.coii. J.Bacterid. 110, 291-299.

111. Plocke D.J., Levinthal C., Valle В. I». 1962. Alkaline phosphatase of E.coii. A zinc metalloenzyme. Biochemistry 1, 373-378.

112. Priest P. G, 1977. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus, Bacteriol.Rev. 41, 711-753.

113. Randall b.L,, Jossefson L.-G., Hardy S.I.S. 1978. Processing in vitro of precursor periplasmic proteins from E.coii. Eur.J, Biochem. 92, 411-415.

114. Randall Ъ,Ь., Josefsson L.G., Hardy S.I.S. 1980. Hovel intermediates in the synthesis of maltoso-binding proteins in E.coii. Eur.J,Biochem. 107, 375-379.

115. Randell J.E,, Hardy S.I.S. 1977, Synthesis of exported proteins Ъу membrane-bound polysomes from E.coii, Eur.J,Biochem, 75, 43-53.

116. Ramaley R.F, 1978. Molecular biology of extracellular enzymes. Adv.Appl.Microbiol, 25, 37-55.

117. Razin S. 1972* Reconstitution of biological membranes. Biochim, Biophys Acta 265, 241-296.

118. Reid T.W., Wilson I.B. 1971. Escherichia coli alkaline phosphatase The Enzymes. Ed.Boyer P.D., v. IV, 17, 373-415.

119. Reynolds J,A., Schlesinger M.J. 1969» Formation and properties of a tetrameric form of E.coii alkaline phosphatase, Biochemistry 8, 11, 588-593,

120. Rio Ii.F R., Arroyo-Begovich A, 1975. Evidence foV the presenceof рС-агау1аве in the cell membrane of B,amyloliquefaciene, Biochem,Biophys,Res,Commun, 65, 161-169

121. Rosenbush J.B, 1974- Characterization of the major envelope protein from E.coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J,Biol,Chem, 249, 8019-8029.

122. Rothman P., Byrne R.J. 1963. Fingerprint analysis of alkaline phosphatase of Escherichia coli K-12. J.Mol.Biol. 6, 330-340,

123. Sabatini D. D., Kreibich G. 1976. Functional specialization of membrane-bound ribosomes in eukariotic cells. In: The Enzymes of Biological Membranes (Martonosi A., ed.) v.2, 531-579, Plenum Press, Hew York.

124. Sato Т., Ito K., Yura T. 1977. Membrane proteins of E.coli K-12. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of inner and outer membranes. Eur.J.Biochem. 78, 557-567.

125. Sargent M, G., Ghosh B.K., Lampen J.O. 1968. Localization of cell-bound penicillinase in B.licheniformis, J. Bacteriol. 96, 1329-1338.

126. Sargent M.G., Lampen J.O. 1970- . Organization of the membranebound penicillinase of B. Licheniformis. Arch. Biochem. Biophys. 136, 167-177.

127. Sarthy A., Fowler A.V,, Zabin I,, Beckwith J,R. 1979. Use of gene fusion to determine the partial signal sequence of alkaline phosphatase. J.Bacteriol. 139, 932-939.

128. Schaller H , Back E,, Takanami M. 1978, Sequence and regulatory signals of the filamentous phage genome. In: "The single stranded DHA phages". Eds.Denhardt D., Dressier D., Ray D., Cold Spring Harbor Laboratory. H>Y. 139-153.

129. Schlesinger M,J., Levinthal C. 1963. Hybrid protein formation of

130. E.coli alkaline phosphatase leading to in vitro complementation, J.МЫ,Biol. 7, 1-12.

131. Schiesinger M,J,, Torriani A.M., Levinthal C. 1963. In vitro formation of enzymatically active hybride proteins from E.coli alkaline phosphatase CRMS, Cold Spring Harbor Simpos Quant, Biol, 28, 539-542,

132. Schiesinger M. J., Barrett K. 1965. The reversible dissociation of the alkaline phosphatase of Escherichia coli. J,Biol.Chem. 240, 4284-4292,

133. Schiesinger M,J., Anderssen L. 1968. Multiple molecular forms of the alkaline phosphatase of Escherichia coli. Ann.H.Y, Acad.Sci. 151, 159-170.

134. Schiesinger M,J., Bloch W,, Kelley P.M. 1975. Differences in thestructure, function and formation of two isoenzymes of E,coli alkaline phosphatase. In: Isoenzymes. Ed.Markert, 333-342.

135. Schwartz J.H, 1963. The phosphorylation of alkaline phosphatase. Proc.Hatl.Acad.Sci.USA 49, 871-878.

136. Schwartz J., bipmann P. 1961. Phosphate incorporation into alkaline phosphatase of E.coli. Proc.Katl,Acad.Sci.USA 47» 19962005.

137. Schweizer M., Henning U„ 1977. Action of a major outer cell envelope protein in conjugation of E.coli K-12, J,Bacterid, 129, 1651-1662.

138. Secizawa I., Inouye S,, Halegoua S,, Inouye H. 1977. Precursors of major outer membrane proteins of E.coli. Biochem.Biophys. Res.Commun. 77, 1126-1133.

139. Simpson R., Vallee B.L,, Tait G. 1968, Alkaline phosphatase from Escherichia coli composition. Biochemistry 7, 4336-4342,

140. Smith W, P., Tai P.O., Thompson R.C., Devis B.D, 1977. Extracellular labeling of nasoent polypeptides traversing the membraneof Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 2830-2834.

141. Smith W.P., Tai P.O., Davis B.D, 1978a. Nasoent peptide as sole at-tachement of polysomes to membranes in bacteria, Proc.Natl. Acad.Sci.USA 75, 814

142. Smith W.P., Tai P.O., Davis B.D. 1978b. Interaction of secretednascent chains with surrounding membrane in B.subtiles. Proc. Natl Acad.Sci.USA 75, 5922-5925.

143. Smith W*P., Tai P.O., Davis B.D. 1979. Extracellular labelling of growing secreted polypeptide chains in B.subtilis with dia-zoidosulfanilic acid. Biochemistry 18, 198-202.

144. Smith W.P,, Tai P.O., Davis B.D. 1981. B,licheniformie penicillinase: cleaveges and attachment of lipid during covrtranslatio-nal secretion. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78, 3501-3505.

145. Sugimoto K., Sugisaki H., Takanami M. 1977. Studies on bacteriophage fd DNA. IV. The sequence of messenger RNA for the major coat protein gene. J.Mol.Biol. 110, 487-507.

146. Sutcliffe J.G. 1978. Nucleotide sequence of the ampicilin resistance gene of E.coli plasmid pBR 322. Proc.Natl,Acad.Sci.USA 75, 3737-3741.

147. Tai P.O., Smith W.P,, Davis B.D. 1979. Direct demonstration of secretion on nascent peptide chains across membranes in bacteria, In: "Limited proteolysis in microorganisms"(Cohen C.N., Holzer H. eds.), 171-176.

148. Tanford C., Reynolds J. 1976. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim.Biophys.Acta 457, 133-170,

149. Teuber C., Bager I. 1976. Action of polymyxin В on bacterial membranes. Phosphatidylglycerol and cardiolipin induced susceptibility to polymyxin В in Acholeplasma laidlawii B. Antimic-rob Agents Chemother, 9, 26-35.

150. Torriani A, 1960. Influence of inorganic phosphate in the formation of phosphatase by E.coli. Biochim.Biophys.Acta 38, 460479.

151. Varenne S., Piovant M., Pages J.M., Lazdunski C. 1978. Evidence for synthesis of alkaline phosphatase on membrane-bound polysomes in Escherichia coli. Eur.J,Biochem. 86, 603-606.

152. Waksman A., Hubert P., Gremel G., Rendon A. 1980, Translocation of protein through biological membranes. Biochim.Biophys.Acta 604, 249-296.

153. Weber K., Osborn M. J. 1969. Reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis. J.Biol.Chem. 224, 4406-4412.

154. Weil-Malherbe H,, Green R.H. 1951. The catalytic effect of molyb-date on the hydrolysis of organic phosphate bonds. Biochem.J, 49, 286-292.

155. Wiclmer W. 1976. Asymmetric orientation of phage M13 protein in E. coli cytoplasmic membranes and synthetic lipid vesicles. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73, 1159-1163.

156. Wickner W, 1980. Assembly of proteins into membranes. Science 210, 861-868.

157. Wickner W., Mandel G,, Zwizinski C., Bates M., Killick T. 1978. Synthesis of phage M13 coat protein and its assembly into membranes in vitro. Proc»Natl.Acad„Sci.USA 75, 1754-1758.

158. Wu H.C., Hou C., Lin J.J.C., Yem D.W. 1977. Biochemical characterization of amutant lipoprotein of E.coli. Proc Natl.Acad, Sci.USA 74, 1388-1392.

159. Считаю своим приятным долгом выразить благодарность моим научным руководителям доктору биологических наук, профессору И.С.Кунаеву и доктору биологических наук М.А.Несмеяновой за постоянную помощь и советы в процессе выполнения работы.